CN103266119A - 一种结核杆菌三抗原融合基因疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种融合蛋白基因，由抗原基因Rv3615c、抗原基因Mtb10.4和抗原基因Rv2660c从5’端到3’端依次串联连接而成。本发明还提供了一种结核杆菌三抗原融合基因疫苗，由一个载体构成，在载体中插入有一段上述的融合蛋白基因。本发明还公开了上述结核杆菌三抗原融合基因疫苗的制备方法和应用。小鼠免疫实验表明，本发明的结核杆菌三抗原融合基因疫苗能诱导较好的细胞免疫应答。使用本发明的结核杆菌三抗原融合基因疫苗能诱导较强的针对结核杆菌感染有重要保护作用的CD4⁺和CD8⁺T细胞免疫保护反应和特异性杀伤应答，可有效对抗结核杆菌的感染，并对结核感染小鼠有较好的保护作用。

Description

一种结核杆菌三抗原融合基因疫苗及其制备方法和应用

技术领域：

本发明属于基因工程领域，涉及一种重组基因疫苗，尤其涉及一种用于治疗和预防结核病的疫苗，具体来说是一种结核杆菌三抗原融合基因疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：

结核病是一种传统的对人类健康有重大威胁的传染性疾病，全球大约有1/3的人口感染结核，其中约有10%的人口会急性发病，另外90%的人群主要为潜伏性感染。近年来，由于耐多药结核病的流行、化疗药物的不良反应以及人免疫缺陷病毒（HIV）的感染、免疫抑制剂的使用和老年性结核病等原因引起的机体免疫功能低下，使难治性结核病增多，抗结核治疗面临巨大的挑战。尤其是耐多药结核菌（MDR-TB）和广泛耐药结核菌（XDR-TB）的出现，使得结核病面临无药可治的困难局面。作为结核病的传统疫苗-卡介苗（BCG），虽然在动物实验中已证实卡介苗具有高度的保护力，但调查发现，卡介苗对预防儿童结核病效果明显，而对成人结核病预防效果极不稳定，因此研制新的抗结核制剂及新的安全、有效的疫苗迫在眉睫。

结核病主要是由结核分枝杆菌引起的以呼吸道传播为主的感染性疾病，其感染过程，分为初始感染，潜伏感染，再次大量增殖造成的疾病复燃三个阶段。在感染过程中，抗体发挥一定的作用，但由于结核杆菌藏匿于细胞内，细胞免疫在控制结核感染中发挥着更为重要的作用。而结核杆菌的获得性细胞免疫又较为复杂，CD4⁺和CD8⁺T细胞都参与作用，其中目前普遍认为CD4⁺T细胞在免疫中的作用最为关键。人类针对分枝杆菌抗原的体外T细胞反应亦主要为CD4⁺T细胞。动物模型研究提示Th1细胞分泌的细胞因子γ干扰素(IFN-γ)是导致巨噬细胞活化、吞噬体酸化及反应氧中间代谢产物释放的主要效应物。IFN-γ和白细胞介素12(IL-12)受体遗传缺陷患者对分枝杆菌感染的高度易感性，说明了Th1细胞应答的重要性。另外，在人类和动物模型中的诸多研究显示，CD8⁺T细胞也在抗结核感染中发挥着重要的作用。CD8⁺T细胞主要通过产生细胞因子及直接杀伤细胞发挥效应，人类CD8⁺T细胞可以使靶细胞裂解和通过颗粒溶解素(granulysin)途径来控制细胞生长。

基因疫苗又称DNA疫苗，是将外源目的基因构建于真核表达质粒、直接注射动物的第三代疫苗，由于可在体内表达目的抗原，通过外源性、内源性以及交叉抗原提呈途径激活DC细胞提呈抗原，不仅能够引发体液免疫应答，特别能有效地激活Th1型细胞免疫应答如CD4⁺Th1和CD8⁺T细胞应答，因此有利于清除作为胞内致病菌的结核杆菌。

鉴于结核感染机体免疫的特点和DNA疫苗的优势，我们设想构建一个含有多个不同抗原的多价DNA疫苗，通过诱导强有力的细胞免疫和体液免疫应答，从而达到预防结核菌感染、控制结核菌复制和防治结核病的目的。通过文献分析，我们选择了三个在结核感染中免疫原性较强的抗原作为我们疫苗的候选蛋白：①Rv3615c（Espc）抗原，也属于ESAT6家族，Espc在体外低PH,低铁环境下高表达于巨噬细胞吞噬小体中，显示Espc是活跃表达的，可能在胞内感染中发挥抗原提呈作用，而且已有文献报道，另外，最近也有文献报道，其在结核病的诊断中也发挥着重要的作用。②Mtb10.4抗原，一种结核感染早期的分泌蛋白，已有学者证实，Mtb10.4在结核患者和BCG接种者身上都能引起强烈的免疫反应和很高的保护作用。③Rv2660c抗原，在结核感染的早期和晚期都持续稳定地表达，研究证实在结核杆菌感染的早期，Rv2660c作为一个多阶段疫苗的成员之一，其发挥的保护作用不是很明显，但在感染的后期与结核感染早期的分泌性蛋白联合应用的疫苗却能发挥很好的保护作用。

由于常规BCG疫苗的效果存在争议、以及结核耐药菌株的出现和AIDS病导致的结核感染，使得现有技术中的疫苗预防或者治疗结核病的效果不佳。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种结核杆菌三抗原融合基因疫苗及其制备方法和应用，所述的这种结核杆菌三抗原融合基因疫苗及其制备方法和应用要解决现有技术中的疫苗诱导细胞免疫应答水平不高、和预防或者治疗结核病效果不佳的技术问题。

本发明提供了一种融合蛋白基因，由抗原基因Rv3615c、抗原基因Mtb10.4和抗原基因Rv2660c从5’端到3’端依次串联连接而成。

进一步的，在所述的抗原基因Rv2660c的3’端连接一个Flag标签。

进一步的，所述的Flag标签的基因序列为DYKDDDDK。

进一步的，所述的融合基因的碱基序列如SEQ ID NO：7所示。

本发明还提供了一种上述的融合蛋白基因编码的蛋白质。

进一步的，所述的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

进一步的，所述的抗原Rv3615c的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，所述的抗原Mtb10.4的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步的，所述的抗原Rv2660c的基因序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明还提供了一种结核杆菌三抗原融合基因疫苗，由一个载体构成，在所述的载体中插入有一段外源融合目的基因，所述的外源目的基因为权利要求1所述的融合蛋白基因。

进一步的，所述的载体为真核表达质粒。

本发明还提供了上述的结核杆菌三抗原融合基因疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)提取结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA作为模板，通过PCR方法扩增蛋白抗原Rv3615c片段，Mtb10.4片段和Rv2660c片段的编码基因；

所述抗原Rv3615c片段的双链DNA的序列为：

所述抗原Mtb10.4片段的双链DNA的序列为

所述抗原Rv2660c片段的双链DNA的序列为:

2)以上述扩增的抗原Rv3615c，Mtb10.4和Rv2660c片段作为模板，通过另外设计的三对引物，经OverPCR的方法扩增抗原Rv3615c，Mtb10.4和Rv2660c片段，获得的三抗原融合蛋白基因，所述三抗原融合基因的双链DNA的序列为：

ttcatt，然后将获得的融合蛋白基因片段经NheI/XhoI双酶切后与经同样双酶切的载体连接，获得上述的一种结核杆菌三抗原融合基因疫苗。

进一步的，将抗原Rv3615c，Mtb10.4和Rv2660c片段混合、热变性使各自成为单链DNA，再通过OverPCR法扩增获得由抗原Rv3615c，Mtb10.4和Rv2660c片段构成融合蛋白基因。

本发明还提供了一种药物组合物，含有有效量的上述的一种结核杆菌三抗原融合基因疫苗，以及药学上可以接受的载体或者赋形剂。

本发明还提供了一种上述的结核杆菌三抗原融合基因疫苗在制备、或者预防结核病的药物中的应用。

本发明选择的3个结核杆菌优势抗原：

1）Rv3615c，一个小分子蛋白，含有103个氨基酸，由RD1之外区域编码，大小和序列与CFP-10，ESAT-6有高度同源性。据报道，Rv3615c在体外低pH和低铁等恶劣环境下高表达于巨噬细胞吞噬小体中，显示Rv3615c是活跃表达的，可能在胞内感染中发挥抗原提呈作用。现已鉴定出Rv3615c中含有多个CD4⁺和CD8⁺T细胞表位，以CD4⁺T细胞表位为主。

2）Mtb10.4，蛋白质全长96个氨基酸，分子量10KD左右，又称Rv0288，一种在结核杆菌感染早期的分泌性蛋白，也属于ESAT-6家族的成员之一，据报道，无论在结核患者还是BCG接种的人群中，Mtb10.4均能诱导很强的T细胞应答并释放大量IFN-γ，能够在抗结核菌感染中起到保护作用，与CFP-10，ESAT-6同作为免疫优势抗原存在，另外，研究也表明，Mtb10.4_1-18肽是一个CD8⁺T细胞表位。

3）Rv2660c，含有75个氨基酸的小分子蛋白，在结核杆菌感染的早期和晚期都持续稳定地表达，尤其在体内低氧和活化的巨噬细胞中活跃转录表达，已有文献证实，作为结核疫苗的成员之一，Rv2660c可能介导了多阶段结核疫苗H56在长期抗结核感染中的保护作用。

本发明通过NCBI GeneBank数据库查找、BLAST网络数据库比对和DNAstar生物软件分析以及亲疏水性、柔软性、抗原指数、表面可及性等参数的分析，并结合已有的研究成果，进一步选择各类参数均较好的结构区域作为候选疫苗抗原组分；通过网络数据库（http://www.syfpeithi.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm）分析确定这些区段中可能存在的T细胞抗原表位；最后结合上述数据，预测同时具有T、B细胞表位的理想抗原作为候选疫苗成分。本发明用计算机分子模拟的方法分析候选基因的T细胞和B细胞表位，并筛选出与HLA I、II类分子具有高亲和力的抗原进行串联。通过基因免疫的手段研究其诱导免疫应答及抗结核分枝杆菌的功能及其机制。

本发明在pcDNA3.1质粒中，插入一段三抗原（Rv3615c，Mtb10.4，Rv2660c）串联排列的融合目的基因846，并在该外源目的基因的3’端融合了一个具有24个碱基序列的Flag标签，以便于体外检测其在真核细胞中的表达，我们将这一融合有3个结核杆菌优势抗原的结核基因疫苗称为p846结核基因疫苗，其编码了分子量大小约为30KDa的蛋白。

本发明中，所述的真核表达质粒载体，包括任何可以转染哺乳动物细胞的高效真核表达质粒载体，包括但不限于：pcDNA3.1、pVAX以及常见和市售的真核质粒载体。

本发明中，p846蛋白编码基因和3个单个抗原基因的获得，可以通过多种方式获得，包括但不限于：1）化学合成DNA；2）通过适当引物以PCR技术扩增得到DNA。

本发明中，将p846基因疫苗注射小鼠的方法采用肌肉注射方式，以本领域技术人员熟知的常规技术进行：以注射器吸取50μg质粒(溶于100μlPBS中)直接注射小鼠胫骨前肌肉。除注射器外，也可选用其他有效的借助于市售仪器的基因免疫的方式，包括但不限于：基因枪技术、电穿孔辅助技术等。

本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和动物而无过度不良副反应（如毒性、刺激、变态反应）、有合理效益/风险比的物质。

本发明中，“药学上可接受的载体”成分是用于将具有活性的有效成分传送给人或动物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂和赋形剂。所述的载体可以是液体、固体或半固体。载体包括但不限于：水、PBS缓冲液、生理盐水、葡萄糖、甘油、叠氮钠或其组合。

本发明的药物组合物，还含有上述有效成分和药学上可接受的载体。通常将其配制于无毒、中性、惰性和药学上可接受的水性载体介质中，pH值通常约6－8。

本发明和与已有技术相对照，其效果是积极和明显的。本发明的具有抗结核杆菌感染的结核杆菌三抗原融合基因疫苗是一种质粒DNA疫苗，其中插入的外源目的基因是融合了来自于结核杆菌H37Rv株或BCG上的免疫优势抗原，它们各自均可诱导特异性T细胞应答。因此理论上这一基因疫苗可有效地激活针对结核特异性T细胞免疫应答和体液免疫应答。通过将本发明的结核杆菌三抗原融合基因疫苗肌肉注射免疫小鼠，证实可诱导针对结核特异性抗原的T细胞应答以及特异性抗体应答，同时还能诱导较强的针对结核特异性抗原的特异性CD4⁺Th1型免疫应答和CD8⁺CTL杀伤应答，分泌高水平IFN-γ，因此是一种潜在的可预防和治疗结核病的有效疫苗。

附图说明

图1显示了本发明的结核杆菌三抗原融合基因疫苗p846的融合目的基因（Rv3615c、Mtb10.4和Rv2660c串联排列）插入pcDNA3.1载体质粒的构建模式图，在融合基因3’端添加了一个Flag标签。

图2是显示了本发明的结核杆菌三抗原融合基因疫苗p846的构建简图。

图3显示了该质粒的构建方法：通过F1/F2、T1/T2、R1/R2三对引物，以提取的结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，分别扩增得到双链DNA片段一（Rv3615c）（309bp）、片段二(288bp)、片段三(249bp)，其中Rv2660c的3’端融合了一个含有24个碱基的Flag标签；而后通过彼此重叠的18个或20个碱基互补相连得到的融合有3个抗原的p846全长基因。

图4显示了本发明的结核杆菌三抗原融合基因疫苗p846的PCR（图4A）及部分测序鉴定结果（图4B）。

图5显示了本发明的结核杆菌三抗原融合基因疫苗p846免疫小鼠诱导的特异性IgG抗体，图5A显示各疫苗免疫小鼠后诱生的抗原特异性IgG的水平；图5B显示血清特异性IgG效价；图5C显示血清抗原特异性抗体亚型。

图6显示了本发明的结核杆菌三抗原融合基因疫苗p846免疫小鼠诱导的结核抗原特异性IFN-γ⁺T细胞应答。

图7显示了本发明的结核杆菌三抗原融合基因疫苗p846免疫小鼠诱导的结核抗原特异性细胞因子分泌水平。

图8显示了本发明的结核杆菌三抗原融合基因疫苗p846免疫小鼠诱导的结核抗原特异性淋巴细胞增殖（图8A）及杀伤活性（图8B）。

图9显示了本发明的结核杆菌三抗原融合基因疫苗p846免疫小鼠产生的抗结核菌攻击的保护作用。图9A显示了肺部HE染色病理情况；图9B显示了肺脏结核杆菌菌落计数。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，所述的实施例是用于描述本发明，而不是限制本发明。

实施例中采用的质粒、菌种、细胞、动物及试剂如下：

质粒、菌种、细胞、动物：质粒pcDNA3.1(+)、pET28a、pGEX-5X-1（本实验室保存），宿主细菌DH5α、BL21(Invitrogen公司购买)。结核分枝杆菌H37Rv株由苏州市第五人民医院惠赠，减毒的卡介苗M.bovisbacille Calmette-Gue′rin(BCG)由苏州市疾病预防控制中心提供，6-8周龄雌性BALB/c(H-2K^d)小鼠购自上海斯莱克动物有限责任公司。

分子生物学试剂：限制性核酸内切酶Nhe I、Xho I（TaKaRa公司）、T4DNA连接酶（MBI公司)；

多聚酶(TaKaRa公司）；RNase A(Ameresco公司)；dNTP(Promega和华美生物公司)；LB培养基(英国OXOID公司)，琼脂粉、琼脂糖、SDS、EB(上海化学试剂采购供应站)，Tris(USB公司)，琼脂糖胶回收试剂盒（上海华舜生物制品公司），大量质粒抽提试剂盒（Qiagen公司）。

免疫学试剂和材料：HRP标记羊抗小鼠IgG，IgG1和IgG2a多克隆抗体(Sant Clous公司)；Percp-anti-CD4抗体、PE-anti-CD8抗体、APC-anti-IFNγ抗体、Brefeldin A(高尔基阻断剂)购自BD公司；1ml无菌注射器（米沙瓦医科工业有限公司）。

实施例1：p846基因疫苗的目的抗原基因的预测

通过BLAST网络数据库、DNAstar生物软件、网络数据库（http://www.syfpeithi.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm）分析，综合亲疏水性、柔软性、抗原指数、表面可及性、与HLA I、II类分子结合、等参数，并结合以往研究，选取了3个来源于结核分枝杆菌H37Rv株的优势抗原：Rv3615c，Mtb10.4和Rv2660c，其中Rv3615c和Mtb10.4也存在于牛型结核分枝杆菌BCG中，而Rv2660c在BCG中是缺少的。

如图1、2所示，以pcDNA3.1为质粒载体，通过NheⅠ/XhoⅠ酶切位点插入了一段Rv3615c，Mtb10.4和Rv2660c三抗原串联排列的融合基因，并在融合基因的3’端融合了一个Flag标签，以便于体外检测。

实施例2p846结核基因疫苗的构建

本发明利用DNA引物直接合成和PCR的方法，从5’到3’端依次扩增三段抗原编码基因，然后把获得的三个单个抗原基因片段混合后作为模板，变性后通过彼此重叠的互补序列连接，最后用5’和3’两端上、下引物PCR扩增出融合有3个结核抗原基因的p846全长基因。同时在基因两端分别带上Nhe I和Xho I酶切位点，经双酶切后可连接入经同样双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)或原核表达载体pET28a。

为构建三抗原Rv3615c，Mtb10.4和Rv2660c的融合基因，我们把三抗原的碱基序列串联排在一起，以Rv3615c的起始密码ATG为初始，到Rv2660c末端的Flag标签的TAG终止密码为终止，把串联起来的全部序列当做一个基因来处理，对此序列设计了三对引物：F1和F2，T1和T2，R1和R2（具体见图3），其中F2与T1引物有22个碱基重叠，T2和R1有29个碱基重叠，以便更有效的利用OverlapPCR的方法扩增出三个抗原的融合基因。下面为具体实施步骤：

首先以提取的H37Rv基因组DNA为模板，分别以引物F1（SEQID NO：9）和F2引物（SEQ ID NO：10）通过PCR扩增片段一（Rv3615c）（如图3所示F1和F2相对，经PCR扩增得到的309bp双链DNA片段），所述的片段1的双链DNA的序列为：

以H37Rv基因组DNA作为模板，以T1引物（SEQ ID NO：11）和T2引物（SEQ ID NO：12）通过PCR扩增片段二（Mtb10.4）（如图3所示T1引物和T2相对，经PCR扩增得到的288bp双链DNA片段），所述片段二的双链DNA的序列为：

以H37Rv基因组DNA作为模板，以R1引物（SEQ ID NO：13）和R2引物（SEQ ID NO：14）通过PCR扩增片段三（Rv2660c）（如图3所示R1引物和R2引物相对，经PCR扩增得到的249bp双链DNA片段），所述的片段3的双链DNA的序列为：

将上述的片段一和片段二混合，变性使各自成为单链DNA，由于片段一、二有20个碱基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，再以F1（SEQ ID NO：7）和T2（SEQ ID NO：10）引物通过PCR法可扩增获得片段一、二的融合片段，再与片段3混合，变性成为单链，由于片段2和片段3也有20个碱基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，以F1（SEQ ID NO：7）和R2引物（SEQ ID NO：12）作为引物，通过PCR方法扩增获得片段一、二、三的融合片段四，即融合了3个结核杆菌抗原的融合基因p846，长度为846bp，编码分子量大小约为30KDa的蛋白（如图4所示）。该p846编码基因经电泳证实为846bp，如图4A所示。再将扩增产物经Nhe I和XhoI双酶切，回收酶切片段，与经相应酶切的载体pcDNA3.1(+)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选转化菌落。经测序鉴定序列正确（图4B），提示成功构建了pcDNA3-846真核表达质粒。所述的片段四p846的双链DNA序列为：

同时通过PCR扩增的三个单个抗原Rv3615c，Mtb10.4和Rv2660c也经同样的酶双切后连接到pcDNA3.1(+)载体，获得pRv3615c，pMtb10.4和pRv2660c的重组质粒，作为我们构建的结核杆菌三抗原融合基因疫苗p846的对照组。

将重组质粒p846，pRv3615c，pMtb10.4，pRv2660c及空载体pcDNA3.1分别转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，经LB

（Amp100μg/ml）液体培养基振荡培养15h，收集菌体，按照QIAGENPlasmid Mega Kit去除杂蛋白、细菌内毒素，得到纯化质粒。

实施例3pET28a-846，pGEX-Rv3615c，pGEX-Mtb10.4，

pGEX-Rv2660c原核表达质粒的构建及蛋白表达纯化

为获得大量的pET-28a-846蛋白抗原，简称为TFP846蛋白，及单个抗原基因编码的蛋白，我们将连接到pcDNA3.1上的经测序鉴定正确的三抗原融合基因846用Nhe I和Xho I双酶切，与经相应酶切的原核表达载体pET28a连接，构建了pET28a-846原核表达质粒。由于单个抗原Rv3615c，Mtb104和Rv2660c的分子量均较小，均编码大小约为10KDa左右的蛋白，连接到原核表达载体pET28a上不易纯化，因此，我们又重新设计了三对引物，构建了pGEX-Rv3615c，pGEX-Mtb10.4，pGEX-Rv2660c的原核表达质粒，尝试利用GST标签去纯化。

将pET28a-846，pGEX-Rv3615c，pGEX-Mtb10.4和pGEX-Rv2660c分别转化入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，37℃培养过夜，筛选阳性克隆。经LB（Amp100μg/ml）液体培养基振荡培养至A600达到0.7左右，加入异丙基硫代半糖苷（IPTG）至终浓度为0.1mM。继续振荡培养6小时，4000r/min离心20min收集菌体，1×PBS重悬后超声破碎，12000r/min于4℃离心20min，分别收获上清和沉淀。

TFP846蛋白以非可溶的形式存在于包涵体即沉淀中，于是我们在变性条件下应用Ni柱亲和层析从沉淀中对TFP846蛋白进行了纯化；而pGEX-Rv3615c，pGEX-Mtb10.4和pGEX-Rv2660c表达的蛋白存在于上清中，我们应用GST的标签从上清中纯化了Rv3615c，Mtb10.4和Rv2660c的蛋白。纯化的四种蛋白经12%SDS-PAGE电泳鉴定后，进行梯度透析，最终获得有活性的TFP846，Rv3615c，Mtb10.4和Rv2660c蛋白，然后通过BCA法进行定量，贮存到-80℃备用。

实施例4p846基因疫苗免疫小鼠

将真核表达质粒p846，pRv3615c，pMtb10.4，pRv2660c及空载体pcDNA3.1分别溶解于无菌、无热源的PBS中，浓度调为500ng/μl。选择6到8周龄雌性BALB/c(H-2^d)小鼠，随机分成6组，每组约20只：p846组，pRv3615c组，pMtb10.4组，pRv2660c组，空载体pcDNA3.1组及BCG阳性对照组，每只小鼠每次使用50μg的重组质粒于0、2、4、6周进行免疫，其中BCG组只在0周以5×10⁵CFU的剂量皮下免疫一次。对免疫小鼠每隔两周进行一次眼眶后静脉丛取血，准备以后血清中IgG抗体检测用。于末次免疫后两周无菌取出脾脏淋巴细胞，制备单细胞悬液，体外用相应的大肠杆菌表达的重组蛋白刺激培养，检测相应的细胞免疫应答类型：包括Brdu检测T细胞增殖、LDH的释放检测T细胞的杀伤活性、流式细胞仪及ELISA检测相关的细胞因子等。同时免疫的一些小鼠于末次免疫后4周，进行BCG攻毒，并于攻毒后的4到6周做该疫苗的保护性实验检测（组织病理切片和CFU实验等）。

实施例5p846基因疫苗诱导的特异性抗体应答

间接ELISA法检测免疫小鼠血清中结核抗原特异性IgG。以实施例3获得的纯化的TFP846蛋白，Rv3615c蛋白，Mtb10.4蛋白及Rv2660c蛋白（10μg/ml）分别包被聚苯乙烯微孔板，100μl/孔，4℃过夜。以封闭液（5%脱脂奶粉、0.05%Tween-20、PBS）封闭微孔板，200μl/孔，37℃2h。把各疫苗免疫组收集的血清经1：100稀释后，100μl/孔加到相应蛋白包被的孔中，37℃1h，洗涤后加入1:5000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，IgG1或IgG2a抗体，37℃1h，洗板后以TMB显色5-15min，终止反应后测A₄₅₀值。

如图5A显示：p846基因疫苗免疫四次后在小鼠体内诱导产生了结核抗原特异性IgG抗体，血清IgG抗体滴度在第14周时达到最高，达到1：4500（如图5B），而空质粒注射组基本无特异性IgG抗体生成。且p846基因疫苗可以产生以IgG2a为主的IgG亚型抗体（如图5C）。统计结果显示，p846疫苗诱生的体液免疫应答和传统疫苗BCG相比基本上没有统计学差异，但相对单个抗原疫苗却有着极其显著的差异。

实施例6p846基因疫苗诱导的IFN-γ⁺T细胞应答

于末次免疫后的两周，颈椎脱臼处死小鼠，无菌分离小鼠脾脏淋巴细胞，1×ACK破红后，洗涤2次，以3×10⁶细胞/孔加入24孔板，分别加入上述纯化的TFP846蛋白，Rv3615c蛋白，Mtb10.4蛋白和Rv2660c蛋白（20μg/ml），37℃、5％CO2培养。24小时后，加入高尔基阻断剂BFA，继续培养2h，收集细胞，用Percp-anti-CD4抗体、PE-anti-CD8抗体及APC-anti-IFN-γ抗体进行表面和胞内染色。洗涤后用流式细胞仪检测分泌IFN-γ的T细胞。如图6所示，p846疫苗组和BCG组免疫均显著诱导了结核抗原特异性分泌IFN-γ的CD4⁺T和CD8⁺T细胞的产生，显著高于单抗原疫苗组（p<0.05）。证明该结核杆菌三抗原融合基因疫苗能诱导较强的针对结核特异性抗原的Th1型细胞免疫应答。

实施例7p836基因疫苗诱导高水平IFN-γ分泌

小鼠免疫第8周处死，取脾细胞，去除红细胞后洗涤2次，以5×10⁶细胞/孔加入12孔板，分别加入上述纯化的TFP846蛋白，Rv3615c蛋白，Mtb10.4蛋白和Rv2660c蛋白（10μg/ml），37℃、5％CO₂培养。72小时后，收集上清，用ELISA方法检测IFNγ、TNFα、IL-4、IL-10及IL-2，IL-17A细胞因子的水平。如图7所示，p846基因免疫组能够显著增强IFN-γ、TNFα和IL-2、IL-17A的分泌，明显高于单抗原疫苗对照组，提示该基因疫苗可有效激活结核抗原特异性T细胞分泌IFN-γ等相关Th1型细胞因子。

实施例8p846基因疫苗诱导的特异性增殖和杀伤效应

小鼠免疫第8周处死，取脾细胞，去除红细胞后洗涤2次，以5×10⁵细胞/孔加入96孔板，分别加入上述纯化的TFP846蛋白，Rv3615c蛋白，Mtb10.4蛋白，Rv2660c蛋白（10μg/ml），37℃、5％CO₂培养。72小时后，按1:1000加入BrdU试剂，37℃、5%CO₂培养24小时后，每孔加100μl抗BrdU抗体，室温反应30-120min，PBS洗三次，每孔加入100μl底物显色液，反应5-30min，于370nm处读取OD值。如图8A所示，p846免疫组淋巴细胞增殖能力显著高于单抗原疫苗对照组，发生特异性激活和增殖。

在淋巴细胞杀伤试验中，以2×10⁷细胞/孔加入6孔板中，分别以上述纯化的TFP846蛋白，Rv3615c蛋白，Mtb10.4蛋白，Rv2660c蛋白刺激，并加入50U/ml的IL-2，培养6天后作为效应细胞，以灭活的结核杆菌H37Rv刺激的SP2/0细胞作为靶细胞，以50：1，25：1，12.5：1的效靶比混合加入96孔板，37℃作用72小时。培养结束后将培养板以250g速度离心10min。每孔取100μl细胞培养上清液，加入96孔平底细胞培养板中，于每孔中加入100μl LDH反应液（Roche），室温避光放置30min。将细胞板置于酶标仪中检测492nm的吸光度（A）值。特异性CTL活性的计算方法：

CTL细胞毒相对活性＝［（A效靶细胞混合－A效应细胞对照－A低释放对照）/（A高释放对照－A低释放对照）］×100%。不同质粒免疫小鼠淋巴细胞的特异性杀伤情况如图8B所示，经结核特异性抗原刺激后，p846基因免疫组杀伤率均达到60％以上，在效靶比50:1时，显著高于单抗原疫苗对照组，证明该基因疫苗能诱导较强的结核抗原特异性杀伤应答；提示该结核杆菌三抗原融合基因疫苗具有抵抗结核分枝杆菌感染的功能。

实施例9p846基因疫苗产生抗结核保护性效果

末次免疫小鼠后4周，用1×10⁷BCG通过滴鼻方式给小鼠攻毒。攻毒后4周处死小鼠，取脾脏和肺脏匀浆，均匀涂布在结核分枝杆菌固体培养基7H11上。4周后，对平板上生长的菌落进行计数。如图所示，p846基因免疫组其肺脏和脾脏菌落数（10^3.7和10^2.8）均明显少于单抗原疫苗对照组(10^5.5左右)（图9B），证明该结核杆菌三抗原融合基因疫苗能较好地保护小鼠抵抗结核分枝杆菌的感染。而肺部HE染色病理结果证实，单抗原疫苗组和pcDNA3.1对照组免疫过的小鼠，其肺部出现较严重的结核病灶，同时有显著炎性细胞浸润和肺泡细胞壁增厚的情况。而p846基因疫苗免疫组和卡介苗BCG免疫组，其肺脏病理程度较轻，大部分肺泡腔是完整的，并且肺泡腔内很少有充血、出血和炎性细胞浸润的情况，接近正常肺脏细胞，提示较好的免疫保护作用（图9A）。

Claims (15)

1.一种融合蛋白基因，其特征在于：由抗原基因Rv3615c、抗原基因Mtb10.4和抗原基因Rv2660c从5’端到3’端依次串联连接而成。

2.如权利要求1所述的一种融合蛋白基因，其特征在于：在所述的抗原基因Rv2660c的3’端连接一个Flag标签。

3.如权利要求2所述的一种融合蛋白基因，其特征在于：所述的Flag标签的基因序列为DYKDDDDK。

4.如权利要求1所述的一种融合蛋白基因，其特征在于：所述的融合基因的碱基序列如SEQ ID NO：7所示。

5.一种权利要求1所述的融合蛋白基因编码的蛋白质。

6.如权利要求5所述的一种蛋白质，其特征在于：所述的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

7.如权利要求1所述的一种融合蛋白基因，其特征在于：所述的抗原Rv3615c的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

8.如权利要求1所述的一种融合蛋白基因，其特征在于：所述的抗原Mtb10.4的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

9.如权利要求1所述的一种融合蛋白基因，其特征在于：所述的抗原Rv2660c的基因序列如SEQ ID NO：3所示。

10.一种结核杆菌三抗原融合基因疫苗，由一个载体构成，在所述的载体中插入有一段外源融合目的基因，其特征在于：所述的外源目的基因为权利要求1所述的融合蛋白基因。

11.如权利要求10所述的一种结核杆菌三抗原融合基因疫苗，其特征在于：所述的载体为真核表达质粒。

12.权利要求10所述的结核杆菌三抗原融合基因疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)提取结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA作为模板，通过PCR方法扩增蛋白抗原Rv3615c片段，Mtb10.4片段和Rv2660c片段的编码基因；

所述抗原Rv3615c片段的双链DNA的序列为：

atgacggaaa acttgaccgt ccagcccgag cgtctcggtg tactggcgtc gcaccatgac

tactgccttt tgaactggca ggtcgggctc gcagagccac atgaccgcag cgtggtactg

aacgcggcgg tcgatgcctc ctcgggcgtc gaagctgccg ctggcctagg cgaatctgtg

ttgcgccgcc agctacggag gagcccgcag cttcgacggc gaccggatcc gcttagacac

gcgatcactc acggtccgta ctgctcacag ttcaacgaca cgttaaatgt gtacttgact

cgctagtgag tgccaggcat gacgagtgtc aagttgctgt gcaatttaca catgaactga

gcccacaatg ccctgggctc gtccttgcat acggccggtg tcgatctcgc caaaagtctt

cgggtgttac gggacccgag caggaacgta tgccggccac agctagagcg gttttcagaa

cgaattgcgg cgaagatata tagcgaggcc gacgaagcgt ggcgcaaggc tatcgacggg

gcttaacgcc gcttctatat atcgctccgg ctgcttcgca ccgcgttccg atagctgccc

ttgtttacct ga

aacaaatgga ct

所述抗原Mtb10.4片段的双链DNA的序列为

atgtcgcaaa tcatgtacaa ctaccccgcg atgttgggtc acgccgggga tatggccgga

tacagcgttt agtacatgtt gatggggcgc tacaacccag tgcggcccct ataccggcct

tatgccggca cgctgcagag cttgggtgcc gagatcgccg tggagcaggc cgcgttgcag

atacggccgt gcgacgtctc gaacccacgg ctctagcggc acctcgtccg gcgcaacgtc

agtgcgtggc agggcgatac cgggatcacg tatcaggcgt ggcaggcaca gtggaaccag

tcacgcaccg tcccgctatg gccctagtgc atagtccgca ccgtccgtgt caccttggtc

gccatggaag atttggtgcg ggcctatcat gcgatgtcca gcacccatga agccaacacc

cggtaccttc taaaccacgc ccggatagta cgctacaggt cgtgggtact tcggttgtgg

atggcgatga tggcccgcga cacggccgaa gccgccaaat ggggcggcta g

taccgctact accgggcgct gtgccggctt cggcggttta ccccgccgat c

所述抗原Rv2660c片段的双链DNA的序列为：

gtgatagcgg gcgtcgacca ggcgcttgca gcaacaggcc aggctagcca gcgggcggca

cactatcgcc cgcagctggt ccgcgaacgt cgttgtccgg tccgatcggt cgcccgccgt

ggcgcatctg gtggggtcac cgtcggtgtc ggcgtgggca cggaacagag gaacctttcg

ccgcgtagac caccccagtg gcagccacag ccgcacccgt gccttgtctc cttggaaagc

gtggttgcac cgagtcagtt cacatttagt tcacgcagcc cagattttgt ggatgaaacc

caccaacgtg gctcagtcaa gtgtaaatca agtgcgtcgg gtctaaaaca cctactttgg

gcaggtcaat cgtggtgcgc gatactggga ttgaaccagt ttcactag

cgtccagtta gcaccacgcg ctatgaccct aacttggtca aagtgatc

2)以上述扩增的抗原Rv3615c，Mtb10.4和Rv2660c片段作为模板，通过另外设计的三对引物，经OverPCR的方法扩增抗原Rv3615c，Mtb10.4和Rv2660c片段，获得的三抗原融合蛋白基因，所述三抗原融合基因的双链DNA的序列为：

atgacggaaa acttgaccgt ccagcccgag cgtctcggtg tactggcgtc gcaccatgac

tactgccttt tgaactggca ggtcgggctc gcagagccac atgaccgcag cgtggtactg

aacgcggcgg tcgatgcctc ctcgggcgtc gaagctgccg ctggcctagg cgaatctgtg

ttgcgccgcc agctacggag gagcccgcag cttcgacggc gaccggatcc gcttagacac

gcgatcactc acggtccgta ctgctcacag ttcaacgaca cgttaaatgt gtacttgact

cgctagtgag tgccaggcat gacgagtgtc aagttgctgt gcaatttaca catgaactga

gcccacaatg ccctgggctc gtccttgcat acggccggtg tcgatctcgc caaaagtctt

cgggtgttac gggacccgag caggaacgta tgccggccac agctagagcg gttttcagaa

cgaattgcgg cgaagatata tagcgaggcc gacgaagcgt ggcgcaaggc tatcgacggg

gcttaacgcc gcttctatat atcgctccgg ctgcttcgca ccgcgttccg atagctgccc

ttgtttacct cgcaaatcat gtacaactac cccgcgatgt tgggtcacgc cggggatatg

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gccggatatg ccggcacgct gcagagcttg ggtgccgaga tcgccgtgga gcaggccgcg

cggcctatac ggccgtgcga cgtctcgaac ccacggctct agcggcacct cgtccggcgc

ttgcagagtg cgtggcaggg cgataccggg atcacgtatc aggcgtggca ggcacagtgg

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aaccaggcca tggaagattt ggtgcgggcc tatcatgcga tgtccagcac ccatgaagcc

ttggtccggt accttctaaa ccacgcccgg atagtacgct acaggtcgtg ggtacttcgg

aacaccatgg cgatgatggc ccgcgacacg gccgaagccg ccaaatgggg cggcgtgata

ttgtggtacc gctactaccg ggcgctgtgc cggcttcggc ggtttacccc gccgcactat

gcgggcgtcg accaggcgct tgcagcaaca ggccaggcaa gccagcgggc ggcaggcgca

cgcccgcagc tggtccgcga acgtcgttgt ccggtccgtt cggtcgcccg ccgtccgcgt

tctggtgggg tcaccgtcgg tgtcggcgtg ggcacggaac agaggaacct ttcggtggtt

agaccacccc agtggcagcc acagccgcac ccgtgccttg tctccttgga aagccaccaa

gcaccgagtc agttcacatt tagttcacgc agcccagatt ttgtggatga aaccgcaggt

cgtggctcag tcaagtgtaa atcaagtgcg tcgggtctaa aacacctact ttggcgtcca

caatcgtggt gcgcgatact gggattgaac cagtttcacg attacaagga tgacgacgat

gttagcacca cgcgctatga ccctaacttg gtcaaagtgc taatgttcct actgctgcta

aagtaa

ttcatt，然后将获得的融合蛋白基因片段经NheI/XhoI双酶切后与经同样双酶切的载体连接，获得上述的一种结核杆菌三抗原融合基因疫苗。

13.如权利要求12所述的结核杆菌三抗原融合基因疫苗的制备方法，其特征在于：将抗原Rv3615c，Mtb10.4和Rv2660c片段混合、热变性使各自成为单链DNA，再通过OverPCR法扩增获得由抗原Rv3615c，Mtb10.4和Rv2660c片段构成融合蛋白基因。

14.一种药物组合物，其特征在于：含有有效量的权利要求10所述的一种结核杆菌三抗原融合基因疫苗，以及药学上可以接受的载体或者赋形剂。

15.权利要求10所述的一种结核杆菌三抗原融合基因疫苗在制备、或者预防结核病的药物中的应用。

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