CN103304646B - 结核分枝杆菌候选抗原多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种结核分枝杆菌候选抗原多肽及其应用。本发明提供一种组合物，由多肽1、多肽2和多肽3的三种或者任意两种组成；所述多肽1的氨基酸序列为序列表中序列1自N末端19-27位；所述多肽2的氨基酸序列为序列表中序列1自N末端21-29位；所述多肽3的氨基酸序列为序列表中序列1自N末端9-17位。本发明的实验证明，本发明筛选了一种多肽及其三个表位多肽的混合物，该多肽可以促进肺结核患者体内淋巴细胞增殖或者促进结核分枝杆菌抗原特异性淋巴细胞增殖，而三个表位多肽的混合物可以激活CTL反应且可以产生特异性IFN-γ，因此证明，多肽及其表位肽混合物可以为结核分枝杆菌抗原，可以用来开发新型结核疫苗；也为开发新的佐剂成分提供新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种结核分枝杆菌候选抗原多肽及其应用。背景技术
据WHO统计，世界上近1/3的人口感染有结核分枝杆菌（Mtb），且随着耐药肺结核病和肺结核病与艾滋病混合感染的增多，肺结核病已经严重危害人民健康，据统计近几年在我国传染病发病数和死亡数中肺结核的排名一直位居前两位。肺结核病已是一种严重危害人民健康和国民经济的传染病，而中国是肺结核病的高负担国，那么对于肺结核病防控策略的制定就成为了关系我国国计民生的重大问题。对于肺结核病的防治目前应用最多的当属“化疗”，化学药物的治疗对肺结核病有明显的效果，但随着“耐多药结核”（MDR-TB）和“严重耐药结核”(XDR-TB)发病率的升高，化疗显现出了局限性。那么，新的防治方法就成为了亟待解决的问题。一直以来，利用免疫学方法寻找新的有效预防和治疗肺结核病的手段都是该领域研究的热点与重点。运用疫苗预防和治疗肺结核病是最有效的肺结核病防控策略之一，但是现阶段研究进展缓慢。目前，唯一可用于预防肺结核病的疫苗――卡介苗（BCG）仅对儿童播散性结核有一定的保护效果，但一般认为对成人结核保护效果比较弱。虽然一些新型的抗肺结核病疫苗相继被开发，但大多仍处于探索阶段，效果不甚理想。其中重要原因除了肺结核病免疫保护机理不十分清楚，还有就是在不同感染时期引起免疫反应的结核分枝杆菌有效抗原仍然不明确，这就成为了疫苗设计以及免疫策略制定的障碍。抗原关系到疫苗的成败，那么筛选出与发病密切相关的功能性抗原以及更好地了解其免疫应答机制就可以为研制不同临床需求的疫苗、制定免疫策略提供更多实际应用选择。
在肿瘤研究领域有研究标明，肿瘤细胞表达的分子伴侣蛋白（Hsp70、Gp96等），利用含有Hsp70、Gp96等蛋白的疫苗免疫小鼠后可引起针对肿瘤抗原的特异性免疫反应，推测分子伴侣携带有肿瘤特异性抗原肽；在感染性疾病研究领域，有研究从乙肝病灶组织中提取的Gp96蛋白带有一段HBV（乙肝病毒）特异性抗原。对于肺结核免疫研究领域，目前还没有直接从肺组织内筛选结核杆菌抗原的相关报道。
目前对于分子伴侣蛋白的分离方法有亲和层析，还有一种方法通过Rotofor液相等电聚焦电泳技术得到富集多种分子伴侣的蛋白混合物。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种多肽。
本发明提供的多肽，是如下1）或2）：
1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；
2）分别将1）所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能分别由1）-4）衍生的多肽。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
本发明的另一个目的是提供一种组合物。
本发明提供的组合物，由多肽1、多肽2和多肽3的三种或者任意两种组成；
所述多肽1的氨基酸序列为序列表中序列1自N末端19-27位；
所述多肽2的氨基酸序列为序列表中序列1自N末端21-29位；
所述多肽3的氨基酸序列为序列表中序列1自N末端9-17位。
上述组合物由所述多肽1、所述多肽2和所述多肽3组成。
上述组合物中，所述多肽1、所述多肽2和所述多肽3的质量比为（0.5-1.5）：（0.5-1.5）：1；所述多肽1、所述多肽2和所述多肽3的质量比具体为1：1：1。
所述组合物的功能为如下1）-5）中的至少一种：
1）用于制备肺结核疫苗；
2）用于制备激活或促进肺结核患者体内特异性CTL反应产品；
3）用于制备激活或促进结核分枝杆菌抗原特异性CTL反应产品；
4）用于制备激活或促进肺结核患者体内特异性IFN-γ产生的产品；
5）用于制备促进或激活结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ产生的产品。
上述功能中，肺结核患者体内特异性CTL反应为如下两种：
A为针对所述多肽的特异性CTL反应；
B为针对结核分枝杆菌其他抗原的特异性CTL反应，所述其他抗原包括结核分枝杆菌中除所述多肽以外的其他多肽抗原和结核分枝杆菌中的其他大分子抗原。
所述促进肺结核患者体内特异性CTL反应或促进结核分枝杆菌抗原特异性CTL反应体现如下a和/或b：
a）提高裂解酶的表达量，
所述裂解酶为granzyme A和/或perforin；
所述granzyme A的氨基酸序列为序列表中的序列4；
所述perforin的氨基酸序列为序列表中的序列5；
所述granzyme A的编码基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列2；
所述perforin的编码基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列3；
b）提高对靶细胞的杀伤比例；
所述靶细胞为表达Caspase-3的细胞，所述表达Caspase-3的细胞具体为离体的THP1细胞。
本发明的第三个目的是提供一种制备上述组合物的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
将上述组合物中的所述多肽1、所述多肽2和所述多肽3的三种或者任意两种混合，得到组合物。
上述方法中，所述多肽1、所述多肽2和所述多肽3混合的质量比为（0.5-1.5）：（0.5-1.5）：1：1；所述多肽1、所述多肽2和所述多肽3的质量比进一步具体为1：1：1。
上述多肽在在制备促进肺结核患者体内淋巴细胞增殖的产品或者制备结核分枝杆菌抗原特异性淋巴细胞增殖的产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述组合物在如下1）-5）中的至少一种中的应用也是本发明保护的范围：
1）制备肺结核疫苗；
2）制备激活或促进肺结核患者体内特异性CTL反应产品；
3）制备激活或促进结核分枝杆菌抗原特异性CTL反应产品；
4）制备激活或促进肺结核患者体内特异性IFN-γ产生的产品；
5）制备促进或激活结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ产生的产品；
所述促进肺结核患者体内特异性CTL反应或促进结核分枝杆菌抗原特异性CTL反应具体体现如下a和/或b：
a为提高裂解酶的表达量；b为提高对靶细胞的杀伤比例；
所述裂解酶为granzyme A和/或perforin；
所述靶细胞为表达Caspase-3的细胞；
所述granzyme A的氨基酸序列为序列表中的序列4；
所述perforin的氨基酸序列为序列表中的序列5；
所述granzyme A的编码基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列2；
所述perforin的编码基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列3。
所述表达Caspase-3的细胞为离体的THP1细胞。
本发明的第四个目的是提供一种产品A或产品B。
本发明提供的产品A，其活性成分为上述多肽；所述产品A为如下1）-3）中任一产品：1）肺结核疫苗、2）促进肺结核患者体内淋巴细胞增殖的产品、3）结核分枝杆菌抗原特异性淋巴细胞增殖的产品；
本发明提供的产品B，其活性成分为上述组合物；所述产品B为如下1）-6）中任一产品：1）肺结核疫苗；2）激活或促进肺结核患者体内特异性CTL反应产品；3）激活或促进结核分枝杆菌抗原特异性CTL反应产品；4）激活或促进肺结核患者体内特异性IFN-γ产生的产品；5）促进或激活结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ产生的产品。本发明的实验证明，本发明筛选了一种多肽及其三个表位多肽的混合物，该多肽可以促进肺结核患者体内淋巴细胞增殖或者促进结核分枝杆菌抗原特异性淋巴细胞增殖，而三个表位多肽的混合物可以激活CTL反应且可以产生特异性IFN-γ，因此证明，多肽及其表位肽混合物可以为结核分枝杆菌抗原，可以用来开发新型结核疫苗；也为开发新的佐剂成分提供新的思路。
附图说明
图1为Rotofor等电聚焦电泳的实验体系
左图为运行中的仪器状态，右图为等电聚焦电泳收集到的组份
图2为等电聚焦电泳组份的SDS-page电泳结果
上图为非肺结核感染对照组，下图为来自肺结核感染组织的样本
图3为各组分Gp96和Hsp70的western检测结果
图4为PRF1和GZMA基因的real-time PCR检测结果
图5为多肽混合物刺激体外CTL反应的检测结果
图6为临床诊断IFN-γELISPOT检测结果
图7为多肽混合物刺激IFN-γELISPOT检测结果
图8为pknA多肽刺激PBMC体外增殖实验结果
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、结核分枝杆菌抗原多肽及其三个表位肽混合物pknA-M的获得
将已有的Rotofor技术整合液相质谱联用技术，快速筛选出组织内存在的结核分枝杆菌抗原多肽，该多肽的氨基酸序列为RTFSSGQRALLWAAGVLGALAIIIAVLLVIKAPG（序列1），共34个氨基酸，命名为pknA。可以通过人工合成该多肽。
该多肽的三个表位肽ALAIIIAVL（序列1自N末端19-27位的氨基酸所示的多肽1）和AIIIAVLLV（序列表中序列1自N末端21-29位的氨基酸所示的多肽2）和ALLWAAGVL（序列表中序列1自N末端9-17位的氨基酸所示的多肽3），均可通过人工合成。
一、多肽的筛选
1、制备组织裂解液
用Tris base、NaCl、TritonX-100、TritonX-114、NP40（Sigma，USA。货号分别为：T4661、S7653、T9284、X114、I3021）、蛋白酶抑制剂（Roche公司，货号：04693159001）配制组织裂解液（Tris-Cl:10mM<PH7.4>；NaCl：10mM；TritonX-100、TritonX-114、NP40各0.1％<V/V>。）。称取1g组织，在5ml组织裂解液中剪碎置于组织研磨器内，冰浴中充分研磨，离心取上清。已鉴定的肺结核病变肺组织（感染了结核分枝杆菌）的含全蛋白的组织裂解液作为实验组样品，用于液相等电聚焦电泳。见图1。
采用同样的方法提取对照组（已鉴定没有肺结核病变）的肺组织的含全蛋白的组织裂解液，作为对照组样品，用于液相等电聚焦电泳。
2、Rotofor液相等电聚焦电泳
1）等电聚焦电泳后分离蛋白Hsp70、Gp96
将上述1得到的对照组样品和实验组样品进行Rotofor液相等电聚焦电泳，结果如图2所示，实验组在pH5.4－6.0范围内得到70KD的蛋白为Hsp70，pH5.9-6.5范围内得到94KD的蛋白为Gp96；对照组在pH4.6-6.0范围内得到70KD的蛋白为Hsp70，pH5.8-6.2得到94KD的蛋白为Gp96。
2）蛋白样品Hsp70、Gp96的Western Blot鉴定
将上述得到的实验组的Hsp70、Gp96和对照组的Hsp70、Gp96分别进行WesternBlot鉴定（抗体为Mouse monoclonal to Hsp70,abcam,货号为ab6535和Mousemonoclonal to GRP94，abcam，货号为ab63469），结果如图3所示，进一步证明，实验组在pH5.4－6.0范围内得到70KD的蛋白为Hsp70，pH5.9-6.5范围内得到94KD的蛋白为Gp96；对照组在pH4.6-6.0范围内得到70KD的蛋白为Hsp70，pH5.8-6.2得到94KD的蛋白为Gp96。
3、合并含有目的蛋白（Hsp70、Gp96）的等电聚焦后组份
将上述经Western Blot鉴定为实验组的Hsp70的各pH值对应的蛋白合并，得到实验组总Hsp70；
将上述经Western Blot鉴定为实验组的Gp96的各pH值对应的蛋白合并，得到实验组总Gp96；
将上述经Western Blot鉴定为对照组的Hsp70的各pH值对应的蛋白合并，得到对照组总Hsp70；
将上述经Western Blot鉴定为对照组的Gp96的各pH值对应的蛋白合并，得到对照组总Gp96。
4、LTQ液质联用离子阱质谱系统分析
1）质谱前处理
将上述实验组总Hsp70、实验组总Gp96、对照组总Hsp70、对照组总Gp96样品经过10KD超滤管浓缩至100ul，再加入0.2％（W/V）TFA酸化处理（4度，10小时。），得到处理后样本。
酸化处理是为了使联系在伴侣分子上的多肽解离下来。
2）、LTQ液质联用离子阱质谱分析混合蛋白样本
将上述得到的处理后各样本经过10KD超滤管离心，收集小于10KD的滤出液体，经过冷冻真空干燥仪浓缩样本至10ul，利用zip－tip（C18反相柱）除盐，然后上机检测，搜集数据。
3）、Bio-work软件搜索结核杆菌全蛋白序列数据库
以蛋白组序列明确的临床菌株：94M4241A、021987、T85、Haarlem、F11、GM1503六株全蛋白序列设立检索数据库进行检索。检索出的可靠性高的序列，其中，实验组即肺结核肺组织样本实验组，检出结核分枝杆菌来源的多肽PknA，其氨基酸序列如下表1所示，对照组未检出结核分枝杆菌相关多肽。
表1LTQ液质联用离子阱质谱系统分析出的多肽序列
| 名称 | 多肽序列 |
| PknA | RTFSSGQRALLWAAGVLGALAIIIAVLLVIKAPG（序列1） |
二、三个表位肽的筛选及多肽混合物pknA-M的获得
上述表1的多肽PknA进行HLA-I表位预测（与MHC-I分子结合能力的预测），利用MHCPred version2.0、IEDB Prediction、SYFPEITH抗原表位分析数据库针对以上多肽序列进行表位预测，结果如下表2所示，Low Predicted IC50Value(nM)=goodbinders。
表2为HLA-I表位预测分析
上述多肽1-3也可以通过合成直接得到。
人工合成多肽1（ALAIIIAVL，序列1自N末端19-27位的氨基酸所示的多肽1）、多肽2（AIIIAVLLV，序列表中序列1自N末端21-29位的氨基酸所示的多肽2）和多肽3（ALLWAAGVL，序列表中序列1自N末端9-17位的氨基酸所示的多肽3。
将上述多肽1、多肽2、多肽3按照质量比为1:1:1混合，得到多肽混合物pknA-M。
实施例2、多肽混合物pknA-M的应用
一、多肽混合物pknA-M特异性地促进CTL反应
1、多肽混合物pknA-M特异性地促进肺结核病患者体内的CTL反应
采用Real－time PCR检测裂解酶基因表达量，这是由于CTL引起细胞杀伤的机理之一就是通过裂解酶，包括granzyme A，granzyme B和perforin，因此，当CTL（细胞毒性T淋巴细胞）反应发生时，裂解酶的表达量上升，因此通过裂解酶的表达量可以间接地反应CTL反应。因此本实验旨在检测质谱筛选出来的多肽是否可以特异性激发细胞毒性作用。
具体如下：
首先从离体的肺结核病患者（已鉴定感染了结核分枝杆菌，患者知情）血液和健康人（已鉴定没有肺结核病变，没有感染结核分枝杆菌，检测者知情）的血液中分别分离得到的肺结核病患者外周血淋巴细胞（PBMC）以及健康人对照的PBMC，分别进行如下2组实验：
阴性对照组1：向肺结核病患者外周血淋巴细胞（PBMC）中加入10ul溶剂PBS（TAKARA公司，货号：T900）；
阴性对照组2：向健康人对照的PBMC中加入10ul溶剂PBS（TAKARA公司，货号：T900）；
实验pknA-M组1：将实施例1得到的多肽混合物pknA-M加入肺结核病患者外周血淋巴细胞（PBMC）中，使多肽混合物pknA-M中的多肽1、2、3在PBMC中的浓度均为10ug/ml；
实验pknA-M组2：将实施例1得到的多肽混合物pknA-M加入健康人对照的PBMC中，使多肽混合物pknA-M中的多肽1、2、3在PBMC中的浓度均为10ug/ml；
将各组多肽与PBMC共同孵育（37度）24小时后，收集悬浮细胞，分别提取各组收集的悬浮细胞的总RNA并反转录为cDNA，进行real-time PCR验证（引物如下表2），检测granzyme A（序列4）和perforin（序列5）对应的基因GZMA（序列2）和PRF1（序列3）的表达水平，从而看出granzyme A和perforin的表达量。
real-time PCR的阴性对照为以水为模板的PCR体系，阳性对照为检测β-actin管家基因的PCR体系。
表3为Real－time PCR检测基因的引物序列
阴性对照组1和阴性对照组2中的granzyme A的相对表达量分别为10.91和8.08；
实验pknA-M组1和实验pknA-M组2中的granzyme A的相对表达量分别为10.60和10.35；
阴性对照组1和阴性对照组2中的perforin的相对表达量分别为9.67和6.89；
实验pknA-M组1和实验pknA-M组2中的perforin的相对表达量分别为8.78和8.05；
将上述结果进行比例计算，结果如图4所示，HD为健康人PBMC；TB为肺结核患者PBMC；Ratio：比率（多肽混合物刺激/PBS阴性对照）=2－△△Ct；
可以看出，pknA-M（3个多肽的混合物）刺激肺结核病人PBMC可以产生显著性高水平的granzyme A（比率为1.24，而健康对照组的比率为0.21）和perforin基因表达（比率为1.85，而健康对照的比率为0.44），预示着该多肽混合物pknA-M可以特异性地促进肺结核病患者体内的CTL反应，具有作为候选结核分枝杆菌特异性功能抗原的潜力。
2、体外CTL反应实验
体外CTL反应实验是经典的检测CTL表位多肽刺激CTL反应的一种方法，CTL反应的结果可以通过多种方法表示出来，本实施是通过流式细胞术检测表达Caspase-3的靶细胞的比例来显示CTL反应的杀伤比例的，具体方法如下。
靶细胞准备：以THP1（ATCC，USA货号：TIB-202TM，表达Caspase-3）为靶细胞，THP1细胞系在终浓度为10ug/ml的PMA（sigma，USA货号：P1585）的刺激下，37度CO2孵箱孵育72小时后，转化为贴壁的巨噬细胞；将贴壁的巨噬细胞用PKH26（sigma，USA货号：MINI26－1KT）染料染色；以每孔2x104个细胞加入到96孔板中；加入待检测多肽混合物（ALAIIIAVL、AIIIAVLLV和ALLWAAGVL，终浓度均为10ug/ml，混合肽刺激组命名为pknA-M），37度孵箱孵育过夜；效应细胞：来自离体的肺结核患者外周血PBMC和离体的健康人的PBMC对照；再将效应细胞混入到加有靶细胞的孔中，每孔2x105个细胞，使效应细胞：靶细胞为10：1，37度孵箱孵育过夜；
以加入等体积PBS作为不刺激的对照（该组命名为PBS）。
收集细胞沉淀，将细胞用FITC标记的Caspase-3抗体（BD Pharmingen，USA货号：560901）标记；
上述分组方式具体如下：
PBS（TB）：肺结核病患者外周血淋巴细胞（PBMC）+THP1+PBS；
PBS（HD）：健康人的PBMC+THP1+PBS；
pknA-M（TB）：肺结核病患者外周血淋巴细胞（PBMC）+THP1+pknA-M；
pknA-M（HD）：健康人的PBMC+THP1+pknA-M；
流式细胞仪检测PKH26阳性和Caspase-3阳性的双阳性细胞比例，PKH26单阳性细胞比例。
结果如图5所示，HD为健康人PBMC；TB为肺结核患者PBMC；
CTL反应杀伤比例等于流式细胞分析检测后总细胞中PKH26阳性和Caspase-3阳性的双阳性细胞的比例比上PKH26单阳性细胞的比例。
因此，PBS（TB）的PKH26和Caspase-3双阳性细胞的细胞比例为2％，PKH26单阳性细胞的比例为8.4％，PBS（TB）的杀伤比例为23.81％；
PBS（HD）PKH26和Caspase-3双阳性细胞的细胞比例为1.6％，PKH26单阳性细胞的比例为6.8％，PBS（HD）杀伤比例为23.53％；
pknA-M（TB）PKH26和Caspase-3双阳性细胞的细胞比例为8.3％，PKH26单阳性细胞的比例为15.3％，pknA-M（TB）的杀伤比例分别为54.25％
pknA-M（HD）PKH26和Caspase-3双阳性细胞的细胞比例为4.1％，PKH26单阳性细胞的比例为9.2％，pknA-M（HD）的杀伤比例分别为44.56％；
从上述可以看出，PBS对照组在不同效应细胞组的杀伤比例无明显差别，而当多肽混合物pknA-M刺激时，来自肺结核病患者的PBMC作为效应细胞时，多肽可以刺激出较健康组更高的靶细胞杀伤比例，肺结核病患者组的CTL反应杀伤比例为54.2％，健康对照组为44.5％。说明pknA多肽中CTL表位多肽混合物（ALAIIIAVL、AIIIAVLLV和ALLWAAGVL）可以引起特异性的CTL杀伤反应，具有作为候选结核分枝杆菌特异性功能抗原的潜力。
二、多肽混合物pknA-M刺激抗原特异性的IFN-γ分泌水平
IFN-γELISPOT检测是目前临床用于诊断结核病的一种辅助方法，也是免疫学实验中用于检测淋巴细胞被抗原刺激后IFN-γ的分泌水平的经典实验，从而评价抗原对淋巴细胞的激活情况。
外周血细胞分离：采集临床确诊为肺结核患者（样本数21个，且临床诊断IFN-γELISPOT检测为阳性，如图6所示，实验用的样品来源于IFN-γELISPOT检测为阳性肺结核患者，Ag-A大于30或Ag-B大于40者为阳性）的外周血，并用Ficoll—Hypaque密度梯度离心法分离PBMC（Ficoll-Paque Plus，公司：Amersham Biosciences货号：18-1152-69），将细胞重悬于Lympho-Spot培养基(公司：U-CyTech Bioscience,TheNetherlands)中。加细胞2x105个细胞/孔于预包被anti-IFN-γ单抗（公司：eBioscience货号：14-7319）的96孔板(MultiScreen-IP;公司Millipore)中，每孔加入多肽混合物（ALAIIIAVL、AIIIAVLLV和ALLWAAGVL，终浓度均为10ug/ml，混合肽刺激组命名为pknA-M），于温箱37°C,5%CO2孵育24小时。加入生物素标记anti-IFN-g检测单抗（公司：eBioscience货号：13-7319）4个小时，再加入streptavidin-alkaline phosphatase conjugatejugate(公司：Pierce Biotechnology)孵育1个小时。洗涤后，加入显色底物nitroblue tetrazolium-BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate，公司：Sigma)，每孔的斑点数通过ELISPOTreader(BioReader4000Pro-X;公司：Biosys,Germany)系统计数。
实验中对照多肽序列为：CWAPKVHGAWNI。
结果如图7所示，对照组斑点数平均值为2.05/2ⅹ105PBMC，标准差为±2.44，pknA-M多肽混合物组斑点数为29.57/2ⅹ105PBMC，标准差为±28.75。两组之间存在统计学差异，t检验p值<0.0001，差异极显著；可以看出，多肽混合物pknA-M的相对于对照多肽，可以显著刺激抗原特异性的IFN-γ分泌水平，说明该多肽混合物可以激活抗原特异性T细胞免疫反应，有作为候选结核分枝杆菌特异性功能抗原的潜力。
实施例3、多肽pknA在促进PBMC中淋巴细胞增殖中的应用
为了检测抗原多肽刺激淋巴细胞增殖的情况，本实施应用临床确诊为肺结核患者（样本数3个，且临床诊断IFN-γELISPOT检测为阳性）以及健康人分离出的PBMC细胞，检测了抗原多肽刺激后的增殖水平。
具体步骤为：用Ficoll—Hypaque密度梯度离心法分离PBMC（Ficoll-Paque Plus;Amersham Biosciences），将细胞重悬于1640培养基中。用PBS（TAKARA公司，货号：T900）重悬细胞，并加入等体积浓度为5 M的CFSE溶液（公司：invitrogen货号：C34554），37°C避光染色10分钟，终止用PBS洗三次后，悬浮于1640培养基中，加4x105个细胞100ul/孔于U型底96孔细胞培养板；加入100ul刺激物；温箱37°C,5%CO2孵育4天后，取出细胞于流式细胞仪读数，相对增殖比率=刺激组增殖比例-阴性对照组增殖比例。
根据刺激物的不同分为如下几组：
pknA-M+TB：pknA+肺结核患者PBMC细胞，pknA中的终浓度为10μg/ml；
pknA-M+HD：pknA+健康人PBMC细胞，pknA中的终浓度为10μg/ml；
CD3组+TB：anti-CD3（公司：BD，货号：14-0039-80）+肺结核患者PBMC细胞，anti-CD3的终浓度为1ug/ml；
CD3组+HD：anti-CD3+健康人PBMC细胞，anti-CD3的终浓度为1ug/ml；
CD28+TB：anti-CD28（公司：BD，货号：14-0289-82）+肺结核患者PBMC细胞，anti-CD28的终浓度为1ug/ml；
CD28组+HD：anti-CD28+健康人PBMC细胞，anti-CD28的终浓度为1ug/ml；
对照多肽+TB：对照多肽（CWAPKVHGAWNI）+肺结核患者PBMC细胞，对照多肽的终浓度为10ug/ml；
对照多肽+HD：对照多肽（CWAPKVHGAWNI）+健康人PBMC细胞，对照多肽的终浓度为10ug/ml；
阴性对照+TB：100ul1640培养基+肺结核患者PBMC细胞
阴性对照+HD：100ul1640培养基+健康人PBMC细胞
结果如图8所示，
pknA+TB组中的淋巴细胞的刺激组增殖比例、阴性对照组增殖比例和相对增殖比率分别为20.45%、12.7%和7.75%；
pknA+HD中的淋巴细胞的刺激组增殖比例、阴性对照组增殖比例和相对增殖比率分别为17.8%、14.7%和3.1%；
CD3CD28组+TB中的淋巴细胞的刺激组增殖比例、阴性对照组增殖比例和相对增殖比率分别为24.65%、12.7%和11.95%；
CD3CD28组+HD中的淋巴细胞的刺激组增殖比例、阴性对照组增殖比例和相对增殖比率分别为26.5%、14.7%和11.8%；
对照多肽+TB中的淋巴细胞的刺激组增殖比例、阴性对照组增殖比例和相对增殖比率分别为17.2%、12.7%和4.5%；
对照多肽+HD中的淋巴细胞的刺激组增殖比例、阴性对照组增殖比例和相对增殖比率分别为18.9%、14.7%和4.2%；
可以看出，多肽pknA刺激组相对对照多肽，增殖比率特异性增高，是潜在活化淋巴细胞增殖的有效结核分枝杆菌抗原。
上述实验均可以看出，多肽混合物pknA-M和多肽pknA为结核分枝杆菌的有效抗原，可以用来作为结核分枝杆菌或肺结核疫苗。
Claims (9)
1.一种多肽，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽。
2.一种组合物，由多肽1、多肽2和多肽3的三种组成；
所述多肽1的氨基酸序列为序列表中序列1自N末端19-27位；
所述多肽2的氨基酸序列为序列表中序列1自N末端21-29位；
所述多肽3的氨基酸序列为序列表中序列1自N末端9-17位；
所述多肽1、所述多肽2和所述多肽3的质量比为1：1：1。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：
所述组合物为具有如下1)-5)中的至少一种功能的组合物：
1)用于制备肺结核疫苗；
2)用于制备激活或促进肺结核患者体内特异性CTL反应药物；
3)用于制备激活或促进结核分枝杆菌抗原特异性CTL反应药物；
4)用于制备激活或促进肺结核患者体内特异性IFN-γ产生的药物；
5)用于制备促进或激活结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ产生的药物。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于：
所述促进肺结核患者体内特异性CTL反应或促进结核分枝杆菌抗原特异性CTL反应体现如下a和/或b：
a为提高裂解酶的表达量；b为提高对靶细胞的杀伤比例；
所述裂解酶为granzyme A和/或perforin；
所述靶细胞为表达Caspase-3的细胞，所述表达Caspase-3的细胞为离体的THP1细胞。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于：
所述granzyme A的氨基酸序列为序列表中的序列4；
所述perforin的氨基酸序列为序列表中的序列5；
所述granzyme A的编码基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列2；
所述perforin的编码基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列3。
6.一种制备权利要求2-5中任一所述组合物的方法，包括如下步骤：
将权利要求2-5中任一所述组合物中的所述多肽1、所述多肽2和所述多肽3的三种混合，得到组合物；
所述多肽1、所述多肽2和所述多肽3的质量比为1：1：1。
7.权利要求1所述多肽在制备肺结核疫苗或制备促进肺结核患者体内淋巴细胞增殖的药物或者制备结核分枝杆菌抗原特异性淋巴细胞增殖的药物中的应用；
或权利要求2-5中任一所述组合物在如下1)-5)中的至少一种中的应用：
1)制备肺结核疫苗；
2)制备激活或促进肺结核患者体内特异性CTL反应药物；
3)制备激活或促进结核分枝杆菌抗原特异性CTL反应药物；
4)制备激活或促进肺结核患者体内特异性IFN-γ产生的药物；
5)制备促进或激活结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ产生的药物；
所述促进肺结核患者体内特异性CTL反应或促进结核分枝杆菌抗原特异性CTL反应具体体现如下a和/或b：
a为提高裂解酶的表达量；b为提高对靶细胞的杀伤比例；
所述裂解酶为granzyme A和/或perforin；
所述靶细胞为表达Caspase-3的细胞；
所述granzyme A的氨基酸序列为序列表中的序列4；
所述perforin的氨基酸序列为序列表中的序列5；
所述granzyme A的编码基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列2；
所述perforin的编码基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列3；
所述表达Caspase-3的细胞为离体的THP1细胞。
8.一种药物A，其活性成分为权利要求1所述多肽；所述药物A为如下1)-3)中任一药物：1)肺结核疫苗、2)促进肺结核患者体内淋巴细胞增殖的药物、3)结核分枝杆菌抗原特异性淋巴细胞增殖的药物。
9.一种药物B，其活性成分为权利要求2-5中任一所述组合物；所述药物B为如下1)-5)中任一药物：1)肺结核疫苗；2)激活或促进肺结核患者体内特异性CTL反应药物；3)激活或促进结核分枝杆菌抗原特异性CTL反应药物；4)激活或促进肺结核患者体内特异性IFN-γ产生的药物；5)促进或激活结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ产生的药物。
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