CN101533018B - 区分牛病原性和非病原性分枝杆菌感染的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫检测领域。本发明涉及用于区分牛病原性与非病原性分枝杆菌感染的检测试剂和方法。所述检测试剂包括作为特异性刺激原的重组融合蛋白rE6-M63-H70，该重组融合蛋白能够有效刺激体外培养的致敏外周血淋巴细胞高水平释放γ-干扰素(IFN-γ)。利用所述检测试剂rE6-M63-H70重组融合蛋白作为刺激原建立的牛IFN-γ释放试验克服了血清学检测方法和以PPD为刺激原的IFN-γ释放试验的不足，具有很高的灵敏度和特异性，可区分牛病原性分枝杆菌(如牛分支杆菌)感染和非病原性分支杆菌(如禽分枝杆菌或非致病性分枝杆菌)感染，甚至能区分牛病原性分枝杆菌感染与BCG免疫，因此可有效用于临床中牛病原性分枝杆菌的感染的检测。

Description

区分牛病原性和非病原性分枝杆菌感染的试剂盒及方法

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域。本发明涉及用于区分牛病原性和非病原性分枝杆菌感染的试剂盒及方法。

背景技术

牛结核病是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)和结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)引起的一种人畜共患慢性消耗性传染病，人和动物交叉感染造成该病广泛流行，因此具有非常重要的公共卫生意义。世界卫生组织(WHO)指出：“在存在牛结核病的国家，人类始终受到威胁，除非消灭牛结核病，否则人类结核病的控制是不会成功的。”目前，一些较发达国家和地区，如美国、澳大利亚和北欧等已基本消灭了牛结核病。但牛结核病在我国依然是最常见的多发性疾病之一，1985年和1987年两次全国奶牛抽样调查结果显示，牛结核病的患病率分别达5.83％和5.43％。近年来，随着个体养牛户的增加，结核病的阳性检出率正逐年上升。目前我国一些省区牛结核病的发病率已达9％，甚至更高。

目前，牛结核病的世界动物卫生组织(OIE)法定检验方法为牛分枝杆菌纯化蛋白衍生物(purified protein derivatives，PPD)皮内变态反应试验(GB/T 18646)，该试验存在主观性强、耗时、耗力、短时间内不能进行重复检测、特异性差、近期受感染牛体敏感性很低等方面的缺点。

为了提高牛分枝杆菌检测的特异性，国内外学者开始利用基因重组技术，重组表达了牛分枝杆菌的多种蛋白，例如，6kDa早期分泌性抗原性靶(The early secreted antigenic target 6kuprotein ESAT-6)、MPB64、MPB70、MPB63、热休克蛋白65(Heat shock protein 65，HSP65)、抗原85B(antigen 85B，Ag85B)、10kDa的培养滤液抗原(10kDa culture filtrate antigen，CFP 10)等。然后，用这些重组蛋白中的一种或者多种混合(又称“鸡尾酒法”)作为包被抗原进行酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测，通过检测牛血清中相应的抗体水平对牛分枝杆菌感染作出血清学诊断，该方法虽然一定程度上提高了检测的特异性，但其敏感性不够理想。

90年代后期国外发展起来的以PPD为抗原的γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)释放试验明显提高了牛结核病诊断的灵敏性，其原理为：致敏的外周血淋巴细胞在体外培养过程中，通过特异抗原(如PPD)刺激后被活化，从而高水平表达并分泌IFN-γ，通过相应的技术手段对培养上清中IFN-γ的释放水平进行检测(如ELISA)从而判断其是否感染，其结果与淋巴细胞增生试验具有很好的相关性。该方法避免了对机体的侵入性实验，可以短时间内多次重复实验，同时也摒弃了结核菌素试验中操作和判断上的主观性，因此具有非常广泛的应用前景，目前国外已将该类牛结核病诊断试剂盒商品化。但由于PPD包含的抗原成分复杂，其中部分抗原在结核分枝杆菌和牛分枝杆菌这类牛病原性分枝杆菌以及禽分枝杆菌与非致病性环境分枝杆菌等牛非病原性分枝杆菌中均广泛存在，致使其检测特异性较差，同时有研究表明，PPD也不能有效区分牛分枝杆菌感染和BCG免疫，在实际使用过程中常常出现假阳性。

因此，亟需开发一种能同时提高检测的特异性和敏感性的检测试剂和方法，既能克服血清学检测方法敏感度不高的缺陷，又较PPD刺激IFN-γ释放试验具有更高的特异性。

本发明通过大量实验，用多基因串联重组表达的融合蛋白替代PPD，作为IFN-γ释放试验的刺激原，提高了实验特异性的同时，也大大克服了单一抗原或“多抗原鸡尾酒”血清学检测敏感度不高的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供用于区分牛病原性和非病原性分支杆菌感染试剂及方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：体外培养致敏的外周血淋巴细胞，在体外培养过程中用特异抗原刺激将其活化，从而高水平释放IFN-γ，然后通过技术手段(如ELISA)检测培养上清中IFN-γ，根据IFN-γ释放水平的变化，判断是否感染牛分枝杆菌。ESAT-6家族蛋白是分枝杆菌的一种早期分泌性抗原，主要分布于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中，而卡介苗(Bacille Calmette-Guerin vaccine，BCG)和大部分非致病性环境分枝杆菌缺失该基因。ESAT-6具有多个T/B细胞表位，不仅能诱导有效的免疫记忆，而且还能激发免疫记忆细胞早期高效表达IFN-γ，这使得通过IFN-γ检测进行结核病的早期诊断成为可能。MPB63是结核分枝杆菌培养滤液中的一种主要分泌蛋白，其表达量在分泌蛋白中居第三位，且与感染结核分枝杆菌的豚鼠阳性血清产生强烈的免疫反应，是结核分枝杆菌的主要保护性抗原。HSP是一类在应激状态下诱导产生的高度保守的蛋白质家族，不仅能作为分子伴侣，还能作为危险信号来诱发机体的免疫应答。在很多抗感染和抗肿瘤免疫反应中，HSP既能活化抗原递呈细胞(antigen-presenting cell，APC)，诱导细胞因子的释放，也能发挥免疫佐剂和细胞因子样作用。因此，本发明中将ESAT-6、MPB63和HSP70的串联表达的重组融合蛋白(即rE6-M63-H70)作为特异性刺激原，刺激体外培养致敏的外周血淋巴细胞高水平释放IFN-γ，取得了很好的效果。

一方面，本发明提供了一种用于区分牛病原性和非病原性分支杆菌感染的试剂，该试剂包括用作刺激原的重组融合蛋白，该重组融合蛋白能够有效刺激体外培养的致敏外周血淋巴细胞高水平释放IFN-γ。

在本发明的具体实施方案中，所述的重组融合蛋白的氨基酸序列包含选自SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在本发明的一个优选实施方案中，所述重组融合蛋白具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

另一方面，本发明提供了一种用于区分牛病原性和非病原性分支杆菌感染的方法，该方法包括下列步骤：

(a)使用本发明所述的重组融合蛋白作为特异性刺激原，与待检牛抗凝全血共孵育；

(b)孵育后，吸取上层血浆作为待检样品；

(c)检测待检样品中牛IFN-γ释放水平，与阴性刺激原的刺激效果进行比较，从而判定待检牛是否感染了牛分枝杆菌；

其中所述的特异性刺激原为一种分离纯化的重组融合蛋白，其氨基酸序列包括SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。

在本发明的一个实施方案中，使用的ELISA检测待检血浆样品中的牛IFN-γ释放水平。一个具体实施方案中，所述ELISA测定包括下列步骤：①用ELISA包被缓冲液将IFN-γ单抗稀释至蛋白质含量为10μg/ml，每孔酶标板加入100μl，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液(PBST)洗板3次，每次3min。②每孔酶标板先加入50μl样品稀释液，再加入50μl待检样品(同时做空白对照，阴性对照及阳性对照孔)至含有样品稀释液的孔中，混匀，封板，37℃孵育1h。③用洗涤缓冲液洗板3次，每次3min。④各反应孔中加入100μl新鲜配制的辣根过氧化物酶标记兔抗牛二抗，37℃孵育1h。⑤用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3min。⑥各反应孔中加入100μl新鲜配制的底物溶液，37℃，避光孵育30min(从加入底物至第一个孔中时开始计时)。⑦各反应孔中加入50μl终止液，轻轻摇动混匀。按照与加入底物相同的顺序、相同的速度加入终止液，终止后5min内读出OD_450nm值，以620-650nm作为参照波长。

当重组融合蛋白刺激后的待检血浆样品OD_450nm值-阴性刺激原刺激后的待检血浆样品的OD_450nm值≥0.1，判为阳性，反之，则判为阴性。

本发明的优点

本发明的牛分枝杆菌检测试剂盒及方法克服了牛分枝杆菌血清学检测方法和以PPD为刺激原的IFN-γ释放试验的不足，具有很强的特异性和敏感性，可区分牛病原性分枝杆菌感染和禽分枝杆菌或非致病性分枝杆菌等非病原性分枝杆菌感染，甚至能区分牛病原性分枝杆菌的感染与BCG免疫，因此可用于牛结核病的临床检测。

附图说明

图1：ESAT-6、MPB63和HSP70基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中图1(a)为ESAT-6基因PCR产物，图1(b)为MPB63基因PCR产物，图1(c)为HSP70基因PCR产物。

图2：图示的是重组融合蛋白rE6-M63-H70的电泳结果。M为蛋白质分子量标准；1为pET-32a(+)空载体对照；2为pET-E6-M63-H70诱导后产物；3为纯化后的rE6-M63-H70重组融合蛋白。

图3：图示的是rE6-M63-H70重组融合蛋白的western-blot实验结果，其中M为蛋白质分子质量标准；1为rE6-M63-H70重组融合蛋白的Western-blot检测结果。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。

实施例

实施例1 重组质粒pET-E6-M63-H70的构建

1.1牛分枝杆菌基因组DNA的提取

参照细菌基因组DNA小量快速提取试剂盒(购自北京博大泰克基因技术有限责任公司)说明书所述方法进行。

1.2引物的设计

根据GenBank中牛分枝杆菌基因组DNA(登录号为BX248333)的ESAT-6、MPB63和HSP70基因序列设计特异性引物，引物由上海生工生物技术有限公司合成，序列见表1(下划线处为酶切位点，阴影处为Linker)。

表1PCR引物名称、序列及扩增产物的大小

1.3目的基因的PCR扩增与产物回收

以牛分枝杆菌基因组DNA为模板，分别用LA Taq DNA聚合酶分别扩增ESAT-6、MPB63和HSP70基因，具体反应体系如下：

灭菌去离子水             26.5μL

10x LAPCR buffer         5μL

2.5mM dNTP               8μL

LATaq(5U/μL)            0.5μL

正向引物(10pmol/μL)     3μL

反向引物(10pmol/μL)     3μL

DNA模板                  4μL

ESAT-6扩增循环参数为：95℃预变性5min，95℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸25s，25个循环，72℃再延伸10min。MPB63扩增循环参数为：95℃预变性5min，95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环，72℃再延伸10min。HSP70扩增循环参数为：95℃预变性5min，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min45s，25个循环，72℃再延伸10min。PCR扩增产物电泳检测，结果见图1，其中牛分枝杆菌ESAT-6、MPB63和HSP70基因产物分别约为300bp(含Linker)、500bp(含Linker)和1878bp，与预期大小一致。

用PCR产物回收试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)分别回收纯化上述PCR产物，然后将ESAT-6、MPB63和HSP70分别连接入pEASY-T1载体(购自北京全式金生物技术有限公司)，获得相应的重组质粒，分别命名为pEASY-T-E6、pEASY-T-M63和pEASY-T-H70。

1.4重组质粒的构建与鉴定

pEASY-T-E6经EcoR I、Sac I双酶切后获得ESAT-6片段，pEASY-T-M63经Sac I、Sal I双酶切后获得MPB63片段，pEASY-T-H70经BamH I、Hind III双酶切后获得HSP70片段，按照设定目标将2组3个基因片段依次定向克隆到pUC18载体中，再经EcoR I、Hind III双酶切，回收目的片段，克隆到pET-32a(+)载体中，获得相应的重组质粒，命名为pET-E6-M63-H70。

pET-E6-M63-H70经EcoR I、Hind III双酶切获得了约2700bp片段，经DNA测序，该融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例2牛分枝杆菌重组融合蛋白rE6-M63-H70的表达及纯化

2.1重组融合蛋白的诱导表达、纯化、SDS-PAGE及Western-blot分析

将实施例1制备的重组质粒pET-E6-M63-H70转化至BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落接种至200mL含终浓度25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床培养至OD600＝0.7，加入终浓度为1mM的IPTG，30℃，160rpm摇床诱导培养10h，9000rpm离心10min收集菌体，菌体用60mL PBS(pH 7.4)重悬，冰浴超声破碎菌体，破碎后混合物经12000rpm，4℃离心30min后取上清，按His Link^TM Protein Purification Resin(购自北京泽平科技有限责任公司)操作手册纯化重组融合蛋白。纯化产物经8％SDS-PAGE电泳后，以BIO-RAD系统电转移至NC膜上，经5％脱脂奶粉封闭后，依次加入1∶100稀释的牛结核病阳性血清37℃孵育1h，经充分洗涤后加入1∶500稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗牛二抗(购自北京索莱宝科技有限公司)37℃孵育1h，充分洗涤，再按照增强型HRP-DAB底物显色试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)说明书显色，并观察结果。

SDS-PAGE电泳结果显示pET-E6-M63-H70表达的重组融合蛋白rE6-M63-H70大小约为116Ku(含pET-32a(+)载体的标签蛋白)，与预期大小一致，且目的蛋白均为可溶性表达。用His Link^TM Protein Purification Resin及蛋白纯化柱(购自北京泽平科技有限责任公司)纯化重组融合蛋白并进行SDS-PAGE分析，结果见图2。Western-blot分析结果显示，表达的重组融合蛋白可与牛结核病阳性牛血清产生特异性反应，见图3。纯化产物使用透析袋在透析外液(200mM Tris-Cl，pH 8.0)中透析24h以除去咪唑，最后用PEG20000包埋透析袋浓缩蛋白，并使用蛋白定量试剂盒(BCA法)(购自SINOPCR公司)进行蛋白定量。rE6-M63-H70重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例3牛分枝杆菌检测方法的建立

3.1待检牛全血的采集及培养

①无菌条件下采集待检牛肝素抗凝全血5ml，室温(22±5℃)运送到实验室并在采血后8h内进行培养。②将抗凝血加入到24孔组织培养板，1.5ml/孔，每头待检牛2孔，再分别无菌加入50μl Tris-Cl(100mM，pH 8.0，作为阴性对照刺激原)、50μl含rE6-M63-H70的溶液(20μg)至相应孔中，充分混匀，37℃CO₂培养箱中孵育24h。③孵育后，小心吸取400μl的上层血浆，转入1.5ml离心管中(血浆可在2-8℃贮存7天，-20℃可贮存几个月)，每管吸取50μl血浆作为待检样品用于牛IFN-γ释放水平的ELISA检测。

3.2牛IFN-γ的ELISA检测

按照牛IFN-γ检测试剂盒(购自北京测迪公司)说明书进行，具体步骤如下：①用ELISA包被缓冲液将IFN-γ单抗稀释至蛋白质含量为10μg/ml，100μl/孔，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液(PBST)洗板3次，每次3min。②各孔中加入样品稀释液，50μl/孔，再加入50μl待检样品(同时做空白对照，阴性对照及阳性对照孔)至含有样品稀释液的孔中，混匀，封板，37℃孵育1h。③用洗涤缓冲液洗板3次，每次3min。④各反应孔中加入100μl新鲜配制的辣根过氧化物酶标记兔抗牛二抗，37℃孵育1h。⑤用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3min。⑥各反应孔中加入100μl新鲜配制的底物溶液，37℃，避光孵育30min(从加入底物至第一个孔中时开始计时)。⑦各反应孔中加入50μl终止液，轻轻摇动混匀。按照与加入底物相同的顺序、相同的速度加入终止液，终止后5min内读出OD_450nm值，以620-650nm作为参照波长。

3.3结果判定

判定结果前必须检查阳性对照和阴性对照的OD值，当牛IFN-γ阴性对照＜0.130、牛IFN-γ阳性对照＞0.700时检测结果有效，如重组融合蛋白刺激后的血浆样品OD_450nm值-阴性对照刺激原刺激后的血浆样品OD_450nm值≥0.1，判为阳性，反之，则判为阴性。

实施例4 rE6-M63-H70重组融合蛋白作为刺激原的牛分枝杆菌感染检测方法的特异性和敏感性试验

4.1待检荷斯坦奶牛的选取

选取PPD皮试试验阳性荷斯坦奶牛15头，阴性荷斯坦奶牛10头，BCG免疫荷斯坦奶牛5头。

4.2待检荷斯坦奶牛全血的采集及培养

同实施例3中的3.1部分，用rE6-M63-H70重组融合蛋白作为刺激原。

4.3牛IFN-γ的ELISA检测

同实施例3中的3.2部分。

4.4检测结果

以实施例3的3.3部分中的标准进行结果判定，结果见表2，并用BOVIGAM^TM牛分枝杆菌IFN-γ检测试剂盒进行复核，确认阳性牛剖检后取肺部病灶提取DNA进行PCR鉴定，鉴定结果表明25头非免疫荷斯坦奶牛中有6头感染了牛分枝杆菌，6头感染了禽分枝杆菌，其余均为阴性健康牛。参照以下公式计算该发明的特异性及敏感性，特异性计算公式为：

敏感性计算公式为：

结果显示：使用rE6-M63-H70重组融合蛋白作为刺激原的牛IFN-γ释放试验(简称rE6-M63-H70-IFN-γ方法)的检测特异性达91.6％，敏感性达83.3％。其中，6头鉴定为禽分枝杆菌感染牛经rE6-M63-H70-IFN-γ方法检测结果均为阴性，证明这种诊断方法可准确区分牛病原性的牛分枝杆菌感染与和牛非病原性的禽分枝杆菌感染；5头BCG免疫牛中，经rE6-M63-H70-IFN-γ方法检测结果判断4头为阴性1头为弱阳性，表明这种检测方法基本能有效区分牛分枝杆菌感染与BCG免疫。

综上所述，该方法能有效区分牛病原性和非病原性分枝杆菌感染，具有很好的应用前景。

表2rE6-M63-H70重组融合蛋白作为刺激原的牛IFN-γ释放试验(rE6-M63-H70-IFN-γ方法)结果

a经BOVIGAM^TM牛分枝杆菌IFN-γ检测试剂盒及剖检后取肺部病灶提取DNA进行PCR鉴定后确定为感染了牛致病性的牛分枝杆菌的阳性荷斯坦奶牛。

b阴性健康荷斯坦奶牛、BCG免疫荷斯坦奶牛以及感染了牛非致病性的禽分枝杆菌的荷斯坦奶牛。

序列表

<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120>区分牛病原性和非病原性分枝杆菌感染的试剂盒及方法

<130>

<160>2

<170>Patent In version 3.4

<210>1

<211>2727

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>基因

<222>(1)..(2727)

<400>1

atgacagagc agcagtggaa tttcgcgggt atcgaggccg cggcaagcgc aatccaggga     60

aatgtcacgt ccattcattc cctccttgac gaggggaagc agtccctgac caagctcgca    120

gcggcctggg gcggtagcgg ttcggaggcg taccagggtg tccagcaaaa atgggacgcc    180

acggctaccg agctgaacaa cgcgctgcag aacctggcgc ggacgatcag cgaagccggt    240

caggcaatgg cttcgaccga aggcaacgtc actgggatgt tcgcatatgg tggaggcggt    300

tctggcggtg gaggatcaga gctcggacca atgaagctca ccacaatgat caagacggca    360

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tatcccatca ccggaaaact tggcagtgag ctaacgatga ccgacaccgt tggccaagtc    480

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gtggccggcc aggtctggga ggccactgcc acggtcaatg cgattcgcgg cagcgtcacg    600

cccgcggtct cgcagttcaa tgcccgcacc gccgacggca tcaactaccg ggtgctgtgg    660

caagccgcgg gccccgacac cattagcgga gccactatcc cccaaggcga acaatcgacc    720

ggcaaaatct acttcgatgt caccggccca tcgccaacca tcgtcgcgat gaacaacggc     780

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tcaggatcca tggctcgtgc ggtcgggatc gacctcggga ccaccaactc cgtcgtctcg     900

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tcaattgtcg cgttcgcccg caacggtgag gtgctggtcg gccagcccgc caagaaccag    1020

gcggtgacca acgtcgatcg caccgtgcgc tcggtcaagc gacacatggg cagcgactgg    1080

tccatagaga ttgacggcaa gaaatacacc gcgccggaga tcagcgcccg cattctgatg    1140

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cacctcggcg gcgacgactg ggaccagcgg gtcgtcgatt ggctggtgga caagttcaag    1500

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gccgagaagg caaagatcga gctgagttcg agtcagtcca cctcgatcaa cctgccctac    1620

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gctgacaccg gcatttcggt gtcggagatc gatcacgttg tgctcgtggg tggttcgacc    1800

cggatgcccg cggtgaccga tctggtcaag gaactcaccg gcggcaagga acccaacaag    1860

ggcgtcaacc ccgatgaggt tgtcgcggtg ggagccgctc tgcaggccgg cgtcctcaag    1920

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aagggcgggg tgatgaccag gctcatcgag cgcaacacca cgatccccac caagcggtcg    2040

gagactttca ccaccgccga cgacaaccaa ccgtcggtgc agatccaggt ctatcagggg    2100

gagcgtgaga tcgccgcgca caacaagttg ctcgggtcct tcgagctgac cggcatcccg  2160

ccggcgccgc gggggattcc gcagatcgag gtcactttcg acatcgacgc caacggcatt  2220

gtgcacgtca ccgccaagga caagggcacc ggcaaggaga acacgatccg aatccaggaa  2280

ggctcgggcc tgtccaagga agacattgac cgcatgatca aggacgccga agcgcacgcc  2340

gaggaggatc gcaagcgtcg cgaggaggcc gatgttcgta atcaagccga gacattggtc  2400

taccagacgg agaagttcgt caaagaacag cgtgaggccg agggtggttc gaaggtacct  2460

gaagacacgc tgaacaaggt tgatgccgcg gtggcggaag cgaaggcggc acttggcgga  2520

tcggatattt cggccatcaa gtcggcgatg gagaagctgg gccaggagtc gcaggctctg  2580

gggcaagcga tctacgaagc agctcaggct gcgtcacagg ccactggcgc tgcccacccc  2640

ggcggcgagc cgggcggtgc ccaccccggc tcggctgatg acgttgtgga cgcggaggtg  2700

gtcgacgacg gccgggaggc caagtga                                      2727

<210>2

<211>908

<212>PRT

<213>人工重组

<220>

<221>融合蛋白

<222>(1)..(908)

<400>2

Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser

1               5                   10                  15

Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly

            20                  25                  30

Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser

        35                  40                  45

Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu

    50                  55                  60

Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly

65                  70                  75                  80

Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala Tyr

                85                  90                  95

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Gly Pro Met Lys

            100                 105                 110

Leu Thr Thr Met Ile Lys Thr Ala Val Ala Val Val Ala Met Ala Ala

        115                 120                 125

Ile Ala Thr Phe Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Ala Tyr Pro Ile Thr

    130                 135                 140

Gly Lys Leu Gly Ser Glu Leu Thr Met Thr Asp Thr Val Gly Gln Val

145                 150                 155                 160

Val Leu Gly Trp Lys Val Ser Asp Leu Lys Ser Ser Thr Ala Val Ile

                165                 170                 175

Pro Gly Tyr Pro Val Ala Gly Gln Val Trp Glu Ala Thr Ala Thr Val

            180                 185                 190

Asn Ala Ile Arg Gly Ser Val Thr Pro Ala Val Ser Gln Phe Asn Ala

        195                 200                 205

Arg Thr Ala Asp Gly Ile Asn Tyr Arg Val Leu Trp Gln Ala Ala Gly

    210                 215                 220

Pro Asp Thr Ile Ser Gly Ala Thr Ile Pro Gln Gly Glu Gln Ser Thr

225                 230                 235                 240

Gly Lys Ile Tyr Phe Asp Val Thr Gly Pro Ser Pro Thr Ile Val Ala

                245                 250                 255

Met Asn Asn Gly Met Glu Asp Leu Leu Ile Trp Glu Pro Tyr Ile Gly

            260                 265                 270

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Met Ala Arg Ala Val

        275                 280                 285

Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Val Val Ser Val Leu Glu Gly

    290                 295                 300

Gly Asp Pro Val Val Val Ala Asn Ser Glu Gly Ser Arg Thr Thr Pro

305                 310                 315                 320

Ser Ile Val Ala Phe Ala Arg Asn Gly Glu Val Leu Val Gly Gln Pro

                325                 330                 335

Ala Lys Asn Gln Ala Val Thr Asn Val Asp Arg Thr Val Arg Ser Val

            340                 345                 350

Lys Arg His Met Gly Ser Asp Trp Ser Ile Glu Ile Asp Gly Lys Lys

        355                 360                 365

Tyr Thr Ala Pro Glu Ile Ser Ala Arg Ile Leu Met Lys Leu Lys Arg

    370                 375                 380

Asp Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Glu Asp Ile Thr Asp Ala Val Ile Thr

385                 390                 395                 400

Thr Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala

                405                 410                 415

Gly Gln Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile Val Asn Glu Pro Thr

            420                 425                 430

Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Gly Glu Lys Glu Gln Arg

        435                 440                 445

Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu

    450                 455                 460

Glu Ile Gly Glu Gly Val Val Glu Val Arg Ala Thr Ser Gly Asp Asn

465                 470                 475                 480

His Leu Gly Gly Asp Asp Trp Asp Gln Arg Val Val Asp Trp Leu Val

                485                 490                 495

Asp Lys Phe Lys Gly Thr Ser Gly Ile Asp Leu Thr Lys Asp Lys Met

            500                 505                 510

Ala Met Gln Arg Leu Arg Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Ile Glu Leu

        515                 520                 525

Ser Ser Ser Gln Ser Thr Ser Ile Asn Leu Pro Tyr Ile Thr Val Asp

    530                 535                 540

Ala Asp Lys Asn Pro Leu Phe Leu Asp Glu Gln Leu Thr Arg Ala Glu

545                 550                 555                 560

Phe Gln Arg Ile Thr Gln Asp Leu Leu Asp Arg Thr Arg Lys Pro Phe

                565                 570                 575

Gln Ser Val Ile Ala Asp Thr Gly Ile Ser Val Ser Glu Ile Asp His

            580                 585                 590

Val Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Met Pro Ala Val Thr Asp Leu

        595                 600                 605

Val Lys Glu Leu Thr Gly Gly Lys Glu Pro Asn Lys Gly Val Asn Pro

    610                 615                 620

Asp Glu Val Val Ala Val Gly Ala Ala Leu Gln Ala Gly Val Leu Lys

625                 630                 635                 640

Gly Glu Val Lys Asp Val Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu

                645                 650                 655

Gly Ile Glu Thr Lys Gly Gly Val Met Thr Arg Leu Ile Glu Arg Asn

            660                 665                 670

Thr Thr Ile Pro Thr Lys Arg Ser Glu Thr Phe Thr Thr Ala Asp Asp

        675                 680                 685

Asn Gln Pro Ser Val Gln Ile Gln Val Tyr Gln Gly Glu Arg Glu Ile

    690                 695                 700

Ala Ala His Asn Lys Leu Leu Gly Ser Phe Glu Leu Thr Gly Ile Pro

705                 710                 715                 720

Pro Ala Pro Arg Gly Ile Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp

                725                 730                 735

Ala Asn Gly Ile Val His Val Thr Ala Lys Asp Lys Gly Thr Gly Lys

            740                 745                 750

Glu Asn Thr Ile Arg Ile Gln Glu Gly Ser Gly Leu Ser Lys Glu Asp

        755                 760                 765

Ile Asp Arg Met Ile Lys Asp Ala Glu Ala His Ala Glu Glu Asp Arg

    770                 775                 780

Lys Arg Arg Glu Glu Ala Asp Val Arg Asn Gln Ala Glu Thr Leu Val

785                 790                 795                 800

Tyr Gln Thr Glu Lys Phe Val Lys Glu Gln Arg Glu Ala Glu Gly Gly

                805                 810                 815

Ser Lys Val Pro Glu Asp Thr Leu Asn Lys Val Asp Ala Ala Val Ala

            820                 825                 830

Glu Ala Lys Ala Ala Leu Gly Gly Ser Asp Ile Ser Ala Ile Lys Ser

        835                 840                 845

Ala Met Glu Lys Leu Gly Gln Glu Ser Gln Ala Leu Gly Gln Ala Ile

    850                 855                 860

Tyr Glu Ala Ala Gln Ala Ala Ser Gln Ala Thr Gly Ala Ala His Pro

865                 870                 875                 880

Gly Gly Glu Pro Gly Gly Ala His Pro Gly Ser Ala Asp Asp Val Val

                885                 890                 895

Asp Ala Glu Val Val Asp Asp Gly Arg Glu Ala Lys

            900                 905

Claims (1)

1.一种用于牛分枝杆菌感染检测的检测试剂，该试剂包括一种重组表达的融合蛋白，该重组融合蛋白能有效刺激体外培养的致敏外周血淋巴细胞高水平释放 IFN-γ，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 2。

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