KR102613348B1 - 알부민 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된 융합단백질, 및 이를 이용한 이중 표적 결합체 - Google Patents

알부민 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된 융합단백질, 및 이를 이용한 이중 표적 결합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알부민 또는 이의 유도체, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 연결된 융합단백질에 관한 것이며, 또한, 본 발명은 코일드코일의 자가결합 특성을 이용한, 상기 융합단백질에 표적물질이 이중으로 연결된 이중 표적 결합체에 관한 것이다.

Description

알부민 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된 융합단백질, 및 이를 이용한 이중 표적 결합체{FUSION PROTEIN COMPRISING ALBUMIN AND COILED COIL FORMING DOMAIN, AND BISPECFIC TARGET CONJUGATE USING THE SAME}
본 발명은 알부민 또는 이의 유도체, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 연결된 융합단백질에 관한 것이며, 또한, 본 발명은 코일드코일 형성 도메인의 자가결합 특성을 이용한, 상기 융합단백질에 2종의 표적 결합 물질이 결합된 이중 표적 결합체에 관한 것이다.
알부민은 세포의 기본 물질을 구성하는 구형 단백질 패밀리로 약 65 내지 70 kDa의 분자량을 가지며 가장 흔한 것은 혈청 알부민이다. 혈청 알부민은 간에서 생산되는, 전체 혈청 단백질의 약 55 내지 60%를 차지하는 가용성 단백질로 순환계에서 주요하게 이용되는 단백질이다. 아미노산, 칼슘, 구리, 아연 등과 같은 금속 및 다양한 약제, 대사산물 등의 운반에 관여하며, 인체 내 다양한 내생적 및 외생적 리간드의 대사, 분포, 수송에 중요한 역할을 한다. 일반적으로 간, 신장, 장과 같은 대다수의 기관 및 순환 경계면에서 리간드의 수송을 용이하게 하는 것으로 알려져 있다.
인간 혈청 알부민(Human serum albumin, HSA)은 17개의 이황화결합(disulfide bridges)를 포함하는 585개의 아미노산으로 구성되어 있다. 혈액 내 약 35 내지 50 g/L로 다량 존재하며 삼투압, pH 및 항상성을 유지하는 기능을 한다. 많은 알부민 패밀리들과 같이, 인간 혈청 알부민은 인간의 순환 및 대사 기능에 깊게 관여하며 거의 모든 인간 조직에서 발견된다.
인간 혈청 알부민은 높은 체내 안정성을 가지며, 리간드 또는 약물에 결합되면 분자 크기 증가로 인해 신장에서 걸러져 배출되는 것이 방지되고, 항체와 유사하게 FcRn과 상호작용하여 세포 안으로 들어가 분해되지 않고 다시 세포 밖으로 방출된다. 이러한 특징으로 인해, 인간 혈청 알부민이 약물전달에 이용되면 기존 리간드 또는 약물의 단독의 투여보다 반감기가 길어지는 효과가 있다. 또한, 인간 혈청 알부민은 암 조직에 높은 표적성을 가져 다량의 알부민이 암 조직에 선택적으로 축적되는 현상을 나타나는데, 이는 암 조직 주변에서 증가되는 투과성 및 정체성 (Enhanced permeability and retention, EPR) 효과에 의한 것이다. 이러한 인간혈청 알부민이 가진 효과로 인해, 다양한 단백질, 리간드, 항체 및 항암제를 화학적으로 결합하여 암조직으로 표적화하고, 동시에, 단독 물질과 비교해 혈액 내에서 순환 시간을 증가시키는 연구들이 진행되고 있다.
그러나, 인간 혈청 알부민과 단백질, 리간드, 항체 또는 항암제를 화학적으로 결합할 때 나타나는 낮은 수율과 품질로 인한 제작의 곤란성, 고가의 비용, 알부민 고유 특성 유지를 위한 결합물질 양의 통제 기술 부재 등으로 인해 사업화는 힘든 실정이다.
코일드코일은 단백질 내 구조적 모티프이며, 2개 이상의 알파 나선으로 이루어져 있다. 코일드코일은 단백질을 올리고머화하는 일반적인 방법이다. 가장 전형적인 코일드코일 1차 서열은 반복성이며, '헵타드'로 불리는 7가지 잔기가 수소결합, 전기적결합, 소수 성결합 및 반데르발스 힘에 의해 두개의 코일드코일 형성 도메인이 결합할 수 있게 한다.
코일드코일을 접합하여 약물 전달체로 이용한 기술로는 recombinant bispecific monoclonal antibodies prepared by the dock-and-lock strategy for pretargeted radioimmunotherapy 가 있으며, 코일드코일의 해리를 줄이기 위해 disulfide bond bridge를 넣어 코일드코일의 안정성을 증가시킨 항체 절편 이중 표적 약물 시스템을 개시하고 있다. 본 기술은 분자 크기 증가에 따른 반감기 증가효과는 가져왔으나, 항체 또는 알부민이 가지고 있는 FcRn 결합능이 없어 약물의 반감기를 획기적으로 증가 시키는 데는 한계점이 있다.
본 발명은 알부민 또는 이의 유사체, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질을 제공한다.
본 발명은 상기 융합단백질을 암호화하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입된 숙주 세포, 상기 숙주 세포를 이용한 융합단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 알부민 또는 이의 유사체, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질; 제1 표적 결합 물질 및 제1' 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 제1 융합체; 및 제2 표적 결합 물질 및 제2' 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 제2 융합체;를 포함하고, 상기 제1 및 제2 융합체는 각각 융합단백질에 결합된 것인, 이중 표적 결합체를 제공한다.
본 발명은 상기 제1 융합체; 또는 상기 제2 융합체를 암호화하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입된 숙주 세포, 상기 숙주 세포를 이용한 제1 융합체 또는 제2 융합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 상기 이중 표적 결합체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 in vitro 상에서 알부민 또는 이의 유사체, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질; 제1 표적 결합 물질 및 제1' 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 제1 융합체; 및 제2 표적 결합 물질 및 제2' 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 제2 융합체;의 혼합물을 제조하는 단계를 포함하는, 이중 표적 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 명세서에서 특별히 정의되지 않은 용어들에 대해서는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것으로 이해되어야 할 것이다. 또한, 문맥상 특별히 정의하지 않은 경우라면, 단수는 복수를 포함하며, 복수는 단수를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용될 뿐 순서나 상위를 정하기 위해 사용되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 항목의 제목은 명세서 기재의 편의성을 위한 것일 뿐, 본 발명을 이로 제한하고자 함이 아니다.
융합단백질
본 발명의 일 양태는 알부민 또는 이의 유사체, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질이다. 본 발명에서, 상기 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인은 알부민 또는 이의 유사체의 N-말단 및 C-말단에 각각 연결된 것일 수 있고, 상기 제1 코일드코일 형성 도메인이 알부민 또는 이의 유사체의 N-말단에 연결되면 제2 코일드코일 형성 도메인은 알부민 또는 이의 유사체의 C-말단에 연결되고, 상기 제1 코일드코일 형성 도메인이 알부민 또는 이의 유사체의 C-말단에 연결되면 제2 코일드코일 형성 도메인은 알부민 또는 이의 유사체의 N-말단에 연결될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "융합단백질"은 적어도 두 개 이상 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산분자에 의해 발현된 하이브리드 단백질을 의미한다. 본 발명에 있어서 융합단백질은 "X-HSA-Y"로 표기될 수 있으며, 여기서 X 및 Y는 본 명세서에서 알파벳으로 부여된 임의의 코일드코일 형성 도메인을 의미하고, HAS(Human Serum Albumin, 인간 혈청 알부민)는 알부민 또는 이의 유사체를 의미하며, "-"는 코일드코일 형성 도메인이 HSA에 연결되어 있음을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "알부민(Albumin)"은 간 세포에서 일차적으로 합성되는 포유류의 혈장에서 가장 풍부한 단백질로서, 혈액 삼투압의 유지, 다양한 기질의 수송 등에 있어서 중요한 역할을 하는 다기능성 혈장 단백질을 의미한다. 상기 알부민은 인간 혈청 알부민(Human Serum Albumin, HSA) 또는 임의의 다른 분리된 또는 천연적으로 발생한 알부민일 수 있다. 알부민은 I, II 및 III의 3개의 도메인을 가지며, 각각의 도메인은 서브도메인 A 및 B로 구성되어 있다. 알부민은 3주의 혈장 반감기를 가지며, 상기 알부민의 긴 반감기는 FcRn(Neonatal Fc receptor)에 의한 알부민의 세포 내 분해와 연관되어 있으며, 알부민의 도메인 I 및 III가 FcRn에 대한 결합에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "유사체"는 모(parent) 단백질 또는 모 폴리펩타이드로부터 유래된 것으로, 목적하는 특성을 제공하고 있는 부분을 포함하고 있어 모 단백질 또는 폴리펩타이드와 동일 또는 유사한 특성을 나타내는 것을 의미한다. 본 발명에서 유사체는 "변이체"에 포함되는 용어로 사용되었으며, 변이체는 모(parent) 단백질 또는 폴리펩타이드 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기에 삽입, 결실, 부가 및/또는 치환이 발생한 단백질 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 또한, 단백질 효소 절단, 인산화 또는 기타 변형에 의해 변형되었으나, 본 발명의 융합단백질이 가지는 목적하는 특성, 예를 들면, 반감기의 증가 특성을 유지하는 것을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 변이체는 본 발명에 개시된 서열과 최소 80 %의 상동성, 구체적으로 최소 90 %의 상동성, 보다 구체적으로는 최소 95 %의 상동성을 가지는 것일 수 있다. 예를 들면, 알부민 유사체는 목적하는 특성의 향상을 위한 야생형 알부민 또는 이의 도메인의 아미노산 서열 중 일부 서열의 치환을 포함할 수 있다. 예를 들면, 알부민의 전체 아미노산 서열 중 FcRn에 대한 친화성을 향상시키는 아미노산 치환을 행함으로 인해 혈중 반감기를 연장하는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 선택적으로 특정 위치의 아미노산(들)을 결실하거나 하나 이상의 아미노산으로 치환 또는 하나 이상의 아미노산을 삽입하는 것을 포함하고, 이는 WO 2011051489에 기술된 것을 참조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 목적하는 특성은 생물학적으로 요구되는 활성은 유지하면서 특정 물질을 표적화하고, 안정성이 증가하며, 반감기가 증가하는 특성일 수 있으며, 바람직하게는 반감기의 증가 특성일 수 있다. 또한, 목적하는 특성을 제공하는 부분은 알부민의 혈청 반감기 증가에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 알부민 도메인 I 및 III 포함하거나 또는 알부민의 FcRn 결합 단편을 포함하는 부분일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 알부민의 유사체는 알부민으로부터 유래되고 알부민의 특성인 긴 반감기를 가지는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 알부민 및 이의 유사체는 알부민의 도메인 I 및 III 중 하나 이상을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 알부민 및 이의 유사체는 알부민의 FcRn 결합 단편을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "FcRn"은 신생아 Fc 수용체, Brambell 수용체 등으로도 지칭되며, FCGRT 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 의미한다. FcRn은 MHC class I 관련 단백질로서, 혈관 내피세포에서 발현되고 IgG 및 알부민에 결합하며, 이에 관하여는 "Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells" 및 "FcRn: the neonatal Fc receptor comes of age"에 상세히 기재되어 있다(Molecular Biology of the Cell.　19　(12): 5490-505., Nature Reviews. Immunology.　7　(9): 715-25).
본 발명에서 사용되는 용어 "FcRn 결합 단편"은 전장 알부민의 아미노산 서열과 비교하여 일부 아미노산이 결여되었으나, FcRn에 결합하여 반감기 증가 효과를 제공할 수 있는 알부민의 일부분을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "상동성"은 두 개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 얼라인하고 비교하여 결정되는 서열 유사성을 의미하며, 이러한 상동성은 일반적으로 "상동성 퍼센트"로 표시된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "단백질" 또는 "폴리펩타이드"는 아미노산 잔기의 중합체를 의미하는 것으로 본 발명에서는 상호교환적으로 사용된다.
본 발명에서 융합단백질의 형성에 사용되는 알부민 또는 이의 유사체는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 다만, 면역원성을 회피하기 위해 인간 혈청에서 유래된 인간 혈청 알부민(Human serum albumin, HSA)인 것이 바람직하고, 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 알부민 또는 이의 유사체는 인간 혈청 알부민 또는 이의 유사체일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 알부민 또는 이의 유사체는 추가적인 특성을 제공하기 위해 임의의 분자 또는 물질을 더 포함할 수 있다. 추가적인 특성을 제공하는 임의의 분자 또는 물질은 세포독성 또는 약학적 활성 잔기와 같은 치료적 또는 진단적 잔기, 또는 대상체에 투여 또는 기타 시험관 내 사용을 위한 융합단백질의 적합성을 증가시키는 분자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 알부민 또는 이의 유사체는 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol, PEG)을 더 포함하여, FcRn에 대한 결합능을 저하시키지 않으면서도 생체적합성이 향상되는 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에서 "코일드코일 형성 도메인"은 다른 코일드코일 형성 도메인과 결합하여 코일드코일을 형성할 수 있는 단백질을 의미한다. 코일드코일은 2개 이상일 수 있고, 구체적으로는 2개 내지 7개의 알파 나선이 로프의 가닥처럼 함께 감겨있는 구조적 모티프이다. 예를 들면, 상기 코일드코일 도메인의 1차 구조는 7개의 아미노산 서열의 연속적인 반복 패턴을 가지는 헵타드 반복부(heptad repeat)를 포함할 수 있다. 상기 헵타드 반복부는(abcdefg)n으로 표시될 수 있으며, 여기서 n은 반복 횟수이고, a 및 d에는 소수성 아미노산 잔기가 위치하여 코일드코일의 소수성 코어를 이루며, e 및 g 위치에는 전하를 띠는 아미노산 잔기가 위치하여 이온성 상호작용을 가능하게 한다. 이러한 특징은 코일드코일 형성 도메인들 간에 소수성 및/또는 이온성 상호작용인 비공유결합을 가능하게 하여, 개별 코일드코일 형성 도메인들이 서로 결합(자가결합) 하여 코일드 코일을 형성할 수 있도록 한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제1 및 제2 코일드코일 형성 도메인은 엘라스틴 유사 폴리펩타이드, BECN(Beclin) 도메인, bZIP VBP(basic leucine zipper vitellogenin-binding protein), 케라틴 중간 섬유, AP1(Jun/Fos), MBD2-NuRD(methyl-binding　domain　protein 2-Nucleosome Remodeling and Deacetylase) 도메인, GABA(γ-aminobutyric acid) 수용체, 아연집게 도메인, 류신 지퍼 및 이들의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 제1 및 제2 코일드코일 형성 도메인은 다른 코일드코일 형성 도메인과 결합하여 코일드코일을 형성할 수 있는 것으로 알려진 것이라면 본 발명에 적용할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인은 각각 서열번호 4, 5, 6, 16, 17 및 18로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 변이체의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "변이체"는 모(parent) 단백질 또는 폴리펩타이드 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기에 삽입, 결실, 부가 및/또는 치환이 발생한 단백질 또는 폴리펩타이드를 의미할 수 있으며, 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 "아미노산 서열의 변이체"는 상기 서열번호 4, 5, 6, 16, 17 및 18로 표시되는 아미노산 서열으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열의 N-말단 및 C-말단 중 적어도 하나에 시스테인이 부가된 것일 수 있다. 구체적으로, 양 말단에 시스테인이 각각 적어도 하나 이상 부가될 수 있고, 보다 구체적으로 양 말단에 시스테인이 각각 하나씩 부가될 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 아미노산 서열의 변이체는 서열번호 42, 43, 44, 48, 49 및 50으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열일 수 있고, 상기 서열번호 4, 5, 6, 16, 17 및 18로 표시되는 아미노산 서열으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열의 N-말단 및 C-말단에 시스테인이 각각 하나씩 부가된 것일 수 있다.
상기와 같이 시스테인을 부가로 돌연변이된 코일드코일 형성 도메인은 당해 기술 분야에 공지된 기술, 예를 들어 펩타이드 합성법 또는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "돌연변이화"는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 내에 그 서열의 변이체를 생성하기 위해 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드를 변경, 결실 또는 삽입하는 것을 의미한다. 구체적으로, 상기 아미노산 서열의 변이체는 코일드코일 형성 도메인의 양 말단(즉, N-말단 및 C-말단)에 시스테인을 부가한 펩타이드를 암호화하는 DNA를 사용하여 재조합 플라스미드를 구축하고 숙주 세포에 형질전환한 후, 상기 시스테인이 부가된 코일드코일 형성 도메인을 발현시켰다. 상기 발현된 시스테인이 부가된 코일드코일 형성 도메인은, 시스테인이 부가된 다른 코일드코일 형성 도메인과 결합하여 코일드코일을 형성할 수 있고 각기 다른 코일드코일 형성 도메인에 부가된 시스테인들 사이에는 이황화결합이 형성되어 결합 안정성이 향상된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인은 알부민 또는 이의 유사체의 N-말단 및 C-말단에 각각 연결된 것일 수 있고, 상기 제1 코일드코일 형성 도메인이 알부민 또는 이의 유사체의 N-말단에 연결되면 제2 코일드코일 형성 도메인은 알부민 또는 이의 유사체의 C-말단에 연결되고, 상기 제1 코일드코일 형성 도메인이 알부민 또는 이의 유사체의 C-말단에 연결되면 제2 코일드코일 형성 도메인은 알부민 또는 이의 유사체의 N-말단에 연결될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "N-말단" 및 "C-말단"은 폴리펩타이드에 있어서 아미노 말단 및 카복시 말단을 의미하며, 본 발명에서 특별히 명시하지 않는 이상 일반적으로 사용되는 바와 같이 서열의 왼쪽이 아미노 말단, 오른쪽은 카복시 말단을 나타낸다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "양 말단"은 "N-말단" 및 "C-말단" 모두를 의미한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인은 상호간 결합을 통해 코일드코일을 형성할 수 없는 것일 수 있다. 만약 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 상호 결합하여 코일드코일을 형성한다면 알부민 또는 이의 유사체의 양 말단에 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질(이하, 융합단백질) 간의 결합이 증가하여 알부민 및 표적 결합 물질 결합체(이하, 이중 표적 결합체)의 수득율이 감소할 것이므로, 본 발명과 같이 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 상호간 결합을 통해 코일드코일을 형성할 수 없다면, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인 결합의 상호 결합에 의한 융합단백질 간 결합은 감소하고 이중 표적 결합체의 수득율이 향상되는 효과가 나타난다.
본 발명의 실시예에 따르면, 알부민 또는 이의 유사체에 연결된, 제1 코일드코일 형성 도메인의 아미노산 서열과 제2 코일드코일 형성 도메인의 아미노산 서열은 상이한 것일 수 있다. 본 발명과 같이 상기 제1 코일드코일 형성 도메인과 제2 코일드코일 형성 도메인이 서로 상이한 아미노산 서열을 포함하는 경우, 융합단백질에 동일한 표적 결합 물질이 연결된, 융합체 두 개가 결합하는 경우가 감소하고 융합단백질에 서로 다른 표적 결합 물질이 연결된, 융합체 두 개가 결합하는 경우가 증가할 것이며, 이중 표적 결합체의 제조 시, 서로 다른 표적 결합 물질이 연결된 융합체들의 혼합비 예측이 가능하여 다양한 조합의 약물을 신속, 간편하게 수득할 수 있을 뿐만 아니라 이중 표적 결합체의 수득율이 향상된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 제1 코일드코일 형성 도메인은 서열번호 4, 5, 6, 16, 17, 18, 42, 43, 44, 48, 49 및 50으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 제2 코일드코일 형성 도메인은 서열번호 4, 5, 6, 16, 17, 18, 42, 43, 44, 48, 49 및 50으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 서열번호 16 또는 48로 표시되는 아미노산 서열은 서로 결합을 형성할 수 있고, 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열은 양 말단에 시스테인이 부가된 것을 제외하고는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 동일한 서열로 볼 수 있으므로, 제1 코일드코일 형성 도메인이 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경우, 제2 코일드 코일 형성 도메인은 서열번호 5, 6, 17, 18, 43, 44, 49 및 50으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 제1 코일드코일 형성 도메인이 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경우, 제2 코일드 코일 형성 도메인은 서열번호 4, 6, 16, 18, 42, 44, 48 및 50으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 제1 코일드코일 형성 도메인이 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경우, 제2 코일드 코일 형성 도메인은 서열번호 4, 5, 16, 17, 42, 43, 48 및 49로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 제1 코일드코일 형성 도메인이 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경우, 제2 코일드 코일 형성 도메인은 서열번호 5, 6, 17, 18, 43, 44, 49 및 50으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 제1 코일드코일 형성 도메인이 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경우, 제2 코일드 코일 형성 도메인은 서열번호 4, 6, 16, 18, 42, 44, 48 및 50으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 제1 코일드코일 형성 도메인이 서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경우, 제2 코일드 코일 형성 도메인은 서열번호 4, 5, 16, 17, 42, 43, 48 및 49로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인은 서열번호 5 및 4; 43 및 42; 또는 44 및 42으로 표시되는 아미노산 서열들일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명의 융합단백질은 생산수율, 품질관리 등을 위한 임의의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 단백질을 세포 밖으로 분비시킬 수 있도록 하는 아미노산 서열, 예를 들어 단백질의 N-말단에 위치하는 시그널 펩타이드와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에 따르면, 알부민 또는 이의 유사체; 및 코일드코일 형성 도메인 사이에 링커를 더 포함하는 것일 수 있다. 본 발명과 같이 알부민 또는 이의 유사체; 및 코일드코일 형성 도메인 사이에 링커를 포함하게 되면 알부민 또는 이의 유사체, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 결합할 때 발생하는 입체 장애 등을 감소시켜 코일드코일 형성을 촉진하는 효과가 있다.
본 발명에 사용되는 용어 "링커"는 알부민 또는 이의 유사체의 N-말단 또는 C-말단 및 표적 결합 물질의 N-말단 또는 C-말단 사이에 존재하는 아미노산을 의미한다. 상기 링커는 임의의 아미노산 조합인 것을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 코일드코일 형성 도메인에 유연성을 부여할 수 있는 링커라면 어느 것이든 사용 가능하다. 또한, 상기 링커는 임의의 길이를 가질 수 있으나, 코일드코일 형성에 있어서 최적의 안정성을 확보할 수 있으면서도 생물학적 활성에 영향을 주지 않는 범위인 것이 바람직하다. 상기 링커는 아미노산이 30개 미만일 수 있으며, 바람직하게는 15개 미만일 수 있다. 또한, 상기 링커는 글라이신 및 세린이 풍부한 것이 바람직하며, 구체적으로 Gly-Gly-Gly-Ser, Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 또는 이들의 조합이 2회 내지 6회 반복되는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 융합단백질에서 알부민 또는 이의 유사체는 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열이고, 상기 제1 및 제2 코일드코일 형성 도메인은 서열번호 4, 5, 6, 16, 17, 18, 42, 43, 44, 48, 49 및 50으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 이 경우 상기 제1 코일드 코일 형성 도메인과 제2 코일드 코일 형성 도메인을 서로 결합하여 코일드 코일을 형성하지 못하고, 상기 제1 코일드 코일 형성 도메인과 제2 코일드 코일 형성 도메인의 아미노산 서열은 서로 상이한 것이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 알부민 또는 이의 유사체, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질은 서열번호 8, 53, 11 및 12에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는, 알부민 또는 이의 유사체, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질을 암호화하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입된 숙주 세포, 상기 숙주 세포를 이용한 알부민 또는 이의 유사체, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질을 제조하는 방법이다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태는, 상기 융합단백질은 알부민 또는 이의 유사체; 및 코일드코일 형성 도메인 사이에 링커를 더 포함하는 융합단백질일 수 있고, 상기 링커를 포함하는 융합단백질을 암호화하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입된 숙주 세포, 상기 숙주 세포를 이용한 상기 융합단백질;을 제조하는 방법이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 먼저 코일드코일 형성 도메인의 DNA를 각각 알부민 또는 이의 유사체의 N-말단 및 C-말단에 해당하는 DNA 서열 위치에 연결하여, 알부민 또는 이의 유사체 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질을 암호화하는 DNA를 준비하였다. 그 다음, 상기 DNA를 pcDNA 3.1 벡터에 도입하여, 7895 bp 크기의 재조합 벡터를 제작하였다. 그 다음, 상기 벡터를 숙주 세포, 구체적으로 CHO 세포에 형질전환시켜 상기 융합단백질을 빠른 시간 내에 제조하기 위한 임시발현(transient expression) 시스템을 확립하였다.
또한, 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 융합단백질을 암호화하는 DNA는 알부민 또는 이의 유사체; 및 코일드코일 형성 도메인을 암호화하는 DNA 사이에 링커를 암호화하는 DNA를 더 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 융합단백질을 암호화하는 DNA는 각 코일드코일 형성 도메인의 DNA의 양 말단(N-말단 및 C-말단에 해당하는 DNA 서열 위치)에 시스테인을 암호화하는 서열이 부가된 것일 수 있다. 상기 DNA에 의해 발현된, 양 말단에 시스테인이 부가된 코일드코일 형성 도메인을 포함하는 융합단백질;과 양 말단에 시스테인이 부가된 코일드코일 형성 도메인과 연결된 표적 결합 물질;의 코일드코일 형성 도메인 사이의 결합으로 코일드코일의 형성 시 양 말단에 위치한 시스테인 사이에 이황화결합이 형성되어 코일드코일의 안정성이 향상된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 알부민 또는 이의 유사체, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질을 암호화하는 핵산분자는 서열번호 7, 52, 9 및 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "핵산분자"는 DNA 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 상기 핵산분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다. 본 발명의 융합단백질을 암호화하는 핵산 분자의 서열은 변형될 수 있으며, 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
본 발명의 핵산분자는 상기한 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 본 발명에서 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 80 %의 상동성, 구체적으로 최소 90 %의 상동성, 보다 구체적으로는 최소 95 %의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함하며, 구체적으로 플라스미드 벡터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 벡터에서 융합단백질을 암호화하는 핵산 분자는 프로모터와 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "작동 가능하게 연결된"은 핵산 발현조절서열(예컨대, 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 예컨대, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli(예를들면, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol.,(1984) 158:1018-1024), 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet.,(1980) 14:399-445)가 조절부위로서 이용될 수 있다. 숙주 세포로서 바실러스 균이 이용되는 경우, 바실러스 츄린겐시스의 독소단백질 유전자의 프로모터 (Appl. Environ. Microbiol.(1998) 64:3932-3938; Mol. Gen. Genet.(1996) 250:734-741) 또는 바실러스균에서 발현 가능한 어떠한 프로모터라도 조절부위로 이용될 수 있다.
한편, 본 발명의 재조합 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pCL, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다. 구체적으로, 본 발명의 재조합 벡터는 CMV 프로모터를 포함한다.
한편, 본 발명의 재조합 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포라면 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 벡터의 적합한 진핵 숙주 세포는 아스페르길러스 속(Aspergillus species)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등 진핵 세포, 곤충-유래 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포, 그리고 식물 또는 포유동물로부터 유래한 세포를 이용할 수 있다.
구체적으로, 숙주 세포는 COS7 세포(monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 또는 293 세포일 수 있으며, 보다 구체적으로는 차이니즈 햄스터 난소 세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서, 숙주 세포로의 "형질전환"은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 상기와 같은 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개 형질전환 방법 등이 포함되나, 이로 한정되지 않는다.
본 발명에서 상기 숙주 세포를 이용한 융합단백질을 제조하는 방법은, 구체적으로 (a) 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 숙주 세포에서 융합단백질을 발현시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 융합단백질 제조에서 형질전환 된 숙주 세포의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 이러한 배양 방법은 다양한 문헌(예를 들면, James M. Lee, Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions, 138-176)에 개시되어 있다. 세포 배양은, 세포의 성장방식에 따라 현탁배양과 부착배양, 배양방법에 따라 회분식, 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다.
동물 세포 배양에 있어, 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예는, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분 및 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유 및 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산 및 리놀레산과 같은 지방산, 글라이세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 그리고 아세트산과 같은 유기산을 포함할 수 있으며, 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 질소원은, 예컨대 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL) 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원을 포함할 수 있으며, 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃내지 45℃ 바람직하게는 25℃내지 40℃이다.
상기 제조방법은, (c) 상기 숙주 세포에서 발현된 알부민 또는 이의 유사체, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 연결된 융합단백질을 회수하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 수득한 융합단백질은 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며, 또는 추가로 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전 및 크로마토그래피 등을 이용하여 고순도로 정제하여 사용될 수 있다. 그 중에서 크로마토그래피를 이용하는 방법이 가장 많이 사용되며, 컬럼의 종류와 순서는 융합단백질의 특성, 배양방법 등에 따라 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등에서 선택할 수 있다.
결합체
본 항목에 있어서 상기 "융합단백질" 항목에서 설명한 바와 동일한 내용에 대해서는 명세서의 복잡성 및 과도한 반복을 피하기 위해 생략한다.
본 발명의 일 양태는, 알부민 또는 이의 유사체, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질; 제1 표적 결합 물질 및 제1' 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 제1 융합체; 및 제2 표적물질 및 제2' 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 제2 융합체;를 포함하고, 상기 제1 및 제2 융합체는 각각 융합단백질에 결합된 것인, 이중 표적 결합체이다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제1 및 제2 융합체는 각각 상기 융합단백질의 서로 다른 위치에 결합한다. 도 1에서 알부민 또는 이의 유사체, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질; 제1 표적 결합 물질 및 제1' 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 제1 융합체; 및 제2 표적물질 및 제2' 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 제2 융합체의 개략적인 모식도를 나타내었다.
본 발명에서 사용되는 용어 "이중 표적 결합체"는 2종의 표적 결합 물질이 코일드코일에 의해 알부민 또는 이의 유사체에 결합되어 있는 것을 의미하고, 이는 알부민 또는 이의 유사체 및 표적 결합 물질의 결합체을 의미하는 것으로 본 발명에서는 상호교환적으로 사용된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "표적 결합 물질"은 특정 단백질, 예를 들어 항원과 같은 단백질과 상호작용 하거나, 발현 시 특정 기능을 수행할 수 있는 물질을 말한다. 상기 표적 결합 물질은 특정 단백질과 상호작용할 수 있는 천연형 단백질뿐 아니라, 기능을 담당하는 도메인 또는 폴리펩타이드의 일부일 수 있으며, 생체 내 존재하지 않는 화합물일 수 있다. 또한, 의약, 약학 등에 유용한 후보물질이나 치료제, 생체 내 작용을 일으키는 물질일 수 있으며, 예를 들면 단백질, 펩타이드, 단백질 도메인, 약물, 독소, 세포독성제, 조영제, 방사성핵종(방사성 동위원소), 방사성 화합물, 유기 중합체, 무기 중합체, 비오틴, 항체, 항체의 도메인, 항체 단편, 단일쇄 항체, 도메인 항체, 효소, 리간드, 수용체, 결합 펩타이드, 에피토프 태그, 재조합 폴리펩타이드 중합체, 사이토카인, 핵산 또는 저분자 화합물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "융합체"는 한 개 이상의 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산분자에 의해 발현된 단백질 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산분자에 의해 발현된 단백질에 상기 정의한 표적 결합 물질이 연결된, 융합 물질을 의미한다. 본 발명에 있어서 융합체는 "표적 결합 물질-Z"로 표기될 수 있으며, 여기서 Z는 본 명세서에서 알파벳으로 부여된 임의의 코일드코일 형성 도메인의 알파벳을 의미하고, "-"는 코일드코일 형성 도메인이 표적 결합 물질에 연결되어 있음을 의미한다. 여기서, 표적 결합 물질과 Z로 표시되는 코일드코일 형성 도메인의 연결 부위는 표적 결합 물질이 상기 결합 물질을 인식하는 리셉터와 상호 작용하는 부위를 고려하여, 상기 상호 작용을 방해하지 않는 부위로 선택될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 이중 표적 결합체에 포함된 상기 제1, 제2, 제1' 및 제2' 코일드코일 형성 도메인은 엘라스틴 유사 폴리펩타이드, BECN(Beclin) 도메인, bZIP VBP(basic leucine zipper vitellogenin-binding protein), 케라틴 중간 섬유, AP1(Jun/Fos), MBD2-NuRD(methyl-binding　domain　protein 2-Nucleosome Remodeling and Deacetylase) 도메인, GABA(γ-aminobutyric acid) 수용체, 아연집게 도메인, 류신 지퍼 또는 이들의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 제1, 제2, 제1' 및 제2' 코일드코일 형성 도메인은 다른 코일드코일 형성 도메인과 결합하여 코일드코일을 형성할 수 있는 것으로 알려진 것이라면 본 발명에 적용할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 이중 표적 결합체에 포함된 상기 제1, 제2, 제1' 및 제2' 코일드코일 형성 도메인은 각각 서열번호 4, 5, 6, 16, 17 및 18로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 변이체의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 "아미노산 서열의 변이체"는 상기 서열번호 4, 5, 6, 16, 17 및 18로 표시되는 아미노산 서열으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열의 N-말단 및 C-말단 중 적어도 하나에 시스테인이 부가된 것일 수 있다. 구체적으로, 양 말단에 시스테인이 각각 적어도 하나 이상 부가될 수 있고, 보다 구체적으로 양 말단에 각각 하나씩 부가될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 아미노산 서열의 변이체는 서열번호 42, 43, 44, 48, 49 및 50으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열일 수 있고, 상기 서열번호 4, 5, 6, 16, 17 및 18로 표시되는 아미노산 서열으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열의 N-말단 및 C-말단에 시스테인이 각각 하나씩 부가된 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인은 상호간 결합을 통해 코일드코일을 형성할 수 없는 것일 수 있고, 제1' 코일드코일 형성 도메인 및 제2' 코일드코일 형성 도메인은 상호간 결합을 통해 코일드코일을 형성할 수 없는 것일 수 있다. 만약 제1' 코일드코일 형성 도메인 및 제2' 코일드코일 형성 도메인이 상호 결합하여 코일드코일을 형성한다면 융합체 간의 결합이 증가하여 이중 표적 결합체의 수득율이 감소할 것이므로, 본 발명과 같이 제1' 코일드코일 형성 도메인 및 제2' 코일드코일 형성 도메인이 상호간 결합을 통해 코일드코일을 형성할 수 없다면, 제1' 코일드코일 형성 도메인 및 제2' 코일드코일 형성 도메인의 상호 결합에 의한 융합체 간 결합은 감소하고 이중 표적 결합체의 수득율이 향상되는 효과가 나타난다.
본 발명의 실시예에 따르면, 이중 표적 결합체에 포함된, 제1 코일드코일 형성 도메인의 아미노산 서열, 제2 코일드코일 형성 도메인의 아미노산 서열, 제1' 코일드코일 형성 도메인의 아미노산 서열 및 제2' 코일드코일 형성 도메인의 아미노산 서열은 상이한 것일 수 있다. 본 발명에서와 같이 상기 제1, 제2, 제1' 및 제2' 코일드코일 형성 도메인이 서로 상이한 아미노산 서열을 포함하는 경우, 융합단백질에 동일한 표적 결합 물질이 연결된, 융합체 두 개가 결합하는 경우가 감소하고 융합단백질에 서로 다른 표적 결합 물질이 연결된, 융합체 두 개가 결합하는 경우가 증가할 것이며, 이중 표적 결합체의 제조 시, 서로 다른 표적 결합 물질이 연결된 융합체들의 혼합비 예측이 가능하여 다양한 조합의 약물을 신속, 간편하게 수득할 수 있을 뿐만 아니라 이중 표적 결합체의 수득율이 향상된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 제1 코일드코일 형성 도메인은 서열번호 4, 5, 6, 16, 17, 18, 42, 43, 44, 48, 49 및 50으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 제2 코일드코일 형성 도메인은 서열번호 4, 5, 6, 16, 17, 18, 42, 43, 44, 48, 49 및 50으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 제1' 코일드코일 형성 도메인은 서열번호 4, 5, 6, 16, 17, 18, 42, 43, 44, 48, 49 및 50으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 제2' 코일드코일 형성 도메인은 서열번호 4, 5, 6, 16, 17, 18, 42, 43, 44, 48, 49 및 50으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 이중 표적 결합체에서 상기 제1 및 제1' 코일드코일 형성 도메인은 결합하여 제1 코일드코일을 형성하고, 상기 제2 및 제2' 코일드코일 형성 도메인은 결합하여 제2 코일드코일을 형성하는 것일 수 있다. 예를 들면, 제1 코일드코일 형성 도메인이 서열번호 4 및 42로 표시되는 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경우 제1' 코일드코일 형성 도메인은 서열번호 16 및 48로 표시되는 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 제1 코일드코일 형성 도메인은 서열번호 5 및 43으로 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경우 제1' 코일드코일 형성 도메인은 서열번호 17 및 49로 표시되는 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있으며, 제1 코일드코일 형성 도메인은 서열번호 6 및 44로 표시되는 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경우 제1' 코일드코일 형성 도메인은 서열번호 18 및 50으로 표시되는 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 이는 제2 코일드코일 형성 도메인과 제2' 코일드코일 형성 도메인의 경우에도 같다. 또한, 본 발명의 실시예에 따르면, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 서열번호 16 또는 48로 표시되는 아미노산 서열은 서로 결합을 형성할 수 있고, 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열은 양 말단에 시스테인이 부가된 것을 제외하고는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 동일한 서열로 볼 수 있으므로, 제1 코일드코일 형성 도메인이 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경우, 제1' 코일드코일 형성 도메인은 서열번호 16 또는 48로 표시되는 아미노산 서열 중 하나를 포함할 수 있고, 제2 코일드 코일 형성 도메인은 서열번호 5, 6, 17, 18, 43, 44, 49 및 50으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 제2' 코일드코일 형성 도메인은, 제2 코일드코일 형성 도메인이 서열번호 5로 표시되는 아미노산을 포함하는 경우 서열번호 17 또는 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 제2 코일드코일 형성 도메인이 서열번호 6으로 표시되는 아미노산을 포함하는 경우 서열번호 18 또는 50으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 제2 코일드코일 형성 도메인이 서열번호 17로 표시되는 아미노산을 포함하는 경우 서열번호 5 또는 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 제2 코일드코일 형성 도메인이 서열번호 18로 표시되는 아미노산을 포함하는 경우 서열번호 6 또는 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 제2 코일드코일 형성 도메인이 서열번호 43으로 표시되는 아미노산을 포함하는 경우 서열번호 17 또는 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 제2 코일드코일 형성 도메인이 서열번호 44로 표시되는 아미노산을 포함하는 경우 서열번호 18 또는 50으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 제2 코일드코일 형성 도메인이 서열번호 49로 표시되는 아미노산을 포함하는 경우 서열번호 5 또는 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 제2 코일드코일 형성 도메인이 서열번호 50으로 표시되는 아미노산을 포함하는 경우 서열번호 6 또는 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 제1 코일드코일 형성 도메인은 서열번호 5, 43 및 44로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열일 수 있고, 제2 코일드코일 형성 도메인은 서열번호 4 또는 42로 표시되는 아미노산 서열 중 하나일 수 있으며, 제1' 코일드코일 형성 도메인은 17, 49 및 50으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열일 수 있으며, 제2' 코일드코일 형성 도메인은 16 또는 48로 표시되는 아미노산 서열 중 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 이중 표적 결합체에서 상기 제1 및 제2 코일드코일은, 각각 a) 해리상수(Kd)가 10 nM 이하이고, b) 헤테로다이머 형태의 코일드코일 형성 도메인을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 코일드코일 형성 도메인들 간의 결합은 자가결합인 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 코일드코일 형성 도메인들 간의 자가결합은 비공유결합일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 이중 표적 결합체에서 상기 코일드코일 형성 도메인들의 양 말단 중 적어도 하나 이상에서 시스테인 잔기가 하나 이상 부가되고, 하나 이상의 이황화결합이 상기 부가된 하나 이상의 시스테인 잔기 사이에서 추가로 형성되는 것일 수 있다. 본 발명과 같이 코일드코일 형성 도메인 간의 결합에 있어서, 비공유결합에 해당하는 자가결합 이외에 추가로 공유결합인 이황화결합을 더 포함하면 코일드코일 형성 도메인 간의 결합 안정성이 더 향상된다.
본 발명의 용어, "자가결합"은 펩타이드 자체 또는 펩타이드 사이에서, 펩타이드에 포함된 도메인들 간에 소수성, 이온성 상호작용 등에 의해 형성되는 비공유결합을 의미한다. 예를 들면, 코일드코일 도메인의 1차 구조는 소수성 아미노산 잔기가 위치하여 코일드코일의 소수성 코어를 이루며, 전하를 띠는 아미노산 잔기가 있어 이온성 상호작용을 가능하게 하여 상기 아미노산을 포함하는 도메인 사이에 소수성, 이온성 상호작용인 비공유결합에 의해 코일드 코일을 형성할 수 있도록 한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 이중 표적 결합체에 포함된 상기 제1 및 제2 표적 결합 물질은 서로 상이한 것 일 수 있다. 이중 표적 결합체는 표적이 되는 분자 등에 결합할 수 있는 표적능 및/또는 치료능을 나타내는 어느 하나의 표적 결합 물질 및 표적능 및/또는 치료능을 나타내는 다른 하나의 표적 결합 물질을 동시에 포함하기 때문에 특정 표적 분자를 발현하는 조직 또는 세포 등에 특이적으로 치료제를 전달할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제1 및 제2 표적 결합 물질은 각각 단백질, 항체, 항체절편, 호르몬 및 펩타이드를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제1 또는 제2 표적 결합 물질은 암 세포 상의 표면 항원을 표적으로 하는 것일 수 있다. 예를 들면, CD2, CD317, CEACAM5, CEACAM6, DR5, EphA2, gpA33, Her2, B7-H3, EGF, EGFR, VEGF 및 VEGFR로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제1 및 제2 표적 결합 물질 중 적어도 어느 하나는 치료제일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "치료제"는 치료효과가 밝혀진, 목적하는 치료 효과를 위해 대상체에 투여되는 분자를 의미한다. 치료제의 예로서, 단백질, 펩타이드, 단백질 도메인, 약물, 독소, 세포독성제, 조영제, 방사성핵종(방사성 동위원소), 방사성 화합물, 유기 중합체, 무기 중합체, 비오틴, 항체, 항체의 도메인, 항체 단편, 단일쇄 항체, 도메인 항체, 효소, 리간드, 수용체, 결합 펩타이드, 에피토프 태그, 재조합 폴리펩타이드 중합체, 사이토카인, 핵산 또는 저분자 화합물을 포함하며, 예를 들면, GFP, mCherry, PD-1, CD80, Insulin 및 GLP-1일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 대상체는 인간 또는 비-인간 포유류를 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제1 및 제2 표적 결합 물질은 각각 GFP, mCherry, PD-1, CD80, Insulin 및 GLP-1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있고, 상기 제1 및 제2 표적 결합 물질은 서로 상이한 것이다.
또한, 본 발명의 실시예에 따르면, 이중 표적 결합체(알부민 또는 이의 유사체 및 2종의 표적 결합 물질의 결합체)는 상기 2종의 표적 결합 물질이 직접 알부민의 N-말단 및 C-말단에 각각 연결된, 융합단백질과 대비 시 각 표적 결합 물질 본연의 구조 및 활성이 더 잘 유지되었다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 이중 표적 결합체에 포함된, 제1 융합체 및 제2 융합체는 표적 결합 물질 및 코일드코일 형성 도메인 사이에 링커를 더 포함할 수 있다. 본 발명과 같이 상기 이중 표적 결합체에 포함된, 표적 결합 물질 및 코일드코일 형성 도메인 사이에 링커를 더 포함하게 되면 융합단백질의 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 각각 표적 결합 물질에 연결된 제1' 코일드코일 형성 도메인 및 제2' 코일드코일 형성 도메인과 결합할 때 발생하는 입체 장애 등이 감소되어 코일드코일 형성을 촉진하고 안정화하는 효과가 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제1 융합체 및 제2 융합체는 각각 서열번호 21, 22, 25, 26, 28, 30, 38 및 51로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 이중 표적 결합체는 in vitro 상에서 제조되는 것일 수 있는데, 알부민 또는 이의 유사체, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질; 제1 표적 결합 물질 및 제1' 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 제1 융합체; 및 제2 표적 결합 물질 및 제2' 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 제2 융합체를 in vitro 상에서 혼합하여 제조되는 것일 수 있다. 본 발명과 같이 이중 표적 결합체를 이루는 융합단백질, 제1 융합체 및 제2 융합체를 각각 따로 제조하고 in vitro 상에서 혼합하여 조립하는 경우, 2종의 표적 결합 물질이 인프레임 상에서 발현될 경우 대비 각 표적 결합 물질의 본연의 구조 및 활성이 잘 유지된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 이중 표적 결합체는 융합단백질과 제1 융합체를 1:2 내지 1:10의 몰농도 비율로 혼합하여 제조되는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 이중 표적 결합체는 융합단백질과 제2 융합체를 1:2 내지 1:10의 몰농도 비율로 혼합하여 제조되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는, 제1 표적 결합 물질 및 제1' 코일드코일 형성 도메인이 연결된 제1 융합체; 또는 제2 표적 결합 물질 및 제2' 코일드코일 형성 도메인이 연결된 제2 융합체;를 암호화하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입된 숙주 세포, 상기 숙주 세포를 이용한 제1 융합체 및 제2 융합체를 제조하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는, in vitro 상에서 알부민 또는 이의 유사체, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질; 제1 표적 결합 물질 및 제1' 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 제1 융합체; 및 제2 표적 결합 물질 및 제2' 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 제2 융합체;의 혼합물을 제조하는 단계를 포함하는, 이중 표적 결합체의 제조방법이다. 본 발명의 이중 표적 결합체는 융합단백질과 코일드코일 형성 도메인이 결합된 각각의 융합체를 in vivo 상에서 코일드코일을 형성을 통해 제조하는 경우보다 in vitro 상에서 제조하는 경우에 이중 표적 결합체의 수득율이 향상된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제조방법은 상기 혼합물로부터 이중 표적 결합체를 회수하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 융합단백질 및 제1 및 제2 융합체를 혼합하여 수득한 이중 표적 결합체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며, 또는 추가로 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전 및 크로마토그래피 등을 이용하여 고순도로 정제하여 사용될 수 있다. 그 중에서 크로마토그래피를 이용하는 방법이 가장 많이 사용되며, 컬럼의 종류와 순서는 융합단백질의 특성, 배양방법 등에 따라 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등에서 선택할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 이중 표적 결합체의 제조 시, 융합단백질과 제1 융합체는 1:2 내지 1:10의 몰농도 비율로 혼합하여 제조할 수 있다. 바람직하게는 1:4의 몰농도 비율, 1:5의 몰농도 비율 또는 1:8의 몰농도 비율로 혼합하여 제조할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 융합단백질과 제2 융합체는 1:2 내지 1:10의 몰농도 비율로 혼합하여 제조할 수 있고, 바람직하게는 1:4의 몰농도 비율, 1:5의 몰농도 비율 또는 1:8의 몰농도 비율로 혼합하여 제조할 수 있다. 위에서도 살펴본 바와 같이 본 발명에 따른 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인은 서로 상이한 아미노산 서열을 가지기 때문에 이중 표적 결합체의 제조에 있어서 제1 융합체 및 제2 융합체의 몰 농도 비율을 간단하게 도출할 수 있다.
본 발명의 이중 표적 결합체의 제조방법은 융합단백질, 제1 융합체 및 제2 융합체를 특정 몰농도 비율로 간단히 혼합하는 것만으로 목적하는 이중 표적 결합체를 얻을 수 있을 뿐만 아니라 임의의 약물 조합을 포함하는 이중 표적 결합체를 높은 수율로 얻을 수 있다. 또한, 상기 이중 표적 결합체를 사용하여 약물 조합의 유효성을 빠르게 검증할 수 있어, 특정 질환을 치료하는 최적의 약물 조합을 신속하게 발굴할 수 있으며 개념증명(POC, Proof of Concept)의 시간 및 비용을 절감할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는, 상기 이중 표적 결합체를 포함하는 약학적 조성물이다. 본 발명의 이중 표적 결합체를 포함하는 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 이중 표적 결합체를 포함하는 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여될 수 있다. 경구 투여 시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 될 수 있으며, 본 발명의 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 알부민 또는 이의 유사체, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질을 이용한 이중 표적 결합체는 인간 혈액 내 다량 존재하는 알부민을 기반으로 하므로, 결합체 약물의 높은 체내 안정성 및 긴 혈장 반감기를 확보할 수 있다.
또한, 본 발명의 이중 표적 결합체는 다양한 조합의 약물을 포함할 수 있고, 신속하게 높은 수율로 제조가 가능하여 약물 조합의 유효성 검증에 소요되는 시간을 단축하여 개념증명(POC, Proof of Concept)의 시간 및 비용을 절감할 수 있으며, 이로 인하여 최적의 약물 조합을 신속하게 발굴할 수 있다.
또한, 본 발명의 이중 표적 결합체는 알부민 융합단백질 및 2종의 표적 결합 물질의 융합체를 개별적으로 발현 후 in vitro 상에서 코일드코일 형성 도메인 간의 자가결합에 의해 제조되므로, 기존의 기술이 가지던 문제점, 즉, 2종의 표적 결합 물질이 인프레임 상에서 발현될 경우 각 표적 결합 물질 본연의 구조 및 활성 유지가 어렵다는 점을 해결하였다.
도 1은 융합단백질, 제1 융합체 및 제2 융합체의 형태를 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 인간 혈청 알부민(HSA) 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는, 재조합 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 3은 SDS-PAGE를 이용해 임시발현 시스템에서 인간 혈청 알부민(HSA) 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질이 발현되는 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 히스티딘 친화성 크로마토그래피 결과를 나타낸 것으로, 도 4a는 히스티딘 친화성 크로마토그래피로 정제한 인간 혈청 알부민(HSA) 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질의 크로마토그램을 나타낸 것이고, 도 4b는 HSA 친화성 크로마토그래피를 진행한 후 peak로 확인된 분획의 단백질 샘플을 SE-HPLC를 이용하여 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 음이온 교환수지 크로마토그래피 결과를 나타낸 것으로, 도 5a는 음이온 교환수지 크로마토그래피로 정제한 인간 혈청 알부민(HSA) 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질의 크로마토그램을 나타낸 것이고, 도 5b는 음이온 교환수지 크로마토그래피를 진행한 후 peak로 확인된 분획의 단백질 샘플을 SE-HPLC를 이용하여 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 융합체의 순도를 확인한 결과를 나타낸 것으로, 음이온 교환수지 크로마토그래피를 진행한 후 peak로 확인된 분획의 단백질 샘플을 SDS-PAGE를 이용하여 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 재조합 플라스미드를 나타낸 것으로, 도 7a는 GFP 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 DNA가 삽입된 재조합 플라스미드를 나타낸 것이고, 도 7b는 mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 DNA가 삽입된 재조합 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 8은 히스티딘 친화성 크로마토그래피로 융합체를 정제한 결과를 나타낸 것으로, 도 8a는 GFP 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체의 크로마토그램을 나타낸 것이고, 도 8b는 mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 9는 히스티딘 친화성 크로마토그래피로 융합체를 정제한 결과를 나타낸 것으로, 도 9a는 히스티딘 친화성 크로마토그래피를 진행한 후 peak로 확인된 분획의 GFP 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체 샘플을 SE-HPLC를 이용하여 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 9b는 히스티딘 친화성 크로마토그래피를 진행한 후 peak로 확인된 분획의 mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체 샘플을 SE-HPLC를 이용하여 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 음이온 교환수지 크로마토그래피로 융합체를 정제한 결과를 나타낸 것으로, 도 10a는 음이온 교환수지 크로마토그래피로 정제한 GFP 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체의 크로마토그램을 나타낸 것이고, 도 10b는 음이온 교환수지 크로마토그래피로 정제한 mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 11은 융합체의 순도를 확인한 결과를 나타낸 것으로, 도 11a는 GFP 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 히스티딘 친화성 크로마토그래피를 이용해 정제한 후 peak로 확인된 분획의 단백질 샘플을 SE-HPLC를 이용하여 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 11b는 mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 히스티딘 친화성 크로마토그래피를 이용해 정제한 후 peak로 확인된 분획의 단백질 샘플을 SE-HPLC를 이용하여 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 회수된 단백질이 목적하는 단백질인지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것으로, 도 12a는 음이온 교환수지 크로마토그래피를 이용해 GFP 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 정제한 후 peak로 확인된 분획의 단백질 샘플을 SDS-PAGE를 이용하여 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 12b는 음이온 교환수지 크로마토그래피를 이용해 mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 정제한 후 peak로 확인된 분획의 단백질 샘플을 SDS-PAGE를 이용하여 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 PD-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 핵산을 포함하는, 재조합 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 14는 SDS-PAGE를 이용해 임시발현 시스템에서 PD-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체가 발현되는 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 Flag 친화성 크로마토그래피로 융합체를 정제한 결과를 나타내는 것으로, 도 15a는 Flag 친화성 크로마토그래피로 정제한 PD-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체의 크로마토그램을 나타낸 것이고, 도 15b는 PD-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 Flag 친화성 크로마토그래피를 진행한 후 peak로 확인된 분획의 단백질 샘플을 SE-HPLC를 이용하여 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 융합체의 순도를 확인한 결과를 나타낸 것으로, 도 16a는 음이온 교환수지 크로마토그래피로 정제한 PD-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체의 크로마토그램을 나타낸 것이고, 도 16b는 PD-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 음이온 교환수지 크로마토그래피를 진행한 후 peak로 확인된 분획의 단백질 샘플을 SE-HPLC를 이용하여 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 회수된 단백질이 목적하는 단백질인지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것으로, PD-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 음이온 교환수지 크로마토그래피를 진행한 후 peak로 확인된 분획의 단백질 샘플을 SDS-PAGE를 이용하여 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 핵산을 포함하는, 재조합 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 19는 SDS-PAGE를 이용해 임시발현 시스템에서 CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체이 발현되는 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 히스티딘 친화성 크로마토그래피로 융합체를 정제한 결과를 나타낸 것으로, 도 20a는 히스티딘 친화성 크로마토그래피로 정제한 CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체의 크로마토그램을 나타낸 것이고, 도 20b는 CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 히스티딘 친화성 크로마토그래피를 진행한 후 peak로 확인된 분획의 단백질 샘플을 SE-HPLC를 이용하여 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 음이온 교환수지 크로마토그래피로 융합체를 정제한 결과를 나타낸 것으로, 도 21a는 음이온 교환수지 크로마토그래피로 정제한 CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체의 크로마토그램을 나타낸 것이고, 도 21b는 CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 음이온 교환수지 크로마토그래피를 진행한 후 peak로 확인된 분획의 단백질 샘플을 SE-HPLC를 이용하여 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 회수된 단백질이 목적하는 단백질인지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것으로, CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 음이온 교환수지 크로마토그래피를 진행한 후 peak로 확인된 분획의 단백질 샘플을 SDS-PAGE를 이용하여 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 insulin 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 핵산을 포함하는, 재조합 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 24는 히스티딘 친화성 크로마토그래피로 정제한 insulin 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 25는 insulin 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 히스티딘 친화성 크로마토그래피를 진행한 후 peak로 확인된 분획의 단백질 샘플을 SE-HPLC를 이용하여 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 음이온 교환수지 크로마토그래피를 이용해 정제한 이중 표적 결합체 (표적 결합 물질: mCherry/GFP)의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 27은 BCA, Lowry 정량법과 UV spectrometer를 이용하여 이중 표적 결합체 (표적 결합 물질: mCherry/GFP)를 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 히스티딘 친화성 크로마토그래피로 이중 표적 결합체를 정제한 결과를 나타낸 것으로, 도 28a는 히스티딘 친화성 크로마토그래피를 이용해 정제한 이중 표적 결합체 (표적 결합 물질: PD-1/CD80, 공유결합 추가)의 크로마토그램을 나타낸 것고, 도 28b는 이중 표적 결합체 (표적 결합 물질: PD-1/CD80, 공유결합 추가)를 히스티딘 친화성 크로마토그래피를 이용해 정제한 peak로 확인된 분획의 단백질 샘플을 RP-HPLC를 이용하여 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 29는 재조합 플라스미드를 나타낸 것으로, 도 29a는 N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 단백질을 코딩하는 DNA가 삽입된 재조합 플라스미드를 나타낸 것이고, 도 29b는 N-말단에 insulin, C-말단에 GLP-1이 융합된 단백질을 코딩하는 DNA가 삽입된 재조합 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 30은 히스티딘 친화성 크로마토 그래피로 이중 표적 결합체를 정제한 결과를 나타낸 것으로, 도 30a는 히스티딘 친화성 크로마토그래피로 정제한 N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 융합 이중 단백질의 크로마토그램을 나타낸 것이고, 도 30b는 히스티딘 친화성 크로마토그래피로 정제한 N-말단에 insulin, C-말단에 GLP-1이 융합된 융합 이중 단백질의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 31은 융합 이중 단백질의 순도를 확인한 결과를 나타낸 것으로, 도 31a는 N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 융합 이중 단백질을 히스티딘 친화성 크로마토그래피를 이용해 정제한 후 peak로 확인된 분획의 단백질 샘플을 SE-HPLC를 이용하여 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 31b는 N-말단에 insulin, C-말단에 GLP-1이 융합된 융합 이중 단백질을 히스티딘 친화성 크로마토그래피를 이용해 정제한 후 peak로 확인된 분획의 단백질 샘플을 SE-HPLC를 이용하여 정성 및 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 32는 음이온 교환수지 크로마토그래피로 융합체를 정제한 결과를 나타낸 것으로, 도 32a는 음이온 교환수지 크로마토그래피로 정제한 N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 융합 이중 단백질의 크로마토그램을 나타낸 것이고, 도 32b는 음이온 교환수지 크로마토그래피로 정제한 N-말단에 insulin, C-말단에 GLP-1이 융합된 융합 이중 단백질의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 33은 융합 이중 단백질의 순도를 확인한 결과를 나타낸 것으로, 도 33a는 음이온 교환 크로마토그래피 진행 후, 분획되어 회수된 N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 융합 이중 단백질을 SE-HPLC로 분석하여 동정한 결과를 나타낸 것이고, 도 33b는 음이온 교환 크로마토그래피 진행 후, 분획되어 회수된 N-말단에 insulin, C-말단에 GLP-1이 융합된 융합 이중 단백질을 SE-HPLC로 분석하여 동정한 결과를 나타낸 것이다.
도 34는 융합단백질 및 2종의 융합체의 자가결합여부를 확인한 결과를 나타낸 것으로, 도 34a는 SE-HPLC peak shift 관찰을 통해 융합단백질 및 서로 다른 표적 결합물질이 연결된, 융합체들이 자가결합을 통해 이중 표적 결합체를 형성함을 확인한 결과를 나타낸 것이고(코일드코일: D/D' 및 C/C', complex: D-HSA-C, D'-GFP 및 mCherry-C'), 도 34b는 SE-HPLC peak shift 관찰을 통해 융합단백질 및 서로 다른 표적 결합물질이 연결된, 융합체들이 자가결합을 통해 이중 표적 결합체를 형성함을 확인한 결과를 나타낸 것이며(코일드코일: K/K' 및 C/C', complex: K-HSA-C, CD80-K' 및 PD1-C'), 도 34c는 SE-HPLC peak shift 관찰을 통해 융합단백질 및 2종의 표적 결합물질이 연결된, 융합체가 자가결합을 통해 이중 표적 결합체를 형성함을 확인한 결과를 나타낸 것이다(코일드코일: K/K' 및 C/C', complex: K-HSA-C, insuln-K' 및 GLP-1-C').
도 35는 HSA에 결합된 코일드코일 형성 도메인 또는 표적 결합 물질에 결합된 코일드코일 형성 도메인 C/C' 및 D/D'의 해리상수를 측정한 결과를 나타낸 것으로, 도 35a는 이중 표적 결합체 내의 코일드코일 형성 도메인 간의 결합력 측정을 통해 코일드코일의 해리상수를 계산한 결과를 나타낸 것이고(코일드코일: C/C'), 도 35b는 이중 표적 결합체 내의 코일드코일 형성 도메인 간의 결합력 측정을 통해 코일드코일의 해리상수를 계산한 결과를 나타낸 것이다(코일드코일: D/D').
도 36은 pH 변화에 따른 이중 표적 결합체의 결합안정성을 SE-HPLC를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 37은 이중 표적 결합체(PD1/CD80, 공유결합 포함)의 rat plasma 내 안정성을 ELISA를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 것이다(여기서, complex는 표적 결합 물질이 PD1 및 CD80인 이중 결합 결합체를 나타냄).
도 38은 이중 표적 결합체의 대조군인 야생형 인간 혈청 알부민(wild type HSA) 대비 rat plasma 내 안정성을 ELISA를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 것으로, 도 38a는 이중 표적 결합체(GLP-1/Insulin, 공유결합 포함)와 대조군인 야생형 인간 혈청 알부민(wild type HSA)의 rat plasma 내 안정성을 비교한 결과를 나타낸 것이고, 도 38b는 이중 표적 결합체의 rat plasma 내 안정성을 나타낸 것이다(여기서, complex는 표적 결합 물질이 GLP-1 및 Insulin인 이중 결합 결합체를 나타냄).
도 39는 이중 표적 결합체의 CD80 in vitro ELISA competitive assay 결과를 나타낸 것이다(여기서, complex는 표적 결합 물질이 CD80 및 PD-1인 이중 결합 결합체이고, fusion은 N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 융합 이중 단백질을 나타냄).
도 40은 이중 표적 결합체의 PD-1 in vitro ELISA competitive assay 결과를 나타낸 것이다(여기서, complex는 표적 결합 물질이 CD80 및 PD-1인 이중 결합 결합체이고, fusion은 N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 융합 이중 단백질을 나타냄).
도 41은 이중 표적 결합체의 GLP-1 in vitro ELISA competitive assay 결과를 나타낸 것이다(여기서, complex는 표적 결합 물질이 GLP-1 및 insulin인 이중 결합 결합체이고, N-말단에 Insulin, C-말단에 GLP-1이 융합된 융합 이중 단백질을 나타냄).
도 42는 이중 표적 결합체의 CD80 in vitro cell blockade assay 결과를 나타낸 것이다(여기서, complex는 표적 결합 물질이 CD80 및 PD-1인 이중 결합 결합체이고, fusion은 N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 융합 이중 단백질을 나타냄).
도 43은 이중 표적 결합체의 PD-1 in vitro cell blockade assay 결과를 나타낸 것이다(여기서, complex는 표적 결합 물질이 CD80 및 PD-1인 이중 결합 결합체이고, fusion은 N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 융합 이중 단백질을 나타냄).
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 알부민 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된 융합단백질
1-1. 인간 혈청 알부민(HSA) 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 플라스미드의 구축
유전자 클로닝을 위해 HSA 및 코일드코일 형성 도메인의 DNA를 코돈 최적화 (codon optimization)한 후, overlap PCR을 통해 코일드코일 형성 도메인의 DNA가 각각 HSA의 N-말단 및 C-말단에 연결된, HSA 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된 융합단백질을 암호화하는 DNA를 준비하였다. Overlap PCR에 사용된 프라이머는 표 1에 나타내었으며, 프라이머의 농도는 500 nM, 주형의 농도는 50 ng였다 (시스테인이 도입된 융합단백질을 암호화하는 DNA의 경우도 동일한 프라이머가 사용되었다).
구체적으로, 유전자 구축을 위해 pcDNA 3.1 벡터를 사용하였으며, insert DNA와 벡터를 각각 overlap PCR 후 DpnI 제한효소를 처리하여 HSA 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질을 암호화하는 핵산(DNA)이 삽입된 7895 bp 크기의 벡터를 제작하였다. 도 2에서 최종적으로 구축된 재조합 플라스미드를 나타내었다. 상기 벡터를 Stella® competent cell(제조사: Clontech)에 삽입한 뒤 벡터 내에 있는 항생제 내성 유전자에 맞는 암피실린 항생제를 첨가한 아가(agar) 플레이트에 도말하여 콜로니를 선별한 뒤, Applied biosystems 3730xl DNA analyzer(제조사: Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 염기서열을 확인하였다.
DNA 시퀀싱을 통해 확인한 코일드코일 형성 도메인을 암호화하는 DNA의 염기서열 및 아미노산 서열을 표 2에 나타내었으며, DNA 염기서열 및 아미노산 서열은 종류에 따라 알파벳을 부여하였다. 또한, 상기 코일드코일 형성 도메인의 양 말단에 시스테인을 도입한 아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 표 2에 나타내었다. 또한, 인간 혈청 알부민을 암호화하는 DNA의 염기서열 및 아미노산 서열은 표 3에 나타내었으며, 본 발명의 일 예로서 HSA 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질을 암호화하는 DNA 염기서열 및 융합단백질의 아미노산 서열을 표 4에 나타내었다.
또한, 공유결합을 통한 코일드코일 형성 도메인 간의 결합 안정성을 높이기 위해 코일드코일 형성 도메인의 양 말단(즉, N-말단 및 C-말단)에 시스테인을 도입한, 코일드코일 형성 도메인 및 HSA이 연결된, 융합단백질을 암호화하는 DNA를 상기와 동일한 방법을 통해 재조합 플라스미드 구축하고 숙주 세포에 형질전환 후 발현시켰다. 본 발명의 일 예로서 DNA 시퀀싱을 통해 확인한 시스테인 돌연변이가 도입된, 코일드코일 형성 도메인 및 HSA이 연결된, 융합단백질을 암호화하는 DNA 염기서열 및 융합단백질의 아미노산 서열을 표 5에 나타내었다.
(위 첨자 "C"는 코일드코일 형성 도메인에 시스테인이 도입되었음을 의미하며, 서열 내 시스테인은 볼드체 및 밑줄로 표시하였다.)
1-2. 인간 혈청 알부민(HSA) 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질의 임시발현 시스템 확립
(1) 형질전환
실시예 1-1에서 유전자 클로닝을 통해 얻은 최종 벡터(KC-HSA-CC를 암호화하는 DNA가 삽입됨)를 Expi CHO 동물 세포에 도입하여 본 발명의 융합단백질을 빠른 시간 내에 확보하기 위한 임시발현(transient expression) 시스템을 확립하였다.
구체적으로, 형질전환 하루 전 플라스크에 세포를 3.0 x 106 세포/mL 농도로 분주한 후 24시간 배양하였다. 형질도입 당일 ExpiCHO® expression 배지를 첨가하여 6.0 x 106 세포/mL 농도로 희석하였다. 이후, DNA 1 μg/mL 및 Opti-PRO® 배지를 섞어주고, ExpiFectamine® 시약과 Opti-PRO® 배지를 부피에 맞춰 혼합한 후 상온에서 5분간 두었다. 그 다음으로 5분간 DNA와 Expifectamine® 시약을 반응시키고 플라스크에 첨가하였으며, 16 내지 22시간 후에 feed 및 enhancer를 처리하고, 5일 후에 추가적으로 feed를 넣어주었다. 8일차에 생존율(viability)이 75% 이상인지 여부를 확인하여 회수하였다.
(2) SDS-PAGE를 이용한 임시발현 단백질 분석
회수한 배양액 16 μL에 5x reducing-PAGE 샘플 버퍼 4 μL를 가한 후, 100℃에서 5분간 가열하였으며, 이후 실온에 20분 방치하였다. 폴리아마이드 젤(12~20%, Invitrogen)을 젤 키트에 삽입 후 샘플과 size standard ladder를 로딩하여 125V 2시간 전기영동 한 후, 젤을 키트에서 분리하여 coomassie blue staining solution을 가하고 1시간 동안 방치하였다. 방치된 젤을 destaining buffer(70% 3차 증류수, 20% 메탄올, 10% 아세트산)로 옮기고 overnight 하였다.
그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, HSA 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질이 적합한 분자량 위치에 과발현됨을 확인하였으며, 이를 통해 임시발현 시스템에서 HSA 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질이 발현됨을 확인하였다.
1-3. 인간 혈청 알부민(HSA) 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질의 정제 및 농축
(1) HSA 친화성 크로마토그래피를 이용한 정제
실시예 1-2의 임시발현 시스템으로부터 얻은 배양액을 0.2 μm 크기 기공을 갖는 PES 여과 막에 여과하여 불순물을 제거하였다. Sartocon® Slice 200 Hydrosart® Cassette 30 KD(Sartorius)가 장착된 농축/투석기에 여과된 배양액을 넣어 농축하고, 20 mM sodium phosphate, pH 7.0 완충액으로 투석한 후 회수하였다.
그 다음으로 상기 회수된 투석액을 알부민 친화성 매트릭스 Albupure®(Prometic Bioseparations Ltd)에 적재하여 HSA 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질을 정제하여 그 결과를 도 4a에 나타내었다. 상기 정제에 사용된 HSA 친화성 크로마토그래피의 조건은 하기와 같다.
<크로마토그래피 조건>
- 수지: Albupure®
- 유속: 480 cm/h
- 평형: 20 mM sodium phosphate, pH 7.0 완충액
- 적재: 최대 35 g 단백질/L 수지 부피
- 재생 및 멸균: 1 M NaOH 용액
- 용출: 20 mM sodium phosphate, 20 mM sodium octanonate, pH 7.0 완충액
- 보관: 20% EtOH
HSA 친화성 크로마토그래피 진행 후, 대조군인 야생형 HSA 보다 먼저 용출된 피크를 가진 단백질 분자들만 회수하였다. 분획되어 회수된 단백질을 SE-HPLC로 분석하였다.
그 결과 도 4b에서 나타낸 바와 같이, 회수된 HSA 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질은 90% 이상의 순도를 가지는 것으로 확인되었다.
(2) 음이온 교환 수지 크로마토그래피를 이용한 정제
HSA 친화성 크로마토그래피를 통해 얻은 단백질 용액을 Q impres(GE healthcare)에 적재하여 HSA 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질을 정제하여 도 5a에서 나타낸 바와 같은 결과를 얻었다. 상기 정제에 사용된 음이온 교환 수지 크로마토그래피 조건은 하기와 같다.
<크로마토그래피 조건>
- 수지: Q impres
- 유속: 120 cm/h
- 평형: 20 mM sodium phosphate, pH 7.0 완충액
- 적재: 최대 10 g 단백질/L 수지 부피
- 재평형: 5 mM sodium phosphate, pH 5.8 완충액
- 세척: 5 mM sodium phosphate, 100 mM sodium chloride pH 5.8 완충액
- 재생 및 멸균: 1 M NaOH 용액
- 용출: 20 mM sodium phosphate, 200 mM sodium chloride, pH 7.0 완충액
- 보관: 0.01 M NaOH 용액
음이온 교환 크로마토그래피 진행 후, 분획되어 회수된 단백질은 SE-HPLC로 분석하여 동정(identification) 하였다. SE-HPLC 분석 결과, 세척 완충액에서 나온 피크는 코일드코일이 발현되지 않았거나 정제 중 코일드코일 결합이 끊어진 HSA 였으며, 용출액에서 나온 피크는 HSA 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질임을 확인할 수 있었다.
또한, 도 5b에서 나타낸 바와 같이, 회수된 HSA 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질은 98% 이상의 순도를 가지는 것으로 확인되었다.
또한, 도 6에서 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE 분석을 통해 적합한 분자량 위치에 순도 높게 band가 나타나는 것을 확인하여, 회수된 단백질이 HSA 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질임을 확인하였다.
이후 회수된 HSA 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질의 양을 UV spectrometer를 이용해 측정한 후, 한외여과방식을 이용해 농축한 후 PBS로 투석하여 -20℃에 보관하였다.
실시예 2. 표적 결합 물질(GFP 또는 mCherry) 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체
2-1. GFP/mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 재조합 플라스미드의 구축
유전자클로닝을 위해 GFP/mCherry 및 코일드코일 형성 도메인의 DNA를 코돈 최적화(codon optimization)한 후, overlap PCR을 통해 코일드코일 형성 도메인의 DNA가 GFP의 N-말단, mCherry의 C-말단에 각각 연결하여 GFP 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 DNA; 및 mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 DNA를 각각 준비하였다(이를 GFP/mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체로 나타낸다.).
유전자 구축을 위해 pQE80 벡터를 사용하였으며, insert DNA와 벡터를 각각 overlap PCR 후 DpnI 제한효소를 처리하여 GFP/mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 DNA가 삽입된, 각각 5544 및 5571 bp 크기의 벡터를 제작하였다. 도 7a는 GFP 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 DNA가 삽입된 재조합 플라스미드를 나타내고 도 7b는 mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 DNA가 삽입된 재조합 플라스미드를 나타낸다. 최종적으로 구축된 재조합 플라스미드를 나타내였다. 상기 벡터를 Stella® competent cell(제조사: Clontech)에 삽입한 뒤 벡터 내에 있는 항생제 내성 유전자에 맞는 암피실린 항생제를 첨가한 아가 플레이트에 도말하여 콜로니를 선별한 뒤, Applied biosystems 3730xl DNA analyzer(제조사: Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 염기서열을 확인하였다.
DNA 시퀀싱을 통해 확인한 코일드코일 형성 도메인을 암호화하는 DNA 염기서열은 표 6에 나타내었으며, 상기 DNA 염기서열은 종류에 따라 알파벳을 부여하였다(여기서 알파벳 옆에 기재된 「'」는 해당 알파벳을 가진 코일드코일 형성 도메인과 코일드코일 형성이 가능한 것을 의미한다. 예를 들어, C와 C'는 코일드코일 형성이 가능한 코일드코일 형성 도메인이다.). 또한, 표 6의 코일드코일 형성 도메인의 양 말단에 시스테인을 도입한 아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열을 암호화 하는 DNA 염기서열을 나타내었다. 또한, 본 발명의 일 예로서 GFP/mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 DNA 염기서열 및 융합체의 아미노산 서열을 표 7에 나타내었다.
또한, 공유결합을 통한 코일드코일 형성 도메인 간의 결합 안정성을 높이기 위해 코일드코일 형성 도메인의 양 말단(즉, N-말단 및 C-말단)에 시스테인을 도입한, GFP/mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 DNA를 상기와 동일한 방법을 통해 재조합 플라스미드 구축하고 숙주세포에 형질전환 후 발현시켰다. 본 발명의 일 예로서 DNA 시퀀싱을 통해 확인한 시스테인 돌연변이가 도입된, GFP/mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 DNA 염기서열 및 융합체의 아미노산 서열을 표 8에 나타내었다.
(위 첨자 "C"는 코일드코일 형성 도메인에 시스테인이 도입되었음을 의미하며, 서열 내 시스테인은 볼드체 및 밑줄로 표시하였다.)
2-2. GFP/mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체의 임시발현 시스템 확립
실시예 2-1에서 유전자 클로닝을 통해 얻은 최종 벡터를 BL21 세포에 heat shock 방법을 통해 형질전환을 진행한 후, 벡터 내에 있는 항생제 내성 유전자에 맞는 암피실린 항생제를 첨가한 아가 플레이트에 도말하여 단일 콜로니를 선별하였다. 콜로니를 종 배양하기 위해 5 mL의 암피실린이 포함된 2xYT 배지에 overnight 배양하였다. 다음날 암피실린이 포함된 1 L의 2xYT 배지로 옮기는 본 배양을 진행하였다. UV spectrometer를 이용해 600 nm에서 OD 0.6 내지 0.8 구간의 대수증식기에 도달되었는지 측정 후, IPTG 넣어 단백질을 유도 하였으며, 4시간 후 GFP/mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 회수하였다.
회수된 GFP/mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체는 각각 발현이 되는 경우 녹색과 분홍빛의 형광을 띄게 되므로, 각각의 형광 유무에 따라 융합체의 발현 유무를 확인하였다. 그 결과 형광을 띄는 것을 확인하여 임시발현 시스템에서, GFP/mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체가 발현됨을 확인하였다.
2-3. GFP/mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체의 정제 및 농축
(1) 히스티딘 친화성 크로마토그래피를 이용한 정제
BL21 세포에서 얻은 배양액을 0.2 μm 크기의 기공을 갖는 PES 여과 막에 여과하여 불순물을 제거하였다. 상기 여과액을 Histrap HP(GE healthcare)에 적재하여 GFP/mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 정제하였다. 그 결과는 도 8a 및 8b에 나타낸 바와 같다. 상기 정제에 사용된 히스티딘 친화성 크로마토그래피의 조건은 하기와 같다.
<크로마토그래피 조건>
- 수지: Histrap HP
- 유속: 180 cm/h
- 평형: 50 mM sodium phosphate, 300 mM sodium chloride, 10 mM imidazole pH 8.0 완충액
- 적재: 최대 30 g 단백질/L 수지 부피
- 재생 및 멸균: 1 M NaOH 용액
- 용출: 50 mM sodium phosphate, 300 mM sodium chloride, 500 mM imidazole pH 8.0 완충액
- 보관: 20% EtOH
평형 완충액 및 용출 완충액을 농도 구배로 흘려주면서 GFP/mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체가 용출되는 피크를 SE-HPLC를 이용하여 분석하였으며, 대조군인 야생형 HSA 보다 먼저 용출된 피크를 가진 융합체 분자들만 회수하였다. 그 결과는 도 9a 및 9b에 나타낸 바와 같다.
(2) 음이온 교환 수지 크로마토그래피를 이용한 정제
히스티딘 친화성 크로마토그래피를 통해 얻은 용액을 Sartocon® Slice 200 Hydrosart® Cassette 10 KD(Sartorius)가 장착된 농축/투석기에 넣어 농축 후 10 mM sodium phosphate, pH 8.0 완충액으로 투석한 후 회수하였다. 상기 회수액을 Q impres (GE healthcare)에 적재하여 GFP/mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 정제하였다. 그 결과는 도 10a 및 10b 에 나타낸 바와 같다. 상기 정제에 사용된 음이온 교환 수지 크로마토그래피 조건은 하기와 같다.
<크로마토그래피 조건>
- 수지: Q impres
- 유속: 120 cm/h
- 평형: 10 mM sodium phosphate, pH 8.0 완충액
- 적재: 최대 10 g 단백질/L 수지 부피
- 재생 및 멸균: 1 M NaOH 용액
- 용출: 10 mM sodium phosphate, 500 mM sodium chloride, pH 8.0 완충액
- 보관: 0.01 M NaOH 용액
음이온 교환 크로마토그래피 진행 후, 분획되어 얻은 융합체는 SE-HPLC로 분석하여 동정하였다. NaCl이 농도 구배로 들어감에 따라 낮은 구간에서 GFP/mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체가 나왔고, 높은 구간에서 응집(aggregation) 형태가 나오는 것을 SE-HPLC 분석 결과 확인할 수 있었다.
또한 도 11a 및 11b에서 나타낸 바와 같이, 회수된 GFP/mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체의 순도가 95% 이상임을 확인하였다.
또한 도 12a 및 12b에서 나타난 바와 같이, SDS-PAGE 분석을 통해 적합한 분자량 위치에 band가 나타나는 것을 확인하여, 회수된 융합체가 GFP/mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체임을 확인하였다.
이후 회수된 GFP/mCherry 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체의 양을 UV spectrometer를 이용해 측정한 후, 한외여과방식을 이용해 농축한 후 PBS로 투석하여 -20℃에 보관하였다.
실시예 3. 표적 결합 물질(PD-1) 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체
3-1. PD-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 재조합 플라스미드의 구축
유전자클로닝을 위해 PD-1 및 코일드코일 형성 도메인의 DNA를 코돈 최적화(codon optimization)한 후, overlap PCR을 통해 코일드코일 형성 도메인의 DNA를 PD-1의 C-말단에 연결하여, PD-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 DNA를 준비하였다.
유전자 구축을 위해 pcDNA 3.1 벡터를 사용하였으며, insert DNA와 벡터를 각각 오버랩 PCR 후 DpnI 제한효소를 처리하여 PD-1의 C-말단에 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 DNA가 삽입된 6473 bp 크기의 벡터를 제작하였다. 도 13에서 최종적으로 구축된 재조합 플라스미드를 나타내었다. 상기 벡터를 Stella® competent cell(제조사: Clontech)에 삽입한 뒤 벡터 내에 있는 항생제 내성 유전자에 맞는 암피실린 항생제를 첨가한 아가 플레이트에 도말하여 콜로니를 선별한 뒤 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 염기서열을 확인하였다.
DNA 시퀀싱을 통해 확인한 합성된 코일드코일 형성 도메인을 암호화 DNA의 염기서열은 표 9에 나타내었고, 본 발명의 일 예로서 PD-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 DNA 염기서열 및 융합체의 아미노산 서열을 표 9에 나타내었다.
(위 첨자 "C"는 코일드코일 형성 도메인에 시스테인이 도입되었음을 의미하며, 서열 내 시스테인은 볼드체 및 밑줄로 표시하였다.)
3-2. PD-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체의 임시발현 시스템 확립
(1) 형질전환
실시예 3-1에서 유전자 클로닝을 통해 얻은 최종 벡터를 Expi CHO 동물 세포에 도입하여 본 발명의 융합체를 빠른 시간 내에 확보하기 위한 임시발현 시스템을 확립하였다.
구체적으로 형질전환 하루 전 플라스크에 세포를 3.0 x 106 세포/mL 농도로 분주한 후 24시간 배양하였다. 형질도입 당일 ExpiCHO® expression 배지를 첨가하여 6.0 x 106 세포/mL 농도로 희석하였다. 이후, DNA 1 μg/mL와 Opti-PRO® 배지를 섞어주고, ExpiFectamine® 시약과 Opti-PRO® 배지를 부피에 맞춰 혼합한 후 상온에서 5분간 두었다. 그 다음, 5분간 DNA와 Expifectamine® 시약을 반응시키고 플라스크에 첨가하였으며, 16 내지 22시간 후에 feed 및 enhancer를 처리하고, 5일 후에 추가적으로 feed를 넣어주었다. 8일차에 생존율(viability)이 75% 이상인지 여부를 확인하고 회수하였다.
(2) SDS-PAGE를 통한 임시발현 융합체 분석
회수한 배양액 16 μL에 5x reducing-PAGE sample buffer 4 μL를 가한 후, 100℃에서 5분간 가열하였으며, 이후 실온에 20분 방치하였다. 폴리아크릴아마이드 젤(12~20%, Invitrogen)을 젤 키트에 삽입 후 샘플과 size standard ladder를 로딩하여 125V 2시간 전기영동 한 후, 젤을 키트에서 분리하여 coomassie blue staining solution을 가하고 1시간 동안 방치하였다. 방치된 젤을 destaining buffer(70% 3차 증류수, 20% 메탄올, 10% 아세트산)로 옮기고 overnight하였다. 결
그 결과 도 14에서 나타낸 바와 같이, PD-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체가 적합한 분자량 위치에 과발현됨을 확인하였으며, 이를 통해 임시발현 시스템에서 PD-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체가 발현됨을 확인하였다.
3-3. PD-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체의 정제 및 농축
(1) Flag 친화성 크로마토그래피를 이용한 정제
실시예 3-2의 임시발현 시스템으로부터 얻은 배양액을 0.2 μm 크기의 기공을 갖는 PES 여과 막에 여과하여 불순물을 제거하였다. 여과액을 Anti-DYKDDDDK(Thermo fisher)에 적재하여 PD-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 정제하였다. 그 결과는 도 15a에서 나타낸 바와 같다. 상기 정제에 사용된 Flag 친화성 크로마토그래피 조건은 하기와 같다.
<크로마토그래피 조건>
- 수지: Anti-DYKDDDDK
- 유속: 300 cm/h
- 평형: Phosphate-buffered saline
- 적재: 최대 3 g 단백질/L 수지 부피
- 재생 및 멸균: 0.01 M NaOH 용액
- 용출: 0.1 M glycine-Hcl pH 2.7 완충액
- 보관: 20% EtOH
Flag 친화성 크로마토그래피 진행 후, 분획되어 얻은 융합체는 0.2 M sodium phosphate, pH 7.0 완충액으로 중화하였으며, SE-HPLC로 분석하여 대조군인 야생형 HSA 보다 먼저 용출된 피크를 가진 융합체 분자들만 회수하였다. 분획되어 회수된 융합체를 SE-HPLC로 분석하였다.
그 결과 도 15b에서 나타낸 바와 같이, 분획되어 회수된 PD-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체는 80% 이상의 순도를 가지는 것을 확인하였다.
(2) 음이온 교환 수지 크로마토그래피를 이용한 정제
Flag 친화성 크로마토그래피를 통해 얻은 융합체 용액을 Sartocon® Slice 200 Hydrosart® Cassette 10 KD(Sartorius)가 장착된 농축/투석기에 넣어 농축 후 10 mM sodium phosphate, pH 8.0 완충액으로 투석한 후 회수하였다. 상기 회수된 투석액을 Q impres(GE healthcare)에 적재하여 PD-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 정제하였다. 그 결과는 도 16a에서 나타낸 바와 같다. 정제에 사용된 음이온 교환 수지 크로마토그래피 조건은 하기와 같다.
<크로마토그래피 조건>
- 수지: Q impres
- 유속: 120 cm/h
- 평형: 10 mM sodium phosphate, pH 8.0 완충액
- 적재: 최대 10 g 단백질/L 수지 부피
- 재생 및 멸균: 1 M NaOH 용액
- 용출: 10 mM sodium phosphate, 500 mM sodium chloride, pH 8.0 완충액
- 보관: 0.01 M NaOH 용액
음이온 교환 크로마토그래피 진행 후, 분획되어 회수된 융합체는 SE-HPLC로 분석하여 동정하였다. NaCl이 농도구배로 들어감에 따라 낮은 구간에서 PD-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체가 나왔고, 높은 구간에서 응집(aggregation) 형태가 나오는 것을 SE-HPLC 분석하였다.
그 결과 도 16b에서 나타낸 바와 같이, 회수된 PD-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체는 98% 이상의 순도를 가지는 것으로 확인되었다.
또한, 도 17에서 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE 분석결과 적합한 분자량 위치에 band가 나타나는 것을 확인하여, 정제된 융합체가 PD-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체임을을 확인하였다.
이후 정제된 PD-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된 융합체의 양을 UV spectrometer를 이용해 측정한 후, 한외여과방식을 이용해 농축한 후 PBS로 투석하여 -20℃에 보관하였다.
실시예 4. 표적 결합 물질(CD80) 및 코일드코일 도메인이 연결된, 융합체
4-1. CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 재조합 플라스미드의 구축
유전자클로닝을 위해 CD80 및 코일드코일 형성 도메인의 DNA를 코돈 최적화(codon optimization)한 후, overlap PCR을 통해 코일드코일 형성 도메인의 DNA를 CD80의 C-말단에 연결하여, CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 DNA를 준비하였다.
유전자 구축을 위해 pcDNA 3.1 벡터를 사용하였으며, insert DNA와 벡터를 각각 overlap PCR 후 DpnI 제한효소를 처리하여 CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 DNA가 삽입된 6641 bp 크기의 벡터를 제작하였다. 도 18에서 최종적으로 구축된 재조합 플라스미드를 나타내었다. 상기 벡터를 Stella® competent cell(제조사: Clontech)에 삽입한 뒤 벡터 내에 있는 항생제 내성 유전자에 맞는 암피실린 항생제를 첨가한 아가 플레이트에 도말하여 콜로니를 선별한 뒤, Applied biosystems 3730xl DNA analyzer(제조사: Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 염기서열을 확인하였다.
DNA 시퀀싱을 통해 확인한 합성된 코일드코일 단백질 암호화 DNA의 염기서열은 표 10에 나타내었으며, 본 발명의 일 예로서 CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된 융합체를 암호화하는 DNA 염기서열 및 융합체의 아미노산 서열을 표 10에 나타내었다.
(위 첨자 "C"는 코일드코일 형성 도메인에 시스테인이 도입되었음을 의미하며, 서열 내 시스테인은 볼드체 및 밑줄로 표시하였다.)
4-2. CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체의 임시발현 시스템 확립
(1) 형질전환
실시예 4-1에서 유전자 클로닝을 통해 얻은 최종 벡터를 Expi 293 동물 세포에 도입하여 본 발명의 융합체를 빠른 시간 내에 확보하기 위한 임시발현 시스템을 확립하였다.
구체적으로, 형질전환 하루 전 플라스크에 세포를 2.5 내지 3.0 x 106 세포/mL 농도로 분주한 후 24시간 배양하였다. 형질도입 당일 ExpiCHO® expression 배지를 첨가하여 3.0 x 106 세포/mL 농도로 희석하였다. 이후, DNA 1 μg/mL와 Opti-MEM® 배지를 섞어주고, ExpiFectamine® 시약과 Opti-MEM® 배지를 부피에 맞춰 혼합한 후 상온에서 5분간 두었다. 그 다음, 20분간 DNA와 Expifectamine® 시약을 반응시키고 플라스크에 첨가하였으며, 16 내지 22시간 후에 enhancer 1, 2를 처리하고, 5일 후에 생존율(viability)이 50% 이상인지 여부를 확인하여 회수하였다.
(2) SDS-PAGE를 통한 임시발현 단백질 분석
회수한 배양액 16 μL에 5x reducing-PAGE sample buffer 4 μL를 가한 후, 100℃에서 5분간 가열하였으며, 이후 실온에 20분 방치하였다. 폴리아크릴아마이드 젤(12~20%, Invitrogen)을 젤 키트에 삽입 후 샘플과 size standard ladder를 로딩하여 125V 2시간 전기영동 한 후 젤을 키트에서 분리하여 coomassie blue staining solution을 가하고 1시간 동안 방치하였다. 방치된 젤을 destaining buffer(70% 3차 증류수, 20% 메탄올, 10% 아세트산)로 옮기고 overnight하였다.
그 결과 도 19에서 나타낸 바와 같이, CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체가 적합한 분자량 위치에 과발현됨을 확인하였으며, 이를 통해 임시발현 시스템에서 CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체가 발현됨을 확인하였다.
4-3. CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체의 정제 및 농축
(1) 히스티딘 친화성 크로마토그래피를 이용한 정제
임시발현 시스템에서 얻은 배양액을 0.2 μm크기의 기공을 갖는 PES 여과 막에 여과하여 불순물을 제거하였다. 여과액을 Sartocon® Slice 200 Hydrosart® Cassette 10 KD(Sartorius)가 장착된 농축/투석기에 넣어 농축 후 50 mM sodium phosphate, 300 mM sodium chloride, 10 mM imidazole, pH 8.0 완충액으로 투석한 후 회수하였다. 상기 회수된 투석액을 Histrap HP(GE healthcare)에 적재하여 CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 정제하였다. 그 결과는 도 20a에 나타낸 바와 같다. 상기 정제에 사용된 히스티딘 친화성 크로마토그래피 조건은 하기와 같다.
<크로마토그래피 조건>
- 수지: Histrap HP
- 유속: 180 cm/h
- 평형: 50 mM sodium phosphate, 300 mM sodium chloride, 10 mM imidazole pH 8.0 완충액
- 적재: 최대 30 g 단백질/L 수지 부피
- 재생 및 멸균: 1 M NaOH 용액
- 용출: 50 mM sodium phosphate, 300 mM sodium chloride, 500 mM imidazole pH 8.0 완충액
- 보관: 20% EtOH
히스티딘 친화성 크로마토그래피 진행 후, 평형 완충액 및 용출 완충액을 농도 구배로 흘려주면서 CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체가 용출되는 피크를 SE-HPLC로 분석한 후, 대조군인 야생형 CD80 보다 먼저 용출된 피크를 가진 융합체분자들만 회수하였다. 분획되어 회수된 융합체를 SE-HPLC로 분석하였다.
그 결과 도 20b에서 나타낸 바와 같이, 회수된 CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체는 80% 이상의 순도를 가지는 것을 확인하였다.
(2) 음이온 교환 수지 크로마토그래피를 이용한 정제
히스티딘 친화성 크로마토그래피를 통해 얻은 용액을 Sartocon® Slice 200 Hydrosart® Cassette 10 KD(Sartorius)가 장착된 농축/투석기에 넣어 농축 후 10 mM sodium phosphate, pH 8.0 완충액으로 투석한 후 회수하였다. 상기 회수된 투석액을 Q impres(GE healthcare)에 적재하여 CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된 융합체를 정제하였다. 그 결과는 도 21a에서 나타낸 바와 같다. 상기 정제에 사용된 음이온 교환 수지 크로마토그래피 조건은 하기와 같다.
<크로마토그래피 조건>
- 수지: Q impres
- 유속: 120 cm/h
- 평형: 10 mM sodium phosphate, pH 8.0 완충액
- 적재: 최대 10 g 단백질/L 수지 부피
- 재생 및 멸균: 1 M NaOH 용액
- 용출: 10 mM sodium phosphate, 500 mM sodium chloride, pH 8.0 완충액
- 보관: 0.01 M NaOH 용액
음이온 교환 크로마토그래피 진행 후, 분획되어 얻은 융합체는 SE-HPLC로 분석하여 동정하였다. NaCl이 농도구배로 들어감에 따라 낮은 구간에서 CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체가 나왔고, 높은 구간에서 응집 형태가 나오는 것을 SE-HPLC 분석결과 확인할 수 있었다. 그 결과 도 21b에서 나타낸 바와 같이, 회수된 CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된 융합체는 98% 이상의 순도를 가지는 것으로 확인되었다.
또한, 도 22에서 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE 분석을 통해 적합한 분자량 위치에 band가 나타나는 것을 확인하여, 회수된 융합체가 CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체임을 확인하였다.
이후 회수된 CD80 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체의 양을 UV spectrometer를 이용해 측정 후, 한외여과방식을 이용해 농축한 후 PBS로 투석하여 -20℃에 보관했다.
실시예 5. 표적 결합 물질(Insulin, 인슐린) 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체
5-1. Insulin 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 재조합 플라스미드의 구축
유전자클로닝을 위해 insulin 및 코일드코일 형성 도메인의 DNA를 코돈 최적화(codon optimization)한 후, overlap PCR을 통해 코일드코일 형성 도메인의 DNA를 insulin의 C-말단에 연결하여, insulin 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 DNA를 준비하였다.
유전자 구축을 위해 pQE80 벡터를 사용하였으며, insert DNA와 벡터를 각각 overlap PCR 후 DpnI 제한효소를 처리하여 insulin 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 DNA가 삽입된 5013 bp 크기의 벡터를 제작하였다. 도 23에서 최종적으로 구축된 재조합 플라스미드를 나타내었다. 상기 벡터를 Stella® competent cell(제조사: Clontech)에 삽입한 뒤 벡터 내에 있는 항생제 내성 유전자에 맞는 암피실린 항생제를 첨가한 아가 플레이트에 도말하여 콜로니를 선별한 뒤, Applied biosystems 3730xl DNA analyzer(제조사: Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 염기서열을 확인하였다.
DNA 시퀀싱을 통해 확인한 합성된 코일드코일 단백질 암호화 DNA의 염기서열은 표 11에 나타내었으며, 본 발명의 일 예로서 insulin 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 암호화하는 DNA 염기서열 및 융합체의 아미노산 서열을 표 11에 나타내었다.
(위 첨자 "C"는 코일드코일 형성 도메인에 시스테인이 도입되었음을 의미하며, 서열 내 시스테인은 볼드체 및 밑줄로 표시하였다.)
5-2. Insulin 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체의 임시발현 시스템 확립
실시예 5-1에서 유전자 클로닝을 통해 얻은 최종 벡터를 BL21 세포에 heat shock 방법을 통해 형질전환을 진행한 후, 벡터 내에 있는 항생제 내성 유전자에 맞는 암피실린 항생제를 첨가한 아가 플레이트에 도말하여 단일 콜로니를 선별하였다. 콜로니를 종 배양하기 위해 5 mL의 암피실린이 포함된 2xYT 배지에 overnight 배양하였다. 다음날 암피실린이 포함된 1 L의 2xYT 배지로 옮기는 본 배양을 진행하였다. UV spectrometer를 이용해 600 nm에서 OD 0.6 내지 0.8 구간의 대수증식기에 도달되었는지 측정 후, IPTG 넣어 단백질을 유도 하였으며, 4시간 후 insulin 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 회수하였다.
5-3. Insulin 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체의 정제 및 농축
(1) 세포 파쇄
배양액에서 회수한 세포 pellet에 50 mM sodium phosphate, 300 mM sodium chloride, 10mM imidazole pH 8.0 (Histrap HP Equilibration buffer) 완충액을 가하여 resuspension한 뒤, ice로 냉각하며 ultrasonicator를 사용하여 30분간 파쇄하였다. 파쇄한 배양액을 11,000 x g, 4℃, 30분으로 centrifuge하여 pellet을 얻은 뒤 HisTrap HP Equilibration buffer로 2회 wash하였다.
(2) 변성화 단계
Denaturation buffer (50 mmol/L sodium phosphate, 300 mmol/L sodium chloride, 8 mol/L urea, 0.1% Triton X-100, 5 mmol/L DTT, pH 8.0)를 (1)의 pellet 넣어 resuspension하였다. 차광하여 rocker에 고정한 뒤 RT에서 100 rpm으로 3시간 rocking하였다. 그 다음으로, 4℃로 옮겨 천천히 rocking하며 overnight incubation 하였다.
(3) 히스티딘 친화성 크로마토그래피를 이용한 정제
(2)에서 얻은 용액을 11,000 x g, 4℃, 30분으로 centrifuge하여 상등액을 0.2 μm 크기의 기공을 갖는 PES 여과 막에 여과하여 불순물을 제거하였다. 상기 여과액을 Histrap HP (GE healthcare)에 적재하여 insulin 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된 융합체를 정제하였다. 그 결과는 도 24에서 나타낸 바와 같다. 상기 정제에 사용된 히스티딘 친화성 크로마토그래피의 조건은 하기와 같다.
<크로마토그래피 조건>
- 수지: Histrap HP
- 유속: 180 cm/h
- 평형: 50 mM sodium phosphate, 300 mM sodium chloride, 10 mM imidazole pH 8.0 완충액
- 적재: 최대 30 g 단백질/L 수지 부피
- 재생 및 멸균: 1 M NaOH 용액
- 용출: 50 mM sodium phosphate, 300 mM sodium chloride, 500 mM
imidazole pH 8.0 완충액
- 보관: 20% EtOH
평형 완충액 및 용출 완충액을 농도 구배로 흘려주면서 insulin 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체가 용출되는 피크를 모아 회수하였다.
(4) 재생화 단계
3.5 kDa dialysis cassette(Thermo scientific) 2개에 (3)의 용출액을 12 mL씩 주입한 뒤, 0.1 mmol/L glycine, 1 mmol/L DTT, pH 10.5, 5L에 넣고 천천히 stirring하며 4℃에서 overnight dialysis하여 refolding을 진행하였다.
Refolding 완료된 sample을 회수한 뒤, 5% (v/v)의 phosphoric acid를 가하여 ~ pH 2.0이 되게 하였고, 추가적으로 5 mM GSH(oxidized)을 가해 산화반응을 종결시켰다. 그 다음으로, 한외여과방식을 이용해 농축한 후 sodium acetate buffer pH4.5로 투석하여 -20℃에 보관하였다.
그 결과 도 25에서 나타낸 바와 같이, 회수된 융합체가 90% 이상의 순도를 가지는 것을 SE-HPLC을 이용하여 확인하였다.
실시예 6. 표적 결합 물질 (GLP-1) 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체
GLP-1 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체는 GL Biochem(Shanghai) Ltd.에 의뢰하여 합성하였으며, 상기 융합체의 아미노산 서열은 다음 표 12에 나타내었다.
(위 첨자 "C"는 코일드코일 형성 도메인에 시스테인이 도입되었음을 의미하며, 서열 내 시스테인은 볼드체 및 밑줄로 표시하였다.)
실시예 7. 이중 표적 결합체의 정제 및 농축
7-1. 이중 표적 결합체의 정제 및 농축
상기 실시예에서 정제한 HSA 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질; 및 2종의 표적 결합 물질 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체를 결합하여 이중 표적 결합체로 만들기 위해서는 상기 융합단백질 및 2종의 융합체들을 결합 시킨 후 정제하는 과정이 요구된다.
이중 표적 결합체의 제조를 위한 융합단백질 및 융합체의 요구량(몰농도)은 하기 표 13에 나타낸 바와 같다.
각 농도의 상기 융합단백질 및 2종의 융합체를 혼합하고 30분간 상온에서 반응시켰다. 이후 상기 반응액을 Q impres(GE healthcare)에 적재하여 이중 표적 결합체를 정제하였다. 그 결과는 도 26에서 나타낸 바와 같다. 상기 정제 시 사용한 크로마토그래피 조건은 하기와 같다.
<크로마토그래피 조건>
- 수지: Q impres
- 유속: 120 cm/h
- 평형: 20 mM sodium phosphate, pH 7.0
- 적재: 최대 10 g 단백질/L 수지 부피
- 재생 및 멸균: 1 M NaOH 용액
- 세척: 20 mM sodium phosphate, 60 mM sodium chloride, pH 7.0
- 용출: 20 mM sodium phosphate, 200 mM sodium chloride, pH 7.0
- 보관: 20% EtOH
BCA 및 Lowry 정량법과 UV spectrometer를 이용하여 이중 표적 결합체를 정량하였다.
그 결과 도 27에서 나타낸 바와 같이, 총단백 정량법과 아미노산 서열로 얻은 흡광계수 값으로 UV spectrometer를 이용해 측정한 값이 일치함을 확인하였고, 이를 통해 이중 표적 결합체의 정량법을 구축하였다.
이후 정제된 이중 표적 결합체의 양을 UV spectrometer를 이용해 측정하고, 한외여과방식을 이용해 농축한 후 PBS로 투석하여 -20℃에 보관하였다.
7-2. 코일드코일 형성 도메인 간 공유결합을 포함하는 이중 표적 결합체의 정제 및 농축(시스테인 돌연변이 도입)
실시예에서 제조된, 시스테인 돌연변이를 도입한 코일드코일 형성 도메인을 포함하는, 융합단백질 및 2종의 융합체를 결합시켜 이중 표적 결합체를 제조하기 위해서는 정제 전 각 물질을 환원/산화 과정이 요구된다.
이중 표적 결합체의 제조를 위해 필요한 융합단백질 및 2종의 융합체의 요구량(몰농도) 및 환원/산화을 위한 TCEP의 농도 조건은 하기 표 14 내지 16에 나타내었다.
표 14 내지 16 각각에 기재된 각 농도의 융합단백질 및 2종의 융합체에 각 농도의 TCEP을 처리하고 25분간 반응시켰다. 이후 융합단백질 및 2종의 융합체를 혼합하고 추가로 5분간 반응시켰다. 반응한 용액에 2 mM의 oxidized glutathione을 섞어주고 4℃에서 3일간 air oxidation을 통해 코일드코일 형성 도메인의 시스테인에 의한 이황화결합이 형성될 수 있도록 두었다.
이후, 상기 표 14의 융합단백질 및 2종의 융합체로부터 수득된 반응물은 실시예 8-1에서와 동일한 방법에 의해 정제 및 농축하였다.
또한, 상기 표 15의 융합단백질 및 2종의 융합체로부터 수득된 반응물은 Capture select human albumin(Thermo fisher)에 적재하여 이중 표적 결합체를 정제하였다. 그 결과는 도 28a에서 나타낸 바와 같다. 상기 정제에 사용된 HSA 친화성 크로마토그래피 조건은 하기와 같다.
<크로마토그래피 조건>
- 수지: Capture select human albumin
- 유속: 480 cm/h
- 평형: PBS 완충액
- 적재: 최대 10 g 단백질/L 수지 부피
- 재생 및 멸균: 0.01 M NaOH 용액
- 용출: 0.1 M glycine-Hcl
- 보관: 20% EtOH
HSA 친화성 크로마토그래피 진행 후, 분획되어 회수된 이중 표적 결합체를 0.2 M sodium phosphate, pH 7.0으로 중화하였다. 공유결합의 형성 유무를 확인하기 위해 RP-HPLC로 분석하였다.
그 결과 도 28b에서 나타낸 바와 같이, 이중 표적 결합체는 98% 이상의 순도를 가져 이황화결합에 의한 공유결합이 형성되었음을 확인하였다.
이후 정제된 이중 표적 결합체의 양을 UV spectrometer를 이용해 측정한 후, 한외여과방식을 이용해 농축한 후 PBS로 투석하여 -20℃에서 보관하였다.
실시예 8. 융합 이중 단백질
8-1. 하나의 폴리펩타이드에 알부민 및 2가지 단백질이 발현되는 융합 이중 단백질을 인코딩하는 재조합 플라스미드의 구축
유전자클로닝을 위해 하나의 폴리펩타이드에 알부민 및 2가지 단백질이 발현되는 융합 이중 단백질의 DNA를 코돈 최적화(codon optimization)한 후, overlap PCR을 통해 단백질의 DNA가 N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 단백질을 암호화하는 DNA와 N-말단에 insulin, C-말단에 GLP-1이 융합된 단백질을 암호화하는 DNA를 준비하였다.
유전자 구축을 위해 pcDNA 3.1 벡터를 사용하였으며, insert DNA와 벡터를 각각 overlap PCR 후 DpnI 제한효소를 처리하여 N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 단백질을 코딩하는 DNA가 삽입된 8738 bp 크기의 벡터와 N-말단에 insulin, C-말단에 GLP-1이 융합된 단백질을 코딩하는 DNA가 삽입된 7988 bp 크기의 벡터를 제작하였으며, 최종적으로 구축된 재조합 플라스미드는 도 29a 및 29b에 나타내었다. 상기 벡터를 Stella® competent cell(제조사: Clontech)에 삽입한 뒤 벡터 내에 있는 항생제 내성 유전자에 맞는 암피실린 항생제를 첨가한 아가 플레이트에 도말하여 콜로니를 선별한 뒤, Applied biosystems 3730xl DNA analyzer(제조사: Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 염기서열을 확인하였다.
본 발명의 일 예로서 N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 단백질과 N- 말단에 insulin, C-말단에 GLP-1이 융합된 단백질을 암호화하는 DNA 염기서열 및 융합단백질의 아미노산 서열을 표 17과 18에 나타내었다.
7-2. 융합 이중 단백질의 임시발현 시스템 확립
실시예 7-1에서 유전자 클로닝을 통해 얻은 최종 벡터를 Expi CHO 동물 세포에 도입하여 본 발명의 융합단백질을 빠른 시간 내에 확보하기 위한 임시발현 시스템을 확립하였다.
구체적으로 형질전환 하루 전 플라스크에 3.0 x 106 세포/mL 농도의 세포를 분주한 후 24시간 배양하였다. 형질도입 당일 ExpiCHO® expression 배지를 첨가하여 6.0 x 106 세포/mL 농도로 희석하였다. 이후, DNA 1 μg/mL와 Opti-PRO® 배지를 섞어주고, ExpiFectamine® 시약과 Opti-PRO® 배지를 부피에 맞춰 혼합한 후 상온에서 5분간 두었다. 그 다음, 5분간 DNA와 Expifectamine® 시약을 반응시키고 플라스크에 첨가하였으며, 16 내지 22시간 후에 feed 및 enhancer를 처리하고, 5일 후에 추가적으로 feed를 넣어주었다. 8일 차에 생존율(viability)이 75%이상인지 여부를 확인하고 회수하였다.
7-3. 융합 이중 단백질의 정제 및 농축
(1) HSA 친화성 크로마토그래피를 이용한 정제
실시예 7-2의 임시발현 시스템으로부터 얻은 배양액을 0.2 μm의 기공 크기를 갖는 PES 여과 막에 여과하여 불순물을 제거하였다. Sartocon® Slice 200 Hydrosart® Cassette 30 KD(Sartorius)가 장착된 농축/투석기에 여과된 배양액을 넣어 농축하고, 20 mM sodium phosphate, pH 7.0 완충액으로 투석한 후 회수하였다. 상기 회수된 투석액을 알부민 친화성 매트릭스 Albupure®(Prometic Bioseparations Ltd)에 적재하여 도 30a에 나타낸 바와 같은 N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 융합 이중 단백질과 도 30b에 나타낸 바와 같은 N-말단에 insulin, C-말단에 GLP-1이 융합된 융합 이중 단백질을 정제하였다. 상기 정제에 사용된 HSA 친화성 크로마토그래피의 조건은 하기와 같다.
<크로마토그래피 조건>
- 수지: Albupure®
- 유속: 480 cm/h
- 평형: 20 mM sodium phosphate, pH 7.0 완충액
- 적재: 최대 35 g 단백질/L 수지 부피
- 재생 및 멸균: 1 M NaOH 용액
- 용출: 20 mM sodium phosphate, 20 mM sodium octanonate, pH 7.0 완충액
- 보관: 20% EtOH
HSA 친화성 크로마토그래피 진행 후, N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 단백질과 N-말단에 insulin, C-말단에 GLP-1이 융합된 단백질이 용출되는 피크를 회수하였다. 분획 되어 회수된 단백질을 SE-HPLC로 분석하였다.
그 결과, 도 31a 및 31b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 회수된 N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 단백질과 N-말단에 insulin, C-말단에 GLP-1이 융합된 단백질은 80% 이상의 순도를 가지는 것을 확인할 수 있었다.
(2) 음이온 교환 수지 크로마토그래피를 이용한 정제
HSA 친화성 크로마토그래피를 통해 얻은 단백질 용액을 Q impres (GE healthcare)에 적재하여 N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 단백질과 N-말단에 insulin, C-말단에 GLP-1이 융합된 단백질을 정제하였다. 그 결과는 도 32a 및 도 32b에서 나타낸 바와 같다. 상기 정제에 사용된 음이온 교환 수지 크로마토그래피 조건은 하기와 같다.
<크로마토그래피 조건>
- 수지: Q impres
- 유속: 120 cm/h
- 평형: 20 mM sodium phosphate, pH 7.0 완충액
- 적재: 최대 10 g 단백질/L 수지 부피
- 재생 및 멸균: 1 M NaOH 용액
- 용출: 20 mM sodium phosphate, 200 mM sodium chloride, pH 7.0 완충액
- 보관: 0.01 M NaOH 용액
음이온 교환 크로마토그래피 진행 후, 분획 되어 회수된 단백질은 SE-HPLC로 분석하여 동정하였다.
그 결과, 도 33a 및 33b에서 나타낸 바와 같이, 용출액에서 나온 피크는 N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 융합 이중 단백질과 N-말단에 insulin, C-말단에 GLP-1이 융합된 융합 이중 단백질임을 SE-HPLC를 통해 확인하였으며, 융합 이중 단백질은 순도가 95% 이상인 것으로 확인하였다.
이후 회수된 N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 단백질과 N-말단에 insulin, C-말단에 GLP-1의 양을 UV spectrometer를 이용해 측정한 후, 한외여과방식을 이용해 농축한 후 PBS로 투석하여 -20℃에 보관하였다.
실험예 1. 이중 표적 결합체의 형성 확인
코일드코일 형성 도메인 간에 자가결합이 이루어져 사이즈가 증가해 이중 표적 결합체가 hetero complex를 이루는지를 SE-HPLC를 통해 측정하였다. 이중 표적 결합체 형성에 사용된 융합단백질 및 2종의 융합체는 코일드코일 형성 도메인의 말단에 시스테인을 engineering하여 넣어주었기 때문에 환원시킨 후 결합을 진행하였다. 구체적으로, 환원제로 사용되는 물질 중 하나인 TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine)을 이용해 융합단백질 및 2종의 융합체의 시스테인을 환원시켜 주었다. 각 융합단백질 및 2종의 융합체 내부의 이황화결합은 환원시키지 않고, 외부의 코일드코일 형성 도메인 주변의 이황화결합만 환원시키기 위해 TCEP 농도를 조절하였으며, HSA 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된 융합단백질의 농도 기준 15배의 TCEP, 각 표적 결합 물질 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된 융합체 농도 기준 7.5배의 TCEP을 30분 반응시킨 후 SE-HPLC로 분석하였다.
그 결과 도 34a 내지 34c에서 나타낸 바와 같이, SE-HPLC 분석 결과 2개의 이중 표적 결합체에서 모두 피크가 왼쪽으로 이동하는 것을 확인하였다. 이는 융합단백질 및 2종의 융합체가 자가결합에 의해 이중 표적 결합체를 이루게 되어 융합단백질 및 2종의 융합체 각각 단독으로 존재할 때 보다 사이즈가 커지는 것을 의미한다. 구체적으로, 도 34a는 표적 결합 물질로서 GFP 및 mCherry가 도입된 이중결합체에 관한 것이고, 도 34b은 표적 결합 물질로서 CD80 및 PD-1이 도입된 이중결합체에 관한 것이며, 도 34c는 표적 결합 물질로서 Insulin 및 GPL-1이 도입된 이중결합체에 관한 것이다. 따라서, 상기 피크의 이동 결과로부터 융합단백질 및 2종의 융합체의 자가결합을 통해 이중 표적 결합체(HSA 및 표적 결합 물질의 결합체)를 형성함을 확인하였다.
실험예 2. 이중 표적 결합체의 결합력 측정
코일드코일 형성 도메인 간의 자가결합에 의한 결합력을 비교하기 위해서 Biacore T-100(GE healthcare) 기기를 이용하여 표면 플라즈마 공명(surface plasmon resonance, SPR) 값을 측정하였다.
Biacore T-100 기기에 CM5 칩을 장착하고 HBS(HEPES buffered saline, HBS) 완충액을 흘려주었다. 그래프의 베이스 선이 일정하게 유지되는지 확인 후 1-에틸-3-디메틸아미노프로필 카보디마이드(1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC) 및 N-하이드록시 숙시니마이드(N-hydroxy succinimide, NHS)를 칩에 흘려주어 아민기를 활성화시켰다. 그리고 HSA 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된 융합단백질을 칩에 주입하여 활성화된 아민기와 공유결합을 형성하게 하여 고정시킨 후, 에탄올아민으로 완전히 고정시켰다. 고정된 HSA 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된 융합단백질과 코일드코일을 형성하여 결합될 수 있는 융합체(표적 결합 물질(mCherry 또는 GFP) 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합체)를 칩에 흘려주어 결합하는 정도를 공명 값(resonance unit, RU)으로 확인한 후 프로그램을 사용하여 해리상수(Kd)를 계산하였다.
그 결과 도 35a 및 도 35b에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 HSA에 결합된 코일드코일 형성 도메인 또는 표적 결합 물질에 결합된 코일드코일 형성 도메인 C/C'의 해리상수는 6.85 nM, D/D'의 해리상수는 1.32 nM로 측정되었으며, 상기 측정된 해리상수는 HSA 또는 표적 결합 물질이 결합되지 않은 코일드코일 형성 도메인과 유사한 해리상수(C/C': 42, D/D': 1 nM)와 유사한 값을 가지는 것을 확인하였다. 이를 통해 코일드코일 형성 도메인에 HSA 또는 표적 결합 물질을 결합하더라도 자가결합에 의한 코일드코일 형성에 문제가 없음을 확인하였다.
실험예 3. 이중 표적 결합체의 pH 안정성 측정
pH 변화에 따른 이중 표적 결합체의 결합 안정성 유지 여부를 SE-HPLC를 이용하여 확인하였다.
구체적으로, 각 이중 표적 결합체를 pH4, 6 및 7.4의 완충액으로 투석과정을 거쳐 제조하였으며, SE-HPLC 이동상 또한 각 pH의 완충액으로 설정하였다.
그 결과 도 36에서 나타낸 바와 같이, pH 4 내지 7.4 범위에서 이중 표적 결합체 형성으로 인한 사이즈의 증가가 관찰되어, pH 변화 여부와 관계없이 코일드코일 형성 도메인 간의 자가결합이 이루어지는 것을 확인하였다.
실험예 4. 이중 표적 결합체의 rat plasma 안정성
37℃의 rat plasma 내에서 이중 표적 결합체의 코일드코일 형성 도메인 간의 결합력이 유지되는지를 확인하기 위해, 비공유결합에 의한 이중 표적 결합체; 및 추가적인 공유결합(이황화결합)에 의해 코일드코일 형성 도메인 간의 결합 안정성이 향상된 이중 표적 결합체의 rat plasma 내 안정성 시험을 진행하였다.
구체적으로, rat에서의 약물 동태학 시험을 진행할 농도와 동일하게 rat plasma 200μL에 5 mg/kg과 동등한 양의 이중 표적 결합체와 대조군인 야생형 HSA를 넣고, 37℃에서 반응시켰으며 0일, 1일 및 2일째의 이중 표적 결합체와 대조군인 야생형 HSA의 농도를 측정하였으며, 이중 표적 결합체와 야생형 HSA의 농도는 ELISA를 이용하여 측정하였다. 코팅용액에 희석한 mCherry 항체 또는 Human CD80(B7-1) 항체를 96 well plate에 각각 100μL씩 첨가하고 4℃에서 overnight로 방치하였다. 플레이트를 PBST(Phosphate buffered saline, Tween-200) 세척용액으로 5번 세척한 후 3% skim milk가 첨가된 blocking buffer를 well 당 200 μL씩 첨가하여 2시간 동안 37℃에서 blocking하였다. 플레이트를 PBST로 5번 세척한 후 128 ng/mL 내지 0.25 ng/mL까지 1/2씩 희석한 표준용액 또는 적절한 비율로 희석한 rat plasma 샘플을 100 μL씩 첨가하고 37℃에서 2시간 incubation 후 PBST 세척용액으로 5번 세척하였다. 이후 GFP 항체 또는 PD-1 human ELISA kit 안에 포함된 biotinylated anti-PD-1 polyclonal 항체를 1/100 희석해서 50μL씩 각 well에 넣고 37℃에서 1.5시간 incubation하였다. 플레이트를 PBST 세척용액으로 5번 세척한 후 anti-mouse IGG-HRP 또는 Streptavidin-HRP를 1/200 희석해서 각 well 당 100μL씩 넣고 37℃에서 1시간 incubation했다. PBST 세척용액으로 5번 세척하고 well 당 100 μL씩 TMB substrate 용액을 첨가한 후 어두운 실온에서 10분간 incubation한 뒤 well 당 100 μL의 1N sulfuric acid로 반응을 종료시키고, 450 nm에서 plate reader로 흡광도를 측정하였다. 단백질의 농도는 ELISA로부터 계산된 양에 희석배수를 계산하여 농도를 구하였다.
그 결과 도 37에 나타낸 바와 같이, 추가적인 공유결합(이황화결합)을 더 포함하는 이중 표적 결합체(PD1/CD80)는 대조군인 야생형 HSA와 유사하게 rat plasma 내에서 2일간 안정성이 유지됨을 확인하였다.
또한, 도 38a 및 38b에 나타낸 바와 같이, 추가적인 공유결합(이황화결합)을 더 포함하는 이중 표적 결합체(GLP-1/insulin)는 대조군인 야생형 HSA와 유사하게 rat plasma 내에서 2일간 안정성이 유지됨을 확인하였다.
이로써 본 발명의 이중 표적 결합체가 rat plasma에서 코일드코일 형성 도메인 간의 결합력을 유지함을 확인하였다.
실험예 5. 이중 표적 결합체의 in vitro efficacy 시험
(1) CD80 in vitro ELISA competitive assay
CD80의 ligand 단백질인 CD28을 antigen coating buffer에 1 μg/mL으로 희석한 뒤 EIA plate에 100 μL씩 4℃에서 overnight coating 하였다. 항체 coating plate의 시료를 제거 한 후 3% skim milk blocking solution 200 μL씩 로딩 한 후, RT에서 2 시간 incubation하여 blocking 하였다. 3% skim milk blocking solution을 제거한 후, CD80-K' 를 100 nmol/L로 희석하여 50 μL씩 duplicate로 로딩하였다. CD80-K'가 로딩된 well에 10 농도구간의 serial dilution으로 이중 표적 결합체(complex, 알부민 또는 이의 유사체 및 표적 결합 물질의 결합체, 표적 결합 물질(PD-1, CD80)) 시료를 duplicate로 50 μL씩 로딩한 후, RT에서 2 시간 incubation하였다. 시료를 제거한 후 0.05% PBST 로 3 회 washing하였다. 3% skim milk blocking solution에 anti-HSA-antibody-HRP를 1:5000으로 희석한 후, 각 well에 로딩하여 RT에서 1 시간 incubation하였다. Anti-HSA-antibody-HRP를 제거한 후 0.05% PBST 로 5 회 세척하였다. TMB solution을 100 μL씩 로딩하여 발색하였다. 1 N Sulfuric acid 100 μL씩 추가하여 발색반응을 멈추게 한 후, Microplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 39에서 나타낸 바와 같이, 이중 표적 결합체(complex, 알부민 또는 이의 유사체 및 표적 결합 물질의 결합체, 표적 결합 물질(PD-1, CD80))의 in vitro efficacy를 확인하였으며 구체적으로, N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 융합 이중 단백질(fusion)에 비해 상기 이중 표적 결합체의 in vitro efficacy가 높음을 확인하였다.
(2) PD-1 in vitro ELISA competitive assay
PD1의 ligand 단백질인 PDL1을 antigen coating buffer에 1 μg/mL으로 희석한 뒤 EIA plate에 100 μL씩 4℃에서 overnight coating 하였다. 항체 coating plate의 시료를 제거 한 후 3% skim milk blocking solution 200 μL씩 로딩한 후, RT에서 2 시간 incubation하여 blocking 하였다. 3% skim milk blocking solution을 제거한 후, PD1-C'를 100 nmol/L로 희석하여 50 μL씩 duplicate로 로딩하였다. PD1-C'가 로딩된 well에 10 농도구간의 serial dilution으로 이중 표적 결합체(complex, 알부민 또는 이의 유사체 및 표적 결합 물질의 결합체, 표적 결합 물질 (PD-1, CD80)) 시료를 duplicate로 50 μL씩 로딩한 후, RT에서 2 시간 incubation하였다. 시료를 제거한 후 0.05% PBST 로 3회 washing하였다. 시료를 제거한 후 0.05% PBST 로 3 회 washing하였다. 3% skim milk blocking solution에 anti-HSA-antibody-HRP를 1:5000으로 희석한 후, 각 well에 로딩하여 RT에서 1시간 incubation하였다. Anti-HSA-antibody-HRP 를 제거한 후 0.05% PBST 로 5회 washing하였다. TMB solution을 100 μL씩 로딩하여 발색하였다. 1 N Sulfuric acid 100 μL씩 추가하여 발색반응을 멈추게 한 후, Microplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 40에서 나타낸 바와 같이, 이중 표적 결합체(complex, 알부민 또는 이의 유사체 및 표적 결합 물질의 결합체, 표적 결합 물질(PD-1, CD80))의 in vitro efficacy를 확인하였으며 구체적으로, N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 융합 이중 단백(fusion)에 비해 상기 이중 표적 결합체의 in vitro efficacy가 높음을 확인하였다.
(3) GLP-1 in vitro ELISA competitive assay
GLP-1의 receptor GLP-1 receptor를 antigen coating buffer에 1 μg/mL으로 희석한 뒤 EIA plate에 100 μL씩 4℃에서 overnight coating 하였다. 항체 coating plate의 시료를 제거 한 후 3% skim milk blocking solution 200 μL씩 lo로딩한 후, RT에서 2 시간 incubation하여 blocking 하였다. 3% skim milk blocking solution을 제거한 후, PD1-C'를 100 nmol/L로 희석하여 50 μL씩 duplicate로 로딩하였다. GLP-1-C'가 로딩된 well에 10 농도구간의 serial dilution으로 이중 표적 결합체(complex, 알부민 또는 이의 유사체 및 표적 결합 물질의 결합체, 표적 결합 물질(GLP-1, Insulin)) 시료를 duplicate로 50 μL씩 l로딩한 후, RT에서 2시간 incubation하였다. 시료를 제거한 후 0.05% PBST 로 3 회 washing하였다. 시료를 제거한 후 0.05% PBST 로 3 회 washing하였다. 3% skim milk blocking solution에 anti-HSA-antibody-HRP를 1:5000으로 희석한 후, 각 well에 로딩하여 RT에서 1 시간 incubation하였다. Anti-HSA-antibody-HRP 를 제거한 후 0.05% PBST 로 5 회 washing하였다. TMB solution을 100 μL씩 로딩하여 발색하였다. 1 N Sulfuric acid 100 μL씩 추가하여 발색반응을 멈추게 한 후, Microplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 41에서 나타낸 바와 같이, 이중 표적 결합체(complex, 알부민 또는 이의 유사체 및 표적 결합 물질의 결합체, 표적 결합 물질(GLP-1, Insulin))의 in vitro efficacy를 확인하였으며 구체적으로, N-말단에 Insulin, C-말단에 GLP-1이 융합된 융합 이중 단백질(fusion)에 비해 상기 이중 표적 결합체의 in vitro efficacy가 높음을 확인하였다.
(4) CD80 in vitro cell blockade assay
이중 표적 결합체의 활성을 확인하기 위하여 CTLA-4 blockade assay kit(Promega)를 이용하여 cell blockade assay를 진행하였다. 이중 표적 결합체 (알부민 또는 이의 유사체 및 표적 결합 물질의 결합체, 표적 결합 물질(PD-1, CD80))를 10 μmol/L로 희석한 뒤, 3배씩 serial dilution하여 9개 농도의 시료를 준비하였다. Kit 내부의 effector cell, 시료(duplicate), APC cell을 차례로 96 well plate에 넣어 준 뒤, 37℃, 5% CO2 incubator에서 6시간 동안 incubation하였다. Kit 내부의 reagent를 넣고 10분 뒤 Microplate reader를 이용하여 luminescence를 측정하였다.
그 결과 도 42에서 나타낸 바와 같이, 이중 표적 결합체(complex, 알부민 또는 이의 유사체 및 표적 결합 물질의 결합체, 표적 결합 물질(PD-1, CD80))의 in vitro cell blockade efficacy를 확인하였으며 구체적으로, N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 융합 이중 단백질(fusion)에 비해 상기 이중 표적 결합체의 in vitro cell blockade efficacy가 높음을 확인하였다.
(5) PD-1 in vitro cell blockade assay
이중 표적 결합체의 활성을 확인하기 위하여 PD1-PDL1 blockade assay kit(Promega)를 이용하여 cell blockade assay를 진행하였다. Kit 내부의 APC cell을 96 well plate에 넣어 준 뒤, 37℃, 5% CO2 incubator에서 overnight incubation하였다. 이중 표적 결합체(complex, 알부민 또는 이의 유사체 및 표적 결합 물질의 결합체, 표적 결합 물질(PD-1, CD80))를 10 μmol/L로 희석한 뒤, 2.5배씩 serial dilution하여 9개 농도의 시료를 준비하였다. 시료와 kit 내부의 effector cell을 차례로 96 well plate에 넣어 준 뒤, 37℃, 5% CO2 incubator에서 6시간 동안 incubation하였다. Kit 내부의 regent를 넣고 10분 뒤 Microplate reader를 이용하여 luminescence를 측정하였다.
그 결과 도 43에서 나타낸 바와 같이, 이중 표적 결합체(complex, 알부민 또는 이의 유사체 및 표적 결합 물질의 결합체, 표적 결합 물질(PD-1, CD80))의 in vitro cell blockade efficacy를 확인하였으며 구체적으로, N-말단에 PD-1, C-말단에 CD80이 융합된 융합 이중 단백질(fusion)에 비해 상기 이중 표적 결합체의 in vitro cell blockade efficacy가 높음을 확인하였다.
<110> HK Inno.N <120> FUSION PROTEIN COMPRISING ALBUMIN AND COILED COIL FORMING DOMAIN, AND ALBUMIN AND TARGET SUBSTANCE CONJUGATE USING THE SAME <130> P19-114-REA-HKI <150> KR 10-2020-0002238 <151> 2020-01-07 <160> 57 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aaggctttca ttgtcacgga tgaggacatt agaaaacaag aagaaagagt tcagcaggtg 60 aggaaaaagt tggaagaagc attgatggct gacatattga gt 102 <210> 2 <211> 84 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gaaattgcgg cactcgaaaa agagattgcc gcgcttgaaa aagagaatgc tgcacttgaa 60 tgggagatag ccgcattgga aaaa 84 <210> 3 <211> 81 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ggacttgagc aagagattgc ggcgctggaa aaggagaacg cagccttgga atgggaaatt 60 gccgcacttg aacagggcgg a 81 <210> 4 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Lys Ala Phe Ile Val Thr Asp Glu Asp Ile Arg Lys Gln Glu Glu Arg 1 5 10 15 Val Gln Gln Val Arg Lys Lys Leu Glu Glu Ala Leu Met Ala Asp Ile 20 25 30 Leu Ser <210> 5 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Ile Ala Ala Leu 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tgagggatga agggaaggct 780 tcttctgcta aacagcgcct caagtgcgcg tctttgcaga agttcggaga gagagccttt 840 aaagcatggg ctgttgctcg cctgtcacag aggtttccaa aagcagagtt tgctgaagtc 900 agcaaactgg tcacagacct taccaaagta catacggaat gctgtcatgg tgatcttttg 960 gaatgcgcag atgaccgagc cgaccttgcg aagtatatct gtgaaaatca ggacagtatt 1020 tcctcaaaat tgaaggagtg ttgcgagaaa ccacttctcg agaagagtca ctgcatcgca 1080 gaagttgaga atgacgagat gccggcggac ttgcctagcc tggctgctga ttttgttgaa 1140 agtaaggacg tgtgcaagaa ctacgctgaa gctaaagacg tctttcttgg gatgttcctg 1200 tatgagtacg cacgaagaca tcctgattac tccgttgtac tgttgcttag actggcaaaa 1260 acgtatgaga ccaccttgga gaaatgttgt gcggcggcag acccccatga atgttacgcc 1320 aaagtattcg acgagtttaa gccccttgta gaagagcctc agaacctgat aaagcaaaac 1380 tgtgagcttt tcgagcagct gggggaatat aaattccaaa acgctcttct cgtgcgctac 1440 actaagaaag ttccgcaggt ttccaccccc acccttgtag aagtgtctag gaaccttggt 1500 aaagttggca gcaaatgctg taaacatcct gaagcaaagc ggatgccgtg cgccgaggac 1560 tatctttctg tagttctgaa tcagctctgt gttctccacg aaaaaacgcc ggtaagtgat 1620 cgcgttacaa aatgctgtac agagagcctg gtcaaccggc gaccctgttt ctccgctctt 1680 gaagttgacg agacttacgt cccgaaagaa ttcaacgccg aaacattcac atttcacgcc 1740 gatatctgta ccttgtctga aaaggaacgc caaattaaaa agcaaaccgc cctggtggag 1800 ctggttaaac acaagccgaa ggcaactaaa gagcagctga aggctgttat ggacgatttc 1860 gctgcgttcg tggagaaatg ttgcaaggcc gacgacaaag agacgtgttt cgcagaggaa 1920 ggaaagaaac ttgtggctgc ttctcaagcc gcacttggac tggggggagg cggcagtgga 1980 ggaggggggt caggaggtgg gggttgtaag gctttcattg tcacggatga ggacattaga 2040 aaacaagaag aaagagttca gcaggtgagg aaaaagttgg aagaagcatt gatggctgac 2100 atattgagtt gt 2112 <210> 11 <211> 705 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Albumin and coiled coil forming domain <400> 11 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Gly Gly Cys Glu Ile Ala Ala Leu 20 25 30 Glu Lys Glu Ile Ala Ala Leu Glu Lys Glu Asn Ala Ala Leu Glu Trp 35 40 45 Glu Ile Ala Ala Leu Glu Lys Cys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 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gtcctttcga aagatcccaa cgaaaagcgt 780 gaccacatgg tccttcttga gtttgtaact gctgctggga ttacacatgg catggatgag 840 ctctacaaac atcaccatca ccatcactg 869 <210> 24 <211> 894 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target substance and coiled coil forming domain <400> 24 catcaccatc accatcacgt ttcaaaaggc gaagaagaca atatggcaat catcaaagaa 60 tttatgcgtt ttaaagtcca tatggaaggc agcgtgaacg gtcacgaatt cgaaattgaa 120 ggtgaaggcg aaggtcgccc gtatgaaggc acccagacgg caaaactgaa agttaccaaa 180 ggcggtccgc tgccgtttgc ttgggatatt ctgagcccgc aattcatgta tggctctaaa 240 gcgtacgtca aacatccggc cgatatcccg gactatctga aactgagctt tccggaaggt 300 ttcaaatggg aacgtgtgat gaactttgaa gatggcggtg tggttaccgt tacgcaggat 360 agctctctgc aagacggcga atttatttat aaagtcaaac tgcgcggcac caatttcccg 420 tctgatggtc cggtgatgca gaagaaaacc atgggttggg aagcgagttc cgaacgtatg 480 tacccggaag acggcgccct gaaaggtgaa atcaaacagc gcctgaaact gaaagatggc 540 ggtcactatg acgcagaagt gaaaaccacg tacaaagcta aaaaaccggt tcaactgccg 600 ggtgcataca acgtcaacat caaactggat atcaccagtc ataacgaaga ctatacgatc 660 gttgaacagt acgaacgcgc ggaaggccgc cactccaccg gcggtatgga tgaactgtac 720 aaagggggag gcggcagtgg aggagggggg tcaggaggtg ggggttgtcc cgaagaaagg 780 gagaggatga ttaaacagct taaagaagag ctgcgccttg aggaagcgaa actggtactg 840 ctcaaaaaac ttaggcagtc acaaatccaa aaagaggcga cggcccaaaa atgt 894 <210> 25 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Target substance and coiled coil forming domain <400> 25 Gly Gly Cys Lys Ile Ala Ala Leu Lys Glu Lys Ile Ala Ala Leu Lys 1 5 10 15 Glu Lys Asn Ala Ala Leu Lys Trp Lys Ile Ala Ala Leu Lys Glu Cys 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Lys 35 40 45 Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp 50 55 60 Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu Gly 65 70 75 80 Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly 85 90 95 Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly 100 105 110 Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 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cgttctgaag tatgagaaag atgcatttaa gcgtgagcat 360 ctggccgaag taactttgtc tgtgaaagcc gattttccta ctccctctat tagcgatttt 420 gaaattccca cttctaacat cagacgcata atatgctcta ccagcggcgg atttcctgag 480 ccacaccttt catggctcga aaatggggaa gaattgaacg ctatcaatac tactgtttcc 540 caagatccag aaacagaatt gtacgccgta agtagcaagc tcgatttcaa tatgacaact 600 aatcacagct ttatgtgtct tattaaatat ggacatctgc gggtcaacca aaccttcaac 660 tggaacacaa ctaagcagga acattttcca gataacggcg gtggggggtc cggtggggga 720 ggttctggag gagggggctg tggaggctgt gggctgaagc aaaagatagc tgccttgaag 780 tataagaacg ccgcattaaa gaaaaaaatc gcagctctta aacagggcgg ctgtggagga 840 ggacaccatc atcaccacca tcaccac 867 <210> 30 <211> 286 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Target substance and coiled coil forming domain <400> 30 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Val Ile His Val Thr Lys Glu Val 20 25 30 Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu 35 40 45 Leu Ala Gln 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aacataagga cgataatcca aatctccccc gcctggtccg cccggaagtc 360 gatgtcatgt gtacagcatt ccatgataat gaagaaacct ttctgaaaaa gtatttgtat 420 gaaatagcca gaaggcaccc gtacttttac gccccagaac tgctgttttt tgcgaagagg 480 tacaaggccg cgtttaccga gtgctgtcag gccgcggaca aagcggcctg cctgctccct 540 aaattggacg agttgaggga tgaagggaag gcttcttctg ctaaacagcg cctcaagtgc 600 gcgtctttgc agaagttcgg agagagagcc tttaaagcat gggctgttgc tcgcctgtca 660 cagaggtttc caaaagcaga gtttgctgaa gtcagcaaac tggtcacaga ccttaccaaa 720 gtacatacgg aatgctgtca tggtgatctt ttggaatgcg cagatgaccg agccgacctt 780 gcgaagtata tctgtgaaaa tcaggacagt atttcctcaa aattgaagga gtgttgcgag 840 aaaccacttc tcgagaagag tcactgcatc gcagaagttg agaatgacga gatgccggcg 900 gacttgccta gcctggctgc tgattttgtt gaaagtaagg acgtgtgcaa gaactacgct 960 gaagctaaag acgtctttct tgggatgttc ctgtatgagt acgcacgaag acatcctgat 1020 tactccgttg tactgttgct tagactggca aaaacgtatg agaccacctt ggagaaatgt 1080 tgtgcggcgg cagaccccca tgaatgttac gccaaagtat tcgacgagtt taagcccctt 1140 gtagaagagc ctcagaacct 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COILED COIL FORMING DOMAIN_CC_ <400> 48 Cys Pro Glu Glu Arg Glu Arg Met Ile Lys Gln Leu Lys Glu Glu Leu 1 5 10 15 Arg Leu Glu Glu Ala Lys Leu Val Leu Leu Lys Lys Leu Arg Gln Ser 20 25 30 Gln Ile Gln Lys Glu Ala Thr Ala Gln Lys Cys 35 40 <210> 49 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> COILED COIL FORMING DOMAIN_DC_ <400> 49 Cys Lys Ile Ala Ala Leu Lys Glu Lys Ile Ala Ala Leu Lys Glu Lys 1 5 10 15 Asn Ala Ala Leu Lys Trp Lys Ile Ala Ala Leu Lys Glu Cys 20 25 30 <210> 50 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> COILED COIL FORMING DOMAIN_KC_ <400> 50 Cys Gly Leu Lys Gln Lys Ile Ala Ala Leu Lys Tyr Lys Asn Ala Ala 1 5 10 15 Leu Lys Lys Lys Ile Ala Ala Leu Lys Gln Gly Gly Cys 20 25 <210> 51 <211> 84 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1-CC_ <400> 51 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Cys Pro Glu 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tgaaatagcc agaaggcacc cgtactttta cgccccagaa 660 ctgctgtttt ttgcgaagag gtacaaggcc gcgtttaccg agtgctgtca ggccgcggac 720 aaagcggcct gcctgctccc taaattggac gagttgaggg atgaagggaa ggcttcttct 780 gctaaacagc gcctcaagtg cgcgtctttg cagaagttcg gagagagagc ctttaaagca 840 tgggctgttg ctcgcctgtc acagaggttt ccaaaagcag agtttgctga agtcagcaaa 900 ctggtcacag accttaccaa agtacatacg gaatgctgtc atggtgatct tttggaatgc 960 gcagatgacc gagccgacct tgcgaagtat atctgtgaaa atcaggacag tatttcctca 1020 aaattgaagg agtgttgcga gaaaccactt ctcgagaaga gtcactgcat cgcagaagtt 1080 gagaatgacg agatgccggc ggacttgcct agcctggctg ctgattttgt tgaaagtaag 1140 gacgtgtgca agaactacgc tgaagctaaa gacgtctttc ttgggatgtt cctgtatgag 1200 tacgcacgaa gacatcctga ttactccgtt gtactgttgc ttagactggc aaaaacgtat 1260 gagaccacct tggagaaatg ttgtgcggcg gcagaccccc atgaatgtta cgccaaagta 1320 ttcgacgagt ttaagcccct tgtagaagag cctcagaacc tgataaagca aaactgtgag 1380 cttttcgagc agctggggga atataaattc caaaacgctc ttctcgtgcg ctacactaag 1440 aaagttccgc aggtttccac ccccaccctt 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attattgcaa tggtggcggt ggtagcggtg gggggggttc tgggggagga 300 ggatctgatg cacacaaaag tgaagttgcg caccgcttta aagacctggg agaagagaac 360 tttaaggcgc tcgttttgat agcgttcgcg caatatcttc agcaatgtcc ctttgaagac 420 cacgtgaagc tcgtcaacga ggtgaccgag ttcgcaaaga catgtgtcgc agacgaatcc 480 gcggagaact gtgacaaatc attgcatact ctttttggcg acaaactctg tacagtggca 540 actttgcgcg aaacttacgg agaaatggct gactgttgtg ctaagcagga accagagcgc 600 aacgaatgct ttttgcaaca caaggatgat aatcccaacc tcccgaggct cgtaagaccc 660 gaagtggacg tcatgtgcac ggcgtttcac gacaatgagg agaccttttt gaaaaagtat 720 ttgtatgaga tagcacgaag gcatccatac ttttacgcac ccgagctgct ctttttcgct 780 aaacggtata aggccgcgtt taccgagtgt tgtcaggcag ccgacaaagc ggcttgtctc 840 cttcctaagc tcgacgagct gagagacgaa gggaaggcaa gtagcgccaa gcagcgcctt 900 aagtgcgctt cattgcaaaa gtttggggaa agggccttta aagcttgggc tgtggcacgc 960 ttgtcacaaa ggttccctaa agcggagttc gctgaagtaa gtaagttggt aacagatctt 1020 accaaagttc atactgaatg ctgtcatgga gatctgctcg aatgcgctga cgaccgggcc 1080 gatttggcta agtacatttg cgaaaatcaa gatagtattt catcaaaact gaaagaatgt 1140 tgcgagaagc cactcctcga gaaatctcac tgcatagcgg aagtggaaaa cgacgaaatg 1200 cctgctgacc ttccgagctt ggcagctgac ttcgtcgaaa gtaaagatgt ctgtaaaaat 1260 tatgctgagg caaaggatgt atttttgggc atgtttctct acgagtatgc caggcgacac 1320 ccagattata gcgtagttct cctgttgcgg ctggctaaga cttacgaaac gactttggag 1380 aagtgttgcg ccgcagctga ccctcatgag tgttatgcca aagtcttcga tgagtttaaa 1440 cctcttgtgg aggaaccaca gaatcttatt aagcagaatt gtgagctttt tgagcaattg 1500 ggggagtaca aatttcagaa cgcgctgctg gtgcggtaca cgaaaaaggt tccgcaggtg 1560 tcaaccccta cccttgtgga ggtctctcgg aatctcggga aagtaggatc caaatgctgt 1620 aagcatccgg aagctaaacg gatgccctgt gccgaagact atctttcagt tgtcttgaat 1680 cagctttgcg ttttgcatga aaagacccct gtaagcgatc gcgttaccaa gtgttgtaca 1740 gaatccctgg taaaccgacg gccgtgtttc tcagcccttg aagtcgacga aacctacgtt 1800 ccaaaggaat ttaatgccga gacatttacg ttccatgcag acatatgtac gctctccgaa 1860 aaggagagac aaattaaaaa gcaaaccgct ttggtggaac tggtaaagca taagccgaag 1920 gcgaccaagg agcaactgaa ggcggttatg gatgactttg ctgcatttgt ggaaaagtgt 1980 tgtaaggccg atgacaagga aacatgcttt gctgaagagg gcaaaaagct tgtagctgct 2040 tctcaggccg cattgggact cggaggggga ggctcaggtg gcggaggtag tggaggtgga 2100 ggcagtcatg gcgagggcac ttttacttct gatgtgtcta gttacttgga agggcaggcg 2160 gcgaaggaat ttattgcatg gctcgtaaaa ggccgccacc accaccatca ccatcatcat 2220 2220 <210> 57 <211> 740 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulin_HSA_GLP-1 <400> 57 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Gln Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gln 50 55 60 Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 85 90 95 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg 100 105 110 Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala 115 120 125 Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu 130 135 140 Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser 145 150 155 160 Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu 165 170 175 Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys 180 185 190 Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys 195 200 205 Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val 210 215 220 Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr 225 230 235 240 Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu 245 250 255 Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln 260 265 270 Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg 275 280 285 Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser 290 295 300 Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg 305 310 315 320 Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu 325 330 335 Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu 340 345 350 Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu 355 360 365 Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro 370 375 380 Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met 385 390 395 400 Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp 405 410 415 Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe 420 425 430 Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu 435 440 445 Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala 450 455 460 Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys 465 470 475 480 Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu 485 490 495 Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg 500 505 510 Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val 515 520 525 Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu 530 535 540 Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn 545 550 555 560 Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr 565 570 575 Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala 580 585 590 Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr 595 600 605 Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln 610 615 620 Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys 625 630 635 640 Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe 645 650 655 Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu 660 665 670 Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly 675 680 685 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Gly 690 695 700 Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala 705 710 715 720 Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg His His His His 725 730 735 His His His His 740

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  14. 알부민 또는 이의 유사체, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질; 제1 표적 결합 물질 및 제1' 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 제1 융합체; 및 제2 표적 결합 물질 및 제2' 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 제2 융합체;를 포함하고, 상기 제1 및 제2 융합체는 각각 상기 융합단백질에 결합된 것이고,
    상기 제1 융합체 및 제2 융합체는 각각 서열번호 21, 22, 25, 26, 28, 30, 38 및 51로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 제1 및 제2 코일드코일 형성 도메인은 각각 서열번호 4, 5, 6, 16, 17 및 18로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며,
    알부민의 유사체는 알부민과 최소 80%의 상동성을 갖는 것인, 이중 표적 결합체.
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  16. 제14항에 있어서, 상기 제1 및 제2 코일드코일 형성 도메인은 상호간 결합을 통해 코일드코일을 형성할 수 없고, 상기 제1' 및 제2' 코일드코일 형성 도메인은 상호간 결합을 통해 코일드코일을 형성할 수 없는 것인, 이중 표적 결합체.
  17. 제14항에 있어서, 상기 제1, 제2, 제1' 및 제2' 코일드코일 형성 도메인은 아미노산 서열에 있어서 서로 상이한 것인, 이중 표적 결합체.
  18. 삭제
  19. 제14항에 있어서, 상기 제1 및 제1' 코일드코일 형성 도메인은 결합하여, 제1 코일드코일을 형성하고, 상기 제2 및 제2' 코일드코일 형성 도메인은 결합하여, 제2 코일드코일을 형성하는 것인, 이중 표적 결합체.
  20. 제19항에 있어서, 상기 제1 및 제2 코일드코일은, 각각
    a) 해리상수 (Kd)가 10 nM 이하이고,
    b) 헤테로다이머 형태의 코일드코일 형성 도메인을 포함하는 것인, 이중 표적 결합체.
  21. 제19항에 있어서, 상기 결합은 자가결합인 것인, 이중 표적 결합체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 자가결합은 비공유결합인 것인, 이중 표적 결합체.
  23. 제19항에 있어서, 상기 결합은 이황화결합을 더 포함하고, 상기 이황화결합은 상기 코일드코일 형성 도메인의 양 말단 중 적어도 어느 하나 이상에서 하나 이상 형성되는 것인, 이중 표적 결합체.
  24. 제14항에 있어서, 상기 제1 및 제2 표적 결합 물질은 서로 상이한 것인, 이중 표적 결합체.
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  29. 제14항에 있어서, 상기 제1 융합체 및 제2 융합체는, 표적 결합 물질; 및 코일드코일 형성 도메인; 사이에 링커를 더 포함하는 것인, 이중 표적 결합체.
  30. 삭제
  31. 제14항에 있어서, 상기 이중 표적 결합체는 상기 융합단백질, 제1 융합체 및 제2 융합체의 결합이 in vitro 상에서 형성되는 것인, 이중 표적 결합체.
  32. 삭제
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  35. in vitro 상에서 알부민 또는 이의 유사체, 제1 코일드코일 형성 도메인 및 제2 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 융합단백질; 제1 표적 결합 물질 및 제1' 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 제1 융합체; 및 제2 표적 결합 물질 및 제2' 코일드코일 형성 도메인이 연결된, 제2 융합체;의 혼합물을 제조하는 단계를 포함하는, 이중 표적 결합체의 제조방법으로서,
    상기 제1 융합체 및 제2 융합체는 각각 서열번호 21, 22, 25, 26, 28, 30, 38 및 51로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 제1 및 제2 코일드코일 형성 도메인은 각각 서열번호 4, 5, 6, 16, 17 및 18로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며,
    알부민의 유사체는 알부민과 최소 80%의 상동성을 갖는 것인, 이중 표적 결합체의 제조방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 혼합물로부터 이중 표적 결합체를 회수하는 단계를 더 포함하는, 이중 표적 결합체의 제조방법.











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