JP6518193B2 - 改善された特性を有する改変コイルドコイル型タンパク質 - Google Patents
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Description
i)OCAファミリー(ここで、OCAは、オリゴマーコイルドコイル接着(oligomeric coiled coil adhesion)を意味する)に見られる二本鎖コイルドコイル:例として、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)防御抗原NadA(4);エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)由来YadA(5);モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)由来UspA2(6);バルトネラ・ヘンセラ(Bartonella henselae)由来BadA(7)、およびインフルエンザ菌(Haemophilus influenza)由来HadA(8)がある。
ii)中でも、インフルエンザ血球凝集素HA2タンパク質(9)、呼吸器合胞体ウイルスF糖タンパク質(10)、HIV−1(11)およびHIV−2(12)のgp41糖タンパク質、ならびにエボラウイルスのgp1、2(13)に見られるトリマーコイルドコイル。
iii)ニューカッスル病HN(血球凝集素−ノイラミダーゼ)糖タンパク質および他のパラミクソウイルス(14、およびその中の参照文献)に見られるテトラマーコイルドコイル。
・WO2007/062819は、第1成分としての鳥類C4bpドメインと第2成分としての抗原を含んでなる複合体を記載し、前記成分は融合タンパク質の形態であるか、または非共有結合的に会合されている。この複合体は、生物に投与された際に抗原の免疫原性の増強を示す。
・WO2011/045612は、ニワトリ由来のC4bpタンパク質フラグメントとマイコバクテリア抗原85Aを含有する融合タンパク質を記載している。前記ハイブリッドタンパク質は、齧歯類などの動物だけでなく霊長類でも85Aの免疫原性を高める。
・陽イオン交換カラムSP FFなどの負電荷クロマトグラフィーカラム、特に、ヘパリン−セファロースカラムへの良好な結合;
・核酸への良好な結合;
・担体タンパク質および抗原の場合、これらの改変コイルドコイル型タンパク質である抗原、または前記改変担体タンパク質と会合している抗原の免疫原性の増強。
「コイルドコイル型タンパク質」は、「コイルドコイル含有タンパク質」または「コイルドコイルドメインを有するタンパク質」とも称され、コイルドコイルモチーフ、すなわち、スーパーコイル状に互いに巻き付いている少なくとも2本のα−ヘリックスストランド、を含んでなるタンパク質を表す。このようなコイルドコイルを含有するいくつかのタンパク質は文献で報告されている。本発明によれば、好ましいコイルドコイル型タンパク質は抗原および担体タンパク質である。
〔配列中、
・Zは任意のアミノ酸であるか、または存在せず;
・Xは任意のアミノ酸であり;
・Bはアルギニン(R)またはリジン(K)である〕
で示される配列を有するものである改変タンパク質に関する。
・インフルエンザ血球凝集素HAタンパク質、
・呼吸器合胞体ウイルスのF糖タンパク質、
・HIV−1のgp41糖タンパク質、
・HIV−2のgp41糖タンパク質、
・エボラウイルスのgp1,2、
・髄膜炎菌由来のNadA、
・エルシニア・エンテロコリチカ由来のYadA、
・モラクセラ・カタラーリス由来のUspA2、
・バルトネラ・ヘンセラ由来のBadA、および
・インフルエンザ菌由来のHadA
からなる群から選択される。
i)記載のように(27、44)変異された黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)プロテインAタンパク質、または黄色ブドウ球菌タンパク質アルファ溶血素、または黄色ブドウ球菌タンパク質ClfBまたは黄色ブドウ球菌タンパク質ソルターゼA;
ii)結核菌(Mycobacterium tuberculosis)により分泌されるタンパク質85A(28);
iii)自己抗原GnRH;
iv)クリプトスポリジウム抗原Cp15;
v)インフルエンザ核タンパク質。
〔配列中、
・Zは任意のアミノ酸であるか、または存在せず;
・Xは任意のアミノ酸であり;
・Bはアルギニン(R)またはリジン(K)である〕
をコイルドコイルドメインに連結することを含んでなる方法に関する。
〔配列中、
・Zは任意のアミノ酸であるか、または存在せず;
・Xは任意のアミノ酸であり;
・Bはアルギニン(R)またはリジン(K)である〕
を前記タンパク質のコイルドコイルドメインに連結することを含んでなる方法に関する。
・上記のものなどの改変担体タンパク質を作製すること、および
・前記抗原を前記改変担体タンパク質および細胞内TLRの核酸リガンドまたはヘパリンに会合させること
を含んでなる方法に関する。
・上記のものなどの改変担体タンパク質を作製すること、および
・前記抗原を前記改変担体タンパク質および細胞内TLRの核酸リガンドまたはヘパリンに会合させること
を含んでなる方法に関する。
・ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーカラムに前記改変タンパク質をロードすること、および
・前記タンパク質を、500mMを超える塩濃度で溶出させること
を含んでなる方法に関する。
IMX313は、標準的な方法によりこのオリゴマー化ドメインをT7に基づく発現ベクターにクローニングすることにより生産した。PCR産物は、N末端のNdeI部位および第2の終止コドンとオーバーラップするHindIII部位を含んでいた。ヌクレオチド配列は、
配列番号8:
タンパク質IMX313Tを、50mMリン酸ナトリウムpH7.4で平衡化したHi Trap SP FF 5mlカラムで精製した。このタンパク質を0Mから1MのNaCl勾配で溶出させた。タンパク質IMX313Tを含有する画分をプールし、1倍PBSに対して透析し、1倍PBSで平衡化したHi Load 26/60 Superdex 75pgカラムに適用した。IMX313Tの溶出容量(Ve 170ml)は、IMX313(Ve 162ml)の溶出容量と酷似していた。
上記のように精製したIMX313Tタンパク質を次に、10mM Tris−HClおよび150mM NaClを含有するバッファーpH7.5にて、HiTrapヘパリンHP 5mlカラムにロードした。結合したタンパク質の溶出は、塩勾配:同じバッファー中2MのNaCl 15カラム容量で行った。正電荷IMX313Tタンパク質はヘパリンカラムに結合し、およそ1M NaClで溶出した。別のカラム実施で、IMX313はヘパリン−セファロースカラムに結合せず、その代わりにフロースルー画分に見られたことが示された。
IMX313を実施例1に記載の通り作製した。細菌溶解液を10mM Tris−HCl、150mM NaClを含有するバッファーpH7.5中で音波処理し、Sorvall SS34ローターにて4℃、18,000rpmで30分間遠心分離した後に、可溶性画分を得た。
異なるリンカー(グリシン対セリンおよびプロリン)を比較するため、またはアルギニンとリジンを比較するために、IMX313Tの他の3つの改変を行った。IMX313Tを発現するプラスミドを、オリゴヌクレオチド:
抗原PAmのIMX313との融合物を生産するために、黄色ブドウ球菌オープンリーディングフレーム由来のプロテインAを、オリゴヌクレオチド:
これらのタンパク質が細胞内TLRリガンドと結合できたかどうかを判定するために、電気泳動移動度シフトアッセイ(electrophoretic mobility shift assay)(EMSA)を行った。
・TLR3の場合:二本鎖RNAの類似体としてのポリシチジル酸にハイブリダイズされるポリイノシン酸ポリヌクレオチドの二重鎖であるポリI:C。鎖長は各鎖20ヌクレオチドであった。
・TLR7の場合:配列5’ GsCsCsCsGsUsCsUsGsUsUsGsUsGsUsGsAsCsUsC 3’ (ここで、「s」はホスホチオエート結合(phosphothioate linkage)を表す)(配列番号25)を有する、ssRNA40と呼ばれるオリゴヌクレオチド。
・TLR9の場合:配列:5’ tccatgacgttcctgacgtt 3’(配列番号26)を有する、ODN1826と呼ばれるオリゴヌクレオチド。
レーン1:低分子量ラダー(NEB);
レーン2:タンパク質IMX497(1mg/ml);
レーン3:FITC CpG ODN(Eurogentec)10μM;
レーン4:タンパク質IMX497(1mg/ml)とFITC CpG ODN 10μM;
レーン5:タンパク質IMX497(0.5mg/ml)とFITC CpG ODN 10μM;
レーン6:タンパク質IMX497(0.25mg/ml)とFITC CpG ODN 10μM;
レーン7:タンパク質IMX497(0.125mg/ml)とFITC CpG ODN 10μM。
レーン1:低分子量ラダー(NEB);
レーン2:タンパク質IMX497(1mg/ml);
レーン3:FITC ssRNA(Eurogentec)10μM;
レーン4:タンパク質IMX497(1.5mg/ml)/FITC ssRNA 10μM;
レーン5:タンパク質IMX497(1mg/ml)/FITC ssRNA 10μM;
レーン6:タンパク質IMX497(0.5mg/ml)/FITC ssRNA 10μM;
レーン7:タンパク質IMX497(0.25mg/ml)/FITC ssRNA 10μM;
レーン8:タンパク質IMX497(0.125mg/ml)/FITC ssRNA 10μM;
レーン9:FITC ssRNA 10μM;
レーン10:陰性対照;
レーン11:ポリ(I:C)(R&D TOCRIS Bioscience)0.5mg/ml;
レーン12:タンパク質IMX497(1.5mg/ml)/ポリ(I:C)0.5mg/ml;
レーン13:タンパク質IMX497(1mg/ml)/ポリ(I:C)0.5mg/ml;
レーン14:タンパク質IMX497(1mg/ml)/ポリ(I:C)0.25mg/ml;
レーン15:タンパク質IMX497(0.5mg/ml)/ポリ(I:C)0.5mg/ml;
レーン16:タンパク質IMX497(0.5mg/ml)/ポリ(I:C)0.25mg/ml;
レーン17:タンパク質IMX497(0.25mg/ml)/ポリ(I:C)0.5mg/ml。
レーン1:低分子量ラダー(NEB);
レーン2:タンパク質IMX497(1mg/ml);
レーン3:タンパク質IMX494(1mg/ml);
レーン4:タンパク質IMX495(1mg/ml);
レーン5:FITC CpG ODN(Eurogentec)10μM;
レーン6:タンパク質IMX497(1,5mg/ml)とFITC CpG ODN 10μM;
レーン7:タンパク質IMX497(1mg/ml)とFITC CpG ODN 10μM;
レーン8:タンパク質IMX497(0.5mg/ml)とFITC CpG ODN 10μM;
レーン9:タンパク質IMX497(0.25mg/ml)とFITC CpG ODN 10μM;
レーン10:タンパク質IMX494(1mg/ml)とFITC CpG ODN 10μM;
レーン11:タンパク質IMX494(0.5mg/ml)とFITC CpG ODN 10μM;
レーン12:タンパク質IMX494(0.25mg/ml)とFITC CpG ODN 10μM;
レーン13:タンパク質IMX495(1mg/ml)とFITC CpG ODN 10μM;
レーン14:タンパク質IMX495(0.5mg/ml)とFITC CpG ODN 10μM;
レーン15:タンパク質IMX495(0.25mg/ml)とFITC CpG ODN 10μM。
前記ペプチドが無ければ、IMX313と抗原PAMの融合タンパク質は、TLR受容体の核酸リガンドと結合することができない。
次に、単独であれIMX313またはIMX313Tに融合された場合であれ、また、細胞内TLRリガンドを伴う処方を用いる場合であれ用いない場合であれ、PAmの免疫原性を判定するために、マウスに免疫を行った。フロイントの完全または不完全アジュバント(CFA/IFA)とともに処方したPAmを対照として用いた。
正電荷ペプチドによるIMX313コイルドコイルの改変はT細胞応答も改善できたかどうかを判定するために、本発明者らはマイコバクテリア抗原85Aをモデルとして用いたが、これはIMX313がマウスおよびサルにおいてこの抗原に対するT細胞応答を改善することが示されていたためである(28)。抗原85A単独またはIMX313Tとの融合物もしくはその14もしくは18個のアミノ酸だけを含有するIMX313の2つの末端切断型との融合物を発現する一連の組換えプラスミドを、まず、Spencerら(28)により記載されているpSG2−85A−IMX313ベクターから85A−IMX313コード配列をGatewayプラスミドpENTR4−LPにサブクローニングすることにより作製した。このpENTR4骨格において、IMX313を欠失させるか改変するような誘導体を作製した。
平底96ウェルニトロセルロースプレート(Millititer;Millipore)をIFN−γ mAb(15μg/ml;MABTECH、ストックホルム)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。PBSで洗浄した後、プレートを37℃にて1時間、10%ウシ胎仔血清でブロッキングした。2×106細胞/ウェルを、15μg/mlの抗ヒトIFN−□でコーティングしたIPVH膜上にて、終濃度2μg/mlの関連ペプチド(CD8エピトープp11、CD4エピトープp15または85Aタンパク質)で刺激し、20時間インキュベートした。インキュベーション後、これらのプレートをPBSで十分に洗浄して細胞を除去し、IFN−γ mAb(1μg/mlのビオチン、MABTECH)を各ウェルに加えた。37℃で2時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、室温で1時間、ストレプトアビジン−HRP(1μg/ml;MABTECH)で現像した。洗浄した後、基質(3−アミノ−9−エチルカルバゾール(3-amino-9-ethycarbazol)(Sigma))を加え、15分間インキュベートした。さらに洗浄した後に、赤色スポットを顕微鏡下で計数した。
DNAワクチンで免疫したマウスの血清において、抗原85Aに対する抗体力価をELISAにより測定した(図9)。
DNAがワクチン接種に使用される場合にも見られた。本発明者らは、85Aタンパク質に特異的なIgGアイソタイプをELISAにおいて評価した(表3)。BALB/cマウスにおいて、IgG2aアイソタイプはTh1型免疫応答に関連付けられ、IgG1アイソタイプはTh2型免疫応答に関連付けられる。
DNAワクチン接種のため、図10に示されるような親プラスミドpcDNA3−NPを下記の例に記載するように改変した。
IMX313コード配列をプラスミドpIMX494から、オリゴヌクレオチドプライマー:
tPAシグナルペプチドをベクターpSG2−85A(28)から、オリゴヌクレオチド:
オリゴヌクレオチドプライマー:
IMX313Tコード配列をプラスミドpIMX497から、オリゴヌクレオチドプライマー:
11.5.1.プロトコール
5個体の雌BALB/Cマウスの群を、種々のプラスミドDNAで、14日間隔で2回、1回の注射につき各プラスミド20μgを用いて筋肉内免疫した。28日目に免疫応答を測定し、種々の改変:+/−IMX313またはIMX313T;+/−tPAシグナルペプチド;+/−モノマー化突然変異の影響を判定した。
平底96ウェルニトロセルロースプレート(Millititer;Millipore)をIFN−γ mAb(15μg/ml;MABTECH、ストックホルム)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。PBSで洗浄した後、プレートを37℃にて1時間、10%ウシ胎仔血清でブロッキングした。2×106細胞/ウェルを、15μg/mlの抗ヒトIFN−γでコーティングしたIPVH膜上にて、終濃度2μg/mlの関連ペプチド(NP Aインフルエンザペプチド)で刺激し、20時間インキュベートした。インキュベーション後、これらのプレートをPBSで十分に洗浄して細胞を除去し、IFN−γ mAb(1μg/mlのビオチン、MABTECH)を各ウェルに加えた。37℃で2時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、室温で1時間、ストレプトアビジン−HRP(1μg/ml;MABTECH)で現像した。洗浄した後、基質(3−アミノ−9−エチルカルバゾール(3-amino-9-ethycarbazol)(Sigma))を加え、15分間インキュベートした。さらに洗浄した後に、赤色スポットを顕微鏡下で計数した。
予備実験で、本発明者らは、NPまたはIMX313に融合されたNPのいずれかをコードするDNAワクチンにより誘導されたNPに対する全T細胞応答を調べた。NP−IMX313免疫マウスから単離された全T細胞は、NP免疫マウスの場合に比べて有意に高いIFNγ応答を示し、IMX313のT細胞応答増強能が確認された。
ELISPOTで検出されたIFN−γがCD4 T細胞により産生されたかCD8 T細胞により産生されたかを判定するために、本発明者らは免疫マウス由来の脾臓CD4+T細胞およびCD8+T細胞を精製し、これらをインフルエンザA NPペプチドと共培養した。NP−IMX313で免疫した群で、CD8+T細胞からのIFN−γ産生の有意な増加が検出された。IFN−γを産生する抗原特異的CD8+細胞のパーセンテージは、対応するCD4+T集団よりも高かった(図12)。
本発明者らは、次に、免疫後および最後の免疫から14日後のNPに対する抗体応答を検討し、血清においてNP特異的IgG Ab応答を測定した。NP対照マウスとNP−IMX313を与えたマウスは中等度のNP特異的IgG Abを示し(図13)、NP−IMX313で免疫した群の方が高かった。
NP特異的IgG1抗体およびIgG2a抗体(Balb/CマウスにおいてそれぞれTh2型およびTh1型の応答を表す)の存在に関しても血清を調べた。NP−IMX313免疫マウスの血清ではNP特異的IgG1およびIgG2a抗体アイソタイプが検出されたが、NPだけを与えたマウス由来の血清サンプルは、低レベルのIgG1およびIgG2a Abを示したに過ぎなかった(図14)。
タンパク質NP−M−IMX313Tをコードする合成遺伝子を大腸菌での発現のためにコドンを最適化して合成した。この合成遺伝子をT7に基づく発現ベクターpIMX04(これは、f1オリジンがプラスミドpSC101のpar遺伝子座により置換されているInvitrogenからのベクターpRsetCである)にクローニングした。発現を数種の標準培地(LB、Studierの自己誘導培地)で誘導し、過剰発現されたタンパク質を、最初は、清澄化およびイオン交換工程に関してYe(30)およびTarus(31)により記載されているように精製したが、最終工程では、融合タンパク質を上記のようにヘパリンセファロースに対する親和性により精製した。
5個体の雌BALB/Cマウスの群を、種々のタンパク質調製物(TLRリガンドを含む処方を用い、または用いずに)で、14日間隔で2回、1回の注射につき2ナノグラムのタンパク質を用いて筋肉内免疫した。28日目に脾細胞を用いて免疫応答を測定し、抗原特異的T細胞応答(ELISPOTにより測定)を判定した。免疫前と28日目の抗体応答を、抗原としてNPを用いたELISAにより測定した。
図15は、NPのモノマー化がその免疫原性を若干改善すること、これはIMX313遺伝子との融合によりさらに改善されるが、最大の改善はモノマーNPとIMX313T遺伝子を融合させることにより得られることを示す。
組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)分泌シグナル配列を含有する一連のNP DNAワクチン構築物:tPA−NP、tPA−NP−M、tPA−NP−M−IMX313、およびtPA−NP−M−IMX313Tを作製した。免疫動物由来の体液性免疫応答および細胞性免疫応答に対するtPAとNPの融合の効果を分析した。
IMX313Tを含有するプラスミドを用いたDNA免疫により得られた結果は、分子のテールが、プロテアーゼが豊富な分泌経路を通過する際にプロテアーゼにより切断されないことを強く示唆する。この疑問をより直接的に検討するために、in vivoでNP−M−IMX313Tを発現させるために使用されるプラスミドを用いてCHO K1細胞のトランスフェクションを行った。トランスフェクションは記載のように行った(33)。
トリマーコイルドコイルの改変が抗原の免疫原性を改善するかどうかを判定するために、インフルエンザ血球凝集素のトリマーコイルドコイルをコードする合成HA2遺伝子を用いて2つのプラスミドを構築した。
参照16に記載されている融合タンパク質DsbA−IMX108のコイルドコイルを、それがまたIMX313上に付与される改善された特性も獲得したかどうかを判定するために改変した。それを改変するために、DsbA−IMX108遺伝子を、オリゴヌクレオチド:
改変IMX313タンパク質との融合がブドウ球菌毒素アルファ溶血素(Hla)のN末端ドメインの免疫原性を改善することができたかどうかを判定するために、末端切断型溶血素遺伝子をNewman株のゲノムDNAから増幅し、T7発現ベクターにクローニングした。オリゴヌクレオチド:
IMX313TおよびIMX313Pが全長ブドウ球菌プロテインA抗原(SpA)の免疫原性を改善することができたかどうかを判定するために、5つの相同ドメイン(参照44に記載の通りに変異させた)をコードする合成遺伝子をT7発現ベクターにNde I−Hind IIIフラグメントとしてクローニングした。ヌクレオチド配列は、
ブドウ球菌抗原ClfBの免疫原性を改善するために、N2N3ドメインを、下記のオリゴ:
ソルターゼA、またはSrtAとして知られるブドウ球菌プロテアーゼの免疫原性を改善するため、次のように、不活性型をIMX313、IMX313TおよびIMX313Pにインフレームでクローニングした。野生型ソルターゼA遺伝子をNewman株ゲノムDNAからオリゴヌクレオチド:
改変IMX313タンパク質が、IMX313自体の使用によって得られる改善以上に、クリプトストリジウム抗原CP15の免疫原性をさらに改善できたかどうかを判定するために、大腸菌でCp15、Cp15−IMX313およびIMX313Tを発現するように設計された3つのプラスミドを用いて、DNAワクチンとしてのpcDNA3ベクターを作製した。pcDNA3のtPAシグナルペプチドの下流に挿入するための、T7発現ベクター由来の3つの遺伝子を増幅するために使用したプライマーは、
IMX313に融合された際の自己抗原GnRHにより誘導される抗体応答をさらに改善するために、タンパク質GnRH−IMX313Tを作製した。このタンパク質コード配列は
改変IMX313タンパク質の使用により得られた免疫原性の改善が古典的アジュバントの使用によりさらに改善できるかどうか、また、2つのアジュバントの使用により誘導できるかどうかを判定するために、下表の「アジュバント」の欄に示されているように下記のタンパク質:PAm、PAm−IMX313およびPAm−IMX313T(上記の実施例6に記載の通りに作製)を作製した。次に、処方したタンパク質を用いて、7群の5〜6週齢Balb/c雌マウスを、0日目と14日目に免疫した。1回の免疫につき5ミリモルの各タンパク質を、アジュバントAddaVaxとともにまたは伴わずに、また、TLRリガンドポリI:Cとともにまたは伴わずに用いた。7番目の群には、TLRリガンドポリI:Cをまずタンパク質PAm−IMX313Tとともに処方した後に、アジュバントAddaVaxとともに処方した。
Claims (18)
- (i)コイルドコイルドメインを有するタンパク質と、(ii)前記コイルドコイルドメインに連結された少なくとも1つの正電荷ペプチドとを含んでなる、改変タンパク質であって、該正電荷ペプチドが、配列番号2(SPRRRRS)、配列番号36(GRRRRRS)または配列番号37(SPRRRRRRRRRS)で示される配列からなる群から選択される配列を有するものであり、前記改変タンパク質が、配列番号7、配列番号42、配列番号61または配列番号67で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる、改変タンパク質。
- 請求項1に記載の改変タンパク質と1以上の抗原とを含んでなる、融合タンパク質。
- 前記抗原が、黄色ブドウ球菌由来のプロテインA、マイコバクテリア抗原85Aおよびインフルエンザ核タンパク質抗原からなる群から選択される、請求項2に記載の融合タンパク質。
- 請求項1に定義される改変タンパク質に融合された、1以上のブドウ球菌抗原を含んでなる、請求項2に記載の融合タンパク質。
- 前記1以上のブドウ球菌抗原が、SpA、Hla、ClfBおよびソルターゼAからなる群から選択されるものである、請求項4に記載の融合タンパク質。
- 請求項1に定義される改変タンパク質に融合された、インフルエンザ核タンパク質などの1以上のインフルエンザ抗原を含んでなる、請求項2に記載の融合タンパク質。
- 請求項1に定義される改変タンパク質に融合された、GnRHなどの1以上の自己抗原を含んでなる、請求項2に記載の融合タンパク質。
- 請求項1に定義される改変タンパク質に融合された抗原を含んでなる、請求項2に記載の融合タンパク質。
- 請求項1に記載の改変タンパク質、または請求項2〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、細胞内TLRの核酸リガンドとを含んでなる、免疫原性組成物。
- コイルドコイルドメインを含んでなる抗原またはコイルドコイルドメインを含んでなる担体タンパク質の免疫原性を増強するための方法であって、少なくとも1つの正電荷ペプチドを前記コイルドコイルドメインに連結することを含んでなり、前記正電荷ペプチドが配列番号2(SPRRRRS)、配列番号36(GRRRRRS)または配列番号37(SPRRRRRRRRRS)で示される配列からなる群から選択される配列を有するものであり、および、得られた改変担体タンパク質が配列番号7、配列番号42または配列番号67で示されるアミノ酸配列を有するものであり、かつ、得られた改変抗原が配列番号61で示されるアミノ酸配列を有するものである、方法。
- 抗原の免疫原性、特にTh1免疫原性を増強するための方法であって、
・請求項10に記載の方法に従って前記改変担体タンパク質を作製すること、および
・前記抗原を、前記改変担体タンパク質、および細胞内TLRの核酸リガンドまたはヘパリンなどの負電荷ポリマーに会合させること
を含んでなる、方法。 - 請求項1に記載の改変タンパク質、または請求項2〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項9に記載の免疫原性組成物を含んでなる、ワクチン組成物。
- 請求項1に記載の改変タンパク質をコードする、または請求項2〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸分子。
- 請求項13に記載の少なくとも1つの核酸分子を含んでなる、ワクチン組成物。
- 請求項1に定義される改変タンパク質に融合された、1以上のブドウ球菌抗原を含んでなる、請求項2に記載の融合タンパク質を含んでなる、ブドウ球菌感染症の治療および予防のための医薬組成物。
- 請求項1に定義される改変タンパク質に融合された、インフルエンザ核タンパク質などの1以上のインフルエンザ抗原を含んでなる、請求項2に記載の融合タンパク質を含んでなる、インフルエンザの治療および予防のための医薬組成物。
- 請求項1に定義される改変タンパク質に融合された抗原を含んでなる、請求項2に記載の融合タンパク質を含んでなる、家禽の免疫感作のための組成物。
- 前記1以上のブドウ球菌抗原が、SpA、Hla、ClfBおよびソルターゼAからなる群から選択されるものである、請求項15に記載の医薬組成物。
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