CN113813281A

CN113813281A - 肌苷在制备预防和治疗结核病药物中的应用

Info

Publication number: CN113813281A
Application number: CN202110996941.5A
Authority: CN
Inventors: 戈宝学; 杨华; 王菲; 郭欣娅
Original assignee: Shanghai Pulmonary Hospital
Current assignee: Shanghai Pulmonary Hospital
Priority date: 2021-08-27
Filing date: 2021-08-27
Publication date: 2021-12-21
Anticipated expiration: 2041-08-27
Also published as: CN113813281B

Abstract

本发明提供了肌苷在制备预防和治疗结核病药物中的应用。本发明证实了肌苷显著降低结核分枝杆菌(Mtb)感染小鼠肺脏的荷菌量，减轻病理变化，抑制结核性肉芽肿恶化，并通过显著促进IL‑1β和IL‑6基因的表达，进而促进巨噬细胞对Mtb的清除，抑制Mtb的体内存活。因此，肌苷有望作为新的有效代谢分子用于制备预防和治疗结核病的药物，为治疗结核病提供新的策略。

Description

肌苷在制备预防和治疗结核病药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及肌苷在制备预防和治疗结核病药物中的应用。

背景技术

结核病(Tuberculosis，TB)是由结核杆菌感染引起的慢性传染病，仍是由单一感染病源引起的第二大杀手疾病。据世界卫生组织报道，2019年全球约1,000万人新发活动性结核病，145万人因TB而死亡。更为严峻的挑战是，全球四分之一人口是结核潜伏感染(Latent TB infection，LTBI)者，其中约5-10％可能发展为活动性结核病，成为新的传染源，感染更多人群。如何有效地控制LTBI并预防更多的人感染Mtb(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)，对于扭转整个结核病疫情具有重要意义，刻不容缓。另一方面，耐多药结核病，尤其是广泛耐药结核病已然成为一种新的不治之症，我国耐药结核病的疫情更是严峻，已有化疗药物治愈率低，死亡率高，急需开发新的治疗策略和创新药物，以实现国家降低结核病发病率、死亡率的迫切要求。

宿主靶向治疗(Host-directed therapy，HDT)不直接杀死Mtb，而是通过调节宿主的免疫功能，控制Mtb感染。多个临床研究表明HDT药物辅助治疗可以有效缩短患者用药时间，尤其对于耐多药结核病患者具有明显疗效。目前，HDT在结核病领域还是一种新兴的治疗方案，已经报道并开发的药物还非常有限。因此找到更多靶向宿主抗结核免疫通路，尤其是靶向肉芽肿进展的HDT药物迫在眉睫，对于临床开发治疗新手段具有重要意义。近年来，越来越多的研究表明绝大多数疾病的发生发展都伴随着局部或整体的代谢异常，而通过干预相关代谢通路或人工添加具有保护作用的代谢产物，可以直接影响很多疾病，尤其是癌症的转归，有可能作为新的治疗方法应用于临床。但是代谢产物对结核病疾病进程，尤其是肉芽肿进展的影响，以及其在抗结核治疗中的应用还缺乏相关研究和报道。

肌苷(Inosine)，也称为次黄苷、次黄嘌呤核苷等，化学式C₁₀H₁₂N₄O₅，是由次黄嘌呤与核糖结合而成的核苷类化合物，适用于各种原因引起的白细胞减少症、血小板减少症、各种心脏疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外尚可治疗中心视网膜炎、视神经萎缩等。前期我们通过Mtb感染肉芽肿小鼠的肺脏和外周血比较代谢组学分析，发现肌苷在小鼠肺脏肉芽肿和外周血中的含量都显著下调，提示肌苷可能参与到结核性肉芽肿的进展过程中，但其在肉芽肿发展中的作用及机制尚不清楚，尤其是在制备预防和治疗结核病药物中的应用未见报道。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了肌苷在制备预防和治疗结核病药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供肌苷在制备预防和治疗结核病药物中的应用，该药物包括肌苷或其药学上可接受的盐作为主要活性成分。

本发明的第二方面是提供肌苷在制备抑制结核性肉芽肿恶化药物中的应用，该药物包括肌苷或其药学上可接受的盐作为主要活性成分。

本发明的第三方面是提供肌苷在制备促进巨噬细胞对Mtb的清除作用的药物中的应用，该药物包括肌苷或其药学上可接受的盐作为主要活性成分。

进一步地，肌苷通过促进IL-1β和IL-6基因的表达促进巨噬细胞对Mtb的清除作用。

本发明的第四方面是提供一种预防和治疗结核病的药物，其包括肌苷或其药学上可接受的盐作为主要活性成分。

进一步地，上述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

进一步地，上述药物的剂型为片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂或注射剂。

进一步地，上述药物的给药途径为口服、透皮、肌肉、皮下或静脉注射。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明证实了肌苷显著降低肺脏的荷菌量，减轻病理变化，抑制结核性肉芽肿恶化，并通过显著促进IL-1β和IL-6基因的表达，进而促进巨噬细胞对Mtb的清除，抑制Mtb的体内存活。因此，肌苷有望作为新的有效代谢分子用于制备预防和治疗结核病的药物，为治疗结核病提供新的策略。

附图说明

图1是本发明一实施例中H37Rv感染小鼠经对照或肌苷处理后肺脏荷菌量检测结果；

图2是本发明一实施例中H37Rv感染小鼠用对照或肌苷处理后肺脏HE和抗酸染色结果；

图3是本发明一实施例中海分枝杆菌感染成鱼经对照或肌苷处理后荷菌量检测结果；

图4是本发明一实施例中海分枝杆菌感染成鱼经对照或肌苷处理后HE和抗酸染色结果；

图5是本发明一实施例中对照或肌苷处理后巨噬细胞感染H37Rv的胞内CFU结果；

图6是本发明一实施例中对照或肌苷处理后巨噬细胞感染H37Rv的IL-1β和IL-6基因表达结果；

图7是本发明一实施例中HEK293、SH-SY5Y和HePG2细胞用不同浓度肌苷处理后OD₅₇₀吸光值。

具体实施方式

本发明提供了肌苷在制备预防和治疗结核病药物中的应用，主要是通过显著促进IL-1β和IL-6基因的表达，进而促进巨噬细胞对Mtb的清除，抑制Mtb的体内存活，抑制肉芽肿恶化。

本发明还提供了一种预防和治疗结核病的药物，其包括肌苷或其药学上可接受的盐作为主要活性成分。

在本发明一优选的实施方式中，上述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。术语“药学上可接受的”是指适用于人而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。“载体或赋形剂”包括粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、湿润剂中的一种或几种。

在本发明一优选的实施方式中，上述药物的剂型为片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂或注射剂。

在本发明一优选的实施方式中，上述药物的给药途径为口服、透皮、肌肉、皮下或静脉注射。

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1

本实施例利用C57BL/6小鼠感染H37Rv模型，分析肌苷对结核病的作用，具体的实验步骤和结果如下：

将6-8周雌性C57BL/6小鼠，每组6只，通过滴鼻方式感染H37Rv菌株，约200CFU/鼠。感染3周后，对照组在饮水中添加1％DMSO，肌苷组在饮水中添加1％肌苷，给药4周后处死小鼠。通过检测以下指标，分析肌苷对小鼠感染结核病的作用：

①肺脏荷菌量：无菌条件下收集肺脏，加入PBS匀浆，10倍稀释后接种于7H10琼脂培养基上，37℃培养4周，观察H37Rv生长情况，计算肺脏荷菌量，结果发现感染H37Rv的小鼠饮用肌苷后，肺脏荷菌量显著降低(图1)。

②肺部组织病理学检测：无菌条件下收集肺脏，取部分肺组织用4％多聚甲醛固定，脱水、浸蜡、包埋、切片，H&E及抗酸染色，显微镜观察肺部组织病理学变化，结果发现饮用肌苷的感染小鼠与对照组相比，肺部病理改变明显减轻，免疫细胞浸润和肺组织损伤也明显减少(图2)。

上述结果表明，肌苷可以显著提高宿主抵抗Mtb的能力。

实施例2

本实施例利用斑马鱼感染模型，分析肌苷对分枝杆菌病，尤其是肉芽肿的作用，具体的实验过程和结果如下：

野生型斑马鱼(AB品系)从中国斑马鱼资源中心购买，在循环养殖系统中饲养，转移到毒理系统进行海分枝杆菌感染实验，同时保证斑马鱼饲养及感染的标准条件(水温约28℃，pH约7.4，电导率约1,500μS)。成年斑马鱼用0.1％三卡因麻醉后，通过腹腔注射感染海分枝杆菌，感染菌量约200CFU，1周后对照组口灌DMSO，肌苷组口灌0.01mg肌苷。给药1周后处死，通过以下指标分析肌苷对海分枝杆菌感染斑马鱼成鱼肉芽肿发生发展的作用：

(1)荷菌量：感染给药后斑马鱼在0.5％三卡因中进行终末麻醉，在PBS中匀浆，10倍稀释后接种于7H10琼脂培养基上，37℃培养1-2周，观察不同组海分枝杆菌生长情况，计算活菌CFU数，结果发现口灌肌苷组的成鱼具有较低的荷菌量，且具有剂量依赖性(图3)。

(2)组织病理学检测：感染给药后斑马鱼在0.5％三卡因中进行终末麻醉，将全鱼在4％中性缓冲的多聚甲醛溶液中固定72小时，脱钙、浸蜡、包埋、切片，H&E及抗酸染色，显微镜观察全鱼，主要是肾脏、肝脏组织肉芽肿病理学变化，结果发现口灌肌苷组的成鱼肉芽肿数量明显减少，病变也显著减轻(图4)。

上述结果表明，肌苷可以显著提高宿主抵抗分枝杆菌的能力，减少肉芽肿的生成和恶化。

实施例3

本实施例利用巨噬细胞体外感染模型，分析肌苷对巨噬细胞胞内Mtb存活的影响，具体的实验过程和结果如下：

取野生型小鼠腹腔原代巨噬细胞，用完全1640培养基(含10％FBS+1％青霉素-链霉素)37℃培养4小时，细胞贴壁后换全无1640培养基，加入肌苷使其终浓度为50μM，12小时后感染H37Rv，MOI＝5。感染3小时后，去上清，PBS清洗细胞三次去除胞外菌，CFU计数进入细胞菌数。另一部分细胞清洗后，加入含DMSO或含50μM肌苷的1640培养基继续培养24小时后，CFU检测胞内菌的存活情况。结果发现，肌苷显著促进巨噬细胞对Mtb的胞内清除，见图5。

实施例4

本实施例利用巨噬细胞感染模型，分析肌苷对巨噬细胞免疫保护反应的影响，具体的实验过程和结果如下：

取野生型小鼠腹腔巨噬细胞，加入DMSO对照或终浓度为50μM的肌苷处理12小时后，给予H37Rv感染，MOI＝5。分别感染0、3、6小时后，去上清，用1ml Trizol裂解细胞，提取RNA，通过qRT-PCR检测保护性炎症因子IL-1β和IL-6基因表达水平的变化，确定肌苷对巨噬细胞炎症因子产生的影响。结果发现肌苷可以促进IL-1β和IL-6基因的表达，见图6。

实施例5

本实施例利用HEK293、SH-SY5Y和HePG2细胞模型，分析肌苷对细胞毒性的影响，具体的实验过程和结果如下：

体外培养HEK293、SH-SY5Y和HePG2细胞系，待细胞长到80％时，加入0、0.001、0.01、0.1、1、5、10、30、100、1000和10000μM的肌苷处理24h，利用MTT试剂盒对细胞毒性OD₅₇₀吸光度值进行测定，结果发现肌苷对HEK293、SH-SY5Y和HePG2细胞均没有毒性，见图7。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.肌苷在制备预防和治疗结核病药物中的应用，其特征在于，所述药物包括肌苷或其药学上可接受的盐作为主要活性成分。

2.肌苷在制备抑制结核性肉芽肿恶化药物中的应用，其特征在于，所述药物包括肌苷或其药学上可接受的盐作为主要活性成分。

3.肌苷在制备促进巨噬细胞对结核分枝杆菌的清除作用的药物中的应用，其特征在于，所述药物包括肌苷或其药学上可接受的盐作为主要活性成分。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，肌苷通过促进IL-1β和IL-6基因的表达促进巨噬细胞对结核分枝杆菌的清除作用。

5.一种预防和治疗结核病的药物，其特征在于，包括肌苷或其药学上可接受的盐作为主要活性成分。

6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

7.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂或注射剂。

8.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物的给药途径为口服、透皮、肌肉、皮下或静脉注射。