CN105903009A - 一种基于阿拉伯半乳聚糖-聚肌苷酸胞苷酸修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明将阿拉伯半乳聚糖(AG)与聚肌苷酸胞苷酸(poly(I:C))进行化学偶联，制备了AG‑poly(I:C)偶联物，用作免疫佐剂。将结核分蛋白枝杆菌复制期表达的抗原蛋白Ag85B与潜伏期表达的抗原蛋白HspX在大肠杆菌中重组融合表达，得到Ag85B‑HspX融合蛋白。用AG‑poly(I:C)偶联物修饰Ag85B‑HspX融合蛋白，得到一种结核分枝杆菌亚单位疫苗。该疫苗在体内具有较长的循环半衰期，可刺激机体产生高水平的体液免疫应答和细胞免疫应答。

Description

一种基于阿拉伯半乳聚糖-聚肌苷酸胞苷酸修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗及其 制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种基于阿拉伯半乳聚糖-聚肌苷酸胞苷酸修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗。

背景技术

结核病(Tuberculosis)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的一种非常古老的传染性疾病，也是艾滋病感染人群的主要死亡威胁之一。据世界卫生组织报道，全球约1/3的人群感染了结核分枝杆菌，每年约有870万新发结核病病例和150万结核病死亡病例。由于长期以来人们对于抗结核药物(异烟肼、链霉素、利福平和乙胺丁醇等)的滥用，导致感染多重耐药和广泛耐药菌株的病例逐年提高。因此，结核分枝杆菌的耐药性问题变得十分严重。我国是世界第二大结核病高负担国家，结核病患者人数众多，而且每年因结核病导致的死亡人数位于传染病死亡人数之首。发病率与耐药率高、因病死亡人数多、潜伏感染人群数量庞大是我国结核病的疫情现状，导致目前的防控形势十分严峻。

卡介苗(Bacille Calmette Guerin,BCG)是目前市场上唯一可用于预防结核病的疫苗。作为一种减毒活疫苗，卡介苗可有效预防儿童粟粒状及脑膜结核。但卡介苗的保护效力不稳定(0-85％)，而且无法预防成人结核病，对于抑制潜伏期结核病的复发也无效。因此，急需研发更加有效的结核分枝杆菌疫苗，用于保护健康成年人和结核分枝杆菌潜伏感染者。蛋白质亚单位疫苗因具化学成分明确和安全性好的优点，成为新型结核疫苗研发的重要类型之一。迄今为止共有12种预防性结核分枝杆菌疫苗进入了临床试验，其中蛋白质亚单位疫苗就占6种。蛋白质亚单位疫苗存在着免疫原性弱的缺点，需要加入有效的疫苗佐剂才能诱导出较强的免疫应答。目前，铝佐剂是唯一被FDA批准用于人体的疫苗佐剂，但其增强细胞免疫应答的效果十分有限。因此，需要开发有效的疫苗佐剂和佐剂递送系统，用于提高蛋白质亚单位疫苗的免疫原性。

阿拉伯半乳聚糖(Arabinogalactan，AG)是一种由阿拉伯糖和半乳糖组成的高度分枝化的聚合物多糖。AG从植物中获得，具有良好的水溶性和生物相容性。AG的主链是半乳聚糖，它的分枝主要是由阿拉伯糖侧链通过β-1,3键或β-1,6键与半乳糖链连接所形成。AG具有免疫刺激作用，可促进脾脏细胞增殖，增强单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞(Natural killer cell)等细胞的免疫活性，还可提高细胞因子和趋化因子的转录表达水平。因此，AG常用于抗细菌、抗病毒和肿瘤的辅助治疗。聚肌苷酸胞苷酸(polyinsinic-polycytidylic acid,poly(I:C))是一种人工合成的病毒双链RNA的核酸类似物，能通过与抗原呈递细胞表面的TLR3受体结合，诱导表达IFN-α、IFN-γ和促炎症细胞因子(如IL-12与IL-16)，加强机体Th1型的细胞免疫应答。临床试验表明，poly(I:C)容易在体内被核酸酶降解，需要较高的剂量才能起到免疫刺激的效果。然而，高剂量的poly(I:C)可能会诱导自身免疫反应，并产生一些其它的毒副作用，在临床应用中需严格控制poly(I:C)的剂量。因此，在保留poly(I:C)佐剂效果的前提下降低其毒副作用是目前需要解决的关键问题。

Ag85B是结核分枝杆菌在活跃复制早期分泌的一种强免疫原蛋白，分子量约为35kDa；HspX是结核分枝杆菌在潜伏期表达的一种重要免疫原蛋白，分子量约为15kDa，可用于预防结核分枝杆菌的潜伏感染。本发明将两种免疫原蛋白在大肠杆菌中进行了重组融合表达，并通过复性和分离纯化获得了Ag85B-HspX融合蛋白(AH)。本发明将AG共价偶联到poly(I:C)上，制备一种AG-poly(I:C)偶联物(AG-P)；该偶联物进一步偶联AH，可以大幅提高AH的免疫原性。该偶联物作为一种免疫佐剂，可起到以下作用：(1)偶联的AG可降低核酸酶对poly(I:C)的降解，延长poly(I:C)在体内的循环半衰期，进而减少其使用剂量，降低甚至消除其毒副作用；(2)AG可与poly(I:C)协同作用，共同加强对AH的免疫刺激作用；(3)AG-P与AH的共价偶联可以保证AG-P与AH同时到达免疫系统，同步刺激抗原呈递细胞，进而诱导强的免疫应答。

发明内容

1.本发明将结核分枝杆菌复制期表达的Ag85B蛋白与潜伏期表达的HspX蛋白在大肠杆菌中进行了重组融合表达，经复性和分离纯化后得到了Ag85B-HspX融合蛋白(AH)。

2.本发明通过化学修饰的方法将阿拉伯半乳聚糖-poly(I:C)偶联物与AH共价结合起来，制备出了一种结核分枝杆菌亚单位疫苗。该疫苗能够诱导机体产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答。

3.本发明提供了一种新型结核分枝杆菌亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)poly(I:C)的衍化：在亚硫酸氢钠的催化下，乙二胺被连接到poly(I:C)的胞嘧啶上，从而在poly(I:C)分子上引入具反应活性的氨基。

(2)AG-poly(I:C)偶联物的制备：在偏酸性反应体系中，阿拉伯半乳聚糖(AG)的邻位羟基被高碘酸钠氧化成醛基，醛基在氰基硼氢化钠作用下与poly(I:C)分子上的氨基反应。反应结束后，用截留分子量为100kDa的滤膜除去未反应的AG和poly(I:C)，得到AG-poly(I:C)偶联物(AG-P)。

(3)结核分枝杆菌亚单位疫苗的制备：在2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液(pH 5.0)体系中，将AH融合蛋白的羧基与AG-P的剩余氨基在碳二亚胺的作用下进行连接。随后，用截留分子量为300kDa的滤膜除去未反应的AH和AG-P，得到亚单位疫苗(AH-AG-P)。

本发明的优势在于以下3点：

(1)本发明采取了佐剂与抗原化学偶联的递送方式。跟佐剂与抗原物理混合后直接使用的传统方法相比，化学偶联的递送方式可以确保佐剂与抗原同步到达抗原呈递细胞，从而诱导机体产生针对抗原的体液免疫和细胞免疫应答，有效地预防结核病的发生。

(2)发明了一种新型的免疫佐剂，即AG-poly(I:C)偶联物。该偶联物可降低人体内核酸酶对poly(I:C)的降解作用，减少poly(I:C)的毒副作用；同时，AG和poly(I:C)可发挥协同效应，共同增强机体对抗原的免疫应答。

(3)AG-poly(I:C)偶联物与AH融合蛋白共价结合后，能显著增加AH的分子尺寸，减少肾小球对AH的过滤作用，延长AG-poly(I:C)偶联物在血浆中的循环半衰期，使AG-poly(I:C)偶联物更加持久地刺激机体。同时，偶联物较大的分子尺寸也利于抗原呈递细胞对疫苗的吞噬作用，共同增强机体对AH的免疫应答。

附图说明

图1 SDS-PAGE凝胶电泳分析大肠杆菌破碎液和纯化的融合蛋白。图1a：第1泳道为标准蛋白；第2泳道为大肠杆菌破碎液；第3和第4泳道为包涵体；第5泳道为上清。图1b：第1泳道为标准蛋白；第2泳道为纯化的融合蛋白。

图2 AG-P佐剂和结核分枝杆菌亚单位疫苗的制备反应示意图。

图3凝胶过滤分析结核分枝杆菌亚单位疫苗。用分析型凝胶过滤柱Superdex 200(1cm×30cm)检测结核分枝杆菌亚单位疫苗。分析条件：流动相为20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)，流速0.5毫升/分钟，检测波长为280纳米。

图4结核分枝杆菌亚单位疫苗产生的抗AH的抗体。图a为抗AH的IgG抗体滴度；图b为抗AH的IgG1和IgG2c抗体滴度。抗AH的抗体滴度由ELISA方法测定。

图5结核分枝杆菌亚单位疫苗产生的细胞因子。图a为疫苗对大鼠脾细胞增殖的研究；图b为测定IFN-γ的浓度；图c为测定TNF-α的浓度；图d为测定IL-2的浓度。

图6 SD大鼠血浆中抗AH的IgG抗体滴度随时间变化的曲线。SD大鼠经腹腔注射疫苗，在不同的时间点采血，离心收集血浆，并在一周后加强免疫一次。随后在不同的时间点再采血，离心收集血浆。抗AH的抗体滴度由ELISA方法测定。

图7 SD大鼠血浆中AH的血药浓度随时间变化曲线。血浆中的AH浓度由双抗夹心ELISA法测定。

具体实施方式：

实施例1：CT融合蛋白的制备

(1)构建Ag85B-HspX重组质粒

首先根据GenBank中结核分枝杆菌标准毒株Rv1886c的Ag85B编码基因序列和Rv2031c的HspX编码基因序列，设计出中间加入3个甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸(Gly-Gly-Gly-Ser)重复单元的全基因序列，并进行全基因合成；然后设计引物，进行PCR扩增全基因序列，用胶回收试剂盒回收目的基因，并用HindⅢ和MscⅠ对全基因序列进行双酶切。同时对载体质粒pET26b进行双酶切，分别回收目的基因片段后，用T4连接酶进行连接；最后将连接产物转化到E.Coli BL21(DE3)，用菌落PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定，从而构建出pET26b-Ag85B-HspX重组质粒。

(2)诱导表达Ag85B-HspX融合蛋白(AH)

a)从pET26b-Ag85B-HspX(TOP10)中提取重组质粒，并转化到E.Coli BL21(DE3)感受态细胞中。菌落PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定，即为保存菌种pET26b-Ag85B-HspX(BL21)；

b)活化表达AH融合蛋白的E.Coli BL21菌体，按1％的比例接种到卡拉霉素的200ml LB培养基，振荡培养至OD₆₀₀等于0.6～0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，于37℃下诱导4小时；

c)于4℃和10000rpm离心10分钟，收集菌体，重悬于50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。于冰浴下进行超声破碎1小时(240W，超声2秒，停5秒)。然后于4℃和10000rpm离心30分钟，分别收集上清和沉淀。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果表明(图1a)，与未经IPTG诱导的菌相比，细胞破碎液有一条明显的特异性蛋白带，其分子量约为51kDa，以包涵体的表达形式为主。

(3)包涵体复性与Ag85B-HspX融合蛋白的分离纯化

a)配制以下溶液：包涵体洗涤液，即100mM Tris-HCl(含0.1M NaCl和2M尿素，pH8.0)；包涵体溶解液，即50mM Tris-HCl(含1mM EDTA、15mM DTT和8M尿素，pH 8.0)；包涵体复性液，即100mM Tris-HCl(含0.18mM EDTA,4mM L-精氨酸,0.9mM还原型谷胱甘肽、0.18mM氧化型谷胱甘肽和8M尿素，pH 8.0)。随后，尿素浓度依次递减(6M、4M、2M、1M、0.5M、0.2M、0.1M和0M)。

b)离心收集含有融合蛋白的菌体。冰浴下超声破碎后，于4℃和10000rpm条件下离心收集包涵体，用包涵体洗涤液洗涤3次，然后用包涵体溶解液于37℃水浴中溶解2小时。将蛋白浓度调整为1.0mg/ml，最后在4℃下逐滴加入到包涵体复性液中，蛋白终浓度为0.1mg/ml，于4℃下复性过夜。

c)由Q Sepharose HP强阴离子交换层析柱对复性的融合蛋白进行分离纯化。阴离子交换柱A液，即20mM Tris-HCl(pH 8.0)；阴离子交换柱B液，即20mM Tris-HCl(含0.5M NaCl，pH 8.0)；所有溶液均过0.22μm滤膜。由A液对层析柱进行平衡和洗脱，随后由A液和B液对层析柱进行梯度洗脱。收集Ag85B-HspX融合蛋白所对应的洗脱峰，将融合蛋白置换到20mM磷酸缓冲液(pH 7.2)。如图1b所示，融合蛋白在SDS-PAGE电泳胶上表现出一个单一的蛋白条带，对应的分子量约为51kDa。

实施例2：结核分枝杆菌亚单位疫苗的制备

(1)poly(I:C)的衍化

称取9.98g乙二胺和2.60g亚硫酸氢钠，溶于25ml去离子水中，充分混合均匀，然后用氢氧化钠将溶液pH调节至5.5-6.0，加入12.5mg poly(I:C)，混合均匀。然后于42℃反应3小时(图2)。反应结束后，将反应液用截留分子量8-12kDa透析袋在去离子水中充分透析，随后冻干备用。

(2)AG-P偶联物的制备

称取10mg AG溶于20mM醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH 5.5-6.0)中。加入高碘酸钠，使其终浓度为20mM，室温避光反应20分钟后，加入少量乙二醇终止反应。随后，用透析袋在20mM磷酸缓冲液中(pH 7.4)中透析12小时，透析三次。称取1mg衍化的poly(I:C)和2.5mg氰基硼氢化钠，加入到5mg氧化的AG溶液中，混合均匀，反应终体积为2ml，于室温下反应过夜(图2)。反应完成后，用截留分子量为100kDa的超滤膜于6000g离心5次，除去未反应的AG、氰基硼氢化钠和poly(I:C)等杂质，得到AG-P偶联物。

(3)AH-AG偶联物的制备

取1mg AH融合蛋白和2.5mg氰基硼氢化钠，加入到5mg氧化的AG溶液中，混合均匀，反应终体积为2ml，于室温下反应过夜(图2)。反应完成后，用截留分子量为100kDa的超滤膜于6000g离心5次，除去未反应的AG、AH和氰基硼氢化钠等杂质，得到AH-AG偶联物。

(4)AH-P偶联物的制备

称取5mg衍化的poly(I:C)，溶于20mM MES缓冲液(pH 5.5,1ml)。将AH蛋白置换到20mM MES缓冲液(pH 5.5)后，取1mg AH蛋白与poly(I:C)溶液混合，再加入0.5mg碳二亚胺，混匀后于4℃反应5小时(图2)。随后，用截留分子量为100kDa的超滤膜于6000g离心5次，除去未反应的poly(I:C)、AH和碳二亚胺等，得到AH-P偶联物。

(5)AH-AG-P偶联物的制备

称取7.5mg衍化的AG-P偶联物，溶于20mM MES缓冲液(pH 5.5,1ml)。将AH蛋白置换到20mM MES缓冲液(pH 5.5)后，取1mg AH蛋白与AG-P偶联物溶液混合，再加入0.5mg碳二亚胺，混匀后于4℃反应5小时(图2)。随后，用截留分子量为100kDa的超滤膜于6000g离心5次，除去未反应的AG-P偶联物、AH和碳二亚胺等，得到AH-AG-P偶联物。

实施例3：疫苗的结构表征

将3种疫苗用分析型Superdex 200凝胶过滤柱(1.0×30cm)进行鉴定，洗脱液为含有0.15M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)，流速为0.5ml/min。如图3所示，与融合蛋白AH相比，AH-AG、AH-P和AH-AG-P的出峰时间均明显提前。其中，AH-AG-P的出峰时间要早于AH-AG和AH-P，表明AG-P偶联物对AH的修饰显著提高了AH的分子量。

实施例4：测定疫苗诱导的抗体水平

选择40只5周龄的雌性C57BL/6小鼠，体重为18-22克。随机分为5组，即AH组、AH-AG组、AH-P组、AH-AG-P组和AG-P/AH物理混合组，每组8只小鼠。以皮下注射的方式，每只每次注射含有10微克抗原蛋白，分别于第0、第14和28天注射，共注射三次。分别于第13、27、49天从眼眶取血，离心收集血清，-80℃保存备用。用ELISA法检测小鼠血清中抗AH的IgG、IgG1、IgG2b和IgG2c滴度。

用ELISA法检测小鼠血清中抗AH的IgG、IgG1及IgG2c。如图4a所示，AH组第一针免疫后产生的抗AH的IgG滴度为5000左右，第二、三针加强免疫后，IgG滴度分别增加了2.2和7.9倍。与抗原AH组相比，第一针免疫后AH-AG组、AH-P组、AH-AG-P组和AG-P/AH组产生的抗AH的IgG滴度分别增加1.5、2.1、5.2和1.8倍，这表明AH-AG-P组比其它实验组能更为快速地诱导产生抗AH的IgG。第二、三针加强免疫后，AH-AG-P组产生的抗AH的IgG滴度比第一针分别增加了10.2和34.1倍。第三针加强免疫后，AH-AG组、AH-P组、AH-AG-P组和AG-P/AH组产生的IgG滴度分别是AH组的1.8倍、6.7倍、22.2倍和4.4倍。这表明AG-P结合物中的AG和poly(I:C)以协同作用的方式刺激AH产生体液免疫应答。

如图4b所示，所有实验组诱导产生较低水平的Th2型抗AH的IgG1滴度，且各实验组间无显著性差异；所有实验组诱导产生的IgG抗体亚型主要是Th1型的抗AH的IgG2c，这表明亚单位疫苗主要诱导产生了趋向于Th1型的免疫应答；AH-AG-P组产生的IgG2c滴度显著高于其它四组。

实施例5：测定疫苗诱导的细胞免疫水平

于第49天取脾细胞，进行脾细胞增殖及相关细胞因子的检测。小鼠脾脏淋巴细胞在体外经AH特异性刺激后，由CCK8法检测淋巴细胞的增殖情况，可反映不同实验组诱导小鼠机体产生细胞免疫的水平。如图5a所示，AH组的细胞增殖率最低，AH-AG-P组的脾细胞增殖率最高，而且要显著高于其它实验组(P<0.05)。这表明AH-AG-P可显著提高机体对AH融合蛋白的细胞免疫应答水平。

小鼠脾脏淋巴细胞在体外经AH特异性刺激72小时后，由ELISA细胞因子定量试剂盒检测细胞上清液中IFN-γ、TNF-α和IL-2的分泌情况。如图5b、5c和5d所示，AH组中IFN-γ、TNF-α和IL-2的分泌水平均相对较低；AH-AG组和AH-P组中3种细胞因子的浓度有一定程度的提高；与AH组相比，AH-AG-P组中IFN-γ、TNF-α和IL-2的浓度分别增加了5.4、2.4和3.7倍，这表明AG-P与AH的共价偶联显著增强了机体对抗原的细胞免疫应答水平。AG-P/AH组的3种细胞因子水平虽然都低于AH-AG-P组(P<0.05)，但均显著高于AH组(P<0.05)。这表明AG-P偶联物是一种较强的免疫佐剂，即使与AH的物理混合也可以显著增强机体对AH的细胞免疫应答水平。

实施例6：疫苗药代动力学与药效动力学的测定

取雄性SD大鼠20只，随机分为4组(7-8周，平均体重250克左右)，即抗原AH组、AH-AG组、AH-P组和AH-AG-P组，每组5只大鼠。腹腔给药，每只大鼠的注射剂量为0.5mg AH/kg大鼠，分别于给药后1、2、4、8、24、48、72和120小时取血。第8天加强免疫一次，腹腔给药，每只大鼠的注射剂量为0.5mg AH/kg大鼠，分别于给药后1，2，4，8，24，48，72、120和168小时取血。血浆中的AH浓度由双抗夹心ELISA法测定；血清中抗AH的抗体滴度由ELISA方法测定。

如图6所示，AH组的血浆半衰期仅为2.7小时。AH-AG组和AH-P组的血浆半衰期分别为13.5小时和14小时，均显著高于AH组(P<0.05)。与AH-AG组和AH-P组相比，AH-AG-P组的半衰期为18.9小时。这表明AH与AG-P偶联后，AH-AG-P的分子半径增加，可减少肾小球对偶联物的过滤作用，延长疫苗的半衰期，使抗原可以持续地刺激免疫系统，增强机体对疫苗的免疫应答。第二针加强免疫后，4个实验组的半衰期有所降低，表明机体清除疫苗的速度加快。这是由于第一针免疫产生了抗AH的特异性抗体，抗体中和第二针免疫的抗原，加快了机体对疫苗的清除速率。

由ELISA法测定抗AH的IgG滴度随时间变化的曲线。如图7所示，第一针免疫后72-120小时，4个实验组的IgG滴度大幅增加；其中，AH-AG-P组的IgG滴度是AH组的7倍。第二针加强免疫72-120小时后，4个实验组的IgG滴度再次大幅增加；其中，AH-AG-P组抗体滴度是AH组的10倍。这表明AH-AG-P可快速诱导机体产生大量抗AH的IgG，有利于预防结核分枝杆菌的感染和快速清除入侵的病原体。

Claims (8)

1.一种基于阿拉伯半乳聚糖-聚肌苷酸胞苷酸结合物共价修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，由阿拉伯半乳聚糖-聚肌苷酸胞苷酸结合物共价修饰结核分枝杆菌Ag85B-HspX融合蛋白制备而成。

2.根据权利要求1所述的基于阿拉伯半乳聚糖-聚肌苷酸胞苷酸结合物共价修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗的制备方法，其特征在于所述结核分枝杆菌Ag85B-HspX融合蛋白的制备步骤包括：(1)将Ag85B-HspX全基因进行PCR扩增，并经双酶切后插入到表达载体的多克隆位点，构建重组载体；(2)将重组载体在大肠杆菌中表达Ag85B-HspX融合蛋白；(3)对大肠杆菌中的包涵体进行复性与分离纯化，得到Ag85B-HspX融合蛋白。

3.根据权利要求1所述的基于阿拉伯半乳聚糖-聚肌苷酸胞苷酸结合物共价修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗的制备方法，其特征在于所述的阿拉伯半乳聚糖-聚肌苷酸胞苷酸结合物，其制备步骤包括：(1)聚肌苷酸胞苷酸在亚硫酸氢钠的催化下，与乙二胺进行衍化反应；(2)阿拉伯半乳聚糖经高碘酸钠氧化生成醛基；(3)聚肌苷酸胞苷酸的氨基与阿拉伯半乳聚糖的醛基在氰基硼氢化钠的还原作用下进行共价结合反应，得到阿拉伯半乳聚糖-聚肌苷酸胞苷酸结合物。

4.根据权利要求3所述的基于阿拉伯半乳聚糖-聚肌苷酸胞苷酸结合物共价修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗的制备方法，其特征在于所述的聚肌苷酸胞苷酸与乙二胺的衍化反应过程，乙二胺、亚硫酸氢钠与聚肌苷酸胞苷酸反应的质量比为4:1:5，反应于42℃下进行3-5小时。

5.根据权利要求3所述的基于阿拉伯半乳聚糖-聚肌苷酸胞苷酸结合物共价修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述的聚肌苷酸胞苷酸与阿拉伯半乳聚糖的共价结合反应中，聚肌苷酸胞苷酸、氰基硼氢化钠与阿拉伯半乳聚糖反应的质量比为2:5:10，反应于室温下进行12-14小时。

6.根据权利要求1所述的基于阿拉伯半乳聚糖-聚肌苷酸胞苷酸结合物共价修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述的制备方法由AG-P与Ag85B-HspX融合蛋白在碳二亚胺的作用下反应，得到阿拉伯半乳聚糖-聚肌苷酸胞苷酸-融合蛋白结合物。

7.根据权利要求6所述的基于阿拉伯半乳聚糖-聚肌苷酸胞苷酸结合物共价修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述结合物、Ag85B-HspX融合蛋白与碳二亚胺的质量比为15:2:1，反应于pH 5.5和4℃下进行5小时。

8.一种结核分枝杆菌亚单位疫苗，其特征在于，所述的结核分枝杆菌亚单位疫苗由根据权利要求1-7任一项所述的制备方法制得，其结构为阿拉伯半乳聚糖-聚肌苷酸胞苷酸与Ag85B-HspX融合蛋白的结合物。