CN102516356A - 可用于结核分枝杆菌感染检测的表位多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了几种结核分枝杆菌特异性抗原表位多肽，特别是抗原Rv3615c的抗原表位多肽，为8-11个连续的多肽片段，通过该抗原多肽在结核病例中的反应的灵敏度和特异性评价其用于临床检测的可行性，结果表明，该抗原多肽库在结核病患者中具有较高的T细胞反应性，且阳性率达到64％(9/14)，且与健康志愿者结果比较，特异性达100％(6/6)，因此，应用该抗原肽库特异性T细胞γ干扰素检测能够有效的诊断结核分枝杆菌感染。

Description

可用于结核分枝杆菌感染检测的表位多肽及其应用

技术领域

本发明涉及结核分枝杆菌特异性抗原表位多肽，特别是抗原Rv3615c的抗原表位多肽。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌引起的传染病，据WHO资料估计，全球三分之一的人口受结核分枝杆菌感染，每年新发活动性感染病例九百多万，死亡一百万例以上。近年来，我国结核病发病率居高不下，每年新发病例超过一百万，死亡近二十万例，对我国公民健康、社会安定和经济发展带来严重危害。

结核病的早期诊断对于控制患者疾病进展和疾病的传播具有重要意义。目前，结核病临床诊断仍然缺乏高灵敏度和高特异性的手段。传统的结核菌素皮下试验所用的抗原结核菌素因为能够跟卡介苗(BCG)接种产生交叉反应使得其产生较高比例的假阳性，而临床诊断的“金标准”——结核分枝杆菌培养，则有时间长，阳性率低等缺陷。另外，基于X射线透射和临床表现的诊断则特异性较低，容易与其他肺部感染或疾病相混淆。

结核分枝杆菌感染人体突破天然免疫屏障后，被感染细胞内一些结核分枝杆菌抗原可以被细胞内蛋白酶体切割成不同长度的多肽，其中8-11个氨基酸长度多肽可以通过人抗原处理相关转运蛋白(TAP)转运至内质网中，并与人白细胞抗原(HLA)I类分子结合形成复合体，共同呈递到细胞表面，通过与T细胞相互识别，从而使得感染细胞的病原体能够被特异性的杀伤性T细胞杀伤并清除。一个抗原往往包含多个HLA限制性表位多肽，从而使得该抗原能够被不同遗传背景人群所识别。通过抗原中不同HLA限制性表位多肽的鉴定，一方面，这些短的表位多肽可以直接结合于HLA分子，用于T细胞免疫为基础的检测减少了细胞内加工过程，能够提高检测效率；另一方面，表位多肽用于疫苗设计能够避免因使用细菌全抗原产生的毒副作用。

目前，通过结核分枝杆菌与BCG菌株基因组的研究比较发现了在所有BCG菌株中完全缺失的基因片段，称为RD区，针对其中RD1区编码的蛋白ESAT-6和CFP-10的特异性T细胞分泌产生的γ-干扰素(IFN-γ)的检测(IGRAs)，催生了两种商品化结核感染诊断试剂盒，即基于酶联免疫斑点技术(ELISPOT)的T-SPOT.TB(Oxford Immunotech，Abingdon，UnitedKingdom)和基于酶联免疫吸附技术(ELISA)的QuantiFERON-TB Gold(Cellestis，Carnegie，Australia)。目前，这两种诊断试剂盒已经得到美国FDA批准上市，作为结核感染临床诊断的辅助手段。

然而，由于专利权的保护，使得我国引进相关产品进行临床诊断时成本极高且不适合我国特殊的流行病学现状，不适用于广泛推广，并且以ESAT-6和CFP-10为抗原的诊断试剂开发都难以逃避这两种抗原的专利保护。因此获得具有较高的灵敏度和特异性的可用于结核分枝杆菌感染或者结核病的抗原，是目前急需解决的问题。

发明内容

最新研究表明，Rv3615c抗原具有较高的T细胞免疫原性，其反应强度与ESAT-6和CFP-10相比较水平相当，且只在结核分枝杆菌感染者体内有反应，因此可能是一个较好的结核特异性诊断抗原。本发明的目的在于通过生物信息学预测Rv3615c抗原中包含的杀伤性T细胞(CTL)表位，并通过结核病例的反应情况，筛选得到一系列中国人群中常见白细胞抗原(HLA)A位点分子限制性表位。根据这些表位多肽在结核病例及健康志愿者中的反应强度和检测灵敏度，并结合其在健康志愿者中的反应情况，提供一种能够用于结核分枝杆菌感染检测的抗原表位多肽组合。

本发明要解决的技术问题是提供几种结核分枝杆菌特异性的抗原表位多肽多肽，其氨基酸序列为(a)或(b)或(c)所示。

(a).所述多肽的氨基酸组成如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.9所示。

(b).(a)中所述氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与结核分枝杆菌的CTL表位相关的由序列(a)衍生的多肽。

(c).与(a)(b)中氨基酸序列整体相似度在85％以上的由(a)衍生的多肽或其类似物。

含有权利要求1所述多肽编码DNA的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

所述抗原表位多肽在制备结核分枝杆菌特异性T细胞检测试剂盒中的应用也属于本发明要求保护的范围。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种结核分枝杆菌特异性T细胞检测试剂盒，含有所述多肽或所述多肽的编码DNA分子或根据他们衍生出的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌等。

本发明的原理：Rv3615c为结核分枝杆菌特异性表达的抗原，且在卡介苗中不表达。通过生物信息学工具预测该抗原全长内中国人群中主要HLA-A位点(A2，A24，A3超家族)限制性多肽。能够被病例所识别的表位多肽能够刺激特异性CD8+T细胞产生γ-干扰素，通过ELISPOT技术可以检测这些特异性CD8+T细胞分泌产生的γ-干扰素，并最终形成斑点。个体对这些表位多肽呈阳性反应说明其体内含有Rv3615c特异性T细胞，即证明该个体受到结核分枝杆菌感染。

本项目选取结核病例14例，健康志愿者6例，采集外周血标本，留取全血标本测定其HLA-A位点及B位点基因分型，并分离外周血单个核细胞(PBMCs)。采用本发明提供的多肽，通过ELISPOT技术检测刺激产生的特异性T细胞分泌的γ干扰素，从而评价其T细胞免疫原性。通过该抗原多肽在结核病例中的反应的灵敏度和特异性评价其用于临床检测的可行性，结果表明，该抗原多肽库在结核病患者中具有较高的T细胞反应性，且阳性率达到64％(9/14)，且与健康志愿者结果比较，特异性达100％(6/6)，因此，应用该抗原肽库特异性T细胞γ干扰素检测能够有效的诊断结核分枝杆菌感染。

附图说明

图1SEQ-ID-1-9表位多肽肽库在结核病例和健康志愿者中的反应水平

A：结核病例组  B：健康对照组

图2结核病例对SEQ-ID-NO.1-9表位多肽的反应情况

图3结核病例与健康志愿者对Rv3615c多肽库的ELISPOT反应直观图

1-5：结核菌感染病例反应；6-10健康志愿者反应。

刺激物：1，6：空白；2，7：ESAT-6肽库；3，8：CFP-10肽库；5，10：Rv3615c肽库；4，9：PHA。

具体实施方式

实施例1可用于结核分枝杆菌检测的抗原

结核分枝杆菌特异性抗原Rv3615c，其氨基酸组成如SEQ ID NO.10所示。

SEQ ID NO.10：

MTENLTVQPERLGVLASHHDNAAVDASSGVEAAAGLGESVAITHGPYCSQFNDTLNVYLT

AHNALGS SLHTAGVDLAKSLRIAAKIYSEADEAWRKAIDGLFT

实施例2可用于结核分枝杆菌检测的多肽

所述多肽氨基酸序列为抗原Rv3615c中的8-11个连续氨基酸组成的多肽，具体如下表所示，其中优选如SEQ-ID-NO.1、SEQ-ID-NO.2、SEQ-ID-NO.5、SEQ-ID-NO.6、SEQ-ID-NO.7所示。

表1、表位多肽信息：

实施例3抗原应用于检测试剂盒的开发

本专利所保护的抗原可用于结核分枝杆菌感染的诊断，形成临床或实验室诊断用试剂盒。

检测试剂盒包含：

1.实施例2中的一条或几条多肽组成的混合多肽肽库；

2.植物凝集素(PHA)溶液阳性对照刺激物；

3.ELISPOT96孔PVDF膜型板；

4.人γ-干扰素单克隆抗体(一抗)，生物素标记的人γ-干扰素单克隆抗体(二抗)，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素及辣根过氧化物酶反应底物；

5.其他ELISPOT检测所需试剂及耗材。

实施例4抗原应用于结核分枝杆菌感染临床检测。

1、志愿者外周血淋巴细胞(PBMCs)分离：

本发明所涉及的病例志愿者同时满足以下临床诊断标准：

A.临床主治医生根据志愿者临床表现确诊为肺结核；

B.分离培养结核分枝杆菌菌落呈阳性；

C.X射线影像呈现肺部病变；

本发明所用的淋巴细胞来自个体的静脉外周血。经过筛选的个体经临床医生体检合格后，由试验者告知具体项目流程及所需血液的数量，经志愿者同意并签署知情同意书，由临床医生将对志愿者进行采血。最终本项目筛选了14例结核病例和6例健康志愿者，采血时使用含有肝素锂抗凝的9ml一次性真空采血管(格雷纳)，每名志愿者采血约20-25ml，采血后立即颠倒防止凝血。

1)、先将新鲜采集的外周血用121℃高压灭菌冷却后的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)稀释一倍，将稀释的血样小心加入到事先准备好的15ml淋巴细胞分离液中，加入时十分小心，缓慢加入，避免界面混乱；

2)、25℃条件下用水平离心机700g离心20min，停止时降速调至最慢；

离心后的样品分四层，将上层血浆用巴斯德移液管吸出，之后小心吸出淋巴细胞层至新的无菌离心管中；

3)用等体积的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)等体积稀释吸出的淋巴细胞层，之后离心(800g，10min，25℃)；

弃掉上清，重悬后加入约7ml无血清RPMI1640清洗，500g离心5min，25℃。

弃上清，重悬，加7-8ml含10％胎牛血清(Hyclone)的RPMI-1640培养基清洗，500g离心，5min，25℃。

4)弃掉上清后用3ml含10％血清的RPMI-1640培养基重悬，取适量于血球计数板上进行细胞计数，并用含10％血清的RPMI-1640培养基最终调整至2.5×10⁶细胞/ml密度；

2.抗原制备

CD4+或者CD8+T细胞免疫反应的激发需要HLA(人白细胞抗原)及其结合的来源于抗原的多肽分子的信号激活作用。一般而言，CD4⁺T细胞通过识别HLA(人类白细胞抗原)II类分子结合表位多肽形成的复合物获得刺激信号，CD8⁺T细胞通过识别HLA-I类分子结合8-11个氨基酸长度的多肽形成的复合物获得刺激信号。HLA I类主要的抗原基因位于染色体上三个基因座位，在人群中具有一定多态性，HLA-A位点在中国人群中以A2，A24，A3超家族成员(主要包括A11，A33，A31，A30，A68)最为常见，占总人口的90％以上。其结合的表位多肽长度为8-11个氨基酸，且不同HLA-A分子对多肽N端和C端氨基酸上具有一定的偏好性。本发明通过不同HLA分子表位多肽结合特征预测Rv3615c抗原中可能包含的主要HLA-A位点分子限制性CTL表位，通过在结核病例外周血中特异性T细胞的检测对这些预测表位进行筛选和验证，最终鉴定出能够被结核感染个体特异性识别的T细胞表位。

(1).通过使用生物信息学软件(BIMAS，NetMHC3.2，SYFPEITHI)在线预测工具，选取中国人群中常见的HLA-A位点亚型(即A2，A24，A3超家族成员)限制性，根据Rv3615c抗原全长的氨基酸序列进行相关HLA-A位点亚型限制性表位多肽预测，设计了SEQ ID NO.1-9所示的多肽，将HLA限制性多肽混合，形成多肽库。

(2).T-SPOT.TB对照：每个结核病例及健康志愿者分得的PBMCs同时进行T-SPOT.TB检测，刺激物分两孔，分别为ESAT-6和CFP-10多肽库，每孔所加细胞数量与Rv3615c肽库反应中所加细胞数一致。

3、ELISPOT检测Rv3615c特异性T细胞：

ELISPOT板提前12小时以上用磷酸盐缓冲液(pH7.4)稀释的抗人γ干扰素单抗包被，4℃水平放置。在加入刺激抗原和细胞前用含10％血清(HyClone)的RPIM-1640培养基室温条件下封闭1小时。

将抗原多肽库用10％血清(HyClone)的RPMI-1640培养基稀释至每条多肽10μg/ml，向ELISPOT板孔内每孔加入100μl，每个肽库设两个重复孔，另设无多肽刺激空白对照孔和植物凝集素(PHA)刺激阳性对照孔.将稀释后的PBMCs细胞每孔加入100μl，加完后将含有100μl多肽稀释液和100μlPBMCs稀释液的ELISPOT板置37℃，5％CO2(二氧化碳)条件下孵育18小时。

4、ELISPOT洗板及结果获取：

1)孵育结束后，弃掉孔内细胞液，迅速在每孔加入200μl常温的去离子水清洗2次，之

后含5‰Tween-20的PBS(PBST)清洗3次。

2)去除洗液，在吸水纸上用力扣干，每孔加入100μl稀释的检测抗体，室温孵育2h.。

3)去除检测抗体溶液，PBST清洗3次，之后每孔加入稀释好的链霉亲和素-HRP结合物100μl，室温孵育1h。

4)显色：去除链霉亲和素-HRP结合物溶液，PBST清洗3次，之后PBS清洗2次。在吸水纸上用力扣干，之后每孔加入100μlAEC底物溶液，室温孵育15～30分钟后，当看到清晰的斑点时，用蒸馏水冲洗膜的双面以中止反应。

5)37℃或室温下晾干，之后将ELISPOT板用自动读板仪(C.T.L)对ELISPOT孔内反应的斑点进行计数，之后调整参数并进行质量控制，给出最终反应结果。

5、结果分析：

本研究共涉及经过严格标准筛选结核病患者共计14名，健康志愿者6例。将三个HLA限制性肽库反应斑点数减去空白对照孔总体反应斑点数后的值相加，得到Rv3615c预测多肽的总体反应斑点数，以每10⁶PBMCs中所含有的特异性T细胞数进行统计，其反应强度如图二所示，其反应灵敏度和特异性如表一所示。

结果显示，该抗原在结核病患者中具有较高的T细胞反应性，结核病例PBMCs对该抗原肽库反应水平与对T-SPOT.TB中ESAT-6和CFF-10抗原肽库的水平相当，统计学分析显示无显著差异，且在健康志愿者中反应水平与T-SPOT.TB检测结果一致，表明其在结核病例中的反应具有特异性(图1)。

取阳性反应判断标准：每孔斑点数＞5且为空白对照孔斑点数两倍以上。本实施例中所有结核病例或健康志愿者PBMCs对Rv3615c、ESAT-6和CFP-10的反应均按照此标准进行量化并作出阳性或阴性反应判断，每孔反应值超过此标准判定为阳性反应，低于此标准判定为阴性反应。分析表明，Rv3615c抗原多肽库在结核病例中的反应敏感度达到64％(9/14)，且与6名健康志愿者结果比较，特异性达100％(表1)。与ESAT-6和CFP-10相比，其灵敏度比ESAT-6低但略高于CFP-10。因此，应用Rv3615c抗原特异性T细胞γ干扰素检测能够有效的诊断结核分枝杆菌感染或者结核病患者。

表2.Rv3615c抗原肽库检测特异性和灵敏度统计

注：反应特异性表示为：(1-健康志愿者阳性反应数/健康志愿者总数)×％。

实施例5：结核菌培养阳性病例PBMCs体外刺激培养后对SEQ-ID-NO.1-9表位多肽反应

取5个实施例4中对Rv3615c肽库反应阳性结核菌阳性病例PBMCs进行体外培养，在培养体系中加入SEQ-ID-NO.1-9表位多肽组成的多肽库，2周后收获细胞，用ELISPOT方法检测扩增后细胞对SEQ-ID-NO.1-9表位多肽的反应情况。

步骤同实施例4中步骤1、3、4。

所加如抗原多肽为SEQ-ID-NO.1至SEQ-ID-NO.9多肽。

结果分析方法同实施例4中步骤5。分析表明，9条多肽均能够被结核病例所识别。其中SEQ-ID-NO.1，SEQ-ID-NO.3，SEQ-ID-NO.4，SEQ-ID-NO.5，SEQ-ID-NO.6，SEQ-ID-NO.7为免疫优势表位，其反应水平高，且能够被多个不同个体所识别，具有较广泛的反应性(图2)。

实施例6：ELISPOT方法检测Rv3615c SEQ-ID-NO.1-9多肽肽库在结核病例与健康志愿者中的反应。

取一名结核分枝杆菌培养阳性的结核病例和一名健康志愿者，分离PBMCs，并以Rv3615c肽库进行刺激，用ELISPOT方法检测其特异性T细胞γ-干扰素的分泌情况，并取ESAT-6和CFP-10刺激作为对照，其反应情况如图3所示。结果表明，结核病例能够对ESAT-6抗原肽库产生明显的反应，出现清晰可见的斑点，而健康志愿者对ESAT-6和CFP-10抗原均没有反应。与之相对应的是，Rv3615c抗原在结核病例中反应也非常明显，特异性斑点数达到18个，而在健康志愿者中未检测到斑点。因此，筛选出的9条表位多肽组成的Rv3615c表位多肽库用于结核分枝杆菌感染检测效果明显。

实施例7：基于CTL表位的结核疫苗

一种基于实施例2中所述表位多肽设计的结核疫苗。该疫苗以产生结核分枝杆菌特异性CTL反应为目的，将实施例2所述的表位多肽中一条或几条进行拼接，中间加入有助于表位多肽切割的链接片段(如“GPGPG”)，经过免疫接种，机体可对疫苗进行加工递呈，产生结核分枝杆菌特异性T细胞免疫反应，从而对结核分枝杆菌感染起到一定控制作用。

该疫苗还可以由权利要求2所述的DNA分子，权利要求3所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌的组合或其任意一种组成，可以达到相同或相似的效果。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.可用于结核分枝杆菌检测的抗原表位多肽，其特征在于其氨基酸组成如(a)或(b)或(c)所示：

(a)由SEQ-ID-NO.1至SEQ-ID-NO.9所示的氨基酸组成的多肽或其类似物；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有相同抗原性的由(a)衍生的多肽或其类似物；

(c)与(a)(b)中氨基酸序列整体相似度在85％以上的由(a)衍生的多肽或其类似物。

2.含有权利要求1所述多肽编码DNA分子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

3.权利要求1所述抗原表位多肽在制备结核分枝杆菌特异性T细胞检测试剂盒中的应用。

4.一种结核分枝杆菌特异性T细胞检测试剂盒，其特征在于含有权利要求1所述的多肽或其类似物，权利要求1所述多肽的编码DNA分子，权利要求2所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌的组合或其任一一种。

5.一种结核疫苗，其特征在于含有权利要求1所述的多肽，权利要求1所述多肽的编码DNA分子，权利要求3所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌的组合或其任一一种。

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