CN109939227B

CN109939227B - 一种豚草花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法

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Publication number: CN109939227B
Application number: CN201910204890.0A
Authority: CN
Inventors: 周俊雄; 尹佳; 高亚娜; 王茜; 文利平; 路蒨; 支玉香
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2018-03-23
Filing date: 2019-03-18
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2039-03-18
Also published as: CN109939227A

Abstract

本发明涉及一种豚草花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法，该豚草花粉变应原浸液，其含有豚草花粉变应原含如SEQ ID NO.4‑SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。该浸液经豚草花粉收集、干燥、脱脂、提取、超滤浓缩、冷冻干燥、复溶等工艺方法制得，其主要组分为豚草花粉变应原，甘油，氯化钠等。该豚草花粉变应原浸液具有特异性高的特点，豚草致敏蛋白组分提取充分，总生物效价稳定，有效期长，无菌效果好；其原液可有效用于变态反应疾病的皮肤点刺试验诊断、经适当稀释后(10^‑2～10^‑20)可用于体外嗜碱性粒细胞活化试验诊断、皮内试验诊断及特异性免疫治疗，可有效诊断由豚草花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。

Description

一种豚草花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种豚草花粉标准化变应原浸浸提物、其液及其制备方法。

背景技术

人们对变态反应疾病的认识始于“花粉热”，花粉热又称过敏性鼻炎。1911年Noon和Freeman首次利用花粉提取液来治疗花粉热，变态原疾病治疗的历史从此开始。目前，变态反应性疾病是全球性重大卫生问题之一。工业化国家超过25％的人口被变应性哮喘、变应性鼻结膜炎及变应性皮炎困扰，其中以变应性哮喘最为常见。吸入致敏花粉是引发变应性哮喘及其他呼吸道变态反应性疾病的最重要因素。VRTA—L.A等调查发现近50％的变态反应性疾病患者对草类花粉过敏。

豚草(Ambrosia artemisiifolia L)为菊科，豚草属，原产于北美洲，现已传播世界各地。70年代中期传入我国，现在我国大部分地区如辽宁，河北，山东，湖北等都大面积生长。在我国满是的豚草有两种，一种为豚草，又名艾叶破布豚草；另一种为三裂叶豚草，又名大破布豚草，此类植物为有害莠草，是世界上多数地区秋季花粉症的首要病原物。豚草花旗每年的7月下旬-9月中旬，其特点芬粉量大，借助风力传播授粉，蔓延得极快，在雾化器空气中芬粉量极高。

张春梅的《过敏性疾病患者多种过敏原特异性IgE分析》指出单价吸入物过敏原阳性，豚草占28.38％；于斌的《青岛地区豚草花粉症85例》研究表明在502例花粉症患者中，85例为屯才花粉症，占16.93％；鹿道温的《青岛地区空气中豚草等常见花粉及其致敏性的调查》指出豚草成为青岛地区主要的致敏花粉，通过624例皮试实验，豚草花粉的阳性率占67.7％；那美玲的《黄石地区豚草花粉分布及临床致敏性研究》指出豚草花粉有很强的致敏性，单纯豚草花粉阳性率为17％，合并豚草花粉阳性率为45％；杨炯的《武昌地区豚草花粉症研究》指出210例花粉症患者的发病患者中，豚草花粉抗原皮试阳性率为57.6％；边艳芬的《大同地区240例花粉症抗原皮试及临床分析》指出240例花粉症患者中，豚草花粉致敏86例，占35.8％；胡颖钊的《豚草花粉症及其相关因素调查》指出豚草为黄石地区主要致敏花粉之一，2000年时皮试阳性率已经高达65.8％；时海波的《大学生豚草花粉症流行病学调查》表明大学生豚草花粉的致敏率为9.2％,昆明(15.4％)和武汉(13.9％)的致敏率较高,其次为西安(7.5％)、广州(6.6％)、南京(5.1％)；王晓红的《哈尔滨地区空中花粉与花粉过敏症》指出三年1047例花粉过敏患者中，豚草花粉过敏患者占17.86％；李静的《呼市地区五年内夏秋季节气传花粉飘散量变化与花粉症相关分析》探讨呼和浩特市花粉症患者主要致敏原，其中豚草花粉占42.57％。

以上豚草花粉流行病学调查研究显示，豚草花粉过敏广泛分布在我国各地，在北方地区豚草花粉是花粉过敏的主要致敏原。进行豚草花粉变应原特异性免疫治疗(allergen specific immunotherapy,SIT)需要豚草花粉体内诊断制剂和治疗制剂。现在变应原特异免疫治疗的方法主要分为皮下注射给药免疫治疗和舌下给药免疫治疗。皮下注射给药免疫治疗已有100多年历史，其安全性和有效性已经被得到证明。上世纪90年代初，变应原舌下滴剂疫苗诞生，1998年，WHO宣布了变应原舌下滴剂疫苗安全和有效。

但是舌下给药免疫脱敏的方式相比皮下注射免疫给药，治疗周期长，短时间内疗效不显著，平均脱敏周期3-5年。在一个治疗周期中，舌下给药方式免疫脱敏给药量是皮下注射给药量的100倍。所以皮下注射给药免疫脱敏的方式相比舌下给药，虽然病人依从性差，但是治疗周期短，见效快，治疗费用低。所以两种给药方式是相辅相成。目前，用于豚草花粉变应原的作为皮下注射免疫制剂的稳定性差，蛋白含量和生物效价都会随时间下降，成分不确定试剂存放一定时间后用于诊断豚草花粉诱发的变态反应疾病时，阳性率降低，准确性低。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种含豚草花粉变应原浸液，该浸液具有于特异性高，豚草致敏蛋白组分提取充分且比例恒定，总生物效价稳定，有效期长的特点。其可有效用于变态反应疾病的皮肤点刺试验诊断及特异性免疫治疗，可有效诊断由豚草花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种豚草花粉变应原浸物，其含有三裂叶豚草花粉变应原蛋白Amb t 1.04’、Ambt 1.05’、Amb t 8’Amb t 10、Amb t 11和Amb t 12；所述Amb t 1.04’含有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，所述Amb t 1.05’含有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，所述Amb t8’含有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，所述Amb t 10含有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，所述Amb t 11含有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，所述Amb t 12含有如SEQ IDNO.9所示的氨基酸序列。

一种豚草花粉变应原浸液，，优选地，所述变应原浸液中含有如上所述的豚草花粉变应原浸提物、体积比为0.2～0.4％的苯酚，体积比为45～55％的甘油和4.5～5.5g/L的NaCl，其pH值为6.0～8.0。

如上所述的豚草花粉变应原浸液，优选地，所述豚草花粉变应原的活性浓度为50000～200000BAU/ml，所述豚草花粉变应原浸液的总蛋白浓度0.32～1.28mg/ml。

进一步地，通过SDS-PAGE和Western Blotting检测，所述豚草花粉变应原的蛋白分布主要在10kDa、14kDa、18kDa、37kDa、38-42kDa、43.8kDa、48kDa、52kDa、68kDa。

如上所述的豚草花粉变应原浸液的制备方法，其包括如下步骤：

S1、采集豚草花粉，常温干燥真空干燥或流化床干燥；

S2、对干燥后的花粉脱脂、干燥；

S3、将脱脂干燥后的豚草花粉按重量g体积ml比1:50～1:10加入pH为7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2-8℃搅拌22～26h进行浸提；

S4、取步骤S3后的浸提液，离心取上清液；将上清液过滤及除菌过滤；

S5、将过滤后的上清液进行超滤浓缩，获得超滤浓缩液；

S6、将所述超滤浓缩液经过二次过滤和除菌过滤后，真空冻干获得豚草花粉变应原冻干品；

S7、将所述豚草花粉变应原冻干品用pH 6.5～7.5磷酸盐—盐水缓冲液复溶配置为豚草花粉变应原原液，2～8℃放置，与等体积灭菌的甘油混匀，调节溶液pH值至6.0～8.0。如上所述的制备方法，优选地，在步骤S2中，所述花粉脱脂采用花粉与丙酮以1：5～1:1的重量g体积ml比进行脱脂处理，重复脱脂至上层液体澄清。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S4中，所述离心的条件为8000～12000g，离心温度2～8℃，时间为15～20分钟；所述过滤及除菌过滤为先用4000目滤布过滤后，再通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S5中，所述超滤浓缩用3KD超滤膜超滤，当超滤透过液总蛋白含量≤0.02mg/ml，停止超滤；当超滤透过液总蛋白含量>0.02mg/ml，更换超滤膜之后对超滤透过液重复超滤，直至超滤透过液总蛋白含量≤0.02mg/ml为止。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S6中，所述真空冻干的条件为-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％。

如上所述的制备方法，优选地，所述步骤S1还包括对原料豚草花粉进行镜检鉴别和/或DNA鉴定的步骤，其中DNA鉴定方法为，以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2为引物，对鉴别豚草原料进行PCR扩增，并检测扩增产物。

如上所述的制备方法，优选地，所述磷酸盐—盐水缓冲液包括4.5～5.5g/L的氯化钠，0.03％～0.05％的磷酸二氢钾，1.5％～2％十二水合磷酸氢二钠，0.2％～0.4％的苯酚，调pH为7.9～8.2。

在制备豚草花粉变应原浸提液时，发明人尝试了多种浸提液，并且比较了它们的浸提效率。所使用的浸提液包括：生理盐水、pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、pH8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、pH8.2的coca’s液、pH8.9的Tris-盐酸缓冲液、pH为7.9～8.2的含有0.5％～1％的氯化钠及0.03％～0.05％的磷酸二氢钾，1.5％～2％十二水合磷酸氢二钠，0.2％～0.4％的苯酚等。实验结果证实，使用pH为7.9～8.2的含有4.5～5.5g/L的氯化钠及0.03％～0.05％的磷酸二氢钾，1.5％～2％十二水合磷酸氢二钠，0.2％～0.4％的苯酚的浸提效率较高，且制备的豚草花粉变应原浸液可长期有效的保存，稳定性高。

本发明还提供一种豚草花粉变应原冻干品，其由包括豚草花粉收集-干燥-脱脂-提取-超滤浓缩-冻干的步骤制得：

(1)收集：用自然脱落法收集豚草花粉；

(2)干燥：常温干燥真空干燥或流化床干燥，直至花粉不再粘附，将干燥后的花粉过150-250目分样筛；

(3)脱脂：将(2)所得到的花粉与丙酮分别按g与ml计，以1：5～1:1的重量体积比进行脱脂处理，振荡脱脂30分钟后，静置分层，倒出上层液，加入新的丙酮，重复脱脂至上层液体澄清，将脱脂后的花粉均匀摊开，室温下干燥48小时至72小时；

(4)提取：将脱脂干燥后的豚草花粉按重量体积比1:50～1:10加入10L，pH 7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2-8℃搅拌22～26h进行浸提；取提取后的浸提液，在离心力8000～12000g，离心温度2～8℃，时间设定为15～20分钟，进行离心，收取上清；先用4000目滤布过滤后，将滤液依次通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤；

(5)超滤浓缩：将过滤后的浸提液，用3KD超滤膜超滤，取样超滤浓缩液、超滤透过液，检测其总蛋白含量；其中，当超滤透过液中总蛋白含量≤0.02mg/ml，则直接排弃透过液；超滤透过液总蛋白含量>0.02mg/ml，则对超滤膜进行完整性测试，超滤膜未破损，则排弃透过液；若超滤膜破损，则更换超滤膜之后对透过液重复超滤；

(6)冻干：将超滤浓缩液经过二次过滤和除菌过滤后，按照冻干工艺条件，-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％，获得豚草花粉变应原冻干品。

如上所述豚草花粉变应原浸提物、豚草花粉变应原浸液及所述的豚草花粉变应原冻干品的应用，用于在制备诊断变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗制剂中的应用，所述诊断变态反应疾病包括过敏性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎和慢性荨麻疹。

进一步，所述豚草花粉变应原浸提物冻干品用于制备成片剂、口崩片，所述豚草花粉变应原浸液用于制备注射液、舌下滴剂、变应原斑贴剂、变应原浸液稀释液。

本发明提供的豚草花粉变应原浸液用于制备治疗豚草花粉过敏性疾病的药物使用。

具体而言，采用本发明提供的豚草花粉变应原浸液或冻干品按治疗有效量或诊断有效量的豚草花粉变应原、以及药学上可接受的载体可制备用于治疗豚草花粉过敏性疾病的药物。

用于治疗豚草花粉过敏性疾病的药物可以制成各种医学上可接受的剂型，并可由医师根据患者年龄、体重和大致疾病状况等因素确定对病人有益的剂量进行施用。用于治疗豚草花粉过敏性疾病的药物的剂型选自口服剂、(皮下)注射剂、舌下含服剂、气雾剂、鼻腔剂、或皮肤点刺剂等液体剂型；优选(皮下)注射剂、舌下含服剂、或皮肤点刺剂。其中，(皮下)注射剂、舌下含服剂一般是作为特异性免疫治疗时常用的剂型，而皮肤点刺剂是作为体内变应原检测时常用的剂型。

当采用本发明豚草花粉变应原浸液应用于诊断由豚草花粉引起的过敏性疾病时(即变应原皮肤点刺诊断试验)，除了本发明豚草花粉变应原浸液外，一般还应包括阴性对照液、阳性对照液、以及点刺针。阴性对照液一般为对人体无过敏性反应的液体(例如甘油与盐溶液的混合物等)，阳性对照液一般为1.0～5.0mg/ml的磷酸组胺/盐酸组胺溶液。

本发明制备的豚草花粉变应原浸液可应用于斑贴试验中。其原理为：将可疑致敏物质(变应原)敷贴于患者皮肤上，通过皮肤或粘膜进入机体后由抗原呈递细胞将抗原呈递给T淋巴细胞，使特异性T淋巴细胞活化，诱发炎症反应。

本发明的有益效果在于：

1、豚草作为北方地区主要花粉过敏原，本发明提供的豚草花粉标准化变应原浸液可以有效诊断由豚草花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。

2、加入稳定剂甘油，提高了稳定性和缓释作用，提高了用药的有效性和安全性。

3、变态反应疾病皮下注射免疫脱敏给药方式，相比舌下含服滴剂给药方式，见效快，周期短。整个治疗周期给药剂量远小于舌下滴剂给药量(约100倍)，其治疗费用远小于舌下滴剂给药免疫脱敏，减轻患者的医疗负担。

4、本发明通过使用制备的应变原浸液以原液做点刺试验分别与变态反应专科医生临床综合特异性诊断和血清特异性IgE(specific IgE,sIgE)诊断进行对比，评价皮内试验结果与临床综合特异性诊断及与血清sIgE的诊断结果一致、具有较好的灵敏度和特异度，安全性好。

5、本发明通过使用制备的变应原浸液以1：10³～10⁸稀释后做体外嗜碱性粒细胞活化试验，能临床特异性诊断豚草过敏患者，避免部分体外sIgE检测假阳性，同时也能避免变应原皮肤试验(点刺或皮内)给部分豚草花粉过敏患者带来过敏性休克的风险。

本发明提供的豚草花粉变应原浸液具有特异性高的特点，豚草致敏蛋白组分提取充分，总生物效价稳定，有效期长，无菌保证好；可有效用于变态反应疾病的皮肤点刺试验诊断及特异性免疫治疗，可有效诊断由豚草花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。可实现标准化控制，使用有效期有效延长，能带来较好的经济效益。

本发明方法通过冻干复溶后得到的浸液，相比北京协和医院研制的豚草花粉变应原注射原液更稳定，生物效价和蛋白含量都比较稳定，且效期为3年。

附图说明

图1为豚草花粉原料ITS2序列PCR电泳结果。

图2为不同批次豚草花粉不同脱脂时间脂肪含量变化趋势。

图3为豚草花粉浸液总蛋白含量与浸提时间的关系。

图4为豚草花粉变应原浸液SDS-PAGE蛋白电泳结果(示意成分鉴别)。

图5为豚草花粉变应原浸液与豚草过敏患者血清Western Blotting反应检测结果(示意豚草变应原成分鉴别)。

图6为豚草花粉变应原浸液产品pH值在长期稳定性试验中的测试结果。

图7为豚草花粉变应原浸液产品苯酚含量在长期稳定性试验中的测试结果。

图8为豚草花粉变应原浸液产品甘油含量在长期稳定性试验中的测试结果。

图9为豚草花粉变应原浸液产品氯化钠含量在长期稳定性试验中的测试结果。

图10为豚草花粉变应原浸液产品总蛋白含量在长期稳定性试验中的测试结果。

图11为豚草花粉变应原浸液产品总应变原活性在长期稳定性试验中的测试结果。

图12为豚草花粉变应原浸液产品主要致敏蛋白在长期稳定性试验中的测试结果。

图13为豚草变应原浸液与豚草变应原注射液医疗机构制剂品种稳定性WesternBlotting对比研究

图14为豚草花粉变应原浸液产品应用于临床豚草花粉过敏患者体外嗜碱性粒细胞活化试验结果示例。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

1、豚草花粉DNA提取

采用天根快速DNA提取扩增试剂盒(天根生化KG203)。

提取方法：称取5mg豚草花粉样品置于1.5mL离心管中，加入Buffer 1100μl后用一次性研磨杵将样品彻底研碎后加入Buffer 2 100μl后震荡混匀，离心机12000r/min离心5min后取上清液于新的离心管中作为DNA模版备用。

2、引物设计及合成

引物序列如下：

Amb ITS2-F(SEQ ID NO.1)：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'

Amb ITS2-R(SEQ ID NO.2)：5'-TCCTC CGCTTATTGATAT GC-3'

引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。合成后分装-20℃保存。

3、PCR反应体系

PCR扩增试剂盒(天根生化)。对提取的DNA采用如下50μl体系的配制PCR反应体系见表1：

表1.豚草花粉ITS2序列PCR反应体系

4、PCR反应条件见表2.

表2.豚草花粉ITS2序列PCR反应条件

对PCR扩增后的反应液进行2％琼脂糖电泳，150V、100mA 20min电泳观察，电泳结果如图1所示。其中L1、L2、L3为3批豚草花粉PCR产物，L_mix是上述3批豚草花粉混合原料PCR产物，DNA Marker如图所示。结果显示，PCR产物在720bp左右。

5、测序

利用PCR产物纯化回收试剂盒(生工SK1141)，回收PCR产物进行测序，测序结果编号Amb ITS2，如SEQ ID NO.3所示。

6、豚草的显微镜检

豚草花粉显微镜下形态学鉴别：三裂叶豚草花粉球形。直径19(18～20)微米。极面观三裂圆形，赤道面观圆形；具3孔沟。

实施例2豚草花粉脱脂及浸提关健工艺步重要参数的确定

1、豚草花粉脱脂工艺步参数确定

(1)将豚草花粉(g)与丙酮(ml)以1：2的重量体积比(w/v)进行脱脂处理。对不同批次(不同采集时间)的豚草花粉不同脱脂时间样品进行脂肪含量进行检测，以确定最优的脱脂时间。

采用海能SOX500脂肪测定仪测定豚草花粉中脂肪含量，通过索式萃取及干燥称重的方法，对比萃前后花粉重量的变化，得到相对应的脂肪含量，并根据脂肪含量结果对之后脱脂后花粉进行质量控制.

结果见图2，可见丙酮脱脂时间为30min后，脂肪含量几乎不随脱脂时间延长而下降，因此脱脂时间确定为30min。

(2)脱脂参数的验证：对不同批次(不同采集时间)的豚草花粉进行30min脱脂后检测脂肪含量，结果如表3所示。

表3.不同批次豚草花粉脱脂30mi_n后脂肪含量降低百分比

从结果得知，豚草花粉中脂肪含量在1.5％～2％，故在之后脱脂过程中，脱脂后的豚草花粉在脂肪含量上应该下降1.5～2％。

2、豚草花粉蛋白浸提工艺步重要参数确定

(1)将豚草花粉(g)与丙酮(ml)以1：2的重量体积比(w/v)进行搅拌或振荡脱脂30分钟处理，静置分层，观察上层液体澄清情况，重复脱脂至上层液体澄清后，将脱脂后的花粉均匀摊开，室温下干燥48小时以上。

(2)将脱脂干燥后的豚草花粉按重量体积比1:10加入10L，pH 7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2～8℃，在搅拌速度为250rpm条件下，在搅拌时间分别为3h、6h、9h、12h、18h、24h、48h、72h等提取点时，将提取后的提取液，将浸提液全部加入到离心桶内，调节平衡，离心力8000～12000g，离心温度4℃，时间设定为15～20分钟，进行离心，收取上清。

(3)将离心分离后的上清液先用4000目滤布过滤后，通过纸板过滤，0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤；得到豚草花粉粗提取液。

取样以Bradford法测定蛋白含量，结果见“图3、豚草花粉浸液总蛋白含量与浸提时间的关系”。

如图3结果表明，在蛋白提取过程中，随搅拌提取时间延长，蛋白提取含量增大，提取时间24h含量达到最高1406±13μg/ml，可见蛋白类物质提取时间过长会影响其蛋白含量，故提取时间优选为22～26h左右。

实施例3豚草花粉原料工艺

1、花粉采集

自然脱落法，收集豚草花粉。常温或真空或流化床干燥，直至花粉不再粘附。将干燥后的花粉过150～250目分样筛，本实施例中优选为180目分样筛。

2、干燥

将花粉摊放于通风干燥处自然干燥，或真空干燥、或流化床干燥6～48h，直至花粉不再粘附。

3、脱脂

将上述所得花粉(g)与丙酮(ml)以1：5～1:1的重量体积比(w/v)进行脱脂处理。本实施例中优选为1：2。搅拌或振荡脱脂30分钟后，静置分层，观察上层液体澄清情况。倒出上层液，加入新的丙酮，重复脱脂至上层液体澄清。

4、再干燥

将脱脂后的花粉均匀摊开，室温干燥、或真空干燥、或流化床干燥6-48h。

5、杂质控制

(1)显微镜下用颗粒计数法测定，其中的杂质颗粒含量应满足如下标准：孢子含量≤1％，无关花粉含量≤2％，其它杂质含量≤10％。

(2)重金属及有害元素

总重金属≤50mg/kg；砷≤5mg/kg。

(3)丙酮残留

丙酮残留量≤0.5％(体积分数)。

实施例4豚草花粉变应原原液(冻干品)制备工艺

1、按实施例3豚草花粉原料工艺制备豚草花粉原料。

2、浸提

将脱脂干燥后的豚草花粉按重量体积比1:50～1:10加入10L，本实施例中优选为1：20，以pH 7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2～8℃搅拌22～26h进行浸提。其中以配制1000ml磷酸盐—盐水缓冲液(pH 8.2)为例的配方如表4。磷酸盐—盐水缓冲液充分溶解后除菌过滤，2～8℃放置，保存期不超过30天。

表4磷酸盐—盐水缓冲液(pH 8.2)配方

3、固液分离

取提取后的浸提液，将浸提液全部加入到离心桶内，调节平衡，离心力8000～12000g，离心温度2～8℃，时间设定为15～20分钟，进行离心，收取上清；

4、澄清

将离心分离后的上清液先用4000目滤布过滤后，将滤液依次通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤；

5、超滤、透析、浓缩

过滤后的浸提液，用3KD或1KD超滤膜切向流超滤，优选地，本实施例中用3KD超滤膜超滤。透析液选用25-125mM的NH₄HCO₃，本实施例中优选为50mM的NH₄HCO₃。根据蛋白含量质量标准，超滤浓缩至适当体积，检测蛋白含量至质量标准的总蛋白含量区间。取样超滤浓缩液、超滤透过液，检测其总蛋白含量。当超滤透过液中总蛋白含量≤0.02mg/ml，则直接排弃透过液；超滤透过液总蛋白含量>0.02mg/ml，则对超滤膜进行完整性测试，超滤膜未破损，则排弃透过液；若超滤膜破损，则更换超滤膜之后对透过液重复超滤。

6、无菌过滤

用0.22μm膜除菌过滤。

7、冻干

按照冻干工艺条件，-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％；获得豚草花粉变应原冻干品。

实施例5豚草花粉变应原浸液成品制备工艺

1、复溶

将按实施例4制备的豚草花粉变应原冻干品用磷酸盐—盐水缓冲液(pH6.5～7.5，配方见表5)复溶，至总蛋白含量位于质量标准2倍范围区间。2～8℃放置。

表5.磷酸盐—盐水缓冲液(pH值6.5～7.5)配制

2、半成品配制

原液复溶后，在净化车间内A级洁净条件下，将复溶液与等体积预先湿热灭菌(121℃、30分钟)并冷却的甘油混匀，调节溶液pH值至6.0～8.0。

3、半成品除菌过滤、无菌分装为成品

在净化车间内A级洁净条件下，将半成品通过0.22μm滤膜除菌过滤，无菌分装为成品，得到pH6.0～8.0浅黄色至棕色液体即为豚草花粉标准化变应原浸液成品。

实施例6豚草花粉变应原浸液成品质量控制

1、豚草花粉标准化变应原浸总蛋白成分SDS-PAGE法鉴别

采用还原型SDS-PAGE法，分离胶浓度为4～12％，考马斯亮蓝染色。结果如图3所示。M为Genstar M223-01Marker，R为冻干内部参考品(即冻干的豚草花粉变应原原液)，L₁，L₂和L₃为不同批次豚草花粉标准化变应原浸液，其蛋白分布主要在10kDa、14kDa、18kDa、37kDa、38-42kDa、43.8kDa、48kDa、52kDa、68kDa左右，其中鉴定的致敏蛋白分子量、过敏血清阳性率、对应全蛋白质谱鉴定肽段概览见表6。

2、豚草花粉标准化变应原浸总变应原成分Western Blotting法鉴别

采用还原型SDS-PAG电泳，分离胶浓度为4～12％，0.2μm PVDF ImmobilonR-PSQ转印膜，一抗血清反应稀释度1：3，室温杂交2h，随后置于4℃冰箱杂交过夜，1×PBST洗3次，10min/次。。二抗Ms mAb to Hu IgE(ab99806)1：1000室温杂交2h，1×PBST洗3次，10min/次。将ECL显影液A液和B液1:1混匀后曝光显色。

结果见图4所示。其中，M为Genstar Marker，R为内部参考品，N为浸液与健康受试者血清反应条带，P_1-24分别为浸液与28例临床确诊的豚草过敏阳性患者(sIgE≥3级，皮试≥+++，典型的夏秋季花粉症病史)血清反应条带结果，其中致敏Amb t 1.04’、Amb t1.05’、Amb t 6、Amb t 8、Amb t 10、Amb t 11、Amb t 12、Amb t X1、Amb t X2的分子量及过敏血清阳性率汇总如表6，由此确定血清阳性率最高的Amb t 1.04’(38-42kDa)、Amb t1.05’(43.8kDa)为豚草花粉的主要致敏蛋白(血清阳性率最高，为96.4％)。

3、致敏蛋白序列测定

本发明产品对相应致敏蛋白(见表6)进行了全蛋白序列测定，并对三裂叶豚草花粉原料中每一致敏蛋白对应mRNA进行了核苷酸全长测序，致敏蛋白代码、序列标识及氨基酸全长序列、对应mRNA全长序列结果详见表6。

其中本发明所含三裂叶豚草致敏蛋白的全序列依次为：

Amb t 1.04’致敏蛋白全序列为SEQ ID NO.4：

CCYILYFTLALVILLQPVRSAEDLQQILPSVNETRSLTTCEANNIIDKCWRCKPDWAENRKALADCAQGFAKGTIGGKMGDIYTVTSDLDDDVANPKEGTLRFGAAQNRPLWIIFARDMVIRLDKEMEVNNDKTIDGRGARVEIINAGFRIKEVKNVIIHNIYFHDINAQPGALVKRNEGPPRLRKGSDGDAISLDGCSQVWIDHCSLSKAFDGLVDAKLGTTRFTVSNSLFTQHQYVLLFWDFEETGMLGTVAFNKFTDHVDQRMPNCRHGFFQVVNNNYDRWGSYCIGGSAAPTILSQGNRFFAPDDPIKKNAVGRHGEAAQESMKWNWRSYNDLLENGAIFVASGVDPVLTPEQSEGMILAEPGEAVLRLTSSAGVLSCQPGAPC

Amb t 1.05’致敏蛋白全序列为SEQ ID NO.5：

MGIKHCCYILYFTLALVTLVQAGRLGEEVDILPSPNDTRRSLQGCEAHNIIDKCWRCKPDWAENRKALGDCAKGFGKGTYGGKGGDIYMVTSDQDDDVVNPREGTLRFGATQDRPLWIIFERDMIIYLQQEMVVTSDTTIDGRGAKVELVYGGITLMNVKNVIIHNLNIHDVRVLPGGLIKSSGGPAIPRYKSDGDAVHVTGSSDIWIDHCTLGNSFDGLVDVNWGSSSVTISNCKFERQDKAILLGASDTHFQDVKMHVTLAYNIFANTVHERMPRCRFGFTQIVNNFYDRWDKYAIGGSSNPTILSQGNKFVAPDNIYRKNVCLRTGAQEPEWMTWNWRTQNDLLENGAVFVASGSDPVLTAEQNAGMIQAEPGETVPQLTMNAGVLTCSPGAPC

Amb t 8致敏蛋白全序列为SEQ ID NO.6：

MSWQTYVDEHLMCDIEGTGQHLASAAIFGTDGNVWAKSTSFPELKPDEINAIIKEFSEPGTLAPIGLFLAGAKYMVIQGESGAVIRGKKGAGGICIKKTGQAMVFGIYEEPVNPGQCNMVVERLGDYLVDQGM

Amb t 10致敏蛋白全序列为SEQ ID NO.7：

MAPENNKLSIFPTDKEEITKIFNRFDTNGDGQISKEELFDILKSLGSDTSPDEVKRVMAEIDADGDGFISLDEFVLFCKGMEAEGDEMNDLKEAFKLYDQNNNGVISANELHQILGRLGENYTVERCADMIKSVDSDGDGFVDFEEFRKMMSRKGGDGAH

Amb t 11致敏蛋白全序列为SEQ ID NO.8：

MEINKFVSFSFSLVLILGLAESFHYHERELESDEGFLGMYDRWREQHNIEMRSPERFNVFKYNVKRIHESNKMDKPYKLKVNEFADMTNLEFVNTYANSKISHFQALRGGAPGSLDTDPNKDFIYANATKIPDKLDWREKNAVTDVKGQGGCGSCWAFAAVVALEGINAIRTGKLVKFSEQQLVDCDMTNAGCDGGLMEPAFTYVIKHGGIAPEANYPYVGKRETCDKAKIKDVLKIDGRQNVPGLDEELLRKAVAHQPVATGIQLSGHGLQFYSEGVYTGDCGTEPNHGVGIVGYGENDKGIKFWTVKNSWGPTWGEKGYIHLQRGARKEGLCGIAMHSSFPIMNDPNPPKDDPIKAPKDDPDLPKDPKFKTTQRLQGIRTKLLEL

Amb t 12致敏蛋白全序列为SEQ ID NO.9：

MATIKAVKARQIFDSRGNPTVEVDVTLSDGTLARAAVPSGASTGIYEALELRDGGSDYLGKGVLKAVDNVNSIIGPALIGKNPTEQTKIDNFMVQELDGTVNEWGWCKQKLGANAILAVSLAVCKAGASVKKIPLYKHIANLAGNKTLVLPVPAFNVINGGSHAGNKLAMQEFMILPVGASSFKEAMKMGVEVYHTLKSVIKKKYGQDATNVGDEGGFAPNIQENKEGLELLKTAISKAGYSGKVVIGMDVAASEFYGEKDKTYDLNFKEENNDGKEKISGEQLKDLYKSFVSEYPIVSIEDPFDQDDWEHYAKMTAECGEQVQIVGDDLLVTNPTRVKKAIDEKTCNALLLKVNQIGSVTESIEAVRMSKHAGWGVMASHRSGETEDTFIADLSVGLATGQIKTGAPCRSERLAKYNQLLRIEEELGSEAVYAGANFRKPVEPY

通过对三裂叶豚草花粉原料中上述每一致敏蛋白对应mRNA进行了核苷酸全长测序后，其mRNA对应序列如下

Amb t 1.04’致敏蛋白基因全序列为SEQ ID NO.10：

tgttgttacatcttgtattttaccttagcccttgtcattttgctgcaacctgttcgttctgccgaagatctccagcaaatcttaccttcagttaacgaaacaaggagcctgacaacatgtgaagcaaacaacattatagacaagtgctggaggtgcaaacctgattgggcagaaaaccgaaaagcgttagccgattgtgcccaaggttttgcaaagggaaccatcggcggaaaaatgggtgatatctacacggtgaccagtgatctagatgatgatgttgctaatccaaaagaaggcacactccggtttggtgccgcccaaaacaggcccttgtggattatttttgcaagagatatggtgattcgtttggataaagagatggaggtaaacaacgacaagaccatcgatggccgaggggcgagagttgaaatcattaacgctggtttccgcatcaaagaagtcaagaatgtaatcattcataacatatattttcatgatattaatgcgcagccaggagccctggttaagagaaacgaaggtccaccacgtctaagaaagggtagtgatggtgatgctataagtcttgatggttgttcacaagtatggatcgaccattgctcgctcagtaaggcttttgatgggctagtcgatgccaaactcggcaccacacgcttcaccgtttccaacagcttatttacccaacaccaatatgtattattgttttgggattttgaagaaacaggcatgctaggaacggtcgcattcaacaagttcactgatcacgttgaccaaagaatgcctaattgtcggcatgggtttttccaagtcgttaacaacaactacgatagatggggatcgtattgcatcggtggtagcgcggccccaaccatactcagccaaggaaacagattctttgcccccgatgatcctatcaagaaaaatgctgtagggaggcatggtgaagccgcacaagagtcgatgaagtggaactggagatcgtataatgatctgcttgaaaatggtgctatttttgttgcatccggcgttgatccagtgttaacccctgaacaaagcgaagggatgattctagccgaaccaggtgaagccgttctaagactcactagtagtgccggtgtactctcatgccaacctggagcaccttgctaa

Amb t 1.05’致敏蛋白基因全序列为SEQ ID NO.11：

atggggatcaaacattgttgttacatcttgtattttaccttagcacttgtcactttggtgcaagctggacgtcttggcgaagaggtcgacatcttaccttcacctaacgatacaaggaggagcctgcaaggatgtgaagcacacaacattatagacaagtgttggaggtgcaaacccgattgggcggagaaccgaaaagcgttaggcgattgtgccaaaggttttggaaagggaacttacggcggaaaagggggtgatatctacatggtcacaagtgatcaggatgatgatgttgtgaatccaagagaaggcacactccggttcggtgccacccaagacaggcccttgtggatcatttttgaaagagatatgattatttatttgcaacaagagatggtagtaaccagcgacacgaccatcgatggtcgaggggcgaaagttgagcttgtttatggaggtatcaccctcatgaatgtcaagaatgtaatcattcacaacctaaatatccatgatgttagagtgcttccaggaggcctgattaagtccagcggtggtccagcaataccaagatataagagtgatggtgatgctgtccatgttactggtagttcagacatatggatcgaccattgcacgctcggcaattcatttgatgggctcgtcgatgtcaactggggtagctcatcagtaaccatttccaactgcaaattcgaacgccaagacaaagccattttgctcggggctagtgacacccattttcaagatgtgaaaatgcatgtaacgcttgcatacaacatcttcgccaataccgttcatgaaagaatgcctagatgccgatttgggtttacccaaattgtaaacaacttctacgacagatgggataagtacgccattggtggtagctcgaaccctactattctcagccaagggaacaaattcgtggcccccgataacatttacaggaaaaacgtctgtctgaggactggtgcacaggagccagaatggatgacttggaactggagaacgcaaaacgacctgcttgaaaatggtgctgtctttgtggcatccgggtctgatccagtgctaaccgctgaacaaaatgcaggcatgattcaagctgaacctggagaaacggttccgcaactcaccatgaatgctggtgtactcacatgctcgcctggagcaccttgctaa

Amb t 8致敏蛋白基因全序列为SEQ ID NO.12：

atgtcgtggcagacttacgtggatgaacatttgatgtgtgacatcgaaggcactggtcagcatctcgcctctgccgctatcttcggtaccgatggcaacgtctgggccaagagcacttctttccccgagttgaaacctgatgagattaatgctatcatcaaagaattcagtgaacctggtactcttgcccctattggtttattcctagccggtgcaaagtacatggtgatccaaggcgagtctggagctgttattcgtggaaagaagggagctggagggatctgcatcaagaaaactggtcaagccatggtgtttggcatctatgaggagccggtgaatcctggtcagtgcaacatggttgtggaaaggttgggtgattatcttgtggatcaaggcatgtaa

Amb t 10致敏蛋白基因全序列为SEQ ID NO.13：

atggcgccagaaaataacaaactttcaatattcccaacagacaaagaagaaataacaaaaatcttcaaccgtttcgacacaaacggcgacggccaaatctccaaagaagagctattcgacatcctgaaatcgctcggttctgatacatctcctgacgaggtgaagcgagtaatggctgaaatcgatgcagatggcgacggtttcattagccttgatgagtttgttctattctgcaaaggaatggaagccgaaggcgatgagatgaatgatctcaaggaagcgtttaagttgtatgatcagaacaacaatggtgtgatatctgcaaatgaattgcatcagatattgggtcggttgggagagaattacacggttgaaaggtgcgcggatatgattaagtctgttgattcggatggcgatggttttgttgattttgaagagtttaggaagatgatgtcaaggaagggaggtgatggtgcacattaa

Amb t 11致敏蛋白基因全序列为SEQ ID NO.14：

atggaaatcaacaagtttgtttctttttcattttctttggttttgattttaggacttgcggagagcttccattaccatgagagagagctcgaatcggacgaggggtttttggggatgtacgataggtggagggagcaacacaatatcgaaatgagaagcccagaacggttcaatgtattcaaatacaatgttaaacgcattcacgaatcgaataagatggacaagccgtataagttgaaggtgaacgagtttgctgacatgactaaccttgagtttgttaacacgtatgctaactcgaagattagccattttcaagctctccgaggaggagcacctggatcgcttgataccgaccctaataaagatttcatatatgcaaatgcgactaaaatcccagataagcttgattggagagagaaaaatgccgtcactgatgtcaagggtcaaggcggatgtggaagttgttgggcatttgccgctgtggttgcattggaaggaataaacgcgatcagaaccggaaaactagtaaaattttccgaacaacaactcgtcgactgtgacatgacgaacgcaggatgcgacggagggctaatggaacctgcattcacatacgtcataaagcatggaggtatagcaccagaagccaactacccttacgtaggcaaaagagaaacctgcgacaaagcaaagattaaagatgtgttgaagatcgatggtagacaaaatgtgcctggacttgatgaagaattactaaggaaggcagtagcacaccagcctgtagctacaggcatacaacttagcggccatggtttgcagttctattccgagggtgtatataccggagattgtggtacagagccgaatcatggagttggaattgtgggatacggtgagaatgataaggggattaaattttggaccgtgaagaactcatggggaccaacgtggggagagaagggatacatacatctacaacgcggagctaggaaagagggactctgcggaatagcaatgcattcttcttttcctattatgaacgacccaaatccacctaaagacgaccccattaaagcacctaaagacgaccctgatttacctaaggaccctaaatttaaaacgactcagaggttgcaggggataaggactaaattgttggagttgtga

Amb t 12致敏蛋白基因全序列为SEQ ID NO.15：

atggcgacgatcaaagccgttaaagctcgtcagatcttcgatagtcgtggtaatcctacggtcgaagttgatgttactctgtctgatggaactttggctagagccgctgtacctagcggtgcttctacaggtatatatgaagcgttggagttgcgagatggaggttcggattatctcggtaaaggtgtcttgaaggctgtggacaatgttaactcgattattggtcctgccttgattggcaagaatcctacggaacagaccaaaattgacaacttcatggttcaagagcttgatggaactgtaaatgaatggggctggtgcaaacagaagcttggtgccaatgccatactggcagtgtcacttgctgtgtgtaaagctggagcatctgttaagaaaattcctctatataagcacattgcaaacctagctggaaacaagacactggtgttgccagtaccagcatttaatgtgatcaatggtgggtcgcatgcaggcaacaaacttgcaatgcaagagtttatgattctccctgttggagcttcttccttcaaggaagccatgaagatgggtgttgaagtgtatcacaccttgaagtctgtaattaaaaagaaatatggtcaagatgctaccaatgttggtgatgaaggtggatttgctcctaacatccaggaaaacaaagaaggccttgaacttttgaagactgcaatatcaaaagctggatacagcggaaaggttgttattggaatggatgttgctgcatctgaattctatggcgagaaggacaagacctatgatctgaacttcaaggaagagaacaacgatggcaaagaaaagatttcaggagaacaactaaaagatctttacaagtcgtttgtgagtgagtaccccattgtgtccattgaggacccatttgaccaagatgactgggagcactatgccaagatgaccgctgaatgtggcgaacaagttcaaattgtaggagacgatcttttggtcaccaaccccacgagagtcaagaaggcaattgatgagaagacttgcaatgctcttcttctaaaggtcaaccaaattgggtctgtgaccgagagtatcgaagctgtgaggatgtccaaacatgctggttggggtgtgatggccagtcaccgcagtggagaaacagaggacaccttcattgctgatctttctgtgggtttggcaacgggtcaaatcaaaactggagctccatgcaggtcagagcgtcttgcaaagtacaaccagctgttgagaatcgaagaagagcttggatcagaagcggtttatgctggagccaacttccgcaagccagtggaaccctactag

4、质谱检测

对豚草变应原浸液进行全蛋白质谱分析以及对豚草变应原经SDS-PAGE分离后对应的胶条分别取样进行质谱鉴定，其主要包含且不限于以下肽段:

Amb t 1.04’致敏蛋白质谱鉴定肽段：

SEQ ID NO.16：MGDIYTVTSDLDDDVANPK

SEQ ID NO.17：KALADCAQGFAK

SEQ ID NO.18：LDKEMEVNNDK

SEQ ID NO.19：NVIIHNIYFHDINAQPGALVK

SEQ ID NO.20：ALADCAQGFAKGTIGGK

SEQ ID NO.21：ALADCAQGFAK

SEQ ID NO.22：VEIINAGFR

SEQ ID NO.23：AFDGLVDAK

SEQ ID NO.24：FTDHVDQR

SEQ ID NO.25：HGFFQVVNNNYDR

SEQ ID NO.26：WGSYCIGGSAAPTILSQGNR

SEQ ID NO.27：FFAPDDPIK

SEQ ID NO.28：HGEAAQESMK

SEQ ID NO.29：FGAAQNRPLWIIFAR

Amb t 1.05’致敏蛋白质谱鉴定肽段：

SEQ ID NO.30：NVIIHNLNIHDVR

SEQ ID NO.31：SSGGPAIPR

SEQ ID NO.32：QDKAILLGASDTHFQDVK

SEQ ID NO.33：AILLGASDTHFQDVK

SEQ ID NO.34：FGFTQIVNNFYDR

SEQ ID NO.35：FVAPDNIYR GAKVELVYGGITLMNVK

SEQ ID NO.36：VELVYGGITLMNVK

SEQ ID NO.37：MHVTLAYNIFANTVHE

SEQ ID NO.38：WDKYAIGGSSNPTILSQGNK

SEQ ID NO.39：YAIGGSSNPTILSQGNK

SEQ ID NO.40：TGAQEPEWMTWNWR

SEQ ID NO.41：CKPDWAENR

SEQ ID NO.42：SLQGCEAHNIIDK

SEQ ID NO.43：RSLQGCEAHNIIDK

Amb t 8致敏蛋白质谱鉴定肽段：

SEQ ID NO.44：STSFPELKPDEINAIIK

SEQ ID NO.45：EFSEPGTLAPIGLFLAGAK

Amb t 10致敏蛋白质谱鉴定肽段：

SEQ ID NO.46：LGENYTVER

SEQ ID NO.47：SVDSDGDGFVDFEEFRK

Amb t 11致敏蛋白质谱鉴定肽段：

SEQ ID NO.48：ELESDEGFLGMYDR

SEQ ID NO.49：IPDKLDWR

SEQ ID NO.50：HGGIAPEANYPYVGK

SEQ ID NO.51：QNVPGLDEELLR

SEQ ID NO.52：APKDDPDLPK

Amb t 12致敏蛋白质谱鉴定肽段：

SEQ ID NO.53：TYDLNFKEENNDGKEK

SEQ ID NO.54：ISGEQLKDLYK

SEQ ID NO.55：ISGEQLK

表6豚草花粉致敏蛋白分子量、序列、过敏血清阳性率情况概览

5、理化性质检测

该豚草变应原浸液经理化性质检验后，其质量标准如表7：

表7豚草花粉变应原浸液理化性质质量标准

6、总变应原活性测定

当变应原浸液包含治疗有效量或诊断有效量的豚草花粉变应原时，用竞争性ELISA法测定相对生物效价为50000BAU/ml-200000BAU/ml。

7、无菌检查

不得有菌生长。

实施例7豚草花粉变应原浸液成品稳定性试验

对上述制备的豚草花粉标准化变应原浸液成品在2-8℃下进行长期稳定性研究试验，分别对三个批次样品分别检测0时，3个月，6个月，9个月和12个月的pH值变化，苯酚含量，甘油含量，氯化钠含量，蛋白含量和总变应原活性，主要致敏蛋白含量的变化情况，结果如图6至图11所示。

从上述稳定性结果中，可以发现在12个月长期试验中，豚草花粉标准化变应原浸液各质控参数虽有不规则波动，可能是实验误差导致，但均在质量标准质控范围内，且不同批次间变化趋势基本一致，这说明按照本发明所述的豚草花粉标准化变应原浸液，在2-8℃条件下，至少12月内能稳定地保存。因此，豚草花粉变应原浸液成品的效期合理预计在36个月。

实施例8本发明豚草变应原浸液与豚草变应原注射液医疗机构制剂(北京协和医院)品种稳定性Western Blotting对比研究

本发明变应原浸液组方中加入了50％的甘油作为稳定剂，优化了磷酸盐缓冲液pH及配方，使其更适合花粉变应原的浸提及保存，且原料经DNA条码技术鉴定，保障了纯度，原液采用了优化的冻干工艺，上述设计及工艺实现使按发明获得的变应原浸液成品稳定好、变应原活性得到良好保存，从而提高临床使用的有效性和安全性。为验证本发明下的处方及工艺对豚草变应原活性保存优于已有工艺及处方配制的同品种豚草变应原粗提液，本实施例针对豚草变应原浸液(本发明，即下述为A的产品)及豚草变应原注射液医疗机构制剂(北京协和医院配制，采用pH为8.2的Coca’s液提取，主要成分0.5％的NaCl、0.275％NaHCO3、0.4％苯酚和注射用水，即下述为B的产品)做了稳定性对比研究。

本实施例通过对比A产品和B产品4℃(温度控制2～6℃，避光保存)长期放置12月后，分别在0点和12月取样，以产品与豚草过敏患者血清池(15例豚草过敏患者组成的血清池，sIgE≥3级，皮试≥+++，典型的夏秋季花粉症病史者入选)的Western Blotting反应评价稳定性差异。

试验采用还原型SDS-PAG电泳，分离胶浓度为4～12％，0.2μm PVDF ImmobilonR-PSQ转印膜，一抗血清反应稀释度1：3，室温杂交2h，随后置于4℃冰箱杂交过夜，1×PBST洗3次，10min/次。。二抗Ms mAb to Hu IgE(ab99806)1：1000室温杂交2h，1×PBST洗3次，10min/次。将ECL显影液1:1混匀后曝光显色。

结果见图13所示，其中，M为蛋白分子量Marker(Genstar)，N为浸液与健康受试者血清反应条带，L1和L2分别为本发明产品0时(A0)和12月(A12)与血清池反应结果，L3和L4分别为原医院制剂0时(B0)和12月(B12)与临床血清池反应条带结果。结果表明，本发明产品比原医院制剂产品在4℃放置12月后，不仅主要致敏蛋白条带清晰，其余多个致敏条带反应仍较明显，说明本发明产品中豚草致敏蛋白更为丰富，保存较好，活性也较高从而证实本发明产品更为稳定、有效。

实施例9评价应用1

目的：通过皮肤点刺试验(skin prick test,SPT)评价豚草花粉变应原浸液诊断豚草花粉过敏症的有效性和安全性。

方法如下：

选取2015年8月10日至2016年10月20日在北京协和医院变态(过敏)反应科就诊，患有过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性结膜炎、特应性皮炎、荨麻疹等过敏性疾病的门诊患者。对所有受试者进行协和豚草花粉变应原SPT，15min后测定平均风团直径(mean whealdiameter，MWD)。以豚草花粉血清特异性免疫球蛋白E specific immunoglobulin E，sIgE)作为确认豚草花粉过敏症的诊断标准，进行受试者工作特征曲线(receiver operatingcharacteristic curve，ROC曲线)分析，判断不同诊断界值下，本发明制备的豚草花粉变应原浸液临床诊断豚草花粉过敏症的准确性；同时记录不良事件，评价豚草花粉变应原浸液的安全性。结果本研究共计入组1026例，无脱落病例。全分析集(full analysis set，FAS)993例，平均年龄(31.28±14.55)岁。FAS的ROC曲线下面积(area under curve，AUC)为0.667(95％可信区间0.632～0.702)。据FAS的ROC估算SPT诊断豚草花粉过敏的MWD最佳诊断界值为3.75mm，特异度达95％时的MWD诊断界值为6.75mm。分别以MWD3.00、4.75和6.75mm为诊断界值,豚草花粉变应原浸液SPT诊断豚草花粉过敏的敏感度依次降低，分别为0.8273(95％可信区间0.7957～0.8589)、0.6200(95％可信区间0.5794～0.6606)、0.1673(95％可信区间0.1361～0.1985)；而特异度依次升高，分别为0.3373(95％可信区间0.2789～0.3957)、0.6190(95％可信区间0.5591～0.6790)、0.9484(95％可信区间0.9211～0.9757)。安全集(save set,SS)1029例，6例出现7次不良事件，不良事件发生率0.58％(6/1029)，主要表现为SPT后鼻痒、喷嚏、流涕、鼻塞、眼痒以及点刺部位局部皮肤出现较大风团反应。所有受试者均未出现严重不良事件。结论豚草花粉变应原浸液对于豚草花粉过敏症具有良好的诊断价值，安全性好。结合病史和不同的SPT诊断界值，可以提高诊断的准确度。

结果表明：本发明通过使用豚草花粉变应原浸液按1:1000稀释液做皮内试验分别与变态反应专科医生临床综合特异性诊断和血清特异性IgE(specific IgE,sIgE)诊断进行对比，皮内试验结果与临床综合特异性诊断及与血清sIgE诊断结果一致、具有较好的灵敏度和特异度，安全性好。

实施例10评价应用2

本发明的制备的豚草花粉变应原浸液对豚草花粉过敏患者全血进行嗜碱性粒细胞活化试验，能进行临床特异性过敏体外诊断。这个检测方法在IgE或非IgE介导的过敏反应中均适用，可以用于部分sIgE体外诊断存在假阴性、假阳性患者的确诊及部分过敏性休克患者不适于进行皮试诊断的情况。

试验原理：变应原与患者全血细胞反应可以模拟人体内变态反应过程：即特异性IgE抗体通过与相应的变应原桥联结合到细胞表面，激活细胞内信号级联导致嗜碱性粒细胞(CCR3持续表达于嗜碱性粒细胞，是其特异性标记)的活化脱颗粒。在这个脱颗粒的过程中，细胞内复合物影响跨膜蛋白CD63(gp53)，使其外表达于细胞表面，并暴露于细胞外基质中，因此可以依赖流式细胞术原理(使用抗人趋化因子受体CCR3-藻红蛋白(anti-CCR3-PE)对嗜碱性粒细胞进行标记，使用抗人CD63单克隆抗体-异硫氰酸荧光素(anti-CD63-FITC)对活化状态的嗜碱性粒细胞进行标记，非特异性细胞活化剂fMLP作为一种阳性质控)，并以嗜碱性粒细胞脱颗粒的百分数变化来判断受试者是否对特定变应原过敏。方法：选择健康受试者、豚草过敏患者，取其EDTA抗凝全血样本，以刺激缓冲液(阴性对照)、豚草变应原浸液(对1：10³～10¹⁰稀释比例进行优化，本实施例中取1：10⁸)、fMLP刺激液(阳性质控)作为嗜碱性粒细胞的激活物，加入到全血中，然后加入anti-CD63-FITC、anti-CCR3-PE染色，48h内上流式细胞仪进行检测。结果如图14所示，结果表明：健康受试者以阴性对照、豚草变应原浸液、阳性对照为嗜碱性粒细胞活化物时，其嗜碱性粒细胞活化率分别应＜15％、＜15％、≥15％，豚草花粉过敏患者以阴性对照、豚草变应原浸液、阳性对照为嗜碱性粒细胞活化物时，其嗜碱性粒细胞活化率分别应＜15％、≥15％、≥15％。结论：该豚草变应原浸液能有效作为活化物运用于嗜碱性粒细胞活化试验，并依据其判断标准有效做出临床诊断。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国医学科学院北京协和医院

<120> 一种豚草花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法

<150> 2018102437497

<151> 2019-03-23

<160> 55

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 40

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gggttaaggc acgggtgtcg ctgactgggg tcgcgatcga agcatcatcg caagacaacg 60

cgttagggta ctttaagagt atctacaaca aggaatgaaa acgcacgaca cgagacgact 120

gtgttatcaa ccaccactag ccgtgcgtcc ctcttgatga gactcccatt taggccaacc 180

acaccatggg cacgggagac caatctccgc cccaaccaaa gtagtccctt gatgggaatg 240

tttggtgggg gcgacgtgat gcgtgacgcc caggcagacg tgccctcaac cggatggctt 300

cgggcgcaac ttgcgttcaa aaactcgatg gttcacggga ttctgcaatt cacaccaagt 360

atcgcatttt gctacgttct tcatcgatgc gtgagccgag atatccgttg ccgagagtcg 420

ttttaggttt aacaaagatg ccacatacaa cacgcacacc gcgaacgggg cgcaatagca 480

cgggcccttt aagtttagtt ttccttggca cgtaccgtgc cgggggtttg ttatcgtgtc 540

tccatgaaat ccatgatgcc ccaaatgttt ggcgcaagca tagacacacg tcgacaaggc 600

ctcacaaaga tcgaaacgta agcttcggtc ccagcttagc cggtgttttt acatgttcac 660

gggtcgttct gctatgcagg gttcgacaat gatccttccg caggttcacc tacggaaacc 720

ttgttacct 729

<210> 5

<211> 388

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 5

Cys Cys Tyr Ile Leu Tyr Phe Thr Leu Ala Leu Val Ile Leu Leu Gln

1 5 10 15

Pro Val Arg Ser Ala Glu Asp Leu Gln Gln Ile Leu Pro Ser Val Asn

20 25 30

Glu Thr Arg Ser Leu Thr Thr Cys Glu Ala Asn Asn Ile Ile Asp Lys

35 40 45

Cys Trp Arg Cys Lys Pro Asp Trp Ala Glu Asn Arg Lys Ala Leu Ala

50 55 60

Asp Cys Ala Gln Gly Phe Ala Lys Gly Thr Ile Gly Gly Lys Met Gly

65 70 75 80

Asp Ile Tyr Thr Val Thr Ser Asp Leu Asp Asp Asp Val Ala Asn Pro

85 90 95

Lys Glu Gly Thr Leu Arg Phe Gly Ala Ala Gln Asn Arg Pro Leu Trp

100 105 110

Ile Ile Phe Ala Arg Asp Met Val Ile Arg Leu Asp Lys Glu Met Glu

115 120 125

Val Asn Asn Asp Lys Thr Ile Asp Gly Arg Gly Ala Arg Val Glu Ile

130 135 140

Ile Asn Ala Gly Phe Arg Ile Lys Glu Val Lys Asn Val Ile Ile His

145 150 155 160

Asn Ile Tyr Phe His Asp Ile Asn Ala Gln Pro Gly Ala Leu Val Lys

165 170 175

Arg Asn Glu Gly Pro Pro Arg Leu Arg Lys Gly Ser Asp Gly Asp Ala

180 185 190

Ile Ser Leu Asp Gly Cys Ser Gln Val Trp Ile Asp His Cys Ser Leu

195 200 205

Ser Lys Ala Phe Asp Gly Leu Val Asp Ala Lys Leu Gly Thr Thr Arg

210 215 220

Phe Thr Val Ser Asn Ser Leu Phe Thr Gln His Gln Tyr Val Leu Leu

225 230 235 240

Phe Trp Asp Phe Glu Glu Thr Gly Met Leu Gly Thr Val Ala Phe Asn

245 250 255

Lys Phe Thr Asp His Val Asp Gln Arg Met Pro Asn Cys Arg His Gly

260 265 270

Phe Phe Gln Val Val Asn Asn Asn Tyr Asp Arg Trp Gly Ser Tyr Cys

275 280 285

Ile Gly Gly Ser Ala Ala Pro Thr Ile Leu Ser Gln Gly Asn Arg Phe

290 295 300

Phe Ala Pro Asp Asp Pro Ile Lys Lys Asn Ala Val Gly Arg His Gly

305 310 315 320

Glu Ala Ala Gln Glu Ser Met Lys Trp Asn Trp Arg Ser Tyr Asn Asp

325 330 335

Leu Leu Glu Asn Gly Ala Ile Phe Val Ala Ser Gly Val Asp Pro Val

340 345 350

Leu Thr Pro Glu Gln Ser Glu Gly Met Ile Leu Ala Glu Pro Gly Glu

355 360 365

Ala Val Leu Arg Leu Thr Ser Ser Ala Gly Val Leu Ser Cys Gln Pro

370 375 380

Gly Ala Pro Cys

385

<210> 5

<211> 397

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 5

Met Gly Ile Lys His Cys Cys Tyr Ile Leu Tyr Phe Thr Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Leu Val Gln Ala Gly Arg Leu Gly Glu Glu Val Asp Ile Leu

20 25 30

Pro Ser Pro Asn Asp Thr Arg Arg Ser Leu Gln Gly Cys Glu Ala His

35 40 45

Asn Ile Ile Asp Lys Cys Trp Arg Cys Lys Pro Asp Trp Ala Glu Asn

50 55 60

Arg Lys Ala Leu Gly Asp Cys Ala Lys Gly Phe Gly Lys Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Gly Gly Lys Gly Gly Asp Ile Tyr Met Val Thr Ser Asp Gln Asp Asp

85 90 95

Asp Val Val Asn Pro Arg Glu Gly Thr Leu Arg Phe Gly Ala Thr Gln

100 105 110

Asp Arg Pro Leu Trp Ile Ile Phe Glu Arg Asp Met Ile Ile Tyr Leu

115 120 125

Gln Gln Glu Met Val Val Thr Ser Asp Thr Thr Ile Asp Gly Arg Gly

130 135 140

Ala Lys Val Glu Leu Val Tyr Gly Gly Ile Thr Leu Met Asn Val Lys

145 150 155 160

Asn Val Ile Ile His Asn Leu Asn Ile His Asp Val Arg Val Leu Pro

165 170 175

Gly Gly Leu Ile Lys Ser Ser Gly Gly Pro Ala Ile Pro Arg Tyr Lys

180 185 190

Ser Asp Gly Asp Ala Val His Val Thr Gly Ser Ser Asp Ile Trp Ile

195 200 205

Asp His Cys Thr Leu Gly Asn Ser Phe Asp Gly Leu Val Asp Val Asn

210 215 220

Trp Gly Ser Ser Ser Val Thr Ile Ser Asn Cys Lys Phe Glu Arg Gln

225 230 235 240

Asp Lys Ala Ile Leu Leu Gly Ala Ser Asp Thr His Phe Gln Asp Val

245 250 255

Lys Met His Val Thr Leu Ala Tyr Asn Ile Phe Ala Asn Thr Val His

260 265 270

Glu Arg Met Pro Arg Cys Arg Phe Gly Phe Thr Gln Ile Val Asn Asn

275 280 285

Phe Tyr Asp Arg Trp Asp Lys Tyr Ala Ile Gly Gly Ser Ser Asn Pro

290 295 300

Thr Ile Leu Ser Gln Gly Asn Lys Phe Val Ala Pro Asp Asn Ile Tyr

305 310 315 320

Arg Lys Asn Val Cys Leu Arg Thr Gly Ala Gln Glu Pro Glu Trp Met

325 330 335

Thr Trp Asn Trp Arg Thr Gln Asn Asp Leu Leu Glu Asn Gly Ala Val

340 345 350

Phe Val Ala Ser Gly Ser Asp Pro Val Leu Thr Ala Glu Gln Asn Ala

355 360 365

Gly Met Ile Gln Ala Glu Pro Gly Glu Thr Val Pro Gln Leu Thr Met

370 375 380

Asn Ala Gly Val Leu Thr Cys Ser Pro Gly Ala Pro Cys

385 390 395

<210> 6

<211> 133

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 6

Met Ser Trp Gln Thr Tyr Val Asp Glu His Leu Met Cys Asp Ile Glu

1 5 10 15

Gly Thr Gly Gln His Leu Ala Ser Ala Ala Ile Phe Gly Thr Asp Gly

20 25 30

Asn Val Trp Ala Lys Ser Thr Ser Phe Pro Glu Leu Lys Pro Asp Glu

35 40 45

Ile Asn Ala Ile Ile Lys Glu Phe Ser Glu Pro Gly Thr Leu Ala Pro

50 55 60

Ile Gly Leu Phe Leu Ala Gly Ala Lys Tyr Met Val Ile Gln Gly Glu

65 70 75 80

Ser Gly Ala Val Ile Arg Gly Lys Lys Gly Ala Gly Gly Ile Cys Ile

85 90 95

Lys Lys Thr Gly Gln Ala Met Val Phe Gly Ile Tyr Glu Glu Pro Val

100 105 110

Asn Pro Gly Gln Cys Asn Met Val Val Glu Arg Leu Gly Asp Tyr Leu

115 120 125

Val Asp Gln Gly Met

130

<210> 7

<211> 160

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 7

Met Ala Pro Glu Asn Asn Lys Leu Ser Ile Phe Pro Thr Asp Lys Glu

1 5 10 15

Glu Ile Thr Lys Ile Phe Asn Arg Phe Asp Thr Asn Gly Asp Gly Gln

20 25 30

Ile Ser Lys Glu Glu Leu Phe Asp Ile Leu Lys Ser Leu Gly Ser Asp

35 40 45

Thr Ser Pro Asp Glu Val Lys Arg Val Met Ala Glu Ile Asp Ala Asp

50 55 60

Gly Asp Gly Phe Ile Ser Leu Asp Glu Phe Val Leu Phe Cys Lys Gly

65 70 75 80

Met Glu Ala Glu Gly Asp Glu Met Asn Asp Leu Lys Glu Ala Phe Lys

85 90 95

Leu Tyr Asp Gln Asn Asn Asn Gly Val Ile Ser Ala Asn Glu Leu His

100 105 110

Gln Ile Leu Gly Arg Leu Gly Glu Asn Tyr Thr Val Glu Arg Cys Ala

115 120 125

Asp Met Ile Lys Ser Val Asp Ser Asp Gly Asp Gly Phe Val Asp Phe

130 135 140

Glu Glu Phe Arg Lys Met Met Ser Arg Lys Gly Gly Asp Gly Ala His

145 150 155 160

<210> 8

<211> 387

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 8

Met Glu Ile Asn Lys Phe Val Ser Phe Ser Phe Ser Leu Val Leu Ile

1 5 10 15

Leu Gly Leu Ala Glu Ser Phe His Tyr His Glu Arg Glu Leu Glu Ser

20 25 30

Asp Glu Gly Phe Leu Gly Met Tyr Asp Arg Trp Arg Glu Gln His Asn

35 40 45

Ile Glu Met Arg Ser Pro Glu Arg Phe Asn Val Phe Lys Tyr Asn Val

50 55 60

Lys Arg Ile His Glu Ser Asn Lys Met Asp Lys Pro Tyr Lys Leu Lys

65 70 75 80

Val Asn Glu Phe Ala Asp Met Thr Asn Leu Glu Phe Val Asn Thr Tyr

85 90 95

Ala Asn Ser Lys Ile Ser His Phe Gln Ala Leu Arg Gly Gly Ala Pro

100 105 110

Gly Ser Leu Asp Thr Asp Pro Asn Lys Asp Phe Ile Tyr Ala Asn Ala

115 120 125

Thr Lys Ile Pro Asp Lys Leu Asp Trp Arg Glu Lys Asn Ala Val Thr

130 135 140

Asp Val Lys Gly Gln Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ala Ala

145 150 155 160

Val Val Ala Leu Glu Gly Ile Asn Ala Ile Arg Thr Gly Lys Leu Val

165 170 175

Lys Phe Ser Glu Gln Gln Leu Val Asp Cys Asp Met Thr Asn Ala Gly

180 185 190

Cys Asp Gly Gly Leu Met Glu Pro Ala Phe Thr Tyr Val Ile Lys His

195 200 205

Gly Gly Ile Ala Pro Glu Ala Asn Tyr Pro Tyr Val Gly Lys Arg Glu

210 215 220

Thr Cys Asp Lys Ala Lys Ile Lys Asp Val Leu Lys Ile Asp Gly Arg

225 230 235 240

Gln Asn Val Pro Gly Leu Asp Glu Glu Leu Leu Arg Lys Ala Val Ala

245 250 255

His Gln Pro Val Ala Thr Gly Ile Gln Leu Ser Gly His Gly Leu Gln

260 265 270

Phe Tyr Ser Glu Gly Val Tyr Thr Gly Asp Cys Gly Thr Glu Pro Asn

275 280 285

His Gly Val Gly Ile Val Gly Tyr Gly Glu Asn Asp Lys Gly Ile Lys

290 295 300

Phe Trp Thr Val Lys Asn Ser Trp Gly Pro Thr Trp Gly Glu Lys Gly

305 310 315 320

Tyr Ile His Leu Gln Arg Gly Ala Arg Lys Glu Gly Leu Cys Gly Ile

325 330 335

Ala Met His Ser Ser Phe Pro Ile Met Asn Asp Pro Asn Pro Pro Lys

340 345 350

Asp Asp Pro Ile Lys Ala Pro Lys Asp Asp Pro Asp Leu Pro Lys Asp

355 360 365

Pro Lys Phe Lys Thr Thr Gln Arg Leu Gln Gly Ile Arg Thr Lys Leu

370 375 380

Leu Glu Leu

385

<210> 9

<211> 445

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 9

Met Ala Thr Ile Lys Ala Val Lys Ala Arg Gln Ile Phe Asp Ser Arg

1 5 10 15

Gly Asn Pro Thr Val Glu Val Asp Val Thr Leu Ser Asp Gly Thr Leu

20 25 30

Ala Arg Ala Ala Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Ile Tyr Glu Ala

35 40 45

Leu Glu Leu Arg Asp Gly Gly Ser Asp Tyr Leu Gly Lys Gly Val Leu

50 55 60

Lys Ala Val Asp Asn Val Asn Ser Ile Ile Gly Pro Ala Leu Ile Gly

65 70 75 80

Lys Asn Pro Thr Glu Gln Thr Lys Ile Asp Asn Phe Met Val Gln Glu

85 90 95

Leu Asp Gly Thr Val Asn Glu Trp Gly Trp Cys Lys Gln Lys Leu Gly

100 105 110

Ala Asn Ala Ile Leu Ala Val Ser Leu Ala Val Cys Lys Ala Gly Ala

115 120 125

Ser Val Lys Lys Ile Pro Leu Tyr Lys His Ile Ala Asn Leu Ala Gly

130 135 140

Asn Lys Thr Leu Val Leu Pro Val Pro Ala Phe Asn Val Ile Asn Gly

145 150 155 160

Gly Ser His Ala Gly Asn Lys Leu Ala Met Gln Glu Phe Met Ile Leu

165 170 175

Pro Val Gly Ala Ser Ser Phe Lys Glu Ala Met Lys Met Gly Val Glu

180 185 190

Val Tyr His Thr Leu Lys Ser Val Ile Lys Lys Lys Tyr Gly Gln Asp

195 200 205

Ala Thr Asn Val Gly Asp Glu Gly Gly Phe Ala Pro Asn Ile Gln Glu

210 215 220

Asn Lys Glu Gly Leu Glu Leu Leu Lys Thr Ala Ile Ser Lys Ala Gly

225 230 235 240

Tyr Ser Gly Lys Val Val Ile Gly Met Asp Val Ala Ala Ser Glu Phe

245 250 255

Tyr Gly Glu Lys Asp Lys Thr Tyr Asp Leu Asn Phe Lys Glu Glu Asn

260 265 270

Asn Asp Gly Lys Glu Lys Ile Ser Gly Glu Gln Leu Lys Asp Leu Tyr

275 280 285

Lys Ser Phe Val Ser Glu Tyr Pro Ile Val Ser Ile Glu Asp Pro Phe

290 295 300

Asp Gln Asp Asp Trp Glu His Tyr Ala Lys Met Thr Ala Glu Cys Gly

305 310 315 320

Glu Gln Val Gln Ile Val Gly Asp Asp Leu Leu Val Thr Asn Pro Thr

325 330 335

Arg Val Lys Lys Ala Ile Asp Glu Lys Thr Cys Asn Ala Leu Leu Leu

340 345 350

Lys Val Asn Gln Ile Gly Ser Val Thr Glu Ser Ile Glu Ala Val Arg

355 360 365

Met Ser Lys His Ala Gly Trp Gly Val Met Ala Ser His Arg Ser Gly

370 375 380

Glu Thr Glu Asp Thr Phe Ile Ala Asp Leu Ser Val Gly Leu Ala Thr

385 390 395 400

Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg Ser Glu Arg Leu Ala Lys

405 410 415

Tyr Asn Gln Leu Leu Arg Ile Glu Glu Glu Leu Gly Ser Glu Ala Val

420 425 430

Tyr Ala Gly Ala Asn Phe Arg Lys Pro Val Glu Pro Tyr

435 440 445

<210> 10

<211> 1167

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgttgttaca tcttgtattt taccttagcc cttgtcattt tgctgcaacc tgttcgttct 60

gccgaagatc tccagcaaat cttaccttca gttaacgaaa caaggagcct gacaacatgt 120

gaagcaaaca acattataga caagtgctgg aggtgcaaac ctgattgggc agaaaaccga 180

aaagcgttag ccgattgtgc ccaaggtttt gcaaagggaa ccatcggcgg aaaaatgggt 240

gatatctaca cggtgaccag tgatctagat gatgatgttg ctaatccaaa agaaggcaca 300

ctccggtttg gtgccgccca aaacaggccc ttgtggatta tttttgcaag agatatggtg 360

attcgtttgg ataaagagat ggaggtaaac aacgacaaga ccatcgatgg ccgaggggcg 420

agagttgaaa tcattaacgc tggtttccgc atcaaagaag tcaagaatgt aatcattcat 480

aacatatatt ttcatgatat taatgcgcag ccaggagccc tggttaagag aaacgaaggt 540

ccaccacgtc taagaaaggg tagtgatggt gatgctataa gtcttgatgg ttgttcacaa 600

gtatggatcg accattgctc gctcagtaag gcttttgatg ggctagtcga tgccaaactc 660

ggcaccacac gcttcaccgt ttccaacagc ttatttaccc aacaccaata tgtattattg 720

ttttgggatt ttgaagaaac aggcatgcta ggaacggtcg cattcaacaa gttcactgat 780

cacgttgacc aaagaatgcc taattgtcgg catgggtttt tccaagtcgt taacaacaac 840

tacgatagat ggggatcgta ttgcatcggt ggtagcgcgg ccccaaccat actcagccaa 900

ggaaacagat tctttgcccc cgatgatcct atcaagaaaa atgctgtagg gaggcatggt 960

gaagccgcac aagagtcgat gaagtggaac tggagatcgt ataatgatct gcttgaaaat 1020

ggtgctattt ttgttgcatc cggcgttgat ccagtgttaa cccctgaaca aagcgaaggg 1080

atgattctag ccgaaccagg tgaagccgtt ctaagactca ctagtagtgc cggtgtactc 1140

tcatgccaac ctggagcacc ttgctaa 1167

<210> 11

<211> 1194

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggggatca aacattgttg ttacatcttg tattttacct tagcacttgt cactttggtg 60

caagctggac gtcttggcga agaggtcgac atcttacctt cacctaacga tacaaggagg 120

agcctgcaag gatgtgaagc acacaacatt atagacaagt gttggaggtg caaacccgat 180

tgggcggaga accgaaaagc gttaggcgat tgtgccaaag gttttggaaa gggaacttac 240

ggcggaaaag ggggtgatat ctacatggtc acaagtgatc aggatgatga tgttgtgaat 300

ccaagagaag gcacactccg gttcggtgcc acccaagaca ggcccttgtg gatcattttt 360

gaaagagata tgattattta tttgcaacaa gagatggtag taaccagcga cacgaccatc 420

gatggtcgag gggcgaaagt tgagcttgtt tatggaggta tcaccctcat gaatgtcaag 480

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aagtccagcg gtggtccagc aataccaaga tataagagtg atggtgatgc tgtccatgtt 600

actggtagtt cagacatatg gatcgaccat tgcacgctcg gcaattcatt tgatgggctc 660

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gacaaagcca ttttgctcgg ggctagtgac acccattttc aagatgtgaa aatgcatgta 780

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agctcgaacc ctactattct cagccaaggg aacaaattcg tggcccccga taacatttac 960

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agaacgcaaa acgacctgct tgaaaatggt gctgtctttg tggcatccgg gtctgatcca 1080

gtgctaaccg ctgaacaaaa tgcaggcatg attcaagctg aacctggaga aacggttccg 1140

caactcacca tgaatgctgg tgtactcaca tgctcgcctg gagcaccttg ctaa 1194

<210> 12

<211> 402

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgtcgtggc agacttacgt ggatgaacat ttgatgtgtg acatcgaagg cactggtcag 60

catctcgcct ctgccgctat cttcggtacc gatggcaacg tctgggccaa gagcacttct 120

ttccccgagt tgaaacctga tgagattaat gctatcatca aagaattcag tgaacctggt 180

actcttgccc ctattggttt attcctagcc ggtgcaaagt acatggtgat ccaaggcgag 240

tctggagctg ttattcgtgg aaagaaggga gctggaggga tctgcatcaa gaaaactggt 300

caagccatgg tgtttggcat ctatgaggag ccggtgaatc ctggtcagtg caacatggtt 360

gtggaaaggt tgggtgatta tcttgtggat caaggcatgt aa 402

<210> 13

<211> 402

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgtcgtggc agacttacgt ggatgaacat ttgatgtgtg acatcgaagg cactggtcag 60

catctcgcct ctgccgctat cttcggtacc gatggcaacg tctgggccaa gagcacttct 120

ttccccgagt tgaaacctga tgagattaat gctatcatca aagaattcag tgaacctggt 180

actcttgccc ctattggttt attcctagcc ggtgcaaagt acatggtgat ccaaggcgag 240

tctggagctg ttattcgtgg aaagaaggga gctggaggga tctgcatcaa gaaaactggt 300

caagccatgg tgtttggcat ctatgaggag ccggtgaatc ctggtcagtg caacatggtt 360

gtggaaaggt tgggtgatta tcttgtggat caaggcatgt aa 402

<210> 14

<211> 1164

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atggaaatca acaagtttgt ttctttttca ttttctttgg ttttgatttt aggacttgcg 60

gagagcttcc attaccatga gagagagctc gaatcggacg aggggttttt ggggatgtac 120

gataggtgga gggagcaaca caatatcgaa atgagaagcc cagaacggtt caatgtattc 180

aaatacaatg ttaaacgcat tcacgaatcg aataagatgg acaagccgta taagttgaag 240

gtgaacgagt ttgctgacat gactaacctt gagtttgtta acacgtatgc taactcgaag 300

attagccatt ttcaagctct ccgaggagga gcacctggat cgcttgatac cgaccctaat 360

aaagatttca tatatgcaaa tgcgactaaa atcccagata agcttgattg gagagagaaa 420

aatgccgtca ctgatgtcaa gggtcaaggc ggatgtggaa gttgttgggc atttgccgct 480

gtggttgcat tggaaggaat aaacgcgatc agaaccggaa aactagtaaa attttccgaa 540

caacaactcg tcgactgtga catgacgaac gcaggatgcg acggagggct aatggaacct 600

gcattcacat acgtcataaa gcatggaggt atagcaccag aagccaacta cccttacgta 660

ggcaaaagag aaacctgcga caaagcaaag attaaagatg tgttgaagat cgatggtaga 720

caaaatgtgc ctggacttga tgaagaatta ctaaggaagg cagtagcaca ccagcctgta 780

gctacaggca tacaacttag cggccatggt ttgcagttct attccgaggg tgtatatacc 840

ggagattgtg gtacagagcc gaatcatgga gttggaattg tgggatacgg tgagaatgat 900

aaggggatta aattttggac cgtgaagaac tcatggggac caacgtgggg agagaaggga 960

tacatacatc tacaacgcgg agctaggaaa gagggactct gcggaatagc aatgcattct 1020

tcttttccta ttatgaacga cccaaatcca cctaaagacg accccattaa agcacctaaa 1080

gacgaccctg atttacctaa ggaccctaaa tttaaaacga ctcagaggtt gcaggggata 1140

aggactaaat tgttggagtt gtga 1164

<210> 15

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggcgacga tcaaagccgt taaagctcgt cagatcttcg atagtcgtgg taatcctacg 60

gtcgaagttg atgttactct gtctgatgga actttggcta gagccgctgt acctagcggt 120

gcttctacag gtatatatga agcgttggag ttgcgagatg gaggttcgga ttatctcggt 180

aaaggtgtct tgaaggctgt ggacaatgtt aactcgatta ttggtcctgc cttgattggc 240

aagaatccta cggaacagac caaaattgac aacttcatgg ttcaagagct tgatggaact 300

gtaaatgaat ggggctggtg caaacagaag cttggtgcca atgccatact ggcagtgtca 360

cttgctgtgt gtaaagctgg agcatctgtt aagaaaattc ctctatataa gcacattgca 420

aacctagctg gaaacaagac actggtgttg ccagtaccag catttaatgt gatcaatggt 480

gggtcgcatg caggcaacaa acttgcaatg caagagttta tgattctccc tgttggagct 540

tcttccttca aggaagccat gaagatgggt gttgaagtgt atcacacctt gaagtctgta 600

attaaaaaga aatatggtca agatgctacc aatgttggtg atgaaggtgg atttgctcct 660

aacatccagg aaaacaaaga aggccttgaa cttttgaaga ctgcaatatc aaaagctgga 720

tacagcggaa aggttgttat tggaatggat gttgctgcat ctgaattcta tggcgagaag 780

gacaagacct atgatctgaa cttcaaggaa gagaacaacg atggcaaaga aaagatttca 840

ggagaacaac taaaagatct ttacaagtcg tttgtgagtg agtaccccat tgtgtccatt 900

gaggacccat ttgaccaaga tgactgggag cactatgcca agatgaccgc tgaatgtggc 960

gaacaagttc aaattgtagg agacgatctt ttggtcacca accccacgag agtcaagaag 1020

gcaattgatg agaagacttg caatgctctt cttctaaagg tcaaccaaat tgggtctgtg 1080

accgagagta tcgaagctgt gaggatgtcc aaacatgctg gttggggtgt gatggccagt 1140

caccgcagtg gagaaacaga ggacaccttc attgctgatc tttctgtggg tttggcaacg 1200

ggtcaaatca aaactggagc tccatgcagg tcagagcgtc ttgcaaagta caaccagctg 1260

ttgagaatcg aagaagagct tggatcagaa gcggtttatg ctggagccaa cttccgcaag 1320

ccagtggaac cctactag 1338

<210> 16

<211> 19

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 16

Met Gly Asp Ile Tyr Thr Val Thr Ser Asp Leu Asp Asp Asp Val Ala

1 5 10 15

Asn Pro Lys

<210> 17

<211> 12

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 17

Lys Ala Leu Ala Asp Cys Ala Gln Gly Phe Ala Lys

1 5 10

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 18

Leu Asp Lys Glu Met Glu Val Asn Asn Asp Lys

1 5 10

<210> 19

<211> 21

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 19

Asn Val Ile Ile His Asn Ile Tyr Phe His Asp Ile Asn Ala Gln Pro

1 5 10 15

Gly Ala Leu Val Lys

20

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 20

Ala Leu Ala Asp Cys Ala Gln Gly Phe Ala Lys Gly Thr Ile Gly Gly

1 5 10 15

Lys

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 21

Ala Leu Ala Asp Cys Ala Gln Gly Phe Ala Lys

1 5 10

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 22

Val Glu Ile Ile Asn Ala Gly Phe Arg

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 23

Ala Phe Asp Gly Leu Val Asp Ala Lys

1 5

<210> 24

<211> 8

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 24

Phe Thr Asp His Val Asp Gln Arg

1 5

<210> 25

<211> 13

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 25

His Gly Phe Phe Gln Val Val Asn Asn Asn Tyr Asp Arg

1 5 10

<210> 26

<211> 20

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 26

Trp Gly Ser Tyr Cys Ile Gly Gly Ser Ala Ala Pro Thr Ile Leu Ser

1 5 10 15

Gln Gly Asn Arg

20

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 27

Phe Phe Ala Pro Asp Asp Pro Ile Lys

1 5

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 28

His Gly Glu Ala Ala Gln Glu Ser Met Lys

1 5 10

<210> 29

<211> 15

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 29

Phe Gly Ala Ala Gln Asn Arg Pro Leu Trp Ile Ile Phe Ala Arg

1 5 10 15

<210> 30

<211> 13

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 30

Asn Val Ile Ile His Asn Leu Asn Ile His Asp Val Arg

1 5 10

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 31

Ser Ser Gly Gly Pro Ala Ile Pro Arg

1 5

<210> 32

<211> 18

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 32

Gln Asp Lys Ala Ile Leu Leu Gly Ala Ser Asp Thr His Phe Gln Asp

1 5 10 15

Val Lys

<210> 33

<211> 15

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 33

Ala Ile Leu Leu Gly Ala Ser Asp Thr His Phe Gln Asp Val Lys

1 5 10 15

<210> 34

<211> 13

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 34

Phe Gly Phe Thr Gln Ile Val Asn Asn Phe Tyr Asp Arg

1 5 10

<210> 35

<211> 26

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 35

Phe Val Ala Pro Asp Asn Ile Tyr Arg Gly Ala Lys Val Glu Leu Val

1 5 10 15

Tyr Gly Gly Ile Thr Leu Met Asn Val Lys

20 25

<210> 36

<211> 14

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 36

Val Glu Leu Val Tyr Gly Gly Ile Thr Leu Met Asn Val Lys

1 5 10

<210> 37

<211> 16

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 37

Met His Val Thr Leu Ala Tyr Asn Ile Phe Ala Asn Thr Val His Glu

1 5 10 15

<210> 38

<211> 20

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 38

Trp Asp Lys Tyr Ala Ile Gly Gly Ser Ser Asn Pro Thr Ile Leu Ser

1 5 10 15

Gln Gly Asn Lys

20

<210> 39

<211> 17

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 39

Tyr Ala Ile Gly Gly Ser Ser Asn Pro Thr Ile Leu Ser Gln Gly Asn

1 5 10 15

Lys

<210> 40

<211> 14

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 40

Thr Gly Ala Gln Glu Pro Glu Trp Met Thr Trp Asn Trp Arg

1 5 10

<210> 41

<211> 9

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 41

Cys Lys Pro Asp Trp Ala Glu Asn Arg

1 5

<210> 42

<211> 13

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 42

Ser Leu Gln Gly Cys Glu Ala His Asn Ile Ile Asp Lys

1 5 10

<210> 43

<211> 14

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 43

Arg Ser Leu Gln Gly Cys Glu Ala His Asn Ile Ile Asp Lys

1 5 10

<210> 44

<211> 17

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 44

Ser Thr Ser Phe Pro Glu Leu Lys Pro Asp Glu Ile Asn Ala Ile Ile

1 5 10 15

Lys

<210> 45

<211> 19

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 45

Glu Phe Ser Glu Pro Gly Thr Leu Ala Pro Ile Gly Leu Phe Leu Ala

1 5 10 15

Gly Ala Lys

<210> 46

<211> 9

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 46

Leu Gly Glu Asn Tyr Thr Val Glu Arg

1 5

<210> 47

<211> 17

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 47

Ser Val Asp Ser Asp Gly Asp Gly Phe Val Asp Phe Glu Glu Phe Arg

1 5 10 15

Lys

<210> 48

<211> 14

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 48

Glu Leu Glu Ser Asp Glu Gly Phe Leu Gly Met Tyr Asp Arg

1 5 10

<210> 49

<211> 8

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 49

Ile Pro Asp Lys Leu Asp Trp Arg

1 5

<210> 50

<211> 15

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 50

His Gly Gly Ile Ala Pro Glu Ala Asn Tyr Pro Tyr Val Gly Lys

1 5 10 15

<210> 51

<211> 12

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 51

Gln Asn Val Pro Gly Leu Asp Glu Glu Leu Leu Arg

1 5 10

<210> 52

<211> 10

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 52

Ala Pro Lys Asp Asp Pro Asp Leu Pro Lys

1 5 10

<210> 53

<211> 16

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 53

Thr Tyr Asp Leu Asn Phe Lys Glu Glu Asn Asn Asp Gly Lys Glu Lys

1 5 10 15

<210> 54

<211> 11

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 54

Ile Ser Gly Glu Gln Leu Lys Asp Leu Tyr Lys

1 5 10

<210> 55

<211> 7

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 55

Ile Ser Gly Glu Gln Leu Lys

1 5

Claims

1.一组豚草花粉变应原蛋白Amb t 1.04’、Amb t 1.05’、Amb t8’、Amb t 10、Amb t 11和Amb t 12用于在制备诊断变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗的制剂中的应用，其特征在于，所述Amb t1.04’如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，所述Amb t 1.05’如SEQ IDNO.5所示的氨基酸序列，所述Amb t 8’如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，所述Amb t 10如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，所述Amb t 11如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，所述Ambt 12如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。

2.一种权利要求1所述豚草花粉变应原蛋白Amb t 1.04’、Amb t 1.05’、Amb t 8’、Ambt 10、Amb t 11和Amb t 12的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

S1、采集豚草花粉，常温干燥或真空干燥或流化床干燥；

S2、对干燥后的花粉脱脂、干燥；

S5、将过滤后的上清液进行超滤浓缩，获得超滤浓缩液；

S7、将所述豚草花粉变应原冻干品用pH 6.5～7.5磷酸盐—盐水缓冲液复溶配置为豚草花粉变应原原液，2～8℃放置，与等体积灭菌的甘油混匀，调节溶液pH值至6.0～8.0；

所述磷酸盐—盐水缓冲液包括4.5～5.5g/L的氯化钠，0.03％～0.05％的磷酸二氢钾，1.5％～2％十二水合磷酸氢二钠，0.2％～0.4％的苯酚，调pH为7.9～8.2。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述花粉脱脂采用花粉与丙酮以1：5～1:1的重量g体积ml比进行脱脂处理，重复脱脂至上层液体澄清；

在步骤S4中，所述离心的条件为8000～12000g，离心温度2～8℃，时间为15～20分钟；所述过滤及除菌过滤为先用4000目滤布过滤后，再通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述超滤浓缩用3KD超滤膜超滤，当超滤透过液总蛋白含量≤0.02mg/ml，停止超滤；当超滤透过液总蛋白含量>0.02mg/ml，更换超滤膜之后对超滤透过液重复超滤，直至超滤透过液总蛋白含量≤0.02mg/ml为止；

在步骤S6中，所述真空冻干的条件为-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1还包括对原料豚草花粉进行镜检鉴别和/或DNA鉴定的步骤，其中DNA鉴定方法为，以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2为引物，对鉴别豚草原料进行PCR扩增，并检测扩增产物。

6.一种权利要求1所述豚草花粉变应原蛋白Amb t 1.04’、Amb t 1.05’、Amb t 8’、Ambt 10、Amb t 11和Amb t 12的冻干品，其特征在于，其由包括豚草花粉收集-干燥-脱脂-提取-超滤浓缩-冻干的步骤制得：

(1)收集：用自然脱落法收集豚草花粉；

(2)干燥：常温干燥或真空干燥或流化床干燥，直至花粉不再粘附，将干燥后的花粉过150-250目分样筛；

(3)脱脂：将(2)所得到的花粉与丙酮分别按g与ml计，以1：5～1:1的重量体积比进行脱脂处理，搅拌或振荡脱脂30分钟后，静置分层，倒出上层液，加入新的丙酮，重复脱脂至上层液体澄清，将脱脂后的花粉均匀摊开，室温干燥或真空干燥或流化床干燥48小时至72小时；

7.根据权利要求6所述的豚草花粉变应原蛋白Amb t 1.04’、Amb t 1.05’、Amb t 8’Amb t 10、Amb t 11和Amb t 12的冻干品的应用，用于在制备诊断变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗的制剂中的应用，所述诊断变态反应疾病包括过敏性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎和慢性荨麻疹。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述豚草花粉变应原浸提物冻干品用于制备成片剂、口崩片，所述豚草花粉变应原浸液用于制备注射液、舌下滴剂、变应原斑贴剂、变应原浸液稀释液。