发明内容
本发明的目的在于提供一种重组的Ag85复合物以及制备重组抗原85复合物(recombinant Antigen 85 Complex,rAg85Com)的方法。
本发明的另一目的在于提供含有所述Ag85复合物的疫苗组合物。
在本发明的第一方面,提供一种重组的抗原85复合物,该复合物含有重组抗原85A(recombinant Antigen 85A,rAg85A)、重组抗原85B(recombinant Antigen 85B,rAg85B)、重组抗原85C(recombinant Antigen 85C,rAg85C)和重组抗原85D(recombinant Antigen85D,rAg85D),并且rAg85A:rAg85B:rAg85C:rAg85D按照重量比为1:(1-2.5):(0.3-1.3):(0.6-2)。
在另一优选例中,所述的rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D的总和占rAg85Com重量的50-100%;优选的是80-100%;更优选的是95-100%;进一步优选的是99-100%。
在另一优选例中,所述的rAg85Com由rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D组成。
在另一优选例中,所述的复合物通过包含以下步骤的方法制备:将rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D按照重量比为1:(1-2.5):(0.3-1.3):(0.6-2)的比例混合,从而rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D发生组合,形成rAg85Com。
在另一优选例中,rAg85A:rAg85B:rAg85C:rAg85D按照重量比为1:(2±0.2):(1±0.1):(1.5±0.2)。
在本发明的第二方面,提供一种制备所述的抗原85复合物的方法,所述方法包括:将rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D按照重量比为1:(1-2.5):(0.3-1.3):(0.6-2)的比例混合,从而rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D发生组合,形成rAg85Com。
在另一优选例中,在将rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D进行混合时,在混合体系中还加入金属离子。
在另一优选例中,所述的金属离子是二价金属离子。
在另一优选例中,所述的二价金属离子选自(但不限于):Cu2+、Ni2+、Zn2+或它们的组合。
在另一优选例中,所述的金属离子在混合体系中的浓度是0.1-50mmol/L,优选的是1-30mmol/L,更优选的是2-20mmol/L。
在另一优选例中,rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D在混合体系中的总蛋白浓度为8μg/mL-100mg/mL。
在另一优选例中,rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D采用酵母细胞表达,方法是:
(a)将含有基因表达盒的表达载体转入酵母细胞,其中所述的基因表达盒分别含有:
rAg85A的编码分子、rAg85B的编码分子、rAg85C的编码分子、rAg85D的编码分子;获得可分别表达rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D的重组酵母细胞;
(b)分别培养所述可表达rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D的重组酵母细胞,获得分别含有rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D的培养物;
(c)从培养物中分离纯化rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D。
在另一优选例中,所述的酵母细胞是甲醇酵母细胞。
在另一优选例中,所述的rAg85A具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;或所述的rAg85B具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;或所述的rAg85C具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列;或所述的rAg85D具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在另一优选例中,rAg85A的编码分子具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列,或具有SEQID NO:5中第139~1023位所示的所示的核苷酸序列;或
rAg85B的编码分子具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列,或具有SEQ ID NO:6中第130~984位所示的所示的核苷酸序列;或
rAg85C的编码分子具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列,或具有SEQ ID NO:7中第148~1029位所示的所示的核苷酸序列;或
rAg85D的编码分子具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列,或具有SEQ ID NO:8中第109~906位所示的所示的核苷酸序列。
在另一优选例中,步骤(c)中,
纯化rAg85A的方法是:将含rAg85A蛋白的溶液疏水层析,收集洗脱液后进行阴离子交换层析,收集洗脱液后进行分子筛层析,从而获得纯化的rAg85A蛋白;或
纯化rAg85B的方法是:将含rAg85A蛋白的溶液疏水层析,收集洗脱液,向该洗脱液中加入钠盐(如NaCl),进行螯合层析,收集流出液再进行疏水层析,收集洗脱液进行阴离子交换层析,梯度洗脱获得纯化的rAg85B蛋白;或
纯化rAg85C的方法是:将包涵体复性后的rAg85C蛋白溶液进行疏水层析,收集洗脱液后进行阴离子交换层析,梯度洗脱获得纯化的rAg85C蛋白;或
纯化rAg85D的方法是:将含rAg85A蛋白的溶液进行疏水层析,收集洗脱液后进行阴离子交换层析,梯度洗获得纯化的rAg85D蛋白。
在本发明的第三方面,提供所述的rAg85Com的用途,用于制备防治结核分枝杆菌感染的组合物。
在本发明的第四方面,提供一种多价的疫苗组合物,所述的疫苗含有有效量的所述的rAg85Com和药学上可接受的载体。
在另一优选例中,所述的疫苗还含有有效量的选自下组的佐剂或佐剂组合:
铝佐剂;铝佐剂+CpG佐剂;DDA佐剂+CpG佐剂;铝佐剂+DDA(双十八烷基二甲基溴化铵)佐剂+CpG佐剂;ISA-720佐剂;ISA-720佐剂+CpG佐剂;ISA-720佐剂+DDA佐剂+CpG佐剂;或聚肌苷-聚胞苷(PolyI:C)佐剂。
在另一优选例中,所述的抗原85复合物与佐剂或佐剂组合的重量比例是(1-100)∶(1-100)。
在本发明的第五方面,提供一种制备疫苗组合物的方法,所述方法包括:将所述的rAg85Com与药学上可接受的载体混合。
另一方面,本发明还提供一种预防结核分枝杆菌感染的方法,所述方法包括:给需要的对象施用所述的rAg85Com。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次揭示体外将rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D按照重量比为1:(1-2.5):(0.3-1.3):(0.6-2)进行组合,可获得rAg85Com;该rAg85Com免疫动物比单独采用rAg85A、rAg85B、rAg85C或rAg85D具有显著优异的免疫原性,且在动物体内的抗体滴度高、细胞免疫原性更显著。并且,在进行组合的体系中加入金属离子更有利于复合体的形成。此外,本发明人还首次利用同一种表达系统(酵母表达系统)成功地表达出了结核分枝杆菌的rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D四种蛋白。在此基础上完成了本发明。
本发明人经过长期研究认为,应该将Ag85Com作为一种参与Mtb细胞壁装配的“多酶复合体”分子,或将其视为一种在体液内引导Mtb侵入细胞“锚分子”,而这种“多酶复合体”或“锚分子”在Mtb生长或侵入人体的不同阶段,其中的组成成分会发生变化。因此,经纯化后的Ag85Com免疫原性显著降低,就是因为其中的某些成分(例如,Ag85C,或Ag85D等)丢失,或纯化导致某些成分结构改变或纯化导致各成分的比例失常等原因,使其不再是完整的“多酶复合体”或“锚分子”的缘故。因此,目前的现有技术中仅纯化或重组表达Ag85Com中一种成分作为抗原,不会成为理想的疫苗侯选抗原。而最理想的方式是,重组获得Ag85Com中的各组分,体外组装出重组型Ag85Com作为新型肺结核疫苗的抗原,这应该能够获得理想的研究结果。
本发明人利用同一蛋白表达系统(酵母表达系统)实现了rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D四种蛋白的分别表达,并且重新装配出Ag85Com,也就是获得了rAg85Com,这从根本上解决了大量获得Ag85Com的难题。
定义
Ag85Com(Antigen 85 Complex,抗原85复合物)是指分枝杆菌分泌表达到培养基或动物或人的体液中的由多种蛋白组成的复合物分子,通常包含有Ag85A、Ag85B和Ag85C,而本发明人认为Ag85Com还应包含有MPT51(也称FbpD或Ag85D),在没有特别说明时本发明提及的Ag85Com都包括这四种蛋白。
FbpA、FbpB、FbpC和FbpD是Ag85Com中四种蛋白成分的别称,分别对应于Ag85A、Ag85B、Ag85C和Ag85D,它们都具有结合人或动物体液或细胞表面的纤维连接蛋白的能力。至于fbpA、fbpB、fbpC和fbpD(缩写的第一个字母F用小写,整个缩写用斜体)代表Ag85Com中四种蛋白的全基因,包括了成熟蛋白和信号肽序列氨基酸残基对应的全部DNA序列。ag85a、ag85b、ag85c和ag85d(小写并用斜体)代表不含信号肽序列的成熟Ag85Com中四种蛋白对应的DNA(基因)序列。以此类推,mut-fbpA、mut-fbpB、mut-fbpC和mut-fbpD或mut-ag85a、mut-ag85b、mut-ag85c和mut-ag85d就是对应的突变形的基因。
rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D是指采用基因工程方法,根据现有技术在生物表达系统(真核或原核)中生产的Ag85A、Ag85B、Ag85C和Ag85D蛋白,本发明主要描述了甲醇酵母表达系统进行细胞内或细胞外表达,都能够大量制备。本发明后面实施实例中所具体使用的rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D,以由它们组成的rAg85Com,如果没有特别说明,实际所用的都是采用甲醇酵母细胞内表达,其氨基酸序列分别符合SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
rAg85Com是指将基因工程手段分别表达并纯化的rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D按一定的比例(如,2:3:1:2或2:4:2:3等)在体外组成的复合物分子。
复合体及其组装
本发明人发现,体外将rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D按照重量比为1∶(1-2.5)∶(0.3-1.3)∶(0.6-2)进行混合,获得的rAg85Com具有良好的免疫原性,且在体内可形成高的抗体滴度。因此,本发明提供一种rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D重量比例为1∶(1-2.5)∶(0.3-1.3)∶(0.6-2)的rAg85复合物(或称复合体)。更为优选的比例是1∶(2±0.2)∶(1±0.1)∶(1.5±0.2),该比例形成的复合体不仅免疫原性高,抗体滴度高,而且还更为稳定。在将Ag85A、Ag85B、Ag85C和Ag85D进行组合时,通常将纯化的各蛋白按照比例溶于常规的蛋白缓冲体系中进行(构成混合体系),所述的缓冲体系例如PB。通常混合体系中rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D总蛋白浓度在8μg/mL-100mg/mL;优选的在20μg/mL-50mg/mL。
所述的Ag85A、Ag85B、Ag85C和Ag85D优选的是重组表达的蛋白,即rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D。本发明研究发现,采用同一酵母表达系统表达的rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D四种蛋白可良好地组装在一起,形成复合体形式的rAg85com。利用该复合体免疫动物比单独采用rAg85A、rAg85B、rAg85C或rAg85D具有显著优异的免疫效果,并且在动物体内的抗体滴度更高、细胞免疫性也更显著。
表达和纯化
因此,本发明提供一种制备所述的抗原85复合物的方法,所述方法包括:将rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D按照重量比为1:(1-2.5):(0.3-1.3):(0.6-2)的比例混合,从而rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D发生组合,形成抗原85复合物。
本发明人意外发现,在体外组合时,在混合体系中添加金属离子后形成复合物分子的速度更快,且形成的复合物分子更稳定。因此,所述方法还包括:在rAg85A、rAg85B、rAg85C或rAg85D的混合体系中还加入金属离子。所述的金属离子优选的是二价金属离子,选自(但不限于):Cu2+、Ni2+、或Zn2+。所述的金属离子在混合体系中的浓度通常0.1-50mmol/L,优选的是1-30mmol/L,更优选的是2-20mmol/L。
作为本发明的优选方式,rAg85A、rAg85B、rAg85C或rAg85D通过重组表达来制备,重组表达的体系是酵母表达体系。尽管本领域已经通过重组表达的方法表达了Ag85A、Ag85B、Ag85C或Ag85D中的部分蛋白,然而还没有找到一种能够同时基于一个系统来表达所有四种蛋白的有效方法。采用不同系统表达的蛋白不利于组装成Ag85复合物,而仅用其中的一种或部分则效果不够理想。此外,采用多种表达系统或表达方式,不利于规模化生产。本发明人经过反复的试验,做了大量的重组表达设计和酵母密码子偏好研究,最终实现了利用同一蛋白表达系统(酵母表达系统)表达出rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D四种蛋白。
优选的,所述的酵母表达系统是甲醇酵母表达系统,该系统能够高效地生产本发明的重组蛋白,且具有成本低廉、适于大规模生产等特点。并且,不同于原核表达的是,利用酵母表达系统表达获得的重组蛋白可保留与天然蛋白基本相同的构型,并保留良好的生物活性,表达产量也很高。
经过甲醇酵母喜好的密码子设计,本发明人通过人工方法全合成了Ag85Com中Ag85A、Ag85B、Ag85C和Ag85D四种蛋白的编码基因,这些编码基因可以携带信号肽编码序列或不携带信号肽编码序列,可用于分泌表达或细胞内表达相应的蛋白。这些编码基因是经过密码子优化的,比相应的天然基因更易于被甲醇酵母表达且表达产量很高。编码基因上信号肽编码序列的加入与否取决于所需表达的目的基因的种类以及是否需要将目的基因分泌到细胞外,以及所用的表达载体上是否含有信号肽。
为保证分泌表达获得rAg85Com中的成分不发生酵母类型的N-糖基化修饰,还可采用常规方法将编码基因中对应糖基化相关位点的序列进行点突变,获得不含N-糖基化修饰的突变形基因。具体地,各蛋白中主要发生糖基化修饰的位点是Ag85A的N203位,Ag85B的N31、N203、N213和N259位,Ag85C的N90、N167、N201、N211、N235和N257位以及Ag85D的N143、N189(编号是按照成熟蛋白的氨基酸数目序列)。突变可以通过多种方式,例如将糖基化位点的N突变成Q或其他氨基酸残基,以不改变蛋白的生物学活性为基本评价标准,优选的是将N变成Q或A。也可以按常规分子生物学操作,通过PCR的方法突变各基因中的N-糖基化位点,获得不会发生修饰的突变型蛋白。
本发明可采用适合于在酵母系统内表达的任何表达载体,更优选的是适合于在甲醇酵母系统内表达的表达载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。所述的表达载体上还含有可与待表达基因操作性相连的其它功能或结构元件,如多克隆位点等。作为本发明的优选方式,所述的表达载体是pPICZα类载体。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含rAg85A、rAg85B、rAg85C或rAg85D编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。包含适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化宿主细胞,从而表达蛋白质。
在表达了所述蛋白后,还需要对获得的蛋白进行纯化。组成rAg85Com的四种蛋白在性质有许多相似性,特别是rAg85A、rAg85B和rAg85。但是,本发明人在实际表达和纯化研究过程中还发现,它们还有各自的特点,因而纯化的方法也有不同。四种蛋白可以采用细胞内表达,也可以采用分泌表达;对于同一蛋白,细胞内与分泌表达的蛋白的纯化在预处理方式上有差别(即细胞内表达需要进行破菌处理),纯化的后续步骤相似。
作为本发明的优选方式,所述的rAg85A的纯化可如下进行:先将破菌上清经过疏水层析介质,收集洗脱下rAg85A蛋白洗脱溶液,并将此洗脱液通过阴离子交换介质,梯度洗脱获得高浓度的rAg85A蛋白溶液。最后将其通过分子筛层析,就可以获得高纯度的rAg85A蛋白。
作为本发明的优选方式,所述的rAg85B的纯化可如下进行:选择疏水层析介质作为第一步层析,收集含rAg85B的目的洗脱液,向该洗脱液中加入钠盐(如,NaCl等),再上螯合层析介质,收集该步骤的流出液再上疏水层析介质,该步骤中获得洗脱液经过阴离子交换介质后,梯度洗脱就可以得到高纯度的rAg85B蛋白。
作为本发明的优选方式,所述的rAg85C的纯化可如下进行:酵母表达的rAg85C形成了包涵体,按照纯化包涵体的常用方法将复性后的rAg85C溶液通过疏水层析介质,就可以洗脱出纯度比较高的rAg85C溶液,再通过阴离子交换介质,就可以获得高纯度rAg85C蛋白。
作为本发明的优选方式,所述的rAg85D的纯化可如下进行:破菌上清通过疏水层析介质,洗脱出含rAg85D的目的峰,再通过阴离子交换介质,按梯度洗脱,就可以获得高纯度的rAg85D蛋白。
本发明中所描述到个各种层析介质,都是目前科研和生产中常用的商业化产品,如GE Healthcare、Merck Biosciences、TOSOH Bioscience LLC、Bio-Rad、PALL等生产厂家都有相应的各种类型的层析介质,使用他们生产的离子交换、疏水和金属螯合层析介质都可以采用相似的层析步骤,只需要调整缓冲液的pH或电导率等就可以纯化出特定的目的蛋白。
组合物
本发明还提供一种组合物,优选的是组合物是疫苗,所述的疫苗是指将本发明的rAg85com和药学上可接受的载体混合后获得的可用于预防分枝杆菌感染的疫苗。所述的药学上可接受的载体例如佐剂。所述的疫苗可用于哺乳动物(如人),通常可制成口服剂或注射剂的形式。
结核病疫苗的研制过程中,佐剂的选择非常关键,应该兼顾细胞和体液免疫,特别是细胞免疫能力。本发明人将rAg85Com与不同佐剂组合,在动物模型中初步测定引起的细胞和体液免疫强度,检测疫苗的保护效力,确定rAg85Com与铝佐剂、CpG、双十八烷基二甲基溴化铵(DDA)、Montanide ISA720的组合能诱导受试动物最理想的保护作用。
作为本发明的优选方式,所述的疫苗可以选自如下的组合:(1).rAg85Com与铝佐剂组合;(2).rAg85Com与铝佐剂、CpG组合;(3).rAg85Com与DDA、CpG佐剂组合;(4).rAg85Com与铝佐剂及DDA+CpG佐剂组合;(5).rAg85Com与ISA-720佐剂组合;(6).rAg85Com与ISA-720、CpG佐剂组合;(7).rAg85Com与ISA-720、DDA+CpG佐剂组合;或(8).rAg85Com与聚肌苷-聚胞苷(PolyI:C)佐剂组合。
其中,铝佐剂是一种传统佐剂,其制备和检测方法都是本领域已知的。CpG是一类脱氧核苷酸片段,它能诱发动物体天然的免疫反应;作为本发明的优选方式,本发明人设计了人工全合成一段分子内含有8个CpG序列,由47个碱基组成的脱氧核苷酸片段,并命名该片段为CpG-ODN/TBV-WX,其全序列如SEQ ID NO:14所示。通常CpG都是同其他佐剂混合使用,所以本发明人尝试了将CpG-ODN/TBV-WX添加到铝佐剂、DDA佐剂、MontanideISA-720佐剂中的研究。DDA(双十八烷基二甲基溴化铵)是一种阳离子表面活性剂,通常作为杀菌用途,它在溶液中可以形成“油包水型”微球,将抗原蛋白或DNA分子包裹其中。ISA-720是Seppic公司(法国)的商品化疫苗佐剂,已经在疟疾疫苗的研究中被选用。聚肌苷-聚胞苷(PolyI:C)是一种广谱的抗病毒类药物,也可作为佐剂。除非另外提供或说明,本发明所用的佐剂或制备佐剂的材料均可通过商购的途径获得。
可随免疫动物的种类不同调节rAg85Com和佐剂的使用剂量以及它们之间的使用比例。rAg85Com和佐剂的使用量还可参考临床或其他标准,通常在用于人时,rAg85Com的使用量在10μg~5mg。最佳使用量以能引起人体发生最佳体液和细胞免疫的最低抗原剂量为准。所述的rAg85Com与佐剂或佐剂组合的比例通常在(1-100):(1-100);优选的在(1-50):(1-50);更优选的在(1-20):(1-20);如比例可以是1:1;1:10。
可通过试验来确定合适的剂型和剂量,检测不同佐剂类型rAg85Com在受试动物中的免疫反应的方式例如如下:
(1).免疫方式:采用肌肉或皮下注的方法免疫豚鼠三次,每次之间间隔3周。每次每只豚鼠的后腿注射0.5mL待测试的抗原、佐剂或疫苗。
(2).细胞免疫反应:分别在免疫后的第3和6周时,从被免疫豚鼠的脾脏中按标准方法,分离出外周血单核细胞(PBMC),并稀释到2×105的细胞浓度,分别培养于96孔板中,每孔200μL,培养后用不同的抗原(rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D和rAg85Com)重新刺激培养的细胞,加入抗原约72小时后取培养孔中的上清,用Elisa法测定上清中IFN-γ含量的高低,确定抗原诱导的细胞免疫强弱。
(3).体液免疫反应:抗体分析采用常规的免疫操作方法,用纯化的四种抗原蛋白包被96孔板,采用Elisa法测定被免疫豚鼠血清的抗体滴度。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室指南(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
实施例1 工程菌的构建
1.fbpA、fbpB、fbpC和fbpD基因的设计与合成
a.制备含有信号肽编码序列的全基因序列
根据GeneBank中公开的Mtb H37Rv全基因组序列中有关Mtb分泌表达的Ag85Com中的Ag85A(SEQ ID NO:1)、Ag85B(SEQ ID NO:2)、Ag85C(SEQ ID NO:3)和Ag85D(SEQ IDNO:4)四种蛋白的氨基酸序列信息,经反复试验找到甲醇酵母菌喜好的密码子,委托上海生工生物工程公司(Sangon)人工全合成其天然的全基因序列(包含信号肽部分的编码序列)fbpA(SEQ ID NO:5)、fbpB(SEQ ID NO:6)、fbpC(SEQ ID NO:7)和fbpD(SEQ ID NO:8)全基因序列。常规方法在各基因的5.-端设计DNA限制性内切酶AsuII识别序列TTCGAA,为增强基因的转录效率,又特别在AsuII(TTCGAA)和基因的起始密码子ATG之间插入三个腺嘌呤碱基序列(AAA,用以增强表达效率);3.-端设计了TAA和TAG双终止密码子,以及紧随其后的DNA限制性内切酶NotI位点GCGGCCGC。人工全合成的基因均亚克隆到通用质粒载体pUC57(华美生物工程公司)中,从而用AsuII和NotI双酶切就可获得5.-端为AsuII,而3.-端为NotI的fbpA、fbpB、fbpC和fbpD基因。
b.制备糖基化位点突变的蛋白
为保证分泌表达获得Ag85Com中的成分不发生酵母类型的N-糖基化修饰,可用常规方法将编码基因中糖基化相关位点进行点突变,获得不含N-糖基化修饰的突变型mut-fbpA、mut-fbpB、mut-fbpC和mut-fbpD基因,利用酵母分泌表达突变型Ag85Com蛋白。
c.制备成熟蛋白的基因序列
利用合成的引物,通过PCR的方法,从完整的fbpA、fbpB、fbpC和fbpD基因中获得不含信号肽的成熟蛋白部分的DNA序列,另在每个DNA序列的5.-端添加起始密码子ATG,5.-端设计DNA限制性内切酶AsuII识别序列TTCGAA,为增强基因的转录效率,在AsuII(TTCGAA)和起始密码子ATG之间还插入AAA碱基序列;3.-端设计TAA和TAG双终止密码子,以及紧随其后的DNA限制性内切酶NotI位点GCGGCCGC。最后PCR获得四个成熟蛋白的基因序列如ag85a(SEQ ID NO:10)、ag85b(SEQ ID NO:11)、ag85c(SEQ ID NO:12)和ag85d(SEQ ID NO:13)。
2.表达载体构造
a.分泌表达型载体
甲醇酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZαA(Invitrogen)的α-信号肽DNA序列前有内切酶AsuII(TTCGAA)位点,多克隆位点(MCS)中有NotI切点。利用AsuII和NotI双切pPICZαA载体,就可以获得不含α-信号肽和MCS序列,而其他调控序列(如,5.-端AOX1启动子,3.-端终止序列等)都完整的pPICZ-AsuII/NotI载体片段。该载体片段中可插入经AsuII-NotI双切出的fbpA、fbpB、fbpC和fbpD基因,构造出pPICZ-fbpA、pPICZ-fbpB、pPICZ-fbpC和pPICZ-fbpD四个分泌型表达载体。因为插入的基因(fbpA、fbpB、fbpC和fbpD)都有自身信号肽序列,可以利用自身信号肽在酵母菌中进行分泌表达,此时表达的蛋白将发生程度的不同的N-糖基化修饰。
如果只是利用表达载体的α-信号肽,则采用常规方法重新设计引物,按照pPICZαA载体的标准操作就可以获得在甲醇酵母中分泌表达的Ag85A、Ag85B、Ag85C和Ag85D蛋白,不过此时表达的蛋白也都将发生程度不同的N-糖基化修饰。具体是:Ag85A的N203位,Ag85B的N31、N203、N213和N259位,Ag85C的N90、N167、N201、N211、N235和N257位以及Ag85D的N143、N189位点等处会发生修饰,其中的氨基酸残基的编号是按成熟蛋白的氨基酸序列。
也可以按常规分子生物学操作,通过PCR的方法突变各基因中的N-糖基化位点,将氨基酸N突变成不会发生修饰的Q或A等氨基酸残基,获得不会发生修饰的突变型Ag85A、Ag85B、Ag85C和Ag85D蛋白。
b.细胞内表达型载体
而将上述获得的ag85a、ag85b、ag85c和ag85d基因,经过AsuII和NotI双切后,插入经AsuII和NotI双切的pPICZαA载体中,就能构造出pPICZ-ag85a、pPICZ-ag85b、pPICZ-ag85c和pPICZ-ag85d四个酵母细胞内表达型载体。
3.菌种的诱导表达筛选
将按照分子生物学的常规操作,先将前述制备获得的各重组载体进行全基因测序,确认序列完全正确后,用SacI线性化处理,转化甲醇酵母宿主菌X33(购自Invitrogen)感受态细胞,铺YPDZ(YPD+500μg/mL Zeocin)平板,挑选阳性克隆,先在YPD培养液中增殖,再转入BMMY诱导培养液中,诱导约30小时,以诱导前菌体为对照,电泳分析诱导后菌体总蛋白,选择表达量高的用于在发酵罐中大规模发酵。
试验例1 构建分泌型表达Ag85D的工程菌株
a.目的基因的获得
采用甲醇酵母喜好密码子,分别设计了Mtb的fbpA、fbpB、fbpC和fbpD四种蛋白的全基因序列,委托上海生工生物工程有限公司(Sangon)全基因合成这四条基因,四条基因都插入到通用的载体pUC57中,基因的5.-端有AsuII位点,而3.-端有NotI位点。以pUC57-fbpD为例,则先培养含pUC57-fbpD质粒的DH5α菌,抽提质粒,用AsuII/NotI双切,胶回收长度约920bp的酶切DNA片段(fbpD基因)作为插入载体中基因。
b.表达载体的构建
用AsuII/NotI双切pPICZαA载体,切除α-信号肽和多克隆位点序列(MCS),回收载体pPICZ-AsuII/NotI大片段,作为插入用载体。将fbpD和pPICZ-AsuII/NotI建立如下连接反应(总体积10μL):pPICZ-AsuII/NotI(载体)2μL;fbpD(基因)4μL;T4连接缓冲液(10×)1μL;T4连接酶(10Weiss Unit/μL)0.5μL;dH2O 2.5μL。
25℃,连接60分钟,65℃灭活T4连接酶10分钟后,转化CaCl2法制备的NovaBlue(Novagen)感受态细胞,铺LB+1.5%Agar+25μg/ml Zeocin平板,挑选阳性克隆,AsuII/NotI双酶切筛选并用5AOX1或3AOX1通用引物(Sagon)确认fbpD基因序列以及插入位点两端序列正确无误。
c.工程菌的表达筛选
将构建成功的细胞内表达载体pPICZ-fbpD,用SacI线性化处理,按Invitrogen操作手册中的标准操作电转化(Minopeot)甲醇酵母宿主菌X33,铺含有Zeocin的YPDZ(YPD+1.5% Agar+500μg/ml Zeocin)平板,倒置平板于30℃下培养3~4天,挑选平板上的单克隆进行诱导表达筛选。
用YPD培养液增殖阳性克隆,约6~8小时,当菌体OD600达到2~3时,保存一份菌液为暂留菌种,并将其余菌液4000rpm离心,上清冻存作诱导前对照。将菌体悬浮后转入诱导培养液BMMY,300rpm振荡培养,每过24小时补无水甲醇至甲醇之终浓度为0.5%,如此维持甲醇诱导状态约48小时。用诱导前上清作对照,电泳检测诱导后发酵上清中rAg85D蛋白条带出现。选择多个克隆,挑选上清中表达产量高的菌落作为发酵用工程菌株,命名为SigD-Ag85D/X33(SigD代表fbpD基因的信号肽序列)。获得酵母工程菌发酵分泌表达rAg85D的情况如图1A。
分泌型表达Ag85A、Ag85B、Ag85C的工程菌株的建立方法基本同Ag85D。
d.分泌表达的rAg85D的N-端测定
fbpD基因在甲醇酵母中可以利用自身的信号肽序列进行分泌表达,但是上清中的rAg85D蛋白SDS-PAGE电泳时有两条非常靠近的蛋白条带,其表观分子质量均大于30kDa,采用质谱法测定发酵上清中rAg85D的分子质量为30.26kDa和31.84kDa,比Ag85D的理论值(27.81kDa)略大。将其转PVDF膜,分别测定N-端氨基酸序列,发现两条带中的蛋白N-端都不均一,分别有A-E-P-T-A-K-A-A-P-Y-和A-P-Y-E-N-L-M-V-P-S-两个N-端。这表明,利用fbpD基因自身信号肽序列在甲醇酵母中分泌表达时,出现两条带的原因既有N-端不均一的原因,也有N-型糖基化修饰程度差别的因素。甲醇酵母分泌表达Ag85D蛋白时,蛋白天然信号肽序列的切除方式同Mtb自然状态下分泌方式相似,也都产生了有两种类型N-端Ag85D蛋白,只是Mtb分泌表达的Ag85D蛋白没有发生糖基化修饰,而在酵母系统分泌表达时产生的rAg85D蛋白有糖链修饰。
因此,在设计在细胞内表达rAg85D蛋白时,应考虑在第2个信号肽切点,即从A-P-Y-E-N-L-M-V-P-S-处作为Ag85D的起始点,以避免细胞内表达时N-端不均一。
试验例2.构建点突变修改N-糖基化位点且分泌表达Ag85D的工程菌株
a.目的基因的PCR定点突变
根据试验例1中分泌表达的rAg85D蛋白有N-糖基化修饰,本发明人设计对Ag85D中的两个N-糖基化位点突变的引物:
通过PCR方法,将Ag85D中第一个糖基化位点N143-T-T(位点以成熟Ag95D蛋白的氨基酸序列计)中的N突变为Q时所用的引物:
QTT-P5(Sangon No AA90805):5’-ggt ttc ttg tac cca tcc caa acc acc-3’(SEQ ID NO:15);QTT-P3(Sangon No AA90806):5’-ggt ggt ttg gga tgg gta caa gaa acc-3’(SEQ ID NO:16)。
将第二个糖基化位点N180-N-T(位点以成熟Ag95D蛋白的氨基酸序列计)中的N突变为Q时所用的PCR引物是:QNT-P5:5’-caa caa aac acc aga gtc tgg gtc tgg tcc-3’(SEQ ID NO:17);QNT-P3:5’-gga cca gac cca gac tct ggt gtt ttg ttg-3’(SEQ ID NO:18)。
以试验例1中构建的pPICZ-fbpD载体为模板,用通用引物5AOX1、3AOX1以及上述的QTT-P5、QTT-P3、QNT-P5和QNT-P3四条引物,对fbpD基因进行分段PCR,修改其中的N-糖基化位点氨基酸残基N密码子AAC为CAA(Q),最后获得了无N-糖基化位点的突变型mut-fbpD基因(SEQ ID NO:9)。
b.表达载体的构建
表达载体pPICZ-mut-fbpD的构建与试验例1中pPICZ-fbpD构建相似。
c.工程菌的表达筛选
分泌表达工程菌的筛选同试验例1也相似,最后获得的工程菌命名为mut-Ag85D/X33,其分泌表达无糖基化修饰的突变型Ag85D(r-mut-Ag85D)蛋白的情况如图1B。
d.分泌蛋白的质谱和N-端测定
分泌到发酵液中的无糖基化位点的mut-Ag85D蛋白仍然是两条带,质谱测定分子量不同的两种蛋白:28566.73Da和27858.12Da。
N-端测序发现,分子量偏大的蛋白条带前10个氨基酸序列是A-E-P-T-A-K-A-A-P-Y-,而分子量偏小的蛋白条带前10个氨基酸序列是:A-P-Y-E-N-L-M-V-P-S-,两者N-端相差A-E-P-T-A-K-A共7个氨基酸残基。
而采用类似方法表达的突变修改N-糖基化位点,且分泌表达的Ag85A、Ag85B、Ag85C工程菌株,实际所分泌表达的Ag85A、Ag85B和Ag85C都没有出现N-端不均一的情况,其N-端序列前15个氨基酸残基均为:F-S-R-P-G-L-P-V-E-Y-L-Q-V-P-S-。
试验例3.构建细胞内表达Ag85A的工程菌株
a.目的基因的获得
用Sangon合成的pUC57-fbpA载体或亚克隆方式构建的pPICZ-fbpA分泌表达载体为模板,用重新合成的如下引物:Ag85A-P5:5-cat ttc gaa aaa atg cat ttg gtt gac aga gtt-3(SEQ IDNO:19);Ag85A-P3:5-catgcg gcc gct att aag cac ctt gtgg-3(SEQ ID NO:20)。
通过PCR的方法,获得成熟的Ag85A蛋白所对应的DNA(基因)序列(SEQ ID NO:10,为与fbpA基因区别,特将此DNA片段称ag85a基因(用小写斜体表示,以区别Ag85A蛋白)。将PCR产物先进行柱回收,再用AsuII/NotI双酶切后胶回收ag85a基因片段,作为连接反应用。
b.表达载体的构建:采用与试验例1类似的方式构造pPICZ-ag85a细胞内表达载体。
c.工程菌的表达筛选
大体构建成功的细胞内表达载体pPICZ-ag85a,用SacI线性化处理,按Invitrogen操作手册,用Cell-Porator型电转化仪(Gibco BRL Life Technologies,USA),按标准操作电转化甲醇酵母宿主菌X33,铺含有Zeocin的YPDZ(YPD+1.5% Agar+500μg/mlZeocin)平板,倒置平板于30℃下培养3~4天,挑选平板上的单克隆进行诱导表达筛选。
用YPD培养液增殖阳性克隆,约6~8小时,当菌体OD600达到2~3时,保存一份200μL菌液为暂留菌种,另一份100μL菌液中的菌体冻存,作为诱导前菌体对照,并将其余菌液4000rpm离心,收集转接于诱导培养液BMMY中,300rpm振荡培养,约24~30小时时,取少量菌体。将此时的菌体与诱导前冻存的菌体用1×Lyticase缓冲液悬浮,各加入2μL的Lyticase(酵母破壁酶,Tiangen公司),混匀25℃约2小时,加入等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲溶液,煮沸约5分钟,再高速离心5分钟,取上清。SDS-PAGE电泳检测诱导前后菌体总蛋白条带的区别,确定细胞内表达情况。以此方法选择多个克隆,用表达产量最高的为菌种,命名为rAg85A/X33。
而构造细胞内表达Ag85B、Ag85C、Ag85D的工程菌株的方式与Ag85A基本同,分别命名为rAg85B/X33、rAg85C/X33和rAg85D/X33,其诱导表达目的蛋白前后的SDS-PAGE电泳图谱如图2。
实施例2 发酵罐发酵
试验例1.分泌表达的工程菌发酵(以Ag85D的表达为例)
发酵种子液的准备:将2支甘油管保存的1ml/管装的Ag85D/X33菌种按1∶500的比例,转接入1瓶装有1000mL YPD培养液的3L摇瓶中,30℃,300rpm培养24小时,使OD600达5.0~7.0,镜检证实酵母形态正常且无杂菌污染后,作为上罐用种子液。
在30L发酵罐中,发酵罐中的初始基础盐培养基BSM(85% H3PO4 26.7ml/L、CaSO40.93g/L、K2SO4 18.2g/L、MgSO4·7H2O 14.9g/L、KOH 4.13g/L、甘油40g/L)体积为15L,121℃灭菌30分钟,用氨水将pH值调为5.0,起始转速300rpm,通气量1.0vvm,添加30mL微量元素培养基PTM1(CuSO4·5H2O 6.0g/L、NaI 0.08g/L、MgSO4·H2O 3.0g/L、Na2MoO4 ·2H2O0.2g/L、H3BO3 0.02g/L、CoCl2 0.5g/L、ZnCl2 20.0g/L、FeSO4·7H2O 65.0g/L、Biotin 0.2g/L、H2SO45ml)。将种子液按1:15接种,进行分批培养,菌体增殖阶段温度为30.0℃,当罐培养基中的甘油耗尽后,溶氧(DO)值急剧上升。开始甘油补料阶段,初始设定甘油补料速度为150mL/h,补料2小时后设定甘油补料速度为350mL/h,流加2~4个小时,通过调节搅拌转速、罐压、空气流量、使DO不低于20%。至菌体湿重达到180~200g/L,用氨水将pH值调为6.2。开始补入甲醇进行甲醇诱导表达,最初甲醇加入量控制在15~20mL/小时,缓慢增加甲醇的加入量持续约3小时,再将甲醇加入量提高至120mL/小时。通过调节搅拌转速、罐压、空气流量使溶氧不低于20%,并保持此补加甲醇状态跃64小时,结束发酵,8000rpm离心15分钟,收集发酵上清。
分泌表达Ag85A、Ag85B、Ag85C的工程菌发酵方法基本同分泌表达Ag85D的工程菌发酵方法。
试验例2.细胞内表达的工程菌发酵
前述获得的可细胞内表达的重组菌种分别命名为rAg85A/X33、rAg85B/X33、rAg85C/X33和rAg85D/X33,它们进行发酵的过程基本相同。
将种子液按1:15接种量接入装有15L BSM培养基的发酵罐中,整个发酵的可分三个阶段:①菌体增殖培养阶段:生长温度30℃,起始转速300rpm培养,通气量15L/min,用氨水调将pH值调为5.0,通过调节转速、通气量、罐压维持溶氧(Dissolved Oxygen,DO)值不低于20%。约20小时左右,DO值迅速上升,菌体湿重约120g/L时表明此阶段结束。②甘油补料的菌体增殖阶段:以150~350mL/h的速率补加50%的甘油溶液,补加约4小时至菌体湿重约200g/L时。停止补料,DO值上升,维持此状态(饥饿)半小时,同时用氨水将pH值调为6.0,准备诱导。③诱导表达阶段:缓慢增加甲醇的加入量,待其适应后,以120mL/h的速率补加,同时维持DO值不低于20%,调pH为5.0,温度保持在25~28℃,诱导约28~32小时,结束发酵后8000rpm离心15分钟,收集菌体。
按上述方法获得的四种抗原在诱导前后细胞内表达情况见图2。
实施例3 细胞内表达产物的具体纯化过程
纯化前的破菌处理:发酵获得的重组酵母菌体采取相同的破菌方式,先用0.1MTris/HCl,pH8.0缓冲液,按湿菌体与破菌缓冲液为1:10(g/V)的比例悬浮菌体,用ATS工业系统有限公司(上海)的AH-100B型高压均质机破菌,破菌压力为1200bar,保证整个破菌过程中破菌液的温度不超过25℃,循环破菌三次,镜检破菌效率不低于90%,高速离心收集的破菌上清或沉淀。对于rAg85A/X33、rAg85B/X33和rAg85D/X33菌体的破菌上清,目的蛋白在破菌上清中,需要用膜(Satorious)过滤破菌上清,收集上清进行后续层析纯化,而rAg85C/X33菌的rAg85C蛋白(包涵体)在菌沉淀之中,则弃上清,收集离心沉淀进行后续纯化。
a.rAg85A的纯化
先将破菌上清经过疏水层析介质,选择Octyl Sepharose FF疏水层析,平衡及捕获缓冲液为20mM Tris/HCl,pH8.0,用H2O可以洗脱下rAg85A蛋白。将此洗脱液加入20mMPB,pH8.0,通过Q-Sepharose FF阴离子交换,可以用20mM PB,pH7.0缓冲液洗脱出高浓度的rAg85A蛋白溶液。最后将其通过Supedex75分子筛层析,用20mMPB,pH7.0缓冲液洗脱,收集主峰,从而获得高纯度的rAg85A蛋白。
b.rAg85B的纯化
向破菌液中加入20mM Tris/HCl,2M NaCl,pH8.0母液,至终浓度20mM Tris/HCl,0.5M NaCl pH8.0,先经过疏水层析介质,选择Octyl Sepharose FF疏水层析,平衡及捕获缓冲液为20mM Tris/HCl,0.5M NaCl,pH8,用20mM Tris/HCl,0.3M NaCl,pH8.0除杂洗脱后,用20mM Tris/HCl,pH8.0缓冲液洗脱出含rAg85B的目的峰。向该洗脱液中加入NaCl母液至终浓度为0.5M,上螯合层析介质(如,Ni2+-ChelatingSepharose FF,Cu2+-ChelatingSepharose FF等),此步骤的结合缓冲为20mM Tris/HCl,0.5M NaCl,pH7.5,直接收集流出液再上Octyl Sepharose FF疏水层析,可用20mM Tris/HCl,pH8.0缓冲液洗脱出rAg85B目的峰。最后将收集的洗脱峰通过Q Sepharose FF阴离子交换层析,此步骤的结合缓冲液为20mM Tris/HCl,pH8.0,用20mM Tris/HCl,0.1M NaCl,pH8.5缓冲液除杂,用20mM Tris/HCl,0.5M NaCl,pH8.0缓冲液洗脱出高纯度的rAg85B蛋白。
c.rAg85C的纯化
甲醇酵母细胞内表达的rAg85C形成了类似包涵体的沉淀,对rAg85C的纯化采用了纯化包涵体的常用方法:先用0.1M Tris/HCl,8M尿素,pH8.5裂解液溶解沉淀(包涵体),用0.1M Tris/HCl,20%Glycerol,1mM EDTA,1mM GSH,0.1mM GSSG,pH8.5复性缓冲液稀释裂解液,4℃下复性约60小时。将复性液用膜(Satorious)过滤,上清通过Octyl Sepharose FF疏水层析,上样及平衡缓冲液为50mM Tris/HCl,pH8.0,用H2O洗脱出含rAg85C的目的峰。收集的目的峰通过Q Sepharose FF阴离子交换层析,此步骤的平衡缓冲液为20mM Tris/HCl,pH8.0,除杂缓冲液为20mM Tris/HCl,0.1M NaCl,pH8.0,用20mM Tris/HCl,0.25M NaCl,pH8.0洗脱出高纯度的rAg85C目的蛋白。
d.rAg85D的纯化
将经过预处理后的破菌上清通过预先用20mM Tris/HCl,pH8.5缓冲液平衡过的PhenylSepharose 6 FF(HS)疏水层析介质,用水洗脱出含rAg85D的目的峰,将此洗脱峰收集到的rAg85D溶液通过Q Sepharose FF阴离子交换层析,此步骤的平衡及捕获缓冲液为20mMTris/HCl,pH8.5,除杂缓冲液为20mM Tris/HCl,0.075M NaCl,pH8.5,用20mM Tris/HCl,0.2M NaCl,pH8.5洗脱出高纯度的rAg85D蛋白。
通过上述步骤纯化获得的rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D蛋白的SDS-PAGE电泳如图3。
实施例4细胞内表达的重组蛋白rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D性质鉴别
1.分子量
通过还原和非还原SDS-PAGE电泳,根据标准蛋白分子量标准,初步估计rAg85A、rAg85B和rAg85C的表观分子质量约30kDa,而rAg85D约27~28kDa。
采用MALDI-TOF测定四种在甲醇酵母细胞内表达的重组蛋白的分子量,其结果分别为rAg85A:31642.5Da、rAg85B:30613.2Da、rAg85C:32108.4Da和rAg85D:28390.4Da。
2.N-端氨基酸序列
委托北京大学生命科学院,用Applied Biosystems公司的Procise491蛋白测序仪,Edman降解法测定四种蛋白的N-端序列,其结果如下:
rAg85A的N-端蛋氨酸已经在蛋白的翻译修饰阶段被切除,前5个氨基酸残基测定结果表明甲醇酵母细胞内表达的rAg85A有两个N-端,分别是:S-R-P-G-L-和R-P-G-L-P-,相差一个氨基酸残基。
rAg85B的N-端蛋氨酸也已经在蛋白翻译修饰时被切除,测定前25个氨基酸残基的结果表明,rAg85B的N-端也不均一,分别是:F-S-R-P-G-L-P-V-E-Y-L-Q-V-P-S-P-S-M-G-R-D-I-K-V-Q-和S-R-P-G-L-P-V-E-Y-L-Q-V-P-S-P-S-M-G-R-D-I-K-V-Q-F-两个N-端,相差一个氨基酸残基。
有关rAg85A和rAg85B的N-端不均一的现象,有研究者也报道了某些分枝杆菌表达的类似蛋白也存在此种情况,但对Mtb分泌的Ag85A或Ag85B的是否也有不均一的问题并没有报道。
rAg85C的N-端蛋氨酸在翻译后未被切除,N-端均一,前32个氨基酸残基是:M-F-S-R-P-G-L-P-V-E-Y-L-Q-V-P-S-A-S-M-G-R-D-I-K-V-Q-F-Q-G-G-G-P-,甲醇酵母细胞内表达的rAg85C比Mtb自然分泌表达的Ag85C在N-端多一个蛋氨酸残基。
rAg85D的N-端蛋氨酸已经在翻译修饰阶段被切除,且N-端均一,前5个氨基酸残基是:A-P-Y-E-N-,这与Mtb产生的Ag85D(MPT51或FbpD)完全一样。
3.分枝菌酰基转移酶活性
根据常规的分枝菌酰基转移酶活性的测定方法,测定rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D,以及rAg85Com的分枝菌酰基转移酶活性,发现rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85Com都有催化分枝菌酰基转移的活性,而rAg85D没有该酶活性。具体方法如下:
先将600μg的TMM(分枝菌酰海藻糖单酯)溶于1.2mL 0.1M磷酸钾缓冲溶液,pH7.5,0.1mM DTT中形成TMM悬乳液,将该悬乳液平分为200μL/管,共6份。1份为对照,仅加入H2O,而其余5份分别加入100μg的rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D和rAg85Com,充分混合后再加入14C-海藻糖(100nmol,30.4mCi/mmol),混匀后37℃下温育30分钟。分别向每份反应样品中加入2mL三氯甲烷:甲醇(2:1)和300μL水,充分混匀后离心,弃上层水相,收集下层有机相,用0.4mL的三氯甲烷:甲醇:水(3:47:48)洗涤收集的有机相两次,最后用氮气流干燥,有机相中的干物质含有分枝菌酰基转移酶催化反应的产物。用薄层层析(TLC)-放射自显影的方法分析有机相干物质,使用硅胶TLC板,溶剂相为三氯甲烷:甲醇:氨水(80:20:2),薄层层析结束后,用KODAK公司的BioMax Light胶片-70℃条件下曝光16小时。用10% α-萘酚,5%硫酸乙醇溶液喷在层析完成后的硅胶板上,110℃加热即可以看到TDM和TMM标准品的条带位置。
4.纤维连接蛋白结合能力
分别用rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D蛋白包被24孔酶标板,以人纤维连接蛋白、以及HRP-人纤维连接蛋白多抗,采用双夹心法,测定四种重组蛋白的结合人纤维连接蛋白能力,发现它们都有结合能力。具体如下:
试验中所用试剂与仪器:血浆纤维连接蛋白(Fibronectin,Human Plasma,Chemicon,USA),兔抗纤维连接蛋白多抗(abcam,UK),HRP-标记抗兔IgG(晶美生物,中国),96-孔板(COSTAR,USA);MK3酶标仪(Thermo,USA)。具体操作过程:①抗原包板,每孔分别加入纯化制备最终稀释浓度均为20μg/mL的rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D抗原,另设计两组:一组加入20μg/mL的血浆纤维连接蛋白作为阳性对照,一组仅加入20mmol/LPB,pH7.4稀释缓冲液100μl作为阴性对照,封闭;②血浆纤维连接蛋白与抗原结合反应:分别加入血浆纤维连接蛋白(10μg/mL)各100μl,37℃孵育2小时,洗板;③兔抗纤维连接蛋白多抗与纤维连接蛋白反应:向各孔中加入兔抗纤维连接蛋白多抗,37℃孵育2小时,洗板;④显色反应:向各孔中加入HRP-标记抗兔IgG(1:200)100μl,37℃孵育2小时,再加入底物DAB,37℃避光放置10分钟,加入硫酸终止反应。在MK3酶标仪中读取OD450值。如样品OD450值与阴性对照的比值大于或等于2.1,则为阳性。测定结果显示:rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D样品均呈阳性,即rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D四种抗原均能同人血浆纤维连接蛋白结合。
实施例5 rAg85Com体外组合
本发明人分别以表1中所示的比例混合rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D四种蛋白,在体外组成rAg85Com。
表1
| Ag85A:Ag85B∶Ag85C∶Ag85D比例(重量比) |
rAg85Coml | 2∶3∶1∶2 |
rAg85Com2 | 2∶4∶2∶3 |
rAg85Com3 | 1∶1.8∶1.1∶1.4 |
rAg85Com4 | 1∶2.1∶1∶1.6 |
rAg85Com5 | 1∶2∶0.9∶1.3 |
rAg85Com6 | 1∶1.2∶0.7∶1.2 |
其中,rAg85Com1、rAg85Com2复合体的SDS-PAGE电泳见图3;四种蛋白和由它们组成的rAg85Com1和rAg85Com2在SEC-HPLC分析的结果如图6,rAg85Com复合物分子所处的缓冲体系是20mM PB,pH7.0~7.4。
此外,在进行体外组合时,本发明人还在混合体系(各重组蛋白按比例溶于pH7.0的PB缓冲液中)中添加终浓度为2mmol/L Cu2+、12mmol/L Cu2+、12mmol/L Cu2+18mmol/L Cu2+;或6mmol/L、15mmol/L Ni2+;或10mmol/L Zn2+。结果发现,各混合体系在添加金属离子后,可更快地形成的复合体分子,并且形成的复合体分子比不加入金属离子时稳定。并且,形成的rAg85Com2、rAg85Com3、rAg85Com4、rAg85Com5比rAg85Com1更为稳定,其中最稳定的是rAg85Com2。
分泌表达的有糖基化修饰的Ag85A、Ag85B、Ag85C和Ag85D由于分子量大,糖基化修饰后,蛋白的某些表位被覆盖,很难作为理想的抗原,而突变过mut-Ag85A、mut-Ag85B、mut-Ag85C和mut-Ag85D同细胞内表达的四种抗原的性质类似。
实施例6rAg85Com、rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D单独免疫小鼠后产生IFN-γ水平比较
1.组别与剂量
单抗原和多价抗原均用磷酸缓冲液配制,不添加任何抗原成分,不论单抗原或多价抗原,每只小鼠每次总抗原使用剂量为24μg。
单抗原四组:rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D(各24μg);
二价抗原一组:rAg85A+rAg85B(各12μg);
三价抗原一组:rAg85A+rAg85B+rAg85C(各8μg);
四价抗原第一组:rAg85Com1(6μg rAg85A+9μg rAg85B+3μg rAg85C+6μg rAg85D);
四价抗原第二组:rAg85Com2(4.2μg rAg85A+8.4μg rAg85B+4.2μg rAg85C+6.3μg rAg85D);
阳性对照组:卡介苗(BCG)(每只小鼠0.1mg)。
2.免疫与检测步骤
每组10只豚鼠,雌雄各半并分笼饲养,每组小鼠免疫后第21天,处死小鼠,取血和脾脏,离心血液收集血浆用于测定抗体滴度,按标准方法脾脏中的T-淋巴细胞,培养,分别用该组动物免疫时使用的抗原(单或多价抗原)刺激培养的细胞,24小时后检测T-淋巴细胞培养上清中的IFN-γ水平,测定结果取平均相对值,结果如图4。
结果发现,有rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D四种抗原组成的rAg85Com效果最好,并且rAg85Com2比rAg85Com1更好,而单抗原或二价或三价抗原都不是很理想。
引起细胞免疫原性的由强到弱的次序是rAg85Com2>rAg85Com1>rAg85ABC>rAg85AB>rAg85A>rAg85D>rAg85B>rAg85C,并且,rAg85Com比rAg85A高100倍。而引起体液免疫反应的强弱,按照产生的抗体滴度从1×103-2.5×106,由高到低的排序是:rAg85Com2≥rAg85Com1>rAg85Com>rAg85ABC>rAg85D>rAg85AB>rAg85A=rAg85B>rAg85C。
rAg85Com1刺激豚鼠产生的抗体滴度比rAg85A高1000倍,rAg85Com2较rAg85Com1的免疫原性更高,抗体滴度高10倍。
实施例7 几种含有rAg85Com的TBV疫苗制备及免疫反应测定
用提外装配成的rAg85Com抗原,与不同的佐剂组合,共形成6种疫苗制剂,免疫豚鼠,检测体液和细胞免疫效果。
[疫苗TBV1].抗原rAg85Com与铝佐剂、CpG佐剂组成的疫苗
1.铝佐剂的制备:配制50mL的7.912% AlCl3溶液,并经的膜过滤,再配制50mL的7.112%的NaOH溶液。量取150ml注射用水,倒入500mL的干烤过的烧杯中,加热至60℃,用Silverson L4RT型乳化仪,将转速调为6000rpm,搅拌烧杯中的注射水,用胶头滴管同时向烧杯的注射水中逐滴加入AlCl3和NaOH溶液,两种溶液最后的实际加入量约25ml,滴加结束后,整个烧杯溶液的pH约7.0,继续搅拌1小时,整个制备过程中保持溶液60℃。最后制备铝佐剂经过Malvern Hydro 2000S型粒径仪测定,确定其平均粒径为4μm,佐剂中的氢氧化铝浓度2mg/ml。
2.抗原rAg85Com与铝佐剂、CpG组合:用纯化的抗原蛋白原液和人工合成CpG(CpG-ODN/TBV-WX,序列见SEQ ID N,O:14),配制成rAg85Com+CpG溶液(每毫升含120μgrAg85A、180μg rAg85B、60μg rAg85C、120μg rAg85D和60μg CpG-ODN/TBV-WX)。将rAg85Com+CpG溶液与铝佐剂按1:1混合,用Silverson L4RT型乳化仪,转速为4000rpm,保持在室温下乳化2分钟,就制备出了rAg85Com-铝-CpG佐剂型疫苗。
[疫苗TBV2].rAg85Com与DDA+CpG佐剂组成的疫苗
1.DDA溶液的准备:按2.5mg/mL的量称取DDA(先端科技有限公司,中国厦门)加入注射用水中,在磁力搅拌器上,搅拌的同时加热到80℃,约20分钟待DDA全部溶于水中后,冷却DDA溶液至室温下备用。
2.rAg85Com与DDA+CpG佐剂组合:配制的Ag85Com+CpG溶液(每毫升含60μg rAg85A、90μg rAg85B、30μg rAg85C、60μg rAg85D和30μg CpG-ODN/TBV-WX)与铝佐剂按10:1的比例混合,用Silverson L4RT型乳化仪,转速为4000rpm,保持在室温下乳化30秒,就制备出了rAg85Com-DDA+CpG佐剂型疫苗,4℃存放备用。
[疫苗TBV3].rAg85Com与铝佐剂、DDA+CpG佐剂组成的疫苗
参照前述制备rAg85Com-DDA+CpG组合,其中各组分的含量每毫升为:120μg rAg85A、180μg rAg85B、60μg rAg85C、120μg rAg85D、60μg CpG-ODN/TBV-WX和500μgDDA。将配制的rAg85Com-DDA+CpG组合与铝佐剂按1:1混合,就制备出了rAg85Com-铝佐剂-DDA+CpG佐剂疫苗,其中每毫升中含60μg rAg85A、90μg rAg85B、30μg rAg85C、60μgrAg85D、30μg CpG-ODN/TBV-WX和250μgDDA,4℃存放备用。
[疫苗TBV4].rAg85Com与ISA720+CpG佐剂组成的疫苗
按7:3(V/V)比例,将rAg85Com原液与ISA720佐剂混合,用Silverson L4RT型乳化仪,转速为4000rpm,保持在室温下乳化3分钟,经过Malvern Hydro 2000S型粒径仪测定,其平均粒径约1μm,其中各抗原的含量随研究目的不同可以以调整为不同的浓度。
[疫苗TBV5].rAg85Com与ISA720+DDA+CpG佐剂组成的疫苗
参照前述方法制备rAg85Com-DDA+CpG组合,其中各组分的含量可以调整。将rAg85Com-DDA+CpG组合与ISA720佐剂按7:3混合,就制备出了rAg85Com-ISA720-DDA+CpG佐剂组成的疫苗,4℃存放备用。
[疫苗TBV6].rAg85Com与聚肌苷-聚胞苷(PolyI:C)佐剂组成的疫苗
聚肌苷-聚胞苷(PolyI:C)佐剂母液的制备:以制备20mL的PolyI:C佐剂母液为例,先称取8.7mg的聚肌苷酸(PolyI),7.3mg的聚胞苷酸(PolyC),用10mL的注射用水,37℃下约30分钟则全部溶解,加入10mmol/L的CaCl2溶液1mL,用注射水定容到20mL,μm的膜过滤除菌,备用。
将确定浓度的抗原rAg85Com与上面配置好的PolyI:C佐剂母液等体积混合,4℃下,磁力搅拌充分混合佐剂与rAg85Com抗原约30分钟。
将上面6组疫苗按标准操作程序免疫豚鼠(体重250~350g),每组疫苗受试动物10只,雌雄各半,雌雄豚鼠均分笼饲养:第一次免疫动物前,对每只受试动物取血作为正常对照备检;分别在第0天、21天、42天三次免疫受试豚鼠,并在第21天、42天取血备检测,而第72天时处死豚鼠,大量取血和脾脏。选择卡介苗(BCG,上海生物制品所,批号:200707001)为阳性对照疫苗,只是在其他豚鼠的第42天免疫时对受试豚鼠免疫一次,30天后,也就是待研究疫苗组动物的第72天,处死受试动物,大量取血和脾脏。检测血清中抗体滴度,并按标准操作培养脾脏T-淋巴细胞,检测培养细胞上清液中分泌出的IFN-γ相对含量高低。
结果发现,疫苗TBV3和TBV4、TBV5疫苗免疫后的豚鼠血清中抗体滴度都很高,而TBV3和TBV5所引起的细胞免疫效应最强(图5)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。