JP6229080B2

JP6229080B2 - 新規な温度敏感性マイコバクテリア菌株を含むマイコバクテリア感染症に対するワクチン組成物

Info

Publication number: JP6229080B2
Application number: JP2016572430A
Authority: JP
Inventors: ボムジュン・キム; ビョンジュン・キム
Original assignee: ソウルナショナルユニバーシティアールアンドディービーファウンデーション
Priority date: 2014-08-18
Filing date: 2015-08-13
Publication date: 2017-11-08
Anticipated expiration: 2035-08-13
Also published as: KR20160021933A; JP2017524661A; CN106794201A; KR101696514B1; WO2016028028A1; CN106794201B

Description

本願は、温度敏感性マイコバクテリア菌株を利用したマイコバクテリア感染症に対するワクチンに関連した技術分野である。

マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、結核菌、ウシ型結核菌および癩菌、鳥型結核菌群（Ｍ．ａｖｉｕｍｃｏｍｐｌｅｘ）およびカメ結核菌（Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ−ｃｈｅｌｏｎａｅｃｏｍｐｌｅｘ）を含む約１５０株の種で構成されている。これらの中で、結核菌とウシ型結核菌、癩菌は、絶対病原性菌、残りのマイコバクテリアを非結核抗酸性菌（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、以下ＮＴＭ）と通称して区分して、ヒトに結核ハンセン病を引き起こすなどその他にも鳥類、家畜などに様々な疾患を誘発している。

この中でも、結核（Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ＴＢ）は、依然として全世界的に上位を占める死亡原因であり、多剤耐性（ＭＤＲ）結核菌の登場により状況がより悪化しているのが実情である。

結核は、一般に長期間の抗生剤治療を介して調節できるが、抗生剤に対する耐性発生、そして患者が治療の手順を遵守するのかに対する徹底したモニタリングが難しいだけでなく、保菌者は、症状がなくても他人を感染させることができて、菌の伝播を防ぐには力不足である。

従って、効果的なワクチンを利用した予防が、結核の伝播を防ぐのにより効果的な方法である。

また、結核を除いた非結核抗酸性菌種の中で、鳥型結核菌群（Ｍ．ａｖｉｕｍｃｏｍｐｌｅｘ）を除いて国内で最も高い頻度で分離される菌は、カメ結核菌（Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ−Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）グループ菌である（非特許文献１）。最近報告によると、この中で、Ｍ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ（Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓｓｕｂｓｐ．ｂｏｌｌｅｔｉｉ）菌種が国内分離カメ結核菌グループ（Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ−Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅｃｏｍｐｌｅｘ）中約半分ほどを（４６．５％）占めると知られている（非特許文献２）。このようなＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓに属する菌種の感染は、抗生剤に対する先天的耐性などにより治療失敗率および死亡率が顕著に高いと知られている。従って、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ菌種に対する新しいワクチンの開発が必要なのが実情である。

従来結核に対する予防ワクチンとして最も広く使用されるものは、ＢＣＧ（ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓＢａｃｉｌｌｅＣａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧの場合、一部幼児期で発生する結核には効果的であるが、成人で発見される強い伝染性を有する結核にはその効果が制限的である。また、ＢＣＧは、リンパ腺炎、局所骨組織感染、および全身感染の副作用が報告されたことがある。

最近、温度敏感性菌株および弱毒化生菌が特定バクテリアに対するワクチンとして開発されている傾向にある。特に温度敏感性菌株のワクチン開発化はより大きい関心を集めているが、その理由は、ヒトだけでなく動物の体外（皮膚など）から体内（臓器など）への温度勾配が存在するためである。皮膚などのように相対的に低い温度では育つことができて局所免疫を刺激させることができる能力を有するが、臓器など体内の中では育つことはできない温度敏感性菌株の開発が行われている（非特許文献３）。これらの中で最も良く知られているのがＳａｂｉｎｐｏｌｉｏワクチンとＦｌｕＭｉｓｔｉｉｎｆｌｕｅｎｚａワクチンである（非特許文献４）。また、獣医学的な目的で温度敏感性菌株が開発、研究されている傾向にある（非特許文献５）。しかし、人為的な遺伝子組換えを介した温度敏感性菌株は、安定性が低く維持するのに困難がある。

特許文献１は、弱毒化された組換えマイコバクテリアを利用した免疫原性またはワクチン組成物に関し、プリンおよびピリミジン生合成と関連した遺伝子が不活性化されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ組換え菌株を利用したワクチン組成物を開示している。

特許文献２は、新規なマイコバクテリア菌株および結核ワクチン組成物に関し、弱毒化されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含むワクチン組成物を開示している。

従来技術とは異なる新しい菌株に基づいた新しいワクチン組成物に対する開発が要求される。

ＷＯ１９９８−０５６９３１米国公開特許２０１３−０１０１６２３号

ＲｙｏｏＳＷ，ＳｈｉｎＳ，ＳｈｉｍＭＳｅｔａｌ．，Ｓｐｒｅａｄｏｆｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｆｒｏｍ１９９３ｔｏ２００６ｉｎＫｏｒｅａｎｓ．ＪＣｌｉｎＬａｂＡｎａｌ．２００８；２２（６）：４１５−２０ＫｉｍＨＹ，ＫｏｏｋＹ，ＹｕｎＹＪｅｔａｌ．，ＰｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅａｎｄＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｌｌｅｔｉｉｓｔｒａｉｎｓａｍｏｎｇＫｏｒｅａｎＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｈｅｌｏｎａｅ−Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｂｓｃｅｓｓｕｓｇｒｏｕｐｉｓｏｌａｔｅｓ．ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８；４６（１０）：３３８４−９０Ｂａｒｒｙｅｔａｌ．，Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉａｌｐａｔｈｏｇｅｎｓｇｅｎｅｒａｔｅｄｂｙｔｈｅｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｏｆｅｓｓｅｎｔｉａｌｇｅｎｅｓｆｒｏｍｃｏｌｄ−ｌｏｖｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌｕｓｅａｓｌｉｖｅｖａｃｃｉｎｅｓ．ＪＭｏｌＭｅｄ．２０１１；８９：４３７−４４４ＭａａｓｓａｂＨＦａｎｄＢｒｙａｎｔＭＬ，Ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｌｉｖｅａｔｔｅｎｕａｔｅｄｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｖａｃｃｉｎｅｆｏｒｈｕｍａｎｓ．ＲｅｖＭｅｄＶｉｒｏｌ．１９９９；９：２３７−２４４Ｃｈａｌｍｅｒｓｅｔａｌ．，ＶｅｔＲｅｃ．１９９７；１４１：６３−６７，ＪａｃｋｗｏｏｄａｎｄＳａｉｆ，ＡｖｉａｎＤｉｓ．１９８５；２９：１１３０−１１３９、Ｍｏｒｒｏｗｅｔａｌ．，ＡｖｉａｎＤｉｓ．１９９８；４２：６６７−６７０

本願は、新しい菌株に基づいたカメ結核菌群を含む結核菌およびウシ型結核菌を含むマイコバクテリア感染症に対するワクチンを提供しようとする。

一様態で本願は、寄託番号ＫＣＴＣ１２６２８ＢＰのマイコバクテリアパラゴルドネ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅ，ｓｔｒａｉｎ４９０６１）菌株を提供する。

他の様態で本願は、さらに本願に係る温度敏感性菌株および薬学的に許容可能な賦形剤を含むマイコバクテリア感染に対するワクチン組成物を提供する。

本願に係るワクチン組成物に効果があるマイコバクテリア感染症は、当業界に知られており、当業者なら感染による疾患を容易に判別または診断できるはずである。このようなマイコバクテリア感染症は、例えば、肺疾患、リンパ節炎、皮膚軟組織感染症、骨感染症、または播種性疾患を含むが、これらに制限されない。本願に係るワクチンの効果があるこのような疾患を引き起こすマイコバクテリアは、ＮＴＭ（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、迅速発育ＮＴＭ、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、またはウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ）を含み、前記ＮＴＭは、カメ結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｈｅｌｏｎｅｉｃｏｍｐｌｅｘ）、マイコバクテリウムアビウムコンプレックス（Ｍ．ａｖｉｕｍｃｏｍｐｌｅｘ）（ＭＡＣ）、マイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウムイントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウムカンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウムアブセサス（Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、またはマイコバクテリウムマシリエンス（Ｍ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ）であるが、これらに制限されない。

本願に係るワクチンに含まれる菌株は、生菌、弱毒化生菌または不活性化菌株であってもよい。特に、本願に係る菌株は、温度敏感性菌株として安全に生菌として使用できる。

本願に係るワクチン組成物は、必要な場合、アジュバントを追加で含むことができ、当業者なら効果を考慮して適切な種類および量を選択することができるはずである。一具現例でアジュバントは、アルミニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート、アルミニウムポタシウムサルフェート、架橋ポリアクリル酸重合体、ＤＤＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−ａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）、免疫調節物質、ラクトフェリン、またはＩＦＮ−ｇａｍｍａ誘導剤の中一つ以上を含むがこれに制限するのではない。他の具現例では、アジュバントとして架橋ポリアクリル酸重合体は、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）単一重合体または共重合体を含み、前記免疫調節物質、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、またはＩＬ−１２を含み、前記ＩＦＮ−ｇａｍｍａ誘導剤は、ｐｏｌｙＩ：Ｃを含む。他の具現例では、アジュバントとしてアルミニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート、またはアルミニウムポタシウムサルフェートは、０．０５重量％〜０．１重量％で含まれて、前記架橋ポリアクリル酸重合体は、０．２５重量％で含まれ得る。

他の様態で本願はさらに本願に係るワクチン組成物の有効量をマイコバクテリア感染症治療または予防が必要な対象体に投与する段階を含む、マイコバクテリア感染症予防または治療方法を提供する。

本願に係る一具現例で、マイコバクテリア感染症は、ＮＴＭ（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、またはウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ）によるものである。他の具現例で、ＮＴＭは、カメ結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｈｅｌｏｎｅｉｃｏｍｐｌｅｘ）、マイコバクテリウムアビウムコンプレックス（Ｍ．ａｖｉｕｍｃｏｍｐｌｅｘ）（ＭＡＣ）、マイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウムイントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウムカンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウムアブセサス（Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、またはマイコバクテリウムマシリエンス（Ｍ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ）を含む。

本願に係るワクチンの効果があるマイコバクテリア感染症は、肺疾患、リンパ節炎、皮膚軟組織感染症、骨感染症、または播種性疾患を含み、技術分野の当業者ならこれらの疾患の定義、判断基準を正確に把握して本願に係るワクチン治療が必要な対象体または患者を判別することができるはずである。

本願に係る方法に使用されるワクチンに含まれる菌は、生菌、弱毒化生菌、または不活性化菌であり、特に温度敏感性菌株として、生菌で安全ながらより効果的に使用できる。当業者なら具体的な感染菌または疾患の種類、感染の程度または疾患の程度、対象体の基底疾患などを考慮して適切な量を投与することができる。

本願に係る方法に使用されるワクチンは、アジュバントを追加で含むことができ、当業者なら具体的な感染菌または疾患の種類、感染の程度または疾患の程度、対象体の基底疾患などを考慮してワクチンと共に使用されるアジュバントを選択でき、例えば、アジュバントは、アルミニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート、アルミニウムポタシウムサルフェート、架橋ポリアクリル酸重合体、ＤＤＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−ａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）、免疫調節物質、ラクトフェリン、またはＩＦＮ−ｇａｍｍａ誘導剤の中一つ以上を含む。一具現例で、架橋ポリアクリル酸重合体は、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）単一重合体または共重合体を含み、前記リンフォカインは、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、またはＩＬ−１２を含み、前記ＩＦＮ−ｇａｍｍａ誘導剤は、ｐｏｌｙＩ：Ｃを含むことができる。他の具現例で、架橋ポリアクリル酸重合体は、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）単一重合体または共重合体を含み、前記リンフォカインは、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、またはＩＬ−１２を含み、前記ＩＦＮ−ｇａｍｍａ誘導剤は、ｐｏｌｙＩ：Ｃを含む。

本願に係る温度敏感性マイゴバクテリアであるＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅ（ｓｔｒａｉｎ４９０６１）菌株およびこれを含むワクチン組成物は、カメ結核菌群および結核菌、ウシ型結核菌を含むマイコバクテリア感染症の予防に効果的に使用できる。体内温度は、皮膚から体内臓器まで温度が増加する勾配指向を示しているが、本願に係るワクチンは、接種時皮膚および皮下では増殖して免疫を刺激させるが、体内中心部では体温より低い温度でだけ育つことができる特徴により増殖が抑制されて感染の可能性が低く、結核菌を含むすべてのマイコバクテリア感染症に対する予防ワクチンおよび免疫治療に安全かつ有用に使用できる。特に、生菌としてマイコバクテリア感染症に対する予防ワクチンおよび免疫治療に安全かつ効果的に使用できる。

本願に係る菌株が新規であること示す結果であり、１６ｓＲＮＡ、ｒｐｏＢ、およびｈｓｐ６５の系統分析結果である。本願に係る菌株が新規であること示す結果であり、本願に係る菌株の１６ｓＲＮＡの配列である。本願に係る菌株が新規であること示す結果であり、本願に係る菌株のｒｐｏＢの配列である。本願に係る菌株が新規であること示す結果であり、本願に係る菌株のｈｓｐ６５の配列である。Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅの特徴を解明したもので、３０℃で７Ｈ９液体培地での成長速度をＭ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、およびＭ．ｍａｒｉｎｕｍと比較、測定したグラフである。Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅの特徴を解明したもので、３７℃で７Ｈ９液体培地での成長速度をＭ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、およびＭ．ｍａｒｉｎｕｍと比較、測定したグラフである。本願の一具現例によりＭ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、およびＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅのＪ７７４ミュリンマクロファージ株に対するインビトロ感染テストを行った結果である。感染を３０℃と３７℃で行った後１日、３日、５日後に細胞を溶解させて７Ｈ１０固体培地に適切希釈倍数に塗抹して３０℃で培養した。その後育ったコロニーの数を計数して比較したグラフである。左側のグラフは、Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、およびＭ．ｍａｒｉｎｕｍの結果を含んで比較したグラフで、右側のグラフは、Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅとＭ．ｇｏｒｄｏｎａｅの間の差を比較したグラフである。本願の一具現例によりＭ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、およびＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅをマウスに感染させた後、肝および脾臓を摘出、均質化して７Ｈ１０固体培地に適切希釈倍数に塗抹して３０℃で培養した結果である。本願の一具現例によりＭ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、およびＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅをマウスに感染させた後、肝および脾臓を摘出、均質化して７Ｈ１０固体培地に適切希釈倍数に塗抹して３０℃で培養した結果である。Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅを利用したＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ関連菌株に対するワクチンテスト結果であり、ワクチン接種手続きを図式的に示す。Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅを利用したＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ関連菌株に対するワクチンテスト結果であり、図５ＡによりＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、７週齢、ｎ＝４）尻尾基底の部分に皮下注射で２回接種した後、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ関連菌株（Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓｓｕｂｓｐ．ｂｏｌｌｅｔｉｉ５０５９４）で攻撃（尻尾静脈注射）、各日付別に臓器を摘出して臓器内Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓｓｕｂｓｐ．ｂｏｌｌｅｔｉｉ５０５９４菌のＣＦＵを測定した結果である。Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅを利用したＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ関連菌株に対するワクチンテスト結果であり、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓｓｕｂｓｐ．ｂｏｌｌｅｔｉｉ５０５９４菌攻撃後３日、１４日目にＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴを行った結果である。Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅを利用したＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａに対するワクチンテスト結果であり、ワクチン接種手続きを図式的に示す。Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅを利用したＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａに対するワクチンテスト結果であり、図６ＡによりＢＣＧおよびＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、７週齢、ｎ＝６）尻尾基底の部分に実験群に応じてワクチンさせた後、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａで攻撃（尻尾静脈注射）、各日付別に臓器を摘出して臓器内Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａ菌のＣＦＵを測定した結果である。Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅを利用したＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａに対するワクチンテスト結果であり、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａ菌攻撃後４週、８週目に得た脾臓細胞を対象にＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴを行った結果である。Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅを利用したＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａに対するワクチンテスト結果であり、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａ菌攻撃後４週、８週目に得た脾臓細胞を抗原（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａ全体タンパク）と反応させて培養後細胞培養液内のＩＦＮ−、ＴＮＦ−およびＩＬ−２に対するＥＬＩＳＡを行った結果である。Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅを利用したＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａに対するワクチンテスト結果であり、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａ菌攻撃後４週、８週目に得た血清内抗原と反応する（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａ全体タンパクおよびＡｇ８５Ｂタンパク）ＩｇＧ２ａ抗体をＥＬＩＳＡで確認した結果である。

本願は、ゆっくり育つ癌発色菌である新規なマイコバクテリア菌株の発見および前記菌株がマイコバクテリア感染症に対するワクチンとして有用であるとの発見に基づいたものである。

本願に係る菌株は、肺感染患者から分離されたものであり、１６ｓＲＮＡ分析、抗酸性（ａｃｉｄｆａｓｔｎｅｓｓ）分析、生長特徴および系統分析結果、マイコバクテリア群に属するＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｏｒｄｏｎａｅに近い（９９．０％配列相同性）菌株と判明された。

本願で分離された菌株は、形態学的にはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｏｒｄｏｎａｅと類似するが、これとは異なり本願の菌株は、最適成長温度は２５〜３０℃であり、３７℃では育たない温度敏感性菌株であることが分かった。また、脂質分析、ｈｓｐ６５およびｒｐｏＢに基づいた系統分析およびＤＮＡ−ＤＮＡ関連性分析結果、新しい菌株と判明され、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅと命名され、２０１４年７月１７日、韓国生命工学研究院微生物資源センターに寄託番号ＫＣＴＣ１２６２８ＢＰで寄託された。

本願に係る新規な温度敏感性マイコバクテリアＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅ（ｓｔｒａｉｎ４９０６１）は、マイコバクテリアに対する感染予防に効果的に使用でき、従って一様態で本願は新規な温度敏感性マイコバクテリアＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅ（ｓｔｒａｉｎ４９０６１）を含む免疫原性、ワクチンまたは免疫治療用組成物に関する。

マイコバクテリアは、結核のような肺疾患、リンパ節炎、皮膚および軟組織感染、骨感染症または播種性疾患の原因菌として知られている。例えば、カメ結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｈｅｌｏｎａｅ−Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓｃｏｍｐｌｅｘ）に属するマイコバクテリアは、免疫能があるかまたは免疫力が弱化された対象体で免疫浸透性皮膚および軟組織感染、結核、血液炎症または膿瘍を引き起こす（ＧｒｉｆｆｉｔｈＤＥｅｔａｌ．，ＡｍＲｅｖＲｅｓｐｉｒＤｉｓ．１９９３；１４７：１２７１−８；ＷａｌｌａｃｅＲＪＪｒ，ｅｔａｌ．，ＲｅｖＩｎｆｅｃｔＤｉｓ．１９８３；５：６５７−７９）。

本願に係るワクチンは、このようなマイコバクテリア感染症に対する疾患に対するワクチンとして使用できる。一具現例で、ＮＴＭ（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）またはウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ）を含むマイコバクテリアの感染に対する保護効果を示す。他の実現例で、ＮＴＭは、例えばカメ結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｈｅｌｏｎｅｉｃｏｍｐｌｅｘ）、Ｍ．ａｖｉｕｍｃｏｍｐｌｅｘ（ＭＡＣ）、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、またはＭ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅを含む。また、本願のワクチンの効果があるＮＴＭは、迅速発育ＮＴＭを含む。

本願に係る一具現例で、本願のワクチン組成物は、特にカメ結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｈｅｌｏｎａｅ−Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓｃｏｍｐｌｅｘ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）またはウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ）等を含むマイコバクテリアによる疾患に対するワクチンとして使用できる。

本願に係るワクチン組成物は、マイコバクテリアに対する免疫反応、例えば、抗体産生および／またはＴ−細胞反応を誘導することができ、これによってカメ結核菌群および結核菌、ウシ型結核菌を含むマイコバクテリア感染を予防するか、または感染による症状を軽減、緩和および／または治療することができる。

本願に係る組成物に使用されるマイコバクテリアＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅ（ｓｔｒａｉｎ４９０６１）は前述したように、生きている生菌、または化学的または熱で死滅した死菌または不活性化菌が使用できる。生菌の場合、弱毒化過程を経たものが使用できる。弱毒化は公知の方法によって行われ、これを介してバクテリアの病原性を減少させるか無くすことができる。一具現例で、本願に係るワクチンは、本願明細書に記載された通り温度敏感性菌株として生菌として安全性があるため、弱毒化過程を経ずに使用でき、他の種類の菌株を使用したワクチンと比較して差別的長所を有する。

一具現例で、本願は生菌として使用される。本願に係る組成物に使用されるＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅは、温度敏感性菌株で生菌の状態で使用されることが特に有利であり得る。生菌ワクチンは、不活性化ワクチンと比較して先天免疫および適応免疫反応を誘導することができ、防御免疫誘導に有利である。また、生菌ワクチンは、持続的抗原刺激による記憶免疫細胞を形成することができ、免疫に有利である。本願に係るＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅは、本願に係る実施例に記載された通り、感染後臓器内で比較菌株として使用されたＭ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｂｏｖｉｓＢＣＧと比較してＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ）が低く、これは本願に係るワクチンは安全性があり、従って生菌ワクチンとして使用できて、他の種類の菌株を使用したワクチンと比較して差別的長所を有する。

本願に係るワクチン組成物は、全身または局所投与用に剤形化でき、薬学的に可能な賦形剤、担体および／または媒体、例えばリン酸緩衝食塩水溶液、蒸溜水、水／油エマルジョン、湿潤剤、エマルジョン化剤、ｐＨ調節剤などを含むことができるが、これらに制限されない。

本願に係るワクチン組成物は、さらにアジュバント、特にＴ−細胞媒介反応を促進または増加させることができる任意の物質または化合物を含むことができる。一具現例で、アジュバントは、化学的または熱によって死滅された菌が組成物に含まれる場合に使用できる。アジュバントは、当業界に公知されていて、例えば、アルミニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート、アルミニウムポタシウムサルフェート、架橋ポリアクリル酸重合体、ＤＤＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−ａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）、免疫調節物質、ラクトフェリン、またはＩＦＮ−ｇａｍｍａ誘導剤などが使用できる。一具現例で、前記架橋ポリアクリル酸重合体は、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）単一重合体または共重合体を含み、前記免疫調節物質は、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、またはＩＬ−１２を含み、前記ＩＦＮ−ｇａｍｍａ誘導剤は、ｐｏｌｙＩ：Ｃを含むことができるが、これに制限されない。一具現例で、前記アルミニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート、またはアルミニウムポタシウムサルフェートは、約０．０５重量％〜０．１重量％で含まれて、前記架橋ポリアクリル酸重合体は、０．２５重量％で含まれるが、これに制限されない。

本願に係る組成物は、局所または全身投与され、一回または多回投与され、様々な経路、例えば、皮下、血内、筋肉内、または静脈で投与されるか、または経口、鼻腔、または吸入経路で投与され得る。本願に係る一具現例では、筋肉内注射で一回投与される。ワクチンの投与量は、投与経路、対象体または患者の年齢、体重、基底疾患、性別および／または健康状態により異なって、本願明細書の記載および当業界の常識を考慮して当業者なら適切な量を決めることができる。

本願に係るワクチン組成物は、投与経路に適合した液状溶液または懸濁剤で製造されるかまたは注射する前に溶液に溶解または懸濁される固形の形態で剤形化できる。

他の様態で、本願はさらに本願に係るワクチン組成物の治療的に有効量をマイコバクテリア感染症治療または予防が必要な対象体に投与する段階を含む、マイコバクテリア感染症予防または治療方法に関する。

本願で治療的有効量とは、本願に係る効果、例えば、マイコバクテリア感染症の予防または治療効果を示すのに必要な投与期間の間の投与量を意味する。治療的に有効な量は、投与経路、投与回数、対象体の疾患状態、性別、基底疾患、体重、および／または本願に係るワクチン組成物が対象体で効果を示す程度などによって異なる。治療的に有効な量は、治療効果が副作用または毒性より上回る量に決められる。当業者なら当業界の知識を考慮して各対象体別に治療的に有効な量を実験的に決めることができる。

本願で対象体とは、マイコバクテリア感染症の治療または予防が必要な哺乳類、特にヒトである。

本願で治療とは、本願に係る組成物の投与で疾患の症状を好転させるか良好に変更するすべての行為を意味する。本願が属する技術分野で通常の知識を有する者なら、大韓医学協会などで提示された資料を参照して疾患の正確な基準を把握して、改善、向上および治療された程度を判断することができる。

本願に係る一具現例でマイコバクテリア感染症は、ＮＴＭ（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）またはウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ）によるものである。他の具現例で、ＮＴＭは、カメ結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｈｅｌｏｎｅｉｃｏｍｐｌｅｘ）、マイコバクテリウムアビウムコンプレックス（Ｍ．ａｖｉｕｍｃｏｍｐｌｅｘ）（ＭＡＣ）、マイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウムイントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウムカンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウムアブセサス（Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、またはマイコバクテリウムマシリエンス（Ｍ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ）を含む。

本願に係るワクチンの効果があるマイコバクテリア感染症は、肺疾患、リンパ節炎、皮膚軟組織感染症、骨感染症、または播種性疾患を含み、技術分野の当業者ならこれらの疾患の定義、判断基準を正確に把握して本願に係るワクチン治療が必要な対象体または患者を判別することができる。

本願に係る方法に使用されるワクチンに含まれる菌は、生菌、弱毒化生菌または不活性化菌であり、特に温度敏感性菌株として、生菌で安全かつより効果的に使用できる。当業者なら具体的な感染菌または疾患の種類、感染の程度または疾患の程度、対象体の基底疾患などを考慮して適切な量を投与することができる。

本願に係る方法に使用されるワクチンは、アジュバントを追加で含むことができ、当業者なら具体的な感染菌または疾患の種類、感染の程度または疾患の程度、対象体の基底疾患などを考慮してワクチンと共に使用されるアジュバントを選択できて、例えば、アジュバントは、アルミニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート、アルミニウムポタシウムサルフェート、架橋ポリアクリル酸重合体、ＤＤＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−ａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）、免疫調節物質、ラクトフェリン、またはＩＦＮ−ｇａｍｍａ誘導剤の中の一つ以上を含む。一具現例で、架橋ポリアクリル酸重合体は、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）単一重合体または共重合体を含み、前記リンフォカインは、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、またはＩＬ−１２を含み、前記ＩＦＮ−ｇａｍｍａ誘導剤は、ｐｏｌｙＩ：Ｃを含むことができる。他の具現例で、架橋ポリアクリル酸重合体は、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）単一重合体または共重合体を含み、前記リンフォカインは、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＩＬ−１、Ｌ−２、またはＩＬ−１２を含み、前記ＩＦＮ−ｇａｍｍａ誘導剤は、ｐｏｌｙＩ：Ｃを含む。

以下、本発明の理解を助けるために実施例を提示する。しかし下記の実施例は、本発明をより理解し易くするために提供されるだけで、本発明が下記の実施例に限定されるのではない。

［実施例１］菌株分離および同定

症状がある肺感染患者由来の痰試料から従来に記述されたとおり（Ｍｕｎｅｔａｌ．，（２００８）．Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｅｎｕｅｎｓｅｓｐ．ｎｏｖ．，ａｓｌｏｗｌｙｇｒｏｗｉｎｇ，ｎｏｎ−ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｓｐｅｃｉｅｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｅｒｒａｅｃｏｍｐｌｅｘ．ＩｎｔＪＳｙｓｔＥｖｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ５８，６４１−６４６．）のように菌株を分離した。

分離された菌株は、関連菌株であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｓｉａｔｉｃｕｍＡＴＣＣ２５２７６ＴおよびＭ．ｇｏｒｄｏｎａｅＡＴＣＣ１４４７０Ｔに対して従来に記述されたとおり生化学分析を行った（Ｋｅｎｔ＆Ｋｕｂｉｃａ，（１９８５）．ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ：ａＧｕｉｄｅｆｏｒｔｈｅＬｅｖｅｌＩＩＩＬａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ａｔｌａｎｔａ：ＣｅｎｔｅｒｓｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．１９８５；Ｐｆｙｆｆｅｒ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ：Ｇｅｎｅｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄｓｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．ＩｎＭａｎｕａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＣＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、９ｔｈｅｄｎ，ｖｏｌ．１，ｐ．５５９，５７３−５７８．ＥｄｉｔｅｄｂｙＰ．Ｒ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｅ．Ｊ．Ｂａｒｏｎ，Ｊ．Ｈ．Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ｌ．Ｌａｎｄｒｙ＆Ｍ．Ａ．Ｐｆａｌｌｅｒ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：ＡｍｅｒｉｃａｎＥＸＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．）。

要約すると、コロニー形態、暗環境で色素沈着、光誘導および様々な温度での成長の有無、ナイアシン蓄積、ナイトレートレダクターゼ、Ｔｗｅｅｎ８０加水分解、ウレアーゼおよびピラジンアミダーゼ、ＴＣＨ（ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄｈｙｄｒａｚｉｄｅ）耐性、ＰＮＢ（ｐ−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏａｔｅ）、５％塩化ナトリウム、エタンブトール、およびピクリン酸分析をＯＡＤＣ（ＯｌｅｉｃＡｌｂｕｍｉｎＤｅｘｔｒｏｓｅＣａｔａｌａｓｅ）で補充されたＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ１０寒天プレートで６週間培養して行った。

結果は表１に記載されている。

表１で１、２、３は使用された菌株を示しており、次のとおりである：１．本願菌株Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅ（ｓｔｒａｉｎ４９０６１）；２．Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕｍＡＴＣＣ２５２７６^Ｔ；３．Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅＡＴＣＣ１４４７０^Ｔ。符号説明は次のとおりである：＋＋＋，Ｓｔｒｏｎｇｇｒｏｗｔｈ；＋＋、ｇｏｏｄｇｒｏｗｔｈ；＋、ｐｏｓｉｔｉｖｅｇｒｏｗｔｈ；−、ｎｅｇａｔｉｖｅ／ｎｏｇｒｏｗｔｈ；±、ｖａｒｉａｂｌｅ。すべての菌株はスムーズ型集落を示し、４５℃で成長しなかった。

形態学的に曲がった形が多い棒状の抗酸性を示す菌株で顕微鏡的には胞子やフィラメントは観察されなかった。最適な成長温度は２５℃〜３０℃であり、３７℃または４５℃では成長しなかった。Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ１０寒天プレートでオレンジ色のスムーズ型集落を示した。ピクリン酸を含む培地では成長しておらず、ウレアーゼ活性は陽性であった。ＤＮＡ−ＤＮＡ関連度分析で最も関連性のある種は７０％未満であった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを利用した脂質分析で他の種と異なることが示され、１６ＳｒＲＮＡ（１３９３ｂｐ）、ｒｐｏＢ（３０６ｂｐ）、およびｈｓｐ６５（６０３ｂｐ）遺伝子でユニークな配列を有することが示された（図１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄ参照）。また、系統分析を介して分離された菌株は、ゆっくり育つマイコバクテリアであることが示された。１６ｓＲＮＡは属を区分して、ｈｓｐ６５、ＲＰＯｂは種間を区分できる遺伝子で、１６ＳｒＲＮＡ、ｈｓｐ６５遺伝子塩基配列は、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅと近いが、それぞれの塩基配列相同性は９９％、９５．９％で、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅとは特異的な配列を有しており、ｒｐｏＢ遺伝子塩基配列は、Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕｍと近いが、塩基配列相同性９５．４％でこれも特異的な塩基配列を有していることを確認することができた（図１Ａ）。このような結果は、本願に係る菌株が新規であることを示すものである。

本バクテリアは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅと命名されて２０１４年７月１７日、韓国生命工学研究院微生物資源センターに寄託番号ＫＣＴＣ１２６２８ＢＰで寄託された。

［実施例２］Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅ菌株の温度敏感性特徴確認および安全性分析

生ワクチンで接種する場合の安全性を証明するために次の実験を行った。

まず、実際に温度敏感性マイコバクテリア菌株（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅ，ｓｔｒａｉｎ４９０６１）が３７℃で育たないか確認するために、他の比較菌株（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ、およびＭ．ｍａｒｉｎｕｍ）と初期接種量を吸光度で同じに合わせた後、液体培地（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９）で３０℃、３７℃温度により生長の有無を時間別に（１、３、５、７日）吸光度（ＯＤ_６００）で測定した。結果は図２に記載されている。これに示された通り温度敏感性マイゴバクテリアＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅ（ｓｔｒａｉｎ４９０６１）は、正常体温（３７℃）に該当する温度で育たなかったが、それより低い温度（３０℃）では良く育つことを確認することができる。

次に感染分析を行った。感染分析は、液体培地および固体培地培養時、Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅ菌株が３７℃で育たない特徴を有していたため、実際大きい食細胞に感染させた時にも温度による差を示すか否かを確認するためのものである。このために、３０℃と３７℃でマクロファージ（Ｊ７７４細胞株、ＡＴＣＣＴＩＢ−６７^ＴＭ）に菌を感染（〜１×１０^７、１０Ｍ．Ｏ．Ｉ．）させた後、細胞を融解した後（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ^ＴＭＸ−１００が含まれたＰＢＳを添加してピペット操作で細胞を引き離す）、７Ｈ１０固体培地に塗抹後３０℃で培養した後、生成されたコロニー数を計測した。

結果は図３に記載されている。これに示された通り、比較菌株とは異なって３７℃で感染させたＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅはほとんど育たないことが示された。

また、インビボ実験でＢＡＬＢ／ｃマウス（７週齢、ｎ＝３）にＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅおよび比較菌株（１０^６ＣＦＵ）を静脈注射して感染させた後、肝と脾臓を１、４、７日目に摘出、均質化してリン酸緩衝溶液で希釈した後、７Ｈ１０固体培地にプレーティングした後３０℃で培養してＣＦＵを測定した。

結果は、図４Ａに記載され、これに示された通り、肝または脾臓でＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅの生長を測定した場合、他の菌株に比較してほとんど育たないことが示され、これは本願菌株が生体に使用時安全であることを示す。

また、インビボ実験でＢＡＬＢ／ｃマウス（７週齢、ｎ＝３）にＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅおよび比較菌株（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、またはＭ．ｂｏｖｉｓＢＣＧ）（１０^６ＣＦＵｉｎ１００μｌＰＢＳ）を静脈注射して感染させた後、肝と脾臓を１、４、７日目（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍと比較時）または、１、７、１４日目（Ｍ．ｂｏｖｉｓＢＣＧと比較時）に摘出、均質化してリン酸緩衝溶液で希釈した後７Ｈ１０固体培地にプレーティングした後３０℃で培養してＣＦＵを測定した。

結果は、図４Ｂに記載されて、これに示された通り、肝、肺、または脾臓でＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅの生長を測定した場合、他の菌株に比較してほとんど育たないことが示された。

［実施例３］Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅワクチン分析

引き続き、ワクチン分析を下記の通り行った。第一に、図５Ａの手続きのようにＡＬＢ／ｃｍｏｕｓｅ（７週齢、ｎ＝４）に１０^６ＣＦＵのＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅ（ｓｔｒａｉｎ４９０６１）を尻尾に２回（０週および８週）静脈注射した。対照群としては、ＰＢＳとＢＣＧを使用した。引き続き、１２週にＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ関連菌株（Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓｓｕｂｓｐ．ｂｏｌｌｅｔｉｉ５０５９４）〜１０^６ＣＦＵを尻尾の下の部分に皮下注射した。引き続き、３日、１４日後に各臓器（肝、脾臓、肺）別Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓｓｕｂｓｐ．ｂｏｌｌｅｔｉｉ５０５９４のＣＦＵを実施例２同様に測定した。Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓｓｕｂｓｐ．ｂｏｌｌｅｔｉｉ５０５９４菌で攻撃して１４日後に脾臓を摘出して、脾臓細胞内にＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓｓｕｂｓｐ．ｂｏｌｌｅｔｉｉ５０５９４菌株の全体タンパク質を処理した時ＩＦＮ−γを分泌する細胞数を測定するために、ＥＬＩＳＰＯＴを実施した。具体的に、ＰＶＤＦ膜がある９６ウェルプレートにＩＦＮ−γ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｓｅ，Ｃａｔ．，１６−７３１３−８５，３μｇ／ｍｌ）を入れて４℃に一日培養した。翌日各ウェルを洗浄した後、完全培地（ＤＭＥＭ＋抗生剤＋１０％ＦＢＳ）で満たして３７℃に培養した。各マウスの脾臓を摘出して７０μｍｃｅｌｌｓｔｒａｉｎｅｒで脾臓細胞を得て各群の脾臓細胞数を約５×１０^５細胞に合わせた後培養させておいたＰＶＤＦがコーティングされた９６ウェルプレートの各ウェルに追加した。引き続き、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓｓｕｂｓｐ．ｂｏｌｌｅｔｉｉ５０５９４全体タンパク１０μｇ／ｍｌを抗原処理群に処理して、残りは完全培地で処理した。陽性対照群でＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌｍｙｒｉｓｔａｔｅａｃｅｔａｔｅ）（５ｎｇ／ｍｌ）とｉｏｎｏｎｍｙｃｉｎ（５００ｎｇ／ｍｌ）を処理した。その後、３７℃で一日培養して翌日洗浄後検出抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｓｅ，Ｃａｔ．，１３−７３１１−８５，３μｇ／ｍｌ）を各ウェルに処理した。引き続き、４℃で一日培養した後各ウェルを洗浄した後、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰを処理して２時間室温培養後洗浄してＡＥＣｓｕｂｓｔｒａｔｅ発色キット（Ｄａｋｏ）を製造者の方法に従って使用して発色した後、スポットを確認した。第二に、図６Ａの記載された方法のようにＢＡＬＢ／ｃｍｏｕｓｅ（７週齢、ｎ＝６）に１０^６ＣＦＵのＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅ（ｓｔｒａｉｎ４９０６１）を尻尾の下の部分に２回（０週および８周）皮下注射してワクチン分析を行った。実験群は次のとおりである：実験群１：ＰＢＳ２回皮下注射、実験群２：ＢＣＧ２回皮下注射、実験群３：ＢＣＧ１回皮下注射後Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅ１回皮下注射、実験群４：Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅ２回皮下注射。引き続き、１２週に非病原性結核菌であるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａ〜１０^６ＣＦＵを尻尾静脈注射した。引き続き、４週後に各臓器（肝、脾臓、肺）別Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７ＲａのＣＦＵを実施例２と同様に測定した。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａ菌で攻撃して４週と８週後に脾臓を摘出して、脾臓細胞内にＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａ菌株の全体タンパクを処理した時ＩＦＮ−γを分泌する細胞数を測定するためのＥＬＩＳＰＯＴと抗原処理後細胞培養液に放出されたＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−２に対するＥＬＩＳＡを実施した。ＥＬＩＳＡの場合、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ（ＴＮＦ−α，Ｃａｔ．Ｎｏ．，ＤＹ４１０）またはＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社（ＩＦＮ−γ，Ｃａｔ．Ｎｏ．，４３０８０５；ＩＬ−２，Ｃａｔ．Ｎｏ．，４３１００２）から提供するキットを製造者の方法し従って行った。引き続き、４週と８週後に集めた血液サンプルから血清を分離して血清内Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａ全体タンパクおよびＡｇ８５Ｂ抗原に反応するｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ２ａタイプの発現差を分析するために、ＩｇＧ２ａに対するＥＬＩＳＡを行った。

結果は、図５および図６に記載されている。図５Ｂの場合、Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅをワクチンさせたマウス臓器でＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓｓｕｂｓｐ．ｂｏｌｌｅｔｉｉ５０５９４のＣＦＵがＰＢＳや他のＭ．ｇｏｒｄｏｎａｅおよびＭ．ｂｏｖｉｓＢＣＧをワクチンさせたマウス臓器でより低いＣＦＵを示す。また、ＩＦＮ−γに対するＥＬＩＳＰＯＴ施行時Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅを接種したマウスでより多くのｓｐｏｔが観察された。ワクチンテスト後ＣＦＵ結果から、Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅがＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓｓｕｂｓｐ．ｂｏｌｌｅｔｉｉ５０５９４に対する防御能を与えたことを示す。

また、既存のＭ．ｂｏｖｉｓＢＣＧと比較してＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ関連菌株のＣＦＵをさらに減少させることにより、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ関連菌株に対する防御能がさらに高いことを示している。また、脾臓細胞内Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓｓｕｂｓｐ．ｂｏｌｌｅｔｉｉ５０５９４に対する防御免疫細胞の数がＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅをワクチンとして使用した場合、ＢＣＧより多いことを、ＥＬＩＳＰＯＴを介して確認したところ、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓｓｕｂｓｐ．ｂｏｌｌｅｔｉｉ５０５９４を含むカメ結核菌群に対する効果的な防御能を与える可能性があることを示す。

図６Ｂの場合、Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅをワクチンさせたマウス臓器でＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７ＲａのＣＦＵがＰＢＳ処理群に比べてずっと低いＣＦＵを示し、ＢＣＧを２回ワクチンさせたグループに比べてＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅを２回ワクチンさせたグループのＣＦＵが統計的に有意に低いＣＦＵを示す。ＩＦＮ−に対するＥＬＩＳＰＯＴ施行時Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅを２回ワクチンさせたマウス脾臓細胞でＢＣＧおよび二つの菌株をワクチンさせたマウス脾臓細胞に比べてより多くのｓｐｏｔが統計的有意性を示して観察された（図６Ｃ）。また、各実験群で摘出した脾臓細胞をＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａ全体タンパクで刺激させた後、細胞培養液に発現されたサイトウカインをＥＬＩＳＡで確認した時、Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅ菌株でワクチンさせた脾臓細胞で防御免疫に関与するＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２の発現がＰＢＳ実験群だけでなく他の実験群に比べて有意に増加することを確認することができた（図６Ｄ）。最後に、各実験群マウスの血清内Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａに対するＩｇＧ２ａ抗体の発現程度をＥＬＩＳＡで確認した。ＩｇＧ２ａ抗体は主にＴｈ１−ｔｙｐｅ免疫反応によって形成されて、ワクチン効能と関連している抗体ｉｓｏｔｙｐｅとして知られている。ＩｇＧ２ａ抗体ＥＬＩＳＡ結果、ＰＢＳまたはＢＣＧをワクチンさせた実験群に比べてＭ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅでワクチンさせた実験群の血清サンプル内にＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａ全体タンパク質およびＡｇ８５Ｂ抗原に対するＩｇＧ２ａ抗体が有意に多く存在していることを確認することができた（図６Ｅ）。これらの結果は、Ｍ．ｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅがＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓｓｕｂｓｐ．ｂｏｌｌｅｔｉｉ５０５９４およびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｓｏｓＨ３７Ｒａに対する防御能を与えたことを示す。

さらに本願に係るワクチンは、自然に温度に敏感な特徴を有するため、安全性も担保されて、ヒトだけでなく動物にもカメ結核菌群、結核およびウシ型結核菌を含むマイコバクテリア感染症に対するワクチンとして効果的に使用できる可能性があることを示すものである。

以上、本願の例示的な実施例に対し詳細に説明したが、本願の権利範囲はこれに限定されるのではなく、次の請求範囲で定義している本願の基本概念を利用した当業者の様々な変形および改良形態も本願の権利範囲に属するものである。

本発明で使用されたすべての技術用語は、別に定義されない以上、本発明の関連分野で通常の当業者が一般的に理解するものと同じ意味として使用される。本明細書に参考文献と記載されるすべての刊行物の内容は本発明に取り込まれる。

受託機関名：ＫＣＴＣ韓国生物資源センター
受託番号：ＫＣＴＣ１２６２８ＢＰ
受託日：２０１４年０７月１７日

Claims

寄託番号ＫＣＴＣ１２６２８ＢＰのマイコバクテリウムパラゴルドネ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅ，ｓｔｒａｉｎ４９０６１）菌株および薬学的に許容可能な賦形剤を含むことを特徴とするマイコバクテリア感染症に対するワクチン組成物。
前記マイコバクテリア感染症は、ＮＴＭ（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、またはウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ）によるものであることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
前記ＮＴＭは、カメ結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｈｅｌｏｎａｅｃｏｍｐｌｅｘ）、マイコバクテリウムアビウムコンプレックス（Ｍ．ａｖｉｕｍｃｏｍｐｌｅｘ）（ＭＡＣ）、マイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウムイントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウムカンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウムアブセサス（Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、またはマイコバクテリウムマシリエンス（Ｍ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ）であることを特徴とする請求項２に記載のワクチン組成物。
前記マイコバクテリア感染症は、肺疾患、リンパ節炎、皮膚軟組織、骨感染症、または播種性疾患であることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
前記菌株は生きているかまたは死んでいるものであることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
前記組成物は、アジュバントを追加で含むものであることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
前記アジュバントは、アルミニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート、アルミニウムポタシウムサルフェート、架橋ポリアクリル酸重合体、ＤＤＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−ａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）、免疫調節物質、ラクトフェリン、またはＩＦＮ−ｇａｍｍａ誘導剤の中の一つ以上であることを特徴とする請求項６に記載のワクチン組成物。
前記架橋ポリアクリル酸重合体は、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）単一重合体または共重合体を含み、前記免疫調節物質、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、またはＩＬ−１２を含み、前記ＩＦＮ−ｇａｍｍａ誘導剤は、ｐｏｌｙＩ：Ｃを含むものであることを特徴とする請求項７に記載のワクチン組成物。
前記アルミニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート、またはアルミニウムポタシウムサルフェートは、０．０５重量％〜０．１重量％で含まれて、前記架橋ポリアクリル酸重合体は、０．２５重量％で含まれるものであることを特徴とする請求項７に記載のワクチン組成物。
治療有効量の請求項１乃至請求項９のうちいずれか一つに記載のワクチン組成物を含むことを特徴とするマイコバクテリア感染症予防剤または治療剤。
前記マイコバクテリア感染症は、ＮＴＭ（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、またはウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ）によるものであることを特徴とする請求項１０に記載のマイコバクテリア感染症予防剤または治療剤。
前記ＮＴＭは、カメ結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｈｅｌｏｎａｅｃｏｍｐｌｅｘ）、マイコバクテリウムアビウムコンプレックス（Ｍ．ａｖｉｕｍｃｏｍｐｌｅｘ）（ＭＡＣ）、マイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウムイントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウムカンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウムアブセサス（Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、またはマイコバクテリウムマシリエンス（Ｍ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ）であることを特徴とする請求項１１に記載のマイコバクテリア感染症予防剤または治療剤。
前記マイコバクテリア感染症は、肺疾患、リンパ節炎、皮膚軟組織感染症、骨感染症、または播種性疾患であることを特徴とする請求項１０に記載のマイコバクテリア感染症予防剤または治療剤。
前記菌株は、生菌、弱毒化生菌または不活性化菌であることを特徴とする請求項１０に記載のマイコバクテリア感染症予防剤または治療剤。
前記組成物は、アジュバントを追加で含むものであることを特徴とする請求項１０に記載のマイコバクテリア感染症予防剤または治療剤。
前記アジュバントは、アルミニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート、アルミニウムポタシウムサルフェート、架橋ポリアクリル酸重合体、ＤＤＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−ａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）、免疫調節物質、ラクトフェリン、またはＩＦＮ−ｇａｍｍａ誘導剤の中の一つ以上であることを特徴とする請求項１５に記載のマイコバクテリア感染症予防剤または治療剤。
前記架橋ポリアクリル酸重合体は、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）単一重合体または共重合体を含み、前記免疫調節物質は、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、またはＩＬ−１２を含み、前記ＩＦＮ−ｇａｍｍａ誘導剤は、ｐｏｌｙＩ：Ｃを含むものであることを特徴とする請求項１６に記載のマイコバクテリア感染症予防剤または治療剤。
寄託番号ＫＣＴＣ１２６２８ＢＰのマイコバクテリウムパラゴルドネ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒａｇｏｒｄｏｎａｅ，ｓｔｒａｉｎ４９０６１）菌株。