CN106479946B - 一种过表达结核分枝杆菌Rv3586的重组卡介苗菌株及其应用 - Google Patents

一种过表达结核分枝杆菌Rv3586的重组卡介苗菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种过表达结核分枝杆菌Rv3586的重组卡介苗菌株及其应用。将含结核分枝杆菌Rv3586编码基因的质粒转化入卡介苗，筛选获得菌株称为Bacillus calmette‑Guerin rBCG‑DisA，简称为rBCG‑DisA，保藏编号为：CCTCC M 2016335。过表达Rv3586的重组卡介苗rBCG‑DisA兼具靶抗原和卡介苗的双重优势，单独免疫或联合结核分枝杆菌Ag85B‑ESAT6亚单位疫苗加强免疫，可诱导正常和感染小鼠更强的免疫应答，提高机体抗分枝杆菌的保护力，因而具有良好的应用前景。

Description

一种过表达结核分枝杆菌Rv3586的重组卡介苗菌株及其应用
技术领域
本发明属于结核病疫苗领域。本发明涉及一种过表达结核分枝杆菌Rv3586的重组卡介苗菌株。本发明还涉及上述重组卡介苗菌株单独或联合亚单位疫苗Ag85B-ESAT6(AE)在结核病预防和治疗性疫苗及制剂中的应用。
背景技术
结核病流行现状
结核病(Tuberculosis，TB)仍然是全球范围内危害最严重的传染病。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)是TB的病原体，全世界已有约1/3人口感染Mtb。据2014年WHO报告，全球约有960万新发TB病例。我国属于全球22个TB高负担国家之一，2014年我国新发TB人数为93万，次于印度和印度尼西亚而位居全球第三位。TB发病率仅次于病毒性肝炎，因此，TB被我国卫生部列为全国重点控制的重大疾病之一。
结核病疫苗研究现状
卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin vaccine，BCG)是目前用于结核病预防的唯一疫苗，但其存在着保护期短、保护性免疫应答不强等缺点，并且作为一种减毒活疫苗，不能用于免疫低下人群的接种。近年来关于新型TB疫苗的研究很多，包括一系列候选疫苗的筛选和不同的疫苗免疫策略。候选疫苗研究策略可分为两类：1)rBCG疫苗：构建重组rBCG以提高现有BCG疫苗菌株的效率；2)以亚单位疫苗、DNA疫苗、重组病毒减毒、Mtb营养缺陷疫苗、非Mtb分枝杆菌疫苗等代替原有BCG疫苗。
BCG生物学特性和诱导机体的免疫应答反应与Mtb最相近，作为TB唯一预防疫苗，全球超过30亿人接种，证明其为安全的疫苗载体(Kaufmann SH.Tuberculosis vaccinedevelopment at a divide.Curr Opin Pulm Med.2014May；20(3):294-300.)。国内外包括第四军医大学微生物学教研室研究，以BCG为载体成功表达了包括Mtb Ag85B和ESAT-6等一系列抗原，且其免疫学特性研究表明，可引起更强的免疫应答反应(Lu,Y.,et al.,Novelrecombinant BCG coexpressing Ag85B,ESAT-6and Rv2608elicits significantlyenhanced cellular immune and antibody responses in C57BL/6mice.Scand JImmunol,2012.76(3):p.271-7.)。BCG作为活疫苗载体具有以下优点：(1)BCG本身为一种强免疫佐剂，可提高宿主的免疫力。(2)BCG可在体内复制繁殖，可不断表达外源抗原，仅单次接种，即可获得持续的免疫应答；(3)所表达的保护性抗原直接用于免疫，保持其活性的同时免去蛋白纯化加工等步骤；(4)通过基因工程技术可根据需要对靶抗原进行修饰。
表达Ag85B的重组BCG已被批准进入临床试验。AERAS、SSI、Sanofi和Intercell联合研制的Ag85B和TB10.4融合蛋白疫苗，目前正在进行I期临床试验。第四军医大学师长宏等前期研究表明，Ag85B-ESAT6(AE)融合抗原的表达增强了BCG的免疫原性，具有较强的疫苗潜能(Shi C，et al.Immune responses and protective efficacy induced by 85Bantigen and early secreted antigenic target-6kDa antigen fusionproteinsecreted by recombinant bacille Calmette-Guérin.Acta Biochim BiophysSin.2007；39(4):290～296.)。表明rBCG具有提高免疫原性，增强疫苗免疫效果的优势，因而具有较好的应用前景。
对于Mtb保护性抗原的研究已持续多年，主要集中于分泌蛋白如ESAT-6、CFP10、Ag85、TB10.4、MTB39和MTB32等，热休克家族如Hsp65、Hsp70、HspX等，及融合蛋白MTB72f等抗原。但是，目前仍未获得替代传统BCG的rBCG，表明仍需充分利用现有研究成果，广泛筛选新的作用机制抗原，或改进疫苗构建方式或免疫策略，已获得更有效的rBCG及其免疫方式。
结核分枝杆菌c-di-AMP合成酶Rv3586研究进展
环二腺苷(Cyclic di-adenosine monophosphate，c-di-AMP)是2008年新发现的细菌小分子信号分子(Witte,G.,et al.,Structural biochemistry of a bacterialcheckpoint protein reveals diadenylate cyclase activity regulated by DNArecombination intermediates.Mol Cell,2008.30(2):p.167-78.)。c-di-AMP参与细菌芽胞形成、细胞壁形成、细胞壁压力感应及控制细菌大小等多种生理过程。体外实验证实，c-di-AMP可诱导宿主细胞固有免疫应答；而且c-di-AMP单独或联合抗原免疫，可调节Th1/Th2/Th17适应性免疫应答，具有显著的免疫佐剂作用(Ebensen,T,et al.,Bis-(3',5')-cyclic dimeric adenosine monophosphate:strong Th1/Th2/Th17promoting mucosaladjuvant.Vaccine,2011.29(32):5210-20.)。仅在细菌中发现c-di-AMP，而真核细胞中没有，因此c-di-AMP成为细菌疫苗和药物研究的新靶点。
c-di-AMP由两分子ATP经二腺苷酸环化酶(Diadenylate cyclase A，DacA)催化合成而来，枯草杆菌中的DisA是第一个发现的c-di-AMP合成酶。从金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌等致病菌中均发现了c-di-AMP合成酶DAC。第四军医大学柏银兰等前期研究中首次报道，Rv3586是Mtb中合成c-di-AMP的DAC酶，其结构和功能与DisA相似(Bai,Y.,et al.,Mycobacterium tuberculosis Rv3586(DacA)is a diadenylate cyclase that convertsATP or ADP into c-di-AMP.PLoS One,2012.7(4):p.e35206)。通过对Mtb基因组分析，发现Rv3586是Mtb中唯一的c-di-AMP合成酶。在Mtb中过表达Rv3586可调控细菌c-di-AMP水平，进行影响细菌毒性和宿主免疫应答。随后Yang和Bai等又研究发现，c-di-AMP水平升高菌株感染Mφ后，引起IFN-β为特征的固有免疫激活，并可降低细菌的毒力(Yang,J.,Y.Bai,Y.Zhang,V.D.Gabrielle,L.Jin,and G.Bai.Deletion of the cyclic di-AMPphosphodiesterase gene(cnpB)in Mycobacterium tuberculosis leads to reducedvirulence in a mouse model of infection.Mol Microbiol,2014.93(1):65-79.)。国外研究者发现，过表达DisA蛋白的重组Mtb菌株免疫小鼠，可诱导更高的细胞因子释放，且细菌的毒力显著降低(Dey B et al,A bacterial cyclic dinucleotide activates thecytosolic surveillance pathway and mediates innate resistance totuberculosis.Nat Med.2015；21(4):401-6.)。此外，第四军医大学柏银兰等研究表明，Mtb感染动物和TB患者血清中均可检测出Rv3586抗体，且Rv3586重组蛋白亚单位疫苗免疫可诱导小鼠较强的体液免疫反应(曹田宇，柏银兰等，结核分枝杆菌c-di-AMP合成酶的表达和纯化以及小鼠多抗血清的制备.中国病原生物学杂志,2015；08:681-684+688.)。因此，Rv3586是Mtb新型疫苗和药物研究的良好靶点。
发明内容
本发明的目的是获得一种过表达结核分枝杆菌Rv3586的重组卡介苗菌株。所述菌株可单独或联合亚单位疫苗用于结核病预防和治疗性疫苗的研制。
本发明是这样实现的：
根据Mtb H37Rv株Rv3586基因序列设计引物；PCR方法从基因组中扩增目的基因序列，将其克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体PW54中，阳性克隆质粒命名为PW56。制备BCG感受态细胞，将重组质粒电转化入细菌，卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆，使用PCR法鉴定其基因型，通过Western-blot分析其表型，阳性菌株命名为过表达Rv3586的重组卡介苗菌株，简称为rBCG-disA。该过表达结核分枝杆菌Rv3586的重组卡介苗菌株(Bacilluscalmette-Guerin rBCG-disA)已送中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为：CCTCC M2016335。
所述的重组卡介苗菌株菌株单独或联合亚单位疫苗Ag85B-ESAT6(AE)用于预防和治疗结核病疫苗及制剂中的应用。
本发明菌株rBCG-DisA扩大培养后，取107皮下单独或联合融合蛋白Ag85B-ESAT6(AE)亚单位疫苗免疫小鼠，检测体液免疫应答水平，如抗体滴度；检测细胞免疫应答水平，包括脾淋巴细胞增殖、细胞因子转录和分泌水平；免疫小鼠以Mtb H37Ra株攻击感染，检测体液免疫应答和细胞免疫应答水平，并检测免疫保护效率。结果显示，筛选获得的过表达Rv3586的rBCG-disA菌株免疫小鼠，可诱导小鼠体液和细胞免疫应答水平升高；特别是以H37Ra攻击感染后，其体液和细胞免疫应答水平显著高于BCG。表达Rv3586的重组卡介苗菌株集中了靶抗原、靶抗原生物活性产物和活载体的优势，免疫接种后刺激机体更强的免疫应答，并可显著提高机体的免疫保护力，因而具有比较大的应用前景。rBCG-DisA免疫小鼠，可诱导特异性的抗体产生，并可诱导更强的细胞免疫反应；rBCG-DisA免疫或联合结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白亚单位疫苗加强免疫，均可诱导感染小鼠更强的免疫应答反应。表达Rv3586的重组卡介苗兼具靶抗原和卡介苗活载体疫苗的双重优势，并且可以与亚单位疫苗联用，诱导更强的免疫应答，提高机体抗分枝杆菌的保护力，因而具有良好的应用前景。
附图说明
图1：Rv3586基因扩增PCR结果图
图2：Rv3586大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体酶切鉴定结果图
图3：rBCG-disA重组菌基因型鉴定PCR结果图
图4：rBCG-disA重组菌表型鉴定Western-blot结果图
图5：rBCG-disA免疫小鼠血清抗体检测结果图
图6：rBCG-disA免疫小鼠脾淋巴细胞增殖结果图
图7：rBCG-disA免疫小鼠脾淋巴细胞因子转录水平RT-PCR相对定量结果图
图8：rBCG-disA免疫小鼠脾淋巴细胞因子分泌水平ELISA检测结果图
图9：rBCG-disA免疫小鼠H37Ra感染后脾淋巴细胞增殖结果图
图10：rBCG-disA免疫小鼠H37Ra感染后脾淋巴细胞因子转录水平RT-PCR绝对定量结果图
图11：rBCG-disA免疫小鼠H37Ra感染后脾淋巴细胞因子分泌水平ELISA检测结果图
图12：rBCG-disA免疫小鼠感染后脏器荷菌数结果图
保藏证明
分类命名
卡介苗rBCG-disA
拉丁文学名
Bacillus Calmette-Guérin rBCG-disA
保藏单位名称
中国典型培养物保藏中心
地址：
湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山
E-mail:cctcc@whu.edu.cn
电话：027-6875 4052
保藏日期
2016年6月20日
保藏号
CCTCC M 2016335
具体实施方式
Rv3586大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体的构建
根据Mtb H37Rv株的基因组Rv3586基因序列设计引物：
P1：5’-tttaagcttatgcacgctgtgactcgtccgacc-3’HindIII位点
P2：5’-gcgaagcttaaggcggataattattgatcgc-3’HindIII位点
由上海生工生物科技有限公司合成引物。以Mtb H37Rv株基因组DNA为模板PCR扩增目的基因，反应参数：95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃复性1min，72℃延伸100s，35个循环，末次循环后72℃延伸5min。1％琼脂糖凝胶电泳分析表明扩增出1 100bp目的条带(图1)。凝胶回收试剂盒回收目的片段，用HindIII酶切，1％琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物。T4DNA连接酶连接同样酶切并回收的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体PW54质粒，16℃过夜，转化E.coli DH5α感受态细胞，用卡那霉素抗性平板筛选。挑取阳性克隆接种于LB液体培养基37℃振荡培养过夜，试剂盒提取质粒DNA，HindIII酶切鉴定阳性质粒进行序列测定(图2)。序列测定结果显示，与Mtb H37Rv株基因组Rv3586公布序列完全一致，表明成功构建Rv3586大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体，命名为PW56，其全基因序列如SEQ ID NO：1所示。
电穿孔感受态细胞的制备
BCG感受态的制备：接种冻存的BCG于3mL 7H9培养基，37℃培养至饱和。将该饱和培养物转接入含有50mL 7H9培养基的250mL锥形瓶中，100rpm振荡培养至OD600nm＝0.5，加入乙酰胺至终浓度为0.2％，继续培养>16h，至OD600nm＝1，室温离心5 000rpm收集细菌沉淀，分别用1/2、1/4、1/8培养物体积的10％甘油重悬并洗涤，最后将细菌沉淀用1/100培养物体积10％甘油溶液重悬，-70℃保存至使用。
重组质粒电转化BCG感受态细胞
取0.4mL BCG感受态细胞室温融化，加入10μl PW56质粒混匀，转入0.2cm预冷的电穿孔杯，电穿一次，参数为：电压2.5kV，电容25μF，电阻1 000Ω；将混合物转入5mL 7H9培养基，37℃培养72h后，收集菌体沉淀，涂布于含OADC和卡那霉素25μg/mL的7H10平板，设空白质粒作为对照，37℃培养直至形成可见菌落。
rBCG基因型和表型鉴定
挑取电转化平板上的单个菌落，以PW56多克隆位点上游引物和Rv3586下游引物进行PCR检测，阳性克隆在约1 200bp处可见扩增的目的条带(图3)。将阳性克隆菌株接种于含卡那霉素的7H9培养基，培养至OD600大于1，收获细菌。将菌重悬于PBS中，6 000rpm离心洗涤，重复三次；在冰浴中进行超声破菌，10s裂菌，5s间歇，共10min，12 000rpm离心10min，将上清转入EP管，取样进行12％SDS-PAGE，然后将蛋白转印到PVDF膜，5％BSA室温封闭1h，加入小鼠抗Rv3586多抗，4℃过夜；PBST洗涤后，加入HRP-羊抗鼠IgG，37℃放置1h；PBS洗涤后，加入底物液显色，可见在约43kDa处可见明显的条带(图4)。鉴定结果表明过表达MtbRv3586的rBCG-DisA菌株构建成功。其保藏编号为：CCTCC M 2016335。
rBCG-DisA免疫小鼠应答水平检测
实验动物分组及免疫：取BALB/c小鼠随机分为4组(n＝5)，分别通过皮下接种BCG、rBCG-DisA、rBCG-DisA+AE以及生理盐水对照组，BCG和rBCG接种剂量均为107CFU/只；rBCG-DisA+AE组第一次皮下接种rBCG-DisA 107CFU，辅以皮下接种AE融合蛋白30μg/只，间隔2w，再加强免疫AE 30μg/只2次。免疫完成后4w，处死小鼠，检测体液和细胞免疫水平。
1、免疫小鼠体液免疫水平检测
ELISA法检测各组免疫小鼠血清中特异性抗体，结果表明，rBCG-DisA免疫两周后就可检测到抗体，加强免疫后抗体水平逐渐升高；rBCG-DisA免疫组和rBCG-DisA+AE组抗体水平均高于BCG组，rBCG-DisA+AE组抗体水平最高，两组均显著高于生理盐水对照组(P<0.05)(图5)。
2、免疫小鼠细胞免疫水平检测
(1)脾淋巴细胞增殖
在小鼠免疫完成后4w，无菌分离各组小鼠脾淋巴细胞，调整细胞浓度至1×106个/mL，加入96孔板中(100μL/孔)，实验组分别加入100μL RPMI 1640完全培养液稀释的的BCG-PPD(25mg/L)和重组Rv3586蛋白(25mg/L)，阴性对照组加入100μL培养液，设置不加脾淋巴细胞的空白对照孔，设3个复孔。37℃培养72h后，加入20μL/孔的MTS(5mg/mL)，继续培养4h，最后加入10％SDS25μL/孔，测定A490值。结果用增殖指数SI表示：SI＝A490(实验组－空白对照)/A490(阴性对照－空白对照)。检测结果显示，以BCG为刺激蛋白，各免疫组脾淋巴细胞增殖显著(P<0.05)；以Rv3586重组蛋白为刺激蛋白，各免疫组脾淋巴细胞均增殖显著，而rBCG-DisA免疫组和rBCG-DisA+AE组更为显著(P<0.001)(图6)。
(2)免疫小鼠脾淋巴细胞因子转录水平
免疫完成后4w，无菌取小鼠肺、脾组织，试剂盒提取组织总RNA，qRT-PCR相对定量法检测细胞因子转录水平，结果显示：所有BCG免疫组小鼠肺和脾脏IFN-γ、IL-2和IL-10转录水平均显著上升，rBCG-DisA免疫组和rBCG-DisA+AE组三种细胞因子转录水平升高更为显著(P<0.01)。与BCG菌株相比，重组菌rBCG-DisA单独或联合亚单位疫苗均可使IFN-γ转录水平显著升高(P<0.05)(图7)。以上结果表明，过表达Rv3586可显著提高BCG菌株的细胞因子转录。
(3)免疫小鼠脾淋巴细胞因子分泌水平
在小鼠免疫完成后，分离各组小鼠脾淋巴细胞并加入BCG抗原刺激(方法同上)。37℃培养72h后，收集细胞培养上清，ELISA检测上清中细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-10的水平。结果显示：各免疫组小鼠IFN-γ产生水平均显著升高(P<0.05)，rBCG-DisA免疫组和rBCG-DisA+AE组升高比BCG免疫组更为显著(P<0.01)；与正常组相比，BCG和rBCG-DisA免疫组小鼠IL-2和IL-10产生水平均升高，rBCG-DisA+AE组升高显著(P<0.01)；不仅如此，rBCG-DisA+AE组IL-2和IL-10产生水平显著高于BCG和rBCG-DisA免疫组(P<0.05)(图8)，表明rBCG-DisA可提高免疫小鼠细胞因子产生水平，该效应在与亚单位疫苗联用时更为显著。
rBCG-DisA免疫小鼠H37Ra感染后检测
上述各组小鼠免疫完成后4w，以Mtb H37Ra 104CFU/只经尾静脉攻击感染免疫的小鼠，感染后4w，处死小鼠，进行如下检测。
1、免疫小鼠H37Ra感染后脾淋巴细胞增殖
无菌分离脾淋巴细胞，进行脾淋巴细胞增殖检测(方法同上)，结果显示，BCG和rBCG-DisA免疫可显著促进感染小鼠脾淋巴细胞增殖(P<0.01)，rBCG-DisA+AE联合免疫促进感染小鼠脾淋巴细胞增殖的作用更显著(P<0.001)(图9)。
2、免疫小鼠H37Ra感染后脾淋巴细胞因子转录水平
无菌取小鼠肺、脾组织，试剂盒提取组织总RNA，qRT-PCR绝对定量法检测脾淋巴细胞因子转录水平，结果显示，与未免疫感染组相比较，rBCG-DisA单独和联合免疫组IFN-γ、IL-2和IL-10的转录水平均显著提高(P<0.001)，而BCG免疫组肺细胞因子转录水平有所提高(P<0.05)，但效果显著不如rBCG-DisA免疫(P<0.05)和rBCG-DisA联合免疫组(P<0.05)(图10)。结果表明，过表达Rv3586可显著提高BCG免疫小鼠H37Ra感染后的细胞因子转录。
(3)免疫小鼠H37Ra感染后脾淋巴细胞因子分泌水平
同上方法分离小鼠脾淋巴细胞，抗原刺激并培养后，ELISA法检测细胞培养上清中的细胞因子水平，结果显示，与感染组相比，rBCG-DisA和联合免疫组诱导细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-10释放显著增加(P<0.001)，BCG组诱导IL-2释放与对照组无显著差别(P>0.05)；rBCG-DisA免疫组和联合免疫组IFN-γ、IL-2和IL-10释放水平显著高于BCG免疫组(P<0.01，P<0.001)(图11)。以上结果表明，过表达Rv3586的重组BCG可诱导免疫小鼠产生更高水平的细胞因子，可提高疫苗的免疫保护力。
(4)免疫小鼠H37Ra感染后主要脏器荷菌数
感染4w后，无菌取脾、肺脏，加入5ml 1640培养液，在200目筛网上充分研磨后，取100μL悬液倍比稀释后，涂布于7H10+10％OADC平板，计数脏器荷菌数，结果显示，各免疫组小鼠均可有效抵抗Mtb H37Ra的感染(P<0.001)；与BCG组相比，rBCG-DisA免疫组和rBCG-DisA+AE组脏器荷菌数无显著差异(P>0.05)(图12)，且实验过程中无动物死亡现象，表明其安全性和免疫保护力与BCG相当。

Claims (2)

1.一种过表达结核分枝杆菌Rv3586的重组卡介苗菌株，将包含结核分枝杆菌Rv3586蛋白编码基因的重组质粒转化入卡介苗，筛选获得的阳性菌株简称为rBCG-DisA，其保藏编号为：CCTCC M2016335。
2.由权利要求1中所述的重组卡介苗菌株单独或联合亚单位疫苗Ag85B-ESAT6(AE)用于预防和治疗结核病疫苗及制剂中的应用。
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