ES2875021T3 - Reactivos de diagnóstico para mejorar el diagnóstico inmunológico de tuberculosis in vivo o in vitro mediado por células - Google Patents

Abstract

Una composición de diagnóstico que comprende una mezcla de polipéptidos sustancialmente puros que comprende a) secuencias de aminoácidos de Rv3874 (SEQ ID NO 1), Rv3615 (SEQ ID NO 2) y Rv2348 (SEQ ID NO 4); o b) fragmentos de 6-50 aminoácidos de longitud de la secuencia de aminoácidos de Rv3874 (SEQ ID NO1), fragmentos de 6-50 aminoácidos de longitud de la secuencia de aminoácidos de Rv3615 (SEQ ID NO 2) y fragmentos de 6-50 aminoácidos de longitud de la secuencia de aminoácidos de Rv2348 (SEQ ID NO 4) y en la que cada uno de los fragmentos comprende epítopos inmunogénicos de dichas secuencias de aminoácidos; o c) (i) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de Rv3874 (SEQ ID NO1) y al mismo tiempo son inmunogénicas, secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de Rv3615 (SEQ ID NO 2) y al mismo tiempo son inmunogénicas y secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de Rv2348 (SEQ ID NO 4) y al mismo tiempo son inmunogénicas o (ii) secuencias de aminoácidos que tienen un 80 % de identidad de secuencia con fragmentos de 6-50 aminoácidos de longitud de la secuencia de aminoácidos de Rv3874 (SEQ ID NO1) y al mismo tiempo son inmunogénicas, fragmentos de 6-50 aminoácidos de longitud de secuencia de aminoácidos de Rv3615 (SEQ ID NO 2) y al mismo tiempo son inmunogénicos y fragmentos de 6-50 aminoácidos de longitud de la secuencia de aminoácidos de Rv2348 (SEQ ID NO 4) y al mismo tiempo son inmunogénicos.

Description

DESCRIPCIÓN

Reactivos de diagnóstico para mejorar el diagnóstico inmunológico de tuberculosis in vivo o in vitro mediado por células

La presente invención divulga composiciones para su uso como reactivo farmacéutico o de diagnóstico para el diagnóstico inmunológico mejorado in vivo o in vitro de tuberculosis mediado por células en un ser humano o animal. La invención se refiere a combinaciones de antígenos que aumentan la sensibilidad (que da menos falsos negativos) en comparación con las combinaciones de antígenos existentes sin comprometer la especificidad (la cantidad de falsos positivos). En particular, la invención se refiere a composiciones de antígeno que no incluyen el antígeno designado como diana antigénica secretora temprana de 6 kDa (ESAT-6) que se usa actualmente en productos registrados para detectar la infección por Mycobacterium tuberculosis. Alternativamente, las nuevas composiciones de diagnóstico o inmunogénicas se pueden usar en combinación con ESAT-6 para mejorar aún más la sensibilidad del diagnóstico mediado por células.

Antecedentes de la invención

La tuberculosis (TB) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Se estima que una persona desarrolla TB cada cuatro segundos y alguien morirá a causa de la enfermedad cada 20-30 segundos. Además, aproximadamente 1/3 de la población mundial está infectada de forma latente con Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), el agente causante de TB.

Los individuos inmunocompetentes infectados con M. tuberculosis en general tienen un riesgo de por vida del 10 % de desarrollar la enfermedad de TB activa, con este riesgo aumentando drásticamente, por ejemplo, si el individuo está coinfectado con el VIH (Sonnenberg, 2005) o tiene diabetes (Young, 2009). Si no se trata, cada persona con TB pulmonar activa infectará de 10-15 personas cada año (World Health Organization Tuberculosis Fact Sheet No 104, 2002). De este modo, es importante poder detectar individuos infectados por M. tuberculosis en una etapa temprana de la infección para prevenir la progresión de la infección por M. tuberculosis a TB pulmonar contagiosa activa. Esto se puede lograr mediante un tratamiento profiláctico en el momento más temprano posible después del diagnóstico. Por lo tanto, un diagnóstico rápido y preciso de la infección por M. tuberculosis es un elemento importante de las medidas de salud mundial para controlar la enfermedad.

Los ensayos de diagnóstico actuales para determinar la infección por M. tuberculosis incluyen cultivo, microscopía y PCR de material relevante del paciente, radiografías de tórax, la prueba cutánea de tuberculina estándar (TST) y ensayos de liberación de interferón gamma (IGRA). Los tres primeros procedimientos se usan para el diagnóstico de la TB contagiosa activa y se basan en la identificación de la bacteria M. tuberculosis y, por lo tanto, dependen de la presencia de bacterias en la muestra. Esto exige una cierta carga bacteriana y acceso a material infeccioso y, por lo tanto, los procedimientos no son apropiados para el diagnóstico precoz de la infección, es decir, antes del inicio de la enfermedad clínica. La radiografía de tórax es insensible y solo se aplica para la TB pulmonar y para detectar la TB en una etapa más avanzada.

La prueba cutánea de tuberculina estándar, que muestra una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH), es un ensayo simple y económico en base al reconocimiento inmunológico de antígenos micobacterianos en individuos expuestos. Sin embargo, está lejos de ser ideal para detectar la infección por M. tuberculosis. Emplea inyección intradérmica de derivado proteico purificado (PPD) que es una mezcla cruda y mal definida de antígenos micobacterianos, algunos de los cuales se comparten con proteínas de la subcepa de vacuna M. bovis bacille Calmette-Guérin (BCG) y de micobacterias ambientales no tuberculosis. Esta amplia reactividad cruzada de PPD causa una escasa especificidad de TST, lo que lleva a una situación en la que la vacunación con BCG y la exposición a micobacterias no tuberculosas dan un resultado de prueba similar al observado en individuos infectados por M. tuberculosis.

La infección por M. tuberculosis media una fuerte respuesta inmune mediada por células (CMI) y la detección de células inmunes y cualquier producto derivado de tales células que se generen como parte de la respuesta específica a la infección por M. tuberculosis sería un procedimiento apropiado para detectar infección (Andersen, 2000). Para generar dicha respuesta específica, el reactivo debe 1) ser ampliamente reconocido por los individuos infectados por M. tuberculosis, y 2) ser específico para M. tuberculosis, discriminando así entre infección por TB, vacunación con BCG y exposición a micobacterias ambientales no tuberculosas.

El genoma de M. tuberculosis predice 4018 marcos de lectura abiertos (http://tubercu-list.epfl.ch/, release R27 -March 2013). Sin embargo, solo una minoría de estos son antígenos de células T con un fuerte y amplio reconocimiento por las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con TB humana. Se han desarrollado algoritmos para predecir los epítopos de las células T, pero la verificación experimental fue esencial para identificar los antígenos inmunodominantes CFP10 y ESAT-6. Las proteínas extracelulares o de filtrado de cultivo (CF) de M. tuberculosis constituyen una fracción de proteína enriquecida en antígenos de células T (Andersen 1994) y la separación de las proteínas de CF mediante un enfoque en base a proteómica bidimensional condujo a la identificación de 59 antígenos de células T humanas, de los cuales 35 habían sido descritos anteriormente (Deenadayalan, 2010). Aunque esta lista puede no ser exhaustiva, enfatiza que solo una pequeña parte de las aprox. 900 CF proteínas (Albrethsen, 2013) son antígenos de células T. Lógicamente, uno esperaría que los antígenos más inmunodominantes codificados del genoma de M. tuberculosis fueran el subconjunto con la expresión más alta y con la tecnología actual sería posible clasificar los genes de acuerdo con los niveles de transcripción bajo ciertas condiciones de crecimiento. Sin embargo, la contribución que hace el nivel de transcripción a la inmunogenicidad es baja y no se puede usar de forma sistemática para identificar qué genes codifican antígenos relevantes (Sidders, 2008).

Se podría buscar un candidato a reactivo altamente específico entre los antígenos de las regiones RD (regiones de deleción) del genoma de M. tuberculosis. Estas regiones representan deleciones genómicas de la cepa de vacuna BCG de M. bovis en comparación con la cepa virulenta de M. tuberculosis (Behr, 1999). Por lo tanto, en teoría, las proteínas de estas regiones (proteínas RD) serían excelentes candidatas como reactivos de diagnóstico de TB, es decir, no deberían ser reconocidas por individuos sanos no infectados independientemente de su estado de vacuna BCG o exposición a cepas micobacterianas no patógenas. Sin embargo, de todos los ORF genómicos predichos (marcos de lectura abiertos) eliminados de BCG, no se sabe per se cuáles se expresan de hecho como proteínas y, adicionalmente, la inmunorreactividad permanece desconocida hasta que se prueba con linfocitos sensibilizados de individuos infectados por M. tuberculosis. Esto puede, por ejemplo, realizarse en un análisis de sangre total, mediante reestimulación de PBMC o inyectando las sustancias en la piel de forma similar a la que se administra la prueba PPD/Mantoux. Por ejemplo, la evaluación de Rv3872 mostró respuestas bajas de interferón gamma (IFN-y) en los pacientes con TB humana probados (n = 7) 1-4 meses después del diagnóstico (WO 99/24577), lo que demuestra que esta proteína RD no se reconoce con frecuencia, y Rv3872 por lo tanto, no se persiguió más para una prueba de diagnóstico basada en CMI.

Las proteínas potenciales específicas de M. tuberculosis no se limitan a proteínas RD como por ejemplo, la proteína EspC (Rv3615c) se reconoce específicamente en pacientes con TB humana y ganado infectado con M. bovis y no en vacunados/infectados con BCG, aunque el gen está presente en BCG (WO2009060184; Sidders, 2008; Millington, 2011). La falta de reacción en los individuos vacunados con BCG se debe muy probablemente a que la secreción de Rv3615c está abolida en BCG, ya que depende del sistema de secreción de ESX-1, que se encuentra en parte en el locus RD1 y que está ausente en BCG. Este antígeno es un reactivo de diagnóstico CMI considerado tan potente como ESAT-6 y CFP10 que induce una fuerte respuesta de IFN-y comparable (ibid).

Cuando se ha identificado un antígeno de células T potencialmente específico, se debe verificar que el antígeno se reconoce específicamente en individuos infectados con M. tuberculosis y no en personas vacunadas con BCG. Para Rv3873 de RD1, pareció que la proteína era miembro de una familia de proteínas con un motivo conservado en los aminoácidos 118-135 también presente en otras proteínas de M. tuberculosis. Como en este motivo estaba presente un epítopo de células T ampliamente reconocido, los individuos vacunados con BCG también respondieron al péptido que abarca esta secuencia (Liu, 2004). Sin embargo, también se observó reactividad cruzada con Rv3878 y Rv3879c, aunque no se detectó homología comparando con secuencias de otras proteínas micobacterianas conocidas (Liu, 2004), enfatizando que la especificidad de un candidato de diagnóstico potencial necesita verificarse experimentalmente. De la misma manera, se reconoció Rv2653c de RD13 tanto en donantes vacunados con BCG como en pacientes con TB, aunque las búsquedas en la base de datos con el algoritmo BLAST no revelaron ninguna proteína micobacteriana obvia que pudiera explicar la reactividad cruzada observada (Aagaard, 2004).

Habiendo identificado proteínas específicas de M. tuberculosis con potencial para el diagnóstico de infección por M. tuberculosis mediante un ensayo en base a CMI, queda por investigar si una combinación de tales proteínas/péptidos proporcionará la sensibilidad deseada para una prueba de diagnóstico. No es posible predecir cuánto agregará un antígeno dado a la sensibilidad después de la combinación con antígenos de diagnóstico ya definidos; esto tiene que ser evaluado experimentalmente para cada antígeno, y preferiblemente en pacientes con TB de diferentes partes del mundo con diferentes antecedentes genéticos.

El potencial diagnóstico de CFP10 (Rv3874), ESAT-6 (Rv3875), dos proteínas de bajo peso molecular de la región RD1 y TB7.7 (Rv2654) está muy bien documentado (Brock, 2004; Moon, 2013, WO2004099771) y se usan actualmente en diferentes reactivos de diagnóstico registrados para uso humano. Los péptidos que cubren CFP10 y ESAT-6 se usan en la prueba T-SPOT®.TB, que es una prueba de sangre celular que detecta la respuesta inmune de las células T que se encuentran en las PBMC que han sido reestimuladas con ESAT-6 y CFP10. Esta respuesta se detecta mediante una metodología de inmunospot ligado a enzimas altamente sensible, denominada ELISPOT, y se comercializa como prueba T-SPOT.TB. Esta prueba es muy sensible e independiente del estado de vacunación con BCG. Otra prueba registrada para la detección de la infección por M. tuberculosis es QuantiFERON®-TB Gold, que es una tecnología de diagnóstico in vitro que permite detectar respuestas inmunitarias en muestras de sangre entera tras la reestimulación con péptidos que cubren ESAT-6, CFP10 y un único péptido de TB7.7. Ambas pruebas miden la producción de interferón-gamma (IFN-y) en respuesta a la exposición con los grupos de péptidos antigénicos específicos seleccionados y en la actualidad se consideran de última generación. Las pruebas T-SPOT.TB y QuantiFERON®-TB Gold se reconocen colectivamente como ensayos de liberación de IFN-y (IGRA).

Otras citocinas y quimiocinas distintas del IFN-y también han mostrado relevancia cuando se monitorea la respuesta inmunológica a los antígenos micobacterianos. La proteína inducida por IFN-y (IP-10) se expresa a niveles 100 veces más altos en comparación con IFN-y y los ensayos de diagnóstico en base a la secreción de IP-10 han demostrado un rendimiento diagnóstico comparable a los ensayos de liberación de IFN-y (Ruhwald, 2009).

Además de estas pruebas in vitro, que ya están registradas para su uso humano y se usan en todo el mundo, ESAT-6 y CFP10 también han demostrado ser eficaces como reactivos para pruebas cutáneas. Los estudios clínicos han demostrado que una prueba cutánea aplicada de la misma manera que el PPD pero usando ESAT-6 y CFP10 producidos y administrados como proteínas recombinantes se puede usar para diagnosticar la infección por M. tuberculosis y no se ve afectado por el estado de vacunación con BCG (Aggerbeck, 2013).

A pesar del uso generalizado de BCG y varios procedimientos de diagnóstico que incluyen IGRA, la TB sigue cobrando su precio con casi dos millones de muertes al año y existe una necesidad continua de desarrollar pruebas de inmunodiagnóstico con una sensibilidad mejorada. Los pacientes inmunodeprimidos tienen un mayor riesgo de desarrollar TB y, desafortunadamente, tanto la TST como los IGRA en su forma actual, funcionan de manera subóptima en estos grupos. Los grupos de pacientes con mayor necesidad de pruebas mejoradas comprenden: pacientes infectados por el VIH, pacientes con enfermedades inflamatorias inmunomediadas, pacientes que reciben medicación inmunosupresora (por ejemplo, prednisolona o inhibidores de TNF-a) y pacientes con insuficiencia renal crónica. En por ejemplo, infección por VIH es bien sabido que un recuento bajo de células CD4 (por ejemplo, < 250 células/|il) está fuertemente asociado con tasas más altas de resultado indeterminado de la prueba, sensibilidad de prueba comprometida para TB activa y menor probabilidad de respuesta positiva a la prueba en individuos expuestos revisados en (Redelman-Sidi, 2013).

Otro grupo muy relevante para las pruebas dirigidas son los niños. El diagnóstico de la infección por TB latente (LTBI) y la TB en los niños es difícil, a menudo no se obtiene la confirmación microbiológica de la infección y el tratamiento se basa únicamente en la presentación clínica. Tanto en los niños pequeños activos como en los supuestamente infectados de forma latente, el sistema inmunológico es inmaduro y es la causa probable de una menor liberación de citocinas y de un rendimiento de IGRA comprometido. Recientemente se demostró que la prueba QuantiFERON©-TB Gold tenía una sensibilidad del 53 % en 81 niños con TB confirmada microbiológicamente, lo que respalda la necesidad de mejorar las pruebas de inmunodiagnóstico para la infección por M. tuberculosis en niños (Schopfer, 2013).

El problema central con el rendimiento de la prueba IGRA en los grupos de pacientes de alto riesgo mencionados anteriormente (por ejemplo, niños inmunosuprimidos, infectados por VIH) es que la condición inmunosupresora subyacente que impulsa el aumento del riesgo de enfermedad de TB en sí misma se caracteriza por bajas respuestas de CMI y baja liberación de IFN-y en respuesta a antígenos. Como el resultado de IGRA se determina en base a la comparación de la magnitud de la liberación de IFN-y con un punto de corte, una liberación de IFN-y comprometida aumenta el riesgo de que el resultado de la prueba se convierta en falso negativo. Por lo tanto, es obvio para el destinatario experto que incluir antígenos más específicos reclutará células T más específicas y dará como resultado una respuesta CMI aumentada y liberación de IFN-y y, en consecuencia, reducirá el riesgo de que la respuesta caiga por debajo del punto de corte. Por lo tanto, la adición de antígenos específicos adicionales aborda una limitación importante en las pruebas IGRA al mejorar la sensibilidad diagnóstica.

Otro beneficio del diagnóstico de infección de M. tuberculosse basa en respuestas de mayor magnitud es una mayor precisión analítica y resultados de prueba más fiables. En la prueba QuantiFERON®-TB Gold, el punto de corte para una prueba positiva es de 0,35 IU/ml o 17,5 pg/ml, una concentración muy baja que es difícil de determinar con alta precisión, incluso con procedimientos sensibles como ELISA. Por ejemplo, el estudio de precisión más grande de un IGRA hasta la fecha, encontró una variabilidad considerable en la respuesta a TB medida por QuantiFERON-TB Gold In-Tube al repetir la prueba de la misma muestra del paciente. La variabilidad dentro de los individuos incluyó diferencias de hasta 0,24 IU/ml, en cualquier dirección, cuando la respuesta inicial estaba entre 0,25 y 0,80 IU/ml. Esto llevó a la conclusión de que los resultados positivos de la prueba QuantiFERON TB Gold In-Tube inferiores a 0,59 IU/ml deben interpretarse con cautela (Metcalfe AJRCCM 2012).

Los estudios de modelización sugieren que sin nuevas vacunas, la TB no se puede eliminar y que las vacunas novedosas y más eficaces son una prioridad internacional. La idea general es complementar la vacuna BCG actual con una vacuna de subunidad de refuerzo o crear una nueva vacuna viva contra la TB para reemplazar la BCG. Hay un número creciente de vacunas experimentales en desarrollo clínico y el consenso emergente es que ESAT-6 parece ser un antígeno de vacuna esencial. De este modo, muchas de las nuevas vacunas que se encuentran actualmente a nivel preclínico o en pruebas clínicas contienen ESAT-6. Recientemente, Aeras Foundation anunció el primer ensayo en humanos de una vacuna que contiene ESAT-6 diseñada para proteger a las personas que ya están infectadas de manera latente con TB, de desarrollar la enfermedad de TB activa (Aagaard, 2011). Varias vacunas candidatas vivas también se diseñan directamente de manera recombinante para expresar ESAT-6, por ejemplo, rBCG:GE (Yang, 2011), rM. S-e6c10 (Zhang, 2010), Salmonella/Ag85B-ESAT-6 (Hall, 2009), rBCG-A(N)-E-A(c) (Xu, 2009) o proteínas de fusión que incorporan ESAT-6, por ejemplo, H1 (van Dissel, 2010; van Dissel, 2011). Desafortunadamente, el uso de diagnósticos basados en ESAT-6 en la prueba IGRA y la vacunación con una vacuna que contiene ESAT-6 es una repetición exacta del problema de reacción cruzada asociado con el uso paralelo de TST y BCG.

En consecuencia, existe una gran necesidad de un reactivo de diagnóstico específico que se pueda usar en paralelo con las vacunas que contienen BCG y ESAT-6. Usando ensayos in vivo o in vitro, el reactivo debería poder detectar infecciones por M. tuberculosis en humanos y animales y discriminar no solo entre la infección por TB y la vacunación con b Cg o las nuevas vacunas que contienen ESAT-6, sino también la exposición a micobacterias ambientales no patógenas. El reactivo de diagnóstico debe tener al menos la misma sensibilidad que la combinación actual de ESAT-6, CFP10 y en algunos ensayos de diagnóstico TB7.7.

El documento EP2417456 describe dicho sistema en el que el uso de Rv3615c junto con CFP-10 proporciona una sensibilidad de diagnóstico muy similar a la combinación ESAT-6/CFP-10.

Debido a que las características únicas de ESAT-6 son altamente inmunogénicas y específicas para la infección por M. tuberculosis, no es probable que reemplazar ESAT-6 con un solo antígeno aumente la sensibilidad en comparación con ESAT cuando se estudian diversos grupos de población. Esto, por ejemplo, se ha demostrado por Brock et al. mostrando el reconocimiento de antígenos individuales entre 14-43 % en pacientes con TB en comparación con ESAT-6 dando lugar a una respuesta en 75 % en el mismo grupo de pacientes. Dado que la mayoría de los antígenos son menos inmunogénicos en comparación con ESAT-6, es más probable que se necesite una combinación de antígenos para obtener respuestas de gran magnitud y sensibilidad diagnóstica mejorada.

Como se ejemplifica, no es sencillo predecir la sensibilidad y especificidad de las combinaciones de antígenos; más bien, esto requiere un diseño detallado de combinaciones de antígenos específicos. Además, al aumentar el número de péptidos en el grupo de diagnóstico, se presenta el riesgo de disminuir aún más la especificidad al aumentar el número de falsos positivos, enfatizando que las composiciones de diagnóstico o inmunogénicas para el diagnóstico específico de t B se deben seleccionar y probar cuidadosamente.

Por lo tanto, existe una necesidad urgente de mejorar un diagnóstico inmunológico mediado por células in vivo o in vitro de la infección por M. tuberculosis en un ser humano o un animal. Esta es una necesidad de combinaciones de antígenos que aumenten la sensibilidad (que dé menos falsos negativos) en comparación con las combinaciones de antígenos existentes sin comprometer la especificidad (cantidad de falsos positivos). Las combinaciones de antígenos mejoradas necesarias se refieren tanto a las composiciones de antígenos que no incluyen el antígeno ESAT-6 para anticipar la situación cuando se introduce una vacuna que comprende ESAT-6, como a las combinaciones de antígenos que comprenden ESAT-6 para mejorar los reactivos de diagnóstico actuales de última generación.

Nuestros datos demuestran que las combinaciones de CFP10/ESAT6 y CFP10/Rv3615 se pueden mejorar más agregando péptidos derivados de tres nuevos antígenos con potencial de diagnóstico. Este hallazgo novedoso es inesperado por dos razones:

a) La mayoría (> 99 %) de los antígenos del genoma de TB no son específicos y se comparten entre diversas especies de micobacterias, por lo que ha sido muy difícil identificar antígenos fuertemente reconocidos que son específicos de Mycobacterium tuberculosis.

b) La sensibilidad de la combinación de diagnóstico CFP10/RV3615c y CFP10/ESAT6 ya es muy alta, por lo que aumentar la sensibilidad aún más se vuelve cada vez más difícil debido a respuestas inespecíficas.

Por lo tanto, la presente invención es muy alentadora ya que describe péptidos con la capacidad no solo de aumentar la sensibilidad de la combinación CFP10/RV3615c sino también del cóctel de diagnóstico actual que incluye ESAT6 - y sin comprometer la especificidad.

Sumario de la invención

La invención se describe en las reivindicaciones.

La invención está relacionada con la detección mejorada de infecciones causadas por especies del complejo TB (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum) y discrimina entre infección por TB y vacunación. La composición de diagnóstico mejorada no debe interferir con el efecto de los antígenos de 1) una nueva vacuna contra TB que contenga ESAT-6, 2) BCG ni 3) exposición a micobacterias ambientales no patógenas. La invención divulga composiciones inmunogénicas o de diagnóstico mejoradas, que se pueden usar ya sea in vivo o in vitro para detectar una respuesta celular a la infección por M. tuberculosis y, por lo tanto, usarse para diagnosticar la TB.

Mediante el uso de un cóctel o grupo de antígenos o un cóctel o grupo de péptidos que cubren estos antígenos, se ha hecho que la prueba sea muy sensible a pesar de la ausencia de ESAT-6 en las composiciones inmunogénicas de diagnóstico. Además, se ha mejorado aún más las composiciones inmunogénicas de diagnóstico que comprenden ESAT-6 usadas en la actualidad.

Divulgación detallada de la invención

Este procedimiento de diagnóstico se basa en el reconocimiento inmunológico mediado por células (CMI) de los antígenos expresados por las bacterias M. tuberculosis (u otras micobacterias del complejo de la tuberculosis) durante la infección. Por lo tanto, la prueba no requiere la presencia de bacterias como los procedimientos tradicionales de cultivo, microscopía y PCR. Esto significa que la prueba se puede aplicar al principio de la fase de infección y que la prueba es aplicable independientemente del sitio anatómico de la infección. El procedimiento es ideal en el rastreo de contactos como reemplazo del TST usado actualmente.

Al seleccionar antígenos específicos de M. tuberculosis con potencial diagnóstico teórico y probar el reconocimiento en una serie de pacientes con TB humana, se pudo identificar tres grupos de diagnóstico que 1) carecen de ESAT-6 y, así, se pueden usar también en los individuos vacunados con ESAT-6 para discriminar entre infección por M. tuberculosis y vacunación, 2) mostraron la misma alta especificidad que los grupos de diagnóstico que contienen ESAT-6, y 3) exhibieron una sensibilidad para la infección por M. tuberculosis superior a la obtenida por una combinación de e Sa T-6, CFP10 y TB7.7.

La presente invención divulga

Una composición de diagnóstico que comprende una mezcla de polipéptidos sustancialmente puros compuestos de

a) secuencias de aminoácidos de Rv3874 (SEQ ID N01), Rv3615 (SEQ ID NO 2) y Rv2348 (SEQ ID NO 4);

o

b) fragmentos de 6-50 aminoácidos de longitud de la secuencia de aminoácidos de Rv3874 (SEQ ID NO1), fragmentos de 6-50 aminoácidos de longitud de la secuencia de aminoácidos de Rv3615 (SEQ ID NO 2) y fragmentos de 6-50 aminoácidos de longitud de la secuencia de aminoácidos de Rv2348 (SEQ ID NO 4) y en la que cada uno de los fragmentos comprende epítopos inmunogénicos de dichas secuencias de aminoácidos;

o

c)

(i) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de Rv3874 (SEQ ID NO1) y al mismo tiempo son inmunogénicas, secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de Rv3615 (SEQ ID NO 2) y al mismo tiempo son inmunogénicas y secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de Rv2348 (SEQ ID NO 4) y al mismo tiempo son inmunogénicas o

(ii) secuencias de aminoácidos que tienen un 80 % de identidad de secuencia con fragmentos de 6-50 aminoácidos de longitud de la secuencia de Rv3874 (SEQ ID NO1) y al mismo tiempo son inmunogénicas, fragmentos de 6-50 aminoácidos de longitud de la secuencia de Rv3615 (SEQ ID NO 2) y al mismo tiempo son inmunogénicas y fragmentos de 6-50 aminoácidos de longitud de la secuencia de Rv2348 (SEQ ID NO 4) y al mismo tiempo son inmunogénicas.

En circunstancias en las que las vacunas que contienen ESAT-6 no se registrarán para uso humano, en áreas donde no se están usando vacunas que contienen ESAT-6 y en otras circunstancias, por ejemplo, para aumentar aún más la sensibilidad de una prueba de diagnóstico, cualquiera de las composiciones de diagnóstico o inmunogénicas divulgadas anteriormente se puede complementar con ESAT-6 (SEQ ID NO 51) o uno o más fragmentos del mismo.

Una composición de diagnóstico preferida que no forma parte de la invención comprende una mezcla de fragmentos que comprenden los epítopos inmunogénicos de Rv3874, Rv3615 y opcionalmente ESAT-6 en la que los fragmentos que comprenden epítopos inmunogénicos de SEQ ID NO 1 se escogen de SEQ ID NO 9-14 y los fragmentos que comprenden epítopos inmunogénicos de SEQ ID NO 2 se escogen de SEQ ID NO 15-18 o SEQ ID NO 59-63 y los fragmentos que comprenden epítopos inmunogénicos de SEQ ID NO 51 se escogen de SEQ ID NO 52-58, en la que los fragmentos que comprenden epítopos inmunogénicos de SEQ ID NO 3 se escogen de SEQ ID NO 19-21 y los fragmentos que comprenden epítopos inmunogénicos de SEQ ID NO 4 se escogen de SEQ ID NO 22-25 y los fragmentos que comprenden epítopos inmunogénicos de SEQ ID NO 5 se escoge desde SEQ ID NO 26-45 y en la que los fragmentos que comprenden epítopos inmunogénicos de SEQ ID NO 6 es SEQ ID NO 8 y los fragmentos que comprenden epítopos inmunogénicos de SEQ ID NO 7 se escogen de SEQ ID NO 46-50.

Los polipéptidos en la composición de diagnóstico o inmunogénica pueden estar presentes como entidades separadas o cuando algunos o todos los polipéptidos se fusionan entre sí opcionalmente mediante enlazantes o espaciadores.

Una composición de diagnóstico o inmunogénica preferida comprende una combinación o mezcla de SEQ ID NO 9 -14, s Eq ID NO 15-18, SEQ ID NO 19-21 y s Eq ID NO 22-25 mencionadas en los ejemplos como grupo de péptidos A.

Descripción detallada de los polipéptidos preferidos y fragmentos de dichos polipéptidos:

CFP10 (SEQ ID NO 1) es una proteína ESX-1 principal. Se seleccionaron los siguientes 6 péptidos que cubren toda la secuencia de aminoácidos de CFP10 (SEQ ID NOs. 9-14)

Rv3615c (SEQ ID NO 2) es una proteína secretada por el sistema ESX-1. Se seleccionaron 4 péptidos que cubrían los aminoácidos 55-103 (SEQ ID NO 15-18). Los péptidos alternativos que cubren la parte C-terminal de Rv3615 son los cinco péptidos con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 59-63.

Rv3865 (SEQ ID NO 3) es una proteína asociada a la secreción de ESX-1: se seleccionaron 3 péptidos que cubren los aminoácidos 9-44 (SEQ ID NOs. 19-21)

Rv2348c (SEQ ID NO 4) se encuentra en la región RD7 que se ha demostrado que está ausente en BCG: se seleccionaron 4 péptidos que cubren los aminoácidos 56-109 de la secuencia de proteínas de longitud completa (SEQ ID NOs. 22-25)

Rv3614c (SEQ ID NO 5) es una proteína secretada: se seleccionaron 20 péptidos que cubren la secuencia completa (SEQ ID NOs. 26-45)

Rv2654c (SEQ ID NO 6)) es una proteína con función desconocida codificada por la región RD11: se seleccionó el péptido 4 (SEQ ID NO 8)

Rv3877 (SEQ ID NO7) se encuentra en la región RD1 y no está presente en BCG: se seleccionaron 5 péptidos que cubren el aminoácido 220-284 en la proteína de longitud completa (511 aa) (SEQ ID NOs.

46-50)

ESAT-6 (Rv3875; SEQ ID NO 51) es una proteína ESX-1 principal. Se seleccionaron 7 péptidos que cubren la secuencia completa (SEQ ID NO 52-58)

También se divulga el uso de composiciones de diagnóstico o inmunogénicas para la preparación de una composición farmacéutica para el diagnóstico de TB causada por micobacterias virulentas, por ejemplo, por M. tuberculosis, Mycobacterium bovis, o Mycobacterium africanum y una herramienta o kit de diagnóstico CMI que comprende una composición de diagnóstico o inmunogénica mencionada anteriormente para el diagnóstico in vitro o in vivo de TB.

También se divulgan procedimientos in vitro e in vivo para diagnóstico de TB causada por micobacterias virulentas, por ejemplo, por M. tuberculosis, Mycobacterium africanum o Mycobacterium bovis, en un animal, incluido un ser humano, usando las composiciones de diagnóstico o inmunogénicas mencionadas anteriormente.

El procedimiento in vivo para diagnóstico de TB comprende inyectar intradérmicamente, en el animal, incluido un ser humano, una composición farmacéutica como se define anteriormente donde una respuesta cutánea positiva en el lugar de la inyección es indicativa de que el animal tiene TB, y una respuesta cutánea negativa en el lugar de la inyección indica que el animal no tiene TB.

El procedimiento in vitro de diagnóstico de TB que comprende poner en contacto una muestra, por ejemplo, una muestra de sangre, con una composición diagnóstica o inmunogénica según la invención para detectar una reacción positiva, por ejemplo, proliferación de las células o liberación de citocinas tales como IFN-y.

Las presentes composiciones de diagnóstico o inmunogénicas pueden reemplazar las composiciones que se usan actualmente en las pruebas IGRA establecidas (CFP10/Rv3874 y ESAT-6/Rv3875 en TB. Prueba s Po T®.TB y TB7.7/Rv2654c, CFP10/Rv3874 y ESAT- 6/Rv3875 en QuantiFERON®-TB Gold.

El procedimiento además tiene la siguiente mejora en comparación con CFP10/Rv3874 y ESAT-6/Rv3875 en TB. La prueba SPOT®.TB y TB7.7/Rv2654c, CFP10/Rv3874 y ESAT-6/Rv3875 en QuantiFERON®-TB Gold:

Si un individuo ha sido vacunado con una vacuna que contiene ESAT-6, tal como una vacuna de proteína de subunidad que comprende ESAT-6 o una vacuna viva recombinante diseñada para o que expresa inherentemente ESAT-6, la composición evita el uso de ESAT-6 y, en consecuencia, es todavía específico para la infección por M. tuberculosis. Este no es el caso de CFP10 y ESAT-6 en la prueba TB.SPOT ®.t B y TB7.7, CFP10 y ESa T-6 en QuantiFERON®-TB Gold o cualquier otra prueba en base a ESAT-6.

Las composiciones que contienen ESAT-6 se están usando en pruebas de M. tuberculosis basadas en CMI. La prueba presentada puede evitar el uso de ESAT-6 y aprovecha un amplio reconocimiento obtenido al usar más de un antígeno específico de M. tuberculosis. En nuestra prueba obtenemos con la combinación de CFP10, Rv3615c, Rv3865 y Rv2348 (grupo de péptidos A) una sensibilidad del 87 % y una especificidad del 98 % en comparación con una sensibilidad del 74 % y una especificidad del 96 % usando los antígenos Quantiferon. De este modo, a pesar de la falta de ESAT-6, conocido por ser un antígeno altamente sensible y reconocido por una alta proporción de individuos portadores de una infección por M. tuberculosis, las composiciones probadas en la presente memoria obtienen una tasa de sensibilidad > 10 % más alta en comparación con las conocidas composiciones en base a ESAT-6 y usadas actualmente en ensayos IGRA.

En la presente memoria, también presentamos datos que muestran que agregando ESAT-6 al grupo de péptidos que consta de CFP10, Rv3615c, Rv3865 y Rv2348, podemos mejorar aún más el rendimiento diagnóstico. Al agregar ESAT-6 al grupo de péptidos especificado, podemos aumentar la magnitud de las respuestas que podrían ser relevantes para el diagnóstico en individuos con diferentes complicaciones inmunosupresoras, por ejemplo, VIH o para su uso en por ejemplo, niños. Además, mediante el uso de una combinación de péptidos de los cinco antígenos (CFP10, ESAT-6, Rv3865, Rv2348 y Rv3615c) podríamos aumentar la frecuencia de pacientes con un diagnóstico confirmado de TB en un 3 % en comparación con el grupo de CFP10, Rv3615c, Rv2348 y Rv3865 solos.

También se divulgan en pruebas in vivo para el diagnóstico de TB. Esto podría tener el formato de una prueba cutánea en un animal, incluido un ser humano, con las composiciones mencionadas anteriormente. La prueba cutánea es: inyección intradérmica en un animal o aplicación sobre la piel de los animales, por ejemplo, con un parche o vendaje, una composición de la presente invención. Una respuesta positiva a la prueba cutánea en el lugar de la inyección o aplicación indica que el animal o el ser humano tiene TB, y una respuesta cutánea negativa en el lugar de la inyección o aplicación indica que el animal no tiene TB.

No es necesario que los grupos de péptidos de la invención comprendan las proteínas en su longitud completa, ya que una secuencia de solo 6-9 aminoácidos (epítopo de células T) es suficiente para provocar una respuesta inmune, pero las proteínas de longitud completa también serán útiles. Dado que es posible para un experto en la técnica determinar la secuencia de aminoácidos exacta y mínima para el epítopo de células T incrustado en una proteína, la presente invención también se refiere a fragmentos (porciones inmunogénicas) de polipéptidos que comprenden dichos epítopos de células T (o análogos de los mismos) sin los aminoácidos adicionales específicos como proteínas de longitud completa y proteínas de fusión que comprenden dichos epítopos de células T (opcionalmente acoplados mediante un enlazante o espaciador), y a cócteles o combinaciones que comprenden dichos polipéptidos o proteínas de fusión.

Se describen otras realizaciones de la invención en los ejemplos y en las reivindicaciones.

Definiciones

Polipéptidos

La palabra "polipéptido" en la presente invención debería tener su significado habitual. Es decir, una cadena de aminoácidos de cualquier longitud, incluida una proteína de longitud completa, oligopéptidos, péptidos cortos y fragmentos de los mismos, en la que los residuos de aminoácidos están unidos por enlaces peptídicos covalentes. El polipéptido se puede modificar químicamente mediante glicosilación, lipidación por ejemplo, por lipidación química con palmitoiloxisuccinimida como se describe por Mowat et al (Mowat, 1991) o con cloruro de dodecanoilo como se describe por (Lustig, 1976), al comprender grupos protésicos, o al contener aminoácidos adicionales tales como por ejemplo, un his-tag o un péptido señal.

De este modo, cada polipéptido se puede caracterizar por aminoácidos específicos y estar codificados por secuencias de ácido nucleico específicas. Se entenderá que dichas secuencias incluyen análogos y variantes producidas por procedimientos recombinantes o sintéticos en los que tales secuencias polipeptídicas han sido modificadas por sustitución, inserción, adición o deleción de uno o más residuos de aminoácidos en el polipéptido recombinante y aún ser inmunogénicas en cualquiera de los ensayos biológicos descritos en la presente memoria. Las sustituciones son preferiblemente "conservadoras". Estos se definen de acuerdo con la siguiente tabla. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferiblemente en la misma línea en la tercera columna se pueden sustituir entre sí. Los aminoácidos de la tercera columna se indican con un código de una letra.

Un polipéptido preferido dentro de la presente invención es un fragmento de un antígeno inmunogénico de M. tuberculosis. Tal antígeno puede, por ejemplo, derivarse de la célula de M. tuberculosis y/o del filtrado del cultivo de M. tuberculosis. De este modo, un polipéptido que comprende una porción inmunogénica de uno de los antígenos anteriores puede consistir enteramente en la porción inmunogénica o puede contener secuencias adicionales. Las secuencias adicionales se pueden derivar del antígeno nativo de M. tuberculosis o ser heterólogas y tales secuencias pueden ser inmunogénicas, aunque no es necesario.

En el presente contexto, el término "fragmento de polipéptido sustancialmente puro" significa una preparación de polipéptido que contiene como máximo un 10 % en peso de otro material polipeptídico con el que está asociado de forma nativa (se prefieren porcentajes más bajos de otro material polipeptídico, por ejemplo, como máximo 4 %, como máximo 3 %, como máximo 2 % y como máximo 1). Se prefiere que el polipéptido sustancialmente puro sea al menos un 96 % puro, es decir, que el polipéptido constituya al menos el 96 % en peso del material polipeptídico total presente en la preparación, y se prefieren porcentajes más altos, tales como al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,25 %, al menos 99,5 % y al menos 99,75 %. Se prefiere especialmente que el fragmento de polipéptido esté en "forma esencialmente pura", es decir, que el fragmento de polipéptido esté esencialmente libre de cualquier otro antígeno con el que esté asociado de forma nativa, es decir, libre de cualquier otro antígeno de bacterias pertenecientes al complejo de tuberculosis o unas micobacterias virulentas. Esto se puede lograr preparando el fragmento de polipéptido por medio de procedimientos recombinantes en una célula huésped no micobacteriana como se describirá en detalle a continuación, o sintetizando el fragmento de polipéptido mediante los procedimientos bien conocidos de síntesis de péptidos en fase sólida o líquida, por ejemplo, por el procedimiento descrito por (Merrifield 1963) o variaciones del mismo.

Por "tuberculosis" (TB) se entiende una infección causada por una micobacteria virulenta del complejo de la tuberculosis, capaz de causar la infección por TB y enfermedad en un animal o en un ser humano. Ejemplos de micobacterias virulentas son M. tuberculosis, M. africanum y M. bovis. Ejemplos de animales relevantes son el ganado, las zarigüeyas, los tejones y los canguros.

Por "un paciente con TB" se entiende un individuo con infección comprobada en cultivo o microscópicamente con micobacterias virulentas, y/o un individuo diagnosticado clínicamente con TB y que responde a la quimioterapia anti-TB. Los expertos en la técnica conocen bien el cultivo, la microscopía y el diagnóstico clínico de la TB.

Por el término "reacción de hipersensibilidad de tipo retardado" (DTH) se entiende una respuesta inflamatoria mediada por células T provocada después de la inyección de un polipéptido en, o aplicación a, la piel, apareciendo dicha respuesta inflamatoria 72-96 horas después de la inyección o aplicación de polipéptidos.

Por el término "citocina" se entiende cualquier agente inmunomodulador, tal como interleucinas e interferones, que se pueda usar como indicación de una respuesta inmunológica. Esto incluye, por ejemplo, interferón-gamma "IFN-y", proteína 10 inducible por interferongamma, también conocida como CXCL10 o "IP-10", e interleucina 2 (IL-2).

A lo largo de esta especificación, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprende", o variaciones de la misma como "comprende" o "comprende", se entenderá que implica la inclusión de un elemento indicado o número entero o grupo de elementos o números enteros, pero no la exclusión de ningún otro elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.

Identidad de secuencia

El término "identidad de secuencia" indica una medida cuantitativa del grado de homología entre dos secuencias de aminoácidos de igual longitud o entre dos secuencias de nucleótidos de igual longitud. Las dos secuencias que se van a comparar deben alinearse para que se ajusten lo mejor posible con la inserción de brechas o, alternativamente, el truncamiento en los extremos de las secuencias de proteínas. La identidad de secuencia se -.v*, )¡oo

puede calcular como ' ' en la que Nd¡f es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinean y en la que Nref es el número de residuos en una de las secuencias. Por consiguiente, la secuencia de ADN AGTCAGTC tendrá una identidad de secuencia del 75 % con la secuencia AATCAATC (Ndif = 2 y Nref = 8). Una brecha se cuenta como no identidad del (los) residuo (s) específico (s), es decir, la secuencia de a Dn AGt Gt C tendrá una identidad de secuencia del 75 % con la secuencia de A d N Ag TCAGTC (Ndif = 2 y Nref = 8). Alternativamente, la identidad de secuencia se puede calcular mediante el programa BLAST, por ejemplo, el programa BLASTP (Pearson, 1988) www.ncbi.nlm.nih.gov/cg-bin/BLAST). En un aspecto de la invención, la alineación se realiza con el procedimiento de alineación de secuencias ClustalW con parámetros predeterminados como describen Thompson, et al (Thompson, 1994), disponible en http://www2.ebi.ac.uk/clustalw/.

Un porcentaje mínimo preferido de identidad de secuencia es al menos 80 %, tales como al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, y al menos 99.5 %.

Epítopo inmunogénico

Un epítopo inmunogénico de un polipéptido es una parte del polipéptido, que provoca una respuesta inmune en un animal o un ser humano, y/o en una muestra biológica determinada por cualquiera de los ensayos biológicos descritos en la presente memoria. El epítopo inmunogénico de un polipéptido puede ser un epítopo de células T o un epítopo de células B. El epítopo inmunogénico puede estar relacionado con una o unas pocas partes relativamente pequeñas del polipéptido, pueden estar dispersos por toda la secuencia polipeptídica o estar situados en partes específicas del polipéptido. Para algunos epítopos de polipéptidos, incluso se ha demostrado que están dispersos por todo el polipéptido que cubre la secuencia completa (Ravn, 1999).

Para identificar los epítopos de células T relevantes que se reconocen durante una respuesta inmune, es posible usar un procedimiento de "fuerza bruta": dado que los epítopos de células T son lineales, los mutantes de deleción del polipéptido, si se construyen sistemáticamente, revelan qué regiones del polipéptido son esenciales en el reconocimiento inmunológico, por ejemplo, sometiendo estos mutantes de deleción, por ejemplo, al ensayo de IFN-y descrito en la presente memoria. Otro procedimiento usa péptidos superpuestos para la detección de epítopos de MHC de clase II, preferiblemente sintéticos, que tienen una longitud de por ejemplo, 20 residuos de aminoácidos derivados del polipéptido. Estos péptidos se pueden probar en ensayos biológicos (por ejemplo, el ensayo de IFN-y como se describe en la presente memoria) y algunos de estos darán una respuesta positiva (y por lo tanto serán inmunogénicos) como evidencia de la presencia de un epítopo de células T en el péptido. Para la detección de epítopos de MHC de clase I, es posible predecir péptidos que se unirán (Stryhn, 1996) y, en lo sucesivo, producir estos péptidos sintéticos y probarlos en ensayos biológicos relevantes, por ejemplo, el ensayo de IFN-y como se describe en la presente memoria. Los péptidos que tienen preferiblemente una longitud de por ejemplo, 8 a 11 residuos de aminoácidos derivados del polipéptido.

Aunque se ha demostrado que la longitud mínima de un epítopo de células T es de al menos 6 aminoácidos, es normal que tales epítopos estén constituidos por tramos más largos de aminoácidos. Por consiguiente, se prefiere que el fragmento de polipéptido de la invención tenga una longitud de al menos 7 residuos de aminoácidos, tales como al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18, al menos 20, al menos 22, al menos 24, y al menos 30 residuos de aminoácidos. Por consiguiente, en realizaciones importantes del procedimiento de la invención, se prefiere que el fragmento de polipéptido tenga una longitud de como máximo 50 residuos de aminoácidos, tal como como máximo de 40, 35, 30, 25 y 20 residuos de aminoácidos. Se espera que los péptidos que tienen una longitud de entre 10 y 30 residuos de aminoácidos demuestren ser más eficientes como epítopos de MHC de clase II y, por lo tanto, las longitudes especialmente preferidas del fragmento de polipéptido usado en el procedimiento de la invención son 18, tales como 15, 14, 13, 12 e incluso 11 residuos de aminoácidos. Se espera que los péptidos que tienen una longitud de entre 7 y 12 residuos de aminoácidos resulten ser más eficientes como epítopos de MHC de clase I y, por lo tanto, las longitudes especialmente preferidas del fragmento de polipéptido usado en el procedimiento de la invención son 11, tales como 10, 9, 8 e incluso 7 residuos de aminoácidos.

Las porciones inmunogénicas (fragmentos que comprenden epítopos inmunogénicos) de polipéptidos, que comprenden el epítopo inmunogénico, pueden ser reconocidas por una parte amplia (alta frecuencia) o por una parte menor (baja frecuencia) de la población humana genéticamente heterogénica. Además, algunas porciones inmunogénicas inducen altas respuestas inmunológicas (dominantes), mientras que otras inducen respuestas más bajas, pero aún significativas (subdominante). Alta frecuencia><baja frecuencia puede estar relacionada con la unión de la porción inmunogénica a moléculas MHC ampliamente distribuidas (tipo HLA) o incluso por múltiples moléculas MHC (Sinigaglia, 1988; Kilgus, 1991). Los fragmentos que comprenden epítopos inmunogénicos de dichos polipéptidos pueden estar presentes como péptidos solapantes de al menos 10 aminoácidos de longitud que abarcan varios epítopos.

Variantes

Una característica común de los polipéptidos de las composiciones de la invención es su capacidad para inducir una respuesta inmunológica como se ilustra en los ejemplos. Se entiende que una variante de un polipéptido de la invención producida por sustitución, inserción, adición o deleción también es inmunogénica determinada por cualquiera de los ensayos descritos en la presente memoria.

Individuo inmune

Un individuo inmune se define como una persona o un animal, que ha eliminado o controlado una infección con micobacterias virulentas o ha recibido una vacuna con M. bovis BCG.

Inmunogénico

Un polipéptido inmunogénico se define como un polipéptido que induce una respuesta inmune en una muestra biológica o en un individuo actual o previamente infectado con una micobacteria virulenta. Un polipéptido inmunogénico es sinónimo de un antígeno o un polipéptido antigénico y los dos términos inmunógeno y antígeno se usan indiscriminadamente en esta divulgación; la definición estricta de un antígeno es que puede unirse específicamente a un receptor de células T o B y la definición estricta de un inmunógeno es que puede provocar una respuesta inmune, pero cuando se trata del diagnóstico, el efecto de los dos los términos son los mismos y, por consiguiente, se usan aquí indiscriminadamente.

Diagnóstico CMI

La respuesta inmune se puede controlar mediante uno de los siguientes procedimientos: Una respuesta CMI in vitro se determina mediante la liberación de una citocina relevante, tales como IFN-y, de linfocitos extraídos de un animal o ser humano actual o previamente infectado con micobacterias virulentas, o mediante la detección de la proliferación de estas células T. La inducción se realiza mediante la adición de la composición inmunogénica a una suspensión de células sanguíneas que comprende preferiblemente de 1x105 células a 1x106 células por pocillo. Las células se aíslan de la sangre, el bazo, el hígado o el pulmón y la adición de la composición inmunogénica da como resultado una concentración de, por ejemplo, 1-200 |ig por ml de suspensión y la estimulación se realiza de dos a cinco días. Para controlar la proliferación celular, las células se pulsan con timidina marcada radiactiva y después de 16-22 horas de incubación se detecta la proliferación mediante recuento de centelleo líquido o cualquier otro procedimiento para detectar una respuesta proliferativa. La liberación de IFN-y se puede determinar mediante el procedimiento ELISA, que es bien conocido para un experto en la técnica. Otras citocinas y quimiocinas además del IFN-y podrían ser relevantes al monitorear la respuesta inmunológica al polipéptido, tal como IL-2, IL-12, TNF-a, IL-4, TGF-p, IP-10, MIP-1p, M C P-1, IL-1RA y MIG. Otro procedimiento más sensible para determinar la presencia de una citocina (por ejemplo, IFN-y) es el procedimiento ELISPOT donde las células aisladas por ejemplo, de la sangre se diluyen a una concentración preferiblemente de 1 a 4 x 106 células/ml y se incuba durante 18-22 horas en presencia de la composición de diagnóstico o inmunogénica dando como resultado una concentración preferiblemente de 1-200 |ig por ml. Las suspensiones de células se diluyen a continuación hasta 1 a 2 x 106/ml y se transfieren a placas de microtitulación de membrana de fluoruro de polivinilideno recubiertas con anti-IFN-y y se incuban preferiblemente durante 4 a 16 horas. Las células productoras de IFN-y se determinan mediante el uso de un anticuerpo anti-IFN-y secundario marcado y un sustrato relevante que da lugar a manchas, que se pueden enumerar usando un microscopio de disección. El ensayo FluoroSpot es una modificación del ensayo ELISPOT y se basa en el uso de múltiples anticitocinas fluorescentes que permiten detectar dos citocinas en el mismo ensayo, lo que permite mejorar la predicción del riesgo de enfermedad como se describe a continuación para la codeterminación de IL-2 e IFN-y. También es posible determinar la presencia de una respuesta de citocina o quimiocina usando tecnología de flujo lateral. Este tipo de ensayo, bien conocido por las pruebas rápidas de embarazo, permite la detección rápida del nivel de citocinas o quimiocinas liberadas y permite el diagnóstico de infecciones y enfermedades también en entornos muy limitados de recursos. Otros inmunoensayos que incluyen ensayos colorimétricos tales como turbidimetría son bien conocidos para el experto y se pueden usar para la detección de alto rendimiento de niveles de citocinas o quimiocinas. También es una posibilidad determinar la presencia de ARNm que codifica la citocina relevante mediante el uso de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La detección de citocinas o quimiocinas a nivel de ARNm suele ser más rápida que a nivel de proteínas, ya que la transcripción de ARNm precede a la síntesis de proteínas. Por ejemplo, los niveles de ARNm de la citocina IFN-y y la quimiocina IP-10 son óptimos en períodos de incubación más cortos en comparación con el nivel de proteína. Las señales de citocinas y quimiocinas detectadas a nivel de ARNm se pueden realizar tan pronto como 2 horas después de la estimulación, y los niveles máximos se alcanzan a las 6-10 horas. Normalmente se medirán una o más citocinas usando, por ejemplo, PCR, flujo lateral, ELISPOT o ELISA. Una persona experta en la técnica apreciará que se puede usar un aumento o disminución significativo en la cantidad de cualquiera de estas citocinas inducidas por un polipéptido específico en la evaluación de la actividad inmunológica del polipéptido. Además, el destinatario experto apreciará que ciertos patrones de liberación de citocinas están asociados con ciertos estados clínicos. En particular, se ha sugerido un predominio de IFN-y a IL-2 como indicativo de enfermedad de TB activa incipiente, mientras que el predominio de IL-2 a IFN-y sugiere control de infección y bajo riesgo de desarrollar enfermedad de TB a pesar de la presencia de infección en mamífero sometido a pruebas (Biselli, 2010; Sester, 2011).

La respuesta de CMI in vitro se puede aumentar mediante la adición de citocinas como IL-7 y/o IL-15, también se puede aumentar la liberación bloqueando sustancias inhibidoras tales como IL-10, IL-4, IL-5. y/o IL-13. Se pueden detectar de forma más fiable respuestas de CMI similares si las condiciones de cultivo in vitro son óptimas para las células sometidas a estimulación. Tales condiciones se pueden adelantar mediante la adición de nutrientes, por ejemplo, en forma de azúcares simples y complejos.

Un procedimiento más simple pero sensible es el uso de muestras de sangre entera sin aislamiento previo de células mononucleares. Con este procedimiento se toma una muestra de sangre entera heparinizada (con o sin lisis previa de los eritrocitos) en una cantidad de 50-1000 ml y se realiza la incubación en 18 horas a 6 días con la composición diagnóstica o inmunogénica de la invención dando como resultado una concentración de preferiblemente 1-200 |ig/ml de suspensión. Se recolecta el sobrenadante y se puede determinar la liberación de IFN-y (o cualquier otra citocina liberada relevante, por ejemplo, IP-10, IL-2 u otras) mediante el procedimiento ELISA, que es bien conocido para un experto en la técnica.

Otro procedimiento in vitro también simple pero sensible para determinar una respuesta de CMI es marcando la muestra, después de la incubación con la composición de diagnóstico o inmunogénica, en papel de filtro, por ejemplo, Whatman 903 o papel Whatman FTA. Después del secado, la muestra manchada se estabiliza y los niveles de citocinas y quimiocinas en la muestra se pueden detectar en una etapa posterior. Las respuestas de CMI se detectan fácilmente con las técnicas mencionadas anteriormente para las mediciones de proteínas o ARNm. Este procedimiento es particularmente apropiado para entornos de bajos recursos o para la preparación y el análisis de muestras de alto rendimiento.

Otro procedimiento in vitro comprende tubos de recogida de sangre vacutainer recubiertos previamente con los polipéptidos inmunogénicos o proteínas de fusión de los mismos, opcionalmente también agregados un estabilizante de sangre tal como heparina y/o nutrientes. Los tubos de incubación recubiertos previamente permiten la extracción de sangre sencilla y eliminan el riesgo de exposición a infecciones transmitidas por la sangre mientras se prepara la muestra para la incubación in vitro. Estos tubos vacutainer son ideales para el procesamiento y la automatización de alto rendimiento.

Por lo tanto, la invención también se refiere a un procedimiento in vitro para diagnosticar la sensibilización en curso o previa en un animal o un ser humano con una micobacteria virulenta, el procedimiento comprende proporcionar una muestra de sangre del animal o ser humano y poner en contacto la muestra del animal con el polipéptido o la composición de la invención, siendo indicativa de que el animal está sensibilizado una liberación significativa en la fase extracelular de al menos una citocina por las células mononucleares en la muestra de sangre. Una respuesta positiva es una respuesta más que la liberación de una muestra de sangre derivada de un paciente sin el diagnóstico de TB más dos desviaciones estándar.

Una respuesta de CMI in vitro también se puede determinar mediante el uso de líneas de células T derivadas de un individuo inmune o una persona infectada por M. tuberculosis donde las líneas de células T han sido impulsadas con micobacterias vivas, extractos de la célula bacteriana o filtrado de cultivo durante 10 a 20 días con la adición de IL-2. La inducción se realiza mediante la adición de preferiblemente 1-200 |ig de polipéptido por ml de suspensión a las líneas de células T que contienen, por ejemplo, 1x105 células a 3x105 células por pocillo y se realiza la incubación de dos a seis días. La inducción de IFN-y o la liberación de otra citocina relevante se detecta mediante ELISA. La estimulación de las células T también se puede controlar detectando la proliferación celular usando timidina marcada radiactivamente como se describió anteriormente. Para ambos ensayos, una respuesta positiva es una respuesta más de fondo más dos desviaciones estándar.

Una respuesta CMI in vivo (por ejemplo, prueba cutánea, prueba cutánea transdérmica, prueba cutánea con parche) que se puede determinar como una respuesta DTH positiva después de una inyección intradérmica o un parche de aplicación local de preferiblemente 1-200 |ig de cada polipéptido en la composición de diagnóstico o inmunogénica de la invención a un individuo que está clínica o subclínicamente infectado con una micobacteria virulenta, una respuesta positiva que tiene un diámetro de al menos 5 mm 72-96 horas después de la inyección o aplicación.

Precisión diagnóstica y puntos de corte

La sensibilidad de cualquier prueba de diagnóstico dada define la proporción de individuos con una respuesta positiva que son correctamente identificados o diagnosticados por la prueba, por ejemplo, la sensibilidad es del 100 %, si todas las personas con una determinada afección tienen una prueba positiva. La especificidad de una prueba de cribado determinada refleja la proporción de personas sin la afección que son correctamente identificadas o diagnosticadas por la prueba, por ejemplo, la especificidad del 100 % es si todas las personas sin la afección tienen un resultado de prueba negativo.

La sensibilidad se define como la proporción de individuos con una condición dada (por ejemplo, infección por TB activa), que se identifican correctamente mediante los procedimientos descritos de la invención (por ejemplo, tiene un resultado positivo en la prueba de IFN-y).

La especificidad en la presente memoria se define como la proporción de individuos sin la afección (por ejemplo, sin exposición a la infección por TB activa), que se identifican correctamente mediante los procedimientos descritos de la invención (por ejemplo, tiene un resultado de prueba de IFN-y negativo).

Características de funcionamiento del receptor

La precisión de una prueba de diagnóstico se describe mejor por sus características de funcionamiento del receptor (ROC) (Zweig, 1993). El gráfico ROC es un gráfico de todos los pares de sensibilidad/especificidad que resultan de variar continuamente el umbral de decisión en todo el intervalo de datos observados.

El rendimiento clínico de una prueba de laboratorio depende de su precisión diagnóstica o de la capacidad de clasificar correctamente a los sujetos en subgrupos clínicamente relevantes. La precisión del diagnóstico mide la capacidad de la prueba para distinguir correctamente dos condiciones diferentes de los sujetos investigados. Tales condiciones son, por ejemplo, salud y enfermedad, infección latente o reciente frente a no infección, o enfermedad benigna frente a maligna.

En cada caso, el gráfico ROC representa la superposición entre las dos distribuciones trazando la sensibilidad frente a 1 - especificidad para el intervalo completo de umbrales de decisión. En el eje y está la sensibilidad, o la fracción de verdaderos positivos [definida como (número de resultados de prueba positivos verdaderos) (número de resultados positivos verdaderos número de resultados de prueba falsos negativos)]. Esto también se conoce como positividad en presencia de una enfermedad o afección. Se calcula únicamente a partir del subgrupo afectado. En el eje x está la fracción de falso positivo, o 1 - especificidad [definida como (número de resultados falsos positivos) / (número de resultados verdaderos negativo número de resultados falsos positivos)]. Es un índice de especificidad y se calcula en su totalidad a partir del subgrupo no afectado.

Debido a que las fracciones de verdadero y falso positivo se calculan completamente por separado, usando los resultados de la prueba de dos subgrupos diferentes, el gráfico ROC es independiente de la prevalencia de la enfermedad en la muestra. Cada punto de la gráfica ROC representa un par de sensibilidad/especificidad correspondiente a un umbral de decisión particular. Una prueba con discriminación perfecta (sin superposición en las dos distribuciones de resultados) tiene una gráfica ROC que pasa por la esquina superior izquierda, donde la fracción de verdadero positivo es 1,0, o 100 % (sensibilidad perfecta), y la fracción de falso positivo es 0 (especificidad perfecta). La gráfica teórica para una prueba sin discriminación (distribuciones idénticas de resultados para los dos grupos) es una línea diagonal de 45° desde la esquina inferior izquierda hasta la esquina superior derecha. La mayoría de las gráficas se encuentran entre estos dos extremos. (Si la gráfica de ROC cae completamente por debajo de la diagonal de 45°, esto se remedia fácilmente invirtiendo el criterio de "positividad" de "mayor que" a "menor que" o viceversa). Cualitativamente, cuanto más cerca esté la gráfica de la parte superior esquina izquierda, mayor será la precisión general de la prueba.

Un objetivo conveniente para cuantificar la precisión diagnóstica de una prueba de laboratorio es expresar su rendimiento mediante un solo número. La medida global más común es el área debajo de la gráfica ROC. Por convención, esta área es siempre > 0,5 (si no lo es, se puede revertir la regla de decisión para que sea así). Los valores oscilan entre 1,0 (separación perfecta de los valores de prueba de los dos grupos) y 0,5 (sin diferencia de distribución aparente entre los dos grupos de valores de prueba). El área no depende solo de una porción particular del gráfico, tal como el punto más cercano a la diagonal o la sensibilidad al 90 % de especificidad, sino de todo el gráfico. Ésta es una expresión cuantitativa y descriptiva de qué tan cerca está la gráfica ROC de la perfecta (área = 1,0).

La utilidad clínica de los nuevos grupos de antígenos se puede evaluar en comparación y en combinación con otras herramientas de diagnóstico para la infección dada. En el caso de infección por M. tuberculosis, la utilidad clínica de un resultado de CMI se puede evalúa en comparación con pruebas de diagnóstico establecidas tales como IGRA o TST usando un análisis de curva de operador receptor.

Procedimientos de preparación

En general, los antígenos de M. tuberculosis y las secuencias de ADN que codifican tales antígenos se pueden preparar usando uno cualquiera de una variedad de procedimientos.

Se pueden purificar como proteínas nativas de la célula de M. tuberculosis o del filtrado del cultivo mediante procedimientos tales como los descritos anteriormente. Los antígenos inmunogénicos también se pueden producir de forma recombinante usando una secuencia de ADN que codifica el antígeno, que se ha insertado en un vector de expresión y se ha expresado en un hospedador apropiado. Ejemplos de células huésped son E. coli. Los polipéptidos o la porción inmunogénica de los mismos también se pueden producir sintéticamente con menos de aproximadamente 100 aminoácidos, y generalmente menos de 50 aminoácidos y se pueden generar usando técnicas bien conocidas para los expertos en la técnica, tales como técnicas de fase sólida disponibles comercialmente, donde los aminoácidos se agregan secuencialmente a una cadena de aminoácidos en crecimiento.

En la construcción y preparación de ADN plasmídico que codifica el polipéptido, se puede usar una cepa huésped tal como E. coli. A continuación, se puede preparar ADN plasmídico a partir de cultivos durante la noche de la cepa huésped que lleva el plásmido de interés y purificarse usando por ejemplo, el kit de columna Qiagen Giga - Plasmid (Qiagen, Santa Clarita, CA, EE. UU.) que incluye una etapa de eliminación de endotoxinas.

Proteínas de fusión

Además de ser entidades separadas, dos o más de los polipéptidos inmunogénicos también se pueden producir como proteínas de fusión, mediante cuyos procedimientos se pueden lograr características superiores del polipéptido de la invención. Por ejemplo, los socios de fusión que facilitan la exportación del polipéptido cuando se produce de forma recombinante, los socios de fusión que facilitan la purificación del polipéptido y los socios de fusión que mejoran la inmunogenicidad del fragmento de polipéptido de la invención son todas posibilidades interesantes. Por lo tanto, la invención también se refiere a un polipéptido de fusión que comprende al menos dos (tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) polipéptidos o fragmentos inmunogénicos definidos anterior y opcionalmente al menos un socio de fusión adicional, y a composiciones que comprenden proteínas de fusión. El socio de fusión puede ser, para potenciar la inmunogenicidad, otro polipéptido derivado de M. tuberculosis, tal como un fragmento de polipéptido derivado de una bacteria perteneciente al complejo de tuberculosis, tal como ESAT-6, TB10.4, CFP10, RD1-ORF2, Rv1036, MPB64, MPT64, Ag85A, Ag85B (MPT59), MPB59, Ag85C, lipoproteína de 19 kDa, MPT32 y alfa-cristalina, o al menos un epítopo de células T de cualquiera de los antígenos mencionados anteriormente (Documentos WO0179274; WO01041519; (Nagai, 1991; Rosenkrands, 1998; Skjot, 2000). La invención también se refiere a un polipéptido de fusión que comprende fusiones mutuas de dos o más (tales como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) de los polipéptidos (o porciones inmunogénicas de los mismos) de la invención.

Leyendas de las figuras

Figura 1. Mapa de calor que muestra el reconocimiento inmunológico en 34 donantes voluntarios de Egipto en base a un límite de 100 pg/ml de IFN-y. Dos casos tenían TB latente (sujetos 1 y 2) y 32 casos fueron diagnosticados con la enfermedad de TB (sujetos 3-34). El código de color blanco indica que no hay respuesta, el código de color gris indica una respuesta y el color negro indica una respuesta al antígeno dado sin respuesta a ESAT-6 o CFP10.

Figura 2. Mapa de calor que muestra el reconocimiento inmunológico en 31 donantes voluntarios de Groenlandia en base a un límite de 50 pg/ml de IFN-y. 14 fueron diagnosticados con TB (sujetos 1-14) y 17 tenían TB latente (sujetos 15-31). El código de color blanco indica que no hay respuesta, el código de color gris indica una respuesta y el color negro indica una respuesta al antígeno dado sin respuesta a ESAT-6 o CFP10.

Figura 3. Mapa de calor que muestra el reconocimiento inmunológico en 30 donantes de control endémico de Egipto en base a un límite de 100 pg/ml de IFN-y. Todos los donantes fueron vacunados con BCG y no tenían antecedentes de enfermedad de TB o contacto conocido con un paciente con TB. Los donantes se definieron como "controles endémicos" ya que vivían en Egipto, que se considera un país endémico intermedio. El código de color blanco indica que no hay respuesta y el código de color gris indica una respuesta. Los antígenos investigados eran todos muy específicos en contraste con PPD, que se incluyó como un ejemplo de estimulación antigénica inespecífica. Los donantes 31 y 77 reconocieron una amplia gama de antígenos de M. tuberculosis que indican infección latente a pesar de los criterios de selección mencionados.

Figura 4. Respuestas de IP-10 al grupo de péptidos Quantiferon (ESAT-6, CFP10, Rv2654c (péptido 4)) y al grupo de péptidos A en 73 pacientes con TB de Egipto. La línea de puntos indica la mediana de las respuestas de 6 ng/ml para los antígenos de Quantiferon y 5,5 ng/ml para el grupo de péptidos A.

Figura 5. Respuestas de IP-10 al grupo de péptidos Quantiferon (ESAT-6, CFP10, Rv2654c (péptido 4)) y al grupo de péptidos A en 100 individuos de Dinamarca no expuestos a M. tuberculosis. La línea de puntos indica la mediana de las respuestas de 0 ng/ml para ambos grupos de antígenos. Esto muestra una alta especificidad (pocos falsos positivos) de todo el grupo de péptidos, lo que indica que cada péptido tiene una alta especificidad.

Figura 6. Respuestas de IFN-y al grupo de péptidos Quantiferon (ESAT-6, CFP10, Rv2654c (péptido 4)) y grupo de péptidos A en 100 individuos no expuestos a M. tuberculosis de Dinamarca. La línea de puntos indica una respuesta mediana de 0 pg/ml para el grupo de péptidos A y 4,9 pg/ml para los antígenos de Quantiferon. Esto muestra una alta especificidad (pocos falsos positivos) de todo el grupo de péptidos, lo que indica que cada péptido tiene una alta especificidad.

Figura 7. Análisis de la curva de características operativas del receptor (ROC) que compara el potencial de diagnóstico del grupo de péptidos A con los antígenos de Quantiferon en 100 individuos no expuestos a M. tuberculosis y 73 pacientes con TB. Esto muestra una alta especificidad (pocos falsos positivos) de todo el conjunto de péptidos, lo que indica que cada péptido tiene una alta especificidad.

Figura 8. Respuestas de IP-10 (ng/ml) al grupo de péptidos Quantiferon (ESAT-6, CFP10 y Rv2654c) y al grupo de péptidos A en 68 casos de pacientes con tuberculosis confirmada microbiológicamente y 36 controles endémicos de Tanzania.

Figura 9. Respuestas de IP-10 (ng/ml) al grupo de péptidos A y al grupo de péptidos A enriquecidos con ESAT-6 en 73 pacientes con TB confirmada del Cairo, Egipto. La línea indica la mediana.

Ejemplos

Ejemplo 1. Selección inicial de antígenos

Los antígenos de células T seleccionados para el inmunodiagnóstico de TB deben ser específicos para la infección por M. tuberculosis para evitar la interferencia de la vacunación con BCG y las micobacterias atípicas más prevalentes. Al mismo tiempo, es importante evitar ESAT-6 dado que ESAT-6 está presente en muchas de las nuevas vacunas contra TB. Como se describió anteriormente en Antecedentes de la invención, a través de un procedimiento de selección descendente extenso y estricto en base a consideraciones teóricas, pruebas prácticas y búsqueda bibliográfica de cientos de antígenos potenciales, se han seleccionado no más de 9 antígenos de M. tuberculosis para pruebas adicionales. Estos son:

CFP10 (Rv3874). El antígeno del filtrado de cultivo de 10 kDa es, junto con ESAT-6, la base de las pruebas de sangre de diagnóstico basadas en células actuales para la infección por M. tuberculosis mediante los ensayos de liberación de IFN-y (IGRA). CFP10 es un antígeno inmunodominante de M. tuberculosis, y la especificidad diagnóstica de CFP10 y ESAT-6 es causada por su ubicación genómica en la región de diferencia 1 (RD1), una región que está ausente en todas las cepas de BCG (Behr, 1999) y está implicada en la patogenia de M. tuberculosis. Los genes que codifican los componentes de la ruta de secreción de ESX-1 también se localizan en RD1. En una revisión de estudios de ensayo de interferón-y, se informó una sensibilidad para CFP10 de 61-71 % en pacientes con TB (Pai, 2004). A diferencia de ESAT-6, CFP10 no forma parte de ninguna de las vacunas candidatas que se están evaluando actualmente.

Rv3877. En cuanto a CFP10, el gen Rv3877 se encuentra en la región RD1 del cromosoma de M. tuberculosis y no tiene homólogos cercanos en ninguna otra parte del genoma de M. tuberculosis. La proteína no está presente en M. bovis BCG o en la micobacteria ambiental M. avium y, por lo tanto, se puede usar para el diagnóstico específico de M. tuberculosis sin interferencia de una posible vacunación previa con BCG o una fuerte exposición a micobacterias ambientales tales como M. avium. Rv3877 es una proteína transmembrana y un componente clave de la secreción de ESX-1, ya que forma el poro a través del cual se secretan los sustratos de ESX-1 (Abdallah, 2007). Un grupo de péptidos sintéticos que cubren la proteína Rv3877 indujo respuestas positivas en el 33 % de las PBMC aisladas de pacientes con TB humana (Mustafa, 2008).

Rv3614c y Rv3615c. El grupo de genes espA-espC-espD (Rv3616c-Rv3615c-Rv3614c) es esencial para la secreción de proteínas dependientes de ESX-1 y la virulencia de M. tuberculosis (Fortune, 2005; MacGurn, 2005), y recientemente se demostró que los tres genes son cotranscritos (Chen, 2012). Rv3616c y Rv3615c se secretan conjuntamente con ESAT-6 y CFP10 (Fortune, 2005; MacGurn, 2005), mientras que la secreción de Rv3614c no requiere exclusivamente funciones de ESX-1 (Chen, 2012). En el ganado, la contraparte de M. bovis de Rv3615c, Mb3645c, estimuló las respuestas de IFN-y en el 37 % de los animales infectados por M. bovis, pero no en los animales sin tratamiento previo y vacunados con BCG (Sidders, 2008). Mb3645c y Rv3615c muestran una identidad de aminoácidos del 100 %. En el ganado, la parte C-terminal de la proteína Mb3645c (aminoácidos 57­ 103) fue la más inmunogénica (Sidders, 2008). En humanos, el Rv3615c también se ha identificado como un candidato potencial para el inmunodiagnóstico en base a células T específicas de M. tuberculosis con reconocimiento de casos de TB y baja respuesta en pacientes vacunados con BCG (Millington, 2011). En pacientes con TB activa, los péptidos reconocidos con mayor frecuencia se ubicaron en la parte C-terminal de la molécula (aminoácidos 66-90). Aunque el gen que codifica Rv3615c está presente en BCG, la proteína Rv3615c se reconoce específicamente en individuos infectados con M. tuberculosis, pero con reconocimiento limitado en personas vacunadas con BCG.

EspF (Rv3865). La proteína EspF asociada a secreción de ESX-1 o M. bovis Mb3895 (idéntica a Rv3865 de M. tuberculosis) fue identificada por Ewer et al (Ewer, 2006) como un marcador de diagnóstico prometedor en ganado infectado experimental o naturalmente con M. bovis. El cincuenta por ciento del ganado infectado experimentalmente respondió al grupo de péptidos Mb3895, mientras que los terneros vacunados con BCG no respondieron a este grupo de péptidos.

Rv2348c. Rv2348c es una proteína hipotética con función desconocida. El gen Rv2348c se encuentra en la región RD7. Se ha demostrado que esta región está ausente en BCG (Behr, 1999) y, por lo tanto, la proteína se puede usar para el diagnóstico de TB sin interferencia de la vacunación previa con BCG. El gen está altamente transcrito in vitro (Arnvig, 2011) y la proteína se ha identificado en estudios de proteomas (de Souza, 2011). El fragmento de aminoácidos 23-50 en el ORF (marco de lectura abierto) de Rv2348c tiene una homología muy alta con el gen de M. avium Mav_2040.

Rv3873. A partir de la secuencia de aminoácidos de Rv3873, una región que cubre los aminoácidos 12-70 estaba cubierta por péptidos superpuestos. Entre varios grupos de péptidos RD evaluados, este grupo de péptidos Rv3873, denominado Rv3873A, se identificó como uno de los grupos más prometedores reconocidos por el 46 % de las PBMC de pacientes con TB (Brock, 2004). En esta parte de la molécula no estaban presentes posibles estiramientos de reacción cruzada.

Rv3878. Como se describió anteriormente para Rv3873, se definió y evaluó un grupo de péptidos denominada Rv3878B, que cubre los aminoácidos 122-189 de esta proteína RD1. Fue reconocido por el 32 % de las PBMC de pacientes con TB humana y se sugirió como un cóctel o grupo de péptidos que se podría combinar con ESAT-6 y CFP10 para maximizar la sensibilidad (Brock, 2004).

Rv2654c. El gen Rv2654c está codificado por la región RD11 y codifica una posible proteína de profago PhiRv2 con función desconocida. Al cribar péptidos superpuestos que cubren todo el producto proteico de Rv2654c (designado TB7.7), Brock et al no encontraron reconocimiento cruzado en individuos vacunados con BCG y, además, mostraron una sensibilidad del 47 % (Brock, 2004). Un péptido seleccionado (SEQ ID NO 8) se incluye en la prueba QuantiFERON® TB Gold.

Tabla 1. Lista de secuencias de los péptidos seleccionados.

Ejemplo 2. Selección de antígenos

Se probaron siete de los antígenos enumerados en el texto anterior para determinar su reconocimiento en pacientes con TB o individuos infectados de forma latente en dos estudios independientes en Egipto y Groenlandia. En ambos estudios, ESAT-6 (Rv3875) también se incluyó como comparador y antígeno de referencia. Adicionalmente, PPD se incluyó en Egipto como un ejemplo de estimulación antigénica inespecífica.

Se volvió a estimular la sangre entera diluida recién muestreada con los péptidos seleccionados de los antígenos como se describe y la respuesta a los grupos de péptidos de ESAT-6 y CFP10 se incluyó como referencia.

En el estudio de Egipto, se incluyeron 34 donantes voluntarios (8 mujeres y 26 hombres) como controles positivos. Treinta y dos de ellos fueron diagnosticados con enfermedad de t B con cultivo de esputo positivo documentado (sujetos 3-34). Dos casos tenían TB latente (sujetos 1 y 2). Además, se incluyeron 30 donantes endémicos de control negativo (5 mujeres y 25 hombres). Se presume que todos ellos estaban vacunados con BCG, no tenían antecedentes de enfermedad de TB y no habían tenido contacto conocido con un paciente con TB. En el estudio de Groenlandia, se incluyeron 31 sujetos (15 mujeres y 16 hombres). Catorce fueron diagnosticados con la enfermedad de TB (sujetos 1-14); en 11 casos con cultivo de esputo positivo documentado y en 4 casos el diagnóstico de TB se realizó por motivos clínicos. Los 17 sujetos restantes tenían TB latente (sujetos 15-31).

En ambos estudios se estimuló sangre entera diluida recién muestreada en placas con los antígenos seleccionados (10 |ig/ml de cada péptido). Los péptidos sintéticos (obtenidos de Genecust) de los antígenos ESAT-6, CFP10, Rv3873, Rv3878, Rv3615c, Rv3865, Rv3877 y Rv2348 se cribaron en ambos estudios y controles positivos (PHA) y negativos (medio solo) y PPD (solo en Egipto) también se incluyeron (no se muestran). La sangre entera diluida se incubó a 37 grados Celsius durante 5 días y, posteriormente, se recogieron los sobrenadantes y se probaron para (IFN-y) mediante un ELISA interno. Una respuesta positiva en estos estudios se definió como una concentración de IFN-y de 100 o 50 pg/ml para el estudio de Egipto y Groenlandia, respectivamente. Las figuras 1, 2 y 3 son representaciones gráficas (mapas de calor) de datos donde los valores individuales contenidos se representan como colores con el color blanco que no muestra respuesta, el color gris indica una respuesta al antígeno dado y el color negro representa una respuesta a un antígeno, donde el mismo donante no responde a ESAT-6 y/o CFP10. Como se muestra, varios de los antígenos de prueba se reconocieron en pacientes con TB o en donantes con infección latente y las respuestas más predominantes se derivaron de la estimulación con Rv3615c (reconocidas en el 49 % de los donantes). Es importante destacar que ESAT-6 solo reconoce a tres pacientes que no se reconocen tras la estimulación con CFP10 (pacientes No. 9 y 17 en la figura 1, y paciente No.

3 en la figura 2) y de esos pacientes Rv3615 es capaz de reconocer a los tres pacientes. Adicionalmente, la reestimulación con Rv3615c mostró reconocimiento en 11 y 9 donantes no reconocidos por ESAT-6 y CFP10, respectivamente. Por el contrario, dos de los antígenos se reconocieron en un número muy limitado de donantes; Rv3873 se reconoció en solo dos de los 65 donantes y Rv3878 se reconoció en siete de los 65 donantes. De este modo, a pesar de los datos previos sobre estos antígenos en pacientes con TB de Dinamarca y los Países Bajos con sensibilidad intermedia (Rv3873 con 32 % para Rv3878 y 46 % para Rv3873 (Brock, 2004), los datos en la presente memoria obtenidos enfatizan que no todos los antígenos se espera que sean sensibles funcionan en todos los entornos. Rv3865, Rv3877 y Rv2348 mostraron una sensibilidad intermedia y se reconoció en 16, 12 y 15 de los 65 donantes. Es importante destacar que los antígenos, Rv3615c, Rv3865 y Rv2348 dan lugar a respuestas en un número de donantes que no reconoció ESAT-6 y/o CFP10, lo que demuestra aún más el potencial diagnóstico de estos antígenos. La especificidad de los antígenos seleccionados se confirmó en un panel de 30 donantes de control negativo endémicos de Egipto (Figura 3). Como se muestra, los antígenos investigados fueron todos muy específicos, en contraste con PPD, que se incluyó como un ejemplo de una estimulación antigénica inespecífica. Los donantes 31 y 77 reconocieron una amplia gama de antígenos de M. tuberculosis, incluidos ESAT-6 y CFP-10 indicando claramente una infección latente a pesar de los criterios de selección mencionados.

Ejemplo 3. CFP10 y 3615c son comparables a CFP10 y ESAT-6

El rendimiento diagnóstico de la combinación CFP10 y Rv3615c se comparó posteriormente con el de la combinación CFP10 y ESAT-6. Se incluyeron muestras de sangre total de 35 individuos de Groenlandia, de los cuales 18 tenían una infección latente por M. tuberculosis definida como una prueba de Quantiferon positiva y/o exposición comprobada a M. tuberculosis y conversión de la prueba cutánea de tuberculina y 17 pacientes que tenían TB confirmada microbiológicamente. Se estimularon alícuotas individuales de 200 |il de sangre entera sin diluir con péptidos superpuestos que representan CFP10 (SEQ ID 1) o Rv3615 (SEQ ID 15-18) o ESAT-6 (SEQ ID 51) en una concentración final de 5 ug/ml en una incubadora a 37 °C, durante 7 días. Se preparó una muestra de control negativo (cero) en paralelo. Después de la incubación, se aisló el sobrenadante de plasma y se determinó el nivel de IFN-y usando ELISA.

La capacidad diagnóstica de los tres antígenos se evaluó sumando el nivel medido de producción específica de antígeno de IFN-y (el nivel en sangre entera estimulada restó el nivel en el pocillo no estimulado) en respuesta a la estimulación con antígeno o antígenos individuales, seguido de la comparación de esta suma con un punto de corte. El punto de corte se definió como una respuesta específica de antígeno combinada de al menos 50 pg/ml y 4 veces mayor que el valor nulo en el paciente individual. Los niveles específicos de antígeno por encima del punto de corte clasificaron al paciente individual como antígeno positivo y los niveles específicos de antígeno por debajo del punto de corte como antígeno negativo.

La tabla 2 muestra la sensibilidad de los antígenos individuales CFP10, Rv3615c, ESAT-6 y combinaciones. Como se muestra, el rendimiento diagnóstico de la combinación CFP10 y Rv3615c es comparable al de CFP10 y ESAT-6 y ambas combinaciones muestran una sensibilidad del 60 %. La combinación de CFP10, Rv3615c y ESAT-6 mejora aún más la sensibilidad desde un 60 % hasta un 69 %.

Tabla 2. Comparación de la sensibilidad de CFP10, Rv3615c y ESAT-6 y combinaciones de los mismos.

Ejemplo 4. Enriquecimiento de la combinación CFP10 y Rv3615c con tres antígenos: Rv2348, Rv3865 y Rv3877

Usando las mismas muestras de sangre entera que antes (35 individuos de Groenlandia; 18 con infección latente por M. tuberculosis y 17 pacientes con TB confirmada microbiológicamente) y las mismas condiciones de ensayo, se evaluó el efecto de combinar CFP10 y Rv3615c con tres antígenos; Rv2348, Rv3865 y Rv3877.

La capacidad diagnóstica de los tres antígenos se evaluó sumando el nivel medido de producción específica de antígeno de IFN-y (el nivel en sangre entera estimulada restó el nivel en el pocillo no estimulado) en respuesta al antígeno o antígenos individuales, seguido de por comparación de la suma con un corte. El punto de corte se definió como una respuesta específica de antígeno combinada de al menos 50 pg/ml y 4 veces mayor que el valor nulo en el paciente individual. Los niveles específicos de antígeno por encima del punto de corte clasificaron al paciente individual como antígeno positivo y los niveles específicos de antígeno por debajo del punto de corte como antígeno negativo.

La tabla 3 muestra la sensibilidad de los antígenos individuales Rv3865, CFP10, Rv3615c y combinaciones. La sensibilidad de Rv3865 es relativamente modesta con solo un 20 % de sensibilidad, pero agregar Rv3865 a CFP10 y Rv3615c aumenta la sensibilidad de diagnóstico general en un 6 % en comparación con CFP10 y Rv3865 solos.

Tabla 3. Comparación de CFP10, Rv3615c, Rv3865 y combinaciones de los mismos para el diagnóstico de infección por M. tuberculosis.

De manera similar, la capacidad de diagnóstico de Rv3877 fue solo del 11 %, pero también este antígeno mejoró la sensibilidad general de CFP10 y Rv3615c desde un 60 % hasta un 69 % (tabla 4).

Tabla 4. Comparación de CFP10, Rv3615c, Rv3877 y combinaciones de los mismos para el diagnóstico de infección por M. tuberculosis.

Finalmente, se evaluó si Rv2348 también era capaz de aumentar la capacidad de diagnóstico de CFP10 y Rv3615c (tabla 5). Como se muestra, la sensibilidad de Rv2348 fue del 29 % y agregar Rv2348 a CFP10 y Rv3615c aumenta la sensibilidad de diagnóstico en un 23 % en comparación con cuando se usa CFP10 y Rv3615c solos.

Tabla 5. Comparación de CFP10, Rv3615c, Rv2348 y combinaciones de los mismos para el diagnóstico de infección por M. tuberculosis.

Seleccionamos los siguientes antígenos (CFP10, Rv3615c, Rv3865 y Rv2348) para una evaluación adicional de la sensibilidad y especificidad cuando se combinan estos 4 antígenos en un solo grupo de péptidos (grupo de péptidos A).

Ejemplo 5. Prueba de sensibilidad y especificidad del grupo de péptidos A

Es bien conocido en el campo que un cóctel de inmunodiagnóstico que comprende ESAT-6, CFP10 y TB7.7p4 es el procedimiento preferido para el diagnóstico de la infección por M. tuberculosis. Este cóctel de antígenos se considera sensible y específico, y constituye la base de la prueba de Quantiferon. Como se desprende de los ejemplos anteriores, la combinación de antígenos mejora la sensibilidad diagnóstica y la fiabilidad de la prueba, ya que la magnitud subyacente de las respuestas de IFN-y es mayor y se detecta de forma más robusta en comparación con tener los antígenos solos.

Un enfoque muy fácil de usar para el inmunodiagnóstico es usar tubos vacutainer recubiertos previamente con los antígenos en un cóctel. Por ejemplo, en la prueba de Quantiferon, los péptidos liofilizados que representan el cóctel de antígenos se recubren con heparina en un tubo vacutainer. Se extrae sangre en este tubo, lo que permite que los péptidos interactúen con las células T CD4 y CD8 específicas de antígeno. Después de 16-24 horas de incubación, el tubo se centrifuga y el nivel de IFN-y producido se puede medir en el sobrenadante de plasma y compararlo con muestras de control negativo y positivo. Los sujetos probados se pueden clasificar además como ya sea infectados o no infectados si el nivel está por encima de un punto de corte para un resultado positivo de la prueba.

Es bien sabido que otras moléculas efectoras inmunes asociadas con la señalización de IFN-y son útiles para diagnosticar la infección por M. tuberculosis (Chego ERJ 2014). La quimiocina IP-10 se produce en niveles muy altos y tiene un rendimiento diagnóstico comparable al IFN-y.

Para demostrar la utilidad de combinar varios antígenos en un cóctel de antígenos, combinamos los siguientes antígenos en el "grupo de péptidos A". El grupo de péptidos A constaba de los siguientes péptidos:

• CFP10: 6 péptidos que cubren toda la secuencia de aminoácidos of CFP10 (SEQ ID NOs. 9-14)

• Rv3615c: 4 péptidos que cubren los aminoácidos 55-103 (SEQ ID NOs. 15-18)

• Rv3865: 3 péptidos que cubren los aminoácidos 9-44 (SEQ ID NOs. 19-21)

• Rv2348c: 4 péptidos que cubren los aminoácidos 56-109 de la secuencia de proteínas de longitud completa (SEQ ID NOs. 22-25)

Se realizó un segundo estudio independiente en Egipto para probar la sensibilidad de los 4 antígenos cuando se combinan en el grupo de péptidos A. En el estudio se incluyeron 73 pacientes con TB con cultivo de esputo positivo documentado y cada sujeto donó una muestra de sangre extraída directamente en tubos de vacío recubiertos con antígeno previamente preparados. Los tubos se recubrieron con péptidos ESAT-6 CFP10 Rv2654c (es decir, los mismos péptidos que en la prueba de Quantiferon y se usaron como referencia, denominado grupo de péptidos Quantiferon) o con el grupo de péptidos A (CFP10 Rv3516c Rv3865 Rv2348 como se indicó anteriormente). Después de 16-24 horas de incubación, se recogieron los sobrenadantes y se probaron para determinar la liberación de la citocina IP-10 con un ensayo ELISA interno. Como se muestra en la figura 4, una alta proporción de los pacientes con TB reconoció tanto el grupo de péptidos A como el grupo de péptidos de Quantiferon. Las respuestas medias fueron 5,5 ng/ml de IP10 para el grupo de péptidos A y 6,0 para el grupo de péptidos Quantiferon.

Paralelamente, se realizó un estudio independiente en Dinamarca para probar la especificidad del grupo de péptidos A. En el estudio, 100 sujetos que vivían en un área de muy baja prevalencia de TB (Dinamarca) y sin exposición conocida a M. tuberculosis fueron incluidos. En 17 casos, se documentó que los sujetos estaban vacunados con BCG, y en 19 casos el estado de vacunación con BCG era desconocido/indocumentado. Los participantes restantes no fueron vacunados con BCG. De manera similar al estudio de sensibilidad, se extrajo sangre entera fresca directamente en tubos de vacío recubiertos previamente con el grupo de péptidos A (CFP10 Rv3615c Rv3865 Rv2348) o el grupo de péptidos de referencia Quantiferon (ESa T-6 Cf P10 Rv2654c). Después de 16-24 horas de incubación, se recogieron los sobrenadantes y se probaron para determinar el contenido de las citocinas IP-10 e IFN-y con un ensayo ELISA interno. Aunque la mediana de las respuestas de IP-10 al grupo de péptidos A y al grupo de péptidos de Quantiferon fue de 0 ng/ml (Figura 5), algunos donantes no expuestos mostraron respuestas positivas tras la reestimulación con los antígenos de Quantiferon con niveles de IP-10 de aproximadamente 5 ng/ml. Se observó la misma tendencia con donantes no expuestos que mostraron respuestas falsas positivas al analizar la secreción de IFN-y (Figura 6; mediana del grupo de péptidos A 0 pg/ml, intervalo intercuartil (IQR) de -0,5-5,2 pg/ml y mediana del grupo de péptidos de Quantiferon 4,9 pg/ml, IQR - 0,6­ 32,45 pg/ml.

La combinación de los datos de los estudios de sensibilidad y especificidad permitió realizar un análisis de la curva de característica operativa del receptor (ROC) comparando el potencial de diagnóstico del grupo de péptidos A con el grupo de antígenos de Quantiferon (Figura 7). El área bajo la curva (AUC) fue 0,979 para el grupo de péptidos A y 0,947 para el grupo de antígenos de Quantiferon. Mediante el análisis de la curva ROC, los puntos de corte óptimos tanto para el grupo de péptidos A como para el grupo de péptidos Quantiferon se identificaron como 1,4 ng/ml para el grupo de péptidos A (sensibilidad 87,7 % con una especificidad del 98,1 %); y 2,3 ng/ml para el conjunto de péptidos Quantiferon (sensibilidad 75,3 % a 96,2 % de especificidad).

Usando estos puntos de corte, se comparó directamente el número de respuestas positivas y negativas tras la reestimulación con el grupo de péptidos Quantiferon y el grupo de péptidos A (Tablas 6 y 7). De los 73 pacientes con TB, 54 (74 %) reconocieron los grupos de péptidos Quantiferon que se encuentran dentro del intervalo publicado sobre la sensibilidad de los antígenos Quantiferon entre 64-89 % (Dewan, 2007). En comparación, el grupo de péptidos A reconoció una mayor proporción de pacientes con TB en este estudio (64 de los 73 pacientes) correspondiente a una sensibilidad estimada del 88 %. Usando una prueba de McNemar, el grupo de péptidos A demostró una sensibilidad significativamente mayor en este estudio en comparación con el grupo de péptidos de Quantiferon (p <0,012).

Tabla 6. Comparación directa del grupo de péptidos Quantiferon y el grupo de péptidos A en 73 pacientes con TB.

Tabla 7. Comparación directa del grupo de péptidos Quantiferon y el grupo de péptidos A en 100 presuntos controles no infectados.

En conclusión, el grupo de péptidos A exhibió una sensibilidad significativamente mayor (más verdaderos positivos; tabla 6) en comparación con los antígenos de Quantiferon y además fue al menos tan específico (falsos positivos comparables; tabla 7). Estos resultados demuestran claramente que es posible 1) diseñar grupos de péptidos de diagnóstico de TB desprovistos de ESAT-6 con una mayor sensibilidad en comparación con los antígenos Quantiferon actuales, 2) diseñar un grupo de antígenos que no contengan ESAT-6 con una especificidad comparable al Quantiferon actual.

Ejemplo 6. Validación del grupo de péptidos A.

Es bien sabido por el destinatario experto que la validación de los puntos de corte para las pruebas de inmunodiagnóstico requiere la confirmación en cohortes independientes. Para este fin, se incluyeron 68 casos de pacientes con TB confirmada microbiológicamente y 36 controles endémicos, es decir, individuos de los cuales algunos tenían una infección por M. tuberculosis preexistente pero controlada de Tanzania.

De cada donante, se extrajo 1 ml de sangre en 5 tubos vacutainer que comprenden heparina liofilizada (18 IU) y péptidos (5 ug/péptido) de la siguiente manera: grupo de péptidos Quantiferon (ESAT-6, CFP10 y TB7.7p4 (tubo 1), comparable a la prueba de Quantiferon); grupo de péptidos A (CFP10, Rv3615, Rv3865 y Rv2348B (tubo 2)) y un tubo de control negativo (tubo 3).

En la figura 8 se muestran las respuestas de IP-10 (ng/ml) restadas del tubo de control negativo (tubo 3) en los casos y controles del tubo 1 y del tubo 2. Es evidente que el grupo de péptidos Quantiferon y el grupo de péptidos A son comparable en términos de la alta magnitud de la respuesta en los casos de TB. Como era de esperar, las respuestas de control endémicas son más heterogéneas y sustentan que algunos individuos probados están infectados.

Usando el punto de corte predefinido identificado en el ejemplo 5 (1,4 ng/ml), se comparó la precisión diagnóstica tanto para pacientes con TB (tabla 8) como para controles endémicos (tabla 9). En el grupo de pacientes con TB, la sensibilidad diagnóstica del grupo de péptidos Quantiferon estándar fue del 66 % (45 definidos como positivos de 68 pacientes incluidos) y mayor para el grupo de péptidos A con una sensibilidad del 72 % (49 definidos como positivos de los 68 pacientes). Como era de esperar, la concordancia entre las dos pruebas fue muy alta con un 91 % de concordancia (44 fueron positivas en ambas pruebas, 18 negativas en ambas pruebas con una concordancia general de 62 de 68).

Tabla 8. Concordancia entre el grupo de péptidos de Quantiferon y el grupo de péptidos A después de clasificar las respuestas a la estimulación antigénica de 68 pacientes con Tb confirmada usando puntos de corte predeterminados para la prueba positiva.

En la población de control endémica no existe un patrón referencial para la infección, por lo tanto, se presenta la tasa como respondedores positivos. El grupo de péptidos A detectó el 39 % (14/36) como positivo y el grupo de péptidos Quantiferon estándar el 31 % (11/36) sugiriendo de nuevo una mayor sensibilidad. La concordancia también fue muy alta (92 % correspondiente a concordancia en 33 casos de los 36 incluidos).

Tabla 9. Concordancia entre el grupo de péptidos de Quantiferon y el grupo de péptidos A después de clasificar las respuestas a la estimulación antigénica de 36 controles endémicos usando puntos de corte predeterminados para la prueba positiva.

Ejemplo 7. El grupo de péptidos A puede mejorarse aún más cuando se combina con ESAT-6.

Se evaluó además la posibilidad de agregar ESAT-6 al grupo de péptidos A con el fin de mejorar aún más el rendimiento diagnóstico. Por lo tanto, se probaron el grupo de péptidos A ESAT-6 y el grupo de péptidos A en la cohorte de 73 casos de TB confirmada en el Cairo, Egipto y usando las mismas condiciones de ensayo que se describen en el ejemplo 5. En la figura 9 es evidente que la magnitud de las respuestas aumenta cuando se combina el grupo de péptidos A con ESAT-6 con el grupo de péptidos A que tiene una respuesta media de 5,50 ng/ml de IP-10 en comparación con el grupo de péptidos A con ESAT-6 donde la mediana es de 6,86 ng/ml de IP-10. Usando un punto de corte de 0,75 ng/ml, se comparó las frecuencias de respuesta en los dos grupos. En el grupo de péptidos A, la frecuencia de respuesta fue del 93 %, siendo 68 positivos de los 73 pacientes se probaron, mientras que la frecuencia para el grupo de péptidos A con ESAT-6 fue del 96 % (70 de 73 pacientes - 96 %). De este modo, la combinación del conjunto de péptidos A con ESAT-6 redujo la tasa de falsos negativos del 7 % al 4 %.

Referencias

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una composición de diagnóstico que comprende una mezcla de polipéptidos sustancialmente puros que comprende

a) secuencias de aminoácidos de Rv3874 (SEQ ID NO 1), Rv3615 (SEQ ID NO 2) y Rv2348 (SEQ ID NO 4); o

b) fragmentos de 6-50 aminoácidos de longitud de la secuencia de aminoácidos de Rv3874 (SEQ ID NO1), fragmentos de 6-50 aminoácidos de longitud de la secuencia de aminoácidos de Rv3615 (SEQ ID NO 2) y fragmentos de 6-50 aminoácidos de longitud de la secuencia de aminoácidos de Rv2348 (SEQ ID NO 4) y en la que cada uno de los fragmentos comprende epítopos inmunogénicos de dichas secuencias de aminoácidos; o

c)

(i) secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de Rv3874 (SEQ ID NO1) y al mismo tiempo son inmunogénicas, secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de Rv3615 (s Eq ID NO 2) y al mismo tiempo son inmunogénicas y secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de Rv2348 (SEQ ID NO 4) y al mismo tiempo son inmunogénicas o

(ii) secuencias de aminoácidos que tienen un 80 % de identidad de secuencia con fragmentos de 6-50 aminoácidos de longitud de la secuencia de aminoácidos de Rv3874 (SEQ ID NO1) y al mismo tiempo son inmunogénicas, fragmentos de 6-50 aminoácidos de longitud de secuencia de aminoácidos de Rv3615 (SEQ ID NO 2) y al mismo tiempo son inmunogénicos y fragmentos de 6-50 aminoácidos de longitud de la secuencia de aminoácidos de Rv2348 (SEQ ID NO 4) y al mismo tiempo son inmunogénicos.

2. Una composición de diagnóstico según la reivindicación 1, que comprende además (i) Rv3865 (SEQ ID NO 3) o fragmentos que comprenden epítopos inmunogénicos del mismo; o (ii) Rv3877 (SEQ ID NO 7) o fragmentos que comprenden epítopos inmunogénicos del mismo.

3. Una composición de diagnóstico según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que los fragmentos que comprenden epítopos inmunogénicos de SEQ ID NO 1 se seleccionan de SEQ ID NO 9-14; y/o los fragmentos que comprenden epítopos inmunogénicos de SEQ ID NO 2 se escogen de SEQ ID NO 15-18 o SEQ ID NO 59-63; y/o los fragmentos que comprenden epítopos inmunogénicos de SEQ ID NO 3 se escogen de SEQ ID NO 19-21; y/o los fragmentos que comprenden epítopos inmunogénicos de SEQ ID NO 4 se escogen de SEQ ID NO 22-25; y/o los fragmentos que comprenden epítopos inmunogénicos de SEQ ID NO 7 se elige entre

4. Una composición de diagnóstico según la reivindicación 1-3 que comprende adicionalmente Rv3875 (SEQ ID NO 51) o uno o más fragmentos del mismo.

5. Una composición de diagnóstico según la reivindicación 4, en la que los fragmentos y los fragmentos que comprenden epítopos inmunogénicos de SEQ ID NO 51 se seleccionan de SEQ ID NO 52-58.

6. Una composición de diagnóstico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que los fragmentos que comprenden epítopos inmunogénicos de dichos polipéptidos están presentes como péptidos solapantes de al menos 10 aminoácidos de longitud.

7. Una composición de diagnóstico según la reivindicación 2(i), en la que la mezcla comprende SEQ ID NO 9 - 25.

8. Una composición de diagnóstico según cualquier reivindicación anterior, en la que algunos o todos los polipéptidos se fusionan opcionalmente mediante enlazantes o espaciadores.

9. Una herramienta o kit de diagnóstico CMI que comprende una composición de diagnóstico según la reivindicación 1-8.

10. Una herramienta o kit de diagnóstico CMI según la reivindicación 9, para el diagnóstico in vitro o in vivo de la tuberculosis.

11. Un procedimiento de diagnóstico in vitro de tuberculosis causada por micobacterias virulentas, por ejemplo, por Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum o Mycobacterium bovis, en un animal, incluido un ser humano, usando una composición de diagnóstico según la reivindicación 1-8.

12. Una composición de diagnóstico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso en un procedimiento de diagnóstico, en la que el procedimiento comprende la inyección intradérmica en un animal de la composición de diagnóstico, en la que una respuesta cutánea positiva en el lugar de la inyección es indicativa del animal que tiene tuberculosis y una respuesta cutánea negativa en el lugar de la inyección es indicativo de que el animal no tiene tuberculosis.

13. La composición de diagnóstico para su uso según la reivindicación 11, que comprende poner en contacto una muestra, por ejemplo, una muestra de sangre, con una composición de diagnóstico según la invención para detectar una reacción positiva, por ejemplo, proliferación de las células o liberación de citocinas tal como IFN-y o IP-10.

14. Una composición de diagnóstico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en un procedimiento de diagnóstico de tuberculosis causada por micobacterias virulentas, por ejemplo, por Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum o Mycobacterium bovis, en un animal, incluido un ser humano, en el que opcionalmente se pone en contacto una muestra, por ejemplo, una muestra de sangre, con una composición de diagnóstico según la invención para detectar una reacción positiva, por ejemplo, proliferación de las células o liberación de citocinas tales como IFN-y o IP-10.