CN103214565A

CN103214565A - 尘螨过敏原Derf24和Derf25及其基因和应用

Info

Publication number: CN103214565A
Application number: CN2013100337909A
Authority: CN
Inventors: 赖仞; 安输; 容明强; 李东升
Original assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2013-01-29
Filing date: 2013-01-29
Publication date: 2013-07-24

Abstract

本发明涉及尘螨过敏原Derf24和Derf25及其基因和应用，属于生物医学技术领域。尘螨过敏原Derf24和Derf25、分别由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成。编码尘螨过敏原Derf24和Derf25的基因，分别由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列组成。所述的尘螨过敏原Derf24和Derf25在制备治疗尘螨过敏性疾病药物中的应用。本发明的有益效果在于：提供尘螨过敏原Derf24和Derf25及其基因，尘螨过敏原Derf24和Derf25能够作为制备治疗尘螨过敏性疾病药物的应用。

Description

尘螨过敏原Derf24和Derf25及其基因和应用

技术领域：

本发明涉及尘螨过敏原Der f 24和Der f 25及其基因和应用，属于生物医学技术领域。

背景技术：

过敏性疾病（如哮喘、过敏性鼻炎等）是临床上的常见病、多发病，世界各国过敏性疾病的总发病率高达10-30%，是当前世界性的重大卫生学问题，目前我国现有哮喘患者2000多万，过敏性鼻炎患者5000多万，并且其发病率和死亡率仍呈上升趋势，近二十年来发病率几乎翻了一倍。在引起过敏性疾病的众多吸入性过敏原中，尘螨是导致呼吸道变态反应性疾病的最重要因素。自从Voorhorst和Spieksma（1964）首次证实尘螨及代谢产物是屋尘中的主要过敏原以来，世界各国（欧美国家、日本、中国等）变态反应学工作者通过大量调查也一致证实尘螨是世界性的主要变应原。尘螨在过敏性疾病患者特异性免疫诊断中阳性率约70-80%。自从Noon和Freeman（1911）首次应用梯牧草花粉变应原浸液（allergen extract）用于治疗花粉症以来，脱敏治疗至今已有90多年的历史。随着对变态反应疾病发病机制的深入研究以及免疫治疗机制的进一步了解，WHO（1997）建议将变应原浸液改称为变应原疫苗（allergen vaccine），并且在《WHO有关免疫治疗的指导文件》（1998）指出：（1）鼓励应用和发展标准化的变应原疫苗；（2）成功的免疫治疗取决于高质量的变应原疫苗。因此，研制出新一代高效变应原疫苗仍是国内外该领域研究热点。

由于尘螨系医学节肢动物，结构和成份复杂，尽管目前人们在尘螨数百种蛋白中已初步鉴定出16种过敏原成份，研究显示尘螨含有的过敏原多达30余种。就某一个尘螨过敏病人而言，他可能仅对尘螨中的一类或数类过敏原蛋白产生过敏反应。而目前在临床上用于尘螨过敏患者诊断和脱敏治疗的仍然为尘螨粗浸液，其中含有大量对患者非特异的过敏原及其它杂质，这严重阻碍了尘螨过敏原试剂标准化的制定及其在临床上的使用。所以进一步探明尘螨过敏原的确切组分，将会为尘螨过敏患者带来个体化的脱敏治疗。

发明内容：

本发明的目的在于提供两种尘螨过敏原Der f 24和Der f 25基因及其应用。

本发明的技术方案如下：

Der f24属于一类alpha-actinin蛋白家族，由885个氨基酸组成，分子量约90 kDa。其氨基酸序列（SEQ ID NO:1）如下：

MTQDGYMQQEEEEWEREGLLDPAWEKQQRKTFTAWCNSHLRKAGTQIDNIEEDFRNGLKL 60

MLLLEVISGETLGKPDRGKMRFHKIANVNKALDFIESKGVKLVSIGAEEIVDGNSKMTLG 120

LIWTIILRFAIQDISVEEMTAKEGLLLWCQRKTAPYKNVNVQNFHLSWKDGLAFCALIHR 180

HRPDLIDYGKLRKDNPMDNFNLAFDVAEKHLNIPRMLDAEDVVYTAKPDERAIMTYVSWY 240

YHAFHGAQQAETAANRICKVLKVNQDNERLMEEYERLASDLLEWIRRTTPWLENRTTDNT 300

LPGTQKKLEEFRSYRRQHKPPRVEQKANLETNFNTLQTKLRLSKRPAYMPSEGKMVSDIT 360

GAWKGLESAEKGFEEWLLSEMMRLERLDHLAQKFKHKADIHEEWTQGKEEMLVSHDFRQC 420

KLNEIKALKKKHEAFESDLAAHQDRVEQIAAIAQELNALGYHDIASINARCQRICDQWDR 480

LGTLTTRRRQALDEAEQILEKVDLFHLEFAKRAAPFNNWLDETREDLVDMFIVHSIEEIQ 540

QLIDAHESFKNTLGEADKEYKTIVGLAQEVQPMATQYQIPGGLENPYTTLTPEVITTKWR 600

DVKQLVPQRDHTLQTELIRQQCNENLRRQFAEKANVVGPWIERQMDAVTAIGMGMQGTLE 660

DQLQRLHEYDQAVVQYRPHVDDLEKIHQEVQEAMIFENRYTQYTMETLRVGWEQLLTSIH 720

RNINEVENQILTRDSKGITQEQLNEFRTSFNHFDKKRTGRLAPEEFKSCLVSLGYNIRND 780

DRPEFRRILAIVDPNKTGYVHFDAFLDFMTREYTDTDTAEQMIDSFRILAGDKPYITADE 840

LRRELPPDQAEYCIRRMTPYNGQCAVPGALDYRSFSTALYGESDL 885

Der f 25属于一类磷酸丙糖异构酶蛋白家族（Triosephosphate isomerase），分子量约34 kDa。Der f 25由247个氨基酸组成，其氨基酸序列如下（SEQ ID NO:3）：

MGRKFFVGGNWKMNGNKTAIKEIVDFLKNGPLDSNVEVVVGVPAIYLMLCKNILPDNIRV 60

AAQNCYKVDKGAFTGEISPAMIKDVGAEWVILGHSERRNVFGESDQLIGEKVEHALQEGL 120

HVIACIGELLEEREAGKTTEVVFRQTQVISKHVKDWFKVVLAYEPVWAIGTGKTASPQQA 180

QEVHQKLRQCFSENVSPQIAETIRIIYGGSVTANNAKELASQADVDGFLVGGASLKPEFV 240

QIVNARQ 247

尘螨过敏原Der f 24和Der f 25基因克隆步骤包括：尘螨总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法扩增编码基因。基因测序结果表明尘螨过敏原Der f 24的编码基因（GenBank accession KC305498）由 2658个核苷酸组成，该基因的5’端至3’端序列为(核苷酸序列为SEQ ID NO:2)：

atgacccagg acggctacat gcagcaagaa gaggaggaat gggaacgtga gggtctgctg 60

gatccagcat gggagaaaca gcagcgcaag acgttcacag catggtgcaa ctcgcacctg 120

cggaaggcgg gaacccagat cgacaatatt gaggaggatt tccgcaacgg actgaaactg 180

atgctgctac tggaagtgat ctcaggggaa accctcggca aacccgaccg aggcaagatg 240

cgcttccaca agatcgccaa cgtgaacaag gcgctggact tcatcgagtc gaagggcgtc 300

aagcttgtgt cgatcggcgc tgaagagatc gttgacggca actcgaagat gaccctcggc 360

ctcatctgga ccatcattct acgcttcgcc atccaggaca tctccgtcga agagatgacc 420

gcgaaagagg gtctcttgct gtggtgccag cgcaagacgg cgccgtacaa gaacgtcaac 480

gtccagaact tccacctgtc ctggaaggac gggctggcgt tctgcgccct catccatcgg 540

catcggccgg acctgatcga ctacggaaag ctcagaaagg acaatccgat ggacaacttc 600

aatctcgcct tcgacgtcgc cgaaaagcac ctcaacatcc ccagaatgtt ggatgccgaa 660

gatgtggtat acactgccaa gccggacgag cgtgctataa tgacgtacgt gtcatggtac 720

taccacgcat tccacggagc ccagcaggcg gaaaccgccg ccaaccgcat ctgcaaagtg 780

ctcaaggtaa atcaggataa tgagcgtctc atggaggagt atgagcgtct tgcgtcggat 840

ctgctggaat ggatccgtcg gaccaccccg tggctggaga accggacaac tgacaatacc 900

ctccccggca cccagaagaa gctggaggag ttccggtcgt atcgacgaca gcacaagcca 960

ccgcgtgtcg agcagaaagc caatctggag accaacttca acaccctgca gacgaagctg 1020

aggctgagca aacggccagc gtacatgccc tccgaaggga aaatggtgtc ggacatcacc 1080

ggtgcgtgga aagggctaga gtccgccgag aagggattcg aggaatggct gctatccgag 1140

atgatgcgtc tggagcgtct ggatcacctc gcccagaagt tcaagcacaa ggccgacatc 1200

cacgaggagt ggacccaggg caaagaggag atgctggtgt cccacgactt ccggcagtgt 1260

aaactcaacg agatcaaggc cctgaagaag aaacacgagg ccttcgagtc cgacctcgcg 1320

gcccatcagg accgcgtcga gcagatcgcc gccatcgccc aagagctgaa cgctcttggg 1380

tatcacgata tcgcatccat caatgcgcgg tgccaacgta tctgcgacca gtgggatcgt 1440

ttgggcacgc tcactacgag acgtcgtcag gctctcgacg aagccgagca aatcctagag 1500

aaggtagacc tgttccatct ggagtttgcc aaacgcgctg caccgtttaa caattggctc 1560

gacgagacgc gtgaagattt agtcgatatg ttcatcgtgc acagcatcga agagattcaa 1620

cagctcatcg acgcccacga gtcgttcaag aacacgctgg gcgaagcgga caaggagtac 1680

aagaccattg tgggattggc ccaagaggtt cagcccatgg ctacacaata ccagattccc 1740

ggaggcctgg agaaccccta caccacgctc actccggagg tgattaccac aaagtggaga 1800

gacgtgaagc agttggtccc gcagcgtgat cacaccctac agaccgaact gatccgacaa 1860

caatgcaacg aaaatctacg ccggcagttt gccgagaaag ccaacgtggt tggaccctgg 1920

attgaacgcc agatggatgc tgtgaccgcg atcggcatgg gtatgcaggg caccctagag 1980

gaccagttgc agcgcttgca cgaatacgac caggccgttg tgcagtacag gcctcacgtg 2040

gacgacctcg agaagatcca tcaagaagtt caggaggcca tgatcttcga gaaccggtac 2100

acccagtaca ccatggagac cctccgcgtg ggctgggagc aactcctgac ctcgatccac 2160

cggaacatca acgaagtcga gaaccaaatc ctcactcgcg actccaaggg aatcacccag 2220

gagcagctga acgagttccg cacgtctttc aatcacttcg acaagaaacg gaccgggaga 2280

ctggctccag aggagttcaa gtcctgcctc gtctcgctcg gttacaacat caggaatgac 2340

gaccgacccg agttccgacg gattttggcc atcgtggatc cgaacaagac gggctacgta 2400

catttcgacg ccttcctgga cttcatgacg cgagagtaca ccgacactga cacggcggaa 2460

caaatgatcg actccttccg aattcttgcc ggcgacaagc cttacataac cgccgatgag 2520

ctcagacgag aacttccgcc cgaccaggcc gagtattgca tccgccggat gacgccatac 2580

aacggtcagt gcgccgttcc cggcgccctc gactaccgct cgttctcgac ggcgctctac 2640

ggcgagtcgg atctgtag 2658

基因测序结果表明尘螨过敏原Der f 25的编码基因（GenBank accession KC305500）由 744个核苷酸组成，该基因的5’端至3’端序列为(核苷酸序列为SEQ ID NO:4)：

atgggtcgca aattcttcgt tggaggtaac tggaaaatga atggtaacaa gaccgcaata 60

aaggagattg tggactttct aaagaatggt ccactcgatt ccaatgttga ggttgtcgtc 120

ggagtcccag ccatatatct catgctatgc aagaatatat tgccagacaa tatccgcgtc 180

gctgctcaaa attgctacaa agtcgataag ggtgcattca ctggtgaaat aagtccagcc 240

atgatcaaag atgttggagc agaatgggtc attcttggtc acagtgaacg tcgaaatgtt 300

tttggtgaaa gtgatcagtt gattggtgaa aaagttgaac acgctcttca agaaggattg 360

catgtaatcg cttgtattgg tgaacttctc gaggaaaggg aagccggaaa gacgactgaa 420

gttgtattcc gtcaaacaca agttatttca aaacatgtca aggattggtt taaagtagtg 480

cttgcatatg aaccggtttg ggccattggt actggtaaaa cagccagtcc acaacaagca 540

caagaagttc atcaaaaact tcgacaatgt ttttctgaaa atgtttcacc acaaattgcc 600

gaaacaattc gaatcattta tggtggttca gtaacggcaa ataatgccaa agaattggca 660

tcacaagcag atgttgatgg ttttcttgtt ggtggtgcat cattgaaacc ggaatttgtc 720

caaattgtta acgctcgtca ataa 744

通过对纯化到的Der f 24 Western blot 检测发现，来自41份尘螨过敏病人血清，Der f 24与其中的35份呈阳性反应，阳性反应率为85.4%。Elisa检测发现，阳性组在450nm处的吸收值约是阴性对照组的4.1倍。通过Elisa 抑制实验发现，Der f 24呈梯度依赖方式抑制尘螨过敏病人血清IgE与包被的尘螨匀浆结合。临床皮肤针刺实验显示，对于10位尘螨过敏患者，Der f 24与其中8位的皮肤针刺实验呈阳性反应，阳性反应率为80%。在嗜碱性细胞活化实验中，Der f 24作用于尘螨过敏病人外周血嗜碱性细胞所诱导的CD63和CCR3双阳性细胞的百分率约是阴性对照组的5.4倍。

通过对纯化到的过敏原检测发现，来自41份尘螨过敏病人血清，Der f 24与其中的35份呈阳性反应而Der f 25与其中的31份呈阳性反应，阳性反应率分别为85.4%和75.6%。Elisa检测发现，两种过敏原的阳性组在450nm处的吸收值约是阴性对照组的4.1倍。Der f 24以及Der f 25呈梯度依赖方式抑制尘螨过敏病人血清IgE与包被的尘螨匀浆结合。临床皮肤针刺实验显示，对于10位尘螨过敏患者，Der f 24与其中8位的皮肤针刺实验呈阳性反应阳性反应率为80%，Der f 25与其中6位的皮肤针刺实验呈阳性反应阳性反应率为60%。在嗜碱性细胞活化实验中，过敏原作用于尘螨过敏病人外周血嗜碱性细胞所诱导的CD63和CCR3双阳性细胞的百分率Der f 24 和Der f 25分别是阴性对照组的5.4和5.2倍。

上述过敏原检测发现，Der f 24和Der f 25具有较强的过敏原性，是来自尘螨的主要过敏原，能作为制备治疗尘螨过敏性疾病药物的应用。

本发明的有益效果在于：提供尘螨过敏原Der f 24和Der f 25及其基因，尘螨过敏原Der f 24和Der f 25能够作为制备治疗尘螨过敏性疾病药物的应用。

附图说明：

图1-A至图1-B是尘螨过敏原Der f 24和Der f 25的分离纯化。其中：

图1-A为尘螨匀浆过分子筛Sephadex-G75的峰型图；图1-B为来自尘螨匀浆分子筛Sephadex-G75第II峰再过阴离子交换柱Resource Q的峰型图及Der f 25电泳图。

图2-A至图2-D是Der f 24和 Der f 25与9个尘螨过敏病人血清及1个阴性对照Western blot结果。其中：

图2-A 为Der f 25，图2-B为Der f 24；图2-C至图2-D过敏原与尘螨过敏病人血清IgE作用的Elisa结果，其中Group1所用血清来自健康人，用作阴性对照，Group2所用血清来自尘螨过敏病人。其中图2-C 为Der f 25，图2-D为Der f 24。

图3-A至图3-D是嗜碱性细胞活化结果。其中：

图3-A所用的嗜碱性细胞来自Der f 24过敏病人的外周血Group1未用Der f 24活化来作为阴性对照，图3-B所用的嗜碱性细胞来自Der f 25过敏病人的外周血Group1未用Der f 25活化来作为阴性对照; 图3-C所用的嗜碱性细胞来自健康人的外周血，Group1是未用Der f 24活化来作为阴性对照, 图3-D所用的嗜碱性细胞来自健康人的外周血，Group1是未用Der f 25活化来作为阴性对照。

图4为尘螨匀浆Sephadex-G75Ⅱ峰的Western blot，其中点6为Der f 25。

具体实施方式：

实施例一：尘螨过敏原的鉴定及其氨基酸序列测定

一、尘螨的饲养和收集及尘螨匀浆的制备

将纯品系的粉尘螨至于25 ℃相对湿度75%的条件下采用磨成粉末状的鼠粮进行批量饲养。由于尘螨具有避光的生活特性，可用白炽灯光照法将尘螨从饲料中分离出来。对于分离的尘螨可加入适量的20mM pH 7.8 Tris-HCL进行充分研磨，然后在转速12000 ×g离心30 min获取上清。

二、尘螨过敏原的分离纯化

以上述收集的上清液为原料，上样于预先用20mM pH7.8 Tris-HCL缓冲液平衡好的分子筛凝胶层析Sephadex-G75，用相同的缓冲液进行洗脱。流速为0.3ml/min，用自动收集器每10min收集一管，检测每管在280nm和215nm处的吸收值，制作吸收值变化的峰型图如图1-A所示。然后将每峰收集冻干浓缩用于下一步的分离纯化或双向电泳及其Western blot检测。

将来自分子筛凝胶层析I和II继续过阴离子交换柱Resource Q，峰型图如图1-B和图1-C所示。

三、双向电泳及其Western blot检测

双向电泳及其Western blot具体步骤如下：

A.样品处理：采用GE公司的2D clean-up对来自分子筛各峰的样品进行脱盐浓缩等处理，主要过程如下：

1：将含有约60 μg 100 μl的样品至于1.5 ml的微型离心管中，加入300 μl沉淀剂振荡搅匀，冰浴15 min。

2：以最大转速（12000×g）离心5 min，尽量取净上清。加入40μl共沉淀剂，冰浴5 min。再次相同转速离心5 min，用移液枪将上清移去，加入25 μl加入1 ml 洗涤缓冲液（在-20 ℃至少预冷1小时）和5 μl洗涤添加剂，振荡直至沉淀完全散开。将管在-20 ℃下孵育至少30 min，每10 min 振荡20至30 s。

3：以转速12000×g离心5 min。

4：小心将上清移去，此时可见白色沉淀，将沉淀简单风干。

5：加入150 μl水化液再溶解沉淀，以备第一向等电聚焦电泳（IEF）使用。

B. 等电聚焦（IEF）: 将含有约60 μg 样品100 μl水化液上样于7 cm长Immobiline DryStrip 非线性胶条，在Ettan IPGphor Ⅲ等电聚焦系统上聚焦，等电聚焦条件为20 ℃，每条胶的电流为50 μA，总聚焦伏小时约为6 kVh。将等电聚焦好的胶条分别用含有二硫苏糖醇（DTT）和碘乙酰胺的平衡液各洗15 min，将平衡好的胶条横放在以配好的浓度为12%的SDS-PAGE胶面上，并用琼脂糖封好，准备第二向电泳。

C. 第二向电泳：对于胶宽度只有7 cm的胶块可用SE260进行跑胶。在20 mA/胶的条件下一个半小时即可。

D. 双向电泳的Western blot: 对于同一个样品需要跑两块双向电泳，其中一块用于直接染色，一块接着用于Western blot，具体过程如下：

1：转膜：将2-D-SDS-PAGE胶上的蛋白用转膜槽在200 mA 2 h的条件下转至PVDF膜上。

2：封闭：将转有蛋白的PVDF膜用5%的脱脂奶粉在常温封闭2h。

3：一抗孵育：将封闭好的PVDF膜用PBS洗涤，把一抗（尘螨过敏病人血清）用5%的脱脂奶粉按1:20稀释，在4 ℃孵育过夜。

4：二抗孵育：将一抗孵育的PVDF膜再用PBS洗涤，把二抗（羊抗人IgE）用5%的脱脂奶粉按1:2000稀释，在常温孵育1小时。

5：显影：将二抗孵育好的PVDF膜用PBS洗涤3次，每次5 min，在膜表面加上适量的二抗特异发光底物，用胶片进行显影。

E. 将与胶片上显影点匹配较好的2-D-PAGE蛋白点进行ESI-Q-TOF质谱测序。

实施例二：尘螨过敏原的基因克隆

一、尘螨总RNA提取

A.称取约80 mg的活尘螨，加入已预冷的1 mL Trizol提取液（美国Invitrogen公司），并加入液氮充分匀浆。

B.加入Trizol 1/5体积的氯仿，剧烈混匀约15秒，室温放置5分钟，4℃，12000 rpm离心10分钟，取上清。

C.上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4 ℃，12000 rpm离心10分钟，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为地鳖虫消化道中肠总RNA。

二、尘螨mRNA的纯化

尘螨mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的 PolyATtract^? mRNA Isolation Systems 试剂盒。

A. 取尘螨总RNA 500 μg 溶于 500 μL DEPC水中， 65 ℃水浴10 min，加人 3 μL的Oligo(dT) 探针和13 μL 20×SSC 溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。

B. 磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加 0. 5× SSC 300 μL，至磁力架吸附30秒，最后加100 μL 0. 5×SSC 悬浮，称为B液。

C. 将A液加入B液中，室温放置10 min，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0. 1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加100 μL DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30 s，将上清移至新的试管，再加入150 μL DEPC水重悬，至磁力架吸附30 s，移上清至上述试管，即为纯化的地鳖虫消化道中肠mRNA。

D. 加入1/10体积的pH5. 2，3 M的乙酸钠溶液，等体积异丙醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000 rpm离心10 min，弃上清，沉淀溶解于10 μL DEPC水中。

三、尘螨cDNA文库构建

采用CLONTECH公司 Creator^TM SMART ^TM cDNA Library Construction Kit 构建尘螨cDNA文库。

A. cDNA第一链合成

于无菌PCR管加入2μl 尘螨mRNA、1 μl SMART IV引物、1 μl CDS III/3’ PCR引物、1 μl RNA-free水，使总体积达到 5 μl ，混匀并短暂离心。

1.72℃ 保温 2 min，冰上孵育2 min。

2.在上述PCR管中加入2 μl 5×第一链buffer、1 μl 20 mmol/L DTT、1 μl 10 mmol/L dNTP 混合物、1 μl PowerScript逆转录酶，混匀并短暂离心。

3.置于PCR仪中42℃保温1 hr后，冰浴终止第一链的合成。

B. 采用长末端聚合酶链式反应（LD- PCR）方法扩增cDNA第二链

1．将1 μl cDNA第一链、40 μl 去离子水、5 μl 10×Advantage 2 PCR 缓冲液、1 μl 50×dNTP 混合物、1 μl 5’PCR引物、1 μl CDS III/3’PCR引物以及1 μl聚合酶于PCR管中混匀。

2．在PCR仪中按以下程序扩增： 95℃，20 sec；22个循环：95℃，5 sec；68℃，6 min。

3．扩增结束后，将合成的双链cDNA置于-70℃保存。

C. 酶切、连接以及连接产物的转化：

1. 在微量离心管中加入1 μL pMD19-T 载体（日本Takara公司）、4 μL尘螨cDNA双链溶液，全量为5 μL。

2. 加入5 μL（等量）的连接酶缓冲混合物。

3. 16℃反应2小时。

4. 全量（10 μL）加入至100 μL DH5α感受态细胞（北京天根生化科技有限公司）中，冰浴30分钟。

5. 42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。

6. 加入37℃温浴过的LB培养基900 μL，37℃缓慢振荡培养60分钟。

7. 取200 μL涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16小时，形成单菌落。

8. 每个LB平皿用5 mL LB液体培养基洗涤菌落，加30%甘油冻存。构建的cDNA大约含2×10⁶个单独克隆。

四、尘螨过敏原Der f 24和Der f 25基因序列扩增和测定：

根据实施例一中分离纯化所得尘螨过敏原Der f 25的氨基酸序列，我们设计了一条简并引物Der f 24-F 和Der f 25-F，与构建地鳖虫消化道中肠cDNA 文库时所使用的接头引物CDS III/3’ PCR配对，正反向引物序列为:

CDS III/3’ PCR：5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCATG-3’。

Der f 24-F: 5’-GC(A/T/CG)GC(A/T/CG)CC(A/T/CG)TA(T/C)AA(T/C)AA(T/C)

TGGTT-3’。

Der f 25-F: 5’-AG(T/C)GT(A/T/C/G)CT(A/T/C/G)TG(T/C)GA(A/G)GA(A/G)

AA(T/C)ATG -3’。

其中，括号内的碱基表示简并引物。

简并引物和接头引物CDS III/3’ PCR配对使用，以尘螨cDNA为模板，进行PCR。其反应条件为：95℃预变性4 min，接着在如下条件进行30轮循环，94℃ 30 sec，55℃ 30 sec，72℃ 40 sec，然后72℃ 10 min。然后将PCR产物连接到T载体上，导入大肠杆菌DH5α，筛选单克隆进行测序。结果表明编码过敏原Der f 24和Der f 25的如SEQ ID NO:4以及SEQ ID NO:4所示。

实施例三：尘螨过敏原Der f 24和Der f 25的过敏原性检测

将分离纯化获得的尘螨过敏原进行如下过敏原性检测。

一、Western blot实验

配制胶浓度为12%的SDS-PAGE胶，在还原条件电泳。电泳后利用转膜槽将PAGE胶上的Der f 25转至PVDF上，用5%的脱脂奶粉封闭2 hr，洗涤液洗涤3次后加一抗4℃孵育过夜（一抗为姚虻过敏病人血清，按1:80稀释）。用洗涤液洗涤3次后加二抗常温孵育1 hr（二抗为羊抗人IgE），再次洗涤3次后，即可用二抗所连接的辣根过氧化物酶底物显影。

二、Elisa实验

用包被液把Der f 25稀释成10 μg/ml，用50 μl 4℃包被过夜，病人血清按1:50稀释，二抗是按1:2000稀释，最终测0D450 nm的光吸收值。

三、竞争性Elisa抑制实验

具体过程：用50 μl浓度为50 μg/ml的尘螨粗提液包被96孔板，一抗用3%的BSA按1:30稀释，然后分别与终浓度为30至3×10^-4μg/ml的粗提液和Der f 24、Der f 25室温作用1小时，二抗按1:2000稀释，检测OD450的吸收值。

四、诱导嗜碱性细胞活化实验

利用ficoll-hypaque法分离对Der f 24和Der f 25过敏病人全血中的外周血单核细胞(PBMC)，PBMC含有淋巴细胞、单核细胞和嗜碱性细胞。以终浓度为1μg/ml的过敏原与PBMC在37℃孵育30 min，洗涤3次后再与抗体FITC-anti-CD63和PE-anti-CD193(CCR3)37℃孵育20分钟，洗涤3次后用流式细胞仪检测。其中阳性对照用的是anti-IgE,阴性对照用的是wash buffer(细胞用PBS)。PE标记的anti-CD193(CCR3)在嗜碱性细胞膜上稳定表达，它可以作为嗜碱性细胞的marker。在PBMC的流式图上嗜碱性细胞位于淋巴细胞和单核细胞的交界处，利用阴性对照和PE-anti-CD193(CCR3)将这部分细胞圈出来(gating)。嗜碱性细胞活化结果可用CD63和CCR3双阳嗜碱性细胞的百分率表示。

五、皮肤针刺实验

用生理盐水溶解的过敏原滴在患者前臂掌侧皮肤，用特制的点刺针刺破皮肤，使少量的Der f 24和Der f 25进入皮肤内，擦干遗留的过敏原，15 min后读结果，分别用生理盐水和组胺作阴性和阳性对照。Der f 24和Der f 25的皮肤针刺实验结果分别为表1以及表2

表1：为Der f 24对10名尘螨过敏病人的皮肤针刺实验结果。

表2：为Der f 25对10名尘螨过敏病人的皮肤针刺实验结果。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院昆明动物研究所

<120> 尘螨过敏原Der f 24和Der f 25及其基因和应用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 885

<212> PRT

<213> Dermatophagoides farinae

<400> 1

Met Thr Gln Asp Gly Tyr Met Gln Gln Glu Glu Glu Glu Trp Glu Arg

1 5 10 15

Glu Gly Leu Leu Asp Pro Ala Trp Glu Lys Gln Gln Arg Lys Thr Phe

20 25 30

Thr Ala Trp Cys Asn Ser His Leu Arg Lys Ala Gly Thr Gln Ile Asp

35 40 45

Asn Ile Glu Glu Asp Phe Arg Asn Gly Leu Lys Leu Met Leu Leu Leu

50 55 60

Glu Val Ile Ser Gly Glu Thr Leu Gly Lys Pro Asp Arg Gly Lys Met

65 70 75 80

Arg Phe His Lys Ile Ala Asn Val Asn Lys Ala Leu Asp Phe Ile Glu

85 90 95

Ser Lys Gly Val Lys Leu Val Ser Ile Gly Ala Glu Glu Ile Val Asp

100 105 110

Gly Asn Ser Lys Met Thr Leu Gly Leu Ile Trp Thr Ile Ile Leu Arg

115 120 125

Phe Ala Ile Gln Asp Ile Ser Val Glu Glu Met Thr Ala Lys Glu Gly

130 135 140

Leu Leu Leu Trp Cys Gln Arg Lys Thr Ala Pro Tyr Lys Asn Val Asn

145 150 155 160

Val Gln Asn Phe His Leu Ser Trp Lys Asp Gly Leu Ala Phe Cys Ala

165 170 175

Leu Ile His Arg His Arg Pro Asp Leu Ile Asp Tyr Gly Lys Leu Arg

180 185 190

Lys Asp Asn Pro Met Asp Asn Phe Asn Leu Ala Phe Asp Val Ala Glu

195 200 205

Lys His Leu Asn Ile Pro Arg Met Leu Asp Ala Glu Asp Val Val Tyr

210 215 220

Thr Ala Lys Pro Asp Glu Arg Ala Ile Met Thr Tyr Val Ser Trp Tyr

225 230 235 240

Tyr His Ala Phe His Gly Ala Gln Gln Ala Glu Thr Ala Ala Asn Arg

245 250 255

Ile Cys Lys Val Leu Lys Val Asn Gln Asp Asn Glu Arg Leu Met Glu

260 265 270

Glu Tyr Glu Arg Leu Ala Ser Asp Leu Leu Glu Trp Ile Arg Arg Thr

275 280 285

Thr Pro Trp Leu Glu Asn Arg Thr Thr Asp Asn Thr Leu Pro Gly Thr

290 295 300

Gln Lys Lys Leu Glu Glu Phe Arg Ser Tyr Arg Arg Gln His Lys Pro

305 310 315 320

Pro Arg Val Glu Gln Lys Ala Asn Leu Glu Thr Asn Phe Asn Thr Leu

325 330 335

Gln Thr Lys Leu Arg Leu Ser Lys Arg Pro Ala Tyr Met Pro Ser Glu

340 345 350

Gly Lys Met Val Ser Asp Ile Thr Gly Ala Trp Lys Gly Leu Glu Ser

355 360 365

Ala Glu Lys Gly Phe Glu Glu Trp Leu Leu Ser Glu Met Met Arg Leu

370 375 380

Glu Arg Leu Asp His Leu Ala Gln Lys Phe Lys His Lys Ala Asp Ile

385 390 395 400

His Glu Glu Trp Thr Gln Gly Lys Glu Glu Met Leu Val Ser His Asp

405 410 415

Phe Arg Gln Cys Lys Leu Asn Glu Ile Lys Ala Leu Lys Lys Lys His

420 425 430

Glu Ala Phe Glu Ser Asp Leu Ala Ala His Gln Asp Arg Val Glu Gln

435 440 445

Ile Ala Ala Ile Ala Gln Glu Leu Asn Ala Leu Gly Tyr His Asp Ile

450 455 460

Ala Ser Ile Asn Ala Arg Cys Gln Arg Ile Cys Asp Gln Trp Asp Arg

465 470 475 480

Leu Gly Thr Leu Thr Thr Arg Arg Arg Gln Ala Leu Asp Glu Ala Glu

485 490 495

Gln Ile Leu Glu Lys Val Asp Leu Phe His Leu Glu Phe Ala Lys Arg

500 505 510

Ala Ala Pro Phe Asn Asn Trp Leu Asp Glu Thr Arg Glu Asp Leu Val

515 520 525

Asp Met Phe Ile Val His Ser Ile Glu Glu Ile Gln Gln Leu Ile Asp

530 535 540

Ala His Glu Ser Phe Lys Asn Thr Leu Gly Glu Ala Asp Lys Glu Tyr

545 550 555 560

Lys Thr Ile Val Gly Leu Ala Gln Glu Val Gln Pro Met Ala Thr Gln

565 570 575

Tyr Gln Ile Pro Gly Gly Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Thr Leu Thr Pro

580 585 590

Glu Val Ile Thr Thr Lys Trp Arg Asp Val Lys Gln Leu Val Pro Gln

595 600 605

Arg Asp His Thr Leu Gln Thr Glu Leu Ile Arg Gln Gln Cys Asn Glu

610 615 620

Asn Leu Arg Arg Gln Phe Ala Glu Lys Ala Asn Val Val Gly Pro Trp

625 630 635 640

Ile Glu Arg Gln Met Asp Ala Val Thr Ala Ile Gly Met Gly Met Gln

645 650 655

Gly Thr Leu Glu Asp Gln Leu Gln Arg Leu His Glu Tyr Asp Gln Ala

660 665 670

Val Val Gln Tyr Arg Pro His Val Asp Asp Leu Glu Lys Ile His Gln

675 680 685

Glu Val Gln Glu Ala Met Ile Phe Glu Asn Arg Tyr Thr Gln Tyr Thr

690 695 700

Met Glu Thr Leu Arg Val Gly Trp Glu Gln Leu Leu Thr Ser Ile His

705 710 715 720

Arg Asn Ile Asn Glu Val Glu Asn Gln Ile Leu Thr Arg Asp Ser Lys

725 730 735

Gly Ile Thr Gln Glu Gln Leu Asn Glu Phe Arg Thr Ser Phe Asn His

740 745 750

Phe Asp Lys Lys Arg Thr Gly Arg Leu Ala Pro Glu Glu Phe Lys Ser

755 760 765

Cys Leu Val Ser Leu Gly Tyr Asn Ile Arg Asn Asp Asp Arg Pro Glu

770 775 780

Phe Arg Arg Ile Leu Ala Ile Val Asp Pro Asn Lys Thr Gly Tyr Val

785 790 795 800

His Phe Asp Ala Phe Leu Asp Phe Met Thr Arg Glu Tyr Thr Asp Thr

805 810 815

Asp Thr Ala Glu Gln Met Ile Asp Ser Phe Arg Ile Leu Ala Gly Asp

820 825 830

Lys Pro Tyr Ile Thr Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Pro Pro Asp

835 840 845

Gln Ala Glu Tyr Cys Ile Arg Arg Met Thr Pro Tyr Asn Gly Gln Cys

850 855 860

Ala Val Pro Gly Ala Leu Asp Tyr Arg Ser Phe Ser Thr Ala Leu Tyr

865 870 875 880

Gly Glu Ser Asp Leu

885

<210> 2

<211> 2658

<212> DNA

<213> Dermatophagoides farinae

<400> 2

atgacccagg acggctacat gcagcaagaa gaggaggaat gggaacgtga gggtctgctg 60

gatccagcat gggagaaaca gcagcgcaag acgttcacag catggtgcaa ctcgcacctg 120

cggaaggcgg gaacccagat cgacaatatt gaggaggatt tccgcaacgg actgaaactg 180

atgctgctac tggaagtgat ctcaggggaa accctcggca aacccgaccg aggcaagatg 240

cgcttccaca agatcgccaa cgtgaacaag gcgctggact tcatcgagtc gaagggcgtc 300

aagcttgtgt cgatcggcgc tgaagagatc gttgacggca actcgaagat gaccctcggc 360

ctcatctgga ccatcattct acgcttcgcc atccaggaca tctccgtcga agagatgacc 420

gcgaaagagg gtctcttgct gtggtgccag cgcaagacgg cgccgtacaa gaacgtcaac 480

gtccagaact tccacctgtc ctggaaggac gggctggcgt tctgcgccct catccatcgg 540

catcggccgg acctgatcga ctacggaaag ctcagaaagg acaatccgat ggacaacttc 600

aatctcgcct tcgacgtcgc cgaaaagcac ctcaacatcc ccagaatgtt ggatgccgaa 660

gatgtggtat acactgccaa gccggacgag cgtgctataa tgacgtacgt gtcatggtac 720

taccacgcat tccacggagc ccagcaggcg gaaaccgccg ccaaccgcat ctgcaaagtg 780

ctcaaggtaa atcaggataa tgagcgtctc atggaggagt atgagcgtct tgcgtcggat 840

ctgctggaat ggatccgtcg gaccaccccg tggctggaga accggacaac tgacaatacc 900

ctccccggca cccagaagaa gctggaggag ttccggtcgt atcgacgaca gcacaagcca 960

ccgcgtgtcg agcagaaagc caatctggag accaacttca acaccctgca gacgaagctg 1020

aggctgagca aacggccagc gtacatgccc tccgaaggga aaatggtgtc ggacatcacc 1080

ggtgcgtgga aagggctaga gtccgccgag aagggattcg aggaatggct gctatccgag 1140

atgatgcgtc tggagcgtct ggatcacctc gcccagaagt tcaagcacaa ggccgacatc 1200

cacgaggagt ggacccaggg caaagaggag atgctggtgt cccacgactt ccggcagtgt 1260

aaactcaacg agatcaaggc cctgaagaag aaacacgagg ccttcgagtc cgacctcgcg 1320

gcccatcagg accgcgtcga gcagatcgcc gccatcgccc aagagctgaa cgctcttggg 1380

tatcacgata tcgcatccat caatgcgcgg tgccaacgta tctgcgacca gtgggatcgt 1440

ttgggcacgc tcactacgag acgtcgtcag gctctcgacg aagccgagca aatcctagag 1500

aaggtagacc tgttccatct ggagtttgcc aaacgcgctg caccgtttaa caattggctc 1560

gacgagacgc gtgaagattt agtcgatatg ttcatcgtgc acagcatcga agagattcaa 1620

cagctcatcg acgcccacga gtcgttcaag aacacgctgg gcgaagcgga caaggagtac 1680

aagaccattg tgggattggc ccaagaggtt cagcccatgg ctacacaata ccagattccc 1740

ggaggcctgg agaaccccta caccacgctc actccggagg tgattaccac aaagtggaga 1800

gacgtgaagc agttggtccc gcagcgtgat cacaccctac agaccgaact gatccgacaa 1860

caatgcaacg aaaatctacg ccggcagttt gccgagaaag ccaacgtggt tggaccctgg 1920

attgaacgcc agatggatgc tgtgaccgcg atcggcatgg gtatgcaggg caccctagag 1980

gaccagttgc agcgcttgca cgaatacgac caggccgttg tgcagtacag gcctcacgtg 2040

gacgacctcg agaagatcca tcaagaagtt caggaggcca tgatcttcga gaaccggtac 2100

acccagtaca ccatggagac cctccgcgtg ggctgggagc aactcctgac ctcgatccac 2160

cggaacatca acgaagtcga gaaccaaatc ctcactcgcg actccaaggg aatcacccag 2220

gagcagctga acgagttccg cacgtctttc aatcacttcg acaagaaacg gaccgggaga 2280

ctggctccag aggagttcaa gtcctgcctc gtctcgctcg gttacaacat caggaatgac 2340

gaccgacccg agttccgacg gattttggcc atcgtggatc cgaacaagac gggctacgta 2400

catttcgacg ccttcctgga cttcatgacg cgagagtaca ccgacactga cacggcggaa 2460

caaatgatcg actccttccg aattcttgcc ggcgacaagc cttacataac cgccgatgag 2520

ctcagacgag aacttccgcc cgaccaggcc gagtattgca tccgccggat gacgccatac 2580

aacggtcagt gcgccgttcc cggcgccctc gactaccgct cgttctcgac ggcgctctac 2640

ggcgagtcgg atctgtag 2658

<210> 3

<211> 247

<212> PRT

<213> Dermatophagoides farinae

<400> 3

Met Gly Arg Lys Phe Phe Val Gly Gly Asn Trp Lys Met Asn Gly Asn

1 5 10 15

Lys Thr Ala Ile Lys Glu Ile Val Asp Phe Leu Lys Asn Gly Pro Leu

20 25 30

Asp Ser Asn Val Glu Val Val Val Gly Val Pro Ala Ile Tyr Leu Met

35 40 45

Leu Cys Lys Asn Ile Leu Pro Asp Asn Ile Arg Val Ala Ala Gln Asn

50 55 60

Cys Tyr Lys Val Asp Lys Gly Ala Phe Thr Gly Glu Ile Ser Pro Ala

65 70 75 80

Met Ile Lys Asp Val Gly Ala Glu Trp Val Ile Leu Gly His Ser Glu

85 90 95

Arg Arg Asn Val Phe Gly Glu Ser Asp Gln Leu Ile Gly Glu Lys Val

100 105 110

Glu His Ala Leu Gln Glu Gly Leu His Val Ile Ala Cys Ile Gly Glu

115 120 125

Leu Leu Glu Glu Arg Glu Ala Gly Lys Thr Thr Glu Val Val Phe Arg

130 135 140

Gln Thr Gln Val Ile Ser Lys His Val Lys Asp Trp Phe Lys Val Val

145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

Glu Asn Val Ser Pro Gln Ile Ala Glu Thr Ile Arg Ile Ile Tyr Gly

195 200 205

Gly Ser Val Thr Ala Asn Asn Ala Lys Glu Leu Ala Ser Gln Ala Asp

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Gln Ile Val Asn Ala Arg Gln

245

<210> 4

<211> 744

<212> DNA

<213> Dermatophagoides farinae

<400> 4

atgggtcgca aattcttcgt tggaggtaac tggaaaatga atggtaacaa gaccgcaata 60

aaggagattg tggactttct aaagaatggt ccactcgatt ccaatgttga ggttgtcgtc 120

ggagtcccag ccatatatct catgctatgc aagaatatat tgccagacaa tatccgcgtc 180

gctgctcaaa attgctacaa agtcgataag ggtgcattca ctggtgaaat aagtccagcc 240

atgatcaaag atgttggagc agaatgggtc attcttggtc acagtgaacg tcgaaatgtt 300

tttggtgaaa gtgatcagtt gattggtgaa aaagttgaac acgctcttca agaaggattg 360

catgtaatcg cttgtattgg tgaacttctc gaggaaaggg aagccggaaa gacgactgaa 420

gttgtattcc gtcaaacaca agttatttca aaacatgtca aggattggtt taaagtagtg 480

cttgcatatg aaccggtttg ggccattggt actggtaaaa cagccagtcc acaacaagca 540

caagaagttc atcaaaaact tcgacaatgt ttttctgaaa atgtttcacc acaaattgcc 600

gaaacaattc gaatcattta tggtggttca gtaacggcaa ataatgccaa agaattggca 660

tcacaagcag atgttgatgg ttttcttgtt ggtggtgcat cattgaaacc ggaatttgtc 720

caaattgtta acgctcgtca ataa 744

Claims

1.尘螨过敏原Der f 24和Der f 25，其特征在于分别由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成。

2.编码尘螨过敏原Der f 24和Der f 25的基因，其特征在于分别由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列组成。

3.权利要求1所述的尘螨过敏原Der f 24和Der f 25在制备治疗尘螨过敏性疾病药物中的应用。