CN105944094B - 一种基于菊粉-壳聚糖修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明将菊粉和壳聚糖以共价键的方式进行偶联，制备了菊粉‑壳聚糖偶联物。将结核分枝杆菌的两种免疫原蛋白CFP10与TB10.4进行融合表达。用菊粉‑壳聚糖偶联物修饰CFP10‑TB10.4融合蛋白，作为一种新型的结核分枝杆菌亚单位疫苗。该疫苗能诱导产生高水平的体液免疫应答和细胞免疫应答。

Description

一种基于菊粉-壳聚糖修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗及其 制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种基于菊粉-壳聚糖修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗。

背景技术

菊粉(inulin)是一种天然的果糖聚合物，由D-果糖经β-1,2糖苷键连接而成，多来源于菊苣、菊芋或大丽花等菊科植物，具有生物相容性好、无毒性等特点。菊粉作为一种天然可溶性膳食纤维，具有控制血脂、降低血糖和促进矿物质吸收等生物保健功能。更为重要的是，研究表明菊粉具有免疫佐剂的功能，能够激活补体旁路途径，进而刺激机体的天然免疫系统，同时能够增强机体的体液免疫和细胞免疫应答。例如，菊粉能够显著促进乙肝疫苗的体液免疫应答和IFN-γ、IL-10、IL-6等细胞因子的产生。菊粉来源广泛，简单易得，成本低廉，具有良好的生物安全性和耐受性，作为免疫佐剂有着巨大的潜力。

壳聚糖(chitosan)是几丁质的脱乙酰化产物，其化学名称为β-(1→4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，广泛存在于自然界中，具有无毒、无刺激性、无免疫原性、生物相容性好、在体内可以降解吸收等生物学特性。壳聚糖分子上带有大量的游离氨基，在溶液中会带正电荷，而表面带正电荷的分子会延长疫苗在注射部位的停留时间。研究表明壳聚糖可以促进巨噬细胞的活化，促进肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)、白介素(IL-12)等细胞因子的分泌，增强抗原呈递作用，增加抗原特异性抗体的产生等。壳聚糖与抗原共同皮下注射后，可诱导机体产生更强的体液免疫应答和细胞免疫应答。

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种古老的传染性疾病，全球每年新增900万患者，近1/3的世界人口已经感染结核分枝杆菌。到目前为止，接种卡介苗被认为是预防结核病发生和传播的最佳途径。但是，卡介苗已经使用了90多年，逐渐暴露出诸如有效性降低、副作用突出等问题，保护能力呈现明显的区域性差异。因此，目前亟待需要一种新型、高效的结核分枝杆菌疫苗。作为结核病的一种候选疫苗，基于结核分枝杆菌免疫原蛋白的亚单位疫苗以其成分明确、安全性高、简单易得而越来越受到人们的关注。其中，CFP10和TB10.4是由结核分枝杆菌分泌至胞外的两种免疫原蛋白。将CFP10和TB10.4融合表达后所制备成亚单位疫苗具有较强的免疫保护潜力。该融合蛋白的一个显著缺点是所引起的免疫保护作用较弱，需要使用适当的免疫佐剂来弥补这一缺陷。

将免疫佐剂与免疫原蛋白进行物理混合，或将佐剂以微球或纳米微粒的形式负载免疫原蛋白是提高疫苗效价比较常见的方法。然而，物理混合所制备的疫苗在免疫保护效果方面欠佳，特别是几乎不能被诱导产生Th1型免疫应答。微球或纳米微粒形式的佐剂能够有效地延长免疫原蛋白在体内的存留时间，提高DC细胞的递呈能力，从而增强疫苗的免疫保护效果。但是，这种佐剂能够引起注射部位发生炎症反应，并伴随着不同程度的毒副作用。

与前两种方法相比，采用化学偶联的方法将免疫原蛋白与佐剂共价结合，能表现出更强的免疫保护作用。化学偶联法制备的疫苗可以提高免疫原蛋白的水化半径、减缓肾小球的清除速率，从而延长疫苗与免疫系统的作用时间，刺激免疫系统产生持续长效的免疫应答。此外，将免疫佐剂与免疫原蛋白共价键结合后可以确保它们同时到达抗原递呈细胞，进而显著提高免疫原蛋白的免疫原性。

发明内容

1.本发明通过基因工程的方法，将结核分枝杆菌的两种免疫原蛋白CFP10和TB10.4的基于融合表达，获得了CFP10-TB10.4融合蛋白(CT)。其制备方法包括以下步骤：

(1)构建CFP10-TB10.4重组质粒：根据GenBank中结核分枝杆菌标准毒株H37Rv的CFP10和TB10.4的基因序列，进行全基因合成；设计引物进行PCR扩增全基因序列，将目的基因与载体质粒pET28a(+)用T4连接酶进行连接；将连接产物转化到E.Coli BL21(DE3)，用菌落PCR筛选阳性克隆，从而构建重组质粒CFP10-TB10.4-pET28a(+)。

(2)诱导表达CT：将重组质粒转化到E.Coli BL21(DE3)中，按1％的比例接种到LB培养基，振荡培养至OD₆₀₀等于0.6～0.8，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于37℃诱导3～4小时；离心收集菌体，重悬后于冰浴下进行超声破碎1小时，然后离心收集上清和沉淀。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，IPTG能诱导产生一条分子量在25kDa左右的蛋白带，以包涵体表达的形式为主。

(3)包涵体复性与CT的纯化：离心收集沉淀，用含1M NaCl和2M尿素的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)将包涵体洗涤三次；然后用含1mM EDTA，15mM DTT，8M尿素的50mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)溶解包涵体；逐滴加入包涵体复性液，于4℃复性过夜。用QSepharose HP阴离子交换介质进行纯化，收集含有CT的洗脱峰。

2.本发明通过化学修饰的方法将菊粉-壳聚糖佐剂与CT偶联起来，制备出了一种结核分枝杆菌亚单位疫苗，能够诱导机体产生的细胞免疫应答和体液免疫应答。

3.本发明涉及菊粉-壳聚糖免疫佐剂的制备工艺，包括以下步骤：

(1)菊粉的活化：将菊粉溶于20mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.8)，然后加入高碘酸钠，于室温下避光反应，透析除去未反应的高碘酸钠和其它副产物。

(2)菊粉与壳聚糖的偶联：将壳聚糖溶于20mM柠檬酸缓冲液(pH 3.0)中，浓度为2.5mg/ml，然后与活化的菊粉混合，同时加氰基硼氢化钠，于室温下反应12小时。

4.本发明涉及一种结核分枝杆菌亚单位疫苗的制备工艺，包括以下步骤：

(1)菊粉-壳聚糖佐剂溶于20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中，然后加入2-亚氨基硫烷，于室温下进行活化1-6小时。2-亚氨基硫烷将壳聚糖上剩余的氨基部分转化成巯基。活化结束后，用透析袋透析除去未反应的2-亚氨基硫烷。

(2)将CT溶于20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中，然后加入3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS)，于4℃下反应1-6小时。MBS将抗原蛋白上暴露在外面的氨基转化成马来酰亚胺基团。反应结束后，用透析袋透析除去未反应的MBS。

(3)将第1步得到的活化菊粉-壳聚糖佐剂与第2步得到的活化免疫原蛋白混合，于4℃下反应14小时。

(4)疫苗的纯化方法选用强阴离子交换层析，优选Q Sepharose HP层析介质(1.6cm×2.5cm)。用于平衡柱子的缓冲液A为20mM磷酸缓冲液(pH 7.2)，用来洗脱柱子的缓冲液B为20mM磷酸缓冲液(含1.0M NaCl，pH 7.2)。收集疫苗对应的洗脱峰。

本发明公开了一种基于菊粉-壳聚糖修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗及其制备方法，其技术优势体现在以下几方面：

(1)本发明将具有佐剂功能的菊粉与壳聚糖相偶联，能够使菊粉和壳聚糖协同地发挥佐剂效应。这使得菊粉-壳聚糖修饰的免疫原蛋白所诱导的免疫应答要显著高于单独修饰菊粉或壳聚糖的免疫原蛋白。

(2)本发明所涉及的菊粉-壳聚糖修饰的免疫原蛋白，其所诱导的免疫应答要显著高于铝佐剂与免疫原蛋白混合所产生的免疫应答。

(3)本发明的结核分枝杆菌亚单位疫苗，其中多糖和免疫原蛋白的结构特征未发生显著改变。

附图说明

图1SDS-PAGE凝胶电泳分析大肠杆菌破碎液。第1泳道为标准蛋白；第2泳道为全菌的破碎液；第3泳道为包涵体；第4泳道为上清。

图2菊粉-壳聚糖佐剂和结核分枝杆菌亚单位疫苗的制备反应示意图。

图3凝胶过滤分析结核分枝杆菌亚单位疫苗。用分析型凝胶过滤柱Superdex 200(1cm×30cm)检测结核分枝杆菌亚单位疫苗。分析条件：流动相为20mM磷酸缓冲液(pH7.4)，流速0.5毫升/分钟，检测波长为280纳米。

图4 ¹H NMR分析菊粉-壳聚糖佐剂。¹H NMR分析由Bruker 600MHz核磁共振仪完成。

图5结核分枝杆菌亚单位疫苗产生的免疫原蛋白特异性抗体。

图6结核分枝杆菌亚单位疫苗产生的IFN-γ、IL-2和TNF-α等细胞因子。

具体实施方式：

实施例1：CT融合蛋白的制备

(1)构建cfp10-tb10.4重组质粒

首先根据Gene Bank中结核分枝杆菌标准毒株H37Rv的CFP10和TB10.4的基因序列，设计出中间加入3个甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸(Gly-Gly-Gly-Ser)重复单元的全基因序列，并进行全基因合成；然后设计引物，进行PCR扩增全基因序列，用胶回收试剂盒回收目的基因，并用HindⅢ和BamHⅠ对全基因序列进行双酶切。同时对载体质粒pET28a(+)进行双酶切，分别回收目的基因片段后，用T4连接酶进行连接；最后将连接产物转化到E.Coli BL21(DE3)，用菌落PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定，从而构建出重组质粒pET28a(+)-CFP10-TB10.4。

(2)诱导表达CFP10-TB10.4融合蛋白(CT)

a)从pET28a(+)-CFP10-TB10.4(TOP10)中提取重组质粒，并转化到E.Coli BL21(DE3)中。菌落PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定，即为保存菌种pET28a(+)-CFP10-TB10.4(BL21)；

b)活化表达CT融合蛋白的E.Coli BL21菌体，按1％的比例接种到200ml LB培养基，振荡培养至OD₆₀₀等于0.6～0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，于37℃下诱导3～4小时；

c)于4℃和10000rpm离心10分钟，收集菌体，重悬于50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)。于冰浴下进行超声破碎1小时(240W，超声2秒，停5秒)。然后于4℃和10000rpm离心30分钟，分别收集上清和沉淀。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果表明(图1)，与未经IPTG诱导的菌相比，细胞破碎液有一条明显的特异性蛋白带，其分子量在25kDa左右，以包涵体表达形式为主。

(3)包涵体复性与融合蛋白的纯化

a)配制以下溶液：包涵体洗涤液，即50mM Tris-HCl(含1M NaCl和2M尿素，pH8.0)；包涵体溶解液，即50mM Tris-HCl(含1mM EDTA、15mM DTT和8M尿素，pH 8.0)；包涵体复性液，即100mM Tris-HCl(含0.18mM EDTA,4mM L-精氨酸,0.9mM还原型谷光甘肽,0.18mM氧化型谷光甘肽和2M尿素，pH 8.0)。

b)离心收集含有融合蛋白的菌体。冰浴下超声破碎后，于4℃和10000rpm条件下离心收集包涵体，用包涵体洗涤液洗涤3次，然后用包涵体溶解液于37℃水浴中溶解2小时。将蛋白浓度调整为1.0mg/ml，最后在4℃条件下逐滴加入到包涵体复性液中，蛋白终浓度为0.1mg/ml，于4℃下复性过夜。

c)由Q Sepharose HP强阴离子交换层析柱对复性的融合蛋白进行分离纯化。阴离子交换柱A液，即20mM Tris-HCl(pH 8.0)；阴离子交换柱B液，即20mM Tris-HCl(含0.5MNaCl，pH 8.0)；所有溶液均过0.22μm滤膜。由A液对层析柱进行平衡和洗脱，随后由A液和B液对层析柱进行梯度洗脱。收集目的蛋白(CT)所对应的洗脱峰，将目的蛋白置换到20mM磷酸缓冲液(pH 7.2)。

实施例2：菊粉-壳聚糖佐剂的制备

将菊粉溶于20mM醋酸钠缓冲液(pH 5.8)溶解，配制成2.5mg/ml的溶液，加入终浓度为20mM高碘酸钠，于室温下避光反应20分钟(图2)。随后，按体积的10％加入乙二醇，消耗过量的高碘酸钠。反应结束后，用截留分子量为2kDa的透析袋透析3次(每2小时换液1次)，除去反应副产物，获得带有醛基的菊粉。透析液为20mM柠檬酸缓冲液(pH 3.0)。

将壳聚糖溶于20mM柠檬酸缓冲液(pH 3.0)，配制成2.5mg/ml的溶液；按菊粉：壳聚糖：氰基硼氢化钠的质量比为3:1:1的比例进行反应，于室温下反应12小时(图2)。用截留分子量为10kDa的透析袋透析3次(每2小时换液1次)，除去未反应的菊粉和其它小分子。透析液为20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)。

实施例3：疫苗的制备

制备了菊粉-壳聚糖修饰的CFP10-TB10.4融合蛋白(Inulin-Cs-CT)。作为对照，还分别制备了菊粉单独修饰的CT(Inulin-CT)和壳聚糖单独修饰的CT(Cs-CT)。它们的制备反应式如图2所示。

(1)Inulin-CT的制备

菊粉(inulin)的氧化方法同实施例1，将其置换到20mM磷酸缓冲液(pH为7.2)中。然后按CT:菊粉:还原剂(氰基硼氢化钠)为1:9:3的质量比，于室温下反应12小时。

(2)Cs-CT的制备

壳聚糖在偏酸性条件下溶于水，但在中性条件下难溶于水。因此，由分子量为5kDa的PEG醛在偏酸性条件下修饰壳聚糖，使之在中性条件下溶于水，实现与融合蛋白的修饰反应。

将壳聚糖用20mM柠檬酸缓冲液(pH 3.0)在水浴加热中溶解，配制成2.5mg/ml的溶液；将PEG醛:壳聚糖:氰基硼氢化钠以质量比为1:2:1的比例进行反应，于室温下反应12小时。用截留分子量为10kDa的透析袋透析，将其缓冲液置换到20mM的磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中。壳聚糖与2-亚氨基硫烷(IT)以质量比为3:1的比例混合，于室温下反应3小时。2-亚氨基硫烷可将壳聚糖上剩余的氨基部分转化成巯基。反应结束后，用截留分子量为10kDa的透析袋透析3次(每2小时换液1次)充分除去未反应的2-亚氨基硫烷。

将融合蛋白CT与3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS)以摩尔比1:50混合，反应pH值为pH 7.2，于4℃下反应3小时，3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯会将CT的氨基转化成马来酰胺基。反应结束后，用截留分子量为6kDa的滤膜于6000g离心5次，除去未反应的MBS。马来酰亚胺化的融合蛋白CT与巯基化的PEG-壳聚糖佐剂以质量比为1:4的比例混合，反应pH值为7.2，于4℃下反应14小时。

(3)结核分枝杆菌亚单位疫苗CT-inulin-Cs的制备

菊粉-壳聚糖佐剂与2-亚氨基硫烷(IT)以质量比为3:1的比例混合，于室温下反应3小时，2-亚氨基硫烷会将壳聚糖上剩余的部分氨基转化成巯基。反应结束后，用截留分子量为10kDa的透析袋透析3次(每2小时换液1次)，除去未反应的2-亚氨基硫烷。马来酰亚胺化的融合蛋白与巯基化的菊粉-壳聚糖佐剂以质量比为1:4的比例混合，反应pH值为7.2，于4℃下反应14小时。

(4)疫苗的分离纯化

由Q Sepharose HP强阴离子交换层析柱对上述三种修饰的蛋白分别进行纯化。先用A液(20mM磷酸盐缓冲液，pH 7.2)平衡层析柱，上样后继续用A液进行充分洗脱，流速为1.0毫升/分钟；随后用A液和B液(含有1.0M氯化钠的20mM磷酸盐缓冲液，pH 7.2)对层析柱进行梯度洗脱，流速为1.0毫升/分钟。分别收集对应于3种疫苗的洗脱峰，将3种疫苗分别置换到20mM磷酸缓冲液(pH 7.2)。

实施例4：疫苗的结构表征

将3种疫苗用分析型Superdex 200凝胶过滤柱(1.0×30cm)进行鉴定，洗脱液为含有0.15M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH 7.2)，流速为0.5毫升/分钟。如图3所示，与融合蛋白CT相比，三种疫苗的出峰时间均明显提前，表明它们的分子量显著增加。

用¹H NMR分析菊粉-壳聚糖佐剂。如图4所示，与壳聚糖相比，PEG-壳聚糖在3.3ppm和3.5-3.7ppm出现特征峰，分别对应于PEG的甲氧基和乙氧基，而菊粉-壳聚糖在2.6-2.7ppm处也出现特征峰，对应于连接菊粉与壳聚糖的酰胺键中的-NH-。这些表明PEG与菊粉均成功地偶联了壳聚糖。

实施例5：测定疫苗诱导的抗体水平

选取30只6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠，随机分为5组，即CT组、CT+铝佐剂组、inulin-CT组、inulin-Cs-CT组和Cs-CT组，每组6只小鼠。以皮下注射的方式，注射剂量每只小鼠每次含有20微克蛋白，分别于第0、第14和28天注射，共注射三次。第二、三次注射前(即第14和28天)和第三次注射后隔三周(即第49天)分别从眼眶取血。离心收集血清，-80℃保存备用。用ELISA法检测小鼠血浆中抗CT的IgG、IgG1、IgG2b和IgG2c。

如图5a所示，在第14天(即第二次免疫前)，免疫原蛋白CT组产生抗CT的IgG滴度较低，而在第28天和第49天，该组产生抗CT的IgG滴度分别是第14天的3.0倍和5.5倍，表明免疫原蛋白能够产生微弱的免疫记忆作用。CT+铝佐剂组产生的IgG滴度除了在第49天是CT组的2倍外，其它时期的IgG滴度与CT组的IgG滴度相当，表明铝佐剂在刺激CT产生IgG抗体滴度方面的作用不强。在第14天，inulin-CT组、Cs-CT组和inulin-Cs-CT组产生抗CT的IgG滴度也较低，在第28天有一定程度的增加(4倍之多)，但在第49天，它们的IgG滴度均有大幅度的提高(20多倍)，表明与inulin或Cs与CT共价偶联后可以引起强烈的免疫记忆并能增强CT特异性的免疫应答。在第49天，与CT组相比，inulin-CT、Cs-CT和inulin-Cs-CT组产生抗CT的IgG滴度分别是CT组的14.2倍、8.9倍和51.4倍。这表明inulin-Cs结合物中的菊粉和壳聚糖以协同作用的方式刺激CT产生体液免疫应答。

如图5b所示，在这五组中，inulin-Cs-CT组产生的IgG1、IgG2b和IgG2c滴度均是最高的，且其IgG2b/IgG1值也是最大的。表明inulin-Cs佐剂能够促使CT诱导产生趋向于Th1的免疫应答。

实施例6：测定疫苗诱导的细胞免疫水平

第49天取小鼠的新鲜脾脏，研磨分离出脾脏细胞进行细胞培养。在细胞数目达到2×10⁶后，用10μg/ml的免疫原蛋白CT刺激60个小时，离心收集上清。用TNF-α、IFN-γ和IL-2细胞因子ELISA检测试剂盒，测定细胞培养上清中的TNF-α、IFN-γ和IL-2水平。如图6所示，inulin-Cs-CT组产生的TNF-α、IFN-γ和IL-2水平均高于其它组，分别是CT组的7.5倍、6.9倍和4.2倍。这表明inulin-Cs佐剂能够促进CT诱导机体产生强烈的细胞免疫应答。

脾脏细胞中CD4⁺和CD8⁺T细胞的相对数量由流式细胞分析仪进行检测。结果如图6d所示，CT组、CT+铝佐剂组、inulin-CT组、Cs-CT组和inulin-Cs-CT组的CD4⁺和CD8⁺T细胞数量均表现出逐渐增多的趋势，其中CD4⁺T细胞多于CD8⁺T细胞，表明inulin-Cs佐剂能够促进CT诱导机体的T细胞增殖。

Claims (6)

1.一种基于菊粉-壳聚糖修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗，其特征在于结核分枝杆菌亚单位疫苗的制备过程包括：(1)构建CFP10-TB10.4重组质粒，诱导表达结核分枝杆菌CFP10-TB10.4融合蛋白，并对CFP10-TB10.4融合蛋白进行分离纯化；(2)制备菊粉-壳聚糖结合物；(3)菊粉-壳聚糖结合物共价修饰结核分枝杆菌CFP10-TB10.4融合蛋白，得到基于菊粉-壳聚糖修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗。

2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌亚单位疫苗，其特征在于CFP10-TB10.4重组质粒的构建方法包括以下步骤：(1)合成3个甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸重复单元的基因序列，将该基因序列插入到结核分支杆菌标准毒株H37Rv的CFP10基因序列和TB10.4基因序列之间，并对新的基因序列进行全基因合成；(2)设计引物，对全基因序列进行PCR扩增，PCR扩增产物由胶回收试剂盒进行纯化；(3)用Hind III和BamH I双酶切CFP10-TB10.4基因和表达载体pET28a(+)，经纯化后，在T4连接酶的作用下进行连接反应，然后转化至大肠杆菌感受态细胞中，构建CFP10-TB10.4重组质粒。

3.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌亚单位疫苗，其特征在于CFP10-TB10.4融合蛋白的诱导表达过程包括以下步骤：(1)将CFP10-TB10.4重组质粒转化到大肠杆菌中，筛选阳性克隆并进行测序鉴定；(2)用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导菌体，振荡培养后离心收集菌体。

4.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌亚单位疫苗，其特征在于CFP10-TB10.4融合蛋白进行分离纯化包括以下步骤：(1)将大肠杆菌菌体于冰浴下超声破碎，离心收集包涵体，用包涵体洗涤液洗涤三次；(2)用包涵体溶解液于37℃水浴中溶解包涵体，然后于4℃进行稀释复性；(3)蛋白复性液由Q Sepharose HP阴离子交换柱进行分离纯化，收集目标蛋白对应的洗脱峰。

5.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌亚单位疫苗，其特征在于菊粉-壳聚糖结合物的制备步骤包括：(1)高碘酸钠氧化菊粉，将菊粉的邻位羟基氧化为醛基；(2)菊粉的醛基与壳聚糖的氨基在氰基硼氢化钠的还原作用下进行结合反应，得到菊粉-壳聚糖结合物；其中，高碘酸钠的浓度为1-50mM；菊粉的浓度为2.5mg/ml；氧化的pH值为5.8；在避光条件下氧化菊粉5-120分钟；菊粉与壳聚糖的质量比为(1-10):1；结合反应的缓冲体系为20mM柠檬酸缓冲液，pH值为2.0-6.0，反应时间为5-24小时。

6.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌亚单位疫苗，其特征在于菊粉-壳聚糖结合物共价修饰结核分枝杆菌CFP10-TB10.4融合蛋白的过程包括：(1)2-亚氨基硫烷与菊粉-壳聚糖结合物反应，将壳聚糖的氨基转化为巯基；(2)3-马来酰亚胺基-苯甲酸琥珀酰亚胺酯与CFP10-TB10.4融合蛋白反应，将CFP10-TB10.4融合蛋白的氨基转化为马来酰亚胺；(3)巯基化的菊粉-壳聚糖结合物与马来酰亚胺化的融合蛋白共价结合；其中，壳聚糖与2-亚氨基硫烷的质量比为(1-10):1，在室温下反应1-12小时；CFP10-TB10.4融合蛋白与3-马来酰亚胺基-苯甲酸琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:(10-100)，在4℃下反应1-6小时；壳聚糖和CFP10-TB10.4融合蛋白的质量比为(1-10):1，在4℃下反应8-24小时。