CN102307894B - 螨过敏原之变体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明系关于一种名为欧洲尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)之家尘螨的第二群过敏原之新颖变体(称为Der p 2变体)，及其用途。该新颖变体具有不同于其他已知Der p 2变体之cDNA及蛋白序列变异。
Description
技术领域
本发明系关于家尘螨Der p 2过敏原之新颖变体及其用途。
背景技术
长久以来，已知家尘螨系诸多疾病之肇因，诸如，气喘、鼻炎、鼻窦炎、湿疹、过敏性皮炎、过敏、结膜炎、及/或血管性水肿(Sporik R，Chapman MD，Platts-Mills TA.House dust mite exposure as a cause of asthma.Clin Exp Allergy 1992；22(10)：897-906.)。特定言之，欧洲尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)是一种主要的家尘螨，且已进行了许多研究辨识其所产生之过敏原。于此，Der p 2已被认定为欧洲尘螨所产生的代表性过敏原。超过80％之过敏病患皆会与Der p 2产生反应(Lind P，Lowenstein H.Identification of allergens in Dermatophagoides pteronyssinus mite body extract by crossed radioimmunoelectrophoresis with two different rabbit antibody pools.Scand J Immunol 1983；17(3)：263-73；Heymann PW，Chapman MD，Aalberse RC，Fox JW，Platts-Mills TA.Antigenic and structural analysis of group II allergens(Der f II and Der p II)from house dust mites (Dermatophagoides spp).J Allergy Clin Immunol 1989；83(6)：1055-67.)。
Der p 2在天然环境下具有长期安定性(de Boer R，van der Hoeven WA，Stapel SO.The decay of house dust mite allergens，Der p I and Der p II，under natural conditions.Clin Exp Allergy 1995；25(8)：765-70.)，且其对热、pH、及各种化学变性处理皆具有抗性(Lombardero M，Heymann PW，Platts-Mills TA，Fox JW，Chapman MD.Conformational stability of B cell epitopes on group I and group II Dermatophagoides spp.allergens.Effect of thermal and chemical denaturation on the binding of murine IgG and human IgE antibodies.J Immunol 1990；144(4)：1353-60.)。Der p 2之三维结构已由NMR(Mueller GA，Benjamin DC，Rule GS.Tertiary structure of the major house dust mite allergen Der p 2：sequential and structural homologies.Biochemistry 1998；37(37)：12707-14.)及X光结晶学(Derewenda U，Li J，Derewenda Z，Dauter Z，Mueller GA，Rule GS et al.The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2，and its biological implications.J Mol Biol 2002；318(1)：189-97.)判定。特定言之，Der p 2具有免疫球蛋白(Ig)折叠结构，含两个反平行β片层。此外，Der p 2缺乏可连接Ig样结构域中的B链及F链之间的片层间二硫键；而是在残基8与119、残基21与27、以及残基73与78之间存在有三个二硫键。此在，残基8与119之间的二硫键使A′链及G′链彼此连结，而另外两个二硫键则是位在环区域。
Der p 2之cDNA序列已完成鉴定，而其推导出来的氨基酸序列显示Der p 2具有146个氨基酸残基，并具有一段含17个残基的信号肽。此外，已经发现Der p 2之DNA序列中存在大量的多型性(Chua KY，Huang CH，Shen HD，Thomas WR.Analysis of sequence polymorphism of a major mite allergen，Der p 2.Clin Exp Allergy 1996；26(7)：829-37；Smith WA，Hales BJ，Jarnicki AG，Thomas WR.Allergens of wild house dust mites：environmental Der p 1and Der p 2sequence polymorphisms.J Allergy Clin Immunol 2001；107(6)：985-92.)。目前为止，已鉴别出八种Der p 2变体，其在所述多型性残基处各自具有独特的氨基酸取代(Hales BJ，Hazell LA，Smith W，Thomas WR.Genetic variation of Der p 2allergens：effects on T cell responses and immunoglobulin E binding.Clin Exp Allergy 2002；32(10)：1461-7.)。此等变体可用于研究尘螨过敏之免疫发病机制，以及研发用以诊断及治疗尘螨过敏之试剂。
发明内容
我们藉由筛选欧洲尘螨λgt11cDNA库，分离出新颖过敏原「Der p 2变体T」之cDNA。在此，本发明鉴定出Der p 2变体T cDNA之核苷酸序列，且在大肠杆菌(E.coli)及毕氏酵母(Pichia pastoris)中制造重组Der p 2变体T多肽。Der p 2变体T可用于疾病之诊断及治疗。
在第一态样中，本发明提供一种聚核苷酸，其系由编码氨基酸序列SEQ ID NO：1之核苷酸序列构成。
在第二态样中，本发明提供一种重组核酸，其包含编码氨基酸序列SEQ ID NO：1之核苷酸序列。
在第三态样中，本发明提供一种转基因生物，其包含上述之聚核苷酸或重组核酸。
在第四态样中，本发明提供一种多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：1。
在第五态样中，本发明提供一种诊断个体对家尘螨之过敏的方法，其包含检测该个体是否会与上述多肽产生反应。
在第六态样中，本发明提供一种诊断个体对家尘螨之过敏的组合物，其包含上述多肽以及稀释剂。
在本发明之第七态样中，其提供一种治疗或预防个体之过敏性疾病的方法，其包含对该个体投与上述多肽。
在第八态样中，本发明提供一种医药组合物，其包含上述多肽以及医药可接受之赋形剂或载体。
在第九态样中，本发明提供一种DNA疫苗，其包含上述聚核苷酸或重组核酸。
附图说明
前述的发明内容以及前述的实施方式，可在结合附呈的图式阅读时更为明了。就说明本发明之目的而言，图式显示的是目前较佳的具体实例。然而，应明了的是，本发明并不限于所示的较佳具体实例。
在附图中：
图1表示本发明Der p 2变体T之cDNA核苷酸序列以及其推导氨基酸序列。
图2表示Der p 2.0101之cDNA分子的核苷酸序列(登录号：AF276239)以及其推导氨基酸序列(登录号：P49278)。
图3显示Der p 2变体T与Der p 2.0101之核苷酸序列间的排列比较，其中在核苷酸序列之上方及下方所指出的氨基酸残基分别为Der p 2变体T及Der p 2.0101之独特氨基酸取代；起始及终止密码子画有底线；符号“·”表示相同的核苷酸；符号“-”表示间隔；而阴影部分则表示3’未翻译核苷酸序列。
图4显示SDS-PAGE分析之结果，其中第1道代表取自大肠杆菌表达系统之GST-Der p 2.0101融合蛋白；第2道代表取自大肠杆菌表达系统之GST-Der p 2变体T融合蛋白；第3道代表取自毕氏酵母表达系统之GST-Der p 2.0101蛋白；第4道代表取自毕氏酵母表达系统之GST-Der p 2变体T蛋白；而M代表分子量标记物。
图5系关于IgE点渍免疫分析，其中(A)显示加在硝基纤维素膜上的蛋白样本之位置，包括GST-Der p 2.0101融合蛋白、GST-Der p 2变体T融合蛋白、GST肽、及欧洲尘螨萃取物；(B)显示免疫分析之结果，编号1至50各自表示取自所述50名病患之血清样本；以及(C)显示由光密度计所定量的蛋白样本IgE反应性程度。
具体实施方式
除非另外定义，本文中所用之所有技术及科学词汇具有所属技术领域的技术人员所通常明了之相同意义。在本文中，除非另有明示，下列之术语具有其所述意义。
在本文中，冠词「一」系指一个或一个以上(亦即，至少一个)该冠词在文法上之受词。举例而言，「一组件」意谓一个组件或一个以上之组件。
术语「聚核苷酸」或「核酸」系指由核苷酸单元所构成之聚合物。聚核苷酸包括天然存在之核酸，诸如，脱氧核糖核酸(「DNA」)或核糖核酸(「RNA」)，以及核酸类似物，包括具有非天然存在之核苷酸者。聚核苷 酸可由合成产生，例如，使用自动化DNA合成仪。术语「核酸」一般而言系指大型聚核苷酸。应明了的是，当一核苷酸序列系由DNA序列表示(亦即，A、T、G、C)，其亦包括RNA序列(亦即，A、U、G、C)，其中以「U」取代「T 」。术语「cDNA」系指与mRNA互补或相同之DNA，其可为单股或双股形式。
术语「互补」系指两聚核苷酸交互作用表面有拓扑兼容性或相互配对。因此，该两分子可被视为互补，两者的接触表面特征彼此互补。如第一聚核苷酸的核苷酸序列与第二聚核苷酸之聚核苷酸结合配对物的核苷酸序列相同，则可称为第一聚核苷酸与第二聚核苷酸互补。因此，序列为5′-TATAC-3′之聚核苷酸系与序列为5′-GTATA-3′之聚核苷酸互补。
术语「编码」系指聚核苷酸(如，基因、cDNA、或mRNA)中之特定核苷酸序列的固有特性，其可在在生物作用中作为模板，以合成其他具有指定核苷酸序列(亦即，rRNA、tRNA、及mRNA)或指定氨基酸序列以及其由其所产生之生物特性的聚合物或巨分子。因此，如由一基因所产生之mRNA的转录及翻译可在细胞或其他生物系统中产生一蛋白，则称该基因编码该蛋白。所属技术领域的技术人员可明了的是，由于遗传密码之简并性，不同的聚核苷酸及核酸可编码相同的多肽。亦可明了的是，使用常规技术，所属技术领域的技术人员可制造出核苷酸取代，其不影响本文所述聚核苷酸所编码之多肽序列，而反映出用以表达该等多肽之任何特定宿主生物的密码子使用偏好。因此，除非另有明示，「编码一氨基酸序列之核苷酸序列」包括所有互为彼此简并版本且编码相同氨基酸序列之核苷酸序列。编码蛋白及RNA之核苷酸序列可包括内含子。
术语「重组核酸」系指具有非天然彼此连结之序列的聚核苷酸或核酸。重组核酸可以载体之形式存在。「载体」可含有想要的指定核苷酸序列以及调控序列。载体可用于表达该指定核苷酸序列或是维持该指定核苷酸序列以进行复制、操纵、或在不同位置间传输(如，在不同之生物间)。可将载体导入适当的宿主细胞，以进行上述目的。
载体之实例包括，但不限于，质粒、粘粒(cosmid)、噬菌体、YACs 或PACs。一般而言，在载体中，指定的核苷酸序列是以可操作之方式与调控序列连结，因而使得载体在被导入宿主细胞中时，指定核苷酸序列可受调控序列之控制而在宿主细胞中表达。调控序列可包含，例如但并不限于，启动子序列(如，巨细胞病毒(CMV)启动子、猴病毒40(SV40)早期启动子、T7启动子、及醇氧化酶基因(AOX1)启动子)、起始密码子、复制起点、增强子、操作子序列、分泌信号序列(如，α-交配因子信号)、以及其他控制序列(如，Shine-Dalgarno序列及终止序列)。较佳者，载体可进一步包含标记序列(如，抗生素抗性标记序列)，以进行后续之筛选流程。更佳者，在载体中，指定的核苷酸序列可与另一非上述调控序列之核苷酸序列连结，以产生一融合多肽，其有利于后续之纯化流程。融合多肽包括，但不限于，融合His-标签之多肽，以及融合GST之多肽。
术语「多肽」系指由经肽键连结之氨基酸残基所构成的聚合物。多肽可由合成产生，例如，使用自动化多肽合成仪。术语「蛋白」一般而言系指大型之多肽。术语「肽」一般而言系指短型之多肽。
氨基酸可由三个字母或一个字母表示。表1列述标准之氨基酸缩写。
表1：标准氨基酸缩写
| 氨基酸 | 3-字母 | 1-字母 |
| 丙氨酸 | Ala | A |
| 精氨酸 | Arg | R |
| 天冬酰胺 | Asn | N |
| 天冬氨酸 | Asp | D |
| 半胱氨酸 | Cys | C |
| 谷氨酸 | Glu | E |
| 谷氨酰胺 | Gln | Q |
| 甘氨酸 | Gly | G |
| 组氨酸 | His | H |
| 异亮氨酸 | Ile | I |
| 亮氨酸 | Leu | L |
| 赖氨酸 | Lys | K |
| 甲硫氨酸 | Met | M |
| 苯丙氨酸 | Phe | F |
| 脯氨酸 | Pro | P |
| 丝氨酸 | Ser | S |
| 苏氨酸 | Thr | T |
| 色氨酸 | Trp | W |
| 酪氨酸 | Tyr | Y |
| 缬氨酸 | Val | V |
术语「疫苗」系指一种试剂或组合物，其含有可在个体体内有效诱发治疗程度之免疫力以对抗特定病原体或疾病之活性组成份。传统上，疫苗之活性组成份系衍生自该疫苗目标病原体之多肽。术语「DNA疫苗」系指其中该活性组成份为DNAs之疫苗。
术语「医药组合物」系指适于在个体体内作为医药用途之组合物。医药组合物包含医药有效量之活性试剂以及医药可接受之载体。「医药有效量」系指可有效产生想要的药学结果之试剂量。「医药可接受之载体」系指任何标准之医药载体、缓冲剂、及赋形剂，诸如，磷酸缓冲盐水溶液、5％葡萄糖水溶液，以及乳液，诸如，油/水或水/油乳液，以及各种不同类型之湿润剂及/或佐剂。较佳的医药载体取决于该活性试剂想要进行的投与模式。典型之投与模式包括肠内(如，口服)或肠外(如，皮下、肌内、静脉、或腹膜注射；或是局部、穿皮、或穿黏膜投与)。
须要诊断或治疗之「个体」系指人类或非人类哺乳动物。非人类哺乳动物包括，但不限于，灵长类、有蹄类、犬科动物、及猫科动物。
本发明分离出一种编码Der p 2新颖变体「Der p 2变体T」之cDNA分子，其可用于诊断及治疗过敏性疾病，特别是与Der p 2相关者。
图1显示Der p 2变体T之cDNA核苷酸序列以及推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。本发明之Der p 2变体T具有显著不同于其他已知Der p2变体之核苷酸及氨基酸序列变异。表2显示在Der p 2变体T多型性区 域之氨基酸取代与其他已知Der p 2变体者间的比较。
表2：Der p 2变体多型性残基之表列*
*氨基酸编号系对应于序列Der p 2.0101(登录号P49278)。
如表2所示，本发明之Der p 2变体T首次揭示两个分别位于-1及26位置的新颖多型性氨基酸残基，其未曾在其他已知Der p 2变体出现。在-1位置，本发明Der p 2变体T之氨基酸残基由其他已知变体中之Arg变化为Ala，而在26位置，本发明Der p 2变体T之氨基酸残基由其他已知变体中之Pro变化为Ser。更特定言之，相较于Der p 2.0101(1989年所分离的第一种Der p 2)，本发明之Der p 2变体T包含四个氨基酸变化，亦即，Arg(-1)至Ala(-1)、Pro 26至Ser 26、Thr 47至Ser 47、以及Asp 114至Asn 114。图2显示Der p 2.0101之核苷酸序列(登录号：AF276239)及氨基酸序列(登录号：P49278)。本发明Der p 2变体T之氨基酸取代使其等电点(7.10)理论值高于Der p 2.0101(6.56)。
在一方面中，本发明提供一种聚核苷酸，其系由编码氨基酸序列SEQID NO：1之核苷酸序列构成。本发明之聚核苷酸可用于制备Der p 2T，其可用于诊断及治疗如上所述之过敏性疾病。在一具体实例中，该聚核苷酸系由核苷酸序列SEQ ID NO：2构成。
本发明之聚核苷酸可为DNA或RNA，双股或单股。当该聚核苷酸为双股时，该双链体之两股(编码及互补股)皆包括在本发明中，不论其为单独或结合。当该聚核苷酸系单股时，应明了的是，其互补股亦包括在内。本发明亦涵括聚核苷酸之简并版本，其中该聚核苷酸之核苷酸序列中的至少一个密码子系由一不同之密码子取代，而该至少一个密码子以及该不同之密码子编码相同之氨基酸残基。
本发明之聚核苷酸可使用重组方法、合成方法、或所属技术领域的技术人员可用之任何方法制备。亦可由标准技术进行克隆。关于分离及制备聚核苷酸之细节描述于下文之实例中。
此外，本发明之聚核苷酸可与另一聚核苷酸接合以构建重组核酸，其可用于，例如，扩增该聚核苷酸。
因此，本发明提供一种重组核酸，其包含编码氨基酸序列SEQ ID NO：1之核苷酸序列，如上所述者。特定言之，该重组核酸包含核苷酸序列SEQID NO：2。
在一具体实例中，本发明之重组核酸系一载体，其系用于表达或维持该核苷酸序列，如上所述者。可为达成上述目的而将本发明之载体导入适当的宿主细胞。
较佳者，本发明之重组核酸系表达载体，其可用于产生Der p 2变体T。特定言之，本发明之表达载体可经改造，藉由包括适当的启动子、复制序列、标记等以进行mRNA之转录及翻译，而使其在原核细胞或真核细胞中产生作用。
此外，本发明之表达载体尚可在其启动子区域中包括操作子，以控制该核苷酸序列表达之启动。操作子序列之实例为所属技术领域的技术人员所熟知。在本发明之具体实例中，该操作子系异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)或甲醇诱导性操作子。
此外，本发明之表达载体尚可包含标签序列，以产生融合蛋白而有利于该蛋白之纯化。举例而言，可将聚组氨酸标签序列(如，六个组氨酸残基)纳入该表达载体中，以产生融合His-标签之蛋白。该His-标签可藉由 镍螯合层析而有利于该蛋白之分离。就另一实例而言，可在该表达载体中包括谷胱甘肽S-转移酶(GST)序列，以产生融合GST之蛋白，而后续之蛋白纯化即可借着使用谷胱甘肽(GSH)亲和管柱而进行。此种标签序列系所属技术领域的技术人员所熟知。可视需要地，例如，可进行酶性反应而将融合于该目标多肽之标签移除，以取得该多肽本身。
本发明之重组核酸可由习知的基因工程技术构建。关于构建本发明重组核酸之细节述于下文之实例中。
可将本发明之聚核苷酸或本发明之重组核酸导入生物体中，该生物可因此转化而具有想要的功能，例如，维持或表达如上所述之核苷酸序列。
因此，在另一态样中，本发明提供一种转基因生物，其包含聚核苷酸或重组核酸，该聚核苷酸或重组核酸各包含编码氨基酸序列SEQ ID NO：1之核苷酸序列，如上所述者。特定言之，该核苷酸序列系SEQ ID NO：2。该生物可用于，例如，维持该核苷酸序列或是产生包含氨基酸序列SEQ ID NO：1之多肽。此等生物亦可作为，例如，用以分析本发明过敏原之作用的模型。
本文所用之术语「转基因生物」包括其中导入上述聚核苷酸或重组核酸之任何适当生物。该生物之实例范围包括低等生物(诸如，细菌)至高等生物(诸如，植物及非人类哺乳动物)。
在本发明之具体实例中，转基因生物系宿主细胞，其可为原核或真核细胞。原核细胞之实例包括，但不限于，细菌，诸如，大肠杆菌、乳酸杆菌(lactobacilli)、及双歧杆菌(bifidobacteria)。真核细胞可为，例如，昆虫、真菌、哺乳动物、或植物细胞，较佳为酵母菌细胞，更佳为毕氏酵母。
宿主细胞可在适当的条件下培养，以表达目标多肽。多肽之表达可为组成型，可持续产生，或诱导型，须刺激以起动表达。就诱导型表达而言，蛋白之生成可在须要时才起动，例如，借着在培养基中添加诱导剂物质，例如，IPTG或甲醇。多肽可以多种所属技术领域的技术人员已知的技术而由宿主细胞中回收及纯化，例如，层析，如，HPLC或亲和管柱。
在本发明之另一具体实例中，转基因生物系植物，其包括，但不限于， 农作物，诸如，稻米、小麦、大麦、高粱、玉米、及燕麦，以及经济植物，诸如，西红柿及香蕉。
在本发明之另一具体实例中，转基因生物系多细胞真菌，其包括，但不限于，蘑菇，较佳系可食性蘑菇，诸如，金针菇。
在本发明之另一具体实例中，转基因生物系非人类转基因动物，特别系哺乳动物，其生殖细胞(亦即，卵或精子)包含上述之本发明聚核苷酸或重组核酸。转基因动物之实例包括，但不限于，小鼠、天竺鼠、兔、猪、绵羊、及牛。
本发明核酸进入该生物体之导入(转化)原则上可由所属技术领域的技术人员所熟悉之所有方法进行。
将核酸导入宿主细胞之方法，诸如，氯化钙处理、电穿孔、DEAE-葡聚糖-介导性转染、脂质转染(lipofection)、及微注射，皆系所属技术领域的技术人员所熟知者，已描述于，例如，Int Arch Allergy Appl Immunol 1990；91(2)：118-23(Chua KY，Doyle CR，Simpson RJ，Turner KJ，Stewart GA，Thomas WR.Isolation of cDNA coding for the major mite allergen Der p II by IgE plaque immunoassay.Int Arch Allergy Appl Immunol 1990；91(2)：118-23.)。
就植物而言，可利用已知用于自植物组织或植物细胞进行植物之转化或再生的方法，进行暂时或稳定的转化。适当的方法系基因枪(biolistic)法，或是藉由原生质体转化、电穿孔、微注射、及农杆菌(agrobacterium)介导性基因转移。上述之方法亦可应用于真菌之转化。此等方法述于，例如，Methods Mol Biol.2004；267：329-50(Lorence A，Verpoorte R.Gene transfer and expression in plants.Methods Mol Biol.2004；267：329-50.)。
就本发明之转基因动物而言，其可，例如，借着将该重组核酸分子导入受精卵或胚胎干(ES)细胞中而产生，一般而言系藉由微注射、电穿孔、脂质转染、粒子介导性基因转移而达成。转基因生物在组织中表达异源核苷酸序列取决于启动子是否可受给予细胞的信号诱导，或是否为组成型启动子。上述方法述于，例如，Curr Drug Deliv.2004；1(2)：165-93(Azzam T，Domb AJ.Current developments in gene transfection agents.Curr Drug Deliv.2004Apr；1(2)：165-93.)。
在又另一态样中，本发明提供一种纯化的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：1(亦即，Der p 2变体T)。如上所述，可在本发明之表达载体中纳入标签序列(如，GST序列)以形成融合蛋白。
本发明之多肽可以重组方法予以制备，如，在适当的条件下培养包含本发明表达载体之宿主细胞，再回收及纯化如上所述之多肽。本发明之多肽亦可以化学合成方法制备，其系借着使一氨基酸之羧基(C端)与另一氨基酸之氨基(N端)偶合而进行。化学合成方法之实例包括，但不限于，固相合成，诸如，t-Boc固相肽合成及Fmoc固相肽合成。
本发明之多肽含有129个氨基酸残基(位置1至129)以及位在氨基端具有17的残基的信号肽(位置-17至-1)。特定言之，位在本发明多肽位置-1之氨基酸残基系Ala，其与其他已知Der p 2变体中的Arg不同，而位在本发明多肽位置26之氨基酸残基系Ser，其与其他已知变体中的Pro不同。更特定言之，在与特定已知变体Der p 2.0101相较时，本发明之多肽包含四个氨基酸变化，亦即，Arg(-1)至Ala(-1)、Pro 26至Ser26、Thr 47至Ser 47、及Asp 114至Asn 114。
用于本文中之基因工程相关技术，诸如，聚核苷酸合成、聚合酶链式反应(PCR)、克隆、载体构建、细胞转化、蛋白表达、肽合成及纯化，皆系所属技术领域的技术人员所熟知者，已描述于，例如，Int Arch Allergy Appl Immunol 1990；91(2)：118-23(Chua KY，Doyle CR，Simpson RJ，Turner KJ，Stewart GA，Thomas WR.Isolation of cDNA coding for the major mite allergen Der p II by IgE plaque immunoassay.Int Arch Allergy Appl Immunol1990；91(2)：118-23.)。
本发明在下列实例中显示，过敏病患对于本发明之多肽具有相较于习知Der p 2变体之较高反应性。本发明之多肽因此可用于诊断及治疗针对家尘螨之过敏。
因此，在另一态样中，本发明提供一种诊断个体对家尘螨之过敏的方 法，其包含检测该个体是否会与本发明之多肽产生反应。特定言之，该个体系罹患气喘、鼻炎、鼻窦炎、湿疹、过敏性皮炎、过敏、结膜炎、及/或血管性水肿。
在一具体实例中，该检测系使用活体外之免疫分析进行。术语「免疫分析」系指一种生物化学试验，其可根据抗体与其抗原间特定交互作用之反应，测定物质在生物样本中之浓度或存在。该等分析之方法系所属技术领域的技术人员所习知。免疫分析之典型实例包括，但不限于，点渍免疫分析、放射免疫分析(RIA)、酵素免疫分析(EIA)、以及颗粒凝集免疫分析。
特定言之，根据本发明，该免疫分析系在取自该个体之样本上进行，测定该样本是否带有对本发明多肽具有反应性之抗体。更特定言之，该样本系取自该个体之血清。又更特定言之，待测定之抗体系IgE。
在一特定实例中，本发明之方法包含将本发明之多肽施用至一硝基纤维素膜上，将取自人类之血清加至该膜并使其共置一段时间，清洗该膜，将放射标记之抗人类IgE加至该膜并使其再共置一段时间，清洗该膜，自该膜发展出信号并以适当装置测量之，再根据所测量之信号判定该个体是否可与该多肽产生反应。如该个体可与该多肽产生反应，则可确认该个体对家尘螨过敏。
在另一具体实例中，依据本发明所进行的检测是使用皮肤点刺试验。皮肤点刺试验常用于测定过敏，通常是将少量之疑似过敏原置于需要该试验之个体皮肤上，接着点刺该皮肤以使该过敏原导入皮肤表面下。接着观察该皮肤之发炎反应，例如，该位点之肿胀及发红现象。皮肤点刺试验之方法系所属技术领域的技术人员所习知。
在一特定实例中，本发明之方法包含将SEQ ID NO：1之多肽置于该个体之皮肤上，点刺该个体之皮肤，观察该皮肤上是否产生发炎反应(如，搔痒、红斑、丘疹、及发红反应)，测量该发炎反应之面积，以及根据该测量面积之大小而判定该个体是否可与该多肽产生反应。如该个体可与该多肽产生反应，则可确认该个体对家尘螨过敏。特定言之，可将本发明之 多肽溶于正常盐水中，将一滴多肽溶液加至个体前臂之手掌，并以抛弃式刺血针点刺该皮肤。更特定言之，尺寸大于3mm×3mm之丘疹视为该皮肤点刺试验之阳性反应。
在又另一方面，本发明提供一种用于上述方法之组合物或试剂，其包含SEQ ID NO：1之多肽。本发明之组合物或试剂组合物或试剂可被轻易制备，例如，借着混合该多肽及适当的稀释剂(诸如，盐水)。
已知过敏性疾病可用特异性减敏免疫疗法(SIT)治疗，其包括投与渐增剂量之启动过敏反应的过敏原，因而可在该病患体内导致对该物质之逐渐减敏。
因此，本发明尚提供一种疗或预防个体之过敏性疾病的方法，其包含对该个体投与SEQ ID NO：1之多肽。较佳者，该过敏性疾病系与家尘螨有关，其包括，但不限于，气喘、鼻炎、鼻窦炎、湿疹、过敏性皮炎、过敏、结膜炎、及/或血管性水肿。
因此，另一方面，本发明系关于一种医药组合物，其包含有效量之本发明多肽，以及医药可接受之赋形剂。本发明之医药组合物可用于上述之治疗中。
在制备本发明之医药组合物时，作为活性成分之本发明多肽通常系以赋形剂稀释及/或包纳于载体中，该载体之形式可为胶囊、小袋、纸、或其他容器。所用之赋形剂一般而言系适于对人类个体或其他哺乳动物进行投与之赋形剂。适当赋形剂之部分实例包括，但不限于，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯啶酮、纤维素、水、糖浆、及甲基纤维素。此外，本发明之医药组合物可为锭剂、丸剂、粉末、悬浮液、乳液、溶液、糖浆、气溶胶(呈固体或在液态基质中)、油膏、胶囊、或无菌包装粉末之形式。再者，本发明之医药组合物可以适当途径投与至个体中，诸如，口服途径或肠外途径。
在一特定具体实例中，本发明之医药组合物系一种疫苗，其用于针对过敏性疾病之预防性治疗。疫苗接种之原则及实施皆为所属技术领域的技 术人员所熟知，已描述于，例如，Int Arch Allergy Immunol 2006；139：332-345(Weiss R，Scheiblhofer S，Gabler M，et al.Is genetic vaccination against allergy possible？Int Arch Allergy Immunol 2006；139：332-345.)。
此外，上述本发明之聚核苷酸或重组核酸可以DNA疫苗之形式投与至一个体。因此，本发明尚提供一种DNA疫苗，其包含聚核苷酸，该聚核苷酸系由编码SEQ ID NO：1之氨基酸序列之核苷酸序列构成，或是一重组核酸，该重组核酸包含编码SEQ ID NO：1之氨基酸序列之核苷酸序列，如前所述。较佳者，该核苷酸序列系SEQ ID NO：2。DNA疫苗之制备及其疫苗接种系所属技术领域的技术人员所熟知，已描述于，例如，Nat Med.1996May；2(5)：540-4(Hsu CH，Chua KY，Tao MH，Lai YL，Wu HD，Huang SK，and Hsieh KH.Immunoprophylaxis of allergen-induced immunoglobulin E synthesis and airway hyperresponsiveness in vivo by genetic immunization.Nat Med.1996May；2(5)：540-4.)。
本发明现将参照下列之具体实例进行更具体之叙述，该等具体实例系因说明而非限制之目的而提供。
实施例1：分离Der p 2变体T之cDNA
以IgE噬菌斑放射免疫分析，使用台湾气喘儿童血清筛选欧洲尘螨(D.pteronyssinus)λgt11cDNA库，分离新颖Der p 2变体T蛋白之cDNA。在37℃下，同时给予剧烈震荡，使宿主大肠杆菌株Y1090在添加2％麦芽糖及10mM MgSO4之Luria-Bertani(LB)培养液中生长。离心隔夜饱和之培养物，接着温和地再次悬浮于0.5倍体积之10mM MgSO4中。就各个含有固化LB琼脂之150mm培养皿，使300μl之Y1090隔夜饱和培养物与10,000pfus之λ-gt11噬菌体在室温下共置培育30分钟(不予震荡)，接着以7-7.5ml之0.7％上层琼脂(top agar)置于LB琼脂上。在上层琼脂固化后，将培养皿置于42℃下3小时。在可见噬菌斑时，将浸泡异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)之硝基纤维素膜置于各个培养皿上，并继续置于37℃下隔夜。自培养皿移除该等膜，并在室温下以10mMTris-HCl、0.15M NaCl、0.05％Tween-20，pH 7.5(TBST)清洗三次，每 次5分钟。以TBST中之5％脱脂牛奶对该等膜进行阻断1小时，再以TBST清洗三次。在4℃下，使血清与大肠杆菌萃取物以1∶1比例进行隔夜吸附反应，并离心澄清以降低抗大肠杆菌抗体之背景值。在4℃下，使血清与经牛奶阻断之膜隔夜共置。以经125I标记之小鼠单株抗人类IgE(Silenus Laboratories，Hawthorn，Victoria，Australia)，在室温下对该等膜进行显影2小时，接着以TBST清洗四次。在-80℃下，以增强屏板对该等膜进行放射照相两天。从该等150mm琼脂盘上切下阳性噬菌斑，再次涂盘于90mm培养皿上，并重复筛选流程，以确认阳性IgE反应性纯系。
最后，分离出新颖的Der p 2cDNA纯系。该cDNA分子编码一种新颖的Der p 2变体蛋白，称为「Der p 2变体T」(图1)。相较于Der p 2.0101(1989年所分离的第一种Der p 2)(图2，登录号P49278)之参照Der p 2蛋白序列，其含有四个多型性氨基酸。此等多型性残基包括Arg(-1)至Ala(-1)、Pro 26至Ser 26、Thr 47至Ser 47、以及Asp 114至Asn 114之氨基酸变化，并使其理论等电点由6.56(Der p 2.0101)升高至7.10(Derp 2变体T)。Der p 2变体T之所有多型性与八种已知变体的比较示于表1(参见上文)。
Der p 2变体之相关核苷酸及氨基酸序列以及其位置述于表3。
表3：关于Der p 2变体之核苷酸及氨基酸序列的叙述
*核苷酸及氨基酸之位置系对应于图1及2
除Ser26外，其他的残基变化在其他已知的Der p 2变体中以不同组合出现。Pro26Ser变化是Der p 2的一个新颖多型性残基，且至今未被揭示。Der p 2变体T之5′未翻译核苷酸序列与Der p 2.0101者相同。编码区域(开放读码框)含有数个多型性核苷酸变化，而3′未翻译核苷酸序列显示高度之变异(图3)。
实施例2：构建质粒及在大肠杆菌中表达Der p 2变体
以聚合酶链式反应(PCR)，使用正向引物pDp2-5′BamHI及反向引物pDp2-3′EcoRI，扩增编码两种成熟Der p 2变体之cDNAs。将PCR产物接合于pGEX-2T载体(Pharmacia，Uppsala，Sweden)之BamHI及EcoRI位点，并将该表达构筑体转化至大肠杆菌菌株TG1中。在30℃下，以0.1mMIPTG诱发融合蛋白生产1小时，再以谷胱甘肽琼脂糖(Sigma，St.Louis，MO，USA)亲和层析纯化，以先前针对Der p 2.0101所述的方法进行(Chua KY，Doyle CR，Simpson RJ，Turner KJ，Stewart GA，Thomas WR.Isolation of cDNA coding for the major mite allergen Der p II by IgE plaque immunoassay.Int Arch Allergy Appl Immunol 1990；91(2)：118-23.)。重组蛋白系以融合谷胱甘肽S-转移酶(GST)之融合蛋白形式制备。所有之引物序列示于表3。
表3：用于构建表达质粒之引物
*画有底线的序列是指限制酶位点
将编码成熟Der p2.0101及Der p2变体T之cDNA亚克隆至pGEX-2T之BamHI及EcoRI位点，并在大肠杆菌菌株TG1中以融合GST之融合蛋白形式表达。如所述方法，使用谷胱甘肽琼脂糖珠由可溶级份中对GST融合蛋白进行亲和纯化，再以SDS-PAGE及银染进行检验(图4)。
实施例3：构建质粒及在毕氏酵母中表达Der p 2变体T
以聚合酶链式反应(PCR)，使用正向引物pDp2-5′KEX2及反向引物pDp2-3′EcoRI(表3)，由质粒pGEX-2T-Der p 2(Ball T，Sperr WR，Valent P，Lidholm J，Spitzauer S，Ebner C et al.Induction of antibody responses to new B cell epitopes indicates vaccination character of allergen immunotherapy.Eur J Immunol 1999；29(6)：2026-36.)扩增成熟Der p 2变体之cDNAs。使用5′XhoI及3′EcoRI位点进行由pPIC9载体中之醇氧化酶基因(AOX1)启动子所驱动之α-因子信号序列的定向合框克隆(directional in-frame cloning)。PCR反应系以pfu DNA聚合酶进行，并对该pPIC9中之插入物进行完整定序。pPIC9载体提供进行分泌用之α-交配因子信号以及进行重组纯系选择用之HIS4基因。以BglII使pPIC9-Der p 2.0101及pPIC9-Der p2变体T两者线性化，再如毕氏酵母表达操作手册(E版)(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中所述，以氯化锂法转化至毕氏酵母菌株GS115中。将His+纯系进一步在两种不同之培养基上进行选择：一种以甲醇(MM)，而另一种则以葡萄糖(MD)作为唯一之碳源。在AOX1基因处产生同源重组之纯系在MM培养基中生长缓慢，且为Muts(甲醇使用缓慢)表型。选择该等Muts纯系进行蛋白表达之筛选。
一般而言，在甲醇诱发4小时后，由考马斯亮蓝(Coomassie blue)染SDS-PAGE，可检测到可溶性分泌重组Der p 2蛋白。蛋白生成继续延长至96小时，而最佳产率则在诱发后48小时取得。接着以阳离子交换层析法，将重组Der p 2蛋白纯化至匀质。
实施例4：由毕氏酵母表达系统纯化Der p 2变体
将含有重组Der p 2.0101或Der p 2变体T之酵母菌培养基加至经20mM醋酸钠(pH 5.5)平衡的Sephadex G25分子筛管柱(5×20cm)。收 集含重组Der p 2的级份，将其加至经前述缓冲液平衡的SP-琼脂糖管柱(2.6×15cm)。以600ml的0至500mM氯化钠线性梯度溶液对链接的蛋白进行溶析。以透析法将含有三种二硫键经破坏的Der p 2突变物之培养基平衡至20mM醋酸钠(pH 5.5)。以12,000g离心10分钟除去沈淀物。使用Hi-Trap SP-琼脂糖管柱(5ml，Pharmacia)进行突变物之纯化。以50ml之0至1M氯化钠梯度溶液对连结的蛋白进行溶析。以SDS-PAGE及银染法检验重组Der p 2之纯度，如图4所示。以摇瓶培养法所取得之重组Der p 2.0101及Der p 2变体T的终产率大于500mg/L。
此外，以N-端肽定序判定，该两种重组Der p 2蛋白皆起始于+1位置。这表示在酵母菌信号肽及Der p 2第一残基之间所设计的接合有产生正确辨识及加工。
本发明中在甲基营养性酵母菌毕氏酵母中成功制备大量优良质量的重组Der p 2变体。相较于酿酒酵母(S.cerevisiae)，使用毕氏酵母具有数种优势。首先，在毕氏酵母中所制备之蛋白的高糖基化情形较少。第二，在毕氏酵母中添加至蛋白上的寡醣链长度较酿酒酵母中者短很多。第三，酿酒酵母之核寡醣具有终端之α-1，3-甘露糖连结，而毕氏酵母则无。由毕氏酵母所制备的蛋白缺乏抗原性α-1，3-甘露糖连结，因此更适于进行诊断及治疗应用，并亦适于进行活体外的动物实验。至今，此种表达已被诸多研究者成功使用，以极高之产率制备异源蛋白(Schmidt M，Hoffman DR.Expression systems for production of recombinant allergens.Int Arch Allergy Immunol 2002；128(4)：264-70.)。本发明利用毕氏酵母表达系统，以高产率制备可溶性重组Der p 2，并避免重组蛋白之内毒素污染。大量的重组Der p 2蛋白非常有助于活体内及活体外之免疫研究。
实施例5：人类IgE免疫点渍
由台大医院(台北，台湾)小儿科过敏门诊之谢贵雄教授提供取自经医师诊断为气喘之儿童(年龄为7至15岁)(并未接受免疫治疗)的50份血清样本。
以先前所述之操作流程进行IgE点渍免疫分析(Greene WK，Chua KY， Stewart GA，and Thomas WR.Antigenic analysis of group I house dust mite allergens using random fragments of Der p I expressed by recombinant DNA libraries.Int Arch Allergy Appl Immunol.1990；92(1)：30-8.)。将2μg纯化GST-Der p 2.0101、GST-Der p 2变体T、及GST蛋白(阴性控制组)以双重试验加至硝基纤维素膜上。以欧洲尘螨萃取物(每点5μg)作为阳性控制组。图5(A)显示加至膜上的蛋白样本的位置。接着以TBST清洗膜三次，并在室温下以TBST中之5％脱脂牛奶对膜进行阻断1小时。以TBST清洗三次后，以TBS对过敏性气喘儿童之血清(组1)进行1∶5稀释，再在4℃下与点渍进行共置12-16小时。在室温下与二级抗体，经125I-标记之小鼠单株抗人类IgE(Silenus Laboratories)，进行共置1小时。在以TBST清洗四次后，以放射照相显影反应信号。以GS-700光密度计扫描底片，并以分子分析(Molecular Analysis)软件(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)进行分析。使用SPSS，11.0.1版(SPSS Inc.，Chicago，IL)测定统计差异。使用斯皮尔曼等级法(Spearman’s rank method)分析相关性。将小于0.05之P-值视为统计显著性。
如图5B所示，病患34、31、及31之血清分别与GST-Der p 2.0101、GST-Der p 2变体T、及欧洲尘螨萃取物有阳性反应。未无记录到与单独之GST蛋白的反应性。部分血清(如，病患3及4之血清)显示与GST-Derp 2变体T有较高反应性；而其他血清(如，病患6及31之血清)则显示与GST-Der p 2.0101有专一反应性。在此组血清中，光密度分析显示GST-Der p 2变体T相较于GST-Der p 2.0101有显著较高的IgE反应性(P＝0.037)(图5C)。换言之，相较于Der p 2.0101变体，Der p 2变体T显示与显著较多数目的试验血清有较高的IgE反应性。以上结果亦由对气喘儿童所进行之皮肤点刺试验获得验证(参见下文)。
实施例6：皮肤点刺试验
根据先前所述之流程，对九名气喘儿童进行皮肤点刺试验(Kuo IC，Cheong N，Trakultivakorn M，Lee BW，and Chua KY.An extensive study of human IgE cross-reactivity of Blo t 5and Der p 5.J Allergy Clin Immunol.2003Mar；111(3)：603-9.)。将纯化的GST-Der p 2.0101及GST-Der p 2变 体T蛋白溶于正常盐水中，并以25μg/ml之浓度进行皮肤点刺试验。将一滴10μl之蛋白溶液加至个体前臂之手掌，并以抛弃式刺血针点刺该皮肤。以组氨酸(1mg/ml)及正常盐水作为阳性及阴性控制组。30分钟后测量丘疹及红斑之长度及宽度。将减去阴性控制组后尺寸大于3mm×3mm之丘疹反应视为阳性皮肤反应。该等结果示于表4。
表4：九名气喘儿童之Der p 2变体皮肤点刺试验
-：阴性皮肤点刺试验反应
*：仅显示Der p 2变体T阳性反应性之个体
如表4所示，试验个体对于GST-Der p 2变体T之皮肤反应性高于GST-Der p 2.0101的皮肤反应性，且其中四名气喘儿童(个体5至8)仅与Der p 2变体T产生反应。
本申请案中所引述之所有刊物及专利文件皆为所有目的而以其全文并入作为参考，其范围如同各刊物或专利文件皆个别标记。
在本发明之说明及附随的权利要求中，除非基于表示语法或必要的含意而在内文有特别指明，否则“包括(comprise)”或其变化词如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”在此使用为包含在内的语意，也 就是表示所描述的特征的存在，但不排除在本发明的各种具体实施例存在或加入进一步的特征。
所有的参考文献，包括任何专利或专利申请案，在此说明书中引述者，均全文并入做为参考文献。不表示任何参考文献构成了前案。此等参考文献的讨论是陈述作者的声明事项，而申请人保留讨论所引文件的正确性及切合性的权利。将可清楚了解的是，虽然此处引用数篇先前公开文献，但并非在澳洲或其他国家构成承认此等文件之任何之一者形成所属技术领域的公知常识的部分。
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Claims (20)
1.一种聚核苷酸，其由编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列构成。
2.如权利要求1所述的聚核苷酸，其中该核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
3.一种重组载体，其包含编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的重组载体，其中该核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
5.如权利要求3所述的重组载体，其为表达载体。
6.如权利要求4所述的重组载体，其为表达载体。
7.一种转基因生物，其包含如权利要求1或2所述的聚核苷酸，或是如权利要求3至6中任一项所述的重组载体，其为细菌、或真菌。
8.如权利要求7所述的转基因生物，其为大肠杆菌（Escherichia coli）、乳酸杆菌（lactobacilli）、或双歧杆菌（bifidobacteria）。
9.如权利要求7所述的转基因生物，其为酵母菌细胞。
10.如权利要求9所述的转基因生物，其为毕氏酵母。
11.如权利要求7所述转基因生物，其为多细胞真菌。
12.如权利要求11所述的转基因生物，其为蘑菇。
13.如权利要求12所述转基因生物，其为金针菇。
14.一种多肽，其由SEQ ID NO:1的氨基酸序列所组成。
15.一种诊断个体对家尘螨的过敏的组合物，其包含如权利要求14所述的多肽以及稀释剂。
16.一种医药组合物，其包含如权利要求14所述之多肽，以及医药可接受之赋形剂或载体。
17.如权利要求16所述的医药组合物，其可用于治疗或预防个体的过敏性疾病。
18.如权利要求17所述的医药组合物，其中该过敏性疾病是与家尘螨有关。
19.如权利要求17所述的医药组合物，其中该过敏性疾病是气喘、鼻炎、鼻窦炎、湿疹、过敏性皮炎、过敏、结膜炎、或血管性水肿。
20.如权利要求16所述的医药组合物，其为疫苗的形式。
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