KR20030009429A - 비형 간염 코어 항원 융합 단백질 - Google Patents

비형 간염 코어 항원 융합 단백질 Download PDF

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Abstract

B형 간염 바이러스(HBV) 캡시드는 입자로 자기 조립하는 코어 항원(HBcAg)으로 불리는 단백질의 단일 종으로 구성된다. 입자는 고도로 면역원성이며 "e1 루프"로 불리는 입자의 표면-노출 영역 중으로 에피토프가 삽입될 때 면역 시스템에 이종 에피토프를 부여할 수 있다. 입자의 구조적 빌딩 블록은 인접 e1 루프가 밀접하게 병치되는 HBcAg의 타이트하게 회합된 다이머이다. e1 루프 중으로 삽입된 서열은 모노머 코어 단백질로 제공될 때 조립된 입자에 입체배좌적으로 보유됨이 제안된다. 본 발명은 코어 단백질을 탠덤 카피로서, 예를 들면 다이머로서 공유결합시켜, 각각의 카피에 독립적으로 삽입될 수 있도록 하여 이러한 문제를 해결하고자 한다. 이는 그러한 서열이 탠덤 반복당 코어 단백질의 단 하나의 카피 중으로만 삽입되게 하여, 조립체에서 잠재적인 입체배좌 부조화를 감소시키기 때문에, e1 루프 중으로 거대 서열의 삽입에 특히 유용하다. 이와 달리, 상이한 서열이 탠덤 반복체의 각 e1 루프 중으로 삽입될 수 있으며, 이에 따라 에피토프 전달 시스템으로서 HBcAg 입자의 유연성을 증가시킨다.

Description

비형 간염 코어 항원 융합 단백질{HEPATITIS B CORE ANTIGEN FUSION PROTEINS}
B형 간염은 선진국과 개발도상국 모두에서 건강 상의 주요 문제점이다. B형 간염 바이러스(HBV)로의 감염은 대다수의 사례에서 간세포 암종 및 사망에 이를 수 있는 급성 또는 만성 질환을 초래할 수 있다. 바이러스는 이중 외피에 싸여 있고, 이의 DNA는 코어 항원(HBcAg)으로 불리는 단백질 구조 내에서 보호된다. 코어는 표면 또는 S 항원(HBsAg)으로 알려져 있는 외피 단백질에 의해 둘러싸여 있다. HBcAg는 면역 시스템으로의 특정 펩타이드를 위한 전달 비히클로서 사용될 수 있는 특이한 항원이다. 항원은 HBV의 표면 항원으로부터의 에피토프, A형 간염 바이러스로부터의 외피 단백질 및 C형 간염 바이러스로부터의 항원을 포함한 각종 바이러스 및 박테리아 병원체로부터의 T-헬퍼, B 및 세포독성 림프구(CTL) 에피토프를 부여하는 데 사용되어 왔다. 고찰을 위해서는 Ulrich et al(1998) Advances in Virus Research50141-182를 참조한다.
HBcAg는 입자로 자기 조립하는 단백질의 분자 구조 때문에 에피토프의 부여를 위한 우수한 비히클이다. 각 입자는 모노머 폴리펩타이드의 180 또는 240 카피(copy)로부터 생성된다. 모노머가 숙주 세포 내에서 적당한 농도에 도달하면 직경이 대략 27 nm인 입자를 형성한다. 구조에 대한 연구는 잔기 68 내지 90의 영역내 아미노산이 입자의 표면에 e1 루프로 알려져 있는 스파이킹(spiked) 구조를 형성한다는 것을 보여주었다. 디설파이드 결합에 의해 연결된 두 모노머는 다이머 스파이크를 형성하도록 연결되고, 가장 노출된 아미노산은 80 위치에 있다(e1 루프의 중심).
EP-A-421635(The Wellcome Foundation Limited)가 입자를 형성하기 위한 단백질의 잠재력을 변질시키지 않으면서 외래 에피토프의 e1 루프로의 삽입을 가능하게 하는 HBV 코어 유전자의 변형을 기술하고 있다. 이 부위에서의 삽입은 단백질의 다이머에 의해 형성된 각 스파이크의 끝에서 삽입된 에피토프의 최고 노출을 가능하게 한다. 입자당 각 모노머의 대략 180 또는 240 카피가 있기 때문에, 각 입자는 해당 에피토프의 180 또는 240 카피를 부여할 수 있다.
발명의 요약
코어 입자의 구조적 빌딩 블록을 형성하는 HBcAg의 다이머에서, 인접 e1 루프는 근접하게 병치되어 있다. e1 루프에 삽입된 서열이 모노머 코어 단백질에 부여될 때 조립된 입자에서 입체배좌가 속박된다는 것이 제시되었다. 본 발명은 탠덤(tandem)형 카피, 예를 들면 다이머로서 코어 단백질을 공유 결합시켜 삽입이 각 카피에서 독립적으로 이루어질 수 있도록 함으로써 이 문제점을 해결하고자 한다. 이는 큰 서열의 e1 루프에의 삽입에 특히 유용한데, 그 이유는 그러한 서열이 탠덤형 반복체당 코어 단백질의 1 카피에만 삽입되도록 하여 조립체에서 잠재적인 입체배좌 부조화를 감소시키기 때문이다. 이와 달리, 상이한 서열이 탠덤형 반복체의 각 e1 루프에 삽입되어, 에피토프 부여 시스템으로서 HBcAg 입자의 유연성을 증가시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 HBcAg의 탠덤형 카피를 포함하는 단백질을 제공한다. 단백질은 일반적으로 HBcAg의 2 카피를 포함하는 다이머이다. 이종 에피토프는 HBcAg의 카피 중 하나 이상의 e1 루프에 삽입될 수 있다. 단백질은 그들의 표면에서 e1 루프에 삽입되는 이종 에피토프를 부여하는 입자로 조립되고 인간 및 동물의 예방적 및 치료적 백신접종에 유용하다.
본 발명은 B형 간염 코어 항원 융합 단백질, 그 단백질을 함유하는 입자, 그 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 그 단백질의 생산방법, 그 단백질을 함유하는 약학 조성물, 예방적 및 치료적 백신접종에서의 그 단백질의 사용에 관한 것이다.
실험 섹션
도면의 간단한 설명
도 1: B형 간염 코어의 결합된 AB 다이머의 가능성을 보여주는 가설 모델.
도 2: 헤테로- 및 호모-탠덤 코어의 작제 개략도. 바는 단백질의 1차 구조를 나타낸다. HBcAg의 조립체 도메인(아미노산 1-144) 내에서, e1 루프(흑색 사각형) 및 인트러다이머(밝은 색조) 및 인터다이머(어두운 색조) 접촉에 관여된 영역이 표시되어 있다. Arg-풍부 핵산 결합 도메인은 +로 표시되어 있다. 프라이머(표 1)는 화살표로 나타내었다.
도 3: 호모-탠덤 코어 입자의 수크로스 밀도 구배 분리로부터의 분획의 12% SDS-PAGE.
도 4: GGS의 5 반복체를 포함하는 링커를 갖는 헤테로-탠덤 코어 입자의 전자 현미경사진.
도 5: 이.콜라이내 헤테로-탠덤 코어의 효율적인 발현을 보여주는 웨스턴 블롯. 코어는 각각 링커로서 5, 6 및 7 GGS 반복체를 함유한다(GGS5, GGS6 및 GGS7).
도 6: 탠덤 코어 입자의 저온-전자현미경 검사 결과. 도 6(a)는 네이티브 입자(중앙의 입자)와 비교한 탠덤 코어 입자(좌측의 입자)를 보여준다. 도 6(a)의 우측 부분은 탠덤 코어 입자내 코어 항원의 C-말단부를 보여준다. 도 6(b)는 탠덤 코어 입자 구조 일부의 네이티브 입자로의 피팅을 보여준다.
방법
HBV 코어 입자 구조의 검사는 적어도 1.5 nm(15 Å)의 유연성 링커가 두 단백질을 그들의 구조 보전성을 파괴함이 없이 다이머 쌍으로 결합시키는 데 사용될 수 있음을 암시한다(도 1). 결과적으로, 업스트림 코어 단백질이 잔기 149까지 절단되고 이어서 GlyGlySer(GGS) 반복 서열의 5, 6 또는 7 카피를 통해 다운스트림 카피에 결합되는 중첩성 PCR에 의해 작제물이 제조된다(도 2). 다운스트림 카피는 완전한 길이의 코어 단백질이거나 Arg-풍부 C-말단 영역 제거를 위해 아미노산 149에서 절단된다. 표 1은 다양한 HBV 탠덤 코어의 작제에 사용된 올리고뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
작제물을 ptrc99A 발현 벡터 중으로 클로닝시켜, 이.콜라이 JM 109 중으로 형질전환시킨 다음 IPTG로 유도시킨다. 이어서, 세포를 원심분리에 의해 수거하여 PBS 중으로 재현탁시킨 다음 2회 초음파처리한다. 가용성의 발현된 탠덤 코어를 함유하는 용해물을 30% 포화 암모늄 설페이트로 처리하고 침전 단백질을 원심분리로 수집하여, PBS 중으로 재현탁시킨 다음 포스페이트-완충 생리식염수에 대해 투석한다. 청정화된 용해물을 15-45% 직선 수크로스 구배에 로딩한 다음 28,000 rpm으로 4시간 동안 4℃에서 원심분리시킨다. 구배물을 튜브 바닥으로부터 2 ml 분취량으로 분획화한 다음 SDS-PAGE 및 HBV 코어 단백질에 대한 모노클로날 1차 항체(mAb 13)를 사용하는 웨스턴 블로팅에 의해 분석한다.
HBV 코어 입자 제조물을 탄소 코팅 그리드 상에 스포팅하고, 우라실 아세테이트로 네가티브 염색한 다음 투과 전자 현미경에서 가시화한다. 코어 입자의 구조는 저온-전자현미경을 사용하여 결정하였다.
ptrc99A 중으로 HBV 탠덤 코어 유전자의 클로닝에 사용된 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 서열
프라이머 서열(5′→3′)
123456789 GTTACCATGGACATTGACCCTTATaGTCCATAGA(ACCACCAGA)5AACAACAGTAGTTTCCGGGTCCATAGA(ACCACCAGA)6AACAACAGTAGTTTCCGGGTCCATAGA(ACCACCAGA)7AACAACAGTAGTTTCCGGGTTGTT(GGTGGTTCT)5ATGGACATTGACCCTTATGTTGTT(GGTGGTTCT)6ATGGACATTGACCCTTATGTTGTT(GGTGGTTCT)7ATGGACATTGACCCTTATTATGAAGCTTATGAGTCCAAGGAbTATGAAGCTTCCGTCGTCAAACAAb
aNcoI 제한 부위는 볼드체로 표시bHindIII 제한 부위는 볼드체로 표시
결과
GGS의 5, 6 또는 7 카피를 갖는 탠덤 HBV 코어 단백질이 모두 성공적으로 발현되었으며 폴리아크릴아미드 겔에서 예상된 이동성으로 이동한 것으로 나타났다. 각각은 수크로스 밀도 구배에서의 침강(도 3) 및 전자현미경에서의 출현(도 4)에 의해 증명되는 바와 같이 코어 입자로 조립되었다. 입자는 ELISA 및 웨스턴 블롯에서 그들의 반응성에 의해 증명되는 바와 같이 항원성을 보유하였다(도 5). 또한, 탠덤 코어 단백질에 의해 형성된 입자의 구조는 저온-전자현미경에서 네이티브 코어 입자의 구조와 식별 불가능하였다(도 6).
단백질
본 발명 단백질의 기초 빌딩 블록은 HBV의 서브타입에 따라 183 또는 185 아미노산(aa)을 가지는 HBcAg이다. ayw 서브타입의 183 아미노산 단백질의 서열과 29 아미노산 프리(pre)-서열이 서열번호 2로 표시된다. 성숙한 HBcAg는 30 위치의 Met 잔기에서부터 C-최말단의 Cys 잔기에까지 이르고, 1 내지 29 위치의 서열이 프리-서열이다.
단백질은 일반적으로 다이머를 형성하는 HBcAg의 2 카피만을 포함하는데, 그 이유는 HBcAg의 다이머가 코어 입자의 구조적 빌딩 블록을 형성하기 때문이다. 그러나, 단백질은 HBcAg의 추가 카피를 포함할 수도 있다. 이에 따라, 단백질은HBcAg의 2 내지 8 카피 또는 2 내지 4 카피를 포함할 수 있다. 2 이상의 카피의 사용이 시스템의 유연성을 증가시키는데; 예를 들면, 3 카피의 사용은 상이한 3 에피토프가 본 발명의 단백질에서 3 e1 루프에 삽입되도록 하여 본 발명의 단백질에 의해 유도되는 면역 반응의 효과를 증가시킨다.
HBcAg 유닛은 일반적으로 헤드-투-토우(head-to-toe) 방식으로 함께 연결되어 있는데, 즉 일 유닛의 C-말단이 인접 유닛의 N-말단에 연결되어 있다. 유닛은 공유결합(예를 들면, 펩타이드 결합)에 의해 직접 연결될 수 있지만, 바람직하게는 이들은 인접 유닛이 일정 간격을 유지하게 하여 인접 유닛 패킹의 붕괴로 인한 문제를 방지하는 링커에 의해 연결된다. 링커의 특성은 후술된다.
본 발명의 단백질에서 HBcAg 유닛 중 하나 이상은 네이티브 완전 길이 HBcAg일 수 있다. 그러나, 일반적으로 유닛 중 적어도 하나는 HBcAg의 변형된 형태, 예를 들면 e1 루프에 이종 에피토프의 삽입에 의해 변형된 HBcAg이다. 본 발명에 따른 다이머에서, HBcAg 유닛 중 하나는 변형될 수 있고 나머지는 네이티브 HBcAg일 수 있다.
일반적으로, 변형은 HBcAg의 입체배좌 및 입자로의 조립능을 손상시키지 않도록 선택된다. 이러한 변형은 입체배좌의 유지에 중요하지 않은 단백질 부위, 예를 들면 e1 루프, C-말단 및/또는 N-말단에서 이루어진다. HBcAg의 e1 루프는 단백질의 입자-형성능을 파괴하지 않으면서 예를 들어, 1 내지 120 아미노산의 삽입을 용인할 수 있다.
HBcAg 서열은 치환, 삽입, 결실 또는 신장에 의해 변형될 수 있다. 삽입, 결실 또는 신장의 크기는 예를 들면, 1 내지 200 aa, 3 내지 100 aa, 또는 6 내지 50 aa일 수 있다. 치환은 HBcAg 서열의 전체 길이에서 예를 들어, 1, 2, 5, 10, 20 또는 50 아미노산까지의 아미노산수를 포함할 수 있다. 신장은 HBcAg의 N- 또는 C-말단에서 일어날 수 있다. 결실은 단백질의 N-말단, C-말단 또는 내부 부위에서 일어날 수 있다. 치환은 단백질 서열의 임의 위치에서 일어날 수 있다. 삽입 또한 단백질 서열의 임의 지점에서 일어날 수 있지만, 통상적으로는 e1 루프와 같이 단백질의 표면-노출 영역에서 이루어진다. 삽입된 서열은 이종 에피토프를 운반할 수 있다. 1 이상의 변형이 각 HBcAg 유닛에서 일어날 수 있다. 따라서, 말단 신장 또는 결실과 또한 내부 삽입도 일으키기가 가능하다. 예를 들면, 절단이 C-말단에서 일어날 수 있고 삽입이 e1 루프에서 일어날 수 있다.
치환은 일반적으로 보존형일 것이고, 예를 들면 하기의 표에 따라 일어날 수 있는데, 여기에서 두 번째 칼럼에서 동일한 블록, 바람직하게는 세 번째 칼럼에서 동일한 라인의 아미노산이 서로에 대해 치환될 수 있다.
지방족 비-극성 G A P
I L V
극성-비하전 C S T M
N Q
극성-하전 D E
K R
방향족 H F W Y
본 발명의 단백질에서 HBcAg 서열의 각 부분은 바람직하게는 서열번호 2로 표시된 서열을 가지는 단백질과 같은 천연 HBcAg 단백질의 상응 서열과 적어도 70%의 서열 동일성을 가진다. 더욱 바람직하게는, 동일성은 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 98%, 적어도 97% 또는 적어도 99%이다. 단백질 서열(및 핵산 서열) 동일성의 측정방법이 당분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, UWGCG 패키지가 BESTFIT 프로그램(Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p. 387-395)을 제공한다. 마찬가지로, PILEUP 및 BLAST 알고리듬이 서열을 정렬하는 데 사용될 수 있다(예를 들면, Altschul S. F. (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300 및 Altschul, S. F, et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10에 기술).
HBcAg의 e1 루프는 68 내지 90 위치에 있고, 이종 에피토프는 이들 위치 사이 어디에도 삽입될 수 있다. 바람직하게는, 에피토프는 69 내지 90, 71 내지 90 또는 75 내지 85의 영역에 삽입된다. 가장 바람직하게는 아미노산 잔기 79 내지 80 또는 80 내지 81에 에피토프를 삽입한다. 이종 에피토프가 삽입되면, HBcAg의 전체 서열이 유지될 수 있거나, 그렇지 않으면 e1 루프 서열의 전체 혹은 일부가 결실되고 이종 서열에 의해 대체될 수 있다. 이에 따라, 아미노산 잔기 69 내지 90, 71 내지 90 또는 75 내지 85가 이종 에피토프에 의해 대체될 수 있다. 이종 에피토프가 e1 루프 서열을 대체하면, 에피토프는 일반적으로 그것이 대체한 서열보다 짧지 않다.
HBcAg의 C-말단 절단은 일반적으로 aa 144 이상을 진행하지 않을 것인데, 그 이유는 임의의 추가 절단이 일어나면 입자가 형성될 수 없기 때문이다. 따라서, 결실된 아미노산은 예를 들면, C-말단 aa(aa 183 또는 185)까지 aa 144, C-말단 aa까지 aa 150, C-말단 aa까지 aa 164 또는 C-말단 aa까지 aa 172를 포함한다. HBcAg의 C-말단은 DNA와 결합하고, 이에 따라 C-말단의 절단은 HBcAg 및 HBcAg 하이브리드 단백질의 제조물로부터 DNA를 감소시키거나 완전히 제거한다.
본 발명의 단백질은 바람직하게는 네이티브 HBcAg에 의해 형성되는 입자를 닮은 입자를 형성한다. 본 발명의 입자는 통상적으로 직경이 적어도 10 nm, 예를 들면 직경 10 내지 50 nm 또는 20 내지 40 nm이지만, 바람직하게는 이들의 직경은 약 27 nm이다(이는 네이티브 HBcAg 입자의 크기이다). 이들은 복수의 HBcAg 유닛, 예를 들면 150 내지 300 유닛을 포함하지만, 일반적으로 이들은 약 180 또는 약 240 유닛으로 고정되어 있다(이는 네이티브 HBcAg 입자에서 유닛의 수이다). 본 발명의 단백질이 다이머이면, 이는 입자에서 단백질 모노머의 수가 75 내지 150일 수 있지만 일반적으로 약 90 또는 약 120임을 의미한다.
인접 HBcAg 유닛 사이의 링커는 일반적으로 길이가 적어도 1.5 nm(15 Å), 예를 들면 1.5 내지 10 nm, 1.5 내지 5 nm 또는 1.5 내지 3 nm인 아미노산쇄이다. 이는 예를 들면, 4 내지 40 aa 또는 10 내지 30 aa, 바람직하게는 15 내지 21 aa를 포함할 수 있다. 링커는 일반적으로 유연성이다. 링커에서 아미노산은 예를 들면, 글리신, 세린 및/또는 프롤린을 포함할 수 있거나 전체가 이로 이루어질 수 있다. 바람직한 링커는 서열 GlyGlySer(GGS)의 하나 이상의 반복체를 포함한다. 이와 달리, 링커는 하나 이상의 GlyPro(GP) 디펩타이드 반복체를 포함할 수 있다. 반복체의 수는 예를 들면, 1 내지 18, 바람직하게는 3 내지 12일 수 있다. GGS 반복체의 경우에, 5, 6 또는 7 반복체의 사용이 입자의 형성을 가능하게 하는 것으로 밝혀졌다. 링커가 항체의 힌지(hinge) 영역에 상응할 수 있고; 이 힌지 영역이 항원-결합 도메인과 항체의 테일 도메인 사이에서 유연성 연결을 제공하는 것으로 생각된다.
앞서 언급하였듯이, 이종 에피토프는 본 발명의 단백질에서 HBcAg의 카피 중하나 이상에, 바람직하게는 e1 루프에 삽입될 수 있다. "이종" 에피토프는 통상적으로 HBcAg에 위치해 있는 자리에는 위치하지 않는 에피토프이고; 일반적으로 HBcAg 이외의 단백질로부터의 에피토프이지만 이는 HBcAg의 상이한 위치로부터의 에피토프일 수도 있다. 에피토프는 면역 반응을 일으키는 아미노산의 서열을 포함한다. 에피토프는 입체배좌형 또는 선형일 수 있다. 이는 예를 들면, 6 내지 120 aa, 6 내지 50 aa 또는 6 내지 20 aa의 서열일 수 있다. 본 발명의 주요 이점은 큰 서열, 예를 들면 30 내지 120 aa, 40 내지 120 aa, 또는 60 내지 120 aa의 서열로 운반된 에피토프가 e1 루프에 삽입되는 것을 가능하게 한다는 것이다.
본 발명의 단백질은 하나 이상의 이종 에피토프, 예를 들면 2, 3, 5 또는 8개까지의 이종 에피토프를 함유할 수 있고, 이 경우에는 에피토프가 동일하거나 상이한 HBcAg 유닛에 존재할 수 있다. 1 카피 이상의 에피토프를 각 HBcAg 유닛에 삽입할 수 있다; 예를 들면, 2 내지 8 카피를 삽입할 수 있다. 본 발명의 단백질내 2 이상의 이종 에피토프가 있는 곳에서, 이들은 동일 또는 상이한 유기체로부터 및 동일 또는 상이한 단백질로부터 온 것일 수 있다.
에피토프는 T-세포 또는 B-세포 에피토프일 수 있다. 에피토프가 T-세포 에피토프인 경우; 이는 세포독성 T-림프구(CTL) 에피토프 또는 T-헬퍼(Th) 세포 에피토프(예를 들면, Th1 또는 Th2 에피토프)일 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 에피토프 중 하나는 T-헬퍼 세포 에피토프이며 다른 하나는 B-세포 또는 CTL 에피토프이다. T-헬퍼 세포 에피토프의 존재는 B-세포 또는 CTL 에피토프에 대한 면역 반응을 증진시킨다.
에피토프의 선택은 대항하여 백신접종 하고자 하는 질환에 좌우된다. 에피토프는 예를 들면, 병원성 유기체, 암-관련 항원 또는 알레르겐으로부터 올 수 있다. 병원성 유기체는 예를 들면, 바이러스, 박테리아 또는 원생동물일 수 있다.
에피토프를 삽입할 수 있는 병원체의 예는 A형 간염 바이러스(HAV), HVB, HCV, 인플루엔자 바이러스, 구제역 바이러스, 소아마비 바이러스, 단순 포진 바이러스, 광견병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스 1형(HIV 1), 인간 면역 결핍 바이러스 2형(HIV 2), 원숭이 면역 결핍 바이러스(SIV), 인간 리노바이러스, 뎅기열 바이러스, 황열 바이러스, 인간 파필로마 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 플라스모듐 팔시파럼(Plasmodium falciparum)(말라리아의 원인), 및 마이코박테리아(Mycobacteria), 보르데텔라(Bordetella), 살모넬라(Salmonella), 이스케리치아(Escherichia), 비브리오(Vibrio), 해모필루스(Haemophilus), 나이세리아(Neisseria), 예르시니아(Yersinia) 및 브루셀라(Brucella)와 같은 박테리아를 포함한다. 특히, 박테리아는 마이코박테륨 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)-결핵의 원인; 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis) 또는 보르데텔라 파라퍼투시스(Bordetella parapertussis)-백일해의 원인; 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium)-몇몇 동물종에서 살모넬라의 원인; 살모넬라 티피(Salmonella typhi)-인간 장티푸스의 원인; 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)-인간 식중독의 원인; 살모넬라 콜레라에수이스(Salmonella choleraesuis)-돼지 살모넬라의 원인; 살모넬라 두블린(Salmonella dublin)-소, 특히 새로 태어난 송아지의 전신 및 설사 질환의 원인; 이.콜라이(Escherichia coli)-인간 식중독의 원인; 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)-수막염의 원인; 나이세리아 고노리아(Neisseria gonorrhoeae)-임질의 원인; 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)-위장염부터 치명적인 패혈성 질환을 아우르는 인간의 광범위 질환의 원인; 및 브루셀라 아보투스(Brucella abortus)-소의 유산 및 불임의 원인 및 인간의 파상열로서 알려진 증상의 원인일 수 있다.
본 발명의 사용을 위한 후보 에피토프의 예는 하기 항원으로부터의 에피토프를 포함한다: HIV 항원 gp 120, gp 160, gag, pol, Nef, Tat 및 Ref; 말라리아 항원 CS 단백질 및 스포로조이트 표면 단백질 2; 인플루엔자 항원 HA, NP 및 NA; 포진 바이러스 항원 EBV gp 340, EBV gp85, HSV gB, HSV gD, HSV gH, HSV 초기 단백질 산물, 사이토메갈로바이러스 gB, 사이토메갈로바이러스 gH, 및 IE 단백질 gP72; 인간 파필로마 바이러스 항원 E4, E6 및 E7; 호흡기 합포체 바이러스 항원 F 단백질, G 단백질, 및 N 단백질; B. 퍼투시스의 pertactin 항원; 종양 항원 암종 CEA, 암종 관련 뮤신, 암종 P53, 멜라노마 MPG, 멜라노마 P97, MAGE 항원, 암종 Neu 종양유전자 산물, 전립선 특이적 항원(PSA), 전립선 관련 항원, ras 단백질 및 myc; 집 먼지 진드기 알레르겐.
특히 바람직한 에피토프는 HBV의 pre-S1 영역, pre-S2 영역, S 영역 또는 코어 항원으로부터의 에피토프이다. pre-S1의 전체 및/또는 pre-S2 영역의 전체를 모두 HBcAg로 삽입하는 것이 가능하지만, 일반적으로는 이러한 하나의 영역의 단지 일부만을 삽입한다. 삽입된 부분은 전형적으로는 적어도 6 아미노산 길이, 예를 들면 6 내지 120 아미노산, 20 내지 80 아미노산 또는 20 내지 50 아미노산 길이이다. 삽입체는 예를 들면 pre-S1 위치 1-9, 10-19, 20-29, 30-39, 40-49, 50-59, 60-69, 70-79, 80-89, 90-99, 100-109 또는 110-119의 잔기 또는 pre-S2 위치 120-129, 130-139, 140-149, 150-159, 160-169 또는 170-174의 잔기를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 삽입체는 pre-S1 잔기 20-47 및 pre-S2 잔기 139-174이다.
본 발명의 단백질 제조
본 발명의 단백질은 일반적으로는 재조합 DNA 기술에 의해 만들어진다. 본 발명은 발현 벡터와 같은, 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산 분자(예를 들면, DNA 또는 RNA)를 포함한다. 핵산 분자는 핵산 조작을 위한 공지 기술을 사용하여 만들 수 있다. 전형적으로는, 두 HBcAg를 암호화하는 두 분리된 DNA 작제물을 만들고, 이어서 중첩 PCR로 함께 연결한다.
단백질이 발현되는 조건하에서, 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포를 배양한 다음, 단백질을 회수함으로써 본 발명의 단백질을 제조할 수 있다. 적당한 숙주 세포는 이.콜라이와 같은 박테리아, 효모, 포유류 세포 및 다른 진핵 세포, 예를 들면, 곤충 Sf9 세포를 포함한다.
본 발명에 따른 핵산 분자를 구성하는 벡터는 예를 들면, 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 이들은 복제 기원, 단백질을 암호화하는 서열의 발현을 위한 프로모터, 인핸서와 같은 프로모터의 조절자, 전사 중지 시그널, 해독 개시 시그널 및/또는 해독 중지 시그널을 함유할 수 있다. 벡터는 또한 1 이상의 선별성 마커, 예를 들면, 박테리아 플라스미드의 경우 앰피실린 내성 유전자 또는 포유류벡터의 경우 네오마이신 내성 유전자를 포함할 수 있다. 벡터는 예를 들면, 시험관내에서 RNA의 제조를 위해 또는 숙주세포를 형질전환 또는 형질감염하는 데 사용될 수 있다. 벡터는 또한, 예를 들면 유전자 요법 또는 DNA 백신접종에서 생체내에서 사용되도록 변용될 수 있다.
프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 시그널을 발현 벡터가 디자인되는 숙주 세포에 적격이도록 선택할 수 있다. 예를 들면, 특히 이.콜라이 균주(이.콜라이 HB101과 같은)에서의 사용에 적당한 원핵세포 프로모터를 사용할 수 있다. 프로모터의 활성이 예를 들면, 혐기성 조건과 같은 주위 환경의 변화에 반응하여 유도되는 프로모터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 htr A 또는 nir B 프로모터를 사용할 수 있다. 특히, 이들 프로모터를 예를 들면, 백신으로서의 사용을 위한 감쇠된 박테리아내 단백질을 발현시키는 데 사용할 수 있다. 본 발명의 단백질 발현을 포유류 세포에서 시험관내 또는 생체내에서 수행한 경우, 포유류 프로모터를 사용할 수 있다. 조직-특이성 프로모터, 예를 들면 간세포 특이성 프로모터를 또한 사용할 수 있다. 바이러스 프로모터, 예를 들면 Moloney 쥐 백혈병 바이러스 롱 터미널 리피트(MMLV LTR), 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, SV40 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) IE 프로모터, 단순 포진 바이러스 프로모터 및 아데노바이러스 프로모터를 또한 사용할 수 있다. 이들 프로모터 모두는 업계에서 쉽게 입수가능하다.
단백질을 정제하기 위한 통상의 기술을 사용하여 본 발명에 따르는 단백질을 정제할 수 있다. 단백질은, 예를 들면 정제된 순수하거나 분리된 형태로 제공될 수있다. 백신에서의 사용을 위해서, 단백질은 일반적으로 높은 순도 수준, 예를 들면 제제내 단백질의 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상을 구성하는 수준으로 제공되어야 한다. 그러나, 최종 백신 제형에 단백질을 다른 단백질과 혼합하는 것이 바람직할 수 있다.
질환에 대한 백신접종
본 발명 단백질의 주요 용도는 치료용 또는 예방용 백신으로서의 용도이다. 본 발명은 본 발명의 단백질, 본 발명의 입자 또는 본 발명의 핵산 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제를 포함하는 약학 조성물(예를 들면, 백신 조성물)을 포함한다.
예방 백신접종 배후의 원리는 숙주내 면역 반응을 유도하여 숙주내 면역학적 기억을 발생시키는 것이다. 이는 숙주가 바이러스성 병원체에 노출되었을 때, 유효(보호) 면역 반응, 즉, 병원체를 불활성화 및/또는 사멸하는 면역 반응을 증가시킴을 의미한다. 본 발명은 HBV, HAV, HCV, 인플루엔자, 구제역병, 소아마비, 포진, 광견병, AIDS, 뎅기열, 황열, 말라리아, 결핵, 백일해, 장티푸스, 식중독, 설사, 수막염 및 임질과 같은 범위의 질환 및 증상에 대한 예방 백신의 토대를 형성할 수 있다. 본 발명의 단백질내 에피토프는 백신이 보호를 제공하고자 하는 질환에 대해 적당하도록 선택된다.
치료 백신접종 배후의 원리는 질환 또는 증상을 경감하거나 근절하도록 숙주의 면역 시스템을 자극하는 것이다. 치료 백신접종을 할 수 있는 다수의 질환 및 증상은, 예를 들면 만성 HBV 및 만성 HCV를 포함하는 만성 바이러스성 질환, 암,및 천식, 아토피, 습진, 비염 및 음식 알레르기와 같은 알레르기가 있다.
만성 바이러스성 질환은 오랜 시간 동안 숙주에서 바이러스가 살아남도록 허용하며, 감염된 숙주의 면역 시스템이 바이러스를 제거하는 데 실패한 경우 발생한다. 바이러스를 제거하기 위하여 만성으로 감염된 개체의 면역 시스템을 유도하는 데 본 발명을 사용할 수 있다. 예를 들면, 만성 간염을 앓는 환자는 부적절한 T-세포 반응을 가지며, 적당한 T-세포 반응의 자극은 바이러스를 제거할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명을 이용하여 만성 바이러스성 간염을 치료하기 위해서, 예를 들면 HSV의 pre-S1 및 pre-S2 영역으로부터의 T-세포 에피토프와 같은 T-세포 에피토프를 본 발명의 단백질에 삽입할 수 있다.
마찬가지로, 암의 경우에도, 암 항원에 대한 T-세포 반응의 증진은 면역 시스템이 암을 파괴하는 것을 돕는 것으로 생각된다. 알레르기성 질환은 적어도 부분적으로는 염증성 Th2 반응이 길항적인 Th1 반응을 넘어서 우세한, 불균형 T-세포 반응에 의해 일어나며, 알레르기는 따라서 Th1 반응을 증진시킴으로써 치료할 수 있는 것으로 생각된다. 이는 Th1 반응을 자극하는 이종 에피토프를 함유하는 단백질을 사용하여 본 발명에 따라 달성할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함시키기에 적당한 담체 및 희석제는 등장 생리식염수 용액, 예를 들면 포스페이트-완충 생리식염수이다. 조성물은 보통 예를 들면 알루미늄 하이드록사이드와 같은 보조제를 포함할 것이다. 주사를 위해 액체형으로 조성물을 조제할 수 있다. 조성물은 예방 또는 치료 유효량의 단백질, 입자 또는 핵산을 포함한다. 전형적으로는 단백질 또는 입자는 0.1 내지 200 ug, 바람직하게는 1 내지 100 ug, 더욱 바람직하게는 10 내지 50 ug 체중의 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 핵산은 업계에 알려진 기술 또는 업계에 알려진 벡터를 사용하여 네이키드 핵산 작제물로서 직접 투여될 수 있다. 투여되는 핵산의 양은 전형적으로는 1 ug 내지 10 mg 범위, 바람직하게는 100 ug 내지 1 mg 범위이다. 백신은 단일 투여량 스케쥴 또는 다중 투여량 스케쥴, 예를 들면 2 내지 32 또는 4 내지 16 투여량으로 부여될 수 있다. 상기에 주어진 투여 경로와 투여량은 단지 가이드에 불과하며, 경로와 투여량은 궁극적으로 의사의 판단에 따를 수 있다.

Claims (23)

  1. B형 간염 코어 항원(HBcAg)의 탠덤 카피를 포함하는 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서, HBcAg의 두 카피의 다이머인 단백질.
  3. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, HBcAg의 카피 중 하나 이상이 e1 루프에 이종 에피토프를 갖는 단백질.
  4. 제 3 항에 있어서, HBcAg의 모든 카피가 e1 루프에 이종 에피토프를 갖는 단백질.
  5. 제 4 항에 있어서, 모든 카피가 e1 루프에 동일한 이종 에피토프를 갖는 단백질.
  6. 제 4 항에 있어서, 각각의 카피가 e1 루프에 상이한 이종 에피토프를 갖는 단백질.
  7. 제 3 항 내지 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 에피토프 또는 각각의 이종 에피토프가 B형 간염 바이러스(HBV)의 pre-S1 또는 pre-S2 영역으로부터 유래되는 단백질.
  8. 제 3 항 내지 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 에피토프 또는 각각의 이종 에피토프가 e1 루프에 10 내지 120 아미노산 잔기로 된 이종 서열에 있는 단백질.
  9. 제 1 항 내지 8 항 중 어느 한 항에 있어서, HBcAg의 카피 중 하나 이상이 C-말단에서 절단되는 단백질.
  10. 제 1 항 내지 9 항 중 어느 한 항에 있어서, HBcAg의 탠덤 카피가 링커에 의해 결합되는 단백질.
  11. 제 10 항에 있어서, 링커가 적어도 1.5 nm 길이인 단백질.
  12. 제 10 항 또는 11 항에 있어서, 링커가 서열 GlyGlySer(GGS)의 다중 카피를 포함하는 단백질.
  13. 제 12 항에 있어서, 링커가 서열 GGS의 5, 6 또는 7 카피를 포함하는 단백질.
  14. 제 1 항 내지 13 항 중 어느 한 항에서 청구된 단백질의 다중 카피를 포함하는 입자.
  15. 제 1 항 내지 13 항 중 어느 한 항에서 청구된 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
  16. 제 15 항에 있어서, 발현 벡터인 핵산 분자.
  17. 제 15 항 또는 16 항에서 청구된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
  18. 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포를 단백질이 발현되는 조건하에서 배양한 다음, 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 13 항 중 어느 한 항에서 청구된 단백질의 생산방법.
  19. 제 1 항 내지 13 항 중 어느 한 항에서 청구된 단백질, 제 14 항에서 청구된 입자 또는 제 15 항 또는 16 항에서 청구된 핵산 분자 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
  20. 인체 또는 동물체의 예방 또는 치료 백신접종법에 사용하기 위한 제 1 항 내지 13 항 중 어느 한 항에 따른 단백질, 제 14 항에 따른 입자 또는 제 15 항 또는 16 항에 따른 핵산 분자.
  21. HBV에 대한 인체 또는 동물체의 예방 또는 치료 백신접종법에 사용하기 위한 제 20 항에 따른 단백질, 입자 또는 핵산 분자.
  22. HBV에 대한 인체 또는 동물체의 예방 또는 치료 백신접종용 약제의 제조를 위한 제 1 항 내지 13 항 중 어느 한 항에 따른 단백질, 제 14 항에 따른 입자 또는 제 15 항 또는 16 항에 따른 핵산 분자의 용도.
  23. 제 1 항 내지 13 항 중 어느 한 항에서 청구된 단백질, 제 14 항에서 청구된 입자 또는 제 15 항 또는 16 항에서 청구된 핵산 분자를 피검자에 투여하는 단계를 포함하는, 피검자의 예방 또는 치료 백신접종법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100465643B1 (ko) * 2001-09-28 2005-01-13 (주) 에이프로젠 비형 간염 바이러스 프리에쓰1 항원 유래의 에피토프 태그및 이에 대한 항체를 이용한 폴리펩티드의 검출 및 정제방법
KR100687653B1 (ko) * 2005-05-13 2007-02-27 유기현 스타-델타 결선용 전자개폐기의 제어방법

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003511075A (ja) * 1999-10-08 2003-03-25 セルテック ファーマ ユアロップ リミテッド 免疫原の設計
US7128911B2 (en) 2001-01-19 2006-10-31 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of bone disease
US7094409B2 (en) 2001-01-19 2006-08-22 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases
AU2002339224B2 (en) 2001-09-14 2008-10-09 Kuros Us Llc Packaging of immunostimulatory substances into virus-like particles: method of preparation and use
US7115266B2 (en) 2001-10-05 2006-10-03 Cytos Biotechnology Ag Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof
BR0213117A (pt) 2001-10-05 2004-09-21 Cytos Biotechnology Ag Conjugados peptìdeo angiotensina-veìculo e seus usos
US6932971B2 (en) 2002-07-18 2005-08-23 Cytos Biotechnology Ag Hapten-carrier conjugates and uses thereof
CA2492930C (en) 2002-07-19 2013-01-08 Cytos Biotechnology Ag Vaccine compositions containing amyloid beta1-6 antigen arrays
KR20050115913A (ko) 2003-03-26 2005-12-08 사이토스 바이오테크놀로지 아게 Ｍｅｌａｎ―ａ 펩티드 유사체-바이러스-양-입자컨쥬게이트
US7537767B2 (en) 2003-03-26 2009-05-26 Cytis Biotechnology Ag Melan-A- carrier conjugates
CN100537762C (zh) * 2004-06-24 2009-09-09 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种嵌合型病毒样颗粒疫苗载体蛋白及其制备方法与应用
WO2009022236A2 (en) 2007-08-16 2009-02-19 Tripep Ab Immunogen platform
WO2009130588A2 (en) * 2008-04-22 2009-10-29 Tripep Ab Immunogen platform
MX337723B (es) 2008-12-09 2016-03-15 Pfizer Vaccines Llc Vacuna de peptido ch3 de ige.
MX2012001194A (es) 2009-07-30 2012-03-07 Pfizer Vaccines Llc Peptidos tau antigenicos y usos de los mismos.
EP2865752A1 (en) 2009-09-03 2015-04-29 Pfizer Vaccines LLC PCSK9 vaccine
GB0918679D0 (en) * 2009-10-23 2009-12-09 Iqur Ltd Influenza vaccine
EP2547695B1 (en) 2010-03-16 2018-05-09 Biontech Protein Therapeutics GmbH Tumor vaccination involving a humoral immune response against self-protein cldn18.2
EP2575868A1 (en) 2010-06-07 2013-04-10 Pfizer Vaccines LLC Ige ch3 peptide vaccine
EP2680883B1 (en) 2011-03-02 2018-09-05 Pfizer Inc Pcsk9 vaccine
CN102199217B (zh) * 2011-04-01 2013-03-27 中国人民解放军第三军医大学 乙型肝炎病毒多表位融合蛋白及其制备方法和应用
US9446120B2 (en) 2011-04-15 2016-09-20 Osaka University DNA vaccine
JP6422022B2 (ja) * 2012-08-31 2018-11-14 国立大学法人大阪大学 Ｖｅｇｆ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープを含むｄｎａワクチン
JP6518193B2 (ja) * 2012-12-11 2019-05-22 オシバ、ソシエテ、パル、アクシオン、シンプリフィエＯｓｉｖａｘ Ｓａｓ 改善された特性を有する改変コイルドコイル型タンパク質
EP3004173B1 (en) * 2013-06-06 2018-05-30 iQur Limited Single domain antibody display
CN104341506A (zh) * 2013-07-30 2015-02-11 复旦大学 一种重组融合蛋白及其用途
EP3104877B1 (en) 2014-02-11 2020-01-22 The USA, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Pcsk9 vaccine and methods of using the same
GB201402890D0 (en) 2014-02-18 2014-04-02 Iqur Ltd Vaccines based on hepatitis B Core antigens
GB201421692D0 (en) * 2014-12-05 2015-01-21 Iquar Ltd Vaccines based on hepatitis B core antigens
GB201505041D0 (en) * 2015-03-25 2015-05-06 Iqur Ltd Vaccines based on hepatitis B core antigens
WO2018089814A1 (en) 2016-11-11 2018-05-17 Fraunhofer Usa, Inc. Covalently fused viral coat proteins for the display of target molecules
CN110343707B (zh) * 2019-05-30 2021-06-15 中国科学院生物物理研究所 基于乙肝核心抗原的hsv分型用蛋白、试剂盒及方法和应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2480780B1 (fr) * 1980-04-22 1985-12-06 Pasteur Institut Procede de transformation de cellules, notamment eucaryotes, par un adn circulaire tel que celui du virus de l'hepatite b et preparations contenant les produits d'expression desdits adn
JP2514033B2 (ja) * 1987-05-20 1996-07-10 財団法人 癌研究会 Ｂ型肝炎ウィルスの複製を可能とする新規な培養細胞
NZ235315A (en) * 1989-09-19 1991-09-25 Wellcome Found Chimaeric hepadnavirus core antigen proteins and their construction
US5723129A (en) * 1991-10-16 1998-03-03 University Of Saskatchewan GnRH-leukotoxin chimeras
JPH06279500A (ja) * 1992-09-30 1994-10-04 Imuno Japan:Kk ＨＢｃ融合蛋白粒子およびその製造方法
WO1997035008A1 (en) * 1996-03-21 1997-09-25 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods and compositions of chimeric polypeptides for tumor antigen vaccines
US20030021804A1 (en) * 1997-01-21 2003-01-30 Philip Needleman Immunological process for increasing the hdl cholestrol concentration
US6172216B1 (en) * 1998-10-07 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of BCL-X expression
US6180343B1 (en) * 1998-10-08 2001-01-30 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Green fluorescent protein fusions with random peptides
JP2003511075A (ja) * 1999-10-08 2003-03-25 セルテック ファーマ ユアロップ リミテッド 免疫原の設計
US20040054139A1 (en) * 2000-06-22 2004-03-18 Mark Page Modification of hepatitis b core antigen
US7351413B2 (en) * 2002-02-21 2008-04-01 Lorantis, Limited Stabilized HBc chimer particles as immunogens for chronic hepatitis

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100465643B1 (ko) * 2001-09-28 2005-01-13 (주) 에이프로젠 비형 간염 바이러스 프리에쓰1 항원 유래의 에피토프 태그및 이에 대한 항체를 이용한 폴리펩티드의 검출 및 정제방법
KR100687653B1 (ko) * 2005-05-13 2007-02-27 유기현 스타-델타 결선용 전자개폐기의 제어방법

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