CN104327159B - 结核分枝杆菌特异性cd8+t细胞表位肽p45及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种结核分枝杆菌特异性CD8+T细胞表位肽及其应用。所述表位肽的氨基酸序列为RLIPFAAPPK，该表位肽与HLA‑A*1101分子亲和力高，能活化CD8+T细胞、诱导其增殖和分泌IFN‑γ。本发明表位肽的确定，为结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物的研发提供了理论基础和新的解决方案，对结核病的防治具有重大意义。
Description
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，特别涉及结核分枝杆菌特异性CD8+T细胞表位肽及其应用。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌感染后诱发、全球感染率最高的传染病，病死率仅次于艾滋病。仅2012年，全球新发结核病患者达860万，死亡130万。结核病疫情的新特点在于：耐药结核病例出现并呈蔓延之势；结核与艾滋病共感染情况愈演愈烈。针对这两类患者，目前并无有效的防治措施。中国是世界上结核病负担最重的国家之一，研发适合中国人群的结核病疫苗和治疗药物已时不我待。
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)是胞内寄生菌，对其有效控制主要依赖于细胞免疫，尤其是T细胞免疫。人体内T细胞主要分为CD4+T(Th)细胞和CD8+T(CTL)细胞两大亚群，大量研究已经证明，这两种T细胞亚群对于控制结核菌感染都具有重要作用，其中CD8+CTL更是清除结核菌的主力军。
T细胞无法识别完整的结核菌和蛋白抗原，而是识别经过抗原递呈细胞摄取和加工后释放出的结核表位肽。表位肽是抗原中引起免疫应答的核心部份，也称为抗原决定簇，它与抗原递呈细胞表面的HLA分子结合形成肽-HLA复合物并被递送和表达在抗原递呈细胞表面，进而活化T细胞，诱发T细胞免疫反应。CD4+T细胞识别HLA II类分子递呈的表位肽，而CD8+T细胞识别HLAI类分子递呈的表位肽。T细胞对表位肽的识别及其活化要求表位肽与抗原递呈细胞表面HLA分子稳定结合，而肽与HLA分子的亲和力是形成肽-HLA复合物的关键，因此制备诱发T细胞免疫的治疗药物和疫苗，首要步骤是筛选出高亲和力的肽，进而鉴定出具有免疫活性的表位肽。
表位肽可以完全通过人工合成获得，研发周期短；由于剔除了表位肽以外病原体其他有害成分，安全性良好；还可以将多个表位肽串联使用，加强免疫效果和减少免疫逃逸。目前已知的结核菌CTL表位肽主要是在欧美人群中鉴定，多为HLA-A*0201限制性，而对于结核病流行最严重的非洲和东南亚人群，并没有合适的表位肽可使用。在中国，HLA-A*1101是 人群中基因频率最高的HLA分子，鉴定HLA-A*1101限制性CTL表位对于研发适合中国人群的表位肽疫苗具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供结核分枝杆菌特异性CD8+T细胞表位肽。
本发明的另一目的在于提供该结核分枝杆菌特异性CD8+T细胞表位肽在制备结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明提供了与HLA-A*1101分子亲和力高，能活化CD8+T细胞、诱导其增殖和分泌IFN-γ的结核分枝杆菌特异性CD8+T细胞表位肽，所述表位肽的氨基酸序列为：RLIPFAAPPK(SEQ ID NO.45)(即：Arg-Leu-Ile-Pro-Phe-Ala-Ala-Pro-Pro-Lys)。
本发明结合生物信息学预测方法和紫外诱导肽置换实验，利用结核分枝杆菌自身的抗原筛选出具有抗结核活性的表位肽，高效准确地检测出表位肽RLIPFAAPPK(SEQ IDNO.45)与HLA-A*1101分子之间的亲和力。这是新的、未被报道过的HLA-A*1101限制性结核分枝杆菌表位肽，被结核病人CD8+T细胞广泛识别。由于HLA-A*1101基因型是中国人中最广泛携带的基因型，目前并未发现结核分枝杆菌特异的HLA-A*1101限制性CTL表位肽，本发明表位肽的确定，为结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物的研发提供了理论基础和新的解决方案，对结核病的防治具有重大意义。
附图说明
图1为候选表位肽与HLA-A*1101分子亲和力示意图。
图2为22条高亲和力的表位肽诱导结核患者T细胞活化并分泌IFN-γ的示意图。
图3为ELISPOT检测P45诱导结核患者T细胞分泌IFN-γ的示意图。
图4为P45的质谱分析图。
图5为CFSE标记的淋巴细胞增殖实验检测P45诱导结核患者CD8+T细胞增殖的结果示意图。
具体实施方式
本发明根据抗原的一级结构，采用免疫信息学手段，运用CBS数据库中的NetMHCcons表位预测软件对结核分枝杆菌抗原蛋白的HLA-A*1101限制性CTL表位肽进行了预测分析， 然后采用紫外诱导肽置换实验检验候选肽与HLA-A*1101分子结合的亲和力和稳定性，筛选获得表位肽，通过体外实验鉴定，CTL表位肽P45可诱导CD8+T细胞产生强烈的细胞免疫应答，分泌高水平IFN-γ，并诱导CD8+T细胞发生显著增殖。
下面结合具体实施例进一步阐述本发明内容。
应用生物信息学方法，预测HLA-A*1101限制性表位肽：
根据文献报道，选取94个有较强免疫原性的结核分枝杆菌抗原蛋白(如表1所示)，从GeneBank获得各个抗原蛋白的氨基酸序列。
表1候选结核分枝杆菌抗原蛋白
| MTB抗原 | |||
| Rv0079 | Rv1478 | Rv2030c | Rv3044 |
| Rv0288 | Rv1569 | Rv2031c | Rv3127 |
| Rv0315 | Rv1626 | Rv2032 | Rv3130c |
| Rv0350 | Rv1733c | Rv2034 | Rv3131 |
| Rv0440 | Rv1738 | Rv2108 | Rv3132c |
| Rv0467 | Rv1787 | Rv2220 | Rv3347c |
| Rv0475 | Rv1788 | Rv2244 | Rv3353c |
| Rv0496 | Rv1789 | Rv2324 | Rv3418c |
| Rv0577 | Rv1790 | Rv2380c | Rv3420c |
| Rv0685 | Rv1791 | Rv2389c | Rv3478 |
| Rv0733 | Rv1793 | Rv2450c | Rv3615c |
| Rv0754 | Rv1813c | Rv2468c | Rv3619c |
| Rv0824c | Rv1837c | Rv2608 | Rv3716c |
| Rv0831 | Rv1860 | Rv2620c | Rv3803c |
| Rv0867c | Rv1884c | Rv2623 | Rv3804c |
| Rv0932c | Rv1886c | Rv2626c | Rv3873 |
| Rv0934 | Rv1908c | Rv2627c | Rv3874 |
| Rv0978c | Rv1926c | Rv2628 | Rv3875 |
| Rv1009 | Rv1956 | Rv2629 | Rv3914 |
| Rv1130 | RV1966 | Rv2744c | |
| Rv1169c | Rv1980c | Rv2770c | |
| Rv1174c | Rv1996 | Rv2780 | |
| Rv1349 | Rv2005c | Rv2875 | |
| Rv1363c | Rv2006 | Rv2903c | |
| Rv1411 | Rv2029c | Rv3020c |
从HLA基因频率数据库AFND(Allele Frequency Net Database,AFND)上获得中国人群 HLA-A位点各基因型的频率分布信息，其中HLA-A*1101基因频率约为28％，为HLA-A位点上频率最高的单个基因型。
使用生物信息学算法预测抗原蛋白所含的HLA-A*1101限制性CTL表位，采用的算法为CBS数据库中的NetMHCcons。根据IC50值将预测结果进行排序，IC50值越低，说明表位肽与HLA分子亲和力越高。由此，预测出94个抗原蛋白中HLA-A*1101限制性表位肽，并且筛选出其中亲和力最高的50条表位肽，作为候选，如表2所示。
表2 50条HLA-A*1101限制性候选表位肽
| 候选表位肽编号 | 氨基酸序列 | 抗原蛋白 | IC50(nM) |
| p1 | MTNTLHSMLK(SEQIDNO.1) | Rv3478 | 4.67 |
| p2 | KTVTFMPK(SEQIDNO.2) | Rv2220 | 5.29 |
| p3 | TTLDAGFLK(SEQIDNO.3) | Rv3130c | 5.9 |
| p4 | VVMTTTLSK(SEQIDNO.4) | Rv1569 | 6.16 |
| p5 | ISSGVFLLK(SEQIDNO.5) | Rv2029c | 6.4 |
| p6 | VSIPTLILFK(SEQIDNO.6) | Rv3914 | 6.97 |
| p7 | SSMTRIAK(SEQIDNO.7) | Rv1884c | 7.16 |
| p8 | MLFSMHGELYK(SEQIDNO.8) | Rv1196c | 7.36 |
| p9 | TAMRVTTMK(SEQIDNO.9) | Rv1009 | 7.69 |
| p10 | STIDEFAK(SEQIDNO.10) | Rv0496 | 7.73 |
| p11 | TTSPIPLK(SEQIDNO.11) | Rv3347c | 7.94 |
| p12 | AVMAGIVRAAK(SEQIDNO.12) | Rv3130c | 8.07 |
| p13 | VSIARALLK(SEQIDNO.13) | Rv1349 | 8.11 |
| p14 | AVAAPAFAEK(SEQIDNO.14) | Rv1790 | 8.16 |
| p15 | GTHPTTTYK(SEQIDNO.15) | Rv1980c | 8.25 |
| p16 | TTSNVSVAK(SEQIDNO.16) | Rv0867c | 8.25 |
| p17 | AVNTLFEK(SEQIDNO.17) | Rv3873 | 8.34 |
| p18 | KVNRFPDPK(SEQIDNO.18) | Rv3131 | 8.34 |
| p19 | MTSGSSSGFK(SEQIDNO.19) | Rv3347c | 8.34 |
| p20 | GTQAVVLK(SEQIDNO.20) | Rv1980c | 8.52 |
| p21 | SVNNYQASK(SEQIDNO.21) | Rv2006 | 8.61 |
| p22 | ATIAKFQK(SEQIDNO.22) | Rv0467 | 8.8 |
| p23 | MTSLDFNK(SEQIDNO.23) | Rv1363c | 8.8 |
| p24 | VVMPVLKK(SEQIDNO.24) | Rv0824 | 8.94 |
| p25 | GTFKSVAVK(SEQIDNO.25) | Rv0440 | 9.65 |
| p26 | AVARLVAISK(SEQIDNO.26) | Rv3130c | 9.86 |
| p27 | TTLTAAITK(SEQIDNO.27) | Rv0685 | 9.86 |
| p28 | RVLGANYK(SEQIDNO.28) | Rv1908c | 10.07 |
| p29 | ATFAEIGHK(SEQIDNO.29) | Rv2324 | 10.69 |
| p30 | KTFGFGFGR(SEQIDNO.30) | Rv1908c | 11.11 |
| p31 | KTQGPGAWPK(SEQIDNO.31) | Rv2389c | 11.6 |
| p32 | KTYCEELK(SEQIDNO.32) | Rv1980c | 11.66 |
| p33 | SVQMTLSK(SEQIDNO.33) | Rv1411 | 11.79 |
| p34 | TVFDYHNENAK(SEQIDNO.34) | Rv2108 | 11.79 |
| p35 | VSNAVRHAK(SEQIDNO.35) | Rv3132c | 12.24 |
| p36 | CVANMPASVPK(SEQIDNO.36) | Rv2780 | 12.58 |
| p37 | RVQTTVLK(SEQIDNO.37) | Rv2108 | 12.64 |
| p38 | VSNSLVAHMK(SEQIDNO.38) | Rv2780 | 12.64 |
| p39 | AVAVVLHK(SEQIDNO.39) | Rv2380c | 12.99 |
| p40 | HTVALFLDK(SEQIDNO.40) | Rv2032 | 12.99 |
| p41 | AIAADPSFK(SEQIDNO.41) | Rv1956 | 13.06 |
| p42 | MTQWLIEEK(SEQIDNO.42) | Rv2030c | 13.13 |
| p43 | GTSDNFQK(SEQIDNO.43) | Rv0932c | 13.2 |
| p44 | KAFAPAHAGK(SEQIDNO.44) | Rv1130 | 13.71 |
| p45 | RLIPFAAPPK(SEQIDNO.45) | Rv1787 | 13.71 |
| p46 | TVINASRFK(SEQIDNO.46) | Rv2380c | 13.79 |
| p47 | VVNKIRGTFK(SEQIDNO.47) | Rv0440 | 13.94 |
| p48 | ATTAFGAK(SEQIDNO.48) | Rv1966 | 14.09 |
| p49 | QANAHGQK(SEQIDNO.49) | Rv1037c | 326.55 |
| p50 | NNMAQTDSAV(SEQIDNO.50) | Rv1037c | 29745 |
应用紫外诱导肽置换实验方法，检测候选表位肽与HLA-A*1101分子之间的亲和力和结合稳定性：
实验过程如下：
含光敏感性表位肽的肽-HLA复合物在紫外线照射下，光敏感性表位肽发生断裂，从HLA分子中脱离，这时往反应体系中加入待检测的候选表位肽，如果候选表位肽和HLA分子亲和力高，则可以形成新的稳定的表位肽-HLA复合物。使用抗-β2m抗体捕获HLA分子，ELISA检测新形成的表位肽-HLA复合物浓度，评价表位肽和HLA分子之间的亲和力大小。共选出与HLA-A*1101具有高亲和力的表位肽(大于100％)22条，见图1和表3所示。
表3与HLA-A*1101具有高亲和力的22条表位肽
ELISpot实验检测22条表位肽诱导T细胞分泌IFN-γ，初步验证表位肽的免疫效应：
实验过程如下：
采用密度梯度法分离HLA-A*1101基因型结核患者外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear,PBMC)。将收集的20ml外周血用PBS稀释一倍，缓慢加入淋巴细胞分离液上方，两者体积比为2:1，然后以800g/min转速离心30min，离心后液体分为三层，其中PBMC在第一层和第二层之间，成白膜状，用滴管小心吸取PBMC至新的离心管中，加入5倍以上体积PBS洗涤，800g/min离心10min，重复洗涤一次，用冻存液(90％FBS+10％DMSO)冻存细胞，液氮储存。
ELISpot实验：复苏HLA-A*1101基因型患者PBMC，在37℃，5％CO2孵箱中静置过夜。用去死细胞磁珠去除PBMC中的死细胞。细胞计数，完全培养基重悬细胞至1.25×106个/mL，将200μL/孔细胞悬液铺入ELISpot板(即2.5×105个/孔)，共48孔。将表3所示的22条候选肽按10μg/mL浓度分别加入44孔中，每孔加入1种肽，每种肽铺2孔，2个阳性对照孔分别加入4μg/mLPHA，2个阴性对照孔不加任何刺激，补上全培。各孔分别加好样后，将培养 板置于细胞培养箱中，37℃，5％CO2培养24h。取出ELISpot板，PBS洗涤5次，拍干后加入酶标抗IFN-γ抗体100ul，孵育2h，PBS洗涤5次，拍干后加入显色剂100ul，待阳性对照孔出现明显斑点后，用超纯水终止反应；晾干，读板，计数，校正。肽特异性T细胞频率以SFC/106表示。
阳性反应判断标准为：①SFC/106>50，②肽刺激孔斑点数大于等于阴性对照孔的两倍。同时满足①②，反应判断为阳性。
统计23个HLA-A*1101型结核患者PBMC对表位肽的识别反应，即病人PBMC对表位肽的识别频率。肽识别率＝阳性反应数/总的检测人数╳100％。筛选出至少能够被20％病人识别的表位肽，结果如图2所示。图3为ELISPOT检测表位肽P45诱导结核病人T细胞分泌IFN-γ的结果示意图。
CFSE标记的淋巴细胞增殖实验检测表位肽P45诱导CD8+T细胞增殖：
实验过程如下：
复苏HLA-A*1101型结核患者PBMC，静置过夜。使用去死细胞磁珠去除死细胞，计数，离心后用PBS重悬细胞至1╳107个/mL，加入5μMCFSE标记，混匀后避光孵育10min。加入5倍体积预冷的完全培养基(10％FBS+RPMI-1640)终止染色标记。300g离心10min，用完全培养基洗涤，重复两次。再次计数，用完全培养基重悬细胞至1╳106个/mL。将细胞悬液铺入96孔U底细胞培养板中，200μL/孔，共8孔，实验组各孔分别加入10μg/mL表位肽P45(图4为P45的质谱分析图)，阳性对照孔加入4μg/mLPHA，阴性对照孔不加任何刺激物，补足全培。在荧光显微镜下观察，确定细胞被CFSE标记(绿色荧光)。37℃，5％CO2孵箱中培养48h。各孔中分别加入100IUIL-2，继续培养至第7d，取出细胞，洗涤后标记anti-CD8抗体，流式细胞术检测。
根据CFSE染料标记的特点，染料随细胞增殖均匀地从母代细胞分配到子代细胞中，荧光强度减半。所以，弱CFSE荧光的细胞，即为增殖后的细胞。表位肽诱导CD8+T细胞增殖能力由弱CFSE荧光的CD8+T细胞/CD8+T细胞表示。检测结果如图5所示。
经过以上方案筛选鉴定的表位肽P45，能够特异地被HLA-A*1101型结核患者识别，并诱导CD8+T细胞增殖和分泌IFN-γ，为结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物的研发提供了理论 基础和新的解决方案，对结核病的防治具有重大意义。
<110> 南方医科大学
<120> 结核分枝杆菌特异性CD8+T细胞表位肽P45及其应用
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<170> PatentIn version 3.5
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Met Thr Asn Thr Leu His Ser Met Leu Lys
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Claims (3)
1.结核分枝杆菌特异性CD8+T细胞表位肽P45，所述表位肽的氨基酸序列为：RLIPFAAPPK(SEQ ID NO.45)。
2.权利要求1所述的结核分枝杆菌特异性CD8+T细胞表位肽P45在制备结核病诊断试剂及治疗结核病药物中的应用。
3.权利要求1所述的结核分枝杆菌特异性CD8+T细胞表位肽P45在制备结核病预防性疫苗中的应用。
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Non-Patent Citations (3)
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| Strong Immunogenicity and cross-reactivity of Mycobacterium tuberculosis ESX-5 type VII secretion encoded PE-PPE proteins predicts vaccine potential;Fadel Sayes et.al;《Cell host & Microbe》;20120419;第11卷;352-363 * |
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