KR101923198B1

KR101923198B1 - Tb7.7에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101923198B1
Application number: KR1020170123385A
Authority: KR
Inventors: 김윤근; 반창일; 장철훈
Original assignee: 주식회사 엠디엡투스; 포항공과대학교 산학협력단; 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2017-09-25
Filing date: 2017-09-25
Publication date: 2018-11-28
Also published as: WO2019059645A1; CN111212911B; US20200407722A1; CN111212911A; US11634717B2

Abstract

본 발명은 TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머, 이를 포함하는 결핵 진단용 바이오센서, 및 결핵 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것으로, 본 발명자들은 본 발명에 따른 DNA 압타머(DNA Aptamer)가 TB7.7 단백질에 대하여 특이적인 결합능을 가질 뿐만이 아니라, 그 결합력 또한 우수하다는 사실을 확인하였다. 따라서 본 발명의 DNA 압타머를 이용한다면, 기존의 항체를 이용한 ELISA 방법보다 뛰어난 안정성을 기대할 수 있어, 상기 압타머는 결핵 진단용 조성물, 결핵 진단용 바이오센서, 결핵 진단을 위한 정보제공 방법 등의 개발 시에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

TB7.7에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 및 이의 용도 {DNA aptamer specifically binding to TB7.7 and use thereof}

본 발명은 단백질 검출 압타머에 관한 것으로, 보다 상세하게는 결핵균(Mycobacterium Tuberculosis) H37Rv에서 발현하는 것으로 알려진 TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머에 관한 것이다.

결핵은 Mycobacterium tuberculosis 균에 감염되어 발병하는 흔하고 치명적인 질병이다. 결핵의 증상은 식욕 부진으로 인한 급격한 체중 저하, 고열, 피가 섞인 가래를 동반한 기침 등의 증상이 있다. 진단법은 X선 검사, 객담 도말 검사, 중합효소 연쇄 반응법 (PCR) 등이 있으며 복합적으로 시도하여 최종 진단한다. 이러한 결핵은 흔히 아프리카 지역을 포함한 후진국에서 많이 발병하는 것으로 알려져 있고, 또한, 최근에는 퇴치된 질병이라 인식되어있다. 그러나 실제 세계보건기구의 통계에 따르면 2015년 전 세계 사망원인 10위 안에 드는 무서운 질병으로, 특히 우리나라는 OECD 국가 중 결핵의 발생률과 사망률에서 압도적인 수치로 1위의 불명예를 안고 있다. 이에 국가차원의 결핵관리지침을 내세웠고, 제일 문제시되는 점이 잠복 결핵의 진단으로, 잠복 결핵의 환자는 전 세계인구의 1/3인 20억 명으로 추산된다. 이들 중 10%가 활동성 결핵으로 진행하는데, 이들이 증상을 보이기 전에 조기 진단을 하여 치료를 하는 것이 중요하다.

현재 잠복결핵의 진단은 투베르쿨린 스킨 테스트 (Tuberculin Skin Test; TST), 인터페론감마 분비 검사 (Inteferon-gamma releasing assay; IGRA) 두 가지를 적용하고 있다. TST는 최소 48시간에서 72시간이 소요되고, BCG 백신 접종 또는 비결핵항산균 감염에 의해서 위양성을 나타낼 수 있다. IGRA의 경우 환자의 혈액을 결핵균 특이 항원이 부착된 튜브에 첨가하여 16시간의 자극을 준 후 인터페론감마의 분비량을 측정하는 간접적인 진단법이다. TST에 비해 결핵균 특이 항원의 사용으로 위양성 비율은 낮으나, 결핵의 유행 지역이 대부분 온도가 높거나 습한 지역임을 감안했을 때, 안정성의 부족이 단점으로 작용한다. 또한, 혈액 내 자극을 통해 IFN-g의 분비를 간접적으로 측정하므로 민감도가 떨어지는 단점이 존재한다.

한편, TB7.7은 Rv2654c로도 불리며 인간에 특히 치명적인 결핵을 유발하는 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 에서 발현하는 것으로 알려져 있다. 감염 시 숙주 내 질병 유발 메커니즘은 정확하게 알려져 있지 않으나, IGRA에서 IFN-g 분비를 위한 결핵균 특이 항원으로 사용되는 ESAT-6과 함께 복합체를 형성하여 Th1 세포성 면역반응을 매개하는 것으로 추정된다.

압타머는 특정 물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA(ssDNA) 또는 RNA로서, 특정물질에 대한 친화도가 매우 높고 안정하기 때문에 최근 많이 개발되고 있고 이를 이용한 치료제 및 진단용 센서로의 응용이 활발히 진행되고 있다(한국 등록특허 10-1279585 참조). 압타머의 합성은 비교적 단순한 방법으로 가능하고 세포, 단백질 그리고 작은 유기물질까지도 표적물질이 될 수 있기 때문에 이를 이용한 새로운 검출방법들의 개발이 가능하며 그 특이성 및 안정성이 이미 개발되어 있는 항체에 비해 매우 높기 때문에 치료제 개발 및 약물전달 시스템, 진단용 바이오센서로의 응용이 가능하여, 이에 대한 연구가 계속 이루어지고 있다.

본 발명자는 TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa)에 대한 항체를 대신할 수 있는 압타머를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, TB7.7 단백질에 대한 특이적인 결합능을 가지는 DNA 압타머를 제조하였으며, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 (DNA Aptamer)로서, 서열번호 6, 7, 또는 8의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, DNA 압타머를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 압타머를 포함하는, 결핵 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa) 특이적 DNA 압타머; 및 상기 DNA 압타머가 고정되어 있는 기판을 포함하되, 상기 DNA 압타머는 서열번호 6, 7, 또는 8의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 결핵 진단용 바이오센서를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 (1) 피검체 시료를 상기 바이오센서에 처리하는 단계; 및 상기 바이오센서에 결합된 TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa)의 수준(level)을 측정하는 단계를 포함하는, 결핵 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 (DNA Aptamer)로서, 서열번호 6, 7, 또는 8의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, DNA 압타머를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 TB7.7는 결핵균 H37Rv에서 발현하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 압타머를 포함하는, 결핵 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa) 특이적 DNA 압타머; 및 상기 DNA 압타머가 고정되어 있는 기판을 포함하되, 상기 DNA 압타머는 서열번호 6, 7, 또는 8의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 결핵 진단용 바이오센서를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 기판은 금속 전극층 및 금속 나노입자층로 이루어지는 것일 수 있으며, 상기 금속은 바람직하게는 금(Au)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 (1) 피검체 시료를 상기 바이오센서에 처리하는 단계; 및 상기 바이오센서에 결합된 TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa)의 수준(level)을 측정하는 단계를 포함하는, 결핵 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 (DNA Aptamer)를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 결핵의 진단방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 (DNA Aptamer)의 결핵 진단용도를 제공한다.

본 발명에 따른 DNA 압타머(DNA Aptamer)는 TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa) 단백질에 대하여 특이적인 결합능을 가질 뿐만이 아니라, 그 결합력 또한 우수하다. 따라서 본 발명의 DNA 압타머를 이용한다면, 기존의 항체를 이용한 ELISA 방법보다 뛰어난 안정성을 기대할 수 있어, 상기 압타머는 결핵 진단용 조성물, 결핵 진단용 바이오센서, 결핵 진단을 위한 정보제공 방법 등의 개발 시에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 TB7.7 유전자를 증폭한 결과이고, 도 1b는 재조합 TB7.7 단백질의 과발현을 확인(1번 레인은 과발현 유도 전, 2번 레인은 IPTG를 처리하여 과발현 유도한 결과)한 것이며, 도 1c는 FPLC를 통해 얻은 고순도의 재조합 TB7.7 단백질을 관찰한 결과이다.
도 2는 ssDNA(single strand DNA)와 TB7.7의 결합 정도(%)를 확인하고, 선별 과정을 진행한 결과이다.
도 3a는 TG4 압타머 서열, 도 3b는 TG5 압타머 서열, 도 3c는 TG6 압타머 서열에 대한 각 Kd 값을 형광측정을 통하여 확인한 결과이다.
도 4는 DNA 압타머를 이용한 TB7.7 단백질 검출용 바이오센서에 대한 개략적인 모식도이다.
도 5는 동일한 농도의 압타머에 Spacer의 농도를 변화시키면서 임피던스 값을 측정한 결과이다.
도 6a 및 도 6b는 TG4 압타머를 이용한 TB7.7 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 TB7.7 단백질에 대한 결합특이성 실험에서 각 단백질과 반응에 따른 상대적인 임피던스 값의 변화를 나타낸 결과이다.
도 8은 정상인과 결핵 환자의 혈청을 분리하여 TG4 압타머에 처리하였을 때 임피던스 값의 변화를 나타낸 결과이다.

본 발명자는 TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa)에 대한 항체를 대신할 수 있는 압타머를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, TB7.7을 박테리아 발현시스템에서 발현 및 정제를 하고, 이를 이용하여 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 기법을 이용하여 압타머를 선별하였으며, DNA 압타머들의 서열 및 구조를 확립하여, 본 발명에서 제조된 DNA 압타머의 TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa) 단백질에 대한 특이적인 결합능을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 (DNA Aptamer)로서, 서열번호 6, 7, 또는 8의 염기서열로 이루어지는 것을 특징을 하는, DNA 압타머를 제공한다.

본 발명에서, "TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa)"은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 의해 생성된 단백질로, Rv2654c라고도 한다. 상기 TB7.7은 ESAT6 및 CFP10 단백질과 함께 Mycobacterium에 대한 임파구 자극에 사용되는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "압타머"란 특정 물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA(ssDNA) 또는 RNA이다. 기존에 개발되어 있는 항체를 이용한 방법은 생체의 면역시스템을 이용하여 만들어지기 때문에 비교적 많은 시간이 들고 고비용이라는 점, 단백질이기 때문에 그 안정성이 문제가 되는 경우가 있는 반면, 압타머는 합성에 있어서, 비교적 단순한 방법으로 가능하고 세포, 단백질 그리고 작은 유기물질까지도 표적물질이 될 수 있기 때문에 이를 이용한 새로운 검출방법들의 개발이 가능하며 그 특이성 및 안정성이 이미 개발되어 있는 항체에 비해 매우 높은 점에 착안하여, TB7.7 단백질의 특이적 검출을 위하여 DNA 압타머를 사용하였다. 상기 압타머는 바람직하게는 서열번호 6 내지 8의 염기서열로 이루어질 수 있으며, 보다 바람직하게는 서열번호 6의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 상기 DNA 압타머 외에 약리학적으로나 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 비정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수있다. 상기 조성물은 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa) 특이적 DNA 압타머; 및 상기 DNA 압타머가 고정되어 있는 기판을 포함하되, 상기 DNA 압타머는 서열번호 6, 7, 또는 8의 염기서열로 이루어지는 것을 특징을 하는, 결핵 진단용 바이오센서를 제공한다.

본 발명의 상기 DNA 압타머가 고정되어 있는 기판은 금속 전극층 및 금속 나노입자층으로 이루어지며, 상기 전극층 및 나노입자의 재질은 전기장 또는 자기장에 의해 유인될 수 있고 전기장의 특성을 변화시킬 수 있는 어떤 재질도 사용할 수 있으며, 바람직하게는 금(Au)으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa) 단백질을 발현, 정제하여 특정 결합서열을 확인하였으며(실시예 1 내지 3 참조), TB7.7 단백질과의 강한 결합능을 가진 압타머를 탐색하였다(실시예 4 참조). 또한, 상기 실험 결과에 기초하여, 단백질과 압타머 간의 결합력을 형광 측정하였고(실시예 5 참조), 이를 통하여 발굴한 DNA 압타머를 가지고 TB7.7을 검출하고자 EIS 방법을 이용하여 바이오센서를 제작하였다(실시예 6 참조). 또한, 상기 바이오센서는 TB7.7 단백질에 대한 결합 특이성 역시 매우 우수한 바, 결핵 진단을 위한 정보제공 방법으로 이용될 수 있음을 확인하였다(실시예 7 참조).

이에, 본 발명은 (1) 피검체 시료를 상기 바이오센서에 처리하는 단계; 및 상기 바이오센서에 결합된 TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa)의 수준(level)을 측정하는 단계를 포함하는, 결핵 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. TB7.7 유전자 클로닝

TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa)에 대한 유전자를 증폭하기 위해 BamH1 제한효소 인식 서열을 포함한 Forward 프라이머 (5'-CCC GGA TCC ATG AGC GGC CAC GCG TTG3'(서열번호 1))와 Xho1 제한효소 인식서열을 포함하는 Reverse 프라이머 (5'CCC CCC TCG AGT CAC GGC GGA TCA CCC C3'(서열번호 2))를 사용하였다.

유전자 증폭을 위한 주형(template)으로 Mycobacterium Tuberculosis H37Rv 의 genomic DNA를 사용하였고, i-pfu 중합효소(polymerase)를 이용하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR) 과정을 통해 증폭하였다. 중합효소 연쇄 반응의 각 단계는 다음과 같다. 1) 주형의 이중 가닥 DNA을 풀어주는 단계로 98℃에서 20초 incubation, 2) 주형과 프라이머가 결합하는 단계로 55℃ 에서 20초 incubation, 3) 새로운 가닥을 합성해 나가는 단계로 72℃에서 30초 incubation하였고, 이와 같은 단계를 30번 반복하였다.

증폭된 TB7.7 유전자는 제한효소와의 반응 및 DNA ligase 통해 (His)6-tag이 포함된 pET32a 벡터(vector)에 클로닝 하였고, 상기 벡터를 이용하여 BL21(DE3) E. coli 세포에 형질전환 하였다. 그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, TB7.7 유전자가 증폭되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 2. TB7.7 단백질의 발현

TB7.7 유전자가 형질 전환된 BL21(DE3) 세포는 LB(Luria Bertani) 배지에서 배양하였으며, UV 600nm에서 OD(optical density)가 0.563에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 그 후, 단백질의 발현을 유도하기 위해 최종 농도가 20mM이 되도록 IPTG(isopropyl-thio-b-D-galactopyranoside)를 첨가한 후, 37℃에서 4시간 배양하였다. 단백질의 발현은 SDS PAGE로 확인하였고, 세포는 원심분리기를 이용하여 배지와 분리시킨 후, PBS(10mM sodium phosphate, 150mM NaCl, pH 8.0) buffer로 한번 씻어 주었다. 그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 재조합 된 TB7.7 단백질이 과발현 되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 3. TB7.7 단백질의 정제

박테리아 세포 BL21(DE3)에서 발현된 TB7.7 단백질을 고순도로 정제하기 위해 세포 용균 버퍼(lysis buffer)(20mM Tris, 500mM NaCl, 0.5mM β-mercaptoethanol, 5% glycerol, pH 8.0)에 세포를 녹인 후, 초음파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 15분 동안 초음파 분쇄(sonication)함으로써 세포를 파괴하였다. 수용액 상의 단백질과 세포를 분리하기 위해 원심분리기를 이용하여 18,000rpm 에서 40분 동안 분리하였다.

또한, 고순도의 단백질을 얻기 위해 Ni-NTA(Ni-Nitrilotriacetic acid)와 (His)6-tag 아미노산이 결합하는 특성을 이용하였다. 구체적으로, 도 1에 나타낸 바와 같이, FPLC(Fast protein liquid chromatography)에 Ni-NTA 컬럼을 연결하고, 수용액상의 TB7.7을 컬럼에 흘려줌으로서 결합시켰다. Ni-NTA 컬럼에 결합된 단백질의 (His)6-tag은 이미다졸(immidazole)의 화합물과 경쟁적으로 결합하기 때문에 표적 단백질을 컬럼에서 분리시키기 위해 elution buffer(20 mM Tris, 500 mM NaCl, 0.5 mM β-mercaptoethanol, 5% glycerol, 300 mM immidazole, pH 8.0)의 농도를 순차적으로 흘려줌으로서 TB7.7을 고순도로 분리하였다.

나아가, 상기 분리된 단백질에서 더욱 고순도의 단백질을 얻기 위해서 추가적인 정제를 실시하였는데, 단백질의 pI값에 따라 분리하는 ion exchange 컬럼인 MonoQ 컬럼을 FPLC에 연결한 후 단백질 수용액을 흘려주었다. TB7.7은 컬럼에 결합 후, elution buffer(50mM Tris-HCl, 1M NaCl, 0.5mM β-MercaptoEthanol, 5% Glycerol, pH 8.00)의 농도를 순차적으로 흘려줌으로써 한 번 더 분리하여, 순도를 높였다. 그 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 고순도의 재조합 TB7.7 단백질을 관찰할 수 있었다.

실시예 4. SELEX을 이용한 TB7.7 단백질에 대한 압타머 탐색

4-1. ssDNA(single strand DNA)라이브러리의 제조

양 말단에 PCR 증폭 및 클로닝을 위한 프라이머의 결합서열을 갖고, 가운데 40개의 무작위 DNA염기서열을 포함하는 90개의 서열을 가지는 합성된 라이브러리(5'-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA-N40-CTGGCTCGAACAAGCTTGC-3'(서열번호 3))를 설계하였다. 또한, PCR 증폭 및 ssDNA 생성을 위하여 Forward프라이머 (5'-CAC CTA ATA CGA CTC ACT ATA GCG GA-3'(서열번호 4))와 Reverse 프라이머(5'-GCA AGC TTG TTC GAG CCA G-3'(서열번호 5)) 및 바이오틴이 결합된 Reverse 프라이머(5'-Biotin - GCA AGC TTG TTC GAG CCA G-3')을 사용하였다. 여기서 사용된 모든 올리고 뉴클레어티드는 바이오닉스 사(한국)에서 합성 및 PAGE 정제하였다.

4-2. TB7.7의 Ni-NTA 자성 비드에 고정화

정제된 TB7.7은 표면에 코발트로 코팅되어 있어 단백질의 His-tag과 결합하는 자성 비드(magnetic bead)인 Dynalbead (invitrogen, 노르웨이)를 이용하여 bead에 고정하였다.

구체적으로 단백질 결합 버퍼 (20mM Tris, 50mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl₂, 0.01% tween 20, pH 8.0) 100uL에 녹아 있는 단백질 1500pmole과 20ul의 bead를 외부 자석을 이용하여 결합버퍼로 세척 후, 한 시간 동안 실온에서 반응하여 bead에 고정화 하였다.

4-3. TB7.7에 특이적인 압타머 선별

TB7.7에 특이적인 압타머를 선별하기 위해 자성을 이용한 특이적 분리 방법을 수행하였다.

구체적으로, 먼저 ssDNA의 가장 안정한 구조형성을 위해, 100uL의 결합 버퍼에 녹아 있는 ssDNA 라이브러리(100pmole)를 90℃에서 3분 동안 배양 후, 4℃에서 30분 전 배양하였다. 그 후, 앞서 magnetic bead에 고정화된 TB7.7 단백질과 함께 약하게 흔들어주면서 1시간 동안 반응하였다. 그 다음, bead에 결합된 TB7.7 단백질과 결합하지 않는 ssDNA를 제거하기 위해 결합 버퍼로 bead를 두 번 세척하였다.

그 후, Magnetic bead에서 단백질과 결합한 ssDNA를 분리하기 위해 용출 버퍼(20 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 0.01% tween 20, 300 mM immidazole, pH 8.0)를 이용해 단백질 및 결합 ssDNA를 용출하였다. 용출된 ssDNA는 에탄올을 이용해 침전시킨 후, 60 uL의 증류수에 용해한 다음 Forward 프라이머 및 바이오틴이 결합된 Reverse 프라이머를 이용하여 i-pfu polymerase(인트론 바이오테크놀로지, 한국)를 이용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 다음 선별 과정을 위한 ssDNA를 생성하기 위해, 바이오틴이 결합된 PCR 산물을 바이오틴과 결합하는 스트렙타아비딘(streptavidin)이 코팅된 자성 비드와 함께 커플링 버퍼(5mM Tris-HCl, 0.5mM EDTA, 1M NaCl, 0.0025% tween 20, pH 7.5)조건에서 1시간 배양하였다. 배양 후 ssDNA만을 분리하기 위해 100ul의 200mM NaOH와 5분 동안 배양하였고, 외부 자석을 이용해 선별된 ssDNA만을 얻을 수 있었다. 또한, 첫 번째 선별된 ssDNA를 다음 선별에 사용하여 선별을 반복하였다. 이때 ssDNA의 양 및 TB7.7의 농도는 엄격한 선별을 위해 보다 감소시키면서 진행하였으며, 반복되는 선별에서 용출된 ssDNA를 UV 분광광도계(UV spectrometer, Biochrom Libra S22 spectromether)로 농도를 측정하여 남아 있는 ssDNA의 TB7.7과의 결합 정도를 확인하며 선별 과정을 진행하였다. 상기 결합 정도(%)는 도 2에 나타낸 바와 같다.

4-4. 압타머 서열분석

13번째의 반복 선별된 ssDNA는 변형되지 않은 Forward 프라이머와 Reverse 프라이머를 이용하여 PCR 과정을 통해 증폭하였고, pENTR/TOPO 벡터(TOPO TA Cloning kit, Invitrogen, 미국)에 클로닝한 후, E. coli TOP10 세포(Invitrogen, 미국)에 형질전환 하였다. ssDNA가 삽입된 클론을 miniprep 키트(MACHEREY-NAGEL, 독일)를 이용하여 정제한 후, 염기서열을 분석(COSMO Genetech, 한국)하였다. 그 결과, 하기 표 1과 같은 TG4 Aptamer 서열(서열번호 6), TG5 Aptamer 서열(서열번호 7), 및 TG6 Aptamer 서열(서열번호 8)을 분석할 수 있었다.

Aptamer	Sequences (5' to 3')	Length (bases)
TG4	5’-CAC CTA ATA CGA CTC ACT ATA GCG GAT CCG AAA GTT GTT AGT AGA CTT AGG GGA GGG TTA AAG TGG GGT GGC TGG CTC GAA CAA GCT TGC3’	90
TG5	5’-CAC CTA ATA CGA CTC ACT ATA GCG GAT CAG AAT TTC TGT AAT TAA GCG ATA AAT TGC TTA ATA GGC ACT CTC TGG CTC GAA CAA GCT TGC3’	90
TG6	5’-CAC CTA ATA CGA CTC ACT ATA GCG GAT CCG ACA CGA AGG ATA CTC AGT AGT ACC CAG GTT GGT AGG GTA GCC TGG CTC GAA CAA GCT TGC3’	90

실시예 5. 형광 측정을 이용한 단백질과 압타머 간의 결합력 측정

16ug 의 TB7.7을 10uL 자성 비드(megnetic bead)와 혼합한 후, 100uL의 결합 버퍼(20mM Tris, 50mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl₂, pH 8.0)에서 1시간 동안 배양하였다. 결합하지 않은 TB7.7을 분리하기 위해 결합 버퍼로 2번 세척하였다. 그 후 다양한 농도의 Cy3으로 표지된 압타머와 1시간 동안 배양하고, 결합하지 않은 압타머는 세척을 통해 제거하였다. TB7.7이 고정된 자성 비드에 결합된 Cy3이 표지된 ssDNA 앱타머의 양은 자석을 이용하여 TB7.7에 결합된 Cy3가 표지된 ssDNA만을 분리하여 형광측정(1420 Victor multilabel counter, PerkinElmer, USA)을 통해 측정하였다. 그 결과, 도 3a 내지 도 3c 및 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, TG4, TG5, 및 TG6의 염기서열이 갖는 DNA 압타머의 kd값을 측정 할 수 있었다. 이를 통하여 TG4가 가장 안정적이고 낮은 Kd 값을 나타내는 것을 확인하여, 향후 진행한 실험에 TG4를 적용하였다.

압타머	Kd (nM)
TG4	37.5 ± 2.5
TG5	106.3 ± 68.6
TG6	34.3 ± 7.7

실시예 6. 검출 조건 최적화 및 바이오센서 제작

상기 실시예 4에서 발굴한 DNA 압타머를 가지고 TB7.7을 검출하기 위하여, EIS(Electrochemical Impedance Spectroscopy) 기술을 이용하여 검출 감도가 뛰어난 바이오센서를 설계하였다. 도 4는 본 발명의 DNA 압타머를 이용한 TB7.7 단백질 검출용 바이오센서에 대한 개략적인 모식도이다.

먼저, 금 전극에 금 나노입자를 흡착시킨 후 DNA 압타머를 전극에 결합시킴으로서, TB7.7 검출용 바이오센서를 제조였는데, 이처럼 금 전극에 금 나노입자를 도포하게 되면 표면적이 넓어져 DNA 압타머를 더 많이 전극에 결합시킬 수 있었다. 이후 TB7.7이 포함된 시료를 넣고 압타머와 TB7.7이 결합하게 되면, TB7.7 단백질이 전자의 흐름을 막게 되어 임피던스가 증가하는 현상을 관찰할 수 있었으며, 이 때 임피던스가 증가한 값과 결합한 TB7.7 단백질 양과의 상관관계로 인해 정량분석이 가능하였다.

그 다음, DNA 압타머를 가지고 바이오센서를 제작하기에 앞서 선택성과 검출 감도를 높이기 위하여 몇 가지 조건을 최적화시키는 과정을 거쳤다. 바이오센서에 다양한 농도의 압타머를 고정시키고 동일한 양의 단백질을 부착시켰다. 그리고 동일한 농도의 압타머에 Spacer의 농도를 변화시키면서 임피던스 값을 측정하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 압타머는 0.5uM일 때, Spacer는 사용하지 않았을 때 최적의 임피던스 값을 나타내었다.

상기로부터, 최적화된 조건을 기반으로 선택된 TG4 압타머를 이용하여 재조합된 TB7.7의 검출하였다. 그 결과, 도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, Nyquist 도식을 보면, TB7.7의 농도가 높아질수록 (10fM~10nM) 임피던스 값이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 6a 참조). 상기 Nyquist 도식에서 구한 임피던스 값을 y축으로 TB7.7 농도의 Log 값을 x축으로 하여 그래프를 얻을 수 있었는데, 이에 상기 제작된 바이오센서를 통하여 TB7.7의 검출이 정량적으로 이루어지며, 검출한계는 0.64fM임을 확인하였다(도 6b 참조).

실시예 7. TB7.7 검출 압타머의 결합특이성 확인

DNA 압타머가 바이오센서로 사용되기 위해서는, 표적 TB7.7 외에 혈액 안의 다른 여러 단백질과 반응을 하지 않는 결합특이성이 중요한바, DNA 압타머가 선택적으로 결합하는지 여부를 확인하기 위하여, 여러 단백질 시료에 대하여 결합특이성을 확인하였다. 이 때 PBS에 각 단백질의 농도가 10pM이 되도록 혼합하여 검출하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, TB7.7 단백질에 대해 특이성이 뛰어난 것을 확인하였다. 특히 ESAT6 및 CFP10은 결핵균이 숙주 내에서 과발현하는 것으로 알려진 결핵균 특이 단백질임에도 불구하고, 본 발명에서 개발된 DNA 압타머와 결합하지 않는 것으로 확인되었다. 이는 본 발명의 DNA 압타머가 높은 결합특이성을 가지고 TB7.7과 반응한다는 것을 의미한다.

나아가, 임상적 시료에서도 이를 적용가능한지 여부를 확인하기 위하여, 정상인과 결핵 환자의 혈청을 TG4 압타머가 고정된 전극 위에 각각 10ng/ml로 처리한 결과, 도 8에 나타낸바와 같이, 정상인에 비해 결핵환자의 경우 더 높은 임피던스 값을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

상기로부터, 본 발명에서 개발된 DNA 압타머가 TB7.7에 매우 높은 결합특이성을 가지고 있을 뿐 아니라, 복잡한 생물학적 시료에서도 바이오센서로 사용될 수 있음을 의미한다.

참고로, 본 발명의 서열목록 리스트는 하기 표3과 같다.

서열목록	명칭	서열
서열번호 1	TB7.7 Forward primer	cccggatcca tgagcggcca cgcgttg
서열번호 2	TB7.7 Reverse primer	cccccctcga gtcacggcgg atcacccc
서열번호 3	ssDNA library	cacctaatac gactcactat agcggatccg anctggctcg aacaagcttg c
서열번호 4	Forward primer	cacctaatac gactcactat agcgga
서열번호 5	Reverse primer	gcaagcttgt tcgagccag
서열번호 6	TG4 Aptamer	cacctaatac gactcactat agcggatccg aaagttgtta gtagacttag gggagggtta aagtggggtg gctggctcga acaagcttgc
서열번호 7	TG5 Aptamer	cacctaatac gactcactat agcggatcag aatttctgta attaagcgat aaattgctta ataggcactc tctggctcga acaagcttgc
서열번호 8	TG6 Aptamer	cacctaatac gactcactat agcggatccg acacgaagga tactcagtag tacccaggtt ggtagggtag cctggctcga acaagcttgc

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> MD Healthcare Inc. POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> DNA aptamer specifically binding to TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa) and use thereof <130> MP17-193 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB7.7 Forward primer <400> 1 cccggatcca tgagcggcca cgcgttg 27 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB7.7 Reverse primer <400> 2 cccccctcga gtcacggcgg atcacccc 28 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA library <400> 3 cacctaatac gactcactat agcggatccg anctggctcg aacaagcttg c 51 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 4 cacctaatac gactcactat agcgga 26 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 5 gcaagcttgt tcgagccag 19 <210> 6 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TG4 Aptamer <400> 6 cacctaatac gactcactat agcggatccg aaagttgtta gtagacttag gggagggtta 60 aagtggggtg gctggctcga acaagcttgc 90 <210> 7 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TG5 Aptamer <400> 7 cacctaatac gactcactat agcggatcag aatttctgta attaagcgat aaattgctta 60 ataggcactc tctggctcga acaagcttgc 90 <210> 8 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TG6 Aptamer <400> 8 cacctaatac gactcactat agcggatccg acacgaagga tactcagtag tacccaggtt 60 ggtagggtag cctggctcga acaagcttgc 90

Claims

TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 (DNA Aptamer)로서, 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, DNA 압타머.
제1항에 있어서,
상기 TB7.7는 결핵균 H37Rv에서 발현하는 것을 특징으로 하는, DNA 압타머.
제1항의 DNA 압타머를 포함하는, 결핵 진단용 조성물.
TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa) 특이적 DNA 압타머; 및 상기 DNA 압타머가 고정되어 있는 기판을 포함하되, 상기 DNA 압타머는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 결핵 진단용 바이오센서로서,
상기 기판은 금속 전극층 및 금속 나노입자층으로 이루어지고, 상기 DNA 압타머는 상기 금속 나노입자층에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는, 결핵 진단용 바이오센서.
삭제
제4항에 있어서,
상기 금속은 금(Au)인 것을 특징으로 하는, 결핵 진단용 바이오센서.
(1) 피검체 시료를 제4항의 바이오센서에 처리하는 단계; 및
(2) 상기 바이오센서에 결합된 TB7.7(Tuberculosis specific antigen 7.7 kDa)의 수준(level)을 측정하는 단계를 포함하는, 결핵 진단을 위한 정보제공 방법.