CN101248084A - 包含潜伏感染阶段期间所表达的抗原的结核疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物，用于预防、改善或者治疗由肺结核致病菌复合群(结核分枝杆菌，牛分枝杆菌，非洲分枝杆菌，田鼠分枝杆菌)所引起的传染病。所述免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物包含融合多肽，该融合多肽包含一种或多种来自结核分枝杆菌的饥饿抗原，融合多肽的单元是结核分枝杆菌各种抗原。进一步地，本发明涉及包含本发明融合多肽序列或者核酸序列的疫苗用于制备所述免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物的用途，所述疫苗与BCG同时给予，也可以与BCG混合或者单独地在不同的位置或者以不同的途径给药。

Description

包含潜伏感染阶段期间所表达的抗原的结核疫苗

技术领域

本发明公开了饥饿诱导的抗原，或者基于饥饿期间诱导的得自结核分枝杆菌的多肽的免疫原性多肽的新的融合多肽，一种或多种本发明的融合多肽或者饥饿诱导的抗原用于制备用来给予人/动物的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物的用途，以及这样的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物。

背景技术

由结核分枝杆菌(M.tuberculosis)所引起的人肺结核是一个严重的全球性健康问题，根据WHO的数据，其造成每年约3百万人死亡。在二十世纪60年代和70年代期间，全世界新的肺结核(TB)发生病例已经下降，但在近年中，部分由于AIDS的来临和结核分枝杆菌的耐多元药物(multidrug)菌株的出现，这种趋势已经发生明显的改变。

目前唯一可供用于临床使用的疫苗是BCG(卡介苗)，该疫苗的效力仍然有些争议。BCG通常在TB动物模型中诱导高水平的获得抗性，并在人群中给予抗传播类型结核如脑脊膜炎(meningitis)和粟粒性结核保护。当给予低龄孩子BCG时，它在几年之内能起到抗结核的保护作用，但之后效力发生变化。比较不同的对照实验(controlled trial)，揭示BCG在成人中的保护效力在无效至80％保护的效力范围内显著地变化。这使得开发新的和改良的抗结核分枝杆菌的疫苗成为非常迫切的事情，其已经被世界卫生组织(WHO)给予非常高的优先权。

已经有了很多对保护性分枝杆菌物质进行阐述的尝试，不同的研究者已经报导了在试验性接种疫苗后获得提高的抗性。结核分枝杆菌具有并分泌一些潜在的适合用于产生新的结核分枝杆菌疫苗的蛋白质。对候选分子的搜索主要集中在从区分的细菌(dividing bacteria)中释放出来的蛋白质。尽管大量这种蛋白质已经被表征，但其中只有少数在动物模型中被证实作为亚单元疫苗诱导保护性的免疫应答，其中最显著的是ESAT-6和Ag85B(Brandt等，2000)。然而，还没有获得具有BCG潜力或加强BCG预防接种人中的能力的特定长期保护性免疫应答的示例(demonstration)。充其量使用BCG的BCG加强没有效果[Colditz，1994]。尽管与单独使用BCG相比没有什么显著的改善，但在近交小鼠品系中用Ag85a进行BCG加强免疫后还是会引起一定的保护作用(Brooks等IAI 2001；WO0204018)。由于BCG需要区分和分泌蛋白质以诱导保护性的免疫应答，故强化免疫效果的缺乏主要是由于环境分枝杆菌的敏感性或来自初次BCG接种的剩余免疫应答。两者均引起抗BCG的急性免疫应答和由此对生长的快速抑制，以及对BCG的清除。

结核分枝杆菌传染的过程主要经历三个时期。在急性期，细菌在器官中增殖，直到免疫应答增强。特定敏化的CD4T淋巴细胞介导传染的调节，最重要的介导分子似乎是γ干扰素(IFN-γ)。细菌负荷(bacterial load)开始减少，在细菌负荷稳定维持在低水平时形成潜伏期。在这个时期，结核分枝杆菌由活跃的增殖趋于休眠，基本上转变为非复制状态并维持在肉芽肿内。在某些情况下，传染趋于再活化时期，休眠的细菌重新开始复制。已经揭示出结核分枝杆菌从初次传染到潜伏期的转变伴随着基因表达的变化(Honer zu Bentrup，2001)。在免疫应答的抗原-特异性方面也有可能发生变化，因为从活跃的复制到休眠的转变期间，细菌调节着基因表达。控制潜伏性感染免疫应答的所有特性和引起再活化的因素基本上是未知的。然而，有一些证据证明与主导细胞(dominant cell)类型中的转变有关。虽然CD4T细胞对急性期的感染控制是必要的和足够的，但研究揭示CD8T细胞反应在潜伏期更为重要。1998年，Cole等公开了结核分枝杆菌的完整基因组序列，并预测其中存在大约4000个开放阅读框，披露了核苷酸序列和推定的蛋白序列(Cole等，1998)。然而重要地是，这个序列信息不能用于预测该DNA是否在体内被翻译和表达成蛋白。众所周知，结核分枝杆菌的一些基因在模拟潜伏期的条件下是正调节的。然而，这些是潜伏性感染期间总的基因表达的有限子集。另外，本领域的技术人员将会容易地理解，一种基因的表达还不足以使其成为一种好的候选疫苗。确定一种蛋白在结核分枝杆菌潜伏感染期间是否被免疫系统识别的唯一方法是制备出这种给定的蛋白，并按照这里描述的适当试验对该蛋白进行测试。一些蛋白质特别重要并有潜力成为晚期抗原(潜伏感染期间识别的抗原)，这是由于在感染后，它们大部分表达了相对较长的时间，而此时免疫系统已经发动了最初的适应性防御，并且环境也变得对分枝杆菌更加敌对。模拟低氧压力的体外缺氧的培养条件此前已显露与这方面相关，现在已经被用于分析基因表达方面的变化。已经发现在这些条件下可以诱导或者显著地正调节一些抗原，例如16kDa抗原α-晶体蛋白(α-crystalin)(Sherman，2001)、Rv2660c和Rv2659c(Betts，2002)(我们自己的申请)。另一个有可能特别感兴趣的环境刺激是饥饿，其设计反映出营养物被局限于肉芽肿内(潜伏感染的位点)以及在饥饿下基因表达产物被正调节，因此有可能成为特别感兴趣的感染潜伏期中的抗原靶。

在超过20000种已知在初次感染期表达并作为疫苗被测试的抗原中，少于半打的抗原表现出明显的潜力。迄今为止仅有一种抗原已经被证实具有作为治疗性疫苗的所有潜质(Lowrie，1999)。然而这个疫苗仅在作为DNA疫苗施用时起作用并被证明是有争议的，因为有其它组声称使用该方案接种诱导了非特异性的保护甚至使疾病恶化(Turner，2000)。相反，如在提供的实施例中所显示的，使用最佳识别的接种疫苗技术，本发明描述的融合多肽可以被掺入疫苗。

进一步地，由于TB疫苗不引起杀菌免疫性而是控制感染在亚临床(subclinical)水平(从而导致随后的潜伏感染的确立)，故本发明描述了将具有预防和治疗活性的成分联合的多期(multiphase)疫苗。常规的预防接种后，初次免疫应答的逃逸(evasion)和潜伏性疾病的随后发展或许至少部分地是由于侵袭细菌的抗原轮廓(antigenic profile)的改变。因此，用与潜伏TB相关的抗原进行接种，应该能预防或者减少潜伏感染的形成，并因此将混合了细菌在第一对数生长期和潜伏发病期间所表达的抗原的疫苗，用作预防性疫苗时，能改善长期的免疫性。由于这种多期疫苗显然也可以作为有效的治疗疫苗，因此可以解决将要接受未来TB疫苗的第三世界的大部分人可能已经被潜伏地感染的问题。

发明概述

本发明涉及用于预防或/和治疗由结核分枝杆菌复合群(complex)(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌等)的物种所引起的感染的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物(包括加强接种疫苗和多期疫苗)，该免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物含有饥饿诱导的抗原或包含一种或多种饥饿诱导的结核分枝杆菌抗原的融合多肽，其中融合多肽的单元是结核分枝杆菌抗原。本发明还涉及像这样的融合多肽和编码该融合多肽的核酸序列。更进一步地，本发明涉及通过合成或重组制备的短重叠(多个)肽或者长重叠(多个)肽或者不重叠的(多个)肽的用途。更进一步地，本发明涉及饥饿诱导的抗原或者本发明的融合多肽序列或者核酸序列用于制备所述免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物的用途，以及由该方法制备的疫苗或者药物组合物。进一步地，本发明涉及包含本发明饥饿诱导的抗原或融合多肽序列或核酸序列的疫苗用于制备所述免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物的用途，所述疫苗同时与BCG给予，也可以与BCG混合或者在不同的位置或以不同的途径单独给药。更进一步地，本发明涉及包含饥饿诱导的抗原或者融合多肽序列或者核酸序列的疫苗作为BCG加强剂的用途。进一步地，通过包含天然感染期间早期和晚期均表达的抗原，疫苗将引起两步的免疫应答以使得免疫系统抵御病原体，无论该病原体带有包括潜伏期间的某时间点上的何种最有效表位。

发明细述

本发明公开了包含饥饿诱导的抗原或者含有一种或多种饥饿诱导的抗原的融合多肽的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物。

这些饥饿诱导(在饥饿期间超过6.5倍正调节或者与饥饿诱导的基因遗传性相连)抗原的氨基酸和核酸序列如以下所示出现在序列表中：

饥饿诱导的抗原	DNA SEQ ID NO	aa SEQ ID NO
			Rv2655	1	2
Rv2656	3	4
			Rv2657	5	6
Rv2658	7	8
			Rv2659c	9	10
Rv2660c	11	12
			Rv2661	13	14
Rv2662	15	16
			Rv2663	17	18
Rv0188	19	20
			Rv3290c	21	22

Rv3289c	23	24
			Rv2034	25	26
Rv2169c	27	28
			Rv0116c	29	30
Rv2558	31	32
			Rv1152	33	34
Rv3291c	35	36
			Rv1284	37	38
Rv1954c	39	40
			Rv3810	41	42
Rv2517c	43	44
			Rv3288c	45	46
Rv0789c	47	48
			Rv1955	49	50
Rv3735	51	52
			Rv3675	53	54
Rv2270	55	56
			Rv2050	57	58
Rv3287c	59	60
			Rv2557	61	62
Rv0122	63	64
			Rv2497c	65	66
Rv1250	67	68
			Rv1552	69	70
Rv2526	71	72
			Rv1809	73	74
Rv0918	75	76
			Rv0516c	77	78
Rv2745c	79	80
			Rv1472	81	82
Rv1660	83	84
			Rv2302	85	86

在目前的上下文中，基于来源于结核分枝杆菌多肽的各个免疫原多肽被定义成融合多肽的“单元”。所述融合可以包含2、3、4、5、6、7、8、9乃至10个不同的单元。

融合多肽中单元的顺序可以是任何组合。在顺序术语中，任何组合的所有上述抗原的融合多肽均属于本发明的范围之内。本发明的融合多肽可用于制备免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物，尤其是在下文中详细描述的BCG加强疫苗。

与饥饿多肽一起构成融合多肽单元的优选多肽具有以下Sanger身份编号和氨基酸序列：

平常(trivial)的名称	SangerID
		ESAT6	Rv3875
TB10.4	Rv0288
		Ag85A	Rv3804c
Ag85B	Rv1886c
		ORF2c	Rv3871(C末端)
TB13.0	Rv1036
		TB9.56	Rv0285
TB9.8	Rv0287

多肽	氨基酸序列
		ESAT6	MTEQQWNFAG    IEAAASAIQG    NVTSIHSLLD    EGKQSLTKLAAAWGGSGSEA    YQGVQQKWDA    TATELNNALQ    NLARTISEAGQAMASTEGNV    TGMFA
Ag85A	SRGPLP    VEYLQVPSPS    MGRDIKVQFQ    SGGANSPALYLLDGLRAQDD    FSGWDINTPA    FEWYDQSGLS    VVMPVGGQSSFYSDWYQPAC    GKAGCQTYKW    ETFLTSELPG    WLQANRHVKPTGSAVVGLSM    AASSALTLAI    YHPQQFVYAG    AMSGLLDPSQAMGPTLIGLA    MGDAGGYKAS    DMWGPKEDPA    WQRNDPLLNVGKLIANNTRV    WVYCGNGKPS    DLGGNNLPAK    FLEGFVRTSNIKFQDAYNAG    GGHNGVFDFP    DSGTHSWEYW    GAQLNAMKPDLQRALGATPN    TGPAPQGA
		Ag85B	SRPGLPVEY    LQVPSPSMGR    DIKVQFQSGG    NNSPAVYLLDGLRAQDDYNG    WDINTPAFEW    YYQSGLSIVM    PVGGQSSFYSDWYSPACGKA    GCQTYKWETF    LTSELPQWLS    ANRAVKPTGSAAIGLSMAGS    SAMILAAYHP    QQFIYAGSLS    ALLDPSQGMGPSLIGLAMGD    AGGYKAADMW    GPSSDPAWER    NDPTQQIPKLVANNTRLWVY    CGNGTPNELG    GANIPAEFLE    NFVRSSNLKFQDAYNAAGGH    NAVFNFPPNG    THSWEYWGAQ    LNAMKGDLQSSLGAG
TB10.4	MSQIMYNYPA    MLGHAGDMAG    YAGTLQSLGA    EIAVEQAALQSAWQGDTGIT    YQAWQAQWNQ    AMEDLVRAYH    AMSSTHEANTMAMMARDTAE    AAKWGG
		ORF2c	MIVGAAGGMP    PMAPLAPLLP    AAADIGLHII    VTCQMSQAYKATMDKFVGAA    FGSGAPTMFL    SGEKQEFPSS    EFKVKRRPPGQAFLVSPDGK    VIQAPYIEPP    EEVFAAPPSA    G
Rv1036	LIPGRMVLNW    EDGLNALVAE    GIEAIVFRTL    GDQCWLWESLLPDEVRRLPE    ELARVDALLD    DPAFFAPFVP    FFDPRRGRPSTPMEVYLQLM    FVKFRYRLGY    ESLCREVADS    IT
		Rv0285	MTLRVVPEGL    AAASAAVEAL    TARLAAAHAS    AAPVITAVVPPAADPVSLQT    AAGFSAQGVE    HAVVTAEGVE    ELGRAGVGVGESGASYLAGD    AAAAATYGVV    GG
Rv0287	MSLLDAHIPQ    LVASQSAFAA    KAGLMRHTIG    QAEQAAMSAQAFHQGESSAA    FQAAHARFVA    AAAKVNTLLD    VAQANLGEAAGTYVAADAAA    ASTYTGF

优选的融合多肽化合物包含以下以不同的单元顺序组合的多肽，所述多肽具有一种或多种饥饿诱导的抗原(X)：ESAT6-Ag85A-X，ESAT6-Ag85B-X，Ag8A-X，Ag85B-X，TB10-Ag85A-X，TB10-Ag85B-X，其中X是任意一种饥饿诱导的抗原，抗原单元的顺序可以是任一种组合，例如其中的顺序是相反的或X被置于中间等。

但是融合多肽可以根据一种或多种饥饿诱导的抗原和一种或多种结核分枝杆菌抗原的任何一种其它组合进行构建。

融合多肽的类似物及编码这种多肽的核酸序列均属于本发明的范围内，所述类似物具有与本发明任一种融合多肽的任何一部分有至少80％序列同一性的氨基酸序列并具有免疫原性。这种类似物包含在术语“本发明的多肽”或“本发明的融合多肽”中，这些术语被贯穿于说明书和权利要求书中交替使用。按照术语“本发明的核酸序列”，其是指编码这种多肽的核酸序列。更进一步地，在本发明的范围内还包括短重叠(多个)肽或长重叠(多个)肽或者不重叠的(多个)肽，所述多肽具有与本发明的任何一种融合多肽有80％序列同一性的氨基酸序列并具有免疫原性。

本发明目前优选的实施方式是加强在先BCG接种疫苗免疫性的疫苗，即，该疫苗给予先前已接种的BCG个体。

本发明的第一个方面包括上述饥饿诱导的抗原或者融合多肽的变体，其被脂化(lipidated)以便提供多肽的自身辅助(self-adjuvating)效果。

本发明免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物可以通过如经口、鼻、颊的粘膜给药或者常规的肌内给药、皮内给药，通过皮下注射给药或者经皮给药，或者任何其它适合的途径给药，例如直肠给药。

在另一个实施方式中，本发明公开了如上定义的饥饿诱导的抗原或者融合多肽在免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物的制备中的用途，所述免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物能和BCG疫苗一起用于预防接种，加强接种或用于治疗性接种，抵抗由毒性分枝杆菌如结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、麻风分枝杆菌或溃疡分枝杆菌所引起的感染。

在第二个方面，本发明公开了免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物，它们包含编码如上定义的饥饿诱导的抗原或者融合多肽的核苷酸序列，或者包含能够在严格条件下与本发明的核酸序列杂交的互补的核酸序列。

所述核酸片段优选是DNA片段。所述片段能被用作下面讨论的药物。

在一个实施方式中，本发明公开了免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物，它们包含任选地插入载体的本发明核酸片段。将引起包括人的动物体内抗原表达的疫苗给予包括人的动物后，表达的抗原数量能有效地将实质上增强的抗性赋予动物包括人，以增强对由毒性分枝杆菌如肺结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛结核杆菌、麻风分枝杆菌或者溃疡分枝杆菌引起的结核病的抗性。

在一个进一步的实施方式中，本发明公开了一种包含本发明核酸片段的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物用于抗由毒性分枝杆菌引起的结核病的治疗性疫苗的用途。

在另一个进一步的实施方式中，本发明公开了免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物，它们能被用于和BCG一起预防接种，或者作为加强疫苗给予以前接种过BCG的人，以免疫动物包括人抵抗由毒性分枝杆菌如结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛结核杆菌、麻风分枝杆菌或者溃疡分枝杆菌所引起的结核病，所述的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物包含作为有效成分的非病原的微生物如牛痘、腺病毒或者牛结核杆菌BCG，其中，包含编码上述融合多肽的DNA序列的至少一拷贝的DNA片段以使微生物可以表达和选择性分泌该融合多肽的方式，被引入微生物中(例如置于质粒或者基因组中)。

在另一个实施方式中，本发明公开了含有本发明核酸片段的有感染力的表达载体，例如牛痘、腺病毒或者牛结核杆菌BCG，以及含有至少一种所述载体的转化的细胞。

在第三个方面，本发明公开了对动物包括人进行免疫或加强它们对毒性分枝杆菌引起的结核病的免疫力的方法，其中毒性分枝杆菌如结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、麻风分枝杆菌或者溃疡分枝杆菌，该方法包括给予动物上述定义的融合多肽、本发明的免疫原性组合物或者本发明的疫苗。

在第四个方面，本发明公开了用于治疗患有活跃或者潜伏的结核病的动物(包括人)的方法，所述结核病由毒性分枝杆菌如结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、麻风分枝杆菌或者溃疡分枝杆菌引起，该方法包括给予动物上述定义的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物。

在第五个方面，本发明公开了上述定义的饥饿诱导的抗原或者融合多肽或者核酸片段在制备免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物中的用途，该免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物与牛分枝杆菌BCG联合用于预防接种(包括加强接种)或治疗性接种以抵抗由毒性分枝杆菌如结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、麻风分枝杆菌或溃疡分枝杆菌所引起的感染。

本发明的疫苗、免疫原性组合物、疫苗和药物组合物能被预防性地用于没有感染毒性分枝杆菌的受试者，或者用于先前接种过结核分枝杆菌BCG的个体，或者治疗性地用于感染了毒性分枝杆菌的受试者。

可以理解本发明第一个方面的实施方式如所描述的免疫原性多肽还可用于本发明的全部其它方面；反之亦然。

贯穿于说明书的全部，除非上下文需要，否则单词“包含/包括(comprise)”或者其变化说法如“包含/包括(comprises)”或者“包含/包括(comprising)”将被理解成内含所述成分、或者整体、或者成分的组、或者整体的组的意思，然而其并非排除任何其它的成分、或者整体、或者成分的组、或者整体的组。

定义

饥饿

按照术语“饥饿”，其被理解为使有机体失去碳、氮或者能源、它们的任一种组合乃至全部。

饥饿诱导的蛋白

按照术语“饥饿诱导的蛋白”，其被理解成分枝杆菌经饥饿胁迫后，在转录或者蛋白质水平上被诱导了(提高了)至少6.5倍的任何一种蛋白质。

与牛分枝杆菌BCG的组合

按照术语“与牛分枝杆菌BCG的组合”，其被理解成与上述定义的一种或多种融合多肽或者一种或多种编码这些融合多肽的核酸片段一起联合施用任何一种牛分枝杆菌BCG菌株，所述牛分枝杆菌BCG菌株包括巴斯德(Pasteur)、Phipps、Frappier、Connaught、Tice、丹麦、葛兰素(Glaxo)、布拉格、Birkhaug、瑞典、日本、Moreau和俄罗斯株，或者同时但在不同的位置或者以不同的途径给药，其数量可以引起动物模型或者人中显著提高的特异性免疫应答或者有效的保护。

牛分枝杆菌BCG的加强

按照术语“牛分枝杆菌BCG的加强”，其被理解成在用任一种牛分枝杆菌BCG菌株接种后的任一时期，给予如上定义的一或多种融合多肽或者编码它们的一或多种核酸片段，其数量能够引起动物模型或者人中显著提高的特异性免疫应答或者有效的保护，其中牛分枝杆菌BCG菌株包括Pasteur、Phipps、Frappier、Connaught、Tice、丹麦、Glaxo、布拉格、Birkhaug、瑞典、日本、Moreau和俄罗斯株。

多肽

被用作本发明融合多肽的单元的多肽优选是来自结核分枝杆菌的免疫原性多肽。这种多肽可以例如基于来源于结核分枝杆菌细胞和/或结核分枝杆菌培养滤液的多肽。多肽通常是重组的或者合成的多肽，可以由免疫原性多肽、其免疫原性部分组成或者可以包含额外的序列。额外的序列可以来源于天然的结核分枝杆菌抗原或者是异源的，且这种序列可以但并非必需具有免疫原性。

按照术语“融合多肽”，其被理解成两个或多个随机排列的来自结核分枝杆菌的免疫原性多肽或者其类似物，其中融合了或者没有融合一种或多种任意长度和序列的氨基酸间隔子(spacer)。

单词“多肽”在本发明中具有其通常的含义，即任一长度的氨基酸链，包括全长蛋白、寡肽、短肽及其片段和融合多肽，其中氨基酸残基经由共价的肽键连接。

多肽可以是经化学修饰的，包括糖基化、脂化(例如用Mowat等1991年所述的棕榈酰基氧基琥珀酰亚胺或用Lustig等1976年所述的十二酰氯化物经化学脂化(lipidation))、包含辅基或者包含额外的氨基酸如组氨酸标签或信号肽。

每一免疫原性多肽由具体的氨基酸表征并由具体的核酸序列编码。通过重组或合成方法制备的这种序列和类似物及突变体也属于本发明的范围内，其中重组多肽中的这种多肽序列已经被取代、插入、添加或者缺失了一个或多个氨基酸残基，但在这里所描述的任何生物检测中仍具有免疫原性。

取代优选是“保守性的”，这些保守性取代如下表所示。在第二栏相同组里的氨基酸，优选是在第三栏相同行中的氨基酸，可以彼此取代。第三栏中的氨基酸由单字母代码指代。

每一多肽由具体的核酸序列编码。类似物和这种经取代、插入、添加或缺失一个或多个核酸修饰的核酸序列属于本发明的范围内。在密码子使用中，取代优选是沉默取代，从而不会引起氨基酸顺序的任何一种改变，但通过引入可以提高蛋白质的表达。

核酸片段

按照术语“核酸片段”和“核酸序列”，它们被理解成任何一种核酸分子，包括DNA、RNA、LNA(锁核酸，locked nucleic acids)、戊糖核酸(PNA)、RNA、dsRNA和RNA-DNA杂交链。此外包括含有非天然存在的核苷的核酸分子。术语包括取决于用途的任何长度的核酸分子，例如从10到10000个核苷酸。当核酸分子被用作一种医药制品，例如在DNA治疗中，或者用于制备根据本发明多肽的方法中时，优选使用编码至少一种表位的分子，其长度从约18到约1000个核苷酸，所述分子可任选地插入载体中。当所述核酸分子用作探针、引物或者反义治疗时，优选使用长度为10-100个核苷酸的分子。根据本发明，其它的分子长度也能被使用，例如具有至少12、15、21、24、27、30、33、36、39、42、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或者1000个核苷酸(或核苷酸衍生物)的分子，或者具有至多10000、5000、4000、3000、2000、1000、700、500、400、300、200、100、50、40、30或者20个核苷酸(或核苷酸衍生物)的分子。

当与杂交条件相连使用时，术语“严格的”如在文献中定义的，即杂交是在温度低于Sambrook等1989年第11.45-11.49页中所述的解链温度Tm值至多15-20℃时进行。优选地，条件是“高严格的”，即低于解链温度Tm值5-10℃。序列同一性

术语“序列同一性”指两个基本上等长的氨基酸序列或两个基本上等长的核酸序列之间相同程度的一种定量的度量标准。比较的两个序列必须被调整成与插入的缺口或者蛋白质序列末端的截短具有最佳潜在的吻合可能性。序列同一性可以通过公式(N_ref-N_dif)100/N_ref计算，其中N_dif是调整后两个序列中非等同残基的总数，其中N_ref是两个序列之一的残基的数量。因此，DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC具有75％的序列同一性(N_dif＝2和N_ref＝8)。缺口被算作是具体(多个)残基的不一致，即DNA序列AGTGTC与DNA序列AGTCAGTC将有75％的序列同一性(N_dif＝2和N_ref＝8)。序列同一性另外可以通过BLAST程序计算，例如BLASTP程序(Pearson W.R和D.J.Lipman(1988))(www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST)。在本发明的一个实施方式中，校准是用序列对比方法ClustalW、采用如Thompson J.等1994年描述的缺省参数进行的，这些可以通过网址http://www2.ebi.ac.uk/clustalw/获得。

优选序列同一性的最低百分数是至少80％，例如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％和至少99.5％。优选地，相对于基于来源于结核分枝杆菌的多肽的免疫原性多肽单元，本发明融合多肽中取代、插入、添加或者缺失一个或多个氨基酸残基的数目是有限的，即发生至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个取代，至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个插入，至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个添加，和至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个缺失。

免疫原性部分

本发明的多肽包含免疫原性部分如B细胞或T细胞表位。

免疫原性多肽的免疫原性部分是多肽的一部分，其引起动物或者人中和/或由任一这里描述的生物实验测定的生物样品的免疫应答。多肽的免疫原性部分可能是T细胞表位或B细胞表位。免疫原性部分可以涉及一个或者一些相对小的多肽的部分，它们可以分散地遍布于多肽序列上或者位于多肽特定的部分中。对于一些多肽表位而言，甚至已经被证实分散贯穿于多肽的全部序列(Ravn等，1999)。

为了鉴定免疫应答期间被识别的相关T细胞表位，有可能使用一种“强力(brute force)”方法：因为T细胞表位是线性的，如果系统地构建多肽的缺失突变体，那么这些突变体将显示多肽的哪些区域对于免疫识别是关键的，例如将这些缺失突变体作为如这里描述的IFN检测的对象。另一种方法是利用重叠寡肽用于探测MHC II类表位，优选合成的具有长度例如20个来自于多肽的氨基酸残基的表位。这些肽可以在生物学分析(例如这里描述的IFN检测)中被测定，并且它们中的一些将产生阳性反应(因此是免疫原性的)，这种反应是肽中存在T细胞表位的证据。为了发现MHC I类表位，预测那些将会结合的肽(Stryhn等，1996)，之后合成制备出这些肽并在相关的生物学分析如这里描述的IFN检测中进行测试。肽优选具有例如8到11个来源于多肽的氨基酸残基的长度。可以通过如Harboe等1998年描述的通过分析B细胞对覆盖感兴趣多肽的重叠肽的识别来确定B细胞表位。

多肽的免疫原性部分可以被遗传性异型杂种人群的大部分(高频率)或者小部分(低频率)识别。另外，一些免疫原性部分诱导高免疫应答(占优势的)，而其它的则诱导较低的但是仍然有效的反应(占第二位优势的)。高频率＞＜低频率可与广泛分布的MHC分子(HLA型)结合的乃至被多重的MHC分子结合的免疫原性部分相关(Kilgus等，1991；Sinigaglia等，1998)。

类似物

本发明融合多肽的共同特征是如实施例中举例说明的，它们能诱导免疫应答。当然，通过取代、插入、添加或者缺失制备的本发明融合多肽的类似物也在本发明的范围内，所述类似物经任何这里描述的检测测定同样具有免疫原性。

基本上纯化的

在目前的上下文中，术语“基本上纯化的多肽”指多肽制品，其包含至多5％重量的与所述多肽天然地或在重组或合成生产中相关联的其它多肽物质(较低百分数的其它多肽物质是优选的，例如至多4％，至多3％，至多2％，至多1％和至多0.5％)。优选基本上纯化的多肽是至少96％纯化的，即多肽占存在于制品中的总的多肽物质重量的96％，并优选更高的百分数，例如至少97％，至少98％，至少99％，至少99.25％，至少99.5％和至少99.75％。特别优选多肽是“基本上纯的形式”，即多肽基本上不含与之天然关联的任何其它抗原，也就是不含有来自属于结核病复合群或毒性分枝杆菌的细菌的任何其它抗原。这可以通过在非分枝杆菌宿主细胞中经重组方法制备多肽实现，如以下将详细描述的一样，或通过公知的固相或液相肽合成方法合成多肽，例如由Merrifield描述的方法或其衍生的方法，以及通过利用本领域技术人员熟知的适当的提纯步骤实现。

毒性分枝杆菌、当前感染的个体和免疫的个体

按照术语“毒性分枝杆菌”，它被理解成能引起动物或者人中结核疾病的细菌。毒性分枝杆菌的例子如结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛结核杆菌、麻风分枝杆菌或者溃疡分枝杆菌。相关动物的例子如牛、负鼠、獾、水牛、狮子、印度马鲅(kurus)和袋鼠。

对于“当前感染了毒性分枝杆菌的动物或人”，其被理解成通过培养或者显微镜证实感染了毒性分枝杆菌的个体，和/或临床上诊断有TB并对抗-TB化疗有反应的个体。培养、显微镜检查和临床诊断TB为任何所属技术领域的专业人员所熟知。

免疫的个体被定义成已经清除或控制了毒性分枝杆菌的感染或已经接受了牛分枝杆菌BCG接种的人或动物。

免疫原性

免疫原性多肽被定义成诱导免疫应答的多肽。免疫应答可以通过以下方法之一监控：

体外的细胞反应通过从淋巴细胞释放的相关细胞因子例如IFN-(来确定，所述细胞分离自当前或者以前感染上毒性分枝杆菌的动物或者人，或者通过检测这些T细胞的增殖来确定。诱导是通过添加多肽或者免疫原性部分到含有1×10⁵个细胞到3×10⁵个细胞每孔的悬浮液中进行的。细胞分离自血液、脾、肝或者肺，添加多肽或者多肽的免疫原性部分至浓度不超过20(g/ml悬浮液，刺激二到五天。为了监控细胞增殖，细胞用放射性标记的胸苷脉冲，温育16-22小时后，通过液体闪烁计数检测增殖。阳性反应是大于背景值加上两个标准偏差的反应。IFN-(的释放可以通过所属技术领域的专业人员所熟知的ELISA方法确定。阳性反应是大于背景值加上两个标准偏差的反应。在监控对多肽的免疫应答时，除了IFN-(，其它的细胞因子也适用，如IL-12、TNF-(、IL-4、IL-5、IL-10、IL-6、TGF-(。用于测定细胞因子(如IFN-()存在的另一个并更灵敏的方法是ELISPOT方法，其中分离自血液、脾、肝或者肺的细胞被稀释至优选1×10⁶细胞/ml到4×10⁶细胞/ml的浓度，在存在浓度不超过20(g/ml的多肽或者多肽的免疫原性部分下，温育18-22个小时。细胞悬液之后被稀释至1×10⁶/ml到2×10⁶/ml并转移到包被有抗-IFN-(的Maxisorp板上，温育优选4到16个小时。通过使用标记有第二抗-IFN-(抗体和相关底物所产生的斑点来确定IFN-(产生细胞，该斑点可以使用解剖显微镜来计数。通过PCR技术也可以测定存在的编码相关细胞因子的mRNA。通常一种或多种细胞因子将通过如PCR、ELISPOT或者ELISA测定。所属技术领域的专业人员可以理解，由特定多肽诱导的任何所述细胞因子总量的显著增加或减少可被用于评定多肽的免疫活性。

还可以通过利用来源于免疫个体或结核分枝杆菌感染者的T细胞系来确定体外的细胞反应，其中所述T细胞系已经由提取自细菌细胞或培养滤液的活的分枝杆菌外加IL-2启动了10到20天。通过添加不超过20(g/ml悬浮液的多肽到含有1×10⁵个细胞至3×10⁵个细胞每孔的T细胞系来实现诱导，温育进行两到六天。IFN-(的诱导或其它相关细胞因子的释放通过ELISA检测。对T细胞的刺激还可以通过使用如上所述的放射性标记的胸苷检测细胞增殖进行监控。对于两种检测而言，阳性反应是大于背景值加上两个标准偏差的反应。

在对临床上或者亚临床上感染了毒性分枝杆菌的个体进行皮内注射或者局部应用贴片(patch)至多100(g多肽或者免疫原性部分后，如果在注射或者应用72-96小时后产生了至少5mm直径的阳性反应，则体内的细胞反应可以被确定为阳性DTH反应。

通过免疫者或者被感染个体中的特异性抗体反应，可以确定体外体液的反应。存在的抗体可以通过ELISA技术或者蛋白质印迹测定，其中多肽或者免疫原性部分被吸收至硝酸纤维膜或者聚苯乙烯的表面。血清优选用PBS稀释，稀释比例从1∶10至1∶100，并被添加到已被吸收的多肽上，温育1到12个小时。通过利用标记的第二抗体，如通过ELISA经测定该特异性标记存在与否就可以确定是否存在特定抗体，其中阳性反应是大于背景值加上两个标准偏差的反应，或者可选地通过蛋白质印迹中的可视反应来确定特定抗体的存在。

用存在于佐剂中的多肽或者DNA疫苗进行接种后，另一个相关参数是测定动物模型中所诱导的保护。适合的动物模型包括经毒性分枝杆菌的感染激发的灵长类、豚鼠或者鼠。诱导的保护的读数可以是靶器官中相对于未接种动物减少的细菌接种量、相对于未接种动物延长的存活时间和相对于未接种动物减少的重量损失或者病理学情况。

制备方法

通常本发明的融合多肽、编码这种融合多肽的DNA序列可以使用各种各样的方法中的任何一种制备。

融合多肽可以使用编码该多肽的DNA序列进行重组制备，其中DNA序列被插入表达载体中并在适合的宿主中表达。宿主细胞的例子为大肠杆菌。具有少于约100个氨基酸和通常少于50个氨基酸的融合多肽还可以通过本领域技术人员所熟知的技术合成制备，例如市售可供的固相技术，该技术是向生长的氨基酸链上按顺序加入氨基酸。

融合多肽还可以通过加入融合伴侣进行制备，通过该方法可以获得本发明多肽优越的特性。例如，那些在重组制备时能促进多肽输出(export)的、能促进多肽纯化的和提高本发明多肽的免疫原性的融合伴侣均是感兴趣的。本发明特别包括含有融合了两个或更多个基于来源于结核分枝杆菌多肽的免疫原性多肽的融合多肽。

其它能提高产物免疫原性的融合伴侣有细胞因子，例如IFN-γ、IL-2和IL-12。为了促进表达和/或纯化，融合伴侣可以例如，是细菌菌毛蛋白(fimbrialprotein)，例如菌毛组分菌毛素(pilin)和papA；蛋白A；ZZ-肽(ZZ-融合肽由瑞典法玛西亚公司(Pharmacia)销售)；麦芽糖结合蛋白；谷胱甘肽(gluthatione)S-转移酶；(-半乳糖苷酶或聚-组氨酸。融合蛋白可以通过在宿主细胞如大肠杆菌中重组生产，在不同的融合伴侣间形成一个连接区域也是可行的。处于例如单独的免疫原性多肽单元之间的连接区域可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。

感兴趣的融合多肽是被脂化的本发明的多肽，这样使得免疫原性多肽以一种适合的方式存在于免疫系统中。这种效果是从如WO 96/40718 A中所描述的基于包柔氏螺旋体(Borrelia burgdorferi)OspA多肽的疫苗或基于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)OprI脂蛋白的疫苗(Cote-Sierra J，1998)获知的。另一个可能性是在免疫原性多肽N末端融合已知的信号序列和N末端半胱氨酸。当在适合的生产宿主中制备时，这种融合引起免疫原性融合多肽在N-末端半胱氨酸处的脂化。

疫苗

本发明的一个重要方面是关于包含本发明融合多肽的疫苗组合物。为了确保这种疫苗组合物的最佳性能，优选它包含免疫学上和制药学上可接受的载体、赋形物或者佐剂。

相对于未接种疫苗的动物而言，能被动物识别的含有本发明融合多肽的有效疫苗，将使得在毒性分枝杆菌激发的动物模型中减少靶器官内的细菌负荷，延长存活时间和/或减少重量损失或者病理学状况。

适合的载体选自聚合物所组成的组，(多个)多肽经疏水的非共价相互作用结合到该聚合物上，比如塑料，如聚苯乙烯，或(多个)多肽共价结合到该聚合物上，如多糖或者多肽如牛血清清蛋白、卵清蛋白或者匙孔青贝(keyholelimpet)血蓝蛋白。适合的赋形物选自稀释剂和悬浮剂所组成的组中。佐剂优选选自下列所组成的组中：二甲基二十八烷基溴化铵(dimethyloctadecylammonium bromide)(DDA)、二甲基二十八烯基溴化铵(dimethyloctadecenylammonium bromide，DODAC)、Quil A、聚I:C、氢氧化铝、弗氏不完全佐剂、IFN-(、IL-2、IL-12、单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、海藻糖二山嵛酸酯(dibehenate)和胞壁酰二肽(MDP)或者分枝杆菌脂质提取物，尤其是PCT/DK2004/000488中公开的非极性脂质提取物。

包含多肽作为活性成分的疫苗的制备是本领域通常所知晓的，如美国专利US4,608,251、4,601,903、4,599,231和4,599,230中例举的，它们全部被引入本文作为参考。

用于获得疫苗佐剂效果的其它方法包括使用制剂，诸如使用氢氧化铝或者磷酸盐(phosphate)(明矾)，糖的合成聚合物(聚羧乙烯(卡巴浦尔Carbopol))，通过热处理使疫苗中蛋白凝聚，通过对白蛋白的经由胃蛋白酶处理的(Fab)抗体再活化的凝聚，与细菌细胞如微小隐孢子虫(C.parvum)或者内毒素或者革兰氏阴性细菌的脂多糖成分相混合，在生理学上可接受的油类赋形物如二缩甘露醇(mannide)单油酸酯(Aracel A)中进行乳化或者与作为封闭替代物(block substitute)的20％全氟化碳溶液乳化(全氟萘烷和全氟三丙胺混合乳剂(Fluosol-DA))。其它的可能包括使用免疫调节物质如细胞因子或者合成IFN-γ诱导物如聚I:C与上述佐剂结合。

实现佐剂效果的另一种感兴趣的可能是使用Gosselin等1992年描述的技术(将其引入这里作为参考)。简言之，相关抗原诸如本发明的抗原可以与抗单核细胞/巨噬细胞上的Fc-受体的抗体缀合(或抗原结合抗体片段)。

为了改善BCG疫苗，一种或多种相关的抗原如一种或多种本发明的融合多肽可以在给药前与BCG混合，同时与BCG注入以获得一种产生更好保护的协同效应。用于实现协同效应的另一个感兴趣的可能性是保持BCG和本发明融合(多个)多肽的独立但同时使用，在不同的位置或通过不同的途径施用它们。

为了加强当前使用的BCG疫苗，可以在BCG典型地开始减弱乃至减弱以前，例如在BCG接种后的2、5、10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、65或70年的时候，给予相关的抗原诸如一种或多种本发明的融合多肽。其后可以每隔规律的时间间隔给药，如1、2、3、4、5或10年，共至5次。

疫苗以一种与剂量配方相一致的方式施用，施用的量例如将是起到预防或者治疗有效的作用和具有免疫原性。施用的量取决于治疗的受试者如引发免疫应答的个体免疫系统的能力和所需的防护程度。适合的剂量范围具有每一接种疫苗含几百微克本发明融合多肽的数量级，优选从约0.1μg到1000μg的范围，例如在约1μg到300μg的范围，特别是在约10μg到100μg的范围。适合用于初次给药和加强注射的用药法也是可以变化的，但是代表性的是在初次给药后接着进行接种或者其它的给药。

施用的方式可以广泛地变化。任何用于疫苗施用的常规方法均适用。这些包括经口、鼻或者粘膜施用，以含有活性成分的固体形式(例如药丸、栓剂或者胶囊)，或者以存在于生理学上可接受的分散剂中的形式，例如喷雾、粉末或者液体，或者通过肠胃外注射的方式，例如皮下、皮内或肌内或经皮施用。疫苗的剂量取决于给药途径，并根据要预防接种人的年龄和次要程度上要预防接种人的身材大小发生变化。目前，大多数疫苗是由针注射通过肌内注射给药，这很可能继续作为标准给药途径。然而，诱导包括粘膜免疫性的疫苗制剂已经被开发出来，一般通过口或鼻递送。目前最广泛研究的用于诱导粘膜免疫性的递送系统包含霍乱毒素(CT)或它的B亚基。当这种蛋白存在于疫苗制剂中给药时，它增强了粘膜的免疫应答并诱导了IgA的产生。口、鼻疫苗的优点是递送方便。来自于其它微生物菌种的修饰的毒素具有降低的毒性但是保留了免疫刺激的能力，例如修饰的来自革兰氏阴性细菌的不耐热肠毒素或葡萄球菌产生的毒素均可用于产生相似的效果。这些分子特别适于粘膜给药。

疫苗通常经注射例如经皮下或者肌内注射进行肠胃外给药。适合于其它给药方式的其它制剂包括栓剂和某些情况下的口服制剂。对于栓剂而言，传统的粘合剂和载体可以包括例如聚亚烷基二醇或者甘油三酯；这种栓剂可以形成自含有0.5％到10％范围的、优选1-2％范围的活性成分的混合物。口服制剂包括诸如通常使用的赋形剂，例如药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠(sodium saccharine)、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或者粉末的形式，有利的是含有10-95％的活性成分，优选25-70％。

在许多情况下，必须多次施用疫苗。特别地，可以施用这些疫苗以预防毒性分枝杆菌的感染和/或治疗确定的分枝杆菌感染或加强先前接种过BCG的人的情况。当疫苗为预防感染给药时，其是在定义的感染的临床征象或者症状出现之前预防性地给予的。

由于遗传变异，不同的个体可以与相同多肽产生不同强度的免疫应答。因此，本发明的疫苗可以包含几种不同的融合多肽和/或多肽以提高免疫应答。疫苗可包含两种或更多种融合多肽或者饥饿诱导的多肽或者它们的免疫原性部分，其中所有饥饿诱导的抗原或者融合多肽如上定义，或者某些(但并非全部)多肽可来源于毒性分枝杆菌。在后者的实施例中，不一定达到上述融合多肽标准的多肽可能由于它们自身的免疫性而发挥作用或者仅仅充当佐剂。

疫苗可包含1-20、如2-20或乃至3-20种不同的多肽或者融合多肽，诸如3-10种不同的多肽或者融合多肽。

本发明还涉及免疫动物包括人以抵抗由毒性分枝杆菌引起的TB的方法，所述方法包括给予动物本发明的融合多肽，或者如上所述的本发明的疫苗组合物，或者上面描述的活疫苗。在目前优选的一个实施方式中，动物或者人是如上定义的免疫个体。

本发明还涉及用于制备本发明的免疫原性组合物的方法，所述方法包括制备、合成或者分离本发明的融合多肽和使该融合多肽溶解或分散在用于疫苗的介质中，并任选地加入其它的结核分枝杆菌抗原和/或载体、赋形物和/或佐剂物质。

本发明的核酸片段可用于完成免疫原性多肽的体内表达，即该核酸片段可用在所谓的DNA疫苗中，如Ulmer等1993年所评述的，其被引入作为参考。

在构建和制备限定用于DNA接种疫苗的编码融合多肽的质粒DNA中，可以使用宿主菌株如大肠杆菌。然后过夜培养携带该感兴趣质粒的宿主菌株，利用如Qiagen Giga-Plasmid column试剂盒(Qiagen、Santa Clarita，CA，美国)包括内毒素去除步骤纯化制备得到质粒DNA。用作DNA接种疫苗的质粒DNA必需不含内毒素。

因此，本发明还涉及包含本发明的核酸片段的疫苗，该疫苗引起动物包括人体内免疫原性多肽的表达，在施用了疫苗后，表达的多肽的数量有效地将实质上增强的抗性赋予动物包括人，增强了它们对毒性分枝杆菌所导致的结核病的抗性。

通过联合使用编码表达产物的基因与编码具有调节免疫应答能力的多肽的DNA片段，这种DNA疫苗的效力可以得到加强。

实现用于有效激活细胞的免疫应答的一种可能性可以通过在非病原的微生物或者病毒中表达相关的免疫原性多肽。这种微生物的最著名实例是牛结核杆菌BCG、沙门氏菌和假单胞菌，病毒的例子是牛痘病毒和腺病毒。因此，本发明另一个重要的方面是对目前可用的活的BCG疫苗进行加强，其中通过特定方式将一个或多个拷贝的编码一种或多种如上定义的融合多肽的DNA序列引入微生物的基因组中，所述特定方式使微生物得以表达和分泌所述融合多肽。预期超过一个拷贝的本发明的核酸序列的引入增强了免疫应答。

另一个可能性是将编码根据本发明的融合多肽的DNA整合入减毒病毒如牛痘病毒或者腺病毒中(Rolph等，1997)。重组牛痘病毒可以进入受感染宿主细胞的细胞质或者细胞核内，预期由此感兴趣的融合多肽可以诱导抗TB的保护性免疫应答。

本发明还涉及本发明的融合多肽或者核酸用作治疗疫苗的用途，如同D.Lowry已经在文献中举例描述的(Lowry等，1999)。具有治疗性质的抗原在用作疫苗时，可以通过基于它们减少实验动物中结核分枝杆菌感染的严重程度或者预防先前感染的再活化的能力进行鉴定。被用作治疗疫苗的所述组合物可以通过如上所述方法制备用于疫苗。

附图说明

图1：来自于乌干达的HIV-阴性(TB+/HIV-)和HIV-阳性(TB+/HIV+)TB患者及来自丹麦的健康对照(对照组)对Rv2660c的抗体反应。切割线(cut-off)基于97％特异性水平的ROC曲线分析。观察到的敏感性显示在数据的图示上方；

图2：Rv2659c的免疫原性

用含Rv2659c的DDA/MPL以两周的间隔对多组F1(Balb/cxC57BL/6)小鼠进行皮下接种三次。最后接种后的一周，被5μg/ml Rv2659c刺激后的PBMCs的INF-γ分泌通过ELISA分析；

图3：Rv2659c诱导抗结核分枝杆菌感染的保护

用Rv2659c对多组Balb/c-C57BL/6小鼠以两周的间隔进行皮下接种共三次，接种后12周，通过对比未免疫的和BCG免疫的小鼠肺中CFU计数的减少来评定保护效力。结果被表示为肺中log₁₀菌落形成单位(CFU)和每一实验组6只小鼠的平均值；

图4：Rv2660c的免疫原性

用含重组Rv2660c蛋白的DDA/MPL对F1(Balb/cxC57BL/6)小鼠进行皮下接种三次，接种间隔为两周。(A)在最后接种后的一周，通过ELISA对0.2、1或5μg/ml的Rv2660c进行刺激后的PBMCs的IFN-γ分泌进行分析。最后接种后的三周，通过ELISA对用0.2、1或5μg/ml的重组Rv2660c刺激后的脾细胞(B)的INF-γ分泌进行分析，经0.2、1或5μg/ml的重组Rv2660c刺激后的外周血单核细胞(PBMCs)(C)被用于增殖反应研究；

图5：由Rv2660c诱导的抗结核分枝杆菌感染的保护

用Rv2660c以两周的间隔对多组Balb/c-C57BL/6小鼠进行皮下接种三次，在气雾剂传染6周后，通过肺中的CFU计数以及与未免疫的和BCG免疫的鼠相比较从而评定保护效力。结果被表示为肺中log₁₀菌落形成单位(CFU)和每一实验组6只鼠的平均值。同时将单一剂量的卡介苗Danish 1331(5×10⁴杆菌/小鼠)作为第一个亚单位疫苗皮下(s.c.)注入尾根(the base of the tail)作为阳性对照，没有给予加强注射；

图6：Hybrid56、HyVac21和HyVac28的免疫原性

用含5微克Ag85b-ESAT6-Rv2660c(H56)、Ag85a-TB10.4-Rv2660c(H21)或者Ag85b-TB10.4-Rv2660c(H28)的DDA/TDB(LipoVac)每隔两周对多组F1(Balb/cxC57BL/6)鼠进行皮下接种共三次。最后接种后一周，在用1μg/ml的用于免疫的融合蛋白Ag85b、TB10.4或Rv2660c刺激后，通过ELISA分析PBMCs的IFN-γ释放(图6A-C)。

用Ag85b-ESAT6-Rv2660c最后接种后的三周，通过ELISA分析脾细胞(D)在用0.2、1或者5μg/ml的重组Ag85B、ESAT6或者Rv2660c刺激后的INF-γ分泌，PBMCs(E)被用于分析抗1μg/ml相同抗原的增殖反应；

图7：用Hybrid56免疫后抗结核分枝杆菌感染的强烈保护

(A)用Ag85B-ESAT6-Rv2660c(杂交56(Hybrid56))以两周的间隔对多组Balb/c-C57BL/6鼠进行皮下接种共三次，在气雾剂感染2、6、12和24周后，通过比较未免疫的和BCG免疫的鼠的肺中的CFU计数来评定保护效力。(B)用Ag85b-ESAT6(Hybridl)或Ag85b-ESAT6-Rv2031c(Hybrid32)以两周的间隔对多组B6小鼠进行皮下接种共三次，气雾剂感染后7、13、24、35和44周，通过比较未免疫的和BCG免疫的鼠肺中CFU计数来评定保护效力。结果被表示为肺中log₁₀菌落形成单位(CFU)和每一实验组6只鼠的平均值。同时将单一剂量的卡介苗Danish 1331(5×10⁴杆菌/鼠)作为第一亚单位疫苗皮下(s.c.)注入尾根作为阳性对照，没有给予加强注射；

图8：Kaplan-Meier生存曲线(n＝7)在低剂量的结核分枝杆菌气雾剂激发后，用Ag85b-ESAT6-Rv2660c融合蛋白对豚鼠进行的免疫延长了其存活时间，使之达到了BCG免疫动物的水平；

图9：Hybrid56(Ag85b-ESAT6-Rv2660c)诱导的免疫性和保护

用含重组Ag85b-ESAT6-Rv2660c(hybrid56)的DDA/MPL对F1(Balb/cxC57BL/6)小鼠进行皮下接种三次，接种间隔时间为两周。最后接种后十周，通过ELISA分析用0.2、1或5μg/ml的Ag85b、ESAT6或Rv2660c刺激的脾细胞的IFN-γ分泌(如图9A中所示)。接种后十周，通过相对于佐剂对照的免疫小鼠的肺中CFU计数的减少评定保护效力。结果被表示为每一实验组12只鼠肺中log₁₀菌落形成单位(CFU)(图9B)。

实施例

材料和方法

动物

雌性的没有特定病原体的C57BL/6xBalb/C F1或C57BL/6小鼠，8至16周龄，获自丹麦的Bomholtegaard，被用于免疫应答的分析和保护的研究，通过CFU分析评定保护。感染研究是在国家血清研究所(Statens Serum Institute)的BSL3设备中进行的。动物被饲养在隔离的笼子里，供给水和任意的无菌食品。在开始实验前给予所有动物1周的休息期(rest period)。

重组的抗原制剂重组的Ag85B-ESAT6(Hybrid1)按照先前描述的方法(Olsen，van Pinxteren等，2001)制备。简要地，His标签蛋白在大肠杆菌XL-1Blue中表达，并在Talon柱纯化后用HiTrap Q柱(法玛西亚(Pharmacia)，乌普萨拉(Uppsala)，瑞典)进行蛋白质阴离子交换层析。在稀释和存储之前，用25mMHEPES缓冲液(pH8.0)-0.15M NaCl-10％甘油-0.01％吐温20透析样品。

通过先前描述的用于其它小的分枝杆菌蛋白的相同的方法(Skjot，Oettinger等，2000)制备重组Rv2660c。简要地，全长的Rv2660c基因从结核分枝杆菌基因组DNA经PCR扩增得到，并将全长的Rv2660c基因亚克隆进表达质粒pDestl7。所述重组蛋白是在大肠杆菌Bl21 blue中生产的，基本上按照先前描述的(Theisen，Vuust等，1995)但使用包含8M尿素的磷酸盐缓冲液，在Ni+柱上通过金属离子亲和色谱的方法进行纯化，纯化后移走重组蛋白。

根据说明书，通过点特异性重组，将Hybrid56(Ag85B-ESAT6-Rv2660c)、Hybrid32(Ag85b-ESAT6-Rv2031c)、HyVac21(Ag85a-TB10.4-Rv2660c)和HyVac28(Ag85b-TB10.4-Rv2660c)融合蛋白克隆进表达载体pDestl7(Invitrogen)中。

在用IPTG诱导后，融合蛋白在大肠杆菌菌株BL21中表达。经温和去污剂(B-PER，西格玛(Sigma))裂解和超声处理后，收集所有四种融合蛋白的包涵体。将洗涤的包涵体溶于pH 4.9的20mM NaOAc+8M尿素中并通过Q琼脂糖凝胶(sepharose)柱以捕获内毒素。收集的流液在Bis-tris缓冲液+8M尿素pH 6.5中稀释，调节pH至6.5。所述蛋白然后通过CM sepharose以捕获杂质，之后在Q sepharose柱上收集蛋白。用bis-tris缓冲液(pH 6.5)+3M尿素洗涤柱子。用NaCl洗脱结合的蛋白。然后过葡聚糖凝胶(Sephadex)柱，缓冲液改用25mM pH8的tris-HCl和10％甘油。

人类识别-血清学

在用于ELISA前，通过添加20μl的大肠杆菌提取物(S3761，Promega，麦迪逊(Madison)，WI)至200μl的血清样品中并接着在室温下混合温育4个小时，全部血清被可交叉反应的抗体被耗尽。离心(10.000xg，10分钟)后，在上清液中加入0.05％叠氮化钠。所述ELISA按照下述进行，96孔Maxisorp(Nunc，Roskilde，丹麦)微量滴定板用1.0μg/ml(100μl每孔)含抗原的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)4℃包被过夜。然后用含0.05％Tween20的PBS(PBS-T)洗涤板3次。以1∶100用含0.2％吐温20和1.0％(wt/vol)牛血清白蛋白的PBS(稀释缓冲液)稀释血清样品，0.1ml的稀释血清添加到成对孔中，一式两份，在室温下温育一个小时。用PBS-T洗涤3x后，在板中加入100μl以1∶8000被稀释缓冲液稀释的过氧化物酶结合的兔抗人Ig(P212，DAKO，Glostrup，丹麦)，温育1个小时。板用PBS-T洗涤3次，与N-四甲基联苯底物(TMB plus，Kem-En-Tec，^***，丹麦)温育30分钟，通过加入1M H₂SO₄终止反应。然后测定405nm处的光密度(OD₄₀₅)。

疫苗制备和免疫步骤

用5微克重组疫苗(Rv2659c、Rv2660c、Hybrid56、HyVac21、HyVac28或Hybrid32)免疫小鼠，重组疫苗是以25μg单磷酰基脂质A(MPL，Corixa，WA，美国)进行递送的，后者在双二十八烷基溴化铵(dioctadecylammoniumbromide)(DDA，250μg/剂量，Eastman Kodak，Inc.，Rochester，N.Y.)中被乳化至总体积200μl，如最近所描述的(Olsen，van Pinxteren等，2001)那样。每隔两周在背部皮下(s.c.)注射所述疫苗(0.2ml/鼠)三次。同时将单一剂量的卡介苗Danish 1331(5×10⁴杆菌/小鼠)作为第一亚单位疫苗皮下(s.c.)注入尾根，没有给予加强注射。预先激发的免疫性通过首次接种后5和7周的血液淋巴细胞和首次接种后的7周的脾细胞进行评定。

试验性的感染和器官中的细菌计数

为了评估保护的水平，在首次免疫后10周激发小鼠，或者采用校准的Glas-Col吸入接触系统通过气雾剂方式，向每个肺递送大约100CFU的结核分枝杆菌Erdman。在2、6、12或24周后(Hybrid56)或7、13、24、35或44周后(Hybrid32)处死小鼠，肺和脾被摘下用于细菌计数。所述器官被均匀地分散在消毒盐水中，系列稀释物被铺于补充有每毫升2mg的2-噻吩-羧酸酰肼的Middlebrook 7H11琼脂上，以选择性地抑制测试器官中残留BCG的生长。在37℃下温育2至3周后对菌落进行计数。

淋巴细胞培养

器官通过离析透过细孔不锈钢滤网进入完全RPMI(GIBCO，Grand Island，NY，含2mM谷氨酰胺，100U/ml青霉素6-钾和100U/ml硫酸链霉素，10％FCS和50mM 2-ME)被均质化。血液淋巴细胞在密度梯度的lympholyte(Cedarlane，Hornby，安大略省(Ontario)，加拿大)上纯化。合并每一组五只小鼠的细胞并以一式三份培养在圆底微量滴定孔(96孔，Nunc，Roskilde，丹麦)中，每个孔含有体积200μl的RPMI 1640培养基，该培养基中含有2×10⁵个细胞，补充有5×10^-5M 2-巯基乙醇、1mM谷氨酰胺、青霉素-链霉素5％(体积/体积)的胎牛血清。所述分枝杆菌抗原的使用浓度范围从5到0.2mg/ml。培养物在37℃、10％CO₂中温育3天，然后移出100μl的上清液用于测定γ干扰素(IFN-γ通过下述的酶联免疫吸附检测(ELISA)。

用于IFN-γ的酶联免疫吸附测定(ELISA)

根据制造商的说明书(Mabtech，AB.Sweden)，利用用于IFN-γ测定的商业试剂盒，双三明治(double sandwich)ELISA方法被用于对培养上清液的双份滴定液中IFN-γ的水平进行定量。样品中IFN-γ的浓度使用产生自重组IFN-γ(Life Technologies)的标准曲线进行计算，结果用pg/ml表示。在重复孔之间的差异一致地小于所述平均值的10％。

在豚鼠模型中的试验性的感染和疫苗的效力评定

购买自Charles River实验室(North Wilmington，Mass.)的远系繁殖的雌性Hartley豚鼠或者被皮内给予10³CFU剂量的BCG一次，或者被给予含20μg的在DDA/MPL中乳化的Ag85b-ESAT6或者Ag85b-ESAT6-Rv2660c三次，该三次免疫间隔为3周。第三次免疫后的六周，使用校准的装置(Glas-Col，TerreHaute，Ind.)递送大约20个杆菌进入每一只豚鼠的肺中给予气雾剂MTB激发。通过观察动物每日基础上食物消耗方面的改变、呼吸困难的证据和行为变化来确定被感染豚鼠的存活时间。另外，以每周为基础对动物进行称重，直到超过几天观察到了表明疾病的体重的持续下降。

实施例1

对饥饿诱导抗原的人类识别

在WHO结核样本库(Tuberculosis Specimen Bank)提供的一组来自乌干达(Uganda)的肺TB患者中，评定Rv2660c的人类识别情况。其中包括具有阴性和阳性HIV感染特征的患者(分别地，N＝94和N＝73)。对照组由一百个健康的在丹麦居住的供体组成，估计的BCG覆盖范围大于90％。

微量滴定板包被有1.0μg/ml(每孔100μl)的Rv2660c蛋白并与100x稀释的血清样品温育，使用过氧化物酶结合的兔抗人Ig和四甲基联苯作为底物显色(结果在图1中示出)。

结论

在该研究中，饥饿诱导蛋白的识别被测试。基于从对照组以97％的灵敏度确定的切割线(cutoff)，有可能证实45％的HIV-病例和61％的HIV+病例中的TB感染。实验清楚地显示了在MTB感染期间，RV2660c蛋白被表达并被免疫系统识别。

实施例2

通过接触后(post-exposure)给予饥饿诱导的抗原(Rv2659c)的免疫原性和再活化的预防

小鼠被结核分枝杆菌感染并通过抗菌素处理以减少细菌负荷(burden)，并进入具有细菌负荷接近于检测水平的潜伏感染阶段。在感染的潜伏期，每隔两周给小鼠接种含Rv2659c的佐剂(如DDA/MPL)共三次。最后接种后的一周，通过ELISA分析血细胞用Rv2659c刺激后的INF-γ分泌(图2)。

饥饿诱导的蛋白Rv2659c诱导抗结核分枝杆菌再活化的保护的能力

多组有潜伏的结核分枝杆菌的小鼠被每隔两周用配制在佐剂(如DDA/MPL)中的Rv2659c进行皮下接种共三次，根据相对于未接种的(潜伏感染的)小鼠、肺和脾中菌落形成单位(CFU)的减少来评定保护效力。抗再活化的保护在接种疫苗后三个月进行评定。相对于再活化的未免疫潜伏感染的小鼠(图3)，Rv2659c诱导肺部细菌水平减少3到90倍。为了评价Rv2659c接种对潜伏感染小鼠有可能发生的病理的影响，从潜伏感染的接种过的小鼠中取出肺组织用于组织病理学检测。在损伤处没有检测到明显的干酪样坏死、纤维化或者矿化作用，也没有发现增加的炎症细胞的浸润。

结论

在该研究中，测试了饥饿诱导的蛋白Rv2659c作为治疗疫苗的潜力。当含Rv2659c蛋白的佐剂组合二甲基双二十八烷基溴化铵-单磷酰脂质A给予小鼠时，诱导/加强了强的免疫应答。免疫作用导致肺中细菌负荷减少0.5-1.0log。由此，我们的研究表明了接触后接种疫苗减少或者延迟了结核分枝杆菌的再活化且没有引发肺部的免疫病理学症状。

实施例3

由饥饿诱导的抗原Rv2660c诱导的抗气雾剂结核分枝杆菌感染的免疫原性和保护性

每隔两周给小鼠接种含Rv2660c的佐剂(如DDA/MPL)共三次。最后接种后的一周，通过ELISA分析用Rv2660c刺激血细胞后的INF-γ分泌(图4A)。最后接种后的三周，脾细胞被用于测定被Rv2660c刺激后的IFN-γ分泌(图4B)，血细胞则用于测定抗原特异性的增殖反应(图4C)。

多组被每隔两周用配制在佐剂(如DDA/MPL)中的Rv2659c进行皮下接种三次的小鼠，被用含结核分枝杆菌的气雾剂感染激发，其保护效力是通过分离自肺的相对于未接种小鼠的菌落形成单位(CFU)的减少来评定的。接种疫苗后12周评定保护。相对于未免疫受感染的小鼠，Rv2660c诱导肺部细菌水平减少大约0.5log(10)(图5)。

结论

在该研究中，饥饿诱导的蛋白Rv2660c作为疫苗抗原的潜力被测试。当含Rv2660c蛋白的佐剂组合二甲基双二十八烷基溴化铵-单磷酰脂质A给予小鼠时，其诱导了强的免疫应答。免疫导致肺中细菌负荷减少约0.5log(10)。

实施例4

饥饿诱导的抗原融合形成预防性疫苗(多期疫苗)

用三种融合蛋白免疫后的免疫应答

每隔两周用含融合多肽Hybrid56、HyVac21或者HyVac28的佐剂(如DDA/MPL)对多组小鼠进行皮下接种两次。最后接种后一周，分析血细胞经1μg/ml融合蛋白或融合蛋白中的单一组分刺激后的IFN-γ分泌(图6A-C)。在用Hybrid56最后接种后三周，脾细胞在用0.2、1或者5μg/ml的所述融合蛋白的单一组分刺激后，通过ELISA测定IFN-γ分泌(如图6D)。在最后接种后的三周对血细胞中抗原特异性的增殖反应进行测定(图6E)。

三种融合多肽在小鼠中诱导抗结核分枝杆菌感染的能力

多组小鼠被每隔两周用配制在佐剂(如DDA/MPL)中的Hybrid1、Hybrid56和Hybrid32进行皮下接种三次，在气雾剂感染后，通过相对于天然(未接种的)小鼠的肺和脾中菌落形成单位(CFU)的减少来评定保护效力。同时将单一剂量的卡介苗Danish 1331(5×10⁴杆菌/小鼠)被作为第一亚单位疫苗皮下(s.c.)注入尾根，作为用于保护研究的阳性对照(图7A和图7B)。

豚鼠中多肽Hybrid56(Ag85b-ESAT6-Rv2660c)抗气雾剂结核分枝杆菌的保护能力

用含融合多肽的佐剂(如DDA/MPL)每隔两周对多组豚鼠进行皮下接种三次，以每周为基础对每只动物进行称重来初步评定保护效力。同时将单一剂量的卡介苗Danish 1331(5×10⁴杆菌/小鼠)被作为第一亚单位疫苗皮内(i.d.)注射，作为用于保护研究的阳性对照。结果为图8所示的存活曲线。

结论

在该研究中，三种融合蛋白(Hybrid56、HyVac21和HyVac28)的免疫潜力得到研究。当含融合蛋白的佐剂组合二甲基双二十八烷基溴化铵-单磷酰酯质A给予小鼠时，三种单一蛋白组分均诱导了强的剂量依赖性免疫应答，表明它们作为多期疫苗的潜力。作为例子选择的Hybrid56诱导的免疫应答伴随着高水平的保护性免疫，这种保护性免疫随时间不断增强，达到的水平明显在用牛结核杆菌BCG这种标准的MTB疫苗接种所能达到的保护水平之上。而且，相似的取代Rv2660c的含有标准MTB潜在抗原Rv2031c(Ag85b-ESAT6-Rv2031c)的三单元(triple)融合蛋白，其并没有显示随时间而改善的保护。最后，对Hybrid56的高水平的保护在更易感的(succeptibel)的豚鼠模型中得到了加强。

实施例5

融合的饥饿诱导抗原的活性和接触后(治疗性地)施用的预防性疫苗(多期疫苗)

小鼠被结核分枝杆菌感染并通过抗菌素处理以减少细菌负荷，并进入低细菌负荷的潜伏感染阶段。在感染的潜伏阶段，每隔两周给小鼠接种含融合多肽的佐剂(如DDA/MPL)共三次。最后接种后十五周，通过ELISA测定血细胞经0.2、1或者5μg/ml所述融合蛋白的单一组分刺激后的IFN-γ分泌(图9A)。

融合多肽诱导抗结核分枝杆菌再活化的保护能力

多组有潜伏的结核分枝杆菌的小鼠被每隔两周用制备在佐剂(如DDA/MPL)中的融合多肽进行皮下接种共三次，根据相对于未接种的(潜伏感染的)小鼠的肺中菌落形成单位(CFU)的减少来评定保护效力。抗再活化的保护在接种疫苗后三个月评定。融合多肽诱导了明显减少的再活化，使得肺部细菌水平相对于再活化的未免疫的潜伏感染小鼠减少了(图9B)。

结论

在该研究中，基于抗原Rv2660c、ESAT6(Rv3875)和抗原85B(Rv1886c)的融合蛋白的结核病亚单位疫苗作为治疗疫苗的潜力得到研究。当含融合蛋白的佐剂组合二甲基双二十八烷基溴化铵-单磷酰脂质A给予小鼠时，诱导/加强了强的免疫应答。在再活化的潜伏感染期，免疫作用导致了肺中细菌负荷的减少。因此我们的研究表明接触后用融合的饥饿诱导的抗原接种免疫，这种预防性疫苗(多期疫苗)减少或者延迟了结核分枝杆菌的再活化。

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序列表

<110>国家血清研究中心

<120>包含潜伏感染阶段期间所表达的抗原的结核疫苗

<130>PIDK0712372

<160>18

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>960

<212>DNA

<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400>1

atggctgaca tcccctacgg ccgtgactat cccgacccga tctggtgtga cgaggacggc   60

cagccgatgc cgccggtcgg cgccgaattg ctcgacgaca ttagggcatt cttgcggcgg  120

ttcgtagtct atccaagcga ccatgaactg atcgcgcaca ccctctggat tgcgcattgc  180

tggtttatgg aggcgtggga ctcaacgccc cgaatcgctt ttttgtcacc ggaacccggc  240

tctggcaaga gccgcgcact cgaagtcacg gaaccgctag tgccccggcc ggtgcatgcc  300

atcaactgca caccggccta cctgttccgt cgggtggccg atccggtcgg gcggccgacc  360

gtcctgtacg acgagtgtga caccctgttt ggcccgaaag ctaaagaaca cgaggaaatt  420

cgcggcgtga tcaacgccgg ccaccgcaag ggagccgtcg cgggccgctg cgtcatccgc  480

ggcaagatcg ttgagaccga ggaactgcca gcgtactgtg cggtcgcctt ggccggcctc  540

gacgacctgc ccgacaccat catgtctcgg tcgatcgtgg tgaggatgcg caggagggca  600

ccaaccgaac ccgtggagcc gtggcgcccc cgcgtcaacg gccccgaggc cgagaagctg  660

cacgaccggt tggcgaactg ggcggccgcc attaacccgc tggaaagcgg ttggccggcg    720

atgccggacg gggtgaccga ccggcgcgcc gacgtctggg agtccctggt tgcggttgct    780

gacaccgcgg gcgggcactg gcccaaaacc gcccgtgcaa ccgcagaaac ggatgcaacc    840

gcaaatcgag gagccaagcc cagcataggc gtgctgctgc tgcgggatat ccgtcgagtc    900

ttcagcgacc gggaccggat gcgcaccagc gacatcctga ccggactgaa ccggatggag    960

<210>2

<211>475

<212>PRT

<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400>2

Met Ala Asp Ile Pro Tyr Gly Arg Asp Tyr Pro Asp Pro Ile Trp Cys

1               5                   10                  15

Asp Glu Asp Gly Gln Pro Met Pro Pro Val Gly Ala Glu Leu Leu Asp

            20                  25                  30

Asp Ile Arg Ala Phe Leu Arg Arg Phe Val Val Tyr Pro Ser Asp His

        35                  40                  45

Glu Leu Ile Ala His Thr Leu Trp Ile Ala His Cys Trp Phe Met Glu

    50                  55                  60

Ala Trp Asp Ser Thr Pro Arg Ile Ala Phe Leu Ser Pro Glu Pro Gly

65                  70                  75                  80

Ser Gly Lys Ser Arg Ala Leu Glu Val Thr Glu Pro Leu Val Pro Arg

                85                  90                  95

Pro Val His Ala Ile Asn Cys Thr Pro Ala Tyr Leu Phe Arg Arg Val

            100                 105                 110

Ala Asp Pro Val Gly Arg Pro Thr Val Leu Tyr Asp Glu Cys Asp Thr

        115                 120                 125

Leu Phe Gly Pro Lys Ala Lys Glu His Glu Glu Ile Arg Gly Val Ile

    130                 135                 140

Asn Ala Gly His Arg Lys Gly Ala Val Ala Gly Arg Cys Val Ile Arg

145                 150                 155                 160

Gly Lys Ile Val Glu Thr Glu Glu Leu Pro Ala Tyr Cys Ala Val Ala

                165                 170                 175

Leu Ala Gly Leu Asp Asp Leu Pro Asp Thr Ile Met Ser Arg Ser Ile

            180                 185                 190

Val Val Arg Met Arg Arg Arg Ala Pro Thr Glu Pro Val Glu Pro Trp

        195                 200                 205

Arg Pro Arg Val Asn Gly Pro Glu Ala Glu Lys Leu His Asp Arg Leu

    210                 215                 220

Ala Asn Trp Ala Ala Ala Ile Asn Pro Leu Glu Ser Gly Trp Pro Ala

225                 230                 235                 240

Met Pro Asp Gly Val Thr Asp Arg Arg Ala Asp Val Trp Glu Ser Leu

                245                 250                 255

Val Ala Val Ala Asp Thr Ala Gly Gly His Trp Pro Lys Thr Ala Arg

            260                 265                 270

Ala Thr Ala Glu Thr Asp Ala Thr Ala Asn Arg Gly Ala Lys Pro Ser

        275                 280                 285

Ile Gly Val Leu Leu Leu Arg Asp Ile Arg Arg Val Phe Ser Asp Arg

    290                 295                 300

Asp Arg Met Arg Thr Ser Asp Ile Leu Thr Gly Leu Asn Arg Met Glu

305                 310                 315                 320

Glu Gly Pro Trp Gly Ser Ile Arg Arg Gly Asp Pro Leu Asp Ala Arg

                325                 330                 335

Gly Leu Ala Thr Arg Leu Gly Arg Tyr Gly Ile Gly Pro Lys Phe Gln

            340                 345                 350

His Ser Gly Gly Glu Pro Pro Tyr Lys Gly Tyr Ser Arg Thr Gln Phe

        355                 360                 365

Glu Asp Ala Trp Ser Arg Tyr Leu Ser Ala Asp Asp Glu Thr Pro Glu

    370                 375                 380

Glu Arg Asp Leu Ser Val Ser Ala Val Ser Ala Val Ser Pro Pro Val

385                 390                 395                 400

Gly Asp Pro Gly Asp Ala Thr Gly Ala Thr Asp Ala Thr Asp Leu Pro

                405                 410                 415

Glu Ala Gly Asp Leu Pro Tyr Glu Pro Pro Ala Pro Asn Gly His Pro

            420                 425                 430

Asn Gly Asp Ala Pro Leu Cys Ser Gly Pro Gly Cys Pro Asn Lys Leu

        435                 440                 445

Leu Ser Thr Glu Ala Lys Ala Ala Gly Lys Cys Arg Pro Cys Arg Gly

    450                 455                 460

Arg Ala Ala Ala Ser Ala Arg Asp Gly Ala Arg

465                 470                 475

<210>3

<211>393

<212>DNA

<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400>3

atgaccgccg tcggcgggtc gccgccgacg cgacgatgcc cggccacaga ggaccgggca   60

cccgcgacag tcgccacacc gtctagcacc gatcctaccg cgtcccgcgc cgtgtcgtgg  120

tggtcggtgc acgagtatgt cgcaccgacc ctggccgccg ccgtggaatg gccgatggcc  180

ggcaccccgg cgtggtgcga cctcgacgac accgacccgg tcaaatgggc cgcgatctgc  240

gacgctgctc ggcattgggc actccgggtg gagacgtgcc aggccgcgtc ggccgaggca  300

tcacgtgacg tatccgccgc cgccgactgg ccggcggtct ctcgggagat ccagcgtcgg  360

cgtgacgcct acattcggcg ggtggtggtc tga                               393

<210>4

<211>130

<212>PRT

<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400>4

Met Thr Ala Val Gly Gly Ser Pro Pro Thr Arg Arg Cys Pro Ala Thr

1               5                   10                  15

Glu Asp Arg Ala Pro Ala Thr Val Ala Thr Pro Ser Ser Thr Asp Pro

            20                  25                  30

Thr Ala Ser Arg Ala Val Ser Trp Trp Ser Val His Glu Tyr Val Ala

        35                  40                  45

Pro Thr Leu Ala Ala Ala Val Glu Trp Pro Met Ala Gly Thr Pro Ala

    50                  55                  60

Trp Cys Asp Leu Asp Asp Thr Asp Pro Val Lys Trp Ala Ala Ile Cys

65                  70                  75                  80

Asp Ala Ala Arg His Trp Ala Leu Arg Val Glu Thr Cys Gln Ala Ala

                85                  90                  95

Ser Ala Glu Ala Ser Arg Asp Val Ser Ala Ala Ala Asp Trp Pro Ala

            100                 105                 110

Val Ser Arg Glu Ile Gln Arg Arg Arg Asp Ala Tyr Ile Arg Arg Val

        115                 120                 125

Val Val

    130

<210>5

<211>261

<212>DNA

<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400>5

atgtgcgcgt tcccgtcgcc gagtctcggg tggacggtct ctcacgagac cgaaaggccc     60

ggcatggcag acgctccccc gttgtcacgg cggtacatca cgatcagtga ggccgccgaa    120

tatctagcgg tcaccgaccg cacggtccgc cagatgatcg ccgacggccg cctacgcgga    180

taccgctccg gcacccgcct cgtccgtctg cgccgcgatg aggtcgacgg cgccatgcac    240

ccgttcggtg gtgccgcatg a                                              261

<210>6

<211>86

<212>PRT

<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400>6

Met Cys Ala Phe Pro Ser Pro Ser Leu Gly Trp Thr Val Ser His Glu

1               5                   10                  15

Thr Glu Arg Pro Gly Met Ala Asp Ala Pro Pro Leu Ser Arg Arg Tyr

            20                  25                  30

Ile Thr Ile Ser Glu Ala Ala Glu Tyr Leu Ala Val Thr Asp Arg Thr

        35                  40                  45

Val Arg Gln Met Ile Ala Asp Gly Arg Leu Arg Gly Tyr Arg Ser Gly

    50                  55                  60

Thr Arg Leu Val Arg Leu Arg Arg Asp Glu Val Asp Gly Ala Met His

65                  70                  75                  80

Pro Phe Gly Gly Ala Ala

                85

<210>7

<211>363

<212>DNA

<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

atggccgatg cggttaagta cgtagttatg tgcaactgcg acgacgaacc gggagcgctc     60

atcatcgcct ggatcgacga cgaacgaccc gccggcgggc acatacagat gcggtcgaac    120

acccgcttca ccgaaacaca gtggggccgc catatcgagt ggaaactcga atgccgggca    180

tgccgaaagt atgcgccgat atccgagatg accgccgcgg cgatcctcga cggtttcggg    240

gcgaagcttc acgagctgag aacgtcgacc atccccgacg ctgacgatcc atcaatagca    300

gaggcgcgac acgtaattcc gttcagcgca ttatgcttgc gcttgagcca gctaggcggg    360

taa                                                                  363

<210>8

<211>120

<212>PRT

<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400>8

Met Ala Asp Ala Val Lys Tyr Val Val Met Cys Asn Cys Asp Asp Glu

1               5                   10                  15

Pro Gly Ala Leu Ile Ile Ala Trp Ile Asp Asp Glu Arg Pro Ala Gly

            20                  25                  30

Gly His Ile Gln Met Arg Ser Asn Thr Arg Phe Thr Glu Thr Gln Trp

        35                  40                  45

Gly Arg His Ile Glu Trp Lys Leu Glu Cys Arg Ala Cys Arg Lys Tyr

    50                  55                  60

Ala Pro Ile Ser Glu Met Thr Ala Ala Ala Ile Leu Asp Gly Phe Gly

65                  70                  75                  80

Ala Lys Leu His Glu Leu Arg Thr Ser Thr Ile Pro Asp Ala Asp Asp

                85                  90                  95

Pro Ser Ile Ala Glu Ala Arg His Val Ile Pro Phe Ser Ala Leu Cys

            100                 105                 110

Leu Arg Leu Ser Gln Leu Gly Gly

        115                 120

<210>9

<211>1128

<212>DNA

<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400>9

gtgacgcaaa ccggcaagcg tcagagacgc aaattcggtc gcatccgaca gttcaactcc     60

ggccgctggc aagccagcta caccggcccc gacggccgcg tgtacatcgc ccccaaaacc    120

ttcaacgcca agatcgacgc cgaagcatgg ctcaccgacc gccgccgcga aatcgaccga    180

caactatggt ccccggcatc gggtcaggaa gaccgccccg gagccccatt cggtgagtac    240

gccgaaggat ggctgaagca gcgtggaatc aaggaccgca cccgcgccca ctatcgcaaa    300

ctgctggaca accacatcct ggccaccttc gctgacaccg acctacgcga catcaccccg    360

gccgccgtgc gccgctggta cgccaccacc gccgtgggca caccgaccat gcgggcacac    420

tcctacagct tgctgcgcgc aatcatgcag accgccttgg ccgacgacct gatcgactcc    480

aacccctgcc gcatctcagg cgcgtccacc gcccgccgcg tccacaagat caggcccgcc    540

accctcgacg agctggaaac catcaccaaa gccatgcccg acccctacca ggcgttcgtg    600

ctgatggcgg catggctggc catgcgctac ggcgagctga ccgaattacg ccgcaaagac    660

atcgacctgc acggcgaggt tgcgcgggtg cggcgggctg tcgttcgggt gggcgaaggc    720

ttcaaggtga cgacaccgaa aagcgatgcg ggagtgcgcg acataagtat cccgccacat    780

ctgatacccg ccatcgaaga ccaccttcac aaacacgtca accccggccg ggagtccctg    840

ctgttcccat cggtcaacga ccccaaccgt cacctagcac cctcggcgct gtaccgcatg    900

ttctacaagg cccgaaaagc cgccggccga ccagacttac gggtgcacga ccttcgacac    960

tccggcgccg tgttggctgc atccaccggc gccacactgg ccgaactgat gcagcggcta   1020

ggacacagca cagccggcgc cgcactccgc taccagcacg ccgccaaggg ccgggaccgc   1080

gaaatcgccg cactgttaag caaactggcc gagaaccagg agatgtga                1128

<210>10

<211>375

<212>PRT

<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400>10

Val Thr Gln Thr Gly Lys Arg Gln Arg Arg Lys Phe Gly Arg Ile Arg

1               5                   10                  15

Gln Phe Asn Ser Gly Arg Trp Gln Ala Ser Tyr Thr Gly Pro Asp Gly

            20                  25                  30

Arg Val Tyr Ile Ala Pro Lys Thr Phe Asn Ala Lys Ile Asp Ala Glu

        35                  40                  45

Ala Trp Leu Thr Asp Arg Arg Arg Glu Ile Asp Arg Gln Leu Trp Ser

    50                  55                  60

Pro Ala Ser Gly Gln Glu Asp Arg Pro Gly Ala Pro Phe Gly Glu Tyr

65                  70                  75                  80

Ala Glu Gly Trp Leu Lys Gln Arg Gly Ile Lys Asp Arg Thr Arg Ala

                85                  90                  95

His Tyr Arg Lys Leu Leu Asp Asn His Ile Leu Ala Thr Phe Ala Asp

            100                 105                 110

Thr Asp Leu Arg Asp Ile Thr Pro Ala Ala Val Arg Arg Trp Tyr Ala

        115                 120                 125

Thr Thr Ala Val Gly Thr Pro Thr Met Arg Ala His Ser Tyr Ser Leu

    130                 135                 140

Leu Arg Ala Ile Met Gln Thr Ala Leu Ala Asp Asp Leu Ile Asp Ser

145                 150                 155                 160

Asn Pro Cys Arg Ile Ser Gly Ala Ser Thr Ala Arg Arg Val His Lys

                165                 170                 175

Ile Arg Pro Ala Thr Leu Asp Glu Leu Glu Thr Ile Thr Lys Ala Met

            180                 185                 190

Pro Asp Pro Tyr Gln Ala Phe Val Leu Met Ala Ala Trp Leu Ala Met

        195                 200                 205

Arg Tyr Gly Glu Leu Thr Glu Leu Arg Arg Lys Asp Ile Asp Leu His

    210                 215                 220

Gly Glu Val Ala Arg Val Arg Arg Ala Val Val Arg Val Gly Glu Gly

225                 230                 235                 240

Phe Lys Val Thr Thr Pro Lys Ser Asp Ala Gly Val Arg Asp Ile Ser

                245                 250                 255

Ile Pro Pro His Leu Ile Pro Ala Ile Glu Asp His Leu His Lys His

            260                 265                 270

Val Asn Pro Gly Arg Glu Ser Leu Leu Phe Pro Ser Val Asn Asp Pro

        275                 280                 285

Asn Arg His Leu Ala Pro Ser Ala Leu Tyr Arg Met Phe Tyr Lys Ala

    290                 295                 300

Arg Lys Ala Ala Gly Arg Pro Asp Leu Arg Val His Asp Leu Arg His

305                 310                 315                 320

Ser Gly Ala Val Leu Ala Ala Ser Thr Gly Ala Thr Leu Ala Glu Leu

                325                 330                 335

Met Gln Arg Leu Gly His Ser Thr Ala Gly Ala Ala Leu Arg Tyr Gln

            340                 345                 350

His Ala Ala Lys Gly Arg Asp Arg Glu Ile Ala Ala Leu Leu Ser Lys

        355                 360                 365

Leu Ala Glu Asn Gln Glu Met

    370                 375

<210>11

<211>228

<212>DNA

<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400>11

gtgatagcgg gcgtcgacca ggcgcttgca gcaacaggcc aggctagcca gcgggcggca    60

ggcgcatctg gtggggtcac cgtcggtgtc ggcgtgggca cggaacagag gaacctttcg    120

gtggttgcac cgagtcagtt cacatttagt tcacgcagcc cagattttgt ggatgaaacc    180

gcaggtcaat cgtggtgcgc gatactggga ttgaaccagt ttcactag                 228

<210>12

<211>75

<212>PRT

<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosi s)

<400>12

Val Ile Ala Gly Val Asp Gln Ala Leu Ala Ala Thr Gly Gln Ala Ser

1               5                   10                  15

Gln Arg Ala Ala Gly Ala Ser Gly Gly Val Thr Val Gly Val Gly Val

            20                  25                  30

Gly Thr Glu Gln Arg Asn Leu Ser Val Val Ala Pro Ser Gln Phe Thr

        35                  40                  45

Phe Ser Ser Arg Ser Pro Asp Phe Val Asp Glu Thr Ala Gly Gln Ser

    50                  55                  60

Trp Cys Ala Ile Leu Gly Leu Asn Gln Phe His

65                  70                  75

<210>13

<211>390

<212>DNA

<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400>13

atgagggctc gcagcgatgc tggaggccag tctgtgaagt cccgcacgtc gaatcggtcc     60

agaagctcgc gccggagccg cgtcaggtca tccatcagtg ccctcgttga taatccgcag    120

gctcggccgc gcgagctccc tgttctgtgc gggtggcccg tagtgcgcgt cgagccggtc    180

tgcgagttcg tgccggagcc ggtttgtgga caggccgagg tgctcggcga gccagccgcc    240

gctcatcggg tcacctcagc ccgccggtca ccctcaacga ccgtttgcag ccgttcgcag    300

aaggcgagcg cggtggtgat cagctccgtc agctcggttg cgcgggtgcg gcgtgcctcg    360

gtgagttcgg tggacgcgac aacagcgtga                                     390

<210>14

<211>129

<212>PRT

<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400>14

Met Arg Ala Arg Ser Asp Ala Gly Gly Gln Ser Val Lys Ser Arg Thr

1               5                   10                  15

Ser Asn Arg Ser Arg Ser Ser Arg Arg Ser Arg Val Arg Ser Ser Ile

            20                  25                  30

Ser Ala Leu Val Asp Asn Pro Gln Ala Arg Pro Arg Glu Leu Pro Val

        35                  40                  45

Leu Cys Gly Trp Pro Val Val Arg Val Glu Pro Val Cys Glu Phe Val

    50                  55                  60

Pro Glu Pro Val Cys Gly Gln Ala Glu Val Leu Gly Glu Pro Ala Ala

65                  70                  75                  80

Ala His Arg Val Thr Ser Ala Arg Arg Ser Pro Ser Thr Thr Val Cys

                85                  90                  95

Ser Arg Ser Gln Lys Ala Ser Ala Val Val Ile Ser Ser Val Ser Ser

            100                 105                 110

Val Ala Arg Val Arg Arg Ala Ser Val Ser Ser Val Asp Ala Thr Thr

        115                 120                 125

Ala

<210>15

<211>273

<212>DNA

<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400>15

atggatgacc tgacgcggct ccggcgcgag cttctggacc gattcgacgt gcgggacttc   60

acagactggc ctccagcatc gctgcgagcc ctcatcgcga cctacgaccc ctggatcgac  120

atgacggcca gcccgccaca gcctgtatcg cccggagggc ctcgactccg actcgtgcga  180

ttaaccacca acccatccgc gagagcagcc cctatcggaa acggtgggga ctcttctgtt  240

tgcgctggtg agaaacagtg ccgcccaccg tag                               273

<210>16

<211>90

<212>PRT

<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400>16

Met Asp Asp Leu Thr Arg Leu Arg Arg Glu Leu Leu Asp Arg Phe Asp

1               5                   10                  15

Val Arg Asp Phe Thr Asp Trp Pro Pro Ala Ser Leu Arg Ala Leu Ile

            20                  25                  30

Ala Thr Tyr Asp Pro Trp Ile Asp Met Thr Ala Ser Pro Pro Gln Pro

        35                  40                  45

Val Ser Pro Gly Gly Pro Arg Leu Arg Leu Val Arg Leu Thr Thr Asn

    50                  55                  60

Pro Ser Ala Arg Ala Ala Pro Ile Gly Asn Gly Gly Asp Ser Ser Val

65                  70                  75                  80

Cys Ala Gly Glu Lys Gln Cys Arg Pro Pro

                85                  90

<210>17

<211>234

<212>DNA

<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400>17

gtggaggtga gggctagcgc ccgcaagcac ggcatcaacg acgacgccat gctccacgca    60

taccgcaacg cgctgcgcta cgtcgaactg gaataccacg gcgaagttca actgctggtg    120

atcggccccg accaaaccgg gcgcctttta gagctggtca tcccagcaga cgaaccaccc    180

cggattatcc acgccaacgt actacgcccg aagttctacg actacctgag gtga          234

<210>18

<211>77

<212>PRT

<213>结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400>18

Val Glu Val Arg Ala Ser Ala Arg Lys His Gly Ile Asn Asp Asp Ala

1               5                   10                  15

Met Leu His Ala Tyr Arg Asn Ala Leu Arg Tyr Val Glu Leu Glu Tyr

            20                  25                  30

His Gly Glu Val Gln Leu Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Thr Gly Arg

        35                  40                  45

Leu Leu Glu Leu Val Ile Pro Ala Asp Glu Pro Pro Arg Ile Ile His

    50                  55                  60

Ala Asn Val Leu Arg Pro Lys Phe Tyr Asp Tyr Leu Arg

65                  70                  75

Claims (19)

1. 包含融合多肽的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物，所述融合多肽含有选自以下序列的一种或多种饥饿诱导的抗原或者一种或多种多肽片段，这些序列为SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84和86。

2. 根据权利要求1所述的包含融合多肽的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物，其中，所述饥饿诱导的多肽或者多肽片段与ESAT6、Ag85B、TB10.4和Ag85A或者它们的类似物以任一种组合和位置顺序融合。

3. 根据权利要求1-2中任一项所述的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物用于预防疾病使用、治疗使用、多期疫苗或者用于加强在先卡介苗接种的免疫性。

4. 根据权利要求1-3中任一项所述的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物，其是皮内给药、经皮给药、皮下给药、肌内给药或粘膜给药。

5. 根据权利要求2所述的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物，其中，所述融合多肽包含2个不同的免疫原性多肽或者其类似物。

6. 根据权利要求2所述的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物，其中，所述融合多肽包含3个不同的免疫原性多肽或者其类似物。

8. 根据权利要求2所述的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物，其中，所述融合多肽包含4个不同的免疫原性多肽或者其类似物。

9. 根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物，其包含具有ESAT6-Ag85A-X、ESAT6-Ag85B-X、Ag8A-X、Ag85B-X、TB10-Ag85A-X、TB10-Ag85B-X的组合的融合多肽，其中，X是任一种饥饿诱导的抗原，抗原单元的顺序可以是任一种组合，例如其中的顺序是相反的或X被置于中间。

10. 根据权利要求9所述的免疫原性组合物、疫苗或药物组合物，其包含氨基酸序列，该序列选自以任何多肽单元顺序编码的下述融合多肽的氨基酸序列或它们的类似物：

Ag85B-ESAT6-Rv2660c；

Ag85B-ESAT6-Rv2659c；

Ag85B-TB10.4-Rv2660c；

Ag85B-TB10.4-Rv2659c；

Ag85B-Rv2660c；

Ag85B-Rv2659c；

Ag85A-Rv2660c；

Ag85A-Rv2659c；

Ag85A-ESAT6-Rv2660c；

Ag85A-ESAT6-Rv2659c；

Ag85A-TB10.4-Rv2660c；

Ag85A-TB10.4-Rv2659c；

Rv2660c-Rv2659c；

Ag85B-ESAT6-Rv2660c-Rv2659c。

11. 前述权利要求中任一项所述的融合多肽。

12. 包含核酸片段的疫苗或者药物组合物，所述核酸片段含有编码根据前述权利要求中任一项所述的融合多肽的核苷酸序列。

13. 根据权利要求11所述的疫苗或者药物组合物用于预防疾病使用、治疗使用、或者前述两者、多期疫苗或者用于加强在先卡介苗接种的免疫性。

14. 包含核酸片段的疫苗或者药物组合物，所述核酸片段含有编码根据前述权利要求中任一项所述的融合多肽的核苷酸序列。

15. 包含一种或多种饥饿诱导的抗原或一种或多种多肽片段的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物，所述饥饿诱导的抗原或多肽片段选自SEQ IDNO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84和86。

16. 根据权利要求15所述的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物用于预防疾病使用、治疗使用、多期疫苗或者用于加强在先卡介苗接种的免疫性。

17. 根据权利要求15-16中任一项所述的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物，其是皮内给药、经皮给药、皮下给药、肌肉给药或粘膜给药。

18. 包含核酸片段的疫苗或者药物组合物，所述核酸片段含有编码饥饿诱导的抗原或其片段的核苷酸序列。

19. 一种免疫动物的方法，该方法包括给予动物根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物。

20. 一种治疗患有由毒性分枝杆菌引起的活跃性结核病或者潜伏性结核病的动物的方法，该方法包括给予动物根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物。

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