JP4713809B2 - Ｂ型肝炎コア抗原融合タンパク質 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎コア抗原融合タンパク質、タンパク質を含有する粒子、タンパク質をコードする核酸分子、タンパク質を製造する方法、タンパク質を含有する医薬組成物、及び予防的又は治療的なワクチン接種による免疫処置におけるタンパク質の使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
Ｂ型肝炎は開発国及び開発途上国の両者を通して主要な保健医療問題である。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による感染は急性又は慢性疾患をもたらし、それは症例に比例して肝細胞癌及び死に至る。ウイルスは、二重に殻に覆われ、そのＤＮＡはコア抗原（ＨＢｃＡｇ）と呼ばれるタンパク質構造で内部に保護されている。コアは、表皮又はＳ抗原（ＨＢｓＡｇ）として知られるエンベロープタンパク質によって囲まれている。ＨＢｃＡｇは、特異的ペプチドの免疫系への輸送媒体として使用することができる特別な抗原である。この抗原は、ＨＢＶの表面抗原からのエピトープ、Ａ型肝炎ウイルスからのエンベロープタンパク質及びＣ型肝炎からの抗原を包含する種々のウイルス及び細菌病原体からＴヘルパー、Ｂ及び細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）エピトープを提示するのに使用されてきた。総説として、Ｕｌｒｉｃｈら（１９９８）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５０，１４１−１８２を参照。
【０００３】
ＨＢｃＡｇは、粒子状に自己集合するタンパク質の分子構造であるので、エピトープの提示に優れた媒体である。各粒子は、単量体ポリペプチドの１８０又は２４０コピーのいずれかから生成される。この単量体は、宿主細胞の内部で適当な濃度に達すると、直径約２７ｎｍの粒子を形成する。構造研究によると、６８から９０残基以内のアミノ酸は、ｅ１ループとして知られる粒子の表面に棘構造を形成することが示されている。２つの単量体がジスルフィド結合により結合して二量体の棘（ｓｐｉｋｅ）を形成し、最も露出したアミノ酸は、第８０位（ｅ１ループの中心で）である。
【０００４】
ＥＰ−Ａ−４２１６３５（Ｔｈｅ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ）は、粒子を形成するためのタンパク質の能力を変えることなく、ｅ１ループ中に外部のエピトープを挿入させるＨＢＶコア遺伝子の修飾を記載している。この部位での挿入は、タンパク質の二量体により創生された各棘の先端に挿入されたエピトープを最大限に露出させることができる。一粒子当り各単量体の約１８０又は２４０コピーがあるので、各粒子は、関心のあるエピトープの１８０又は２４０コピーを提示することができる。
【０００５】
（発明の概要）
コア粒子の構造構築ブロックを形成するＨＢｃＡｇの二量体において、隣接したｅ１ループは近接して並んでいる。ｅ１ループに挿入された配列は、単量体のコアタンパク質中に存在するとき、組み立てられた（ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）粒子の中で立体配座的に制約を受けていることが提案されている。本発明は、例えば二量体のようなタンデムコピーとして、共有結合によってコアタンパク質を結合することによってこの問題を解決しようとするものであり、それによって各コピーにそれぞれ独立に挿入ができる。このことは、大きな配列をｅ１ループに挿入するのに特に有用である。というのは、そのような配列にはタンデムリピート当り丁度１コピーのコアタンパク質が挿入されることが許容され、それによって組み立てにおいて潜在的な立体配座の衝突を減少することができるからである。換言すれば、異なった配列をタンデムリピートの各ｅ１ループに挿入することができ、それ故エピトープ提示システムとしてのＨＢｃＡｇ粒子の自由度が増加する。
【０００６】
それ故、本発明は、ＨＢｃＡｇのタンデムコピーを含むタンパク質を提供する。タンパク質は、一般的に、ＨＢｃＡｇの２つのコピーを含む二量体である。異種エピトープは、ＨＢｃＡｇのコピーの１つ又はそれ以上のｅ１ループに挿入される。タンパク質は粒子内に組み込まれ、粒子はその表面のｅ１ループに挿入された異種エピトープを提示し、そしてヒト又は動物の予防的又は治療的ワクチン接種による免疫処置において有用である。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
タンパク質
本発明のタンパク質の基礎構築ブロックはＨＢｃＡｇであり、それはＨＢＶの亜型によって１８３又は１８５アミノ酸（ａａ）を有する。ａｙｗ亜型の１８３アミノ酸タンパク質プラス２９アミノ酸プレ配列の配列は配列番号２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）に示される。成熟ＨＢｃＡｇは、位置３０のＭｅｔ残基からＣ末端の端のＣｙｓ残基まで、位置１から２９までの配列をプレ配列として、延びている。
【０００８】
タンパク質は、一般的に、ＨＢｃＡｇの二量体がコア粒子の構造構築ブロックを形成するので、二量体を形成するＨＢｃＡｇの２つのコピーだけを含む。しかしながら、タンパク質は更にＨＢｃＡｇのコピーを含み得る。それ故、タンパク質は、ＨＢｃＡｇの２から８コピー又は２から４コピーを含み得る。２コピー以上の使用は系の自由度を増加し、例えば、３コピーの使用は、本発明のタンパク質中の３つのｅ１ループに３つの異なったエピトープが挿入されることを可能にし、それによって本発明のタンパク質により誘導される免疫応答の幅を広げる。
【０００９】
ＨＢｃＡｇの単位は、一般的に、頭と爪先（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔｏｅ）様式、即ち１単位のＣ末端が隣接する単位のＮ末端に結合して互いに結合している。これらの単位は、共有結合（例えば、ペプチド結合）により直接結合し得るが、しかし好ましくは隣接する単位の間隔をあけさせるリンカーによって結合され、それによって隣接する単位の詰込みによる破壊の問題を防止する。リンカーの性質は、以下で考察する。
【００１０】
本発明のタンパク質における１つ又はそれ以上のＨＢｃＡｇ単位は、天然の全長ＨＢｃＡｇであり得る。しかし、一般的には、少なくとも１つの単位は、ＨＢｃＡｇの修飾型であり、例えばｅ１ループ中に異質エピトープを挿入することによって修飾されたＨＢｃＡｇである。本発明の二量体において、ＨＢｃＡｇ単位の１つが修飾され、他は天然のＨＢｃＡｇであり得る。
【００１１】
一般的な規則として、いかなる修飾もＨＢｃＡｇの立体配座及びその粒子に組み立てる能力を妨害しないように選択される。そのような修飾は、立体配座の維持に重要でないタンパク質の部位、例えばｅ１ループ、Ｃ末端及び／又はＮ末端で行われる。ＨＢｃＡｇのｅ１ループは、例えば１から１２０アミノ酸の挿入に、タンパク質の粒子形成能を破壊することなく、耐えることができる。
【００１２】
ＨＢｃＡｇ配列は、置換、挿入、欠失又は伸張によって修飾される。挿入、欠失又は伸張の大きさは、例えば、１から２００ａａ、３から１００ａａ又は６から５０ａａである。置換は、例えばＨＢｃＡｇ配列の長さにわたって１、２、５、１０、２０又は５０アミノ酸までの、多くのアミノ酸を含み得る。伸張はＨＢｃＡｇのＮ又はＣ末端である。欠失は、Ｎ末端、Ｃ末端、又はタンパク質の内部の部位である。置換は、タンパク質配列のいかなる位置においても行い得る。挿入は、又、タンパク質配列のいかなる位置においても行い得るが、典型的には、ｅ１ループのようなタンパク質の表面露出領域において行われる。挿入された配列は、異種エピトープを担持する。１つ以上の修飾が各ＨＢｃＡｇ単位に対して行われ得る。それ故、末端伸張又は欠失及び内部挿入を行うことが可能である。例えば、末端切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）はＣ末端で行うことができ、そして挿入はｅ１ループで行い得る。
【００１３】
置換は一般的に保存的であり、例えば、以下の表に記載のように、第二列の同一ブロック内、及び好ましくは、第三列の同一行内のアミノ酸が、互いに置換されるように行われる。
【００１４】
【００１５】
本発明のタンパク質におけるＨＢｃＡｇ配列の各部分は、天然のＨＢｃＡｇタンパク質、例えば配列番号２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）に示された配列を有するタンパク質の相当する配列に、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性を有している。より好ましくは、同一性は、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９８％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％である。タンパク質配列（及び核酸配列）の同一性を測定する方法は公知技術である。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージはＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供している［Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，ｐ．３８７−３９５］。同様に、ＰＬＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムは、配列を並べるのに使用することができる［例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００及びＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０に記載されている］。
【００１６】
ＨＢｃＡｇのｅ１ループは、位置６８ないし９０であり、異種エピトープはこれらの位置のいずれにでも挿入され得る。好ましくは、エピトープは、位置６９から９０、７１から９０又は７５から８５の領域内に挿入される。最も好ましいのは、アミノ酸残基７９と８０の間、又は残基８０と８１の間にエピトープを挿入することである。異種エピトープが挿入されるとき、ＨＢｃＡｇの完全配列が保持され、或いは代わりにｅ１ループ配列の全部又は一部が欠失し、そして、異種配列によって置換される。それ故、アミノ酸残基６９から９０、７１から９０、又は７５から８５は、異種エピトープにより置換され得る。異種エピトープがｅ１ループ配列を置換する場合、エピトープは、一般的に、それが置換する配列よりも短くはない。
【００１７】
ＨＢｃＡｇのＣ末端切断は、一般的に、ａａ１４４を超えては行われない。というのは、もし更に端を切断することが行われると粒子を生成しないであろうからである。それ故、欠失したアミノ酸は、例えば、Ｃ末端ａａに対しａａ１４４（ａａ１８３又は１８５）、Ｃ末端ａａに対しａａ１５０、Ｃ末端ａａに対しａａ１６４、又はＣ末端ａａに対しａａ１７２、を含む。ＨＢｃＡｇのＣ末端はＤＮＡを結合し、それ故Ｃ末端の端の切断は、ＨＢｃＡＧ及びＨＢｃＡｇハイブリッドタンパク質の組成からＤＮＡを減じるか完全に除去する。
【００１８】
本発明のタンパク質は、好ましくは天然のＨＢｃＡｇによって形成される粒子に類似している粒子を形成する。本発明の粒子は、典型的には少なくとも直径１０ｎｍ、例えば直径１０から５０ｎｍ又は２０から４０ｎｍであるが、しかし好ましくは直径約２７ｎｍである（これは、天然ＨＢｃＡｇ粒子の大きさである）。それらは、多数のＨＢｃＡｇ単位、例えば１５０から３００単位を含み、一般的には、約１８０又は約２４０単位（これらは、天然ＨＢｃＡｇ粒子の単位の数である）に固定されている。本発明のタンパク質が二量体である場合、これは粒子中のタンパク質単量体の数が７５から１５０、一般的には約９０又は約１２０であることを意味している。
【００１９】
隣接するＨＢｃＡｇ単位間のリンカーは、一般的に、少なくとも長さ１．５ｎｍ（１５オングストローム）、例えば１．５から１０ｎｍ、１．５から５ｎｍ、又は１．５から３ｎｍのアミノ酸の鎖である。それは、例えば、４から４０ａａ、又は１０から３０ａａ、好ましくは１５から２１ａａを含む。リンカーは一般的に自由度がある。リンカーのアミノ酸は、例えば、グリシン、セリン及び／又はプロリンを包含し、或いは、完全にそれらから構成されている。好ましいリンカーは、配列ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（ＧＧＳ）の１回又はそれ以上の反復を含む。或いは又、リンカーは、ＧｌｙＰｒｏ（ＧＰ）ジペプチド反復配列を含む。反復の数は、例えば、１から１８、好ましくは３から１２である。ＧＧＳ反復配列の場合、５、６又は７反復配列の使用は、粒子の形成を可能にすることが見出されている。リンカーは、抗体のヒンジ領域に相当し、このヒンジ領域は抗体の抗原結合ドメインと尾部ドメイン間の可動継手を提供していると考えられる。
【００２０】
上記に示したように、異種エピトープは、本発明のタンパク質におけるＨＢｃＡｇの１つ又はそれ以上のコピー、好ましくはｅ１ループに挿入され得る。「異種」エピトープは、ＨＢｃＡｇ中にそれが位置している位置に本来位置していないエピトープであり、それは一般的にＨＢｃＡｇ以外のタンパク質からのものであるが、ＨＢｃＡｇの異なった位置からのものでもあり得る。エピトープは、免疫応答を高めるアミノ酸の配列を含む。エピトープは、立体配座的であるか直鎖状である。それは、例えば、６から１２０ａａ、６から５０ａａ、又は６から２０ａａの配列中にある。本発明の主要な利点は、エピトープがｅ１ループに挿入される大きな配列、例えば３０から１２０ａａ、４０から１２０ａａ、又は６０から１２０ａａの配列、で運ばれることを可能にすることである。
【００２１】
本発明のタンパク質は、１つ以上の異種エピトープ、例えば２、３、５又は８つの異種エピトープまでを含有することができ、そしてこの場合、エピトープは同じか又は異なったＨＢｃＡｇ単位に存在する。１コピー以上のエピトープが、各ＨＢｃＡｇ単位に挿入され、例えば２から８コピーが挿入され得る。本発明のタンパク質には２又はそれ以上の異種エピトープがあるので、それらは同じか又は異なった生物から、及び同じか又は異なったタンパク質からのものである。
【００２２】
エピトープは、Ｔ細胞又はＢ細胞エピトープである。もしそれがＴ細胞エピトープであれば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープ、或いはＴヘルパー（Ｔｈ）細胞エピトープ（例えば、Ｔｈ１又はＴｈ２エピトープ）である。本発明の好ましい実施態様において、エピトープの１つはＴヘルパー細胞エピトープであり、他はＢ細胞又はＣＴＬエピトープである。Ｔヘルパー細胞エピトープの存在は、Ｂ細胞又はＣＴＬエピトープに対する免疫応答を増強する。
【００２３】
エピトープの選択は、疾病に対するワクチン処置をしようと欲する疾病に依存している。エピトープは、例えば、病原体、ガン関連抗原、又はアレルゲンからのものである。病原体は、例えば、ウイルス、細菌又は原生動物（ｐｒｏｔｏｚｏａｎ）である。
【００２４】
挿入するエピトープを有する病原体の例としては、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ＨＢＶ、ＨＣＶ、インフルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス、ポリオウイルス、単純ヘルペスウイルス、狂犬病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ１）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒトライノウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＲＳウイルス、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、マラリアの原因）、及び細菌、例えば、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）及びブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）が挙げられる．具体的には、細菌は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核の原因菌）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ又はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（百日咳の原因菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（幾種類かの動物におけるサルモネラ症の原因菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｉｐｈｉ（ヒト腸チフスの原因菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（ヒトにおける食中毒の原因菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ（ブタにおけるサルモネラ症の原因菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂｌｉｎ（ウシ、特に新生仔牛における全身性及び下痢疾患の原因菌）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ヒトにおける食中毒の原因菌）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（髄膜炎の原因菌）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（淋病の原因菌）Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ（胃腸炎から致死性敗血症にわたるヒトにおける一連の疾病の原因菌）、及びＢｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ（牛における流産及び不妊症、及びヒトにおける波状熱として知られる状態の原因菌）である。
【００２５】
本発明において使用するためのエピトープの候補例は、以下の抗原からのエピトープを包含する：ＨＩＶ抗原ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ及びＲｅｆ；マラリア抗原ＣＳタンパク質及びスポロゾイト表面タンパク質２；インフルエンザ抗原ＨＡ、ＮＰ及びＮＡ；ヘルペスウイルス抗原ＥＢＶｇｐ３４０、ＥＢＶｇｐ８５、ＨＳＶｇＢ、ＨＳＶｇＤ、ＨＳＶｇＨ、ＨＳＶ初期タンパク質産生物、サイトメガロウイルスｇＢ、サイトメガロウイルスｇＨ、及びＩＥタンパク質ｇＰ７２；ヒトパピローマウイルス抗原Ｅ４、Ｅ６及びＥ７；ＲＳウイルス抗原Ｆタンパク質、Ｇタンパク質、及びＮタンパク質；Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのペルタクチン抗原；腫瘍抗原カルシノーマＣＥＡ、カルシノーマ関連ムチン、カルシノーマＰ５３、メラノーマＭＰＧ、メラノーマＰ９７、ＭＡＧＥ抗原、カルシノーマＮｅｕ腫瘍遺伝子産物、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺関連抗原、ｒａｓタンパク質、及びｍｙｃ；及びハウスダストダニアレルゲン。
【００２６】
特に好ましいエピトープは、ＨＢＶのプレＳ１領域、プレＳ２領域、Ｓ領域又はコア抗原からのものである。プレＳ１の全体及び／又はプレＳ２領域の全体をＨＢｃＡｇに挿入することは可能であるが、一般的には領域の１つの部分だけが挿入される。挿入された部分は、典型的には、少なくとも、長さが６アミノ酸、例えば６から１２０ａａ、２０から８０ａａ、又は２０から５０ａａである。挿入は、例えば、プレＳ１の位置１〜９、１０〜１９、２０〜２９、３０〜３９、４０〜４９、５０〜５９、６０〜６９、７０〜７９、８０〜８９、９０〜９９、１００〜１０９、又は１１０〜１１９の残基、あるいはプレＳ２の位置１２０〜１２９、１３０〜１３９、１４０〜１４９、１５０〜１５９、１６０〜１６９、又は１７０〜１７４、の残基を包含する。特に好ましい挿入は、プレＳ１残基２０〜４７及びプレＳ２残基１３９〜１７４である。
【００２７】
本発明のタンパク質の作成
本発明のタンパク質は、一般的には組換えＤＮＡ技術によって作られる。本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）、例えば発現ベクターを包含する。核酸分子は、核酸を操作するための公知の技術を用いて作られる。典型的には、２つのＨＢｃＡｇ単位をコードする２つの別々のＤＮＡ構築物が作られ、そしてＰＣＲを重ね合わせることによって共に結合される。
【００２８】
本発明のタンパク質は、タンパク質が発現されるような条件下でタンパク質をコードする核酸分子を含有する宿主細胞を培養し、そしてタンパク質を回収することによって製造され得る。適当な宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌、酵母、哺乳類細胞及びその他の真核細胞、例えば昆虫のＳｆ９細胞を包含する。
【００２９】
本発明に記載の核酸分子を構成するベクターは、例えば、プラスミド又はウイルスベクターである。それらは複製開始点、タンパク質をコードする配列の発現のためのプロモーター、エンハンサーのようなプロモーターの調節因子、転写停止シグナル、翻訳開始シグナル及び／又は翻訳停止シグナルを含有する。ベクターは、又、１又はそれ以上の選択マーカー遺伝子、例えば細菌のプラスミドの場合におけるアンピシリン耐性遺伝子、又は哺乳類ベクターの場合におけるネオマイシン耐性遺伝子を含有する。ベクターは、イン・ビトロで、例えば、ＲＮＡ製造のために、或いは宿主細胞を形質転換するため又はトランスフェクトするために使用され得る。ベクターは、又、例えば遺伝子治療又はＤＮＡワクチン接種による免疫処置の方法において、イン・ビボで使用するために採用され得る。
【００３０】
プロモーター、エンハンサー及びその他の発現制御シグナルは、発現ベクターが設計された宿主細胞と合致するように選択される。例えば、原核細胞プロモーター、特にＥ．ｃｏｌｉ菌株（例えばＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１）において使用するのに適したものが使用される。プロモーターで、その活性が周囲の環境、例えば嫌気条件、の変化に応じて誘導されるものが使用される。好ましくは、ｈｔｒＡ又はｎｉｒＢプロモーターが使用され得る。これらのプロモーターは、例えばワクチンとして使用するために、特に、弱毒化細菌においてタンパク質を発現するために使用され得る。本発明のタンパク質の発現が、哺乳類細胞においてイン・ビトロ又はイン・ビボのいずれかで行われるときは、哺乳類プロモーターが使用され得る。組織特異的プロモーター、例えば肝細胞特異的プロモーターも又使用され得る。ウイルスプロモーター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復配列（ＭＭＬＶＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーターＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、及びアデノウイルスプロモーターも又使用され得る。これら全てのプロモーターは、容易に入手することができる。
【００３１】
本発明に記載のタンパク質は、タンパク質を精製する通常の技術を用いて精製することができる。タンパク質は、例えば、精製した、純粋な、或いは単離された形で提供される。ワクチンにおいて使用するためには、タンパク質は、一般的に純度の高いレベル、例えば、調製物においてタンパク質の８０％以上、９０％以上、９５％以上、あるいは９８％以上を含有するレベルで提供されなければならない。しかしながら、最終ワクチン製剤においては、タンパク質は他のタンパク質と混合されることが望ましい。
【００３２】
疾病に対するワクチン接種
本発明のタンパク質の第一の使用は、治療又は予防ワクチンとしてである。本発明は、本発明のタンパク質、本発明の粒子又は本発明の核酸分子、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物（例えば、ワクチン組成物）を包含する。
【００３３】
予防ワクチン接種の背後の原理は、宿主における免疫応答を誘導し、宿主に免疫学的記憶を生じさせることである。このことは、宿主が強毒病原体に曝露されたとき、効果的な（防御）免疫応答、即ち、病原体を不活化及び／又は殺滅する免疫応答を備えることを意味する。本発明は、例えば、ＨＢＶ、ＨＡＶ、ＨＣＶ、インフルエンザ、口蹄疫、ポリオ、ヘルペス、狂犬病、エイズ、デング熱、黄熱病、マラリア、結核、百日咳、チフス、食中毒、下痢、髄膜炎及び淋病のような、ある範囲の疾病と状態に対する予防ワクチンの基礎を形成することができた。本発明のタンパク質におけるエピトープは、疾病に対してワクチンが防御を提供しようとするのに適するように選択される。
【００３４】
治療的ワクチン接種の背後の原理は、疾病又は状態を軽減する又は根絶するために、宿主の免疫系を促進することである。治療的ワクチン接種に感受性である疾病及び状態は多数あり、例えば、慢性ＨＢＶ及び慢性ＨＣＶを含む慢性ウイルス疾患、ガン、及びアレルギー、例えば喘息、アトピー、湿疹、鼻炎、及び食物アレルギーが挙げられる。
【００３５】
感染した宿主の免疫系がウイルスを排除するのに失敗し、長期間宿主にウイルスの永続を許してしまうと、慢性ウイルス疾患が起こる。本発明は、慢性的に感染した個体の免疫系を、ウイルスを排除するように誘導するために使用され得る。例えば、慢性肝炎の患者は不十分なＴ細胞応答を有しており、適切なＴ細胞応答の促進はウイルスを排除すると信じられている。それ故、本発明を用いて慢性ウイルス性肝炎を治療するために、ＨＢＶのプレＳ１及びプレＳ２領域からのＴ細胞エピトープのような、Ｔ細胞エピトープが本発明のタンパク質に挿入され得る。
【００３６】
同様に、ガンの場合、腫瘍抗原に対するＴ細胞応答の増強は、腫瘍を破壊する免疫系を援助すると信じられている。アレルギー疾患は、炎症性Ｔｈ２応答が拮抗性Ｔｈ１応答を支配して、少なくとも部分的には、不均衡なＴ細胞応答によるものであり、そして、アレルギーは、それ故、Ｔｈ１応答を増強することによって治療されるであろうと信じられている。このことは、Ｔｈ１応答を促進する異種エピトープを含有するタンパク質を使用することによる本発明の記載に従って達成することができる。
【００３７】
本発明の医薬組成物に含まれる適当な担体及び賦形剤は、等張生理食塩水、例えばリン酸緩衝食塩水である。組成物は、通常、アジュバント、例えば水酸化アルミニウムを含む。組成物は、注射用液体形態に処方される。組成物は、予防的又は治療的に有効な量のタンパク質、粒子又は核酸を含む。典型的には、タンパク質又は粒子は、体重当り０．１から２００μｇ、好ましくは１から１００μｇ、より好ましくは１０から５０μｇの投与量で投与される。本発明の核酸は、公知の技術を使った、又は公知のベクターを使った、ありのままの核酸として直接投与される。投与される核酸の量は、典型的には、１μｇから１０ｍｇ、好ましくは１００μｇから１ｍｇの範囲である。ワクチンは、単回投与スケジュール又は多回投与スケジュール、例えば２から３２、又は４から１６回投与で投与される。投与経路及び上記の投与量は、単なる手引きに過ぎず、投与経路及び投与量は、究極的には、医師の判断による。
【００３８】
（実験の部）
方法
ＨＢＶコア粒子構造の検討によって、少なくとも１．５ｎｍ（１５オングストローム）の可撓性のあるリンカーが、構造の完全さを破壊することなく二量体の対の２つのタンパク質を結合するのに使われ得ることが示唆された（図１）。従って、構築物は、上流コアタンパク質を残基１４９で端を切断し、そして、ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（ＧＧＳ）反復配列の５、６又は７コピーを経て下流のコピーに結合するＰＣＲを重ねることによって作られた（図２）。下流のコピーは、全長のコアタンパク質であるか、又はＡｒｇリッチなＣ末端領域を除去するためにアミノ酸１４９で端を切断されているかであった。表１は、種々のＨＢＶタンデムコアを構築するために使用されたオリゴヌクレオチド配列を示す。
【００３９】
構築物を、ｐｔｒｃ９９Ａ発現ベクターにクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９に形質転換し、そしてＩＰＴＧで誘導した。次いで細胞を、遠心分離により収穫し、ＰＢＳに再懸濁し、そして２度超音波処理した。可溶性の発現したタンデムコアを含有する溶解産物を、３０％飽和硫安処理し、沈殿したタンパク質を遠心分離で集め、ＰＢＳに再懸濁し、リン酸緩衝食塩水にて透析した。透明な溶解産物を１５〜４５％直線ショ糖勾配にかけ、そして、２８，０００ｒｐｍ、４時間、４℃にて遠心分離した。勾配をチューブの底から２ｍｌ量に分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び、ＨＢＶコアタンパク質に対するモノクローナル一次抗体（ｍＡｂ１３）を使用するウエスタンブロッティングによって分析した。
【００４０】
ＨＢＶコア粒子調製物を、カーボン膜を張ったグリッドの上にスポットし、酢酸ウラニルでネガティブ染色して、透過型電子顕微鏡で可視化した。コア粒子の構造は、低温電子顕微鏡法を用いて決定した。
【００４１】
（表１）ＨＢＶタンデムコア遺伝子をｐｔｒｃ９９Ａにクローニングするために使用したオリゴヌクレオチドプライマーの配列
a：ＮｃｏＩ制限部位は太字で表されている。
b：ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は太字で表されている。
【００４２】
結果
ＧＧＳの５、６又は７コピーを有するタンデムＨＢＶコアタンパク質は全て成功裏に発現され、ポリアクリルアミドゲル上で予期された移動度で移動していることが示された。それぞれは、ショ糖密度勾配における沈降（図３）、及び電子顕微鏡における外観（図４）によって証明されたように、コア粒子内に組み立てられていた。粒子は、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットにおける反応性によって実証されたように抗原性を保持していた（図５）。更に、タンデムコアタンパク質によって生成した粒子の構造は、低温電子顕微鏡法における天然のコア粒子の構造と区別できなかった（図６）。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｂ型肝炎コアの結合したＡＢ二量体の可能性を示す仮想モデル。
【図２】 ヘテロ及びホモタンデムコアの構築の模式提示。バーはタンパク質の一次構造を示す。ＨＢｃＡｇのアセンブリ（ａｓｓｅｍｂｌｙ）ドメイン（アミノ酸１〜１４４）内に、ｅ１ループ（黒い矩形）、及び二量体内（薄い陰影）及び二量体間（濃い陰影）の連結に関与する領域を示す。Ａｒｇリッチな核酸結合ドメインは＋で表す。プライマー（表１）は矢印で示す。
【図３】 ホモタンデムコア粒子のショ糖密度勾配分離からの画分の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図４】 ＧＧＳの５回反復を含むリンカーを有する、ヘテロタンデムコア粒子の電子顕微鏡写真。
【図５】 Ｅ．ｃｏｌｉにおけるヘテロタンデムコアの効率的発現を示すウエスタンブロット。コアは、リンカーとしてそれぞれ５、６及び７ＧＧＳ反復を含有する（ＧＧＳ５、ＧＧＳ６及びＧＧＳ７）。
【図６】 タンデムコア粒子の低温電子顕微鏡法の結果。図６（ａ）は、天然の粒子（中央の粒子）と比較した、タンデムコア粒子（左側の粒子）を示す。図６（ａ）の右側部分は、タンデムコア粒子内のコア抗原のＣ末端部分を示す。図６（ｂ）は、タンデムコア粒子の構造の部分の、天然の粒子との合致を示す。
【配列表】
本発明は、Ｂ型肝炎コア抗原融合タンパク質、タンパク質を含有する粒子、タンパク質をコードする核酸分子、タンパク質を製造する方法、タンパク質を含有する医薬組成物、及び予防的又は治療的なワクチン接種による免疫処置におけるタンパク質の使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
Ｂ型肝炎は開発国及び開発途上国の両者を通して主要な保健医療問題である。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による感染は急性又は慢性疾患をもたらし、それは症例に比例して肝細胞癌及び死に至る。ウイルスは、二重に殻に覆われ、そのＤＮＡはコア抗原（ＨＢｃＡｇ）と呼ばれるタンパク質構造で内部に保護されている。コアは、表皮又はＳ抗原（ＨＢｓＡｇ）として知られるエンベロープタンパク質によって囲まれている。ＨＢｃＡｇは、特異的ペプチドの免疫系への輸送媒体として使用することができる特別な抗原である。この抗原は、ＨＢＶの表面抗原からのエピトープ、Ａ型肝炎ウイルスからのエンベロープタンパク質及びＣ型肝炎からの抗原を包含する種々のウイルス及び細菌病原体からＴヘルパー、Ｂ及び細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）エピトープを提示するのに使用されてきた。総説として、Ｕｌｒｉｃｈら（１９９８）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５０，１４１−１８２を参照。
【０００３】
ＨＢｃＡｇは、粒子状に自己集合するタンパク質の分子構造であるので、エピトープの提示に優れた媒体である。各粒子は、単量体ポリペプチドの１８０又は２４０コピーのいずれかから生成される。この単量体は、宿主細胞の内部で適当な濃度に達すると、直径約２７ｎｍの粒子を形成する。構造研究によると、６８から９０残基以内のアミノ酸は、ｅ１ループとして知られる粒子の表面に棘構造を形成することが示されている。２つの単量体がジスルフィド結合により結合して二量体の棘（ｓｐｉｋｅ）を形成し、最も露出したアミノ酸は、第８０位（ｅ１ループの中心で）である。
【０００４】
ＥＰ−Ａ−４２１６３５（Ｔｈｅ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ）は、粒子を形成するためのタンパク質の能力を変えることなく、ｅ１ループ中に外部のエピトープを挿入させるＨＢＶコア遺伝子の修飾を記載している。この部位での挿入は、タンパク質の二量体により創生された各棘の先端に挿入されたエピトープを最大限に露出させることができる。一粒子当り各単量体の約１８０又は２４０コピーがあるので、各粒子は、関心のあるエピトープの１８０又は２４０コピーを提示することができる。
【０００５】
（発明の概要）
コア粒子の構造構築ブロックを形成するＨＢｃＡｇの二量体において、隣接したｅ１ループは近接して並んでいる。ｅ１ループに挿入された配列は、単量体のコアタンパク質中に存在するとき、組み立てられた（ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）粒子の中で立体配座的に制約を受けていることが提案されている。本発明は、例えば二量体のようなタンデムコピーとして、共有結合によってコアタンパク質を結合することによってこの問題を解決しようとするものであり、それによって各コピーにそれぞれ独立に挿入ができる。このことは、大きな配列をｅ１ループに挿入するのに特に有用である。というのは、そのような配列にはタンデムリピート当り丁度１コピーのコアタンパク質が挿入されることが許容され、それによって組み立てにおいて潜在的な立体配座の衝突を減少することができるからである。換言すれば、異なった配列をタンデムリピートの各ｅ１ループに挿入することができ、それ故エピトープ提示システムとしてのＨＢｃＡｇ粒子の自由度が増加する。
【０００６】
それ故、本発明は、ＨＢｃＡｇのタンデムコピーを含むタンパク質を提供する。タンパク質は、一般的に、ＨＢｃＡｇの２つのコピーを含む二量体である。異種エピトープは、ＨＢｃＡｇのコピーの１つ又はそれ以上のｅ１ループに挿入される。タンパク質は粒子内に組み込まれ、粒子はその表面のｅ１ループに挿入された異種エピトープを提示し、そしてヒト又は動物の予防的又は治療的ワクチン接種による免疫処置において有用である。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
タンパク質
本発明のタンパク質の基礎構築ブロックはＨＢｃＡｇであり、それはＨＢＶの亜型によって１８３又は１８５アミノ酸（ａａ）を有する。ａｙｗ亜型の１８３アミノ酸タンパク質プラス２９アミノ酸プレ配列の配列は配列番号２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）に示される。成熟ＨＢｃＡｇは、位置３０のＭｅｔ残基からＣ末端の端のＣｙｓ残基まで、位置１から２９までの配列をプレ配列として、延びている。
【０００８】
タンパク質は、一般的に、ＨＢｃＡｇの二量体がコア粒子の構造構築ブロックを形成するので、二量体を形成するＨＢｃＡｇの２つのコピーだけを含む。しかしながら、タンパク質は更にＨＢｃＡｇのコピーを含み得る。それ故、タンパク質は、ＨＢｃＡｇの２から８コピー又は２から４コピーを含み得る。２コピー以上の使用は系の自由度を増加し、例えば、３コピーの使用は、本発明のタンパク質中の３つのｅ１ループに３つの異なったエピトープが挿入されることを可能にし、それによって本発明のタンパク質により誘導される免疫応答の幅を広げる。
【０００９】
ＨＢｃＡｇの単位は、一般的に、頭と爪先（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔｏｅ）様式、即ち１単位のＣ末端が隣接する単位のＮ末端に結合して互いに結合している。これらの単位は、共有結合（例えば、ペプチド結合）により直接結合し得るが、しかし好ましくは隣接する単位の間隔をあけさせるリンカーによって結合され、それによって隣接する単位の詰込みによる破壊の問題を防止する。リンカーの性質は、以下で考察する。
【００１０】
本発明のタンパク質における１つ又はそれ以上のＨＢｃＡｇ単位は、天然の全長ＨＢｃＡｇであり得る。しかし、一般的には、少なくとも１つの単位は、ＨＢｃＡｇの修飾型であり、例えばｅ１ループ中に異質エピトープを挿入することによって修飾されたＨＢｃＡｇである。本発明の二量体において、ＨＢｃＡｇ単位の１つが修飾され、他は天然のＨＢｃＡｇであり得る。
【００１１】
一般的な規則として、いかなる修飾もＨＢｃＡｇの立体配座及びその粒子に組み立てる能力を妨害しないように選択される。そのような修飾は、立体配座の維持に重要でないタンパク質の部位、例えばｅ１ループ、Ｃ末端及び／又はＮ末端で行われる。ＨＢｃＡｇのｅ１ループは、例えば１から１２０アミノ酸の挿入に、タンパク質の粒子形成能を破壊することなく、耐えることができる。
【００１２】
ＨＢｃＡｇ配列は、置換、挿入、欠失又は伸張によって修飾される。挿入、欠失又は伸張の大きさは、例えば、１から２００ａａ、３から１００ａａ又は６から５０ａａである。置換は、例えばＨＢｃＡｇ配列の長さにわたって１、２、５、１０、２０又は５０アミノ酸までの、多くのアミノ酸を含み得る。伸張はＨＢｃＡｇのＮ又はＣ末端である。欠失は、Ｎ末端、Ｃ末端、又はタンパク質の内部の部位である。置換は、タンパク質配列のいかなる位置においても行い得る。挿入は、又、タンパク質配列のいかなる位置においても行い得るが、典型的には、ｅ１ループのようなタンパク質の表面露出領域において行われる。挿入された配列は、異種エピトープを担持する。１つ以上の修飾が各ＨＢｃＡｇ単位に対して行われ得る。それ故、末端伸張又は欠失及び内部挿入を行うことが可能である。例えば、末端切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）はＣ末端で行うことができ、そして挿入はｅ１ループで行い得る。
【００１３】
置換は一般的に保存的であり、例えば、以下の表に記載のように、第二列の同一ブロック内、及び好ましくは、第三列の同一行内のアミノ酸が、互いに置換されるように行われる。
【００１４】
本発明のタンパク質におけるＨＢｃＡｇ配列の各部分は、天然のＨＢｃＡｇタンパク質、例えば配列番号２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）に示された配列を有するタンパク質の相当する配列に、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性を有している。より好ましくは、同一性は、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９８％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％である。タンパク質配列（及び核酸配列）の同一性を測定する方法は公知技術である。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージはＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供している［Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，ｐ．３８７−３９５］。同様に、ＰＬＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムは、配列を並べるのに使用することができる［例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００及びＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０に記載されている］。
【００１６】
ＨＢｃＡｇのｅ１ループは、位置６８ないし９０であり、異種エピトープはこれらの位置のいずれにでも挿入され得る。好ましくは、エピトープは、位置６９から９０、７１から９０又は７５から８５の領域内に挿入される。最も好ましいのは、アミノ酸残基７９と８０の間、又は残基８０と８１の間にエピトープを挿入することである。異種エピトープが挿入されるとき、ＨＢｃＡｇの完全配列が保持され、或いは代わりにｅ１ループ配列の全部又は一部が欠失し、そして、異種配列によって置換される。それ故、アミノ酸残基６９から９０、７１から９０、又は７５から８５は、異種エピトープにより置換され得る。異種エピトープがｅ１ループ配列を置換する場合、エピトープは、一般的に、それが置換する配列よりも短くはない。
【００１７】
ＨＢｃＡｇのＣ末端切断は、一般的に、ａａ１４４を超えては行われない。というのは、もし更に端を切断することが行われると粒子を生成しないであろうからである。それ故、欠失したアミノ酸は、例えば、Ｃ末端ａａに対しａａ１４４（ａａ１８３又は１８５）、Ｃ末端ａａに対しａａ１５０、Ｃ末端ａａに対しａａ１６４、又はＣ末端ａａに対しａａ１７２、を含む。ＨＢｃＡｇのＣ末端はＤＮＡを結合し、それ故Ｃ末端の端の切断は、ＨＢｃＡＧ及びＨＢｃＡｇハイブリッドタンパク質の組成からＤＮＡを減じるか完全に除去する。
【００１８】
本発明のタンパク質は、好ましくは天然のＨＢｃＡｇによって形成される粒子に類似している粒子を形成する。本発明の粒子は、典型的には少なくとも直径１０ｎｍ、例えば直径１０から５０ｎｍ又は２０から４０ｎｍであるが、しかし好ましくは直径約２７ｎｍである（これは、天然ＨＢｃＡｇ粒子の大きさである）。それらは、多数のＨＢｃＡｇ単位、例えば１５０から３００単位を含み、一般的には、約１８０又は約２４０単位（これらは、天然ＨＢｃＡｇ粒子の単位の数である）に固定されている。本発明のタンパク質が二量体である場合、これは粒子中のタンパク質単量体の数が７５から１５０、一般的には約９０又は約１２０であることを意味している。
【００１９】
隣接するＨＢｃＡｇ単位間のリンカーは、一般的に、少なくとも長さ１．５ｎｍ（１５オングストローム）、例えば１．５から１０ｎｍ、１．５から５ｎｍ、又は１．５から３ｎｍのアミノ酸の鎖である。それは、例えば、４から４０ａａ、又は１０から３０ａａ、好ましくは１５から２１ａａを含む。リンカーは一般的に自由度がある。リンカーのアミノ酸は、例えば、グリシン、セリン及び／又はプロリンを包含し、或いは、完全にそれらから構成されている。好ましいリンカーは、配列ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（ＧＧＳ）の１回又はそれ以上の反復を含む。或いは又、リンカーは、ＧｌｙＰｒｏ（ＧＰ）ジペプチド反復配列を含む。反復の数は、例えば、１から１８、好ましくは３から１２である。ＧＧＳ反復配列の場合、５、６又は７反復配列の使用は、粒子の形成を可能にすることが見出されている。リンカーは、抗体のヒンジ領域に相当し、このヒンジ領域は抗体の抗原結合ドメインと尾部ドメイン間の可動継手を提供していると考えられる。
【００２０】
上記に示したように、異種エピトープは、本発明のタンパク質におけるＨＢｃＡｇの１つ又はそれ以上のコピー、好ましくはｅ１ループに挿入され得る。「異種」エピトープは、ＨＢｃＡｇ中にそれが位置している位置に本来位置していないエピトープであり、それは一般的にＨＢｃＡｇ以外のタンパク質からのものであるが、ＨＢｃＡｇの異なった位置からのものでもあり得る。エピトープは、免疫応答を高めるアミノ酸の配列を含む。エピトープは、立体配座的であるか直鎖状である。それは、例えば、６から１２０ａａ、６から５０ａａ、又は６から２０ａａの配列中にある。本発明の主要な利点は、エピトープがｅ１ループに挿入される大きな配列、例えば３０から１２０ａａ、４０から１２０ａａ、又は６０から１２０ａａの配列、で運ばれることを可能にすることである。
【００２１】
本発明のタンパク質は、１つ以上の異種エピトープ、例えば２、３、５又は８つの異種エピトープまでを含有することができ、そしてこの場合、エピトープは同じか又は異なったＨＢｃＡｇ単位に存在する。１コピー以上のエピトープが、各ＨＢｃＡｇ単位に挿入され、例えば２から８コピーが挿入され得る。本発明のタンパク質には２又はそれ以上の異種エピトープがあるので、それらは同じか又は異なった生物から、及び同じか又は異なったタンパク質からのものである。
【００２２】
エピトープは、Ｔ細胞又はＢ細胞エピトープである。もしそれがＴ細胞エピトープであれば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープ、或いはＴヘルパー（Ｔｈ）細胞エピトープ（例えば、Ｔｈ１又はＴｈ２エピトープ）である。本発明の好ましい実施態様において、エピトープの１つはＴヘルパー細胞エピトープであり、他はＢ細胞又はＣＴＬエピトープである。Ｔヘルパー細胞エピトープの存在は、Ｂ細胞又はＣＴＬエピトープに対する免疫応答を増強する。
【００２３】
エピトープの選択は、疾病に対するワクチン処置をしようと欲する疾病に依存している。エピトープは、例えば、病原体、ガン関連抗原、又はアレルゲンからのものである。病原体は、例えば、ウイルス、細菌又は原生動物（ｐｒｏｔｏｚｏａｎ）である。
【００２４】
挿入するエピトープを有する病原体の例としては、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ＨＢＶ、ＨＣＶ、インフルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス、ポリオウイルス、単純ヘルペスウイルス、狂犬病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ１）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒトライノウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＲＳウイルス、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、マラリアの原因）、及び細菌、例えば、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）及びブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）が挙げられる．具体的には、細菌は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核の原因菌）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ又はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（百日咳の原因菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（幾種類かの動物におけるサルモネラ症の原因菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｉｐｈｉ（ヒト腸チフスの原因菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（ヒトにおける食中毒の原因菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ（ブタにおけるサルモネラ症の原因菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂｌｉｎ（ウシ、特に新生仔牛における全身性及び下痢疾患の原因菌）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ヒトにおける食中毒の原因菌）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（髄膜炎の原因菌）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（淋病の原因菌）Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ（胃腸炎から致死性敗血症にわたるヒトにおける一連の疾病の原因菌）、及びＢｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ（牛における流産及び不妊症、及びヒトにおける波状熱として知られる状態の原因菌）である。
【００２５】
本発明において使用するためのエピトープの候補例は、以下の抗原からのエピトープを包含する：ＨＩＶ抗原ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ及びＲｅｆ；マラリア抗原ＣＳタンパク質及びスポロゾイト表面タンパク質２；インフルエンザ抗原ＨＡ、ＮＰ及びＮＡ；ヘルペスウイルス抗原ＥＢＶｇｐ３４０、ＥＢＶｇｐ８５、ＨＳＶｇＢ、ＨＳＶｇＤ、ＨＳＶｇＨ、ＨＳＶ初期タンパク質産生物、サイトメガロウイルスｇＢ、サイトメガロウイルスｇＨ、及びＩＥタンパク質ｇＰ７２；ヒトパピローマウイルス抗原Ｅ４、Ｅ６及びＥ７；ＲＳウイルス抗原Ｆタンパク質、Ｇタンパク質、及びＮタンパク質；Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのペルタクチン抗原；腫瘍抗原カルシノーマＣＥＡ、カルシノーマ関連ムチン、カルシノーマＰ５３、メラノーマＭＰＧ、メラノーマＰ９７、ＭＡＧＥ抗原、カルシノーマＮｅｕ腫瘍遺伝子産物、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺関連抗原、ｒａｓタンパク質、及びｍｙｃ；及びハウスダストダニアレルゲン。
【００２６】
特に好ましいエピトープは、ＨＢＶのプレＳ１領域、プレＳ２領域、Ｓ領域又はコア抗原からのものである。プレＳ１の全体及び／又はプレＳ２領域の全体をＨＢｃＡｇに挿入することは可能であるが、一般的には領域の１つの部分だけが挿入される。挿入された部分は、典型的には、少なくとも、長さが６アミノ酸、例えば６から１２０ａａ、２０から８０ａａ、又は２０から５０ａａである。挿入は、例えば、プレＳ１の位置１〜９、１０〜１９、２０〜２９、３０〜３９、４０〜４９、５０〜５９、６０〜６９、７０〜７９、８０〜８９、９０〜９９、１００〜１０９、又は１１０〜１１９の残基、あるいはプレＳ２の位置１２０〜１２９、１３０〜１３９、１４０〜１４９、１５０〜１５９、１６０〜１６９、又は１７０〜１７４、の残基を包含する。特に好ましい挿入は、プレＳ１残基２０〜４７及びプレＳ２残基１３９〜１７４である。
【００２７】
本発明のタンパク質の作成
本発明のタンパク質は、一般的には組換えＤＮＡ技術によって作られる。本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）、例えば発現ベクターを包含する。核酸分子は、核酸を操作するための公知の技術を用いて作られる。典型的には、２つのＨＢｃＡｇ単位をコードする２つの別々のＤＮＡ構築物が作られ、そしてＰＣＲを重ね合わせることによって共に結合される。
【００２８】
本発明のタンパク質は、タンパク質が発現されるような条件下でタンパク質をコードする核酸分子を含有する宿主細胞を培養し、そしてタンパク質を回収することによって製造され得る。適当な宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌、酵母、哺乳類細胞及びその他の真核細胞、例えば昆虫のＳｆ９細胞を包含する。
【００２９】
本発明に記載の核酸分子を構成するベクターは、例えば、プラスミド又はウイルスベクターである。それらは複製開始点、タンパク質をコードする配列の発現のためのプロモーター、エンハンサーのようなプロモーターの調節因子、転写停止シグナル、翻訳開始シグナル及び／又は翻訳停止シグナルを含有する。ベクターは、又、１又はそれ以上の選択マーカー遺伝子、例えば細菌のプラスミドの場合におけるアンピシリン耐性遺伝子、又は哺乳類ベクターの場合におけるネオマイシン耐性遺伝子を含有する。ベクターは、イン・ビトロで、例えば、ＲＮＡ製造のために、或いは宿主細胞を形質転換するため又はトランスフェクトするために使用され得る。ベクターは、又、例えば遺伝子治療又はＤＮＡワクチン接種による免疫処置の方法において、イン・ビボで使用するために採用され得る。
【００３０】
プロモーター、エンハンサー及びその他の発現制御シグナルは、発現ベクターが設計された宿主細胞と合致するように選択される。例えば、原核細胞プロモーター、特にＥ．ｃｏｌｉ菌株（例えばＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１）において使用するのに適したものが使用される。プロモーターで、その活性が周囲の環境、例えば嫌気条件、の変化に応じて誘導されるものが使用される。好ましくは、ｈｔｒＡ又はｎｉｒＢプロモーターが使用され得る。これらのプロモーターは、例えばワクチンとして使用するために、特に、弱毒化細菌においてタンパク質を発現するために使用され得る。本発明のタンパク質の発現が、哺乳類細胞においてイン・ビトロ又はイン・ビボのいずれかで行われるときは、哺乳類プロモーターが使用され得る。組織特異的プロモーター、例えば肝細胞特異的プロモーターも又使用され得る。ウイルスプロモーター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復配列（ＭＭＬＶＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーターＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、及びアデノウイルスプロモーターも又使用され得る。これら全てのプロモーターは、容易に入手することができる。
【００３１】
本発明に記載のタンパク質は、タンパク質を精製する通常の技術を用いて精製することができる。タンパク質は、例えば、精製した、純粋な、或いは単離された形で提供される。ワクチンにおいて使用するためには、タンパク質は、一般的に純度の高いレベル、例えば、調製物においてタンパク質の８０％以上、９０％以上、９５％以上、あるいは９８％以上を含有するレベルで提供されなければならない。しかしながら、最終ワクチン製剤においては、タンパク質は他のタンパク質と混合されることが望ましい。
【００３２】
疾病に対するワクチン接種
本発明のタンパク質の第一の使用は、治療又は予防ワクチンとしてである。本発明は、本発明のタンパク質、本発明の粒子又は本発明の核酸分子、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物（例えば、ワクチン組成物）を包含する。
【００３３】
予防ワクチン接種の背後の原理は、宿主における免疫応答を誘導し、宿主に免疫学的記憶を生じさせることである。このことは、宿主が強毒病原体に曝露されたとき、効果的な（防御）免疫応答、即ち、病原体を不活化及び／又は殺滅する免疫応答を備えることを意味する。本発明は、例えば、ＨＢＶ、ＨＡＶ、ＨＣＶ、インフルエンザ、口蹄疫、ポリオ、ヘルペス、狂犬病、エイズ、デング熱、黄熱病、マラリア、結核、百日咳、チフス、食中毒、下痢、髄膜炎及び淋病のような、ある範囲の疾病と状態に対する予防ワクチンの基礎を形成することができた。本発明のタンパク質におけるエピトープは、疾病に対してワクチンが防御を提供しようとするのに適するように選択される。
【００３４】
治療的ワクチン接種の背後の原理は、疾病又は状態を軽減する又は根絶するために、宿主の免疫系を促進することである。治療的ワクチン接種に感受性である疾病及び状態は多数あり、例えば、慢性ＨＢＶ及び慢性ＨＣＶを含む慢性ウイルス疾患、ガン、及びアレルギー、例えば喘息、アトピー、湿疹、鼻炎、及び食物アレルギーが挙げられる。
【００３５】
感染した宿主の免疫系がウイルスを排除するのに失敗し、長期間宿主にウイルスの永続を許してしまうと、慢性ウイルス疾患が起こる。本発明は、慢性的に感染した個体の免疫系を、ウイルスを排除するように誘導するために使用され得る。例えば、慢性肝炎の患者は不十分なＴ細胞応答を有しており、適切なＴ細胞応答の促進はウイルスを排除すると信じられている。それ故、本発明を用いて慢性ウイルス性肝炎を治療するために、ＨＢＶのプレＳ１及びプレＳ２領域からのＴ細胞エピトープのような、Ｔ細胞エピトープが本発明のタンパク質に挿入され得る。
【００３６】
同様に、ガンの場合、腫瘍抗原に対するＴ細胞応答の増強は、腫瘍を破壊する免疫系を援助すると信じられている。アレルギー疾患は、炎症性Ｔｈ２応答が拮抗性Ｔｈ１応答を支配して、少なくとも部分的には、不均衡なＴ細胞応答によるものであり、そして、アレルギーは、それ故、Ｔｈ１応答を増強することによって治療されるであろうと信じられている。このことは、Ｔｈ１応答を促進する異種エピトープを含有するタンパク質を使用することによる本発明の記載に従って達成することができる。
【００３７】
本発明の医薬組成物に含まれる適当な担体及び賦形剤は、等張生理食塩水、例えばリン酸緩衝食塩水である。組成物は、通常、アジュバント、例えば水酸化アルミニウムを含む。組成物は、注射用液体形態に処方される。組成物は、予防的又は治療的に有効な量のタンパク質、粒子又は核酸を含む。典型的には、タンパク質又は粒子は、体重当り０．１から２００μｇ、好ましくは１から１００μｇ、より好ましくは１０から５０μｇの投与量で投与される。本発明の核酸は、公知の技術を使った、又は公知のベクターを使った、ありのままの核酸として直接投与される。投与される核酸の量は、典型的には、１μｇから１０ｍｇ、好ましくは１００μｇから１ｍｇの範囲である。ワクチンは、単回投与スケジュール又は多回投与スケジュール、例えば２から３２、又は４から１６回投与で投与される。投与経路及び上記の投与量は、単なる手引きに過ぎず、投与経路及び投与量は、究極的には、医師の判断による。
【００３８】
（実験の部）
方法
ＨＢＶコア粒子構造の検討によって、少なくとも１．５ｎｍ（１５オングストローム）の可撓性のあるリンカーが、構造の完全さを破壊することなく二量体の対の２つのタンパク質を結合するのに使われ得ることが示唆された（図１）。従って、構築物は、上流コアタンパク質を残基１４９で端を切断し、そして、ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（ＧＧＳ）反復配列の５、６又は７コピーを経て下流のコピーに結合するＰＣＲを重ねることによって作られた（図２）。下流のコピーは、全長のコアタンパク質であるか、又はＡｒｇリッチなＣ末端領域を除去するためにアミノ酸１４９で端を切断されているかであった。表１は、種々のＨＢＶタンデムコアを構築するために使用されたオリゴヌクレオチド配列を示す。
【００３９】
構築物を、ｐｔｒｃ９９Ａ発現ベクターにクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９に形質転換し、そしてＩＰＴＧで誘導した。次いで細胞を、遠心分離により収穫し、ＰＢＳに再懸濁し、そして２度超音波処理した。可溶性の発現したタンデムコアを含有する溶解産物を、３０％飽和硫安処理し、沈殿したタンパク質を遠心分離で集め、ＰＢＳに再懸濁し、リン酸緩衝食塩水にて透析した。透明な溶解産物を１５〜４５％直線ショ糖勾配にかけ、そして、２８，０００ｒｐｍ、４時間、４℃にて遠心分離した。勾配をチューブの底から２ｍｌ量に分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び、ＨＢＶコアタンパク質に対するモノクローナル一次抗体（ｍＡｂ１３）を使用するウエスタンブロッティングによって分析した。
【００４０】
ＨＢＶコア粒子調製物を、カーボン膜を張ったグリッドの上にスポットし、酢酸ウラニルでネガティブ染色して、透過型電子顕微鏡で可視化した。コア粒子の構造は、低温電子顕微鏡法を用いて決定した。
【００４１】
（表１）ＨＢＶタンデムコア遺伝子をｐｔｒｃ９９Ａにクローニングするために使用したオリゴヌクレオチドプライマーの配列
b：ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は太字で表されている。
【００４２】
結果
ＧＧＳの５、６又は７コピーを有するタンデムＨＢＶコアタンパク質は全て成功裏に発現され、ポリアクリルアミドゲル上で予期された移動度で移動していることが示された。それぞれは、ショ糖密度勾配における沈降（図３）、及び電子顕微鏡における外観（図４）によって証明されたように、コア粒子内に組み立てられていた。粒子は、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットにおける反応性によって実証されたように抗原性を保持していた（図５）。更に、タンデムコアタンパク質によって生成した粒子の構造は、低温電子顕微鏡法における天然のコア粒子の構造と区別できなかった（図６）。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｂ型肝炎コアの結合したＡＢ二量体の可能性を示す仮想モデル。
【図２】 ヘテロ及びホモタンデムコアの構築の模式提示。バーはタンパク質の一次構造を示す。ＨＢｃＡｇのアセンブリ（ａｓｓｅｍｂｌｙ）ドメイン（アミノ酸１〜１４４）内に、ｅ１ループ（黒い矩形）、及び二量体内（薄い陰影）及び二量体間（濃い陰影）の連結に関与する領域を示す。Ａｒｇリッチな核酸結合ドメインは＋で表す。プライマー（表１）は矢印で示す。
【図３】 ホモタンデムコア粒子のショ糖密度勾配分離からの画分の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図４】 ＧＧＳの５回反復を含むリンカーを有する、ヘテロタンデムコア粒子の電子顕微鏡写真。
【図５】 Ｅ．ｃｏｌｉにおけるヘテロタンデムコアの効率的発現を示すウエスタンブロット。コアは、リンカーとしてそれぞれ５、６及び７ＧＧＳ反復を含有する（ＧＧＳ５、ＧＧＳ６及びＧＧＳ７）。
【図６】 タンデムコア粒子の低温電子顕微鏡法の結果。図６（ａ）は、天然の粒子（中央の粒子）と比較した、タンデムコア粒子（左側の粒子）を示す。図６（ａ）の右側部分は、タンデムコア粒子内のコア抗原のＣ末端部分を示す。図６（ｂ）は、タンデムコア粒子の構造の部分の、天然の粒子との合致を示す。
【配列表】
Claims (20)
- Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）のタンデムコピーを含むタンパク質であって、ＨＢｃＡｇの第１コピーのＣ末端がリンカーによりＨＢｃＡｇの第２コピーのＮ末端に結合しており、ＨＢｃＡｇのコピーの１つ又は両者がｅ１ループ中に異種エピトープを有する、上記タンパク質。
- ＨＢｃＡｇのコピーの両者がｅ１ループ中に異種エピトープを有する請求項１記載のタンパク質。
- 両者のコピーがｅ１ループ中に同じ異種エピトープを有する請求項２記載のタンパク質。
- 各コピーがｅ１ループ中に異なった異種エピトープを有する請求項２記載のタンパク質。
- 各異種エピトープがＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のプレＳ１又はプレＳ２領域から由来する請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 各異種エピトープがｅ１ループ中の１０から１２０アミノ酸残基の異種配列中にある請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質。
- ＨＢｃＡｇのコピーの１以上がＣ末端で切断された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ものである請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質。
- リンカーが少なくとも長さ１．５ｎｍである請求項１〜７記載のタンパク質。
- リンカーが配列ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（ＧＧＳ）の多数のコピーである請求項１〜８に記載のタンパク質。
- リンカーが配列ＧＧＳの５、６又は７コピーである請求項９記載のタンパク質。
- 請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質の多数のコピーを含む粒子。
- 請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸分子。
- 発現ベクターである請求項１２記載の核酸分子。
- 請求項１２又は１３に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
- タンパク質が発現する条件下でタンパク質をコードする核酸分子を含有する宿主細胞を培養し、タンパク質を回収することを含む方法である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質を製造する方法。
- 請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１１記載の粒子又は請求項１２もしくは１３に記載の核酸分子、及び医薬的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
- ヒト又は動物体の予防的又は治療的なワクチン接種の方法に使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１１記載の粒子又は請求項１２もしくは１３に記載の核酸分子。
- ＨＢＶに対するヒト又は動物体の予防的又は治療的ワクチン接種の方法に使用するための、請求項１７記載のタンパク質、粒子又は核酸分子。
- ＨＢＶに対するヒト又は動物体の予防的又は治療的ワクチン接種用の薬剤を製造するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１１記載の粒子又は請求項１２もしくは１３に記載の核酸分子の使用。
- 被験者の予防的又は治療的なワクチン接種のための薬剤であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１１記載の粒子又は請求項１２もしくは１３に記載の核酸分子を活性成分として含む、上記薬剤。
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