CN106405107B - 结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941及其T细胞表位肽的应用 - Google Patents

结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941及其T细胞表位肽的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941及其T细胞表位肽在制备结核病检测试剂、疫苗和药物中的应用，所述抗原蛋白Rv2941及其T细胞表位肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1‑5所示。本发明利用结核分枝杆菌Rv2941蛋白抗原及其T细胞表位肽作为刺激物用于结核分枝杆菌感染引起的特异性T细胞和B细胞免疫反应，与以往采用完全抗原相比，能够降低由于抗原不纯造成的假阳性。由所述Rv2941蛋白抗原及其表位肽制备的检测试剂可广泛用于结核病的辅助诊断、流行病学监测等相关领域，Rv2941蛋白抗原及其表位肽制备的结核疫苗和抗结核药物可用于结核病的预防和治疗。

Description

结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941及其T细胞表位肽的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和免疫学领域，具体地说，涉及结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941及其T细胞表位肽在结核病检测试剂、疫苗和药物制备中的应用。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染性疾病，调查结果显示全世界有三分之一的人口处于潜伏感染，且有5％～10％在未来的生活中将可能发展为活动性结核病。自1993年世界卫生组织宣布结核病成为全球危机后，结核病的发病率和死亡率一直居高不下，据WHO报告，每年新增结核病人约800万，每年约有200～300万人死于结核病。我国在22个结核高负担国家中位居第2位，全国第5次流行病学抽样检查结果显示：全国130万人发病，占全球发病率的14.3％，我国也是全球27个耐药结核病高负担国家之一，耐多药结核病患病人数占据全球第一。每个未经治疗的活动性肺结核病人能够传染10～15人。结核病已经成为全球重要的卫生问题，需引起人们的高度重视。
结核的早期诊断和预防治疗对结核病的控制至关重要，临床上常用的是细菌学方法痰涂片镜检和痰培养，痰涂片镜检是世界范围内结核病检查中使用最广泛的技术，由于此法设备简便，适合在经济不发达的地区使用。但是由于对样本中的菌含量要求高，因此该方法灵敏度不高，导致大量涂阴患者不被发现从而转阳，且涂阴患者具有传染性，不容忽视，该方法无种特异性，灵敏度差，受痰液标本和病情的影响。痰培养作为结核病诊断的金标准，但是存在培养时间过长，现在已有BACTEC MGIT960系统等快速培养系统可在2周内分离培养结核分枝杆菌，但由于其配制的培养基、营养添加剂、杂菌抑制剂价格昂贵，无法在发展中国家广泛推广，并且快速培养与改良L-J培养相比污染率显著增高，导致假阳性结果出现。常用的用于人群筛查的检测方法是皮肤结核菌素实验，使用的是结核菌纯蛋白衍生物(PPD)，由于PPD中含有许多分枝杆菌种类(致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌和BCG)所共有的抗原分子，因此PPD诊断结核病的特异性较差，不能有效区分结核分枝杆菌感染与卡介苗接种，结核的影像学检查如常规的X线检查、CT检查、MRI检查、超声检查等价格昂贵，且对身体造成一定伤害，特异性低，不适合用于常规的检查诊断。
结核分枝杆菌侵入人体后寄居在巨噬细胞内，人体对结核分枝杆菌主要的免疫反应是细胞免疫应答，主要参与的细胞是CD4+和CD8+T细胞。CD8+T细胞可以通过穿孔素、颗粒酶等途径将被结核分枝杆菌感染的巨噬细胞或树突状细胞杀死从而达到清除结核分枝杆菌的目的。感染结核分枝杆菌的人再次接触结核分枝杆菌特异性抗原时，T淋巴细胞增殖产生IFN-γ，通过单克隆抗体检测出IFN-γ即可确定曾经或正在感染结核分枝杆菌。
目前以T细胞为基础的检测方法T-SPOT是利用IFN-γ特异性抗体捕获经结核抗原刺激的外周血淋巴细胞培养后产生的IFN-γ，并以酶联免疫斑点显色的方式表现出来，从斑点的数量来确定细胞分泌细胞因子的情况，从单细胞水平评价细胞免疫功能。以T细胞为基础的体外γ干扰素的检测被用于结核病的辅助诊断，该检测方法不仅能筛选出活动性结核病人，同时也能检测出潜伏期病人，从而能更好的预防和控制潜伏期结核，目前已有以结核分枝杆菌基因组RD1区编码的结核特异性抗原ESAT-6和CFP-10的全蛋白或多肽为刺激物的商品化的IGRA检测试剂盒，如QuantiFERON-TB Gold test和T-SPOT，均呈现较高的灵敏性和特异性，但是尚未达到结核病的诊断需求。
Rv2941(GI:15610078)位于H37Rv基因组上，全长1743bp，编码含有580个氨基酸的蛋白，是脂肪酸AMP合成酶，利用生物信息学软件对其进行抗原表位预测分析，发现Rv2941蛋白存在较多的T细胞表位，具有潜在的诊断效能。
本发明建立在反向疫苗学的基础上，利用计算机筛选出结核分枝杆菌可能的免疫原性抗原库，然后利用生物信息学软件TE predict和IEDB预测结核抗原MHC-I类T细胞表位，通过固态合成法合成这些多肽，先利用人群免疫筛选试验对结核新抗原进行筛选，筛选出免疫优势抗原之后，再通过动物实验对其免疫原性进行验证，最后经验证得到的免疫优势抗原可一方面用于结核诊断，另一方面可用于卡介苗的改造。
发明内容
本发明的目的是提供结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941的应用。
本发明的另一目的是提供结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941 T细胞表位肽及其应用。
本发明基于T细胞IFN-γ释放技术，利用生物信息学软件TEpredict和IEDB对Rv2941编码基因上T细胞抗原表位进行预测，利用固态合成法合成表位多肽，再通过T-SPOT法(酶联免疫斑点实验)对结核病人、肺部其他疾病患者、健康人体内的特异性T淋巴细胞进行检测，从而评价该抗原用于结核检测的灵敏度和特异性，同时通过人群免疫学实验筛选出Rv2941抗原蛋白上的免疫优势表位肽，确定免疫优势T细胞表位肽的免疫原性。
为了实现本发明目的，本发明提供结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941在制备结核检测试剂、疫苗和药物中的应用；其中，所述抗原蛋白Rv2941的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。
本发明还提供结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941T细胞表位肽，所述表位肽选自P327、P330、P332、P334，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1～4所示。
本发明还提供由所述T细胞表位肽衍生的表位肽或其类似物。
本发明还提供编码所述表位肽的DNA分子。
本发明还提供含有编码所述表位肽的DNA分子的表达盒及表达载体。
本发明还提供含有编码所述表位肽的DNA分子的转基因细胞系。
本发明还提供含有编码所述表位肽的DNA分子的重组菌及其表达纯化的重组蛋白。
本发明还提供所述表位肽、编码所述表位肽的DNA分子、所述转基因细胞系或所述重组菌及其表达纯化的重组蛋白在制备结核检测试剂、疫苗和药物中的应用。
本发明还提供一种结核诊断试剂，所述诊断试剂中含有结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941，或编码所述抗原蛋白Rv2941的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白；和/或，
所述表位肽、编码所述表位肽的DNA分子和/或所述重组蛋白。
本发明还提供含有上述诊断试剂的结核T-SPOT检测试剂盒。所述试剂盒还包括以下材料或试剂：
①一抗：抗人或动物IFN-γ的小鼠IgG单克隆抗体。
②酶标试剂：辣根过氧化物酶标记的抗人或动物IFN-γ不同表位的另一种小鼠IgG单克隆抗体。
③标准品：
培养板：含有PVDF膜或硝酸纤维素膜的96孔微孔反应板，阳性对照孔中含有结核非特异性刺激抗原(如PHA等)，阴性对照孔含有PBS或基底液。
④其他T-SPOT检测所需的试剂及耗材。
优选地，一抗固定在上述微孔反应板上。
本发明是基于双抗体夹心原理，采用T-SPOT法检测抗原，实验过程为：PVDF膜上包被的一抗作为捕获抗体能够结合细胞上清中的IFN-γ，而IFN-γ又能被酶标二抗捕获、显色。两种抗体为识别IFN-γ不同抗原表位的单克隆抗体。
本发明还提供结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941和/或所述表位肽、编码所述表位肽的DNA分子、所述转基因细胞系或所述重组菌及其表达纯化的重组蛋白在制备结核疫苗和抗结核药物中的应用。
本发明还提供一种结核疫苗，其有效成分为结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941，或编码所述抗原蛋白Rv2941的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白；和/或，
所述表位肽、编码所述表位肽的DNA分子和/或所述重组蛋白。
发明还提供一种抗结核药物，其有效成分包括以结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941和/或所述表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，制备的多克隆抗体，或者以结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941和/或所述表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，采用杂交瘤技术和DNA重组技术，制备的识别所述结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941及其T细胞表位肽抗原的人源化单克隆抗体。
本发明进一步提供结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941和/或所述表位肽及其衍生的表位肽或其类似物在检测结核分枝杆菌感染引起的特异性T细胞和B细胞免疫反应中的应用。其是将人或动物的淋巴细胞经所述表位肽及其衍生的表位肽或其类似物抗原或它们的组合物刺激后，检测T细胞或B细胞分泌的细胞因子。
其中，结核特异性T细胞分泌的细胞因子包括：γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等。B细胞分泌的细胞因子包括抗体。
针对结核特异性T细胞分泌的细胞因子的检测方法包括酶联免疫斑点试验(ELISPOT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫胶体金试验、细胞因子内染色和T细胞增殖试验等。B细胞分泌的细胞因子的检测方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)等。
所述淋巴细胞来自人或动物的外周血、静脉血、脑脊液、胸腔积液或胸水等。
本发明具有以下优点：
(一)本发明利用结核分枝杆菌Rv2941蛋白抗原及其T细胞表位肽作为刺激物用于结核分枝杆菌感染引起的特异性T细胞和B细胞免疫反应，与以往采用完全抗原相比，能够降低由于抗原不纯造成的假阳性。
(二)研究证明，本发明提供的抗原表位均能够刺激机体产生较强的T细胞免疫反应，因此当使用上述表位作为刺激物进行体外T细胞γ干扰素释放实验时，灵敏度显著提高。
(三)采用固相合成的方法合成表位多肽，有利于质量控制，且成本较低，纯度高，适合大规模商业化生产。
实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 结核分枝杆菌抗原基因Rv2941的克隆及蛋白的表达纯化
Rv2941(GI:15610078)是结核分枝杆菌H37Rv基因组编码的保守膜蛋白，含580个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。根据其编码基因序列，设计引物，利用原核表达系统(如大肠杆菌)表达并纯化获得抗原蛋白Rv2941。
实施例2 结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941 T细胞表位肽的合成
基于T细胞IFN-γ释放技术，利用生物信息学软件TE predict和IEDB对Rv2941编码基因上T细胞抗原表位进行预测，利用固态合成法合成表位多肽，再通过T-SPOT法对结核病人、肺部其他疾病患者、健康人体内的特异性T淋巴细胞进行检测，从而评价该抗原用于结核检测的灵敏度和特异性。
本实施例提供的结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941 T细胞表位肽选自P327、P330、P332、P334，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1～4所示。
实施例3 结核T-SPOT检测试剂盒的制备
所述试剂盒基本组成如下：
①实施例1制备的蛋白抗原Rv2941和/或实施例2合成的表位肽抗原：所述表位肽选自如氨基酸序列SEQ ID NO:1～4中的至少一种。
②一抗：抗人或动物IFN-γ的小鼠IgG单克隆抗体。
酶标试剂：辣根过氧化物酶标记的抗人或动物IFN-γ不同表位的另一种小鼠IgG单克隆抗体。
③标准品：
培养板：含有PVDF膜或硝酸纤维素膜的96孔微孔反应板，阳性对照孔中含有结核非特异性刺激抗原(如PHA等)，阴性对照孔含有PBS或基底液。
④其他T-SPOT检测所需的试剂及耗材。
将一抗固定在上述微孔反应板上。
该试剂盒是基于双抗体夹心原理设计的，采用T-SPOT法检测抗原，实验过程为：PVDF膜上包被的一抗作为捕获抗体能够结合细胞上清中的IFN-γ，而IFN-γ又能被酶标二抗捕获、显色。两种抗体为识别IFN-γ不同抗原表位的单克隆抗体。
实施例4 抗原表位肽用于结核感染的临床检测
1.外周血淋巴细胞的分离
1.1受试对象
①志愿者病例的筛选标准：
临床表现症状、体征及胸部影像学检查诊断为肺结核的，且痰培养为阳性的肺结核患者。
②肺部疾病患者的筛选标准：
痰培养和痰涂片为阴性的肺部其他疾病，如尘肺、慢阻肺等肺部疾病患者。
③健康志愿者的筛选标准：
无结核临床症状、无结核病人密切接触史、无其他疾病或感染。
入选的结核病患者和志愿者年龄在15-80岁之间，从到结核病室就诊的连续时间样本中随机选取。共采集了50例结核病志愿者、42例肺部疾病患者及55例健康志愿者血液样本，采血时使用无内毒素的肝素抗凝真空采血管采集外周静脉血，每名志愿者采血约5ml～10ml。
1)样品于4小时内用Ficoll-Hypaque分离液分离PBMCs。
2)先将全血用RPMI-1640培养基1:1稀释混匀，在离心管中加入一定体积的分离液，将稀释后的血样平铺到分离液液面上方，保持两液面界面清晰，分离液、抗凝未经稀释全血、RPMI 1640培养基体积为1:1:1，室温(18～26℃)，800g离心20分钟。
3)离心结束后，管底是红细胞，中间层是分离液，最上层是血浆层，血浆层与分离液层之间是白色云雾状的单个核细胞(包括淋巴细胞和单核细胞)层。用吸管吸取白色云雾状细胞层并转移至15ml无菌离心管中，加入RPMI 1640培养基至10ml，室温下800g离心10分钟。
4)弃去上清，重悬后加入7ml RPMI 1640培养基，700g离心10分钟。
5)弃去上清加0.5ml AIM-V培养基重悬沉淀。
6)利用自动细胞计数仪对细胞计数，用AIM-V培养基配制500μL细胞浓度为2.5×106/ml的细胞悬液。
2.抗原表位肽的准备
将实施例2中固相合成法合成的抗原表位肽用DMSO溶解，各条表位肽分别用含10％胎牛血清的RPIM1640培养基稀释至一定浓度后使用。
3.T-SPOT检测抗原表位肽特异性T细胞
采用实施例3的试剂盒，向预包被一抗的微孔板中加入以下试剂，每个病人分别设6个检测孔：阳性对照孔(加100μL浓度为15μg/ml的植物血凝素PHA作为阳性刺激物)、阴性对照孔(加100μL PBS作为阴性对照)、4个检测孔(两个孔中分别加入100μL浓度为20μg/ml的多肽P327、P330、P332、P334)，每个孔中加入100μL上述稀释好的PBMC，使每孔中PBMC的数量达25万个，将抗原与PBMC细胞置于37℃，5％CO2的培养箱中培养20小时。
4.洗板及结果判定
洗去PBMC细胞和抗原刺激物，加100μL一抗室温下孵育1小时，用PBS洗5遍，加二抗室温孵育1小时，再用PBS洗5遍，加底物避光显色7分钟后，用纯化水终止显色，将培养板放在通风口处晾干观察板上的斑点数。
结果判定(表1)：空白对照孔斑点数＝N、检测孔斑点数＝T、阳性质控孔斑点数＝P。
表1 T-SPOT结果判断标准
其中两条表位肽检测50例结核病人、42例肺部其他疾病患者和55个健康人的结果统计见表2。
表2 Rv2941蛋白抗原四条表位肽检测灵敏度和特异度统计
表位肽 灵敏度(％) 特异度(％)
P327 8 100
P330 4 97.94
P332 12 100
P334 12 100
四条多肽联合 24 97.94
检测灵敏度＝(结核病患者检测阳性数/结核病患者总数)×100％
检测特异度＝1-(肺结核病患者检测阳性数+健康志愿者检测阳性数)/(肺部疾病患者总数+健康志愿者总数)
按照单条多肽检测出阳性即为阳性的原则，经计算得出Rv2941蛋白抗原P327、P330、P332、P334四条表位肽联合检测出结核病人的灵敏度为24％，特异度为97.94％。
优选地，在本发明的结核病诊断试剂盒中采用ESAT6和CFP10联合抗原可提高结核病的诊断效率，本实施例中结核病人PBMC对Rv2941及其表位多肽具有细胞免疫应答，而肺部其他疾患病人和健康人的PBMC对Rv2941及其表位多肽无免疫应答，证实Rv2941蛋白表位多肽能够被结核病人特异性识别，且四条多肽的联合诊断效率相对于单条多肽的诊断效率提高，因此Rv2941及其表位肽具有潜在的诊断性能，可以考虑作为联合抗原，用于结核病的检测试剂中。另外，人群筛选试验也证实了Rv2941表位多肽能刺激机体产生的IFN-γ，IFN-γ可以激活巨噬细胞从而促进巨噬细胞对结核分枝杆菌的清除，因此可以考虑将Rv2941及其表位多肽用于结核的疫苗的构建和制备。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941在制备结核检测试剂、结核疫苗或抗结核药物中的应用；其中，所述抗原蛋白Rv2941的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
2.结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941T细胞表位肽，其特征在于，所述表位肽选自如SEQ IDNO:1-4所示氨基酸序列中的一种。
3.权利要求2所述表位肽在制备结核检测试剂中的应用。
4.一种结核诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂中含有结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941，或编码所述抗原蛋白Rv2941的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白；和/或，
权利要求2所述表位肽，或编码所述表位肽的DNA分子，或由含有编码所述表位肽的DNA分子的重组菌产生的重组蛋白。
5.含有权利要求4所述诊断试剂的结核T-SPOT检测试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有：
①一抗：抗人或动物IFN-γ的小鼠IgG单克隆抗体；
②酶标试剂：辣根过氧化物酶标记的抗人或动物IFN-γ不同表位的另一种小鼠IgG单克隆抗体；
③标准品：
培养板：含有PVDF膜或硝酸纤维素膜的96孔微孔反应板，阳性对照孔中含有结核非特异性刺激抗原，阴性对照孔含有PBS；
④其他T-SPOT检测所需的试剂及耗材；
其中，一抗固定在上述微孔反应板上。
7.一种结核疫苗，其特征在于，其有效成分为结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941，或编码所述抗原蛋白Rv2941的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白。
8.一种抗结核药物，其特征在于，其有效成分包括以结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，制备的多克隆抗体，或者以结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，采用杂交瘤技术或DNA重组技术，制备的识别结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941的人源化单克隆抗体。
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