CN104127883A - 以hsp65为表位支架的多t细胞表位结核基因疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了以HSP65为表位支架的多T细胞表位结核基因疫苗，在载体中插入嵌合有来自结核分枝杆菌抗原的5个T细胞表位多肽基因的HSP65蛋白的全长基因。该疫苗的制备方法是在HSP65全长基因中插入5个来自结核分枝杆菌抗原中的T细胞表位基因EAST-6_1-60、Ag85B_{721 - 765}、MTB10.4_7-33、PPE25_{721 - 765} 和PE19_{10 - 54}。该结核基因疫苗通过将基因疫苗与脱乙酰壳聚糖形成纳米颗粒复合物滴鼻免疫小鼠，证实可诱导针对HSP65载体的血清IgG和肺SIgA应答，同时诱导多结核抗原表位特异性的较强的分泌高水平IFNγ的细胞免疫应答，是一种潜在预防和治疗结核病的疫苗。

Description

以HSP65为表位支架的多T细胞表位结核基因疫苗

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，涉及一种结核病的基因疫苗及其制备方法和应用，特别是涉及一种以结核分枝杆菌热休克蛋白65（HSP65）为表位支架的多T细胞表位结核基因疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

结核病的死灰复燃是全球重大的健康问题，由于常规BCG疫苗对肺结核预防的无效性、结核耐药菌株的出现、以及HIV感染导致的结核合并感染，肺结核的发病及死亡目前居高不下，形势十分严重。全球每年有800万活动性结核患者并导致300万死亡；我国约有5.5亿人口曾经感染结核，每年约有12万新发病人，13万人死于结核。2006年起结核已一跃成为我国感染性疾病的发病首位，研制新型结核预防疫苗和治疗性疫苗非常迫切。

卡介苗（BCG）是目前为止唯一获准用于预防结核病的疫苗，虽然BCG能预防儿童结核病和成人的肺外结核病，却未能有效预防成人肺结核的发生。同时BCG的免疫保护效果在不同地区不同种族中存在显著差异。其原因可能在于BCG与结核分枝杆菌的野生型毒株H37Rv相比，缺失了一些序列。

结核研究表明，诱导Th1型的和多功能的T细胞免疫应答对于清除巨噬细胞内感染的结核杆菌至关重要，诱导分泌IFNγ的CD4＋Th1、CD8＋CTL的产生及诱导多功能Th 1（IFNγ+IL-2+TNF<+的CD4＋T）应答据报道可有效保护动物抵抗结核分枝杆菌攻击。基因疫苗及DNA疫苗，是将外源目的基因构建于真核表达质粒、将基因直接免疫动物的第三代疫苗，由于其可在体内表达目的抗原，通过外源性、内源性以及交叉抗原提呈途径被DC细胞提呈，有效激活CD4＋Th1和CD8＋CTL细胞，因此特别有利于诱导Th1型免疫应答。

抗原表位又称为抗原决定簇，是指被抗原受体TCR和BCR特异性识别的抗原最小的结构和功能单位。一般来说，只有位于抗原表面的表位易与抗原识别受体BCR或抗体结合，称功能性表位，而位于分子内部的表位难以被BCR识别；TCR虽然识别经过降解的小分子多肽，但是由于蛋白的剪切需要正确的侧翼序列，因此通常位于抗原表面的具有良好空间构象的表位容易被正确剪切而后被MHC分子提呈并被TCR识别。表位由于分子量小，结构简单，故免疫原性较弱，且在体内易降解，单独使用很难引起较强的免疫应答和免疫记忆。

多表位基因疫苗是通过基因工程的方法将多个表位进行串联或嵌合表达在某一基因载体中，通过载体作用使表位的免疫原性得以增强。表位若直接串联很可能会失去在天然蛋白中的空间伸展性和构象，难以被B细胞表面的BCR识别，同时由于缺乏必要的侧翼序列，难以被正确剪切成为T细胞表位，因此被TCR良好识别的概率也较低。通常要在多个表位之间插入适当的侧翼序列才能保证T细胞表位的正确剪切。如将表位嵌合入大分子蛋白结构中，则表位同时获得了被BCR识别所需的空间构象和TCR识别所需的侧翼序列，因此，是一种构建多个T细胞表位疫苗的良好方法。同时，多个T细胞表位的良好构筑，有望同时激活多个T细胞表位特异性的T细胞应答，实现更为全面有效的抗结核免疫保护。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以结核分枝杆菌来源HSP65为表位支架的多T表位结核基因疫苗及其制备方法和应用，所述的这种以HSP65为表位支架的多T表位结核基因要解决由于常规BCG疫苗的无效性、以及结核耐药菌株的出现和AIDS病导致的结核感染使得现有疫苗预防和治疗结核病的效果不佳的技术问题。

本发明提供了一种以HSP65为表位支架的多T表位结核基因，由一个载体构成，在所述的载体中插入有结核分枝杆菌H37Rv株来源的HSP65的全长基因，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的HSP65的全长基因中嵌合有来自结核杆菌抗原的5个T细胞表位多肽基因，所述的5个T细胞表位分别是结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的1～60位基因，结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的721～765位基因，结核分枝杆菌H37Rv株来源的MTB10.4蛋白的7～33位基因，结核分枝杆菌H37Rv株来源的PPE25蛋白的 721～765位基因，结核分枝杆菌H37Rv株来源的PE19蛋白的10～54位基因，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的的热休克蛋白HSP65基因的DNA序列如SEQ ID NO：2所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的1～60位基因的DNA序列如SEQ ID NO:4所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的721～765位基因的DNA序列如SEQ ID NO:6所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的MTB10.4蛋白的7～33位基因的DNA序列如SEQ ID NO:8所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的PPE25蛋白的 721～765位基因的DNA序列如SEQ ID NO:10所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的PE19蛋白的10～54位基因的DNA序列如SEQ ID NO:12所示。在结核分枝杆菌H37Rv株来源的的HSP65全长基因中的第438位碱基后插入结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的1～60位基因、第453位碱基后插入结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的721～765位基因、第471位碱基后插入结核分枝杆菌H37Rv株来源的MTB10.4蛋白的7～33位基因、第1185位碱基后插入结核分枝杆菌H37Rv株来源的PPE25蛋白的721～765位基因和结核分枝杆菌H37Rv株来源的PE19蛋白的10～54位基因，所述的MTB10.4蛋白的7～33位基因后嵌入gccgcctac基因序列。嵌合了结核分枝杆菌H37Rv株来源的5个T细胞表位基因的HSP65的全长基因所构成的外源目的基因的DNA序列如SEQ ID NO：14所示。

进一步的，所述的载体为真核表达质粒，所述的真核表达质粒选自pcDNA3.1质粒、或pVAX1质粒。

进一步的，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的的热休克蛋白HSP65的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源ESAT-6蛋白的1～60位基因的氨基酸序列ESAT-6_1－20如SEQ ID NO:3所示。

进一步的，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源Ag85B蛋白的721～765位基因的氨基酸序列Ag85B_241－255如SEQ ID NO:5所示。

进一步的，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源MTB10.4蛋白的7～33位基因的氨基酸序列MTB10.4_3－11如SEQ ID NO:7所示。

进一步的，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源PPE25蛋白的721～765位基因的氨基酸序列PPE25_241－255如SEQ ID NO:9所示。

进一步的，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源PE19蛋白的10～54位基因的氨基酸序列PE19_4－18如SEQ ID NO:11所示。

进一步的，嵌合了结核分枝杆菌H37Rv株来源的5个T细胞表位基因的热休克蛋白HSP65的全长基因所构成的外源目的基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。

本发明还提供了上述的以HSP65为表位支架的多T表位结核基因疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1）              提取结核分枝杆菌H37Rv株DNA作为模板，通过PCR方法扩增热休克蛋白HSP65编码基因；

2）              以上述HSP65基因作为模板，分别通过PCR扩增双链DNA片段1、片段3、片段4，其中片段3与片段4有17个碱基重叠序列。所述的片段1的双链DNA的序列为 

atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac

taccggttct gttaacgcat gctgcttctc cgggcagcgc cggagctcgc cccgaacttg

gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa

cgggagcggc tacgccattt ccactgtaac ccggggttcc cggcgttgca gcaggacctt

aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag

ttcttcaccc cacgggggtg ctagtggttg ctaccacaca ggtagcggtt cctctagctc

ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc

gacctcctag gcatgctctt ctagccgcgg ctcgaccagt ttctccatcg gttcttctgg

gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc

ctactgcagc ggccactgcc gtggtgctgc cggtggcacg accgggtccg caaccaagcg

gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa

ctcccggacg cgttgcagcg ccggccgcgg ttgggcgagc cagagtttgc gccgtagctt

aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag

ttccggcacc tcttccagtg gctctgggac gagttcccgc ggttcctcca gctctggttc

gagcagattg cggccaccat gacagagcag cagtggaatt tcgcgggtat cgaggccgcg

ctcgtctaac gccggtggta ctgtctcgtc gtcaccttaa agcgcccata gctccggcgc

gcaagcgcaa tccagggagc agcgatttcg gcg

cgttcgcgtt aggtccctcg tcgctaaagc cgc

所述的片段3的双链DNA的序列为

ggtgaccagt ccatcggtca aatcatgtac aactaccccg cgatggccgc ctacgacctg

ccactggtca ggtagccagt ttagtacatg ttgatggggc gctaccggcg gatgctggac

atcgccgagg cgatggacaa ggtgggcaac gagggcgtca tcaccgtcga ggagtccaac

tagcggctcc gctacctgtt ccacccgttg ctcccgcagt agtggcagct cctcaggttg

acctttgggc tgcagctcga gctcaccgag ggtatgcggt tcgacaaggg ctacatctcg

tggaaacccg acgtcgagct cgagtggctc ccatacgcca agctgttccc gatgtagagc

gggtacttcg tgaccgaccc ggagcgtcag gaggcggtcc tggaggaccc ctacatcctg

cccatgaagc actggctggg cctcgcagtc ctccgccagg acctcctggg gatgtaggac

ctggtcagct ccaaggtgtc cactgtcaag gatctgctgc cgctgctcga gaaggtcatc

gaccagtcga ggttccacag gtgacagttc ctagacgacg gcgacgagct cttccagtag

ggagccggta agccgctgct gatcatcgcc gaggacgtcg agggcgaggc gctgtccacc

cctcggccat tcggcgacga ctagtagcgg ctcctgcagc tcccgctccg cgacaggtgg

ctggtcgtca acaagatccg cggcaccttc aagtcggtgg cggtcaaggc tcccggcttc

gaccagcagt tgttctaggc gccgtggaag ttcagccacc gccagttccg agggccgaag

ggcgaccgcc gcaaggcgat gctgcaggat atggccattc tcaccggtgg tcaggtgatc

ccgctggcgg cgttccgcta cgacgtccta taccggtaag agtggccacc agtccactag

agcgaagagg tcggcctgac gctggagaac gccgacctgt cgctgctagg caaggcccgc

tcgcttctcc agccggactg cgacctcttg cggctggaca gcgacgatcc gttccgggcg

aaggtcgtgg tcaccaagga cgagaccacc atcgtcgagg gcgccggtga caccgacgcc

ttccagcacc agtggttcct gctctggtgg tagcagctcc cgcggccact gtggctgcgg

atcgccggac gagtggccca gatccgccag gagatcgaga acagcgactc cgactacgac

tagcggcctg ctcaccgggt ctaggcggtc ctctagctct tgtcgctgag gctgatgctg

cgtgagaagc tgcaggagcg gctggccaag ctggccggtg gtgtcgcggt gatcaaggcc

gcactcttcg acgtcctcgc cgaccggttc gaccggccac cacagcgcca ctagttccgg

ggtgccgcca ccgaggtcga actcaaggag cgcaagcacc gcatcgaggc gcagttcttc

ccacggcggt ggctccagct tgagttcctc gcgttcgtgg cgtagctccg cgtcaagaag

gcctcgatcg cacagcagct gaccttcggc ccagtgacca ca

cggagctagc gtgtcgtcga ctggaagccg ggtcactggt gt

所述的片段4的双链DNA的序列为

ttcggcccag tgaccacaca gccggaagcc ctggcagctg cggcggcgaa cctagatgcg

aagccgggtc actggtgtgt cggccttcgg gaccgtcgac gccgccgctt ggatctacgc

gttcgcaatg ccaaggccgc cgtcgaggag ggcatcgtcg ccggtggggg tgtgacgctg

caagcgttac ggttccggcg gcagctcctc ccgtagcagc ggccaccccc acactgcgac

ttgcaagcgg ccccgaccct ggacgagctg aagctcgaag gcgacgaggc gaccggcgcc

aacgttcgcc ggggctggga cctgctcgac ttcgagcttc cgctgctccg ctggccgcgg

aacatcgtga aggtggcgct ggaggccccg ctgaagcaga tcgccttcaa ctccgggctg

ttgtagcact tccaccgcga cctccggggc gacttcgtct agcggaagtt gaggcccgac

gagccgggcg tggtggccga gaaggtgcgc aacctgccgg ctggccacgg actgaacgct

ctcggcccgc accaccggct cttccacgcg ttggacggcc gaccggtgcc tgacttgcga

cagaccggtg tctacgagga tctgctcgct gccggcgttg ctgacccggt caaggtgacc

gtctggccac agatgctcct agacgagcga cggccgcaac gactgggcca gttccactgg

cgttcggcgc tgcagaatgc ggcgtccatc gcggggctgt tcctgaccac cgaggccgtc

gcaagccgcg acgtcttacg ccgcaggtag cgccccgaca aggactggtg gctccggcag

gttgccgaca agccggaaaa ggagaaggct tccgttcccg gtggcggcga catgggtggc

caacggctgt tcggcctttt cctcttccga aggcaagggc caccgccgct gtacccaccg

atggatttc

tacctaaag

3）              以上述的片段1作为模板，通过PCR扩增双链DNA片段2，得到的片段2与片段3有17个碱基重叠序列。所述的片段2的双链DNA的序列为 

atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac

taccggttct gttaacgcat gctgcttctc cgggcagcgc cggagctcgc cccgaacttg

gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa

cgggagcggc tacgccattt ccactgtaac ccggggttcc cggcgttgca gcaggacctt

aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag

ttcttcaccc cacgggggtg ctagtggttg ctaccacaca ggtagcggtt cctctagctc

ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc

gacctcctag gcatgctctt ctagccgcgg ctcgaccagt ttctccatcg gttcttctgg

gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc

ctactgcagc ggccactgcc gtggtgctgc cggtggcacg accgggtccg caaccaagcg

gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa

ctcccggacg cgttgcagcg ccggccgcgg ttgggcgagc cagagtttgc gccgtagctt

aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag

ttccggcacc tcttccagtg gctctgggac gagttcccgc ggttcctcca gctctggttc

gagcagattg cggccaccat gacagagcag cagtggaatt tcgcgggtat cgaggccgcg

ctcgtctaac gccggtggta ctgtctcgtc gtcaccttaa agcgcccata gctccggcgc

gcaagcgcaa tccagggagc agcgatttcg gcgcaggatg cgtacaacgc cgcgggcggg

cgttcgcgtt aggtccctcg tcgctaaagc cgcgtcctac gcatgttgcg gcgcccgccc

cacaacgccg tgttcaacgg tgaccagtcc atcggt

gtgttgcggc acaagttgcc actggtcagg tagcca

4）              将上述的片段3与片段4混合，变性成为单链，通过彼此重叠的17个碱基互补连接，以此作为模板，通过PCR方法扩增获得片段5，片段5嵌合有PPE25及PE19表位，片段5与片段2有17个彼此重叠的碱基序列，所述的片段5的双链DNA的序列为：

ggtgaccagt ccatcggtca aatcatgtac aactaccccg cgatggccgc ctacgacctg

ccactggtca ggtagccagt ttagtacatg ttgatggggc gctaccggcg gatgctggac

atcgccgagg cgatggacaa ggtgggcaac gagggcgtca tcaccgtcga ggagtccaac

tagcggctcc gctacctgtt ccacccgttg ctcccgcagt agtggcagct cctcaggttg

acctttgggc tgcagctcga gctcaccgag ggtatgcggt tcgacaaggg ctacatctcg

tggaaacccg acgtcgagct cgagtggctc ccatacgcca agctgttccc gatgtagagc

gggtacttcg tgaccgaccc ggagcgtcag gaggcggtcc tggaggaccc ctacatcctg

cccatgaagc actggctggg cctcgcagtc ctccgccagg acctcctggg gatgtaggac

ctggtcagct ccaaggtgtc cactgtcaag gatctgctgc cgctgctcga gaaggtcatc

gaccagtcga ggttccacag gtgacagttc ctagacgacg gcgacgagct cttccagtag

ggagccggta agccgctgct gatcatcgcc gaggacgtcg agggcgaggc gctgtccacc

cctcggccat tcggcgacga ctagtagcgg ctcctgcagc tcccgctccg cgacaggtgg

ctggtcgtca acaagatccg cggcaccttc aagtcggtgg cggtcaaggc tcccggcttc

gaccagcagt tgttctaggc gccgtggaag ttcagccacc gccagttccg agggccgaag

ggcgaccgcc gcaaggcgat gctgcaggat atggccattc tcaccggtgg tcaggtgatc

ccgctggcgg cgttccgcta cgacgtccta taccggtaag agtggccacc agtccactag

agcgaagagg tcggcctgac gctggagaac gccgacctgt cgctgctagg caaggcccgc

tcgcttctcc agccggactg cgacctcttg cggctggaca gcgacgatcc gttccgggcg

aaggtcgtgg tcaccaagga cgagaccacc atcgtcgagg gcgccggtga caccgacgcc

ttccagcacc agtggttcct gctctggtgg tagcagctcc cgcggccact gtggctgcgg

atcgccggac gagtggccca gatccgccag gagatcgaga acagcgactc cgactacgac

tagcggcctg ctcaccgggt ctaggcggtc ctctagctct tgtcgctgag gctgatgctg

cgtgagaagc tgcaggagcg gctggccaag ctggccggtg gtgtcgcggt gatcaaggcc

gcactcttcg acgtcctcgc cgaccggttc gaccggccac cacagcgcca ctagttccgg

ggtgccgcca ccgaggtcga actcaaggag cgcaagcacc gcatcgaggc gcagttcttc

ccacggcggt ggctccagct tgagttcctc gcgttcgtgg cgtagctccg cgtcaagaag

gcctcgatcg cacagcagct gaccttcggc ccagtgacca cacagccgga agccctggca

cggagctagc gtgtcgtcga ctggaagccg ggtcactggt gtgtcggcct tcgggaccgt

gctgcggcgg cgaacctaga tgcggttcgc aatgccaagg ccgccgtcga ggagggcatc

cgacgccgcc gcttggatct acgccaagcg ttacggttcc ggcggcagct cctcccgtag

gtcgccggtg ggggtgtgac gctgttgcaa gcggccccga ccctggacga gctgaagctc

cagcggccac ccccacactg cgacaacgtt cgccggggct gggacctgct cgacttcgag

gaaggcgacg aggcgaccgg cgccaacatc gtgaaggtgg cgctggaggc cccgctgaag

cttccgctgc tccgctggcc gcggttgtag cacttccacc gcgacctccg gggcgacttc

cagatcgcct tcaactccgg gctggagccg ggcgtggtgg ccgagaaggt gcgcaacctg

gtctagcgga agttgaggcc cgacctcggc ccgcaccacc ggctcttcca cgcgttggac

ccggctggcc acggactgaa cgctcagacc ggtgtctacg aggatctgct cgctgccggc

ggccgaccgg tgcctgactt gcgagtctgg ccacagatgc tcctagacga gcgacggccg

gttgctgacc cggtcaaggt gacccgttcg gcgctgcaga atgcggcgtc catcgcgggg

caacgactgg gccagttcca ctgggcaagc cgcgacgtct tacgccgcag gtagcgcccc

ctgttcctga ccaccgaggc cgtcgttgcc gacaagccgg aaaaggagaa ggcttccgtt

gacaaggact ggtggctccg gcagcaacgg ctgttcggcc ttttcctctt ccgaaggcaa

cccggtggcg gcgacatggg tggcatggat ttc

gggccaccgc cgctgtaccc accgtaccta aag

5）              将上述的片段2与片段5混合，变性成为单链，通过彼此重叠的17个碱基互补连接，以此作为模板，通过PCR方法扩增获得嵌合了5个T细胞表位的HSP65外源目的基因，将目的基因经双酶切后与经同样双酶切的载体连接，获得权利要求1所述的以HSP65为表位支架的多T表位结核基因疫苗。

进一步的，以SEQ ID NO：15所示的HSP65上游引物T1和SEQ ID NO：16所示的T2引物通过PCR扩增片段1。

进一步的，以SEQ ID NO：18所示的引物 T4序列和SEQ ID NO：19所示的引物 T5序列通过PCR扩增片段3。

进一步的，以SEQ ID NO：20所示的引物T6序列和SEQ ID NO：21 所示的HSP65下游引物T7通过PCR扩增片段4。

进一步的，以SEQ ID NO：15所示的HSP65上游引物T1和SEQ ID NO：17所示的T3引物，以片段1为模板，通过PCR方法扩增出片段2；

进一步的，以SEQ ID NO：18所示的T4引物和SEQ ID NO：21所示的HSP65下游引物T7，以片段3、4混合并变性为单链、互补连接后的基因为模板，通过PCR方法扩增出片段5；

进一步的，以SEQ ID NO：15所示的HSP65上游引物T1和SEQ ID NO：21所示的HSP65下游引物T7以片段2、5混合并变性为单链、互补连接后的基因为模板，通过PCR方法扩增得到嵌合了5个T细胞表位的结核杆菌HSP65外源目的基因。

进一步的，嵌合了5个T细胞表位的HSP65外源目的基因插入载体的酶切位点分别为EcoRI和Hind III位点。

进一步的，所有抗原来自结核分枝杆菌H37Rv株。

进一步的，所述的载体选自pcDNA3.1质粒、或pVAX1质粒。

本发明还提供了一种药物组合物，含有有效量的上述的以HSP65为表位支架的多T表位结核基因疫苗。进一步的，还含有药学上可接受的载体或者赋形剂。

本发明还提供了上述的以HSP65为表位支架的多T表位结核基因疫苗在制备治疗和预防结核病的药物中的应用。

本发明通过查阅相关文献，从结核分枝杆菌H37Rv株的已知的5种关键抗原ESAT-6、Ag85B、MTB10.4、PPE25和PE19中各自筛选了一个T细胞表位。这5种结核抗原的特征是：

1）ESAT-6，又称Rv3875，全长288bp，95个氨基酸，分子量9.9KD，仅在H37Rv毒株中存在。含有多个T细胞表位，能激活CD4⁺、CD8⁺ T细胞，在抗结核保护性免疫中起重要作用。ESAT-6还可刺激结核病人的外周血T细胞增殖并释放IFN-γ。用ESAT-6和佐剂制成的亚单位疫苗免疫小鼠具有较好的保护性，文献提示ESAT-6的1-60位基因所编码的氨基酸序列ESAT-6_1－20是一个很好的Th1表位；

2）Ag85B，又称MPT59、Rv1886，285氨基酸，分子量34.6KD。是一种结核分枝杆菌转移酶，与细菌细胞壁合成有关。具有多个T细胞表位，能诱导Th1反应及IFN-γ产生。文献提示Ag85B的第721-765位基因所编码的氨基酸序列Ag85B_241－255是较强的CD8⁺CTL表位；

3）MTB10.4，结核杆菌感染早期分泌性蛋白，ESAT-6家族的成员之一，结核患者及BCG接种人群外周血单核细胞均对Mtb10.4刺激产生强烈的免疫应答，文献提示MTB10.4的7-33位基因所编码的氨基酸序列MTB10.4_3－11是一个较好的CD8⁺CTL细胞表位；

4）PPE25和PE19是PPE及PE家族成员之一，其基因位点位于ESX-5中，ESX-5抗原核酸疫苗比BCG的保护效果更好，文献提示PPE25的第721-765位基因所编码的氨基酸序列PPE25_241－255和PE19的第10-54位基因所编码的氨基酸序列PE_4－18是较好的Th1表位；与H37Rv毒株相比，BCG传代过程中丢失ESAT-6基因。本发明所选择的上述5个表位既含有BCG的优势抗原表位，又含有H37Rv特有而BCG缺失的抗原表位，可同时激活CD4+T和CD8+T细胞应答。然而表位仅有8－20个氨基酸，免疫原性很弱，通常不能诱导很强的免疫应答。因此有必要采用一种载体，将5个T细胞表位插入载体基因中，组间免疫原性较强的含多个T细胞表位的结核外源目的基因。

本发明选择结核分枝杆菌H37Rv来源的热休克蛋白65（HSP65）作为嵌入T细胞表位的基因载体。HSP65是热休克蛋白60家族成员，在细菌和人均高度保守。全长1623bp，编码540个氨基酸，分子量65kD。以其作为T细胞表位的载体的原因在于：1）HSP是已知的重要的结核保护性抗原，内含多个T细胞和B细胞表位，HSP65作为目的抗原免疫小鼠可产生抗结核强保护性免疫应答，且与产生IFN-γ的CD8⁺/CD44^hi细胞有关。2）HSP作为细胞内伴侣蛋白，参与蛋白质转位、折叠和装配，可帮助嵌入的表位更好地折叠形成空间结构。

综上，本发明通过查阅文献选择了5个结核T细胞表位：ESAT-6蛋白的1～60位基因（EAST-6_1-60）、Ag85B蛋白的721～765位基因（Ag85B_721-765）、MTB10.4蛋白的7～33位基因（MTB10.4_7-33）、PPE25蛋白的721～765位基因（PPE25_721-765）和PE19蛋白的10～54位基因（PE19_10-54）。分别将其插入结核分枝杆菌来源的HSP65基因的第438位、第453位、第471位、第1185位碱基后，获得了含有5个结核T细胞表位和一个结核蛋白的多T细胞表位结核外源目的基因（简称PES）。将该基因插入pcDNA3.1或pVAX1 质粒中，构建了一种多T细胞表位结核基因疫苗，由5个结核T细胞表位嵌合到结核HSP65蛋白的3个非关键结构位置所共同构成。经结构分析，5个表位的嵌入基本不影响HSP65本身的正常三级、四级空间结构，我们将这一嵌合有5个T细胞表位的HSP65结核基因疫苗称为PES（Poly-epitope casted in HSP65 skeloton）“以HSP65为表位支架的多T表位”疫苗。

本发明中，所述的真核表达质粒载体，包括任何可转染哺乳动物细胞的高效真核表达质粒载体，包括但不限于：pcDNA3.1、pVAX以及常见和市售的真核质粒载体。

本发明中，HSP65蛋白编码基因和5个T细胞表位的获得，可以通过多种方式获得，包括但不限于：1）化学合成DNA；2）通过适当引物以PCR技术扩增得到DNA。

本发明中，为诱导良好的肺部黏膜免疫应答，我们采用滴鼻免疫的方式。为在鼻咽局部进行免疫，以天然阳离子生物多糖-壳聚糖(chitosan)系多聚物与PES基因疫苗与以共凝聚法制备纳米颗粒复合物，chitosan-DNA的制备方法为：在55度水浴中，将0.02%、pH5.7的chitosan溶液逐滴滴入800ug/ml质粒中，同时高速振荡30s，即可形成均一略带混浊的复合物。以本领域技术人员熟知的常规技术进行滴鼻：小鼠经麻醉后，以枪头吸取50-60μl新鲜chitosan-DNA（PES）复合物，逐滴滴入小鼠两侧鼻孔，枪头不接触小鼠皮肤，可分2次滴入。除了选用chitosan作为基因疫苗黏膜递送载体，还可使用oligo-chitosan(壳寡糖)与质粒DNA形成纳米级别的颗粒复合物。chitosan-DNA疫苗每隔2周滴鼻免疫1次，每次免疫的DNA含量为50μg，共免疫4次。除滴鼻免疫外，也可选用其他有效的基因疫苗递送方式，包括但不限于：肌肉注射、基因枪技术、电穿孔辅助技术等。

本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和动物而无过度不良副反应（如毒性、刺激、变态反应）、有合理效益/风险比的物质。

本发明中，“药学上可接受的载体”成分是用于将具有活性的有效成分传送给人或动物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂和赋形剂。所述的载体可以是液体、固体或半固体。载体包括但不限于：水、PBS缓冲液、生理盐水、葡萄糖、甘油、叠氮钠及其组合。

本发明和与已有技术相对照，其效果是积极和明显的。本发明的结核基因疫苗是一种质粒DNA疫苗，其中外源目的基因是嵌合有5个T细胞表位的HSP65基因，其中5个T细胞表位和HSP65蛋白均可单独诱导结核特异性T细胞应答，因此理论上这一基因疫苗至少可诱导6种结核抗原特异性T细胞应答，其中既包括CD4+T细胞应答，也包括CD8+CTL应答；同时借助HSP65载体蛋白的空间支撑和伴侣蛋白作用，5个T细胞表位的免疫原性显著增强。将该疫苗经壳聚糖（chitosan）或壳寡糖(oligo-chitosan)复合行黏膜递送，即以滴鼻方式免疫小鼠，可同时诱导多抗原特异性的全身免疫和肺部黏膜免疫应答。本发明的具体实施例中，通过将PES基因疫苗与chitosan形成纳米颗粒复合物滴鼻免疫小鼠，证实可诱导针对多个结核抗原的特异性的分泌高水平IFNγCD4⁺T及CD8⁺T细胞应答，以及针对HSP65的血清IgG与肺灌洗液SIgA，因此比常规结核疫苗针对的结核抗原更多，诱导的免疫应答扩展至肺黏膜，有望在结核分枝杆菌感染肺脏早期，有效清除细菌，因此是一种潜在的可预防和治疗结核病的优良疫苗。

附图说明

图1显示了本发明的pcDNA3.1载体质粒和以HSP65为表位支架的多T表位结核基因疫苗的外源目的基因的构建模式图。

图2显示了构建多T细胞表位基因疫苗的具体步骤：通过HSP65上游引物T1/T2、T4/T5、T6/HSP65下游引物T7三对引物分别扩增得到双链DNA片段1（1-513bp）、片段3(559-1380bp) 、片段4(1363-1851bp)，而后以片段1为模板，通过引物T1、T3扩增得到双链DNA片段2(1-576bp)，以片段3和片段4为模板，以引物T4、引物T7,通过彼此重叠的17个碱基互补相连得到片段5(559-1851bp),最后以片段2和片段5为模板，通过彼此重叠的17个碱基互补相连，经HSP65上游引物T1和HSP65下游引物T7扩增获得嵌合5个T细胞表位的HSP65全长基因，其中，粗体带下划线的序列是插入的5个T细胞表位序列。

图3显示了本发明的以HSP65为表位支架的多T表位结核基因疫苗的PCR（图3A）、酶切（图3B）及部分测序鉴定结果（图3C）。

图4显示了本发明的以HSP65为表位支架的多T表位结核基因疫苗滴鼻免疫小鼠诱导的特异性血清IgG和肺灌洗液SIgA。图A显示免疫后第10周的HSP65抗原特异性IgG的效价；图B显示HSP65特异性SIgA效价。

图5显示了本发明的以HSP65为表位支架的多T表位结核基因疫苗免疫小鼠诱导的特异性细胞免疫应答。图A显示了经胞内IFNγ和IL-2染色后的流式结果；图B显示了脾脏淋巴细胞IFNγELISPOT检测结果；图C显示了肺脏淋巴细胞IFNγELISPOT检测结果。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中采用的质粒、菌种、细胞、动物及试剂如下：

质粒、菌种、细胞、动物：结核分枝杆菌标准H37Rv株（上海市疾病预防控制中心结防科提供）。质粒pcDNA3.1(-)、pET32a、宿主细菌DH5α 、BL21(Invitrogen公司购买)。引物合成委托上海赛百盛公司。6周龄雌性C57BL/6(H-2K^b)小鼠购自上海斯莱克动物中心。多肽： EAST-6_1-20、Ag85B_241-255、MTB10.4_3-11 、PPE25_241-255 及PE19_4-18 由吉尔生化上海有限公司合成，纯度>90%。 

分子生物学试剂：限制性核酸内切酶EcoR I、Hind III（TaKaRa公司）、T4 DNA连接酶（MBI公司)；Taq DNA聚合酶(Promega公司)；RNase A(Ameresco公司)；dNTP(Promega和华美生物公司)；LB培养基(英国OXOID公司)，琼脂粉、琼脂糖、SDS、EB (上海化学试剂采购供应站)，Tris(USB公司)，琼脂糖胶回收试剂盒（上海华舜生物制品公司），大量质粒抽提试剂盒（Qiagen Plasmid Mega Kit）。chitosan（分子量380000～420000，脱乙酰度为75%-85%，sigma公司）。

免疫学试剂和材料：PerCP标记的抗CD4的抗体、PerCP标记的抗CD8的抗体、 FITC标记的抗IFN-γ的抗体, PE标记的抗IL-2的抗体(BD公司)；IFNγELISPOT试剂盒(BD公司) ；HRP标记羊抗小鼠IgG、IgA多克隆抗体（Southern Biotech公司）。

实施例1： pcDNA3-PES结核基因疫苗的构建

通过查阅相关文献，选择5个结核分枝杆菌H37Rv株来源的T细胞表位：ESAT-6蛋白的1～60位基因（EAST-6_1-60）；Ag85B蛋白的721～765位基因（Ag85B_721-765）；MTB蛋白的7～33位基因（MTB10.4_7-33）；PPE25蛋白的721～765位基因（PPE25_721-765）；PE19蛋白的10～54位基因（PE19_10-54）。如图1所示，以pcDNA3.1或pVAX为质粒载体，以HSP65基因作为嵌合表位的基因载体，经计算机预测其二级结构的基础上，在其中不影响关键结构的位置：第438位碱基后插入ESAT-6的1～60位基因、第453位碱基后插入Ag85B的721～765位基因、第471位碱基后插入MTB10.4的7～33位基因、第1185位碱基后插入PPE25的721～765位基因和所述PE19的10～54位基因，MTB10.4蛋白的7～33位基因后连接gccgcctac基因序列。

为了不在HSP65基因和T细胞表位基因之间引入酶切位点，本发明利用DNA引物直接合成和PCR的方法，从5‘和3’端依次扩增三段包含部分HSP65基因和T细胞表位的基因片段，片段1，片段3，片段4，以片段1为模板扩增出片段2，以片段3、片段4变性后通过彼此重叠的互补序列连接扩增出片段5，最后以片段2、片段5变性后通过彼此重叠的互补序列连接，用5’和3’两端HSP65上、下引物PCR扩增出嵌合有5个T细胞表位的HSP65全长基因。同时在基因两端分别带上EcoR I和Hind III酶切位点，经双酶切后可连接入载体pcDNA3.1(-)或原核表达载体pET32a。

首先提取结核分枝杆菌H37Rv株DNA作为模板，用HSP65上游引物（SEQ ID NO：15）和下游引物（SEQ ID NO：21）通过PCR方法扩增获得HSP65片段，回收并纯化PCR产物。

以HSP65基因作为模板，分别以HSP65上游引物T1（SEQ ID NO：15）和T2引物（SEQ ID NO：16）通过PCR扩增片段1（如图2所示HSP65上游引物和T1相对，经PCR扩增得到的1－513bp双链DNA片段），所述的片段1的双链DNA的序列为：

atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac

taccggttct gttaacgcat gctgcttctc cgggcagcgc cggagctcgc cccgaacttg

gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa

cgggagcggc tacgccattt ccactgtaac ccggggttcc cggcgttgca gcaggacctt

aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag

ttcttcaccc cacgggggtg ctagtggttg ctaccacaca ggtagcggtt cctctagctc

ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc

gacctcctag gcatgctctt ctagccgcgg ctcgaccagt ttctccatcg gttcttctgg

gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc

ctactgcagc ggccactgcc gtggtgctgc cggtggcacg accgggtccg caaccaagcg

gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa

ctcccggacg cgttgcagcg ccggccgcgg ttgggcgagc cagagtttgc gccgtagctt

aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag

ttccggcacc tcttccagtg gctctgggac gagttcccgc ggttcctcca gctctggttc

gagcagattg cggccaccat gacagagcag cagtggaatt tcgcgggtat cgaggccgcg

ctcgtctaac gccggtggta ctgtctcgtc gtcaccttaa agcgcccata gctccggcgc

gcaagcgcaa tccagggagc agcgatttcg gcg

cgttcgcgtt aggtccctcg tcgctaaagc cgc

以T4引物（SEQ ID NO：18）和T5引物（SEQ ID NO：19）通过PCR扩增片段3（如图2所示T4引物和T5相对，经PCR扩增得到的559-1380bp双链DNA片段），所述片段3的双链DNA的序列为：

ggtgaccagt ccatcggtca aatcatgtac aactaccccg cgatggccgc ctacgacctg

ccactggtca ggtagccagt ttagtacatg ttgatggggc gctaccggcg gatgctggac

atcgccgagg cgatggacaa ggtgggcaac gagggcgtca tcaccgtcga ggagtccaac

tagcggctcc gctacctgtt ccacccgttg ctcccgcagt agtggcagct cctcaggttg

acctttgggc tgcagctcga gctcaccgag ggtatgcggt tcgacaaggg ctacatctcg

tggaaacccg acgtcgagct cgagtggctc ccatacgcca agctgttccc gatgtagagc

gggtacttcg tgaccgaccc ggagcgtcag gaggcggtcc tggaggaccc ctacatcctg

cccatgaagc actggctggg cctcgcagtc ctccgccagg acctcctggg gatgtaggac

ctggtcagct ccaaggtgtc cactgtcaag gatctgctgc cgctgctcga gaaggtcatc

gaccagtcga ggttccacag gtgacagttc ctagacgacg gcgacgagct cttccagtag

ggagccggta agccgctgct gatcatcgcc gaggacgtcg agggcgaggc gctgtccacc

cctcggccat tcggcgacga ctagtagcgg ctcctgcagc tcccgctccg cgacaggtgg

ctggtcgtca acaagatccg cggcaccttc aagtcggtgg cggtcaaggc tcccggcttc

gaccagcagt tgttctaggc gccgtggaag ttcagccacc gccagttccg agggccgaag

ggcgaccgcc gcaaggcgat gctgcaggat atggccattc tcaccggtgg tcaggtgatc

ccgctggcgg cgttccgcta cgacgtccta taccggtaag agtggccacc agtccactag

agcgaagagg tcggcctgac gctggagaac gccgacctgt cgctgctagg caaggcccgc

tcgcttctcc agccggactg cgacctcttg cggctggaca gcgacgatcc gttccgggcg

aaggtcgtgg tcaccaagga cgagaccacc atcgtcgagg gcgccggtga caccgacgcc

ttccagcacc agtggttcct gctctggtgg tagcagctcc cgcggccact gtggctgcgg

atcgccggac gagtggccca gatccgccag gagatcgaga acagcgactc cgactacgac

tagcggcctg ctcaccgggt ctaggcggtc ctctagctct tgtcgctgag gctgatgctg

cgtgagaagc tgcaggagcg gctggccaag ctggccggtg gtgtcgcggt gatcaaggcc

gcactcttcg acgtcctcgc cgaccggttc gaccggccac cacagcgcca ctagttccgg

ggtgccgcca ccgaggtcga actcaaggag cgcaagcacc gcatcgaggc gcagttcttc

ccacggcggt ggctccagct tgagttcctc gcgttcgtgg cgtagctccg cgtcaagaag

gcctcgatcg cacagcagct gaccttcggc ccagtgacca ca

cggagctagc gtgtcgtcga ctggaagccg ggtcactggt gt

以T6引物（SEQ ID NO：20）和HSP65 下游引物T7（SEQ ID NO：21）通过PCR扩增片段4（如图2所示T6引物和HSP65下游引物T7相对，经PCR扩增得到的1363-1851bp双链DNA片段），所述的片段4的双链DNA的序列为：

ttcggcccag tgaccacaca gccggaagcc ctggcagctg cggcggcgaa cctagatgcg

aagccgggtc actggtgtgt cggccttcgg gaccgtcgac gccgccgctt ggatctacgc

gttcgcaatg ccaaggccgc cgtcgaggag ggcatcgtcg ccggtggggg tgtgacgctg

caagcgttac ggttccggcg gcagctcctc ccgtagcagc ggccaccccc acactgcgac

ttgcaagcgg ccccgaccct ggacgagctg aagctcgaag gcgacgaggc gaccggcgcc

aacgttcgcc ggggctggga cctgctcgac ttcgagcttc cgctgctccg ctggccgcgg

aacatcgtga aggtggcgct ggaggccccg ctgaagcaga tcgccttcaa ctccgggctg

ttgtagcact tccaccgcga cctccggggc gacttcgtct agcggaagtt gaggcccgac

gagccgggcg tggtggccga gaaggtgcgc aacctgccgg ctggccacgg actgaacgct

ctcggcccgc accaccggct cttccacgcg ttggacggcc gaccggtgcc tgacttgcga

cagaccggtg tctacgagga tctgctcgct gccggcgttg ctgacccggt caaggtgacc

gtctggccac agatgctcct agacgagcga cggccgcaac gactgggcca gttccactgg

cgttcggcgc tgcagaatgc ggcgtccatc gcggggctgt tcctgaccac cgaggccgtc

gcaagccgcg acgtcttacg ccgcaggtag cgccccgaca aggactggtg gctccggcag

gttgccgaca agccggaaaa ggagaaggct tccgttcccg gtggcggcga catgggtggc

caacggctgt tcggcctttt cctcttccga aggcaagggc caccgccgct gtacccaccg

atggatttc

tacctaaag

以上述的片段1为模板，以HSP65上游引物T1（SEQ ID NO：15）和引物T3（SEQ ID NO：17）通过PCR扩增片段2（如图2 所示HSP65上游引物T1和引物T3相对，经PCR扩增得到的1-576bp双链DNA片段），所述的片段2的双链DNA的序列为

taccggttct gttaacgcat gctgcttctc cgggcagcgc cggagctcgc cccgaacttg

gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa

cgggagcggc tacgccattt ccactgtaac ccggggttcc cggcgttgca gcaggacctt

aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag

ttcttcaccc cacgggggtg ctagtggttg ctaccacaca ggtagcggtt cctctagctc

ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc

gacctcctag gcatgctctt ctagccgcgg ctcgaccagt ttctccatcg gttcttctgg

gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc

ctactgcagc ggccactgcc gtggtgctgc cggtggcacg accgggtccg caaccaagcg

gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa

ctcccggacg cgttgcagcg ccggccgcgg ttgggcgagc cagagtttgc gccgtagctt

aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag

ttccggcacc tcttccagtg gctctgggac gagttcccgc ggttcctcca gctctggttc

gagcagattg cggccaccat gacagagcag cagtggaatt tcgcgggtat cgaggccgcg

ctcgtctaac gccggtggta ctgtctcgtc gtcaccttaa agcgcccata gctccggcgc

gcaagcgcaa tccagggagc agcgatttcg gcgcaggatg cgtacaacgc cgcgggcggg

cgttcgcgtt aggtccctcg tcgctaaagc cgcgtcctac gcatgttgcg gcgcccgccc

cacaacgccg tgttcaacgg tgaccagtcc atcggt

gtgttgcggc acaagttgcc actggtcagg tagcca

将上述的片段2和片段3混合，变性使各自成为单链DNA，由于片段2、3有17个碱基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，以T4引物（SEQ ID NO：18）和T7引物（SEQ ID NO：21）作为引物，通过PCR方法扩增获得获得片段5（如图2 所示引物T4和引物T7相对，经PCR扩增得到的559-1851bp双链DNA片段），所述的片段5的双链DNA的序列为

ggtgaccagt ccatcggtca aatcatgtac aactaccccg cgatggccgc ctacgacctg

ccactggtca ggtagccagt ttagtacatg ttgatggggc gctaccggcg gatgctggac

atcgccgagg cgatggacaa ggtgggcaac gagggcgtca tcaccgtcga ggagtccaac

tagcggctcc gctacctgtt ccacccgttg ctcccgcagt agtggcagct cctcaggttg

acctttgggc tgcagctcga gctcaccgag ggtatgcggt tcgacaaggg ctacatctcg

tggaaacccg acgtcgagct cgagtggctc ccatacgcca agctgttccc gatgtagagc

gggtacttcg tgaccgaccc ggagcgtcag gaggcggtcc tggaggaccc ctacatcctg

cccatgaagc actggctggg cctcgcagtc ctccgccagg acctcctggg gatgtaggac

ctggtcagct ccaaggtgtc cactgtcaag gatctgctgc cgctgctcga gaaggtcatc

gaccagtcga ggttccacag gtgacagttc ctagacgacg gcgacgagct cttccagtag

ggagccggta agccgctgct gatcatcgcc gaggacgtcg agggcgaggc gctgtccacc

cctcggccat tcggcgacga ctagtagcgg ctcctgcagc tcccgctccg cgacaggtgg

ctggtcgtca acaagatccg cggcaccttc aagtcggtgg cggtcaaggc tcccggcttc

gaccagcagt tgttctaggc gccgtggaag ttcagccacc gccagttccg agggccgaag

ggcgaccgcc gcaaggcgat gctgcaggat atggccattc tcaccggtgg tcaggtgatc

ccgctggcgg cgttccgcta cgacgtccta taccggtaag agtggccacc agtccactag

agcgaagagg tcggcctgac gctggagaac gccgacctgt cgctgctagg caaggcccgc

tcgcttctcc agccggactg cgacctcttg cggctggaca gcgacgatcc gttccgggcg

aaggtcgtgg tcaccaagga cgagaccacc atcgtcgagg gcgccggtga caccgacgcc

ttccagcacc agtggttcct gctctggtgg tagcagctcc cgcggccact gtggctgcgg

atcgccggac gagtggccca gatccgccag gagatcgaga acagcgactc cgactacgac

tagcggcctg ctcaccgggt ctaggcggtc ctctagctct tgtcgctgag gctgatgctg

cgtgagaagc tgcaggagcg gctggccaag ctggccggtg gtgtcgcggt gatcaaggcc

gcactcttcg acgtcctcgc cgaccggttc gaccggccac cacagcgcca ctagttccgg

ggtgccgcca ccgaggtcga actcaaggag cgcaagcacc gcatcgaggc gcagttcttc

ccacggcggt ggctccagct tgagttcctc gcgttcgtgg cgtagctccg cgtcaagaag

gcctcgatcg cacagcagct gaccttcggc ccagtgacca cacagccgga agccctggca

cggagctagc gtgtcgtcga ctggaagccg ggtcactggt gtgtcggcct tcgggaccgt

gctgcggcgg cgaacctaga tgcggttcgc aatgccaagg ccgccgtcga ggagggcatc

cgacgccgcc gcttggatct acgccaagcg ttacggttcc ggcggcagct cctcccgtag

gtcgccggtg ggggtgtgac gctgttgcaa gcggccccga ccctggacga gctgaagctc

cagcggccac ccccacactg cgacaacgtt cgccggggct gggacctgct cgacttcgag

gaaggcgacg aggcgaccgg cgccaacatc gtgaaggtgg cgctggaggc cccgctgaag

cttccgctgc tccgctggcc gcggttgtag cacttccacc gcgacctccg gggcgacttc

cagatcgcct tcaactccgg gctggagccg ggcgtggtgg ccgagaaggt gcgcaacctg

gtctagcgga agttgaggcc cgacctcggc ccgcaccacc ggctcttcca cgcgttggac

ccggctggcc acggactgaa cgctcagacc ggtgtctacg aggatctgct cgctgccggc

ggccgaccgg tgcctgactt gcgagtctgg ccacagatgc tcctagacga gcgacggccg

gttgctgacc cggtcaaggt gacccgttcg gcgctgcaga atgcggcgtc catcgcgggg

caacgactgg gccagttcca ctgggcaagc cgcgacgtct tacgccgcag gtagcgcccc

ctgttcctga ccaccgaggc cgtcgttgcc gacaagccgg aaaaggagaa ggcttccgtt

gacaaggact ggtggctccg gcagcaacgg ctgttcggcc ttttcctctt ccgaaggcaa

cccggtggcg gcgacatggg tggcatggat ttc

gggccaccgc cgctgtaccc accgtaccta aag

将上述的片段2和片段5混合，变性使各自成为单链DNA，由于片段2、5有17个碱基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，以HSP65 上游引物T1（SEQ ID NO：15）和HSP65 下游引物T7（SEQ ID NO：21）作为引物，通过PCR方法扩增获得获得片段（2＋5），即嵌合了5个T细胞表位的HSP65基因，也即PES编码基因（如图2所示）。PCR扩增出的5个片段，如图3A所示。再将扩增产物经EcoR I和Hind III双酶切，回收酶切片段，与经相应酶切的载体pcDNA3.1(-)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选转化菌落。经酶切（图3B）及测序鉴定（图3C），成功构建了pcDNA3-PES真核表达质粒。5段表位基因就以没有酶切位点的方式插入至HSP65基因。

将重组质粒PES转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，经LB（Amp100μg/ml）液体培养基振荡培养12-16h，收集菌体，按照质粒大量提取纯化试剂盒去除杂蛋白、细菌内毒素，得到纯化质粒。

实施例2    pET32a-HSP65原核表达载体的构建及蛋白表达纯化

为获得大量的HSP65蛋白抗原，将扩增得到的HSP65编码基因用EcoR I和Hind III双酶切，与经相应酶切的原核表达载体pET32a连接，构建了pET32a-HSP65原核表达质粒。

以pET32a-HSP65转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，37℃培养过夜，筛选阳性克隆。经LB液体培养基振荡培养至A600达到0.6-1.0，加入异丙基硫代半糖苷（IPTG）至终浓度为1mM。继续振荡培养4小时，4000r/min离心20min收集菌体，1×PBS重悬后超声破碎，12000r/min于4℃离心20min，分别收获上清和沉淀。上清过亲和层析柱，以不同浓度咪唑洗脱液洗脱，收集每1ml洗脱液，保存A280大于1.0的洗脱液，最后经10% SDS-PAGE电泳鉴定表达的蛋白。最后得到纯化融合蛋白HSP65。

实施例3  chitosan-pES结核基因疫苗的制备

1）质粒DNA的大量制备：依照QIAGEN Plasmid Mega Kit进行。

2）分别制备chitosan溶液和pcDNA3.1-PES溶液，方法如下：首先制备0.02%、pH5.7的chitosan溶液，称取0.02g chitosan (Fluka, MW约400000，脱乙酰度75％－85％)，先以500μl-1 ml 1% HAc溶液将其缓慢溶解，37℃放置1hr。而后称取0.042g NaAc，以80ml H₂O溶解，加入上述已彻底溶解的chitosan溶液，混匀后，以1N NaOH调节pH值至5.7，此即0.02%、pH5.7的chitosan溶液。pcDNA3.1-PES质粒以5mM Na₂SO₄溶解，DNA浓度为1mg/ml，-20⁰C保存备用。

3）采用共沉淀法（共凝聚法）制备chitosan-DNA纳米颗粒，方法如下：在55℃水浴中，将0.02%、pH5.7的chitosan溶液逐滴滴入800ug/ml 质粒DNA溶液中，同时15000rpm高速振荡20秒，即可形成均一略带混浊的chitosan-DNA纳米颗粒。

实施例4 pcDNA3-PES基因疫苗滴鼻免疫小鼠

6-8周龄雌性C57BL/6(H-2^b)健康小鼠18只，分为3组：（1）chitosan-pcDNA3.1空质粒对照组；（2）chitosan-pHSP65组；（3）chitosan-PES质粒；（4）BCG组（阳性对照）。采用滴鼻法免疫：0.75%戊巴比妥钠80-120μl 经腹腔注射C57BL/6小鼠，使轻度麻醉后，以含50μg DNA的chitosan-DNA于0周、2周、4周、6周滴鼻免疫小鼠，共4次。BCG组于0周皮下注射1×10⁶BCG 1次。每两周采血，血清-70℃冻存。每两周以500μl PBS对3只小鼠的肺泡进行灌洗，获得小鼠肺泡灌洗液，-70℃冻存。

实施例 5 chitosan-PES滴鼻免疫可诱导结核特异性抗体应答

间接ELISA法检测免疫小鼠的结核抗原HSP65特异性血清IgG和肺灌洗液SIgA。以5μg/ml HSP65蛋白包被聚苯乙烯微孔板（包被液0.1M Na₂CO₃, pH9.6）4℃过夜。以5% milk-PBS封闭板，200μl/孔，37℃2h。依次加100μl/孔1：100稀释血清或者肺灌洗液原液，37℃1h，洗板后加HRP-羊抗小鼠IgG或IgA 37℃1h，洗板后以邻苯二胺显色30min，2N H₂SO₄终止反应后测A₄₉₀值。 

如图4A显示：chitosan-PES结核基因疫苗黏膜免疫四次后在小鼠体内诱生了高水平的HSP65特异性血清IgG，在免疫第4周即可检测到HSP65特异性血清IgG，其水平随时间不断增高，于第10周达到最高，抗体滴度为1:7000，显著高于孔质粒对照组。chitosan-pHSP65组也诱导了高水平的血清IgG，抗体效价为1:8500。chitosan-PES和chitosan-pHSP65均诱生了HSP65特异性肺灌洗液SIgA，于第10周达到最高，效价分别为1:1400和1:1500（图4B）。总之， chitosan-PES疫苗滴鼻免疫诱导了结核载体抗原HSP65特异性血清IgG和肺灌洗液SIgA，提示在HSP65蛋白中插入5感染表位并未显著影响HSP65载体载体蛋白诱导抗体应答的能力，且滴鼻免疫显著诱导了HSP65特异性黏膜SIgA，有助于中和和清除经呼吸道感染的结核杆菌。

实施例6 流式检测分泌IFN-γ、IL-2的多功能T细胞

1）小鼠肺脏局部淋巴细胞细胞的分离

取末次免疫后10天小鼠肺组织分离免疫小鼠肺脏局部淋巴细胞，方法如下：取末次免疫后10天小鼠肺组织，称重约100 mg/只，剪碎置于10ml消化液中（胶原酶(1mg/ml)、DNA酶(5 U/ml)、完全1640），于37°C180 rpm振摇90min。将混悬液过70μM滤网去除碎块，1500rpm离心5min，细胞沉淀重悬于5ml 40% Percoll中，轻柔加至等体积70% Percoll上方，800g离心30 min，吸取分界处淋巴细胞，10 ml PBS洗涤1次，重悬于完全1640中，调整浓度为5×10⁶/ml备用。

取末次免疫后10天小鼠脾脏，制备淋巴细胞悬液，以5×10⁶细胞/孔加入24孔板，每孔1 ml，同时每孔加入1×10⁶细胞正常小鼠灭活脾细胞做为feed cell，加入5种混合肽（终浓度为10uM）, 37℃，5％CO₂培养8小时后，加入豆蔻酰佛波醇乙酯PMA(400μg/ml)使其终深度为50ng/ml，离子霉素（ionomycin）500 ng/ml，培养4小时后加入高尔基体阻断剂10 ug/ml ，培养1－1.5小时后收集细胞。离心，弃上清，PBS洗一遍。加入PerCP标记的抗CD4的抗体和PerCP标记的抗CD8的抗体，4℃避光染色30min。PBS洗1遍，加固定液4℃半小时PBS洗1遍，加穿膜液室温避光30 min，PBS洗1遍，加入含有FITC标记的抗IFN-γ抗体、 PE标记的抗IL-2抗体的穿膜液，4℃避光染色30min。PBS重悬后流式上机检测。

如图5A所示，chi-pPES 显著诱导了结核特异性IFN-γ+IL-2+T细胞的激活，提示该基因疫苗能激活CD4+T和CD8+T细胞分泌高水平的IFN-γ和IL-2，有清除结核分枝杆菌感染的潜能。

实施例 7 ELISPOT检测免疫小鼠脾脏和肺脏IFN-γ+T淋巴细胞

以5μg/ml IFN-γ包被抗体100μl/孔4℃包被过夜，吸去液体，用200μl 完全1640 37℃ 封闭2hr。去液体，取末次免疫后10天小鼠脾脏和肺脏淋巴细胞，重悬于完全1640中，以1×10⁶细胞/孔加入ELISPOT板，随后分别加入特异性抗原HSP65蛋白（10μg/ml）、5种表位多肽 (10μM)或阳性对照ConA(5μg/ml)，37℃，5％CO₂培养60hr，吸弃各孔液体，加200μl冰预冷的去离子水，在冰上放置10min，PBST洗3次。加100μl生物素标记的抗小鼠IFN-γ检测抗体（2μg/ml），37℃放置1 hr。去液体，PBST洗3次。加100μl HRP标记链亲和素（Streptavidin-HRP），37℃1 hr，PBST洗4次，PBS洗2次，拍干。加100μl AEC底物避光显色30min，用自来水冲洗终止反应，室温下干燥板，在免疫斑点成像分析仪下计数斑点。

如图5B和5C所示，与对照组及chi-pHSP65组，chi-pPES组脾脏和肺脏淋巴细胞均诱导了高水平IFN-γ+T 细胞应答，chi-pPES组对5种肽表位的应答均高于chi-pHSP65组。T细胞对5种T细胞表位多肽均有反应，其中以Ag85B和 PE19表位多肽的刺激效果最佳。chi-pPES组和chi-pHSP65组均对HSP65的刺激产生良好反应。证明所该多T表位基因疫苗能诱导并增强多个表位特异性Th1应答, 且滴鼻免疫显著诱导了肺黏膜局部的表位特异性IFN-γ+Th1应答，有助于中和和清除经呼吸道感染的结核杆菌，比BCG更有抵抗结核分枝杆菌感染的潜能。

本发明提供的一种以HSP65为表位支架的多T表位结核基因疫苗，其含有5个结核分枝杆菌抗原来源T细胞表位，包括BCG的优势抗原表位和H37Rv特有而BCG缺失的抗原表位，既能诱导CD4+T又能诱导CD8+T细胞应答。同时载体HSP65也诱导了高水平的结核特异性体液和细胞免疫应答。因此，该结核基因疫苗至少可诱导针对6种良好结核抗原的T细胞应答。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种以热休克蛋白65为表位支架的多T细胞表位结核基因疫苗，其特征在于：由一个载体构成，在所述的载体中插入有结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白65（HSP65）的全长基因，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的HSP65的全长基因中嵌合有来自结核分枝杆菌抗原的5个T细胞表位多肽基因，所述的5个T细胞表位分别是结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的1～60位基因，结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的721～765位基因，结核分枝杆菌H37Rv株来源的MTB10.4蛋白的7～33位基因，结核分枝杆菌H37Rv株来源的PPE25蛋白的 721～765位基因，结核分枝杆菌H37Rv株来源的PE19蛋白的10～54位基因，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白65基因的DNA序列如SEQ ID NO：2所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的1～60位基因的DNA序列如SEQ ID NO:4所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的721～765位基因的DNA序列如SEQ ID NO:6所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的MTB10.4蛋白的7～33位基因的DNA序列如SEQ ID NO:8所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的PPE25蛋白的 721～765位基因的DNA序列如SEQ ID NO:10所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的PE19蛋白的10～54位基因的DNA序列如SEQ ID NO:12所示，在结核分枝杆菌H37Rv株来源的的HSP65全长基因中的第438位碱基后插入结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的1～60位基因、第453位碱基后插入结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的721～765位基因、第471位碱基后插入结核分枝杆菌H37Rv株来源的MTB10.4蛋白的7～33位基因、第1185位碱基后插入结核分枝杆菌H37Rv株来源的PPE25蛋白的721～765位基因和结核分枝杆菌H37Rv株来源的PE19蛋白的10～54位基因，所述的MTB10.4蛋白的7～33位基因后嵌入gccgcctac基因序列，嵌合了结核分枝杆菌H37Rv株来源的5个T细胞表位基因的结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白65的全长基因所构成的外源目的基因的DNA序列如SEQ ID NO：14所示。

2.根据权利要求1所述的以热休克蛋白65为表位支架的多T细胞表位结核基因疫苗，其特征在于：所述的载体为真核表达质粒，所述的真核表达质粒选自pcDNA3.1质粒或pVAX1质粒中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的以热休克蛋白65为表位支架的多T细胞表位结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白65的氨基酸序列SEQ ID 如NO：1所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的ESAT-6蛋白的1～60位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的Ag85B蛋白的721～765位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的MTB10.4蛋白的7～33位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的PPE25蛋白的721～765位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述的结核分枝杆菌H37Rv株来源的PE19蛋白的10～54位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，嵌合了结核分枝杆菌H37Rv株来源的5个T细胞表位基因的结核分枝杆菌H37Rv株来源的热休克蛋白65的全长基因所构成的外源目的基因蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，嵌合了结核杆菌5个T细胞表位基因的结核杆菌热休克蛋白65的全长基因所构成的外源目的基因的DNA序列如SEQ ID NO：14所示。

4.权利要求1所述的以热休克蛋白65为表位支架的多T细胞表位结核基因疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）提取结核分枝杆菌H37Rv株的DNA作为模板，通过PCR方法扩增结核杆菌热休克蛋白HSP65编码基因；

2）以结核杆菌热休克蛋白HSP65基因作为模板，分别通过PCR扩增双链DNA片段1、片段3、片段4，其中片段3与片段4有17个碱基重叠序列；所述的片段1的双链DNA的序列为 

atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac

taccggttct gttaacgcat gctgcttctc cgggcagcgc cggagctcgc cccgaacttg

gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa

cgggagcggc tacgccattt ccactgtaac ccggggttcc cggcgttgca gcaggacctt

aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag

ttcttcaccc cacgggggtg ctagtggttg ctaccacaca ggtagcggtt cctctagctc

ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc

gacctcctag gcatgctctt ctagccgcgg ctcgaccagt ttctccatcg gttcttctgg

gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc

ctactgcagc ggccactgcc gtggtgctgc cggtggcacg accgggtccg caaccaagcg

gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa

ctcccggacg cgttgcagcg ccggccgcgg ttgggcgagc cagagtttgc gccgtagctt

aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag

ttccggcacc tcttccagtg gctctgggac gagttcccgc ggttcctcca gctctggttc

gagcagattg cggccaccat gacagagcag cagtggaatt tcgcgggtat cgaggccgcg

ctcgtctaac gccggtggta ctgtctcgtc gtcaccttaa agcgcccata gctccggcgc

gcaagcgcaa tccagggagc agcgatttcg gcg

cgttcgcgtt aggtccctcg tcgctaaagc cgc

所述的片段3的双链DNA的序列为

ggtgaccagt ccatcggtca aatcatgtac aactaccccg cgatggccgc ctacgacctg

ccactggtca ggtagccagt ttagtacatg ttgatggggc gctaccggcg gatgctggac

atcgccgagg cgatggacaa ggtgggcaac gagggcgtca tcaccgtcga ggagtccaac

tagcggctcc gctacctgtt ccacccgttg ctcccgcagt agtggcagct cctcaggttg

acctttgggc tgcagctcga gctcaccgag ggtatgcggt tcgacaaggg ctacatctcg

tggaaacccg acgtcgagct cgagtggctc ccatacgcca agctgttccc gatgtagagc

gggtacttcg tgaccgaccc ggagcgtcag gaggcggtcc tggaggaccc ctacatcctg

cccatgaagc actggctggg cctcgcagtc ctccgccagg acctcctggg gatgtaggac

ctggtcagct ccaaggtgtc cactgtcaag gatctgctgc cgctgctcga gaaggtcatc

gaccagtcga ggttccacag gtgacagttc ctagacgacg gcgacgagct cttccagtag

ggagccggta agccgctgct gatcatcgcc gaggacgtcg agggcgaggc gctgtccacc

cctcggccat tcggcgacga ctagtagcgg ctcctgcagc tcccgctccg cgacaggtgg

ctggtcgtca acaagatccg cggcaccttc aagtcggtgg cggtcaaggc tcccggcttc

gaccagcagt tgttctaggc gccgtggaag ttcagccacc gccagttccg agggccgaag

ggcgaccgcc gcaaggcgat gctgcaggat atggccattc tcaccggtgg tcaggtgatc

ccgctggcgg cgttccgcta cgacgtccta taccggtaag agtggccacc agtccactag

agcgaagagg tcggcctgac gctggagaac gccgacctgt cgctgctagg caaggcccgc

tcgcttctcc agccggactg cgacctcttg cggctggaca gcgacgatcc gttccgggcg

aaggtcgtgg tcaccaagga cgagaccacc atcgtcgagg gcgccggtga caccgacgcc

ttccagcacc agtggttcct gctctggtgg tagcagctcc cgcggccact gtggctgcgg

atcgccggac gagtggccca gatccgccag gagatcgaga acagcgactc cgactacgac

tagcggcctg ctcaccgggt ctaggcggtc ctctagctct tgtcgctgag gctgatgctg

cgtgagaagc tgcaggagcg gctggccaag ctggccggtg gtgtcgcggt gatcaaggcc

gcactcttcg acgtcctcgc cgaccggttc gaccggccac cacagcgcca ctagttccgg

ggtgccgcca ccgaggtcga actcaaggag cgcaagcacc gcatcgaggc gcagttcttc

ccacggcggt ggctccagct tgagttcctc gcgttcgtgg cgtagctccg cgtcaagaag

gcctcgatcg cacagcagct gaccttcggc ccagtgacca ca

cggagctagc gtgtcgtcga ctggaagccg ggtcactggt gt

所述的片段4的双链DNA的序列为

ttcggcccag tgaccacaca gccggaagcc ctggcagctg cggcggcgaa cctagatgcg

aagccgggtc actggtgtgt cggccttcgg gaccgtcgac gccgccgctt ggatctacgc

gttcgcaatg ccaaggccgc cgtcgaggag ggcatcgtcg ccggtggggg tgtgacgctg

caagcgttac ggttccggcg gcagctcctc ccgtagcagc ggccaccccc acactgcgac

ttgcaagcgg ccccgaccct ggacgagctg aagctcgaag gcgacgaggc gaccggcgcc

aacgttcgcc ggggctggga cctgctcgac ttcgagcttc cgctgctccg ctggccgcgg

aacatcgtga aggtggcgct ggaggccccg ctgaagcaga tcgccttcaa ctccgggctg

ttgtagcact tccaccgcga cctccggggc gacttcgtct agcggaagtt gaggcccgac

gagccgggcg tggtggccga gaaggtgcgc aacctgccgg ctggccacgg actgaacgct

ctcggcccgc accaccggct cttccacgcg ttggacggcc gaccggtgcc tgacttgcga

cagaccggtg tctacgagga tctgctcgct gccggcgttg ctgacccggt caaggtgacc

gtctggccac agatgctcct agacgagcga cggccgcaac gactgggcca gttccactgg

cgttcggcgc tgcagaatgc ggcgtccatc gcggggctgt tcctgaccac cgaggccgtc

gcaagccgcg acgtcttacg ccgcaggtag cgccccgaca aggactggtg gctccggcag

gttgccgaca agccggaaaa ggagaaggct tccgttcccg gtggcggcga catgggtggc

caacggctgt tcggcctttt cctcttccga aggcaagggc caccgccgct gtacccaccg

atggatttc

tacctaaag

3）以上述的片段1作为模板，通过PCR扩增双链DNA片段2，得到的片段2与片段3有17个碱基重叠序列；所述的片段2的双链DNA的序列为 

atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac

taccggttct gttaacgcat gctgcttctc cgggcagcgc cggagctcgc cccgaacttg

gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa

cgggagcggc tacgccattt ccactgtaac ccggggttcc cggcgttgca gcaggacctt

aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag

ttcttcaccc cacgggggtg ctagtggttg ctaccacaca ggtagcggtt cctctagctc

ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc

gacctcctag gcatgctctt ctagccgcgg ctcgaccagt ttctccatcg gttcttctgg

gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc

ctactgcagc ggccactgcc gtggtgctgc cggtggcacg accgggtccg caaccaagcg

gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa

ctcccggacg cgttgcagcg ccggccgcgg ttgggcgagc cagagtttgc gccgtagctt

aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag

ttccggcacc tcttccagtg gctctgggac gagttcccgc ggttcctcca gctctggttc

gagcagattg cggccaccat gacagagcag cagtggaatt tcgcgggtat cgaggccgcg

ctcgtctaac gccggtggta ctgtctcgtc gtcaccttaa agcgcccata gctccggcgc

gcaagcgcaa tccagggagc agcgatttcg gcgcaggatg cgtacaacgc cgcgggcggg

cgttcgcgtt aggtccctcg tcgctaaagc cgcgtcctac gcatgttgcg gcgcccgccc

cacaacgccg tgttcaacgg tgaccagtcc atcggt

gtgttgcggc acaagttgcc actggtcagg tagcca

4）将上述的片段3与片段4混合，变性成为单链，通过彼此重叠的17个碱基互补连接，以此作为模板，通过PCR方法扩增获得片段5，片段5嵌合有PPE25及PE19表位，片段5与片段2有17个彼此重叠的碱基序列，所述的片段5的双链DNA的序列为：

ggtgaccagt ccatcggtca aatcatgtac aactaccccg cgatggccgc ctacgacctg

ccactggtca ggtagccagt ttagtacatg ttgatggggc gctaccggcg gatgctggac

atcgccgagg cgatggacaa ggtgggcaac gagggcgtca tcaccgtcga ggagtccaac

tagcggctcc gctacctgtt ccacccgttg ctcccgcagt agtggcagct cctcaggttg

acctttgggc tgcagctcga gctcaccgag ggtatgcggt tcgacaaggg ctacatctcg

tggaaacccg acgtcgagct cgagtggctc ccatacgcca agctgttccc gatgtagagc

gggtacttcg tgaccgaccc ggagcgtcag gaggcggtcc tggaggaccc ctacatcctg

cccatgaagc actggctggg cctcgcagtc ctccgccagg acctcctggg gatgtaggac

ctggtcagct ccaaggtgtc cactgtcaag gatctgctgc cgctgctcga gaaggtcatc

gaccagtcga ggttccacag gtgacagttc ctagacgacg gcgacgagct cttccagtag

ggagccggta agccgctgct gatcatcgcc gaggacgtcg agggcgaggc gctgtccacc

cctcggccat tcggcgacga ctagtagcgg ctcctgcagc tcccgctccg cgacaggtgg

ctggtcgtca acaagatccg cggcaccttc aagtcggtgg cggtcaaggc tcccggcttc

gaccagcagt tgttctaggc gccgtggaag ttcagccacc gccagttccg agggccgaag

ggcgaccgcc gcaaggcgat gctgcaggat atggccattc tcaccggtgg tcaggtgatc

ccgctggcgg cgttccgcta cgacgtccta taccggtaag agtggccacc agtccactag

agcgaagagg tcggcctgac gctggagaac gccgacctgt cgctgctagg caaggcccgc

tcgcttctcc agccggactg cgacctcttg cggctggaca gcgacgatcc gttccgggcg

aaggtcgtgg tcaccaagga cgagaccacc atcgtcgagg gcgccggtga caccgacgcc

ttccagcacc agtggttcct gctctggtgg tagcagctcc cgcggccact gtggctgcgg

atcgccggac gagtggccca gatccgccag gagatcgaga acagcgactc cgactacgac

tagcggcctg ctcaccgggt ctaggcggtc ctctagctct tgtcgctgag gctgatgctg

cgtgagaagc tgcaggagcg gctggccaag ctggccggtg gtgtcgcggt gatcaaggcc

gcactcttcg acgtcctcgc cgaccggttc gaccggccac cacagcgcca ctagttccgg

ggtgccgcca ccgaggtcga actcaaggag cgcaagcacc gcatcgaggc gcagttcttc

ccacggcggt ggctccagct tgagttcctc gcgttcgtgg cgtagctccg cgtcaagaag

gcctcgatcg cacagcagct gaccttcggc ccagtgacca cacagccgga agccctggca

cggagctagc gtgtcgtcga ctggaagccg ggtcactggt gtgtcggcct tcgggaccgt

gctgcggcgg cgaacctaga tgcggttcgc aatgccaagg ccgccgtcga ggagggcatc

cgacgccgcc gcttggatct acgccaagcg ttacggttcc ggcggcagct cctcccgtag

gtcgccggtg ggggtgtgac gctgttgcaa gcggccccga ccctggacga gctgaagctc

cagcggccac ccccacactg cgacaacgtt cgccggggct gggacctgct cgacttcgag

gaaggcgacg aggcgaccgg cgccaacatc gtgaaggtgg cgctggaggc cccgctgaag

cttccgctgc tccgctggcc gcggttgtag cacttccacc gcgacctccg gggcgacttc

cagatcgcct tcaactccgg gctggagccg ggcgtggtgg ccgagaaggt gcgcaacctg

gtctagcgga agttgaggcc cgacctcggc ccgcaccacc ggctcttcca cgcgttggac

ccggctggcc acggactgaa cgctcagacc ggtgtctacg aggatctgct cgctgccggc

ggccgaccgg tgcctgactt gcgagtctgg ccacagatgc tcctagacga gcgacggccg

gttgctgacc cggtcaaggt gacccgttcg gcgctgcaga atgcggcgtc catcgcgggg

caacgactgg gccagttcca ctgggcaagc cgcgacgtct tacgccgcag gtagcgcccc

ctgttcctga ccaccgaggc cgtcgttgcc gacaagccgg aaaaggagaa ggcttccgtt

gacaaggact ggtggctccg gcagcaacgg ctgttcggcc ttttcctctt ccgaaggcaa

cccggtggcg gcgacatggg tggcatggat ttc

gggccaccgc cgctgtaccc accgtaccta aag

5）将上述的片段2与片段5混合，变性成为单链，通过彼此重叠的17个碱基互补连接，以此作为模板，通过PCR方法扩增获得嵌合了5个T细胞表位的结核分枝杆菌热休克蛋白HSP65外源目的基因，将目的基因经双酶切后与经同样双酶切的载体连接，获得权利要求1所述的热休克蛋白65为表位支架的多T细胞表位结核基因疫苗。

5.如权利要求1所述的以热休克蛋白65为表位支架的多T细胞表位结核基因疫苗的制备方法，其特征在于：以SEQ ID NO：15所示的HSP65上游引物T1和SEQ ID NO：16所示的HSP65T2引物通过PCR扩增片段1，以SEQ ID NO：18所示的引物HSP65 T4序列和SEQ ID NO：19所示的引物HSP65 T5序列通过PCR扩增片段3，以SEQ ID NO：20所示的引物HSP65T6序列和SEQ ID NO：21 所示的HSP65下游引物T7通过PCR扩增片段4；用SEQ ID NO：15所示的HSP65上游引物T1和SEQ ID NO：17所示的HSP65的T3引物以片段1为模板，通过PCR方法扩增出片段2；用SEQ ID NO：18所示的HSP65T4引物和SEQ ID NO：21所示的HSP65下游引物T7以片段3、4混合并变性为单链、互补连接后的基因为模板，通过PCR方法扩增出片段5；用SEQ ID NO：15所示的HSP65上游引物T1和SEQ ID NO：21所示的HSP65下游引物T7以片段2、5混合并变性为单链、互补连接后的基因为模板，通过PCR方法扩增嵌合了5个T细胞表位的结核分枝杆菌热休克蛋白HSP65外源目的基因。

6.如权利要求4所述的以热休克蛋白65为表位支架的多T细胞表位结核基因疫苗的制备方法，其特征在于：嵌合了5个T细胞表位的HSP65外源目的基因和插入载体的酶切位点分别为EcoRI和Hind III位点。

7.如权利要求4所述的以热休克蛋白65为表位支架的多T细胞表位结核基因疫苗的制备方法，其特征在于：所有抗原来自结核分枝杆菌H37Rv株。

8.一种药物组合物，其特征在于：含有有效量的权利要求1所述的以热休克蛋白65为表位支架的多T细胞表位结核基因疫苗。

9.如权利要求1所述的一种药物组合物，其特征在于：还含有药学上可接受的载体或者赋形剂。

10.权利要求1所述的以热休克蛋白65为表位支架的多T细胞表位结核基因疫苗在制备治疗和预防结核病的药物中的应用。