CN105829891A - 用于改进的体内或体外细胞介导的结核病免疫诊断的诊断试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于检测结核病的具有增强的特异性和灵敏度的体外和体内诊断方法。本发明的诊断试剂可以代替先前的包含ESAT?6的抗原的混合物(mixture)/混合物(cocktail)/库,但包含ESAT?6进一步改进诊断。
Description
本发明公开了作为药物或诊断试剂用于人类或动物中改进的体内或体外细胞介导的结核病免疫诊断的组合物。本发明涉及相比于现存的抗原组合增加灵敏度(产生更少的假阴性)而不牺牲特异性(假阳性的量)的抗原组合。特别地,本发明涉及抗原组合物,所述抗原组合物不包含目前在用于检测结核分支杆菌感染的注册产品中使用的被定名为早期分泌型抗原靶6kDa(ESAT-6)的抗原。可选地,该新型诊断组合物或免疫原性组合物可以与ESAT-6组合使用,以进一步增强细胞介导的诊断的灵敏度。
发明背景
结核病(TB)是全世界范围发病率和死亡率的主要原因。估计每4秒钟有一人患TB,并且每20-30秒钟有人会死于该疾病。此外,大约1/3的世界人口潜伏性地感染TB的病原体结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)(M.tuberculosis)。
感染结核分枝杆菌的具有免疫能力的个体通常具有10%的发展成活动性TB疾病的终生风险,如果例如个体同时感染HIV(Sonnenberg,2005)或患有糖尿病(Young,2009)该风险显著增加。如果未经治疗,每个携带活动性肺TB的人,每年将传染10-15个人(世界卫生组织结核病情况表104号(WorldHealthOrganizationTuberculosisFactSheetNo104),2002)。因此,能够在感染的早期阶段检测结核分枝杆菌感染的个体以防止结核分枝杆菌感染发展成活动性传染性肺TB是重要的。这可以通过在诊断后可能的最早的时间点的预防性治疗实现。因此,快速准确的诊断结核分枝杆菌感染是控制该疾病的全球卫生措施的重要因素。
目前确定结核分枝杆菌感染的诊断测定包括相关患者材料的培养、显微镜检查和PCR、胸部X射线、标准结核菌素皮肤测试(TST)以及干扰素γ释放测定(IGRA)。前三种方法用于诊断活动性传染性TB并基于结核分枝杆菌细菌的鉴定,并且因此依赖于样品中细菌的存在。这需要一定的细菌载量和传染性材料的获得,因此该方法不适于感染的早期诊断,即在临床疾病发病前。胸部X射线不灵敏,并且仅可应用于肺TB以及用于在更加发展的阶段检测TB。
标准结核菌素皮肤测试,表现出迟发型超敏反应(DTH),是一种基于免疫学识别暴露的个体中的分枝杆菌抗原的简单和便宜的测定。但是,其在检测结核分枝杆菌感染中还远不理想。其采用纯化的蛋白衍生物(PPD)的皮内注射,PPD是粗的且分枝杆菌抗原的不明确的混合物,其中的一些与来自疫苗亚菌株牛分枝杆菌bacilleCalmette-Guèrin(BCG)和来自非结核环境的分枝杆菌的蛋白质是共享的。PPD的这种广泛的交叉反应引起差的TST特异性,导致BCG疫苗接种和暴露于非结核性分枝杆菌产生类似于在结核分枝杆菌感染个体中所见结果的测试结果的情况。
结核分枝杆菌感染介导强烈的细胞介导的免疫(CMI)应答,并且对于免疫细胞以及来源于此类细胞作为对结核分枝杆菌感染特异性应答的一部分产生的任何产物的检测,将是检测感染的合适方法(Andersen,2000)。为了产生这样的特异性应答,试剂必须1)被结核分枝杆菌感染的个体广泛识别,并且2)对于结核分枝杆菌是特异性的从而区分TB感染、BCG疫苗接种和暴露于非结核环境的分枝杆菌。
结核分枝杆菌的基因组预测了4018个开发阅读框(http://tuberculist.epfl.ch/,releaseR27-2013年3月)。但是,这些中仅有小部分是被来自人类TB患者的外周血单核细胞(PBMC)强烈和广泛识别的T细胞抗原。已经开发了预测T细胞表位的算法,但是实验验证对于鉴定免疫显性抗原CFP10和ESAT-6是必要的。结核分枝杆菌细胞外蛋白或培养滤液(CF)蛋白组成在T细胞抗原中富集的蛋白质组分(Andersen1994),并且通过基于二维蛋白组学的方法分离CF蛋白,导致59个人类T细胞抗原的鉴定,所述59个人类T细胞抗原中的35个以前已经被描述(Deenadayalan,2010)。虽然该列表可能不够详尽,其强调接近900CF的蛋白的仅一小部分(Albrethsen,2013)是T细胞抗原。逻辑上,可以期待大多数从结核分枝杆菌基因组编码的最具免疫显性的抗原将是最高表达的子集,并且使用目前的技术可能根据某些生长条件下的转录水平排列这些基因。但是,转录水平对免疫原性作出的贡献低,并且其不能系统地使用以精确的找到哪个基因编码相关抗原(Sidders,2008)。
高度特异性的候选试剂可以从来自结核分枝杆菌基因组的RD区域(缺失区域)的抗原中寻找。这些区域代表来自牛分枝杆菌BCG疫苗菌株的与有毒力的结核分枝杆菌菌株相比的基因组缺失(Behr,1999)。因此,理论上,来自这些区域的蛋白(RD蛋白)将是作为TB诊断试剂的优良候选,即其不应该被健康的未感染的个体识别,这不依赖于它们的BCG疫苗状态或暴露于非致病性分枝杆菌菌株。但是,在所有预测的从BCG缺失的基因组ORF(开放阅读框)中的哪一个被实际表达为蛋白质是本身未知的,此外,免疫反应性(immunoreactivity)仍是未知的,除非用来自结核分枝杆菌感染的个体的敏化的淋巴细胞测试。这可以例如通过PBMC的再次刺激或通过以类似于施用PPD/核菌素皮内测试(Mantouxtest)的方式注射该物质到皮肤中在全血测定中完成。例如Rv3872的评价显示在诊断后1-4个月在测试的人类TB患者中(n=7)的低干扰素γ(IFN-γ)应答(WO99/24577),说明该RD蛋白不被频繁识别,并且因此Rv3872不被进一步追踪用于基于CMI的诊断测试。
潜在的特异性结核分枝杆菌蛋白不限于RD蛋白,因为例如EspC蛋白(Rv3615c)在人类TB患者中和牛分枝杆菌感染的牛中被特异性识别,但在BCG疫苗接种/感染的中不被特异性识别,即使该基因存在于BCG中(WO2009060184;Sidders,2008;Millington,2011)。在BCG疫苗接种的个体中缺少反应最可能是由于在BCG中消除了Rv3615c的分泌,因为Rv3615c的分泌依赖于部分定位于RD1位点且在BCG中不存在的ESX-1分泌系统。该抗原是CMI诊断试剂,在诱导相当强烈的IFN-γ应答上,被认为与ESAT-6和CFP10一样有效(同上)。
当潜在的特异性T细胞抗原已经被鉴定时,应该验证该抗原在结核分枝杆菌感染的个体中被特异性识别,并且在BCG疫苗接种的人中不被识别。对于来自RD1的Rv3873,似乎该蛋白是具有氨基酸118-135的保守基序(motif)的蛋白家族的成员,所述基序也存在于其他结核分枝杆菌蛋白中。由于被广泛识别的T细胞表位存在于该基序中,BCG疫苗接种的个体也对跨越该序列的肽应答(Liu,2004)。但是,虽然通过与其他已知的分枝杆菌蛋白序列比较未检测到同源性,对Rv3878和Rv3879c也观察到交叉反应(Liu,2004),这强调潜在诊断候选物的特异性需要被实验验证。以同样的方式,来自RD13的Rv2653c在BCG疫苗接种的供体和TB患者中被识别,虽然用BLAST算法的数据库搜索未显示任何明显的可以解释观察到的交叉反应的分枝杆菌蛋白(Aagaard,2004)。
已经鉴定了具有通过基于CMI的测定诊断结核分枝杆菌感染的潜能的结核分枝杆菌特异性蛋白,仍需要研究这类蛋白/肽的库是否会提供诊断测试所需的灵敏度。不可能预测给定抗原在与已经确定的诊断抗原组合后将增加多少的灵敏度;这必须对每个抗原进行实验评估,并且优选地在来自世界不同地区具有不同遗传背景的TB患者中进行实验评估。
来自RD1区域的两个低分子蛋白CFP10(Rv3874)、ESAT-6(Rv3875)和TB7.7(Rv2654)的诊断潜能被很好地记载(Brock,2004;Moon,2013,WO2004099771),并且所述三个蛋白目前在注册用于人类使用的不同诊断试剂中使用。覆盖CFP10和ESAT-6的肽被用于TB测试中,TB测试是一种检测在已经用ESAT-6和CFP10再刺激的PBMC中发现的T细胞免疫应答的细胞血液测试测试。该应答通过被命名为ELISPOT的高度灵敏的酶联免疫斑点法检测,并且作为T-SPOT.TB测试被商业化。该测试具有高度灵敏度并且不依赖于BCG疫苗接种状态。另一个用于检测结核分枝杆菌感染的注册的测试是Gold,其是能够在用覆盖ESAT-6、CFP10的肽和来自TB7.7的单个肽再刺激后的全血样品中检测免疫应答的体外诊断技术。这两个测试均测量响应于对选择的特异性抗原肽库暴露的干扰素γ(IFN-γ)的产生,并且被认为是目前的最先进技术。T-SPOT.TB和Gold测试共同被认为是IFN-γ释放测定(IGRA)。
当监测对分枝杆菌抗原的免疫应答时,除了IFN-γ之外的其他细胞因子和趋化因子也显示出关联性。IFN-γ诱导的蛋白(IP-10)以比IFN-γ高100倍的水平表达,并且基于IP-10的分泌的诊断测定已经表现出与IFN-γ释放测定相当的诊断性能(Ruhwald,2009)。
除了这些已经注册用于人类使用并且全世界使用的体外测试,ESAT-6和CFP10也已被证明是有效的皮肤测试试剂。临床研究已经表明,以与PPD相同的方式应用但是使用作为重组蛋白产生并递送的ESAT-6和CFP10的皮肤测试被用于诊断结核分枝杆菌感染并且不受BCG疫苗接种状态的影响(Aggerbeck,2013)。
尽管广泛使用BCG和包括IGRA在内的若干诊断方法,TB继续以每年几乎两百万的死亡作为代价,并且存在对开发具有改进的灵敏度的免疫诊断测试的持续需要。免疫损伤的患者存在发生TB的高风险,并且不幸的是,TST和IGRA二者以其现在的形式,在这些组中表现欠佳。最需要改进的测试的患者组包括:HIV感染的患者、患有免疫介导的炎性疾病的患者、接受免疫抑制性药物治疗(例如泼尼松龙或TNF-α抑制剂)的患者以及患有慢性肾功能衰竭的患者。在(Redelman-Sidi,2013)的综述中,例如在HIV感染的患者中,公知低的CD4细胞数(例如<250细胞/μl)与对于暴露的个体中高比率的不确定的测试结果、牺牲对活动性TB的测试灵敏度、阳性测试反应可能性降低强烈相关。
另一个与靶向的测试非常相关的组是儿童。诊断在儿童中的潜伏性TB感染(LTBI)和TB是困难的,微生物学确定感染通常是不可得的,并且治疗仅由临床表现指导。在活动性和假定的潜伏性感染的幼儿中,免疫系统不成熟,并且是较低的细胞因子释放和减弱的IGRA性能的可能原因。近期,显示在81个患有微生物学确定的TB的儿童中,Gold测试具有53%的灵敏度,这支持对于用于儿童中结核分枝杆菌感染的改进的免疫诊断测试的需要(Schopfer,2013)。
在上文提到的高风险患者组(例如免疫抑制的患者组、HIV感染的患者组、儿童)中,IGRA测试性能的核心问题是:驱动其自身增加TB疾病风险的潜在免疫抑制状态由低的CMI应答和低的响应于抗原的IFN-γ释放表征。由于基于IFN-γ释放的量值与截断值(cutoff)的比较确定IGRA的结果,削弱的IFN-γ释放增加了测试结果成为假阴性的风险。因此,对于熟练的技术人员,很明显,包括更加特异性的抗原将募集更加特异性的T细胞,并且导致扩大的CMI应答和IFN-γ释放,并且因此降低应答下降到截断值以下的风险。因此,添加另外的特异性抗原,通过改进诊断灵敏度解决了在IGRA测试中的主要限制。
基于较高量值的应答诊断结核分枝杆菌感染的另一个好处是增加分析的准确度和更可靠的测试结果。在Gold测试中,阳性测试的截断值是0.35Iu/ml或17.5pg/ml,是以高精度甚至用灵敏的方法诸如ELISA难以确定的非常低的浓度。例如,目前对IGRA的最精确研究发现用QuantiFERON-TBGoldIn-Tube再次测试相同的患者样品测量的TB应答变化很大。当起始应答在0.25和0.80IU/ml之间时,个体内部的变化在每个方向包括多达0.24IU/ml的差异。这推出结论:小于0.59IU/ml的阳性QuantiFERONTBGoldIn-Tube测试结果应该被谨慎解释(MetcalfeAJRCCM2012)。
模型化研究表明没有新的疫苗,TB不能被消除,并且新的且更加有效的疫苗是国际优先的。总体观点是为目前的BCG疫苗补充booster亚单位疫苗或创造新的活TB疫苗代替BCG。临床开发中存在增加数目的实验性疫苗,并且形成的共识是ESAT-6似乎是必要的疫苗抗原。因此,目前在临床前水平或在临床测试中的新型疫苗中的许多含有ESAT-6。最近,AerasFoundation宣布含有ESAT-6的疫苗首次用于人体的实验,该实验被设计为防止已经潜伏性感染TB的人发展成活动性TB疾病(Aagaard,2011)。一些活疫苗候选物也被直接重组工程化以表达ESAT-6,例如rBCG:GE(Yang,2011)、rM.S-e6c10(Zhang,2010)、沙门氏菌(Salmonella)/Ag85B-ESAT-6(Hall,2009)、rBCG-A(N)-E-A(C)(Xu,2009)或并入ESAT-6的融合蛋白例如H1(vanDissel,2010;vanDissel,2011)。不幸的是,在IGRA测试中使用基于ESAT-6的诊断,和用含有ESAT-6的疫苗接种是与平行使用TST和BCG相关的交叉反应问题的精确重复。
因此,存在对能够与含有BCG和ESAT-6二者的疫苗平行使用的特异性的诊断试剂的极大需要。使用体内或体外测定,所述试剂应该能够在人类和动物中检测到结核分枝杆菌感染,并且不仅能够区分TB感染与用BCG或新型的含有ESAT-6的疫苗进行的疫苗接种,而且能够区分暴露于非致病性环境分枝杆菌。所述诊断试剂应该至少具有与目前的ESAT-6、CFP10的组合和在一些诊断测定中ESAT-6、CFP10和TB7.7的组合相同的灵敏度。
EP2417456描述了这样的系统,其中Rv3615c与CFP-10的联合使用提供了与ESAT-6/CFP-10组合非常相似的诊断灵敏度。
由于ESAT-6的高度免疫原性和对于结核分枝杆菌的特异性的独特特征,当研究多个群组时,用单一抗原代替ESAT-6与ESAT相比会增加灵敏度是不可能的。这已经被例如Brock等人证实,Brock等人示出在TB患者中的14-43%之间的单个抗原的识别与ESAT-6相比在相同的患者组中产生75%中的应答。考虑到大多数抗原与ESAT-6相比具有更低的免疫原性,更加可能的是抗原库是高量值的应答和改进的诊断灵敏度所需要的。
如示例的,预测抗原组合的灵敏度和特异性并不简单;而且这需要特异性抗原组合的详细设计。此外,通过增加诊断库中肽的数目,其进一步通过增加假阳性的数目引起降低特异性的风险,这强调了用于TB的特异性诊断的诊断组合物或免疫原性组合物需要被仔细选择和测试。
因此,存在对于在人或动物中结核分枝杆菌感染的改进的体内或体外细胞介导的免疫诊断的急切需要。这是对于与现存的抗原组合相比增加灵敏度(其产生更少的假阴性)而不牺牲特异性(假阳性的量)的抗原组合的需求。需要的改进的抗原组合不但涉及不包含ESAT-6抗原的抗原组合物以预期达到引入包含ESAT-6的疫苗时的状况,并且涉及包含ESAT-6的抗原组合物以改进目前的最先进技术的诊断试剂。
我们的数据表明通过添加衍生自具有诊断潜能的三种新型抗原的肽,CFP10/ESAT6和CFP10/Rv3615组合能够被进一步改进。由于两个原因,高新发现是出乎意料的:
a)TB基因组的大多数(>99%)抗原是非特异性的,并且在多种分枝杆菌物种中共有,因此鉴定对于结核分枝杆菌特异的强烈识别的抗原是非常困难的;
b)CFP10/RV3615c和CFP10/ESAT6诊断组合的灵敏度已经非常高,因此由于非特异性应答进一步增加灵敏度甚至变得越来越困难。
因此,本发明是非常令人鼓舞的,因为其描述的多肽具有不但增加CFP10/RV3615c组合的灵敏度,而且增加目前的包含ESAT-6的诊断混合物(cocktail)的灵敏度——并且不牺牲特异性的能力。
发明概述
本发明涉及由TB复合物(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌)的物种引起的感染的改进的检测以及TB感染与疫苗接种的区分。改进的诊断组合物必须既不干扰来自1)新型的包含ESAT-6的TB疫苗、2)BCG的抗原的效果,也不干扰来自暴露于非致病性环境分枝杆菌的抗原的效果。本发明公开了改进的诊断组合物或免疫原性组合物,其可以在体内或体外使用以检测对结核分枝杆菌感染的细胞应答,并且因此被用于诊断TB。通过使用抗原混合物或抗原库或覆盖这些抗原的肽混合物或肽库,我们使所述测试即使在免疫原性诊断组合物中不存在ESAT-6的情况下也高度灵敏。此外,我们已经进一步改进了目前使用的包含ESAT-6的免疫原性诊断组合物。
发明的详细公开
该诊断方法基于感染期间由结核分枝杆菌(或来自结核复合体的其他分枝杆菌)细菌表达的抗原的细胞介导的免疫学(CMI)识别。因此,该测试不像传统培养、显微镜检查和PCR方法那样需要存在细菌。这意味着所述测试可以应用于感染阶段的早期,并且不论感染的解剖部位如何,所述测试是可以应用的。所述方法在接触追踪中作为目前使用的TST的代替物是理想的。
通过选择具有理论诊断潜能的结核分枝杆菌特异性抗原,并且在一系列人类TB患者中测试识别,我们能够鉴定三个诊断库,所述诊断库1)缺少ESAT-6,并且因此也可以在ESAT-6疫苗接种的个体中使用以区分结核分枝杆菌感染和疫苗接种,2)表现出与包含ESAT-6的诊断库相同的高特异性,和3)呈现对于结核分枝杆菌感染的优于通过ESAT-6、CFP10和TB7.7的组合获得的灵敏度的灵敏度。
本发明公开了一种诊断组合物或免疫原性组合物,所述诊断组合物或免疫原性组合物包含基本上纯的多肽的混合物,所述多肽包含选自以下氨基酸序列:
a)
Rv3874(SEQIDNO1)、Rv3615(SEQIDNO2)和选自Rv3865(SEQIDNO3)、Rv2348(SEQIDNO4)、Rv3614(SEQIDNO5)、Rv2654(SEQIDNO6)和Rv3877(SEQIDNO7)的另外的组合物;
或b)
所述多肽的片段的混合物;
或c)
其中所选择的多肽的混合物或所述多肽的片段的混合物与来自a)或b)中的选择的多肽中的任一个具有至少80%的序列同一性并且同时是有免疫原性的。
在包含ESAT-6的疫苗将不被注册用于人类使用的情况下,在未正在使用包含ESAT-6的疫苗的地区,以及在其他的情况下例如为了进一步增加诊断测试的灵敏度,上文公开的诊断组合物或免疫原性组合物中的任一种可以补充有ESAT-6(SEQIDNO51)或其一种或其更多种片段。
优选的诊断组合物包含含有Rv3874、Rv3615以及任选地ESAT-6的免疫原性表位的片段的混合物,其中包含SEQIDNO1的免疫原性表位的片段选自SEQIDNO9-14,并且包含SEQIDNO2的免疫原性表位的片段选自SEQIDNO15-18或SEQIDNO59-63,并且包含SEQIDNO51的免疫原性表位的片段选自SEQIDNO52-58,其中包含SEQIDNO3的免疫原性表位的片段选自SEQIDNO19-21,并且包含SEQIDNO4的免疫原性表位的片段选自SEQIDNO22-25,并且包含SEQIDNO5的免疫原性表位的片段选自SEQIDNO26-45,并且其中包含SEQIDNO6的免疫原性表位的片段是SEQIDNO8,并且包含SEQIDNO7的免疫原性表位的片段选自SEQIDNO46-50。
所述诊断组合物或免疫原性组合物中的多肽可以以独立的实体存在,或所述多肽中的一些或全部融合在一起,任选地经由接头或间隔物融合在一起。
优选的诊断组合物或免疫原性组合物包含在实施例中提到的作为肽库A的SEQIDNO9-14、SEQIDNO15-18、SEQIDNO19-21和SEQIDNO22-25的库或混合物。
优选的多肽和所述多肽的片段的详细描述
CFP10(SEQIDNO1)是主要的ESX-1蛋白。选择以下覆盖CFP10的整个氨基酸序列的6个肽(SEQIDno9-14)。
Rv3615c(SEQIDNO2)是由ESX-1系统分泌的蛋白。选择覆盖氨基酸55-103的4个肽(SEQIDNO15-18)。覆盖Rv3615的C末端部分的可选的肽是具有氨基酸序列SEQIDNO59-63的5个肽。
Rv3865(SEQIDNO3)是ESX-1分泌相关蛋白:选择覆盖氨基酸9-44的3个肽(SEQIDno19-21)。
Rv2348c(SEQIDNO4)位于已表明在BCG中不存在的RD7区域:选择覆盖全长蛋白序列的氨基酸56-109的4个肽(SEQIDno22-25)。
Rv3614c(SEQIDNO5)是分泌蛋白:选择覆盖整个序列的20个肽(SEQIDno26-45)。
Rv2654c(SEQIDNO6)是由RD11区域编码的具有未知功能的蛋白:选择肽4(SEQIDno8)。
Rv3877(SEQIDNO7)位于RD1区域,并且在BCG中不存在:选择覆盖全长蛋白(511aa)中的氨基酸220-284的5个肽(SEQIDno46-50)。
ESAT-6(Rv3875;SEQIDNO51)是主要的ESX-1蛋白。选择覆盖整个序列的7个肽(SEQIDNO52-58)。
本发明进一步公开了所述诊断组合物或免疫原性组合物用于制备用于诊断TB的药物组合物的用途,所述TB由有毒力的分枝杆菌例如由结核分枝杆菌、牛分枝杆菌或非洲分枝杆菌引起,并且公开了包含上文提到的诊断组合物或免疫原性组合物的用于在体内或体外诊断TB的CMI诊断工具或试剂盒。
本发明还公开了使用上文提到的诊断组合物或免疫原性组合物在包括人类的动物中诊断TB的体外和体内方法,所述TB由有毒力的分枝杆菌例如由结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌或牛分枝杆菌引起。
诊断TB的体内方法包括在包括人类的动物中皮内注射如上文限定的药物组合物,其中在注射部位的阳性皮肤反应指示该动物患有TB,且在注射部位的阴性皮肤反应指示该动物未患有TB。
诊断TB的体外方法包括使样品例如血液样品与根据本发明的诊断组合物或免疫原性组合物接触以检测阳性反应,所述阳性反应例如细胞的增殖或细胞因子诸如IFN-γ的释放。
本发明的诊断组合物或免疫原性组合物可以代替目前在已建立的IGRA测试中使用的组合物(在测试中的CFP10/Rv3874和ESAT-6/Rv3875以及在Gold中的TB7.7/Rv2654c、CFP10/Rv3874和ESAT-6/Rv3875)。
此外,相比于在测试中的CFP10/Rv3874和ESAT-6/Rv3875,以及Gold中的TB7.7/Rv2654c、CFP10/Rv3874和ESAT-6/Rv3875,本方法进一步具有以下改进:
如果个体已经用包含ESAT-6的疫苗诸如包含ESAT-6的亚单位蛋白疫苗或被工程化的或固有的表达ESAT-6的重组活疫苗接种,所用组合物避免使用ESAT-6并且因此仍对结核分枝杆菌感染特异。对于测试中的CFP10和ESAT-6,以及在Gold中的TB7.7、CFP10和ESAT-6或基于ESAT-6的任何其他测试,情况不是这样的。
包含ESAT-6的组合物在基于CMI的结核分枝杆菌测试中正在被使用。提供的测试可以避免使用ESAT-6,并且利用从使用多于一种结核分枝杆菌特异性的抗原获得的广泛识别。与使用Quantiferon抗原的74%的灵敏度和96%的特异性相比,在我们的测试中我们使用CFP10、Rv3615c、Rv3865和Rv2348的组合(肽库A)获得87%的灵敏度和98%的特异性。因此,尽管缺失已知为高度灵敏的抗原并且被高比例的具有结核分枝杆菌感染的个体识别的ESAT-6,本文测试的组合物获得比公知的基于ESAT-6且目前在IGRA测定中使用的组合物高>10%的灵敏度。
在此,我们还提供了表明以下的数据:通过向由CFP10、Rv3615c、Rv3865和Rv2348组成的肽库中添加ESAT-6,我们能够进一步改进诊断性能。通过向特定的肽库中添加ESAT-6,我们能够增加应答的量值,这可以对于在患有不同免疫抑制并发症例如HIV的个体中的诊断或对于在例如儿童中的使用是有意义的。并且,通过使用来自所有5个抗原(CFP10、ESAT-6、Rv3865、Rv2348和Rv3615c)的肽的组合,与具有仅CFP10、Rv3615c、Rv2348和Rv3865的库相比,我们可以将具有确定的TB诊断的患者的频率增加3%。
本发明还公开了用于诊断TB的体内测试。这可以为使用以上提到的组合物在包括人类的动物上的皮肤测试的形式。所述皮肤测试为:将本发明的组合物皮内注射到动物中或例如用贴剂或绷带应用到动物皮肤上。在注射或应用部位的阳性皮肤测试反应指示动物或人类患有TB,且在注射或应用部位的阴性皮肤测试反应指示动物未患有TB。
本发明的肽库不必要以其全长包含蛋白,因为仅6-9个氨基酸(T细胞表位)的序列足以诱导免疫应答,但全长蛋白也将是有用的。由于对于本领域技术人员来说确定嵌入蛋白的T细胞表位的确切和最小的氨基酸序列是可能的,本发明还涉及包含所述T细胞表位(或其类似物)而无如全长蛋白一样的特定的额外的氨基酸的多肽的片段(免疫原性部分),和包含所述T细胞表位的融合蛋白(任选地经由接头或间隔物连接),并且涉及包含这类多肽或融合蛋白的混合物或库。
本发明的进一步的实施方案在实施例中和权利要求中描述。
定义
多肽
本发明中的词“多肽”应该具有其通常的含义。其是任何长度的氨基酸链,包括全长蛋白、寡肽、短肽及其片段,其中氨基酸残基由共价的肽键连接。多肽可以通过被糖基化、通过被脂化、通过包含辅基、或通过含有另外的氨基酸诸如例如his-标签或信号肽被化学修饰,所述脂化例如,如Mowat等(Mowat,1991)所述的用棕榈酰氧基琥珀酰亚胺化学脂化,或如(Lustig,1976)所述的用十二酰氯化学脂化。
因此,每个多肽可以由特定的氨基酸表征,并且由特定的核酸序列编码。应理解,这类序列包括通过重组或合成方法产生的类似物和变体,其中这类多肽序列已经通过置换、插入、添加或缺失重组多肽中的一个或更多个氨基酸残基被修饰,并且在本文所述的生物学测定的任一个中仍有免疫原性。优选地置换是“保守的”。这些是根据下表定义的。在第二列的相同的框中地氨基酸并且优选地在第三列的相同行中的氨基酸可以彼此置换。第三列中的氨基酸以单字母码指示。
脂肪族 | 非极性 | GAP |
ILV | ||
极性不带电 | CSTM | |
NQ | ||
极性带电 | DE | |
KR | ||
芳香族 | HFWY |
本发明内优选的多肽是来自结核分枝杆菌的免疫原性抗原的片段。例如,这种抗原可以衍生自结核分枝杆菌细胞和/或结核分枝杆菌培养滤液。因此,包含以上抗原之一的免疫原性部分的多肽可以完全由免疫原性部分组成,或可以包含另外的序列。所述另外的序列可以衍生自天然的结核分枝杆菌抗原或是异源的,并且这类序列可以,但不必需是免疫原性的。
在本发明的上下文中,术语“基本上纯的多肽片段”意指含有以重量计最多10%的与其天然缔合的其他多肽物质的多肽制剂(优选更低百分比的其他多肽物质,例如最多4%、最多3%、最多2%和最多1%)。优选的是,基本上纯的多肽是至少96%纯,即所述多肽组成存在于制剂中总多肽物质的以重量计至少96%,并且优选更高的百分比,诸如至少97%、至少98%、至少99%、至少99.25%、至少99.5%和至少99.75%。特别优选的是多肽片段呈“基本上(essentially)纯的形式”,即所述多肽片段基本上不含任何与其天然缔合的其他抗原,即不含任何来自于属于结核复合体或有毒力的分枝杆菌的细菌的其他抗原。这可以通过如在下面将详细描述的在非分枝杆菌宿主细胞中通过重组的方式制备多肽片段完成,或通过经由已知的固相或液相肽合成方法合成多肽片段,例如通过由(Merrifield1963)所述的方法或其变化实现。
“结核病”(TB)被理解为由来自结核复合体的有毒力的分枝杆菌引起的感染,结核复合体的有毒力的分枝杆菌能够在动物或人类中引起TB感染和疾病。有毒力的分枝杆菌的实例是结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌和牛分枝杆菌。相关动物的实例是牛、负鼠、獾和袋鼠。
“TB患者”被理解为具有培养或显微镜检查证明的有毒力的分枝杆菌感染的个体,和/或临床诊断患有TB且对抗-TB化学疗法有反应的个体。TB的培养、显微镜检查和临床诊断对本领域的任何技术人员是熟知的。
术语“迟发型超敏反应”(DTH)被理解为,注射多肽到皮内或应用多肽至皮肤后引起的T细胞介导的炎性反应,所述炎性反应在多肽注射或应用后72-96小时出现。
术语“细胞因子”被理解为可以被用作免疫应答的指示的任何免疫调节剂诸如白细胞介素和干扰素。这包括例如干扰素-γ“IFN-γ”、也被称为CXCL10或“IP-10”的干扰素-γ诱导的蛋白10和白细胞介素2(IL-2)。
遍及本说明书,除非上下文另有要求,否则词语“包含(comprise)”或其变化形式诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为意指包含陈述的元素或整体或者元素或整体的组,但不排除任何其他元素或整体或者元素或整体的组。
序列同一性
术语“序列同一性”指示两个相同长度的氨基酸序列之间或两个相同长度的核苷酸序列之间的同源程度的定量量度。待比较的两个序列必需被比对到最佳可能的匹配,可能利用插入空白,或可选地,在蛋白序列的末端截短实现。序列同一性可计算为其中Ndif是比对时两个序列中不相同的残基的总数,并且其中Nref是序列的一个中残基的数目。因此,DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC将具有75%的序列同一性(Ndif=2且Nref=8)。空位被算作特定残基的非同一性,即DNA序列AGTGTC与DNA序列AGTCAGTC将具有75%的序列同一性(Ndif=2和Nref=8)。可选择地,序列同一性可以通过BLAST程序例如BLASTP程序(Pearson,1988)(www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST)计算。在本发明的一个方面,用在http://www2.ebi.ac.uk/clustalw/可得的如Thompson等(Thompson,1994)所述的序列比对方法ClustalW使用默认参数进行比对。
优选的序列同一性的最小百分比是至少80%,诸如至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%和至少99.5%。
免疫原性表位
多肽的免疫原性表位是通过本文所述的生物学测定中的任一个确定的在动物或人类中和/或在生物样品中引起免疫应答的多肽的部分。多肽的免疫原性表位可以是T细胞表位或B细胞表位。免疫原性表位可以与多肽的一个或一些相对小的部分相关,其可以遍及多肽序列分散或位于多肽的特定部分。对于一些多肽,甚至已经证实表位遍及覆盖整个序列的多肽分散(Ravn,1999)。
为了鉴定在免疫应答期间被识别的相关的T细胞表位,可能使用“暴力(bruteforce)”方法:由于T细胞表位是线性的,如果是被系统构建的,多肽的缺失突变体将揭示多肽的哪个区域在免疫识别中是必需的,例如通过使这些缺失突变体经历例如本文所述的IFN-γ测定。另一个方法利用重叠肽用于检测MHCII类表位,所述重叠肽优选为合成的、具有衍生自所述多肽的例如20个氨基酸残基的长度。这些肽可以在生物学测定(例如本文所述的IFN-γ测定)中被测试,并且这些中的一些将产生阳性反应(并且因此是免疫原性的),作为肽中存在T细胞表位的证据。为了检测MHCI类表位,可能预测将会结合(Stryhn,1996)的肽,并且此后生产合成的这些肽,并且在相关的生物学测定例如本文所述的IFN-γ测定中测试它们。所述肽优选地具有来自所述多肽的例如8到11个氨基酸残基的长度。
虽然已经表明T细胞表位的最小长度是至少6个氨基酸,这类表位由较长延长的氨基酸组成是正常的。因此,优选的是,本发明的多肽片段具有至少7个氨基酸残基的长度,诸如至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个、至少22个、至少24个和至少30个氨基酸残基。因此,在本发明方法的重要实施方案中,优选的是,多肽片段具有最多50个氨基酸残基的长度,诸如最多40、35、30、25和20个氨基酸残基。预期具有在10到30个氨基酸残基之间的长度的肽将证明作为MHCII类表位是最有效的,因此本发明方法中使用的多肽片段的特别优选的长度是18,诸如15、14、13、12和甚至11个氨基酸残基。预期具有在7到12个氨基酸残基之间的长度的肽将证明作为MHCI类表位是最有效的,因此本发明方法中使用的多肽片段的特别优选的长度是11,诸如10、9、8和甚至7个氨基酸残基。
包含免疫原性表位的多肽的免疫原性部分(包含免疫原性表位的片段),可以被遗传异质性人类群体的大部分(高频率)或小部分(低频率)识别。此外,一些免疫原性部分诱导高免疫应答(显性的),而其他诱导较低的但仍显著的应答(亚显性)。高频率><低频率可以与结合到广泛分布的MHC分子(HLA类型)或甚至被多个MHC分子结合的免疫原性部分相关(Sinigaglia,1988;Kilgus,1991)。包含来自所述多肽的免疫原性表位的片段可以作为至少10个氨基酸长度的重叠肽存在,因此跨越多个表位。
变体
本发明的组合物的多肽的共同特征是其诱导免疫应答的能力,如在实施例中阐明的。应理解,通过置换、插入、添加或缺失产生的本发明的多肽的变体也是通过本文所述的测定的任一个确定的有免疫原性的。
免疫个体
免疫个体被定义为已经清除或控制了有毒力的分枝杆菌感染,或已经接受牛分枝杆菌BCG疫苗接种的人或动物。
免疫原性的
免疫原性多肽被定义为在生物学样品中或在目前或以前感染有毒力的分枝杆菌的个体中诱导免疫应答的多肽。免疫原性多肽是抗原或抗原多肽的同义词,并且两个术语免疫原和抗原在本公开中无差别地使用;对于抗原的严格定义是其能够特异性结合到T或B细胞受体,对于免疫原的严格定义是其能够引起免疫应答,但当提到诊断时这两个术语的作用是一样的,并且因此本文无差别地使用。
CMI诊断
免疫应答可以通过以下方法之一监测:体外CMI应答通过相关细胞因子诸如IFN-γ从由目前或以前感染有毒力的分枝杆菌的动物或人类中取出的淋巴细胞的释放而确定,或通过检测这些T细胞的增殖而确定。通过向优选地每孔包含从1×105个细胞到1×106个细胞的血细胞悬浮液添加免疫原性组合物进行诱导。从血液、脾、肝脏或肺分离细胞并且添加免疫原性组合物得到例如每ml悬浮液1-200μg的浓度,并且刺激进行2天至5天。为了监测细胞增殖,细胞被用放射性标记的胸苷脉冲标记(pulse),并且培养16-22小时后,通过液体闪烁计数或检测增殖反应的任何其他方法检测增殖。可以通过本领域技术人员熟知的ELISA方法确定IFN-γ的释放。当监测对多肽的免疫应答时除了IFN-γ的其他细胞因子和趋化因子,诸如IL-2、IL-12、TNF-α、IL-4、TGF-β、IP-10、MIP-1β、MCP-1、IL-1RA和MIG,可以是相关的。用于确定存在细胞因子(例如IFN-γ)的另一个且更灵敏的方法是ELISPOT方法,其中从例如血液分离的细胞被稀释至优选的1至4×106个细胞/ml的浓度,并且在产生优选的1-200μg/ml的浓度的诊断组合物或免疫原性组合物的存在下孵育18-22小时。此后,细胞悬浮液被稀释至1到2×106/ml,并且转移到被用抗IFN-γ包被的聚偏氟乙烯膜微量滴定板,并且孵育优选4到16小时。产生IFN-γ的细胞通过使用标记的二级抗IFN-γ抗体和产生可以使用解剖显微镜计数的斑点的相关底物确定。FluoroSpot测定是ELISPOT测定的改变形式,并且基于使用多个荧光抗细胞因子,使在相同的测定中标出2个细胞因子成为可能,可能允许改进的预测疾病风险,如下文对IL-2和IFN-γ共确定所描述的。还可能使用侧流技术确定细胞因子或趋化因子应答的存在。这种类型的测定——从快速妊娠测试熟知的——使能够快速检测释放的细胞因子或趋化因子的水平,并且也使能够在非常资源限制的设置中诊断感染和疾病。其他免疫测定包括比色测定诸如比浊法是技术人员熟知的,并且可以被用于高通量检测细胞因子或趋化因子的水平。还可能通过使用聚合酶链式反应(PCR)技术确定编码相关细胞因子的mRNA的存在。由于mRNA转录先于蛋白质合成,检测mRNA水平的细胞因子或趋化因子通常比蛋白质水平快。例如,与蛋白质水平相比,细胞因子IFN-γ和趋化因子IP-10的mRNA水平在较短的孵育时期方面是最佳的。在mRNA水平上检测的细胞因子和趋化因子信号可以早在刺激后2小时完成,并且在6-10小时达到最大水平。通常将利用例如PCR、侧流、ELISPOT或ELISA,测量一个或更多个细胞因子。本领域技术人员会理解,由特异性多肽诱导的这些细胞因子中的任一个的量的显著增加或减少可以被用于评价所述多肽的免疫活性。熟练的技术人员也理解特定模式的细胞因子释放与某些临床状态相关。特别地,IFN-γ相对于IL-2的优势被提出为早期活动性TB疾病的指示,而IL-2相对于IFN-γ的优势表示感染控制和发展成TB疾病的低风险,尽管在经历测试的哺乳动物中存在感染(Biselli,2010;Sester,2011)。
体外CMI应答可以通过添加细胞因子诸如IL-7和/或IL-15放大,并且放大的释放可以通过阻断抑制性物质诸如IL-10、IL-4、IL-5和/或IL-13实现。如果体外培养条件对于经历刺激的细胞是最适的,相似的CMI应答可以被更可靠地检测到。这类条件可以通过例如以单糖和复合糖的形式添加营养素被提供。
一种更加简单且又灵敏的方法是使用未事先分离单核细胞的全血样品。对于这种方法,50-1000ml量的肝素化的全血样品(经过或未经事先裂解红细胞)和与得到优选的1-200μg/ml悬浮液的浓度的本发明的诊断组合物或免疫原性组合物在18小时到6天内进行孵育。收获上清液,并且通过本领域技术人员熟知的ELISA方法可以确定IFN-γ(或任何其他相关的释放的细胞因子例如IP-10、IL-2或其他)的释放。
另一种也简单且又灵敏的确定CMI应答的体外方法是与诊断组合物或免疫原性组合物孵育之后,将样品点到滤纸例如Whatman903或WhatmanFTA纸上。干燥后,稳定点出的样品,并且可以在后面的阶段检测样品中细胞因子和趋化因子的水平。用上文提及的用于蛋白质或mRNA测量的技术,容易检测CMI应答。此方法特别适合用于低资源设置或用于高通量样品制备和分析。
另一种体外方法包括用免疫原性多肽或其融合蛋白预先包被真空(vacutainer)采血管,还任选地添加血液稳定剂诸如肝素和/或营养素。预先包被的孵育管允许简单的血液收集,并且在制备用于体外孵育的样品时消除暴露于血源性感染的风险。这类真空管对于高通量处理和自动化是理想的。
因此,本发明还涉及用于诊断携带有毒力的分枝杆菌的动物或人类中进行中的或以前的敏化作用的体外方法,所述方法包括提供来自动物或人类的血液样品,并且使来自动物的样品与本发明的多肽或组合物接触,由血液样品中的单核细胞显著释放至少一种细胞因子到细胞外相,指示动物被敏化。阳性反应为高于从来源于诊断为未患TB的患者的血液样品的释放加两个标准偏差的反应。
体外CMI应答也可以通过使用来源于免疫个体或结核分枝杆菌感染的人的T细胞系确定,其中所述T细胞系已经用活的分枝杆菌、来自所述细菌细胞的提取物或培养滤液并添加IL-2驱动(drive)10到20天。通过向包含例如每孔1×105个细胞到3×105个细胞的T细胞系中添加优选的每ml悬浮液1-200μg多肽进行诱导,并且进行孵育两天至六天。IFN-γ的诱导或另一种相关细胞因子的释放由ELISA检测。也可以通过如上文所述使用放射性标记的胸苷检测细胞增殖来监测T细胞的刺激。对于两个测定,阳性反应是高于背景加两个标准偏差的反应。
体内CMI应答(例如皮肤测试、透皮测试、贴肤测试)其按照以本发明的诊断组合物或免疫原性组合物中每种多肽优选1-200μg皮内注射或局部应用贴片到临床或亚临床感染有毒力的分枝杆菌的个体后的阳性反应来确定,阳性反应是注射或应用后72-96小时具有至少5mm的直径。
诊断准确性和截断
任何给定诊断测试的灵敏度表明通过该测试正确鉴定或诊断的具有阳性反应的个体的比例,例如,如果具有给定状况的所有个体具有阳性测试,灵敏度是100%。给定筛选测试的特异性反映通过测试被正确鉴定或诊断的不具有状况的个体的比例,例如,如果所有不具状况的个体具有阴性测试结果,特异性是100%。
灵敏度被定义为通过本发明所述的方法被正确鉴定(例如具有阳性IFN-γ测试结果)的具有给定状况(例如,活动性TB感染)的个体的比例。
本文的特异性被定义为通过本发明所述的方法被正确鉴定(例如具有阴性IFN-γ测试结果)的不具有状况(例如,未暴露于活动性TB感染)的个体的比例。
接受者操作特性
诊断测试的准确性由其接受者操作特性(ROC)最佳描述(Zweig,1993)。ROC曲线图是在观察的整个数据范围内由连续变化的判定阈所得的所有灵敏度/特异性对的图。
实验室测试的临床性能取决于其诊断准确性,或将受试者正确分类到临床相关的亚组的能力。诊断准确性测量测试正确区分被研究的受试者的两种不同状况的能力。所述状况例如是健康和疾病、潜伏性或近期感染相对于未感染、或良性疾病相对于恶性疾病。
在每种情况下,ROC曲线通过对完全范围的判定阈绘出灵敏度对1-特异性,描绘在两种分布间的重叠。y轴上是灵敏度或真阳性分数[定义为(真阳性测试结果的数目)(真阳性的数目+假阴性测试结果的数目]。存在疾病或状况时,这也被指称为阳性。其从受影响的亚组单独计算。x轴上是假阳性分数或1-特异性[定义为(假阳性结果的数目)/(真阴性的数目+假阳性结果的数目)]。其是特异性的指数,并且完全从未受影响的亚组计算。
由于真阳性分数和假阳性分数是通过使用来自两个不同亚组的测试结果完全独立计算的,ROC曲线图不依赖于样品中疾病的患病率。ROC曲线图上的每个点代表对应于特定决定阈的灵敏度/特异性对。具有完美辨别性(结果的两个分布中无重叠)的测试具有穿过左上角的ROC曲线,其中真阳性分数是1.0或100%(完美灵敏度),且假阳性分数是0(完美特异性)。对于不具有辨别性的测试的理论曲线(对于两组的结果分布一致)是从左下角到右上角的45°对角线。大多数曲线落在这两个极端之间。(如果ROC曲线完全落在45°对角线下面,这通过将“阳性”标准从“大于”颠倒为“小于”容易地纠正,或反之亦然。)定量地,曲线越接近左上角,测试的整体准确性越高。
定量实验室测试的诊断准确性的一个方便目标是通过单一数字表示其性能。最普遍的全局测量是在ROC曲线下的面积。按照惯例,该面积总是>0.5(如果不是>0.5,可以颠倒判定准则使其>0.5)。值范围在1.0(两组的测试值完美分开)和0.5(在两组测试值之间无明显的分布差异)之间。该面积不是只取决于曲线的特定部分诸如最接近对角线的点或在90%特异性处的灵敏度,而是取决于整个曲线。这是ROC曲线如何接近完美ROC曲线(面积=1.0)的定量描述性表达。
新的抗原库的临床利用可以与用于给定感染的其他诊断工具比较并且与其组合进行评价。在结核分枝杆菌感染的情况下,CMI结果的临床应用可以使用接受者操作曲线分析,与已建立的诊断测试诸如IGRA或TST比较进行评价。
制备方法
通常,可以使用多种程序的任一种制备结核分枝杆菌抗原和编码此类抗原的DNA序列。
它们可以通过诸如上文所述的那些的步骤从结核分枝杆菌细胞或培养滤液被纯化为天然蛋白。也可以使用编码抗原的DNA序列重组产生免疫原性抗原,所述DNA序列被插入表达载体并且在合适的宿主中表达。宿主细胞的实例是大肠杆菌。具有少于约100个氨基酸并且通常少于50个氨基酸的多肽或其免疫原性部分也可以被合成产生,并且可以使用本领域普通技术人员熟知的技术产生,诸如商业可得的氨基酸被顺序添加到生长的氨基酸链的固相技术。
在编码多肽的质粒DNA的构建和制备中,可以使用宿主菌株诸如大肠杆菌。然后,可以从携带感兴趣的质粒的宿主菌株的过夜培养物中制备质粒DNA,并且使用例如包括除去内毒素的步骤的QiagenGiga-Plasmid柱试剂盒(Qiagen,SantaClarita,CA,USA)纯化质粒DNA。
融合蛋白
除了是独立的实体,两个或更多个免疫原性多肽也可以作为融合蛋白产生,通过该方法可以获得本发明的多肽的优越特性。例如,当被重组产生时有利于多肽的输出的融合伴侣、有利于多肽纯化的融合伴侣以及增强本发明的多肽片段的免疫原性的融合伴侣都是令人关注的可能。因此,本发明还涉及包含至少两个(诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)多肽或以上定义的免疫原性片段和任选地至少一个另外的融合伴侣的融合多肽,并且涉及包含融合蛋白的组合物。为了增强免疫原性,融合伴侣可以是源自结核分枝杆菌的另一个多肽,诸如源自属于结核复合体的细菌的多肽片段,诸如ESAT-6、TB10.4、CFP10、RD1-ORF2、Rv1036、MPB64、MPT64、Ag85A、Ag85B(MPT59)、MPB59、Ag85C、19kDa脂蛋白、MPT32和α-晶体蛋白,或以上提及的抗原中的任一个的至少一个T细胞表位(WO0179274;WO01041519;(Nagai,1991;Rosenkrands,1998;Skjot,2000)。本发明还涉及包含两个或更多个(诸如3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)本发明的多肽(或其免疫原性部分)的相互融合的融合多肽。
图例
图1.显示基于100pg/ml的IFN-γ的截断的来自埃及的34个志愿者供体中免疫识别的热图。两例患有潜伏性TB(受试者1和2)并且32例被诊断为患有TB疾病(受试者3-34)。白色码指示无反应,灰色码指示反应,并且黑色指示对给定抗原反应而对ESAT-6或CFP10无反应。
图2.显示基于50pg/ml的IFN-γ的截断的来自格陵兰的31个志愿者供体中的免疫识别的热图。14例被诊断患有TB(受试者1-14)并且17例患有潜伏性TB(受试者15-31)。白色码指示无反应,灰色码指示反应,并且黑色指示对给定抗原反应而对ESAT-6或CFP10无反应。
图3.显示基于100pg/ml的IFN-γ的截断的来自埃及的30个地方性对照供体中的免疫识别的热图。所有患者被BCG疫苗接种,并且无TB病史或与已知TB患者接触史。由于其住在被认为是中间的地方性流行的国家的埃及,供体被定义为“地方性流行对照”。白色码指示无反应并且灰色码指示反应。与作为非特异性抗原刺激的实例被包括的PPD不同,研究的抗原都是高度特异的。供体31和77都识别广泛范围的结核分枝杆菌抗原,指示潜伏性感染,而不论提到的选择标准如何。
图4.来自埃及的73个TB患者中对Quantiferon肽库(ESAT-6、CFP10、Rv2654c(肽4))和对肽库A的IP-10应答。虚线指示对Quantiferon抗原为6ng/ml和对肽库A为5.5ng/ml的中值应答。
图5.来自丹麦的100个未暴露于结核分枝杆菌的个体中对Quantiferon肽库(ESAT-6、CFP10、Rv2654c(肽4))和对肽库A的IP-10应答。虚线指示对两个抗原库0ng/ml的中值应答。这显示整个肽库的高度特异性(很少假阳性),指示每个肽具有高度特异性。
图6.来自丹麦的100个未暴露于结核分枝杆菌的个体中对Quantiferon肽库(ESAT-6、CFP10、Rv2654c(肽4))和肽库A的IFN-γ应答。虚线指示对肽库A为0pg/ml和对Quantiferon抗原为4.9pg/ml的中值应答。这显示整个肽库的高度特异性(很少假阳性),指示每个肽具有高度特异性。
图7.在100个未暴露于结核分枝杆菌的个体和73个TB患者中比较肽库A与Quantiferon抗原的诊断潜能的接受者操作特性(ROC)曲线分析。这显示整个肽库的高度特异性(很少假阳性),指示每个肽具有高度特异性。
图8.在来自坦桑尼亚的68例微生物学证实的TB患者和36个地方性流行对照中,对Quantiferon肽库(ESAT-6、CFP10和Rv2654c)和对肽库A的IP-10(ng/ml)应答。
图9.在来自埃及开罗的73个被证实为TB的患者中对肽库A和用ESAT-6富集的肽库A的IP-10(ng/ml)应答。线指示中值。
实施例
实施例1:抗原的初步选择
选择的用于免疫诊断TB的T细胞抗原应该对结核分枝杆菌感染特异,以避免来自BCG疫苗接种和大多数流行的非典型分枝杆菌的干扰。同时,考虑到ESAT-6存在于许多对针对TB的新型疫苗中,避免ESAT-6是重要的。如在以上本发明的背景中所述,通过基于对数百个选择的潜在抗原的理论考虑、实际测试和文献检索的广泛且严格的向下选择(down-selection)方法,我们有不超过9个结核分枝杆菌抗原用于进一步测试。它们是:
CFP10(Rv3874).10-kDa的培养滤液抗原和ESAT-6一起是目前通过IFN-γ释放测定(IGRA)的用于结核分枝杆菌感染的基于细胞的诊断性血液测试的基础。CFP10是免疫显性的结核分枝杆菌抗原,并且CFP10和ESAT-6的诊断特异性是由它们在差异区域1(RD1)中的基因组位置导致的,该区域在所有BCG菌株中不存在(Behr,1999),并且参与结核分枝杆菌的发病机理。编码ESX-1分泌途径的组分的基因也位于RD1中。在一篇关于干扰素γ测定研究的综述中,报道了TB患者中61-71%的对于CFP10的灵敏度(Pai,2004)。与ESAT-6不同,CFP10不是目前在评估的任一疫苗候选物的一部分。
Rv3877.与对CFP10一样,Rv3877基因位于在结核分枝杆菌染色体上的RD1区域,并且在结核分枝杆菌基因组的其他部位不具有相近的同源物。该蛋白不存在于牛分枝杆菌BCG或环境分枝杆菌鸟分枝杆菌(M.avium)中,并因此可被用于特异性的结核分枝杆菌诊断,而不具有来自可能的先前BCG疫苗接种或严重暴露于环境分枝杆菌诸如鸟分枝杆菌的干扰。Rv3877是跨膜蛋白并且是ESX-1分泌的关键组分,由于其形成ESX-1底物被分泌通过的孔(Abdallah,2007)。覆盖Rv3877蛋白的合成肽的库在从人类TB患者中分离的33%的PBMC中诱导阳性反应(Mustafa,2008)。
Rv3614c和Rv3615c.espA-espC-espD(Rv3616c-Rv3615c-Rv3614c)基因簇对于ESX-1依赖的蛋白分泌和结核分枝杆菌毒力是必需的(Fortune,2005;MacGurn,2005),并且这三个基因近期被证明是共转录的(Chen,2012)。Rv3616c和Rv3615c与ESAT-6和CFP10共分泌(Fortune,2005;MacGurn,2005),而Rv3614c的分泌不仅仅需要ESX-1的功能(Chen,2012)。在牛中,Rv3615c的牛分枝杆菌的对应物Mb3645c在37%的牛分枝杆菌感染的动物中刺激IFN-γ应答,但在未经感染的和BCG疫苗接种的动物中则不会(Sidders,2008)。Mb3645c和Rv3615c显示100%的氨基酸同一性。在牛中,Mb3645c蛋白的C末端部分(氨基酸57-103)是最具免疫原性的(Sidders,2008)。在人类中,Rv3615c也已经被鉴定为用于结核分枝杆菌特异的基于T细胞的免疫诊断的潜在候选,具有TB病例的识别和BCG疫苗接种者的低应答(Millington,2011)。在患有活动性TB的患者中,最频繁被识别的肽定位于分子的C末端部分(氨基酸66-90)。虽然编码Rv3615c的基因存在于BCG中,Rv3615c蛋白在结核分枝杆菌感染的个体中被特异性识别,但在BCG接种的人中被有限地识别。
EspF(Rv3865).ESX-1分泌相关蛋白EspF蛋白或牛分枝杆菌Mb3895(与来自结核分枝杆菌的Rv3865相同)被Ewer等鉴定(Ewer,2006)为实验或自然感染牛分枝杆菌的牛中的有前途的诊断标记物。50%的实验感染的牛对Mb3895肽库应答,而BCG疫苗接种的牛对此肽库不应答。
Rv2348c.Rv2348c是具有未知功能的假定蛋白。Rv2348c基因位于RD7区域。已经显示,该区域在BCG中不存在(Behr,1999),并且因此该蛋白可用于TB诊断而不具有来自先前BCG疫苗接种的干扰。该基因在体外高度转录(Arnvig,2011),并且在蛋白质组学研究中已经鉴定了该蛋白(deSouza,2011)。Rv2348cORF(开放阅读框)中的氨基酸片段23-50与鸟分枝杆菌基因Mav_2040具有非常高的同源性。
Rv3873.根据Rv3873的氨基酸序列,覆盖氨基酸12-70的区域被重叠的肽覆盖。在被评价的若干RD肽库中,这个称为Rv3873A的Rv3873肽的库,被鉴定作为最有前景的库之一,其被来自来自TB患者的46%的PBMC识别(Brock,2004)。潜在的交叉反应的延伸不存在于该分子的这个部分。
Rv3878.如上文对Rv3873所述的,称为Rv3878B的覆盖该RD1蛋白的氨基酸122-189的肽库被定义和评价。其被来自人类TB患者的32%的PBMC识别,并且被建议作为可以与ESAT-6和CFP10结合以最大化灵敏度的肽混合物或库(Brock,2004)。
Rv2654c.Rv2654c基因由RD11区域编码,并且编码一个可能的具有未知功能的PhiRv2噬菌体蛋白。通过筛选覆盖Rv2654c(被命名为TB7.7)的整个蛋白产物的重叠肽,Brock等发现在BCG疫苗接种的个体中无交叉识别,并且此外显示47%的灵敏度(Brock,2004)。选择的肽(SEQIDno8)被包括在TBGold测试中。
表1.选择肽的序列表
蛋白质 | 肽 | SEQ ID NO. |
Rv2654 | P4 | 8 |
CFP10(Rv3874) | P1-P6 | 9-14 |
Rv3615c | P1-P4 | 15-18 |
Rv3865 | P1-P3 | 19-21 |
Rv2348 | P1-P4 | 22-25 |
Rv3614 | P1-P20 | 26-45 |
Rv3877 | P1-P5 | 46-50 |
实施例2.抗原的选择
在埃及和格陵兰的两个独立的研究中测试了在TB患者或潜伏性感染的个体中,以上内容中列出的7个抗原的识别。在两个研究中,还包含ESAT-6(Rv3875)作为比较物和基准抗原。此外,在埃及中包含PPD作为非特异性抗原刺激的实例。
新鲜取样的稀释的全血用从列出的抗原中选择的肽再刺激,并且包括对ESAT-6和CFP10的肽库的应答作为基准。
在埃及研究中,包括34个志愿者供体(8个女性和26个男性)作为阳性对照。这些中的32个被诊断患有TB疾病,具有记录的阳性痰培养物(受试者3-34)。2例具有潜伏性TB(受试者1和2)。此外,包括30个地方性流行阴性对照供体(5个女性和26个男性)。他们都是推定的BCG疫苗接种的,无TB疾病史,并且没有已知的与TB患者的接触。在格陵兰研究中,包括31个受试者(15个女性和16个男性)。14个被诊断患有TB疾病(受试者1-14);在11例中具有记录的阳性痰培养物,并且在4例中TB诊断在临床上完成。其余的17个受试者具有潜伏性TB(受试者15-31)。
在两个研究中,新鲜取样的稀释的全血在平板中被用选择的抗原刺激(每个肽10μg/ml)。在两个研究中,筛选来自抗原ESAT-6、CFP10、Rv3873、Rv3878、Rv3615c、Rv3865、Rv3877和Rv2348的合成肽(从Genecust获得),并且还包括阳性(PHA)和阴性(仅培养基)对照以及(仅在埃及中的)PPD(未显示)。稀释的全血在37摄氏度孵育5天,随后收获上清液并且通过内部ELISA对(IFN-γ)测试。在这些研究中,对埃及和格陵兰研究的阳性反应分别被定义为100或50pg/ml的IFN-γ浓度。
图1、2和3是数据的图示(热图),其中包含的单个值表示为颜色,白色显示无反应,灰色指示对给定抗原反应,并且黑色代表对抗原的反应,其中相同供体对ESAT-6和/或CFP10不应答。如显示的,在具有源自Rv3615c的刺激的最主要应答的TB患者或潜伏性感染的供体中,若干测试抗原被识别(在49%的供体中被识别)。重要的是,ESAT-6仅识别3个用CFP10刺激后不被识别的患者(图1中的9号和17号患者,图2中的3号患者),并且那些中Rv3615能够识别所有三个患者。此外,用Rv3615c再刺激显示了11个和9个供体分别不被ESAT-6和CFP10识别的识别。相反,所述抗原中的两个在非常有限数目的供体中被识别;Rv3873仅在65个患者中的2个中被识别并且Rv3878在65个供体中的7个中被识别。因此,尽管关于来自丹麦和荷兰的TB患者中的这些抗原的具有中等灵敏度的以前的数据(对于Rv3878为32%以及对于Rv3873为46%(Brock,2004)),本文获得的数据强调不是所有的预期灵敏的抗原在所有的设置中都有效(perform)。Rv3865、Rv3877和Rv2348显示中等灵敏度,并且在65个供体中的16、12和15个中被识别。重要的是,抗原Rv3615c、Rv3865和Rv2348在许多不识别ESAT-6和/或CFP10的供体中均产生应答,进一步证明这些抗原的诊断潜能。所选择的抗原的特异性在来自埃及的30个地方性流行的阴性对照供体的小组中被证实(图3)。如显示的,与作为非特异性抗原刺激的实例被包括的PPD不同,研究的抗原都是高度特异的。供体31和77二者识别广泛范围的包括ESAT-6和CFP-10二者的结核分枝杆菌抗原,强烈地指示潜伏性感染,不管提到的选择标准如何。
实施例3.CFP10和3615c与CFP10和ESAT-6相当
随后将组合CFP10和Rv3615c的诊断性能与组合CFP10和ESAT-6的诊断性能比较。我们包括来自35个来自格陵兰的个体的全血样品,35个个体中的18个具有潜伏性结核分枝杆菌感染,被定义为阳性Quantiferon测试和/或被证明暴露于结核分枝杆菌和结核菌素皮肤测试转化,并且17个患者被微生物学证实为TB。200μl未稀释的全血的单个等分试样在潮湿的37℃培养箱中用终浓度为5μg/ml的代表CFP10(SEQID1)或Rv3615(SEQID15-18)或ESAT-6(SEQID51)的重叠肽刺激7天。平行制备阴性对照样品(nil)。孵育后,分离血浆上清液,并且使用ELISA确定IFN-γ的水平。
通过将测量的响应于单个抗原刺激的抗原特异性的IFN-γ产生的水平(被刺激的全血中的水平减去未被刺激的孔中的水平)相加,随后将该总和与截断相比较,评价三个抗原的诊断能力。截断被定义为在个体患者中至少50pg/ml且比nil值高4倍的组合的抗原特异性应答。高于截断的抗原特异性水平将个体患者分类为抗原阳性,低于截断的抗原特异性水平为抗原阴性。
表2示出了单独的抗原CFP10、Rv3615c、ESAT-6和组合的灵敏度。如显示的,组合CFP10和Rv3615c的诊断性能与CFP10和ESAT-6的相当,两个组合显示60%的灵敏度。组合CFP10、Rv3615c和ESAT-6进一步使灵敏度从60%增强到69%。
表2.比较CFP10、Rv3615c和ESAT-6以及其组合的灵敏度
抗原 | 灵敏度% |
CFP10 | 49 |
Rv3615c | 34 |
ESAT-6 | 31 |
CFP10+Rv3615c | 60 |
CFP10+ESAT-6 | 60 |
CFP10+Rv3615c+ESAT-6 | 69 |
实施例4.用三种抗原Rv2348、Rv3865和Rv3877富集组合CFP10和Rv3615c
使用与上文相同的全血样品(35个来自格陵兰的个体;18个具有潜伏的结核分枝杆菌感染和17个具有微生物学证实的TB的患者)和相同的测定条件,我们评价了将CFP10和Rv3615c与三种不同的抗原Rv2348、Rv3865和Rv3877组合的效果。
通过将测量的响应于单个抗原的抗原特异性的IFN-γ产生的水平(被刺激的全血中的水平减去未被刺激的孔中的水平)相加,随后将该总和与截断相比较,来评价三个抗原的诊断能力。截断被定义为在个体患者中至少50pg/ml且比nil值高4倍的组合的抗原特异性应答。高于截断的抗原特异性性水平把个体患者分类为抗原阳性,低于截断的抗原特异性水平为抗原阴性。
表3示出了单独的抗原Rv3865、CFP10、Rv3615c和组合的灵敏度。Rv3865的灵敏度相对普通,仅具有20%的灵敏度,但相比于仅CFP10和Rv3865,向CFP10和Rv3615c添加Rv3865将总体诊断灵敏度增加了6%。
表3.CFP10、Rv3615c、Rv3865和其组合用于诊断结核分枝杆菌感染的比较
类似的,Rv3877的诊断能力仅11%,但是该抗原也将CFP10和Rv3615c的整体灵敏度从60%增强到高达69%(表4)。
表4.CFP10、Rv3615c、Rv3877和其组合用于诊断结核分枝杆菌感染的比较
抗原 | 灵敏度% |
Rv3877 | 11 |
CFP10+Rv3615c | 60 |
CFP10+Rv3615c+Rv3877 | 69 |
最后,我们评价Rv2348是否也能够增加CFP10和Rv3615c的诊断能力(表5)。如显示的,Rv2348的灵敏度是29%,并且相比于当仅使用CFP10和Rv3615c时,向CFP10和Rv3615c添加Rv2348将诊断灵敏度增加了23%。
表5.CFP10、Rv3615c、Rv2348和其组合用于诊断结核分枝杆菌感染的比较。
抗原 | 灵敏度% |
Rv2348 | 29 |
CFP10+Rv3615c | 60 |
CFP10+Rv3615c+Rv2348 | 83 |
我们选择了下列抗原(CFP10、Rv3615c、Rv3865和Rv2348)用于进一步评价当把这4个抗原组合到单一肽库(肽库A)中时的灵敏度和特异性。
实施例5.肽库A的灵敏度和特异性测试
在本领域熟知,包含ESAT-6、CFP10和TB7.7p4的免疫诊断混合物是用于诊断结核分枝杆菌感染的优选方法。该抗原混合物被认为是灵敏且特异的,并且其形成Quantiferon测试的基础。从以前的实例中清楚的是,抗原的组合改进诊断灵敏度和测试可靠性,因为与具有单独的所述抗原相比,IFN-γ应答的基础量值更高并且检测更加稳健。
一种非常用户友好的免疫诊断方法是使用用呈混合物的抗原预包被的真空管。例如,在Quantiferon测试中,在真空管内用肝素包被代表抗原混合物的冻干的肽。血液被抽进该管,允许该肽与抗原特异性的CD4和CD8T细胞相互作用。16-24小时的孵育之后,将该管离心,并且可以在血浆上清液中测量产生的IFN-γ的水平,并且将其与阴性和阳性对照样品比较。如果水平高于阳性测试结果的截断,测试的受试者可以被进一步分类为感染的或未感染的。
公知与IFN-γ信号传递相关的其他免疫效应分子对于诊断结核分枝杆菌感染是有用的(ChegoERJ2014)。趋化因子IP-10被以非常高的水平产生,并且具有与IFN-γ相当的诊断性能。
为了阐明将若干抗原组合成一个抗原混合物的有用性,我们将下列抗原组合成“肽库A”。肽库A由以下肽组成:
·CFP10:覆盖CFP10的整个氨基酸序列的6个肽(SEQIDno9-14)
·Rv3615c:覆盖氨基酸55-103的4个肽(SEQIDno5-18)
·Rv3865:覆盖氨基酸9-44的3个肽(SEQIDno19-21)
·Rv2348c:覆盖全长蛋白序列的氨基酸56-109的4个肽(SEQIDno22-25)
为了测试当被组合成肽库A时4种抗原的灵敏度,完成了在埃及的第二个且独立的研究。在该研究中,包括73个具有记录的阳性痰培养的TB患者,并且每个受试者捐献血液样品,该血液样品被直接抽取到先前准备的抗原包被的真空管中。用ESAT-6+CFP10+Rv2654c肽(即与在Quantiferon测试中相同的肽,并且其用作基准,被命名为Quantiferon肽库)或用肽库A(如上所指示的CFP10+Rv3516c+Rv3865+Rv2348)包被管。孵育16-24小时后,收集上清液并且用内部ELISA测定测试细胞因子IP-10的释放。如图4中所示,高比例的TB患者识别肽库A以及Quantiferon肽库。中值应答对于肽库A为5.5ng/ml的IP10,对于Quantiferon肽库为6.0。
为了测试肽库A的特异性,平行地,在丹麦中完成独立的研究。在该研究中,包括100个住在非常低的TB流行的地区(丹麦)和具有未知的暴露于结核分枝杆菌的受试者。在17例中,受试者是记录的BCG疫苗接种的,并且在19例中BCG疫苗接种状态是未知的/未记录的。其余的参与者是未被BCG疫苗接种的。与灵敏度研究类似,新鲜的全血被直接抽取到用肽库A(CFP10+Rv3615c+Rv3865+Rv2348)或基准Quantiferon肽库(ESAT-6+CFP10+Rv2654c)预包被的真空管中。孵育16-24小时后,收集上清液并且用内部ELISA测定测试细胞因子IP-10和IFN-γ的含量。虽然对肽库A和Quantiferon肽库的中值IP-10应答均是0ng/ml(图5),一些未暴露的供体在用Quantiferon抗原再刺激后展示出阳性反应,有大约5ng/ml的IP-10水平。当分析IFN-γ的分泌时,观察到未暴露的供体显示假阳性反应的相同趋势(图6;肽库A中值为0pg/ml,四分位间距(IQR)为-0.5-5.2pg/ml并且Quantiferon肽库中值为4.9pg/ml,IQR为-0.6-32.45pg/ml)。
组合来自灵敏度和特异性研究的数据允许我们进行接受者操作特性(ROC)曲线分析,比较肽库A与Quantiferon抗原库的诊断潜能(图7)。曲线下面积(AUC)对于肽库A是0.979,对于Quantiferon抗原库是0.947。通过ROC曲线分析,对于肽库A和Quantiferon肽库二者的最佳截断被确定为对于肽库A为1.4ng/ml(在98.1%特异性下灵敏度为87.7%);和对于Quantiferon肽库为2.3ng/ml(在96.2%特异性下灵敏度为75.3%)。
使用这些截断,我们头对头比较用Quantiferon肽库和肽库A再刺激后的阳性和阴性反应的数目(表6和7)。73个TB患者中,54个(74%)识别Quantiferon肽库,这在公布的关于Quantiferon抗原的灵敏度的64-89%之间(Dewan,2007)的范围内。相比之下,在本研究中肽库A识别更高比例的TB患者(73个患者中的64个),对应于88%的评估的灵敏度。使用McNemar′s测试,本研究中肽库A相比于Quantiferon肽库显示出显著更高的灵敏度(p<0.012)。
表6.在73个TB患者中Quantiferon肽库和肽库A的头对头比较。
表7.在100个推定未感染的对照中Quantiferon肽库和肽库A的头对头比较。
总之,肽库A相比于Quantiferon抗原展示出显著更高的灵敏度(更多的真阳性;表6),并且此外至少一样特异(相当的假阳性;表7)。这些结果清楚地表明:可能1)设计没有ESAT-6的相比于目前的Quantiferon抗原具有更高的灵敏度的TB诊断肽库,2)设计不含有ESAT-6的具有与目前的Quantiferon相当的特异性的抗原库。
实施例6.肽库A的验证。
技术人员熟知,用于免疫诊断测试的截断的验证需要在独立群组中证实。为达此目的,我们包括68例微生物学证实的TB患者和36个地方性流行对照,即个体中的一些患有来自坦桑尼亚的预先存在的但被控制的结核分枝杆菌感染。
从每个供体抽取1ml血液到5个包含冻干的肝素(18IU)和以下肽(5ug/肽)的真空管中:Quantiferon肽库(ESAT-6、CFP10和TB7.7p4(管1),与Quantiferon测试相当);肽库A(CFP10、Rv3615、Rv3865和Rv2348B(管2))以及阴性对照管(管3)。
图8中,我们示出来自管1和管2的病例和对照中减去阴性对照管(管3)的IP-10(ng/ml)应答。明显的,Quantiferon肽库和肽库A在TB病例的高量值应答方面是相当的。如预期的,地方性流行对照应答是较不均一的,支持了一些测试的个体被感染。
使用在实施例5中确定的预定义截断(1.4ng/ml),对TB患者(表8)和地方性流行对照(表9)二者均比较了诊断准确性。在TB患者组,标准Quantiferon肽库的诊断灵敏度是66%(68个包括的患者中,45个被定义为阳性),并且对于肽库A更高,具有72%的灵敏度(68个包括的患者中,49个被定义为阳性)。如预期的,在两个测试间的一致性非常高,具有91%的一致性(accordance)(在两个测试中44个是阳性,在两个测试中18个是阴性,具有68个中62个的总体一致性)。
表8.使用用于阳性测试的预定的截断,将来自68个患有证实的TB的患者的对抗原刺激的应答分类后,Quantiferon肽库和肽库A之间的一致性。
在地方性流行对照群体中,不存在用于感染的黄金标准,因此我们按照阳性应答者来呈现比率。肽库A检测到39%(14/36)作为阳性,并且标准Quantiferon肽库31%(11/36),再次显示更高的灵敏度。一致性也非常高(92%,对应于36个被包括者中33例一致)。
表9.使用用于阳性测试的预定的截断,将来自36个地方性流行对照的对抗原刺激的应答分类后,Quantiferon肽库和肽库A之间的一致性。
实施例7.当与ESAT-6组合时,肽库A可以被进一步改进。
为了更进一步改进诊断性能的目的,我们进一步评估了向肽库A添加ESAT-6的可能。因此,我们在73例埃及开罗的证实的TB群组中测试肽库A+ESAT-6和肽库A并且使用如在实施例5中所述的相同的测定条件。在图9中,明显的是,当将肽库A与ESAT-6组合时,应答的量值增加,相比于中值为6.86ng/mlIP-10的具有ESAT-6的肽库A,肽库A具有5.50ng/mlIP-10的中值应答。使用0.75ng/ml的截断,我们比较两组中的应答者频率。在肽库A中,应答者频率是93%,73个测试的患者中68个是阳性的,而具有ESAT-6的肽库A的频率是96%(73个患者中的70个-96%)。因此,将肽库A与ESAT-6组合,使假阴性率从7%减少到4%。
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Claims (23)
1.一种诊断组合物,所述诊断组合物包含基本纯的多肽的混合物,所述多肽包含选自以下的氨基酸序列
a)
Rv3874(SEQIDNO1)、Rv3615(SEQIDNO2)和选自Rv3865(SEQIDNO3)、Rv2348(SEQIDNO4)、Rv3614(SEQIDNO5)、Rv2654(SEQIDNO6)和Rv3877(SEQIDNO7)的一个或更多个;
或b)
包含来自所述多肽的免疫原性表位的片段;
或c)
其中所选择的多肽的混合物或所述多肽的片段的混合物与来自a)或b)中的选择的多肽中的任一个具有至少80%的序列同一性并且同时是有免疫原性的。
2.根据权利要求1所述的诊断组合物,包含Rv3874(SEQIDNO1)、Rv3615(SEQIDNO2)和Rv3865(SEQIDNO3)或包含其免疫原性表位的片段。
3.根据权利要求1所述的诊断组合物,包含Rv3874(SEQIDNO1)、Rv3615(SEQIDNO2)和Rv2348(SEQIDNO4)或包含其免疫原性表位的片段。
4.根据权利要求1所述的诊断组合物,包含Rv3874(SEQIDNO1)、Rv3615(SEQIDNO2)和Rv3877(SEQIDNO7)或包含其免疫原性表位的片段。
5.根据权利要求1所述的诊断组合物,包含Rv3874(SEQIDNO1)、Rv3615(SEQIDNO2)、Rv3865(SEQIDNO3)和Rv2348(SEQIDNO4)或包含其免疫原性表位的片段。
6.根据权利要求1-4所述的诊断组合物,其中包含SEQIDNO1的免疫原性表位的片段选自SEQIDNO9-14。
7.根据权利要求1-4所述的诊断组合物,其中包含SEQIDNO2的免疫原性表位的片段选自SEQIDNO15-18或SEQIDNO59-63。
8.根据权利要求1-7所述的诊断组合物,其中包含SEQIDNO3的免疫原性表位的片段选自SEQIDNO19-21。
9.根据权利要求1-7所述的诊断组合物,其中包含SEQIDNO4的免疫原性表位的片段选自SEQIDNO22-25。
10.根据权利要求1-7所述的诊断组合物,其中包含SEQIDNO5的免疫原性表位的片段选自SEQIDNO26-45。
11.根据权利要求1-7所述的诊断组合物,其中包含SEQIDNO6的免疫原性表位的片段是SEQIDNO8。
12.根据权利要求1-7所述的诊断组合物,其中包含SEQIDNO7的免疫原性表位的片段选自SEQIDNO46-50。
13.根据权利要求1-12所述的诊断组合物,所述诊断组合物另外包含Rv3875(SEQIDNO51)或其一个或更多个片段。
14.根据权利要求13所述的诊断组合物,其中所述片段和包含SEQIDNO51的免疫原性表位的片段选自SEQIDNO52-58。
15.根据权利要求1所述的诊断组合物,其中所述包含来自所述多肽的免疫原性表位的片段作为至少10个氨基酸长度的重叠肽存在。
16.根据权利要求5所述的诊断组合物,其中所述混合物包含SEQIDNO9-25。
17.根据前述权利要求任一项所述的诊断组合物,其中所述多肽的一些或全部任选地经由接头或间隔物融合在一起。
18.根据前述权利要求任一项所述的诊断组合物用于制备用于诊断TB的药物组合物的用途,所述TB由有毒力的分枝杆菌例如由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)或非洲分枝杆菌(Mycobacteriumafricanum)引起。
19.一种CMI诊断工具或试剂盒,所述CMI诊断工具或试剂盒包含根据权利要求1-17所述的诊断组合物。
20.一种根据权利要求19所述的CMI诊断工具或试剂盒,用于在体外或体内诊断结核病。
21.一种使用根据权利要求1-17所述的诊断组合物,在包括人类的动物中体外或体内诊断结核病的方法,所述结核病由有毒力的分枝杆菌例如由结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌或牛分枝杆菌引起。
22.根据权利要求21所述的诊断结核病的方法,所述方法包括在动物中皮内注射如上所限定的诊断组合物,其中在注射部位的阳性皮肤反应指示该动物患有结核病,且在注射部位的阴性皮肤反应指示该动物未患有结核病。
23.根据权利要求16所述的诊断结核病的方法,所述方法包括使样品例如血液样品与根据本发明的诊断组合物接触以检测阳性反应,所述阳性反应例如细胞的增殖或细胞因子诸如IFN-γ或IP-10的释放。
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Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
CB02 | Change of applicant information |
Address after: Copenhagen, Denmark Applicant after: National Serum Institute Address before: Copenhagen, Denmark Applicant before: Statens Seruminstitut |
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COR | Change of bibliographic data | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |