CN105481947A - 结核分枝杆菌特异性cd4+t细胞表位肽p12及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了结核分枝杆菌特异性CD4⁺T细胞表位肽P12及其应用。本发明综合利用生物信息学、免疫信息学的技术手段，利用结核分枝杆菌自身的抗原筛选出具有抗结核活性的表位肽，其中筛选出的表位肽P12与HLA-DRB₁*09:01分子之间具有高亲和力，该表位肽可被结核病人CD4⁺T细胞广泛识别。由于HLA-DRB1*09:01基因型是中国人中广泛携带的基因型之一，目前并未发现结核分枝杆菌特异的HLA-DRB1*09:01限制性Th1表位肽，本发明表位肽P12的确定，为结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物的研发提供了理论基础和新的解决方案，对结核病的防治具有重大意义。

Description

结核分枝杆菌特异性CD4+T细胞表位肽P12及其应用

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，特别涉及结核分枝杆菌特异性CD4⁺T细胞表位肽及其应用。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌感染后诱发、全球感染率最高的传染病，病死率仅次于艾滋病。仅2012年，全球新发结核病患者达860万，死亡130万。结核病疫情的新特点在于：耐药结核病例出现并呈蔓延之势；结核与艾滋病共感染情况愈演愈烈。针对这两类患者，目前并无有效的防治措施。中国是世界上结核病负担最重的国家之一，研发适合中国人群的结核病疫苗和治疗药物已时不我待。

结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）是胞内寄生菌，对其有效控制主要依赖于细胞免疫，尤其是T细胞免疫。人体内T细胞主要分为CD4⁺T（Th）细胞和CD8⁺T（CTL）细胞两大亚群，大量研究已经证明，这两种T细胞亚群对于控制结核菌感染都具有重要作用。CD4⁺T细胞被认为是人类抗结核感染的最重要的媒介。人类主要组织相容性抗原MHCII能够递呈将结核分枝杆菌肽表位，进而激活CD4⁺T细胞，并且主要为Th1型CD4⁺T细胞，后者继而分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2等细胞因子，加强抗原递呈细胞和CD8⁺T细胞的活性，促进其对结核分枝杆菌的清除。

T细胞无法识别完整的结核菌和蛋白抗原，而是识别经过抗原递呈细胞摄取和加工后释放出的结核表位肽。表位肽是抗原中引起免疫应答的核心部份，也称为抗原决定簇，它与抗原递呈细胞表面的HLA分子结合形成肽-HLA复合物并被递送和表达在抗原递呈细胞表面，进而活化T细胞，诱发T细胞免疫反应。CD4⁺T细胞识别HLAII类分子递呈的表位肽，而CD8⁺T细胞识别HLAI类分子递呈的表位肽。T细胞对表位肽的识别及其活化要求表位肽与抗原递呈细胞表面HLA分子稳定结合，而肽与HLA分子的亲和力是形成肽-HLA复合物的关键，因此制备诱发T细胞免疫的治疗药物和疫苗，首要步骤是筛选出高亲和力的肽，进而鉴定出具有免疫活性的表位肽。

表位肽可以完全通过人工合成获得，研发周期短；由于剔除了表位肽以外病原体其他有害成分，安全性良好；还可以将多个表位肽串联使用，加强免疫效果和减少免疫逃逸。目前已知的结核菌表位肽主要是在欧美人群中鉴定，多为HLA-A*0201限制性，而对于结核病流行最严重的非洲和东南亚人群，并没有合适的表位肽可使用。在中国，HLA-DRB1*09:01是人群中基因频率最高的HLA分子，鉴定HLA-DRB1*09:01限制性Th1表位对于研发适合中国人群的表位肽疫苗具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结核分枝杆菌特异性CD4⁺T细胞表位肽。

本发明的另一目的在于提供该结核分枝杆菌特异性CD4⁺T细胞表位肽在制备结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种结核分枝杆菌特异性CD4⁺T细胞表位肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。

上述表位肽在制备结核病疫苗中的应用。

上述表位肽在制备结核病诊断试剂盒中的应用。

上述表位肽在制备治疗结核病药物中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明提供了与HLA-DRB1*09:01分子亲和力高，能活化CD4⁺T细胞、诱导其增殖和分泌IFN-γ的结核分枝杆菌特异性CD4⁺T细胞表位肽P12。

本发明综合利用生物信息学、免疫信息学的技术手段，利用结核分枝杆菌自身的抗原筛选出具有抗结核活性的表位肽，其中筛选出的表位肽P12与HLA-DRB₁*09:01分子之间具有高亲和力。该表位肽是新的、未被报道过的HLA-DRB1*09:01限制性结核分枝杆菌表位肽，可被结核病人CD4⁺T细胞广泛识别。由于HLA-DRB1*09:01基因型是中国人中广泛携带的基因型之一，目前并未发现结核分枝杆菌特异的HLA-DRB1*09:01限制性Th1表位肽，本发明表位肽P12的确定，为结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物的研发提供了理论基础和新的解决方案，对结核病的防治具有重大意义。

附图说明

图1为P12的质谱分析图；

图2为表位肽P12诱导结核患者T细胞活化并分泌IFN-γ的示意图；

图3为ELISPOT检测P12诱导结核患者表位肽特异T细胞的频率；图中DRB1*0901^-表示非HLA-DRB1*0901结核患者；

图4为CFSE标记增殖实验检测P12诱导结核患者表位肽特异CD4⁺T细胞增殖，图中W/O表示对照组。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1：HLA-DRB1*09:01限制性表位肽的获得

本发明从HLA基因频率数据库AFND（AlleleFrequencyNetDatabase,AFND）上获得中国人群HLA-DRB1位点各基因型的频率分布信息，其中HLA-DRB1基因频率约为15%，为HLA-DRB1位点上频率最高的单个基因型。使用生物信息学算法预测抗原蛋白所含的HLA-DRB1*09:01限制性CD4⁺T细胞表位。

本发明综合利用各种生物信息学、免疫信息学的技术手段，对结核分枝杆菌抗原蛋白序列上所含的HLA-DRB1*09:01限制性CD4⁺T表位肽进行预测分析，通过大量的筛选，筛选出与HLA分子具有高亲和力的表位肽，并通过免疫学实验鉴定。筛选结果发现CD4⁺T表位肽P12可诱导CD4⁺T细胞产生强烈的细胞免疫应答，分泌高水平IFN-γ，并诱导CD4⁺T细胞发生显著增殖。

表位肽P12的氨基酸序列为QQFVYAGAMSGLLDP（SEQIDNO:1），其质谱分析图如图1所示。

表位肽P12与HLA分子的亲和力使用IC50值表示，IC50值越低，则表位肽与HLA分子亲和力越高，其中通常认为IC50值低于50nM即表示高亲和力。而表位肽P12与HLA分子的IC50值为0.07nM，可见表位肽P12与HLA分子间具有极高的亲和力。

实施例2：ELISA实验检测表位肽P12诱导T细胞分泌IFN-γ

实验方法如下：

采用密度梯度法分离HLA-DRB1*09:01基因型结核患者外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclear,PBMC）。将收集的20ml外周血用PBS稀释一倍，缓慢加入淋巴细胞分离液上方，两者体积比为2:1，然后以800g/min转速离心30min，离心后液体分为三层，其中PBMC在第一层和第二层之间，成白膜状，用滴管小心吸取PBMC至新的离心管中，加入5倍以上体积PBS洗涤，800g/min离心10min，重复洗涤一次，用冻存液（90%FBS+10%DMSO）冻存细胞，液氮储存。

ELISA实验：复苏HLA-DRB1*09:01基因型患者PBMC，在37℃，5%CO₂孵箱中静置过夜。用去死细胞磁珠去除PBMC中的死细胞。细胞计数，完全培养基重悬细胞至1.25×10⁶个/mL，将200μL/孔细胞悬液铺入96孔U底板（即2.5×10⁵个/孔）。加入P12（浓度为10ug/mL）进行刺激。并设置阴性对照孔和阳性对照孔，分别为不刺激和ESAT-6刺激。各孔分别加好样后，将培养板置于细胞培养箱中，37℃，5%CO₂培养72h。72h小时后，收集各孔细胞培养上清。使用ELISA试剂盒检测细胞上清中IFN-γ浓度。

实验结果：

检测结果如图2所示，从中可以看出，表位肽P12诱导结核患者T细胞活化并分泌IFN-γ，其诱导T细胞分泌IFN-γ的水平接近阳性对照组（ESAT-6刺激）的水平，明显高于阴性对照组，说明表位肽P12具有相应的免疫效应。

实施例3：ELISpot实验检测表位肽P12诱导分泌IFN-γ的抗原特异性T细胞的频率

实验方法如下：

采用密度梯度法分离结核患者外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclear,PBMC）。将收集的20ml外周血用PBS稀释一倍，缓慢加入淋巴细胞分离液上方，两者体积比为2:1，然后以800g/min转速离心30min，离心后液体分为三层，其中PBMC在第一层和第二层之间，成白膜状，用滴管小心吸取PBMC至新的离心管中，加入5倍以上体积PBS洗涤，800g/min离心10min，重复洗涤一次，用冻存液（90%FBS+10%DMSO）冻存细胞，液氮储存。

ELISpot实验：复苏HLA-DRB1*09:01和非HLA-DRB1*09:01结核患者PBMC，在37℃，5%CO₂孵箱中静置过夜。用去死细胞磁珠去除PBMC中的死细胞。细胞计数，完全培养基重悬细胞至1.25×10⁶个/mL，将200μL/孔细胞悬液铺入ELISpot板（即2.5×10⁵个/孔）。将P12按10ug/mL浓度加入细胞孔中，设置阳性对照孔和阴性对照孔，2个阳性对照孔分别加入10μg/mLESAT-6(结核抗原)，2个阴性对照孔不加任何刺激。另外，对于HLA-DRB1*09:01结核病人PBMC，设置anti-CD4抗体组，2个anti-CD4抗体阻断组加入25ug/mlanti-CD4抗体。各孔分别加好样后，将培养板置于细胞培养箱中，37℃，5%CO₂培养24h。取出ELISpot板，PBS洗涤5次，拍干后加入酶标抗IFN-γ抗体100ul，孵育2h，PBS洗涤5次，拍干后加入显色剂100ul，待阳性对照孔出现明显斑点后，用超纯水终止反应；晾干，读板，计数，校正。肽特异性T细胞频率以SFC/10⁶表示。

实验结果：

图3显示表位肽P12刺激HLA-DRB1*09:01结核患者和非HLA-DRB1*0901结核患者后，ELISPOT检测到的分泌IFN-γ抗原特异性CD4⁺T细胞的频率（SFC/10⁶）。由图可以看出，HLA-DRB1*09:01结核患者PBMC中，P12特异性CD4⁺T细胞频率显著高于非HLA-DRB1*0901结核患者（DRB1*0901^-）。并且通过anti-CD4抗体阻断后，IFN-γ受到明显抑制，表明P12刺激后活化的T细胞为CD4⁺T细胞。

实施例4：CFSE标记的淋巴细胞增殖实验检测表位肽P12诱导CD4 ⁺ T细胞增殖：

实验方法如下：

复苏结核患者和健康志愿者PBMC，静置过夜。使用去死细胞磁珠去除死细胞，计数，离心后用PBS重悬细胞至1╳10⁷个/mL，加入5μMCFSE标记，混匀后避光孵育10min。加入5倍体积预冷的完全培养基（10%FBS+RPMI-1640）终止染色标记。300g离心10min，用完全培养基洗涤，重复两次。再次计数，用完全培养基重悬细胞至1╳10⁶个/mL。将细胞悬液铺入96孔U底细胞培养板中，200μL/孔，共8孔，实验组各孔分别加入10μg/mL表位肽P12（图1为P12的质谱分析图），对照孔不加任何刺激物（W/O）。在荧光显微镜下观察，确定细胞被CFSE标记(绿色荧光)。37℃，5%CO₂孵箱中培养48h。各孔中分别加入100IUIL-2，继续培养至第7d，取出细胞，洗涤后标记anti-CD3/anti-CD4抗体，流式细胞术检测。

根据CFSE染料标记的特点，染料随细胞增殖均匀地从母代细胞分配到子代细胞中，荧光强度减半。所以，弱CFSE荧光的细胞，即为增殖后的细胞。表位肽P12诱导CD4⁺T细胞增殖能力由带弱CFSE荧光的CD4⁺T细胞/CD4⁺T细胞表示。

实验结果：

检测结果如图4所示，从中可以看出，在健康志愿者组中，在有或没有表位肽P12处理的情况下，PBMC中能够被诱导成CD4⁺T细胞的数目没有明显差异（1.12%和2.45%）；而在HLA-DRB1*09:01型结核患者组中，P12能够显著诱导HLA-DRB1*09:01型结核患者CD4⁺T细胞反应特异性增殖（8.04%），阴性对照组仅为2.16%。这表明P12具有较强的免疫原性，能够诱导并扩大CD4⁺T细胞反应，并且P12是由HLA-DRB1*09:01递呈的。

综上所述，本发明筛选鉴定的表位肽P12能够特异地被HLA-DRB1*09:01型结核患者识别，并诱导CD4⁺T细胞增殖和分泌IFN-γ，为结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物的研发提供了理论基础和新的解决方案，对结核病的防治具有重大意义。如可以将本发明表位肽P12直接作为结核病的疫苗，也可将表位肽P12作为治疗结核病药物的成分；也可以通过检测患者对表位肽P12的免疫反应来判断患者是否患有结核病，故表位肽P12也可作为结核病诊断试剂盒中的成分。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110>南方医科大学

<120>结核分支杆菌特异性CD4+T细胞表位肽P12及其应用

<130>

<160>1

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>15

<212>PRT

<213>人工多肽

<400>1

GlnGlnPheValTyrAlaGlyAlaMetSerGlyLeuLeuAspPro

151015

Claims (4)

1.一种结核分枝杆菌特异性CD4⁺T细胞表位肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。

2.权利要求1所述的表位肽在制备结核病疫苗中的应用。

3.权利要求1所述的表位肽在制备结核病诊断试剂盒中的应用。

4.权利要求1所述的表位肽在制备治疗结核病药物中的应用。