BR112015013387B1

BR112015013387B1 - Proteínas tipo coiled-coil modificadas possuindo propriedades melhoradas

Info

Publication number: BR112015013387B1
Application number: BR112015013387-8A
Authority: BR
Inventors: Judith DEL CAMPO ASCARATEIL; Imene TURKI HANI; Fergal Hill
Original assignee: Osivax Sas
Priority date: 2012-12-11
Filing date: 2013-12-11
Publication date: 2022-12-20
Also published as: CN104981541A; AU2013357367A1; KR102237130B1; EP2931896A1; JP6518193B2; RU2677799C2; AU2013357367B2; EP2931896B1; MX363443B; BR112015013387B8; US20150093406A1; KR20150094697A; BR112015013387A2; WO2014090905A1; CN104981541B; MX2015007421A; JP2016501266A; US9388225B2; RU2015126105A; CA2893120A1

Abstract

PROTEÍNAS TIPO ESPIRAL ENROLADA MODIFICADAS POSSUINDO PROPRIEDADES MELHORADAS. O presente pedido de patente está relacionado com uma proteína modificada, que compreende uma proteína possuindo um domínio de espiral enrolada e um peptídeo possuindo a sequência tal como apresentada em SEQ ID NO 1: ZXBBBBZ que está ligado ao domínio de espiral enrolada em que: ? Z é qualquer aminoácido ou está ausente; ? X é qualquer aminoácido; ? B é uma arginina (R) ou uma lisina (K). A referida proteína modificada é, em particular, um antígeno ou uma proteína transportadora associada a um antígeno. Esta proteína modificada tem uma maior afinidade para os polímeros carregados negativamente, tais como ácidos nucleicos ou a heparina, e mostra uma imunogenicidade aumentada.

Description

[001] A presente invenção está relacionada a antígenos recombinantes contendo os domínios coiled-coil ou a antígenos de proteínas fundidas contendo espirais enroladas, em que as espirais enroladas são modificadas. A modificação melhora a imunogenicidade dos referidos antígenos. Ao mesmo tempo, melhora a sua capacidade de se ligar a polímeros carregados negativamente, tais como ácidos nucleicos, incluindo DNA e RNA, e à heparina.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Uma coiled-coil é um motivo estrutural em proteínas, em que alfa-hélices são enroladas em conjunto como os fios de uma corda. Domínios coiled-coil são abundantes em proteínas naturais (1, 2), e podem ser o método mais comum na natureza de oligomerizar as proteínas. Espirais enroladas consistem em duas ou mais hélices alfa enroladas em torno de si em uma super espiral, uma dobra de proteínas versátil, contudo simples (3). Uma sequência típica primária de coiled-coil é repetitiva, feita de repetições de sete resíduos chamadas de “heptad”.

[003] Muitas proteínas do tipo coiled-coil estão envolvidas em funções biológicas importantes. De particular interesse aqui, são as encontradas em antígenos ou proteínas transportadoras.

[004] Exemplos de espirais enroladas encontradas em antígenos incluem, mas não estão limitados a: i) as espirais enroladas diméricas encontradas na família OCA (onde OCA significa a adesão em coiled-coil oligomérica): exemplos são NadA, um antígeno protetor de Neisseria meningitidis (4); Yada de Yersinia enterocolitica (5); UspA2 de Moraxella catarrhalis (6); BadA de Bartonella henselae (7) e Hada de Haemophilus influenzae (8). ii) as espirais enroladas triméricas encontradas em, dentre outros, a proteína da hemaglutinina da influenza HA2 (9), a glicoproteína F do vírus sincicial respiratório (10), as glicoproteínas gp41 de HIV-1 (11) e do HIV-2 (12), e gp1,2 do vírus Ebola (13). iii) as espirais enroladas tetraméricas encontradas na glicoproteína HN da doença de Newcastle (hemaglutinina- neuraminidase) e outros paramixovírus (14, e referências aí contidas).

[005] Proteínas transportadoras são, nomeadamente, utilizadas para melhorar a imunogenicidade de antígenos. Proteínas transportadoras contendo espirais enroladas foram descritas anteriormente, nomeadamente um derivado pentamérico de COMP (15) e uma sequência artificial que também forma pentâmeros (34), e heptâmeros derivados de domínios de oligomerização de mamíferos C4BP, tais como o domínio murino IMX108 (16), ou domínios de oligomerização aviários C4bp (16, WO 2005/077976 e WO 2007/062819). Um domínio de oligomerização aviária híbrido chamado IMX313 (documento WO 2007/062819) é usado aqui como um exemplo.

ESTADO DA TÉCNICA

[006] No estado da técnica, espirais enroladas têm sido objeto de extensas pesquisas para compreender o que determina os seus estados de oligomerização e a orientação relevante (paralela ou anti-paralela) das suas hélices (35). No entanto, estudos para melhorar a imunogenicidade de antígenos, modificando as suas espirais enroladas têm faltado. Dois exemplos notáveis no estado da técnica dizem respeito aos grupos associados dentro da indústria de vacina necessários para purificar dois antígenos separados contendo espirais enroladas visando a vacinação (10, 36, 37); nenhum dos grupos modificou as espirais enroladas no antígeno.

[007] No estado da técnica, alguns peptídeos específicos têm sido mostrados para melhorar as propriedades de ligação de proteínas monoméricas, que carecem de espirais enroladas. Demonstrou-se que, quando uma cauda de poliarginina é fundida com proteínas recombinantes, elas são mais fáceis de purificar por cromatografia de troca iônica (17, 18). Em utilizações anteriores, as argininas adicionais foram removidas após purificação por meios enzimáticos (17, 18) ou, em alternativa, deixadas no lugar e utilizadas para imobilização de enzimas e/ou o re-enrolamento (19, 20). Um peptídeo tão curto quanto seis argininas consecutivas foi utilizado para imobilizar uma enzima monomérica sobre uma coluna de heparina-sepharose, prevenindo a agregação de monômeros por ligação da matriz e permitindo a reutilização da enzima (19, 20). Fuchs e Raines demonstraram que uma marcação de poliarginina de nove aminoácidos pode ser utilizada para imobilizar uma enzima monomérica (RNase A) sobre uma variedade de suportes, tais como vidro e resina de sílica (22).

[008] Outros peptídeos de ligação de ácidos nucleicos têm sido descritos, tal como o motivo SPKK, o qual foi identificado na década de 1980 como um motivo de ligação ao DNA, e peptídeos contendo o motivo SPKK podem ligar o DNA de cadeia dupla (21). No entanto, a ligação ao RNA ou ao DNA de cadeia simples não foi demonstrada, e os dados de Suzuki sugerem fortemente que a ligação ao DNA de cadeia simples não iria ocorrer, já que o sulco menor só existe em moléculas de dupla hélice.

[009] Outros peptídeos que foram mostrados para ligar o DNA incluem o domínio tipo protamina do antígeno do núcleo da hepatite B (38), que contém a sequência SPRRRRS de peptídeo, utilizado em alguns dos exemplos aqui apresentados.

[010] No entanto, as caudas de poliarginina são muito suscetíveis à clivagem por proteases, especialmente de serina-proteases, e foram substituídas em uso rotineiro por marcadores de poli-histidina, para ambos os fins de purificação e imobilização (45).

[011] Separadamente nos peptídeos do estado da técnica foram fundidas as proteínas monoméricas para melhorar a sua imunogenicidade. Shibagaki e colegas mostraram que os domínios de transdução de proteína (PTDs) podem ser utilizados para melhorar a transdução de células dendríticas (DC) in vitro, e que, quando as DCs transduzidas são re-injetadas nos animais, a imunogenicidade melhorada do antígeno é obtida (43). Além disso, Shimada e colegas demonstraram que os peptídeos de poliarginina podem melhorar a imunogenicidade de uma proteína, a ovalbumina, a qual se encontra fundida (42), ou quando injetados diretamente em um tumor que expressa a proteína, ou quando injetados por via intradérmica (41).

[012] A maioria dos antígenos purificados são fracamente imunogênicos. Os adjuvantes têm sido utilizados para aumentar a sua imunogenicidade. A utilização de um pequeno domínio, que contém uma coiled-coil, de proteínas C4bp para aumentar a imunogenicidade de antígenos foi demonstrada anteriormente: • WO 2007/062819 descreve complexos compreendendo como primeiro componente um domínio C4bp aviário e como segundo componente um antígeno, os referidos componentes sendo na forma de uma proteína de fusão ou sendo associados de forma não covalente. Este complexo mostra um aumento da imunogenicidade do antígeno quando administrado a um organismo. • WO 2011/045612 descreve uma proteína de fusão contendo um fragmento de proteína C4bp aviária, e o antígeno micobacteriano 85A. A referida proteína híbrida melhora a imunogenicidade de 85A, não só em animais, tais como roedores, mas também em primatas.

[013] Além disso, melhorar os métodos de imunização também é de grande importância para induzir a sinalização através de receptores TLR, mas é pelo menos tão importante ser capaz de limitar esta sinalização. Receptores do tipo Toll (TLRs) são uma classe de proteínas que desempenham um papel chave no sistema imune inato. Uma vez que os micróbios tiverem violado as barreiras físicas de organismos, eles são reconhecidos por TLRs. As características reconhecidas de micróbios incluem RNA de dupla cadeia de vírus, sítios de cpG não-metilados de DNA bacteriano e viral, e certas outras moléculas de RNA e DNA.

[014] Existe um interesse substancial em tais ácidos nucleicos, uma vez que eles são ligantes para uma classe de receptores tipo Toll (TLRs daqui em diante), e nomeadamente para TLR3, TLR7, TLR8, TLR9 e TLR13(23 e referências nele contidas). Estes são algumas vezes classificados como os “receptores do tipo Toll intracelulares”, mas, pelo menos, TLR3 também está presente em algumas superfícies celulares (24). TLR7 e TLR9 estão localizados em compartimentos intracelulares (nomeadamente o retículo endoplasmático e endossomos), e foi demonstrado claramente para TLR9 e TLR7 que a clivagem do receptor é necessária para a ativação de MyD88, através do qual um sinal de ligantes dos receptores (25, 26). Como esta clivagem ocorre apenas em endolisossomos, é possivelmente uma adaptação evolucionária para evitar a sinalização inadequada a partir de ácidos auto-nucleicos.

[015] TLR3 é expresso por uma variedade de células epiteliais das vias aéreas, incluindo, uterina, da córnea, vaginal, cervical, biliar e das células epiteliais intestinais, e estas células parecem expressar TLR3 sobre as suas superfícies celulares (24). É, talvez, não surpreendente, portanto, que a administração de poli I:C tem sido associada a um número de efeitos adversos (26). Nesse estudo, a administração repetida em doses de 3 miligramas por grama foi usada. Se o camundongo médio pesa cerca de 35 g, uma dose de 100 mg administrada repetidamente pode induzir esses efeitos. Foi apenas necessário 2,5μg de poli I:C por dose nas imunizações descritas aqui.

[016] A importância de limitar a sinalização através destes receptores e, nomeadamente, o receptor TLR3, é dose-dependente. Uma vantagem da ligação de ligantes nucleicos firmemente ao antígeno é, portanto essencial. Os ligantes TLR fortemente intracelulares são, portanto, altamente preferidos sobre formulações em que a ligação é menos firme. Portanto, o técnico especialista no assunto está à procura de composições antigênicas capazes de se ligarem de forma eficiente aos ligantes de TLR, de modo que eles não são separados do antígeno antes do antígeno chegar às células, onde desencadeará uma resposta imunitária com o objetivo de diminuir potenciais efeitos adversos mediados pela ligação dos ligantes aos receptores TLR em qualquer outro local.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[017] A invenção está relacionada com proteínas compreendendo os domínios coiled-coil que são modificados pela ligação de um peptídeo carregado positivamente para o domínio coiled-coil. As proteínas modificadas do tipo coiled-coil melhoraram a imunogenicidade e, simultaneamente, melhoram as propriedades de ligação de polímeros carregados negativamente, tais como a heparina e os ácidos nucleicos. Todas as proteínas de coiled-coil são recombinantes, e a modificação é obtida através da fusão de sequências peptídicas curtas para os terminais das espirais enroladas. Nos exemplos do presente documento, a modificação é realizada por técnicas de engenharia genética, mas existem outros métodos de obtenção das espirais enroladas modificadas, tais como a síntese de peptídeos.

[018] Este peptídeo carregado positivamente compreende preferencialmente argininas, mas também pode compreender, em vez disso lisinas, ou uma combinação de ambas. Este peptídeo é curto, compreendendo sete aminoácidos ou menos, em particular 5, 6 ou 7 aminoácidos. Um ou mais peptídeos podem ser utilizados para cada cadeia da coiled-coil.

[019] A ligação é feita diretamente para o domínio coiled-coil ou através de um peptídeo ligante que compreende um ou mais aminoácidos que não afetam os efeitos técnicos do domínio coiled-coil, o peptídeo carregado positivamente e a sua combinação. Os ligantes podem conter quaisquer aminoácidos, mas ligantes preferidos contêm glicina, serina ou prolina, ou suas combinações.

[020] Em uma série de exemplos, a proteína modificada é a proteína transportadora IMX313, derivada das proteínas C4BP de frango.

[021] A invenção também está relacionada com uma proteína de fusão compreendendo uma proteína transportadora de coiled-coil modificada fundida com um antígeno.

[022] A invenção também está relacionada com um antígeno modificado que compreende um domínio coiled-coil modificado.

[023] A invenção também está relacionada com uma composição imunogênica que compreende a proteína de fusão modificada ou um antígeno modificado, e ligantes de ácidos nucleicos para TLRs intracelulares.

[024] A invenção também está relacionada com um suporte levando a proteína modificada da invenção, a ligação para o suporte sendo formada através do peptídeo ligado ao domínio coiled-coil. O suporte de heparina pode ser utilizado in vitro ou in vivo. Métodos para a utilização de heparina para melhorar a imunogenicidade de proteínas carregadas positivamente são bem conhecidos (47, e referências aí contidas).

[025] O presente pedido de patente também está relacionado com a utilização de um antígeno modificado ou de uma proteína de fusão modificada ou uma composição imunogênica como descrita acima, para induzir uma resposta imune em um paciente.

[026] Uma proteína do tipo coiled-coil modificada de acordo com o presente pedido, em que o peptídeo carregado positivamente está ligado ao domínio coiled-coil da proteína modificada, apresenta vantagens em comparação com a proteína não modificada correspondente, e nomeadamente: - uma melhor ligação a colunas de cromatografia de carga negativa, tais como o a coluna de troca de íons catiônica SP FF, e especialmente para colunas de Heparina- Sepharose; - uma melhor ligação aos ácidos nucleicos; - no caso de proteínas de transporte e de antígenos, um aumento da imunogenicidade dos antígenos que são estas proteínas do tipo coiled-coil modificadas, ou de antígenos associados com as referidas proteínas transportadoras modificadas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[027] Antes de descrever a presente invenção em detalhes, é para ser entendido que esta invenção não está limitada a métodos particularmente exemplificados e pode, é claro, variar. Em particular, a presente invenção está relacionada a antígenos modificados possuindo domínios em coiled-coil, e não se limitando a proteínas transportadoras específicas ou aos antígenos específicos contendo espirais enroladas.

[028] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados, ou supra ou infra, são aqui incorporados por referência na sua totalidade. No entanto, as publicações aqui mencionadas são citadas para a finalidade de descrever e revelar os protocolos, reagentes e vetores que são relatados nas publicações e que podem ser utilizados em ligação com a invenção.

[029] Além disso, a prática da presente invenção emprega, a menos que indicado ao contrário, técnicas de biologia molecular e de purificação de proteínas convencionais dentro da especialidade da técnica. Tais técnicas são bem conhecidas do especialista, e estão completamente explicadas na literatura. Nas reivindicações que se seguem e na descrição consecutiva da invenção, exceto quando o contexto exija de outra forma devido à linguagem expressa ou implicação necessária, as palavras “compreendem”, “contém”, “envolver” ou “incluir”, ou variações tais como “compreende”, “compreendendo”, “contendo”, “envolveu”, “incluiu”, “incluindo” são utilizadas em um sentido inclusivo, isto é, para especificar a presença de características indicadas, mas não impedem a presença ou a adição de outras características em várias modalidades da invenção.

[030] Os termos seguintes são definidos para uma melhor compreensão da invenção:

[031] Uma “proteína tipo coiled-coil”, também referida como “proteína contendo coiled-coil” ou “proteína possuindo um domínio coiled-coil” designa uma proteína que compreende um motivo de coiled-coil, ou seja, pelo menos, duas cadeias alfa-helicoidal de enrolamento em torno de si em uma super espiral. Várias proteínas contendo tais espirais enroladas foram relatadas na literatura. De acordo com a invenção, as proteínas do tipo em coiled-coil preferidas são antígenos e proteínas de transporte.

[032] Uma “proteína transportadora” designa geralmente uma proteína a que os antígenos estão conjugados ou fundidos e, assim, os antígenos são processados mais imunogênicos. Aqui, o termo é usado especificamente no sentido de uma proteína que transporta um antígeno. A função da proteína é a de aumentar a imunogenicidade do referido antígeno para o qual é conjugada ou fundida. A fusão tem a vantagem de criar um produto homogêneo. Mais formalmente, a “conjugação” pode ser descrita como genética: o DNA que codifica o marcador pró-imunogênico ou proteína transportadora é unido ao DNA que codifica o antígeno. Com os métodos tradicionais de conjugação química, não é sempre capaz de controlar com precisão as posições em que o antígeno é unido à proteína. Nesta forma, esta subclasse de proteínas transportadoras também é chamada de “marcadores pró-imunogênicos” ou até mesmo “adjuvante” (16) ou “adjuvantes genéticos”.

[033] De acordo com a invenção, uma “proteína modificada” designa uma proteína que possui uma sequência modificada em comparação com a sequência de tipo selvagem, com a adição ou a substituição parcial de um peptídeo carregado positivamente de acordo com a invenção. A diferença entre a proteína não modificada e a proteína modificada da invenção situa-se no peptídeo carregado positivamente ligado ao domínio coiled-coil, adicionado ou parcialmente substituído. É compreendido pelo técnico especialista no assunto que a proteína modificada da invenção é uma proteína recombinante, ou uma quimera não encontrada na natureza. Proteínas naturais que compreendem um domínio coiled-coil e um domínio de peptídeo carregado modificado noutro local, mas não no domínio de peptídeo carregado, não fazem parte da presente invenção.

[034] A invenção está relacionada com uma proteína modificada compreendendo (i) uma proteína possuindo um domínio coiled-coil e (ii) pelo menos um peptídeo carregado positivamente ligado ao domínio coiled-coil, o peptídeo carregado positivamente possuindo a sequência ZXBBBBZ (SEQ ID NO 1), em que: - Z é qualquer aminoácido ou está ausente; - X é qualquer aminoácido; - B é uma arginina (R) ou uma lisina (K).

[035] O último aminoácido do peptídeo pode ser nem um resíduo de arginina nem um de lisina, quando é desejado proteger o peptídeo contra a destruição por exoproteases, tais como carboxipeptidase B.

[036] Quando a proteína modificada da invenção compreende mais do que um peptídeo carregado positivamente da SEQ ID NO1, os peptídeos são preferivelmente fundidos em conjunto para formar um único peptídeo carregado positivamente sendo uma repetição da SEQ ID NO1 da fórmula (ZXBBBBZ)n, em que n é um número inteiro de 1 ou mais, até, pelo menos, 6, em particular 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, de preferência 2.

[037] Em outra modalidade, os dois, três, quatro, cinco ou seis peptídeos podem ser separados por um ou mais ligantes, tal como definido abaixo.

[038] Em uma modalidade preferida da invenção, o peptídeo possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências SPRRRRS (SEQ ID NO 2), GRRRR (SEQ ID NO 3), SPKKKK (SEQ ID NO 4), GKKKK (SEQ ID NO 5) e GRRRRRS (SEQ ID NO 36) especialmente para espirais enroladas heptaméricas. Particularmente para espirais enroladas triméricas, uma fusão de dois peptídeos carregados positivamente é preferida, mais preferencialmente com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências SPRRRRRRRRRS (SEQ ID NO 37), uma combinação de um primeiro peptídeo SPRRRR (ID SEQ NO 38) com um segundo peptídeo RRRRRS (ID SEQ NO 39) e GRRRRRRRRRRS (SEQ ID NO 40), uma combinação de um primeiro peptídeo GRRRRR (ID SEQ NO 41) com os peptídeos RRRRRS (ID SEQ NO 39).

[039] O peptídeo pode ser fundido com a coiled- coil na extremidade C-terminal, ou na N-terminal. A fusão do peptídeo para a proteína pode ser realizada com um ligante, uma sequência peptídica curta que liga o peptídeo e a proteína, ou sem. Os ligantes podem conter quaisquer aminoácidos, mas ligantes preferidos contêm glicina, serina ou prolina, ou suas combinações.

[040] Em uma modalidade particular, alguns aminoácidos do C-terminal da proteína podem ser eliminados e substituídos com uma ou mais cópias do peptídeo ZXBBBBZ.

[041] Em um aspecto preferido da invenção, o peptídeo é ligado à coiled-coil na sua extremidade C- terminal.

[042] Em um aspecto da invenção, a proteína modificada tem uma função da proteína transportadora, nomeadamente atua como uma transportadora para os antígenos.

[043] Em um aspecto preferido da invenção, a proteína modificada é a proteína de ligação C4 transportadora derivada do frango, compreendendo uma coiled-coil heptamérica, descrita no pedido de patente WO 2007/062819.

[044] Uma proteína específica modificada de acordo com a invenção é a proteína IMX313, em que o peptídeo GRRRR (ID SEQ NO 3) é ligado ao domínio coiled-coil de IMX313.

[045] Outra proteína específica modificada de acordo com a invenção é a proteína IMX313, em que o peptídeo SPKKKK (SEQ ID NO: 4) está ligado com o domínio coiled-coil de IMX313.

[046] Outra proteína específica modificada de acordo com a invenção é a proteína IMX313 em que o peptídeo GKKKK (SEQ ID NO 5) está ligado com o domínio coiled-coil de IMX313.

[047] Uma proteína específica preferida modificada de acordo com a invenção é a proteína IMX313 em que o peptídeo SPRRRRS (SEQ ID NO 2) é ligado ao domínio coiled- coil de IMX313.

[048] As sequências de aminoácidos de IMX313, IMX313T e IMX313P são mostradas abaixo (o * representa o códon de parada): IMX313 KKQGDADVCGEVAYIQSVVSDCHVPTAELRTLLEIRKLFLEIQKLKVELQGL SKE* (SEQ ID NO 6) IMX313T KKQGDADVCGEVAYIQSVVSDCHVPTAELRTLLEIRKLFLEIQKLKVELQSP RRRRS* (SEQ ID NO 7) IMX313P KKQGDADVCGEVAYIQSVVSDCHVPTAELRTLLEIRKLFLEIQKLKVEGRRR RRS* (SEQ ID NO 42).

[049] Em uma modalidade preferida, a proteína que possui a função de uma proteína transportadora é a IMX313P (SEQ ID NO 42). Uma proteína que compreende a sequência de IMX313P (SEQ ID NO 42) é também por si um objeto da presente invenção, sozinha ou fundida com um ou peptídeo carregado mais positivamente e um antígeno ou outra proteína.

[050] Em uma modalidade mais preferida, o domínio coiled-coil de IMX313P (SEQ ID NO 42) está ligado a uma fusão de dois peptídeos carregados positivamente de SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente, o peptídeo de sequência SPRRRRRRRRRS (SEQ ID NO 37), ou o peptídeo de sequência GRRRRRRRRRRS (SEQ ID NO 40).

[051] Em outro aspecto da invenção, a proteína modificada não é uma proteína transportadora, mas é um antígeno. O referido antígeno oligomérico é em particular selecionado a partir do grupo consistindo de: - proteína de hemaglutinina da influenza HA2, - a glicoproteína F do vírus sincicial respiratório, - a glicoproteína gp41 de HIV-1 - a glicoproteína gp41 de HIV-2, - gp1,2 de Ebolavirus, - NadA de Neisseria meningitidis, - Yada de Yersinia enterocolitica, - UspA2 de Moraxella catarrhalis, - BadA de Bartonella henselae e - Hada de Haemophilus influenza.

[052] A invenção também está relacionada com uma associação entre uma proteína transportadora modificada e um antígeno. Esta associação de uma proteína transportadora (IMX313) e um antígeno já foi mostrada para aumentar a imunogenicidade do referido antígeno (ver pedido de patente WO 2007/062819). Com uma proteína transportadora modificada, o aumento de imunogenicidade é ainda melhor do que com a proteína IMX313 não modificada.

[053] Em particular, a proteína transportadora modificada associada a um antígeno é IMX313P possuindo a sequência SEQ ID NO 42.

[054] Em uma alternativa, os dois componentes associados estão associados não covalentemente um com o outro. Em uma alternativa preferida, os dois componentes associados são acoplados quimicamente, e estão na forma de uma proteína de fusão. O técnico especialista no assunto sabe como ligar dois componentes peptídicos, com o objetivo de produzir uma proteína de fusão.

[055] A invenção está, em particular, relacionada com uma proteína de fusão compreendendo uma proteína transportadora com uma coiled-coil modificada e um ou mais antígenos.

[056] Em um aspecto preferido da invenção, um dos seguintes antígenos é fundido com a proteína IMX313T IMX313P modificada: i) a proteína Proteína A de Staphylococcus aureus, mutada, tal como descrito (27, 44), ou a proteína hemolisina alfa de Staphylococcus aureus, ou proteína ClfB de Staphylococcus aureus ou a proteína Sortase A de Staphylococcus aureus; ii) 85A, uma proteína secretada pela Mycobacterium tuberculosis (28); iii) os auto-antígeno GnRH; iv) o antígeno criptosporídico Cp15; v) a nucleoproteína da influenza.

[057] Uma proteína de fusão específica de acordo com a invenção é a proteína IMX313P (SEQ ID NO 42) em que o peptídeo GRRRRRS (SEQ ID NO 36) é ligado ao domínio coiled- coil de IMX313, e a proteína modificada é fundida com a proteína Proteína A de Staphylococcus aureus.

[058] Outra proteína de fusão específica de acordo com a invenção é a proteína IMX313P (SEQ ID NO 42) em que o peptídeo GRRRRRS (SEQ ID NO 36) é ligado ao domínio coiled- coil de IMX313, e a proteína modificada é fundida com a proteína 85A.

[059] Outra proteína de fusão específica de acordo com a invenção é a proteína IMX313 (SEQ ID NO 6), em que o peptídeo SPKKKK (SEQ ID NO: 4) está ligado com o domínio coiled-coil de IMX313, e a proteína modificada é fundida com a proteína Proteína A de Staphylococcus aureus.

[060] Outra proteína de fusão específica de acordo com a invenção é a proteína IMX313 (SEQ ID NO 6), em que o peptídeo SPKKKK (SEQ ID NO: 4) está ligado com o domínio coiled-coil de IMX313, e a proteína modificada é fundida com a proteína 85A.

[061] Outra proteína de fusão específica de acordo com a invenção é a proteína IMX313 (SEQ ID NO 6), em que o peptídeo GKKKK (SEQ ID NO 5) está ligado com o domínio coiled-coil de IMX313, e a proteína modificada é fundida com a proteína Proteína A de Staphylococcus aureus.

[062] Outra proteína de fusão específica de acordo com a invenção é a proteína IMX313 (SEQ ID NO 6), em que o peptídeo GKKKK (SEQ ID NO 5) está ligado com o domínio coiled-coil de IMX313, e a proteína modificada é fundida com a proteína 85A.

[063] Outra proteína de fusão específica de acordo com a invenção é a proteína IMX108T (SEQ ID NO 64), em que o peptídeo SPRRRRS (SEQ ID NO 2) é fundido ao domínio coiled-coil da proteína IMX108 (SEQ ID NO 63).

[064] Uma proteína específica preferida modificada de acordo com a invenção é a proteína IMX313 (SEQ ID NO 6), em que o peptídeo SPRRRRS (SEQ ID NO 2) está ligado com o domínio coiled-coil de IMX313, e a proteína modificada é fundida com a proteína Proteína A de Staphylococcus aureus.

[065] Uma outra proteína específica preferida modificada de acordo com a invenção é a proteína IMX313 (SEQ ID NO 6), em que o peptídeo SPRRRRS (SEQ ID NO 2) está ligado com o domínio coiled-coil de IMX313, e a proteína modificada é fundida com a proteína 85A.

[066] Como mostrado nos exemplos, estes dois antígenos modelos foram usados para demonstrar que a modificação de espirais enroladas melhoraram a sua imunogenicidade. Ambas as respostas das células B e T foram melhoradas. Além disso, as espirais enroladas modificadas foram mais imunogênicas quando administradas ou como proteínas ou como ácidos nucleicos.

[067] A invenção também está relacionada com uma composição imunogênica que compreende uma proteína modificada do tipo coiled-coil tal como descrita acima, ou uma proteína de fusão tal como descrita acima, e os ligantes de ácidos nucleicos para TLRs intracelulares. Estes ligantes de ácido nucleico para TLRs são preferencialmente complexados com uma proteína transportadora modificada. Com vantagem, os ligantes de ácidos nucleicos são ligados à proteína modificada, embora a proteína transportadora não modificada correspondente foi incapaz de ligar significativamente estes ligantes de ácidos nucleicos para TLRs.

[068] A invenção também está relacionada com uma composição imunogênica que compreende uma proteína modificada do tipo coiled-coil tal como descrita acima, ou uma proteína de fusão tal como descrita acima, e heparina. A heparina é preferencialmente complexada com uma proteína transportadora modificada. De um modo vantajoso, a heparina está ligada à proteína modificada, embora a proteína transportadora não modificada correspondente fosse incapaz de se ligar de forma significativa para a heparina.

[069] A invenção também está relacionada com um suporte sólido transportando uma proteína modificada, em que a referida proteína é ligada ao suporte com o peptídeo ZXBBBBZ. Com efeito, a abundância de cargas em que o peptídeo é suficiente para ligar fortemente a proteína modificada à superfície.

[070] A invenção também está relacionada com um método para aumentar as capacidades de ligação a um suporte de uma proteína compreendendo um domínio coiled-coil, que compreende a ligação de pelo menos um peptídeo ZXBBBBZ ao domínio coiled-coil, em que: - Z é qualquer aminoácido ou está ausente, - X é qualquer aminoácido; - B é uma arginina (R) ou uma lisina (K).

[071] Em particular, o suporte é uma coluna de cromatografia. Todas as proteínas modificadas solúveis de espirais enroladas podem ser ligadas a essas colunas, utilizando o peptídeo carregado positivamente como um marcador de afinidade. O operador pode modificar o número de resíduos de arginina no peptídeo de sequência ZXBBBBZ geral para reforçar ou diminuir a ligação. Em alternativa, o operador pode modificar o número de peptídeos da sequência geral ZXBBBBZ para fortalecer a ligação. Quanto menor o número de cadeias de proteínas no oligômero, maior o número de argininas no peptídeo ou peptídeos que devem ser usados. Assim, por exemplo, com uma coiled-coil trimérica, nove ou mais argininas por cadeia devem ser preferencialmente utilizadas para assegurar a purificação semelhante em heparina-sepharose.

[072] A invenção também está relacionada com um método para aumentar a imunogenicidade de uma proteína transportadora, ou de um antígeno compreendendo um domínio coiled-coil, que compreende a ligação de pelo menos um peptídeo ZXBBBBZ o domínio coiled-coil da referida proteína, em que: - Z é qualquer aminoácido ou está ausente, - X é qualquer aminoácido; - B é uma arginina (R) ou uma lisina (K).

[073] A invenção também está relacionada com um método para aumentar a imunogenicidade de um antígeno compreendendo: - preparar uma proteína transportadora modificada conforme o método tal como descrito acima; e - associar o referido antígeno à referida proteína transportadora modificada, e aos ligantes de ácidos nucleicos para TLRs intracelulares ou heparina.

[074] A invenção está, em particular, relacionada com um método para aumentar a imunogenicidade de Th1 de um antígeno, caracterizado por proporções muito elevadas de IgG2 para IgG1, tal como exemplificado abaixo, que compreende: - preparar uma proteína transportadora modificada conforme o método tal como descrito acima; e - associar o referido antígeno à referida proteína transportadora modificada, e aos ligantes de ácidos nucleicos para TLRs intracelulares ou heparina.

[075] A invenção também está relacionada com um antígeno modificado de acordo com a invenção, ou de uma proteína de fusão de acordo com a invenção, para o seu uso como uma vacina.

[076] O presente pedido também está relacionado com um método para induzir uma resposta imune em um paciente com necessidade, compreendendo a administração ao paciente de uma composição de vacina compreendendo uma proteína de fusão compreendendo uma proteína transportadora modificada e um antígeno.

[077] O presente pedido também está relacionado com um método para induzir uma resposta imune em um paciente com necessidade, compreendendo a administração ao paciente de uma composição de vacina compreendendo uma composição imunogênica compreendendo uma proteína modificada e ligantes de ácidos nucleicos para TLRs intracelulares ou heparina.

[078] A invenção também está relacionada com as moléculas de ácido nucleico que codificam as proteínas modificadas e proteínas de fusão tais como as descritas acima.

[079] Além disso, a presente invenção diz respeito a uma composição de vacina compreendendo pelo menos uma molécula de ácido nucleico tal como descrita acima. As composições de vacina que compreendem moléculas de ácidos nucleicos são bem conhecidas pelos técnicos especialistas no assunto, e são descritas em particular no pedido de patente WO2008/122817, aqui incorporado por referência.

[080] Tais ácidos nucleicos podem ser utilizados por si só, ou eles podem ser administrados em vetores virais que são também descritos no pedido de patente WO2008/122817. Alguns vetores virais foram modificados para produzir os ácidos nucleicos que poderiam, em seguida, se ligar aos antígenos modificados que são codificados em vetores virais. A modificação de vetores virais para a produção de ácidos nucleicos é descrita no documento WO2007/100908, aqui incorporado por referência.

[081] A presente invenção também está relacionada com um método para a purificação de uma proteína modificada do tipo coiled-coil tal como descrita acima, compreendendo as seguintes etapas sucessivas: - carregar uma coluna de cromatografia de heparina- sepharose com a proteína modificada, - e eluir a referida proteína com uma concentração de sal superior a 500 mM.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[082] Figura 1. Cromatogramaa de IMX313T purificada sobre uma coluna Hi Trap heparin HP. Uma coluna de Heparina-sepharose separa claramente os contaminantes (picos A e B) a partir da proteína IMX313T largamente pura (pico C). A linha pontilhada mostra a gradiente de sal para eluir a proteína modificada.

[083] Figura 2. Os ligantes TLR 9 e a proteína IMX497 (PAm-IMX313T) - eletroforese em gel de agarose (0,8% em tampão TAE). A posição no gel para a qual o oligonucleotídeo migrou é observável sob luz ultravioleta, quando o gel é corado com brometo de etídio.

[084] Figura 3. Os ligantes TLR7 e TLR3 e a proteína IMX497 (PAm-IMX313T) - eletroforese em gel de agarose (0,8% em tampão TAE).

[085] Figura 4. Ligantes TLR7 e as proteínas MX495 (PAm), IMX494 (PAm-IMX313) e IMX497 (PAm-IMX313T- eletroforese em gel de agarose (0,8% em tampão TAE).

[086] Figura 5. Grupos de camundongos fêmea BALB/C (n = 5) foram imunizados duas vezes por via subcutânea, com um intervalo de 14 dias, com PAm, PAm-IMX313, PAm-IMX313T ou PAm formuladas pela primeira vez em CFA e, em seguida, em IFA. Vinte e oito dias após a primeira imunização, os títulos de IgG específicos de PAm em soros foram determinados utilizando um teste de ELISA, em que as placas foram revestidas com PAm. Os resultados são expressos como a DO das amostras medida a 405 nm + SEM. As diferenças significativas entre as médias dos diferentes grupos foram determinadas por ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. Um valor-p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo, e é representado por * diferente, ao passo que *** representa p <0,001 e ** representa p <0,01.

[087] Figura 6. Os níveis de expressão de IFN-Y em populações de células T totais. Respostas imunes mediadas por células específicas 85A em camundongos imunizados por via intramuscular. Grupos de camundongos fêmeas BALB/c (n = 5) imunizados duas vezes, com 14 dias de intervalo, com plasmídeos expressando: 85A, 85A-IR14, 85A-TL18, 85A-IMX313 ou 85A-IMX313T. Duas semanas após a última imunização, os camundongos foram sacrificados e as células T do baço foram purificadas. As células foram co-cultivadas com a proteína recombinante 85A. As diferenças significativas entre as médias dos diferentes grupos foi determinada por ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. Um valor-p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Respostas de IFN-y nos sobrenadantes de co- cultura são expressas como células que segregam IFN- Y/milhão de células.

[088] Figura 7. Os níveis de expressão de IFN-y em populações de células T CD8+. Respostas imunes mediadas por células específicas 85A em camundongos imunizados por via intramuscular. Grupos de camundongos fêmeas BALB/c (n = 5) imunizados duas vezes, com 14 dias de intervalo, com plasmídeos expressando: 85A, 85A-IR14, 85A-TL18, 85A- IMX313, ou 85A-IMX313T. Duas semanas após a última imunização, os camundongos foram sacrificados e as células T CD8+ esplênicas purificadas. As células foram co- cultivadas com o peptídeo 85A p11. As diferenças significativas entre as médias dos diferentes grupos foram determinadas por ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. Um valor-p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Respostas de IFN-Y nos sobrenadantes de co-cultura foram expressas como células que segregam IFN-y/milhão de células.

[089] Figura 8. Os níveis de expressão de IFN-Y em populações de células T CD4+. Respostas imunes mediadas por células específicas 85A em camundongos imunizados por via intramuscular. Grupos de camundongos fêmeas BALB/c (n = 5) imunizados duas vezes, com 14 dias de intervalo, com plasmídeos expressando: 85A, 85A-IR14, 85A-TL18, 85A-IMX313 ou 85A-IMX313T. Duas semanas após a última imunização, os camundongos foram sacrificados e as células T CD8+ esplênicas purificadas. As células foram co-cultivadas com o peptídeo 85A p15. As diferenças significativas entre as médias dos diferentes grupos foram determinadas por ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. Um valor-p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Respostas de IFN-Y nos sobrenadantes de co- cultura foram expressas como células que segregam IFN- Y/milhão de células.

[090] Figura 9. Grupos de camundongos fêmea BALB/c (n = 5) foram imunizados por via intramuscular, duas vezes, com 14 dias de intervalo, com o plasmídeo 85A-IMX313, o plasmídeo 85A-IMX313T e as sequências mais curtas 85A-IR14 e 85A-TL18. Vinte e oito dias após a primeira imunização, os níveis de IgG específicos para 85A no soro foram determinados utilizando um ELISA específico para 85A. Os resultados são expressos como a DO das amostras medida a 405 nm+ SEM. As diferenças significativas entre as médias dos diferentes grupos foram determinadas por ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. Um valor-p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. NS significa não significativo; valores de significância são mostrados com um asterisco: ***(p < 0,001), **(p < 0,01),* (p < 0,05)

[091] Figura 10: Mapa do plasmídeo parental pcDNA3 NP - Este plasmídeo e seus derivados, construídos como descrito nos Exemplos, foram usados para a vacinação de DNA.

[092] Figura 11: Comparação do total de células T que segregam IFN-Y em resposta à imunização com os plasmídeos que codificam NP, sobre NP fundido com IMX313.

[093] Figure 12: Comparação de células CD8 e CD4 T que segregam IFN-Y em resposta à imunização com um plasmídeo que codifica NP ou um plasmídeo que codifica NP fundido com IMX313.

[094] Figura 13: Comparação das respostas de anticorpos IgG para NP recombinante induzido pelos plasmídeos de DNA que codificam ou NP ou NP fundido com IMX313.

[095] Figura 14: Comparação de respostas de subclasses dos anticorpos IgG para NP recombinante induzido por plasmídeos de DNA que codificam ou NP ou NP fundido com IMX313.

[096] Figura 15: Comparação das respostas das células T totais de plasmídeos que codificam NP, NP monomérico (NP-M), NP monomérico fundido com IMX313 (NP-M- IMX313) e NP monomérico fundido com IMX313T (NP-H-IMX313T).

[097] Figura 16: Comparação das respostas de células T CD8 + e CD4+ para plasmídeos que codificam NP, NP monomérico (NP-M), NP monomérico fundido com IMX313 (NP-M- IMX313) e NP monomérico fundido com IMX313T (NP-M-IMX313T).

[098] Figura 17: Comparação das respostas de anticorpos IgG, medidas por ELISA, utilizando NP recombinante, para os plasmídeos que codificam NP, NP monomérico (NP-H), NP monomérico fundido com IMX313 e NP monomérico fundido com IMX313T.

[099] Figura 18: Comparação das respostas das subclasses de anticorpos IgG, medidas utilizando NP recombinante, plasmídeos codificando NP, NP monomérico (NP- M), NP monomérico fundido com IMX313 e NP monomérico fundido com IMX313T.

[100] Figura 19: Influência da secreção pelo peptídeo sinal tPA, das várias proteínas de fusão NP. Total de células T foram medidas por ELISPOTs de IFN-y comparando NP, NP secretado (tPA-NP), NP monomérico secretado (NP-tPA- M), NP secretado fundido a IMX313 (tPA-NP-IMX313), NP monomérico secretado fundido com IMX313, e NP monomérico secretado fundido com IMX313T (tPA-NP-M-IMX313T).

[101] Figura 20: Influência da secreção, pelo peptídeo sinal tPA, nas respostas de CD8+ e CD4+ a várias proteínas de fusão NP, medidas por ELISPOTs de IFN-y comparando: NP, NP secretado (tPA-NP), NP monomérico secretado (tPA-NP-M), NP secretado fundido a IMX313 (tPA- NP-IMX313), NP monomérico secretado fundido com IMX313, e NP monomérico secretado fundido com IMX313T (tPA-NP-M- IMX313T).

[102] Figura 21: Influência da secreção, pelo peptídeo sinal tPA, as respostas de IgG contra várias proteínas de fusão NP, medidas por ELISA comparando: NP, NP secretado (tPA-NP), NP monomérico secretado (tPA-NP-M), NP secretado fundido a IMX313 (tPA-NP-IMX313), NP monomérico secretado fundido com IMX313, e NP monomérico secretado fundido com IMX313T (tPA-NP-M-IMX313T).

[103] Figura 22: Influência da secreção, pelo peptídeo sinal tPA, sobre as respostas de subclasse de IgG para várias proteínas de fusão NP, medidas por ELISA comparando: NP, NP secretado (tPA-NP), NP monomérico secretado (tPA-NP-M), NP secretado fundido a IMX313 (tPA- NP-IMX313), NP monomérico secretado fundido com IMX313, e NP monomérico secretado fundido com IMX313T (tPA-NP-M- IMX313T).

[104] Figura 23: Esta figura mostra que a proteína IMX743 se liga a um oligonucleotídeo de DNA ODN1826 fortemente, ao passo que IMX744 se liga apenas fracamente ao mesmo oligonucleotídeo. Eletroforese em gel de agarose foi realizada em 0,8% em tampão TAE. A posição no gel para a qual o oligonucleotídeo migrou é observável sob luz ultravioleta, quando o gel é corado com brometo de etídio. Prepararam-se diferentes combinações de ODN1826 ligante de TLR9 e as proteínas IMX744 e IMX743, como descrito na Tabela acima o gel, e a formação do complexo foi analisada por eletroforese em gel de agarose. A formação do complexo foi claramente detectável, porque os complexos migraram mais lentamente do que o ligante não complexado. À medida que a concentração da proteína foi diminuída, os complexos observados tornaram-se mais difusos, e uma banda de ligante TLR não ligada tornou-se visível. O gel mostra que o desvio em gel é reprodutível com IMX743 (comparar as faixas 6 e 12), mas que IMX744 (faixas 3 a 5) produz uma mudança que é quase imperceptível no gel.

EXEMPLOS 1. Produção das proteínas IMX313, IMX313T e IMX313P

[105] IMX313 foi produzida por clonagem deste domínio de oligomerização em vetor de expressão baseado em T7 através de métodos padrão. O produto de PCR continha um local de Ndel na extremidade N-terminal e um local HindIII que se sobrepõem ao segundo códon de paragem. A sequência de nucleotídeos é: SEQ ID NO 8: CATATGTCAAAGAAGCAAGGTGATGCTGATGTGTGCGGAGAGGTTGCTTATATT CAGAGCGTCGTCTCCGATTGCCACGTGCCTACAGCGGAACTGCGTACTCTGCTGGAAAT ACGAAAACTCTTCCTGGAGATTCAAAAACTGAAGGTGGAATTGCAAGGACTGAGCAAGG AGTAATAAGCTT

[106] Este gene codifica a seguinte sequência de proteína (SEQ ID NO 9): MSKKQGDADVCGEVAYIQSVVSDCHVPTAELRTLLEIRKLFLEIQKLKVELQGL SKE**

[107] Os asteriscos representam códons de parada. A serina na segunda posição permitiu a remoção completa da metionina de iniciação, tal como determinado por espectrometria de massa.

[108] IMX313 foi expressa na cepa de Escherichia coli C43 (DE3). As células transformadas foram cultivadas em meio Terrific Broth a 37°C até uma OD600 de aproximadamente 0,6, em seguida, a expressão foi induzida com IPTG a uma concentração de 1mM, e a cultura foi cultivada durante a noite a 37°C. As bactérias colhidas foram lisadas por sonicação em um tampão contendo 50 mM de fosfato de sódio pH 7,4 e centrifugado a 18000 rpm durante 30 minutos a 4°C. A proteína IMX313 foi encontrada na fração solúvel.

[109] IMX313T foi gerado substituindo os últimos cinco aminoácidos C-terminais (GLSKE) de IMX313 com o peptídeo carregado positivamente (SPRRRRS) como se segue: um sítio de restrição PstI (CTGCAG: que codifica os aminoácidos leucina e glutamina) foi criado pela mutagênese-dirigida para o local imediatamente precedendo os aminoácidos a serem substituídos (GLSKE). Isto permite a substituição dos últimos cinco aminoácidos da IMX313 por quaisquer aminoácidos codificados por dois oligonucleotídeos complementares que podem ser emparelhados e ligados ao local PstI e o local Hind III imediatamente a jusante dos códons de paragem.

[110] Os seguintes oligonucleotídeos fosforilados substituíram a sequência de codificação LQGLSKE** (SEQ ID NO 10) por LQSPRRRRS** (SEQ ID NO 11, em que * representa um códon de paragem), quando hibridados e clonados entre os locais HindIII e PstI: SEQ ID NO 12: 5’ GTCTCCGCGTCGCCGTCGCTCCTAATA 3’e SEQ ID NO 13: 5’ AGCTTATTAGGAGCGACGGCGACGCGGAGACTGCA 3’.

[111] A sequência de nucleotídeos que codifica IMX313T é como se segue (SEQ ID NO 14): atgtcaaagaagcaaggtgatgctgatgtgtgcggagaggttgcttatattcag agcgtcgtctccgattgccacgtgcctacagcggaactgcgtactctgctggaaatacg aaaactcttcctggagattcaaaaactgaaggtggaactgcagtctccgcgtcgccgtc gctcctaataa

[112] IMX313T também foi expressa na cepa de Escherichia coli C43 (DE3). As células transformadas foram cultivadas em meio Terrific Broth a 37°C até uma DO600 de aproximadamente 0,6, em seguida, a expressão foi induzida pela adição de IPTG para 1 mM, e a cultura foi cultivada durante a noite a 37°C. As bactérias foram lisadas por sonicação em um tampão contendo 50 mM de fosfato de sódio pH 7,4 e centrifugadas a 18000 rpm durante 30 minutos a 4°C. A proteína IMX313T também foi verificada na fração solúvel.

[113] IMX313P foi construído por mutação do plasmídeo expressando IMX313T com os oligonucleotídeos: IMX205: 5 'GGAGATTCAAAAACTGAAGGTGGAAGGTCGCCGTCGCCGTCGCTCC 3' (SEQ ID NO 43) e IMX139: 5’ GGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGC 3’ (SEQ ID NO 44).

[114] O produto de PCR foi inserido pelo método de Geiser (29) dentro de um vetor T7 que expressa a proteína IMX313T.

[115] A sequência de nucleotídeos que codifica IMX313P é como se segue (SEQ ID NO 45): ATGTCAAAGAAGCAAGGTGATGCTGATGTGTGCGGAGAGGTTGCTTATATTCAG AGCGTCGTCTCCGATTGCCACGTGCCTACAGCGGAACTGCGTACTCTGCTGGAAATACG AAAACTCTTCCTGGAGATTCAAAAACTGAAGGTGGAAGGTCGCCGTCGCCGTCGCTCCT AA

[116] A proteína IMX313P foi purificada produzida da mesma maneira como a proteína IMX313T, exceto que o tampão de lise continha também 1 M de NaCl. O lisado clarificado bacteriana foi aquecido a 80°C durante 20 minutos e novamente clarificado por centrifugação a 18000 rpm durante 30 minutos são 4°C.

2. IMX313P e IMX313T, como IMX313, são heptaméricas

[117] A proteína IMX313T foi purificada em uma coluna Hi Trap SP de 5 ml equilibrada com 50 mM de fosfato de sódio pH 7,4. A proteína foi eluída em um gradiente de 0 a 1M de NaCl. As frações contendo a proteína IMX313T foram reunidas, dialisadas contra 1x PBS e aplicadas a uma coluna de 75 pg Hi Load 26/60 Superdex, que foi equilibrada com 1x PBS. O volume de eluição para IMX313T (Ve 170 ml) foi muito semelhante ao de IMX313 (Ve 162 mL).

[118] A proteína IMX313P foi purificada em uma coluna de Heparina-sepharose. A proteína foi dialisada em primeiro lugar contra uma solução de Tris-HCl a pH 8,0 e NaCl de 150 mM, antes de ser carregada na coluna. A coluna foi em seguida desenvolvida com Tris-HCl a pH 8,0 e 2M de NaCl. As frações de proteína IMX313P eluídas foram reunidas, dialisadas contra PBS contendo 500 mM de NaCl, e aplicadas a uma coluna de 75 pg Hi Load 26/60 Superdex que foi equilibrada com 1x PBS contendo 500 mM de NaCl. O volume de eluição era indistinguível daquele de IMX313T.

[119] Para demonstrar a formação de heptâmero em géis de SDS-PAGE, as proteínas IMX313T e IMX313P purificadas foram analisadas sob condições nativas, desnaturantes e redutoras. Na ausência de agente de redução, IMX313T e IMX313P oligomerizadas, como fez IMX313, e todas migraram com um peso molecular muito mais elevado do que os seus monômeros.

3. A fusão de um peptídeo curto, carregado positivamente para IMX313 facilita a purificação de proteínas

[120] A proteína IMX313T purificada como acima foi subsequentemente carregada em uma coluna de 5 mL HiTrap Heparin HP em um tampão consistindo em 10 mM de Tris-HCl e 150 mM de pH 7,5. A eluição das proteínas ligadas foi realizada com um gradiente salino: 15 volumes de coluna de 2M de NaCl no mesmo tampão. A proteína IMX313T carregada positivamente ligada à coluna de heparina e foi eluída com cerca de 1 M de NaCl. Em uma corrida de coluna separada, foi mostrado que IMX313 não se ligou à coluna de heparina- sepharose, mas em vez disso foi encontrada no fluxo de passagem de fração.

[121] Heparina sefarose é uma coluna de cromatografia de afinidade. É amplamente utilizada para a purificação de proteínas do soro, incluindo fatores de coagulação, lipases, lipoproteínas e receptores de hormônios e também tem sido utilizada com sucesso para a purificação de fatores de crescimento. A estrutura polianiônica de heparina, que serve como um análogo de DNA e RNA, permitiu a purificação de diversos tipos de proteínas que interagem com o DNA ou RNA, incluindo as polimerases, ligases, quinases, e proteínas ribossomais.

[122] Mostramos aqui que a modificação de espirais enroladas por fusão de um peptídeo carregado positivamente (tal como uma cauda de poliarginina), confere a capacidade útil de se ligar à coluna de heparina-sepharose com carga negativa o que simplifica grandemente a purificação.

[123] Isto era inesperado porque quando Stempfer et al. (19,20) utilizaram seis resíduos de arginina fundido com uma enzima para imobilizar a enzima em Heparin-Sefarose , a enzima pode ser eluída da coluna com apenas 0,35 M de NaCl. A esta concentração de sal, outras proteínas em extratos de células também eluirão como mostrado no exemplo 4, e existe uma vantagem significativa de ser capaz de eluir a grande maioria das proteínas que se ligam à coluna com concentrações de sal, por exemplo, menos do que 500 mM de NaCl, e depois eluindo a proteína de fusão em coiled- coil modificada com concentrações ainda mais elevadas de sal em uma forma substancialmente pura. Isso permite que um gradiente em degrau ou purificações em lote a serem executados. Assim as colunas de Heparina-Sepharose podem ser utilizadas como colunas de afinidade para proteínas fundidas para IMX313T, e outras espirais enroladas modificadas da maneira descrita aqui.

[124] Em comparação com as colunas de troca catiônica, tais como as colunas de Heparina Sefarose Hi Trap SP FF são mais úteis porque são mais específicas para espirais enroladas modificadas. No nosso estudo, a proteína IMX313Tque eluiu a partir da coluna de troca catiônica (Hi Trap SP FF; pH7,4) não foi totalmente pura. Quando esta proteína purificada SP FF e S75 foi carregada em uma coluna de heparina-sepharose (HiTrap Heparin HP), os contaminantes vestigiais foram removidos no fluxo de passagem, e a proteína IMX313T foi eluída com uma pureza > 98%, mostrando que a heparina é mais coluna específica do que SP FF para a coiled-coil modificada pela adição dos SPRRRRS peptídicos, embora a proteína foi eluída a partir de ambas as colunas a concentrações similares de NaCl.

4. Heparina-sepharose atua como uma coluna de afinidade para espirais enroladas modificadas

[125] IMX313 foi produzida como descrito no exemplo 1. A fração solúvel foi obtida após sonicação do lisado bacteriano em um tampão contendo 10 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, pH 7,5 e centrifugação a 18.000 rpm durante 30 minutos a 4°C em rotor Sorvall SS34.

[126] O sobrenadante contendo a proteína de fusão foi carregado sobre a coluna HP de heparina Hi Trap equilibrada com 10 mM de Tris-HCl a pH 7,5 e 150 mM de NaCl. A eluição foi realizada com um gradiente salino: 2 M de NaCl no mesmo tampão. Quase todos os contaminantes foram removidos no fluxo de passagem, ou com baixa concentração de sal; e a proteína IMX313T foi eluída posterior com, aproximadamente, 1 M de NaCl com uma pureza muito elevada (aproximadamente 95%) em apenas um único passo cromatográfico. A purificação adicional por meio de filtração em gel produz uma proteína essencialmente pura. Os resultados são apresentados na figura 1.

5. Outros peptídeos carregados positivamente curtos fundidos com IMX313

[127] Três outras modificações de IMX313T foram feitas, a fim de comparar diferentes ligantes (glicina contra serina e prolina) ou para comparar a arginina com lisina. O plasmídeo que expressa IMX313T foi mutado por amplificação com os oligonucleotídeos: IMX206: 5’ GGAGATTCAAAAACTGAAGGTGGAAGGTCGCCGTCGCCGTTAATAAGCTTGATCCGGC 3’ (SEQ ID NO 46) ou IMX207: 5’ CTGAAGGTGGAATCTCCGaaaaagaaaaagTAATAAGCTTGATCCGGCTG 3’ (SEQ ID NO 47) ou IMX208: GGAGATTCAAAAACTGAAGGTGGAAGGTAAAAAGAAAAAGTAATAAGCTTGATCCGGC 3’ (SEQ ID NO 48) e IMX139 5 'GGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGC 3' (SEQ ID NO 49) e o produto de PCR foi inserido pelo método de Geiser (29) dentro de um vetor T7 que expressa a proteína IMX313T.

[128] Os plasmídeos resultantes, denominados pIMX427, pIMX428 e pIMX429 codificam as proteínas: IMX427: MSKKQGDADVCGEVAYIQSVVSDCHVPTAELRTLLEIRKLFLEIQKLKVEGRRRR* (SEQ ID NO 50) IMX428: MSKKQGDADVCGEVAYIQSVVSDCHVPTAELRTLLEIRKLFLEIQKLKVESPKKKK* (SEQ ID NO 51) IMX429: MSKKQGDADVCGEVAYIQSVVSDCHVPTAELRTLLEIRKLFLEIQKLKVEGKKKK* (SEQ ID NO 52)

[129] Estes foram purificados como IMX313P foi, em seguida, o seu comportamento sobre uma coluna de 5 ml de heparina-sepharose foi examinada em comparação com IMX313T e IMX313P.

[130] As condições foram as seguintes: Tampão de carregamento Tris 20 mM pH 7,5 NaCl 150 mM. Em seguida, um gradiente de eluição usando um segundo padrão foi realizado. O segundo tampão era 20 mM de Tris, pH 7,5 e 2 M de NaCl.

[131] Estes resultados podem ser comparados com as experiências de Fromm e colegas (47), que demonstraram que um peptídeo de sete argininas eluiu da heparina-sepharose a uma concentração de NaCl de 820 mM, e um peptídeo de sete lisinas eluiu com uma concentração de NaCl de 640 mM. Claramente, a fusão de peptídeos carregados positivamente para uma coiled-coil melhora a sua ligação à heparina.

6. Produção e purificação do antígeno PAm, e das proteínas de fusão PAm-IMX313 e PAm-IMX313T

[132] Para produzir o antígeno PAm fundido com IMX313, a proteína A do quadro de leitura aberta de Staphylococcus aureus foi amplificada a partir do plasmídeo pEZZ18 (Amersham Pharmacia) utilizando os oligonucleotídeos: SEQ ID NO 15 - IMX1078: 5’ CTTTAAGAAGGAGATATACATATGgctgatgcgcaacaaaataac 3’ e SEQ ID NO 16 - IMX1079: 5’ CCGCACACatcagcatcaccttgcttttttggtgcttgagcatcatttagc 3’ e o produto de PCR de ~ 233bp de pares de bases foi inserido pelo método de Geiser (29) dentro de um vetor T7 que expressa a proteína IMX313. O quadro de leitura da proteína A, em seguida, foi mutado utilizando os oligonucleotídeos: SEQ ID NO 17 - IMX1080: 5’ cttcaacaaagaAAaaAaGaAcgccttctatg 3’ e SEQ ID NO 18 - IMX1081: 5’ gcgctttggcttggagccgcttttaagctttgg 3’ para introduzir as mutações descritas por Kim et al. (27), criando o vetor de expressão pIMX494, que tem a seguinte cassete de expressão (SEQ ID NO 19): atggctgatgcgcaacaaaataacttcaacaaaggaaaaaagaacgccttctat gaaatc ttgaatatgcctaacttaaacgaagaacaacgcaatggtttcatccaaagctta aaagcg gctccaagccaaagcgctaaccttttagcagaagctaaaaagctaaatgatgct caagca ccaaaaaagcaaggtgatgctgatgtgtgcggagaggttgcttatattcagagc gtcgtc tccgattgccacgtgcctacagcggaactgcgtactctgctggaaatacgaaaa ctcttc ctggagattcaaaaactgaaggtggaattgcaataataa

[133] Este codifica a proteína de sequência (SEQ ID NO 20): MADAQQNNFNKGKKNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLAEAKK LNDAQAPKKQGDADVCGEVAYIQSVVSDCHVPTAELRTLLEIRKLFLEIQKLKVELQ**

[134] Note-se que esta versão da IMX313 carece dos últimos cinco aminoácidos (GLSKE) encontrados na versão de aminoácido cinquenta e cinco para facilitar a interpretação das imunizações previstas. A proteína de fusão IMX494 (PAM- IMX313) foi expressa na cepa C43 (DE3) sobre a indução com IPTG. O pellet de células foi lisado por sonicação em 20 mM de Tris-HCl a pH 7 e centrifugado a 18.000 rpm durante 15 minutos a 4°C. A proteína de fusão foi encontrada no pellet que foi então sonicado em um tampão constituído por 50 mM de Tris-HCl, 3M de ureia, pH 7,4, e centrifugado novamente a 18.000 rpm. Desta vez, a proteína de fusão estava na fração sobrenadante, que foi carregada na coluna Hi Trap Q FF 5ml e a coluna desenvolvida com um gradiente de 1M de NaCl.

[135] As frações contendo a proteína IMX494 foram reunidas dialisadas contra PBS e ainda purificadas por filtração em gel em uma coluna Hi Load 26/60 Superdex 75.

[136] Para produzir o antígeno PAm não fundido com a proteína transportadora, a sequência de codificação IMX313 foi suprimida do vetor pIMX494 utilizando os oligonucleotídeos: SEQ ID NO 21 - IMX1279 5’ gcagccggatcaagcttattattttggtgcttgagcatc 3’ e SEQ ID NO 22 - T7 para a frente: 5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’. O produto de PCR foi inserido (27) para o vetor parental criando o plasmídeo pIMX495.

[137] Uma cultura de 500 ml de pIMX495 na cepa C43 (DE3) foi induzida com 1 mM de IPTG, e cresceu durante a noite. As bactérias colhidas foram lisadas por sonicação em tampão de: 50 mM de fosfato de sódio pH 7,4 e centrifugado a 18000 rpm durante 15 minutos a 4°C em um rotor Sorvall SS34. A proteína IMX495 (PAm sem a sua metionina N- terminal) foi encontrada no sobrenadante, e purificada por aquecimento do sobrenadante a 76°C durante 15 minutos seguido de uma segunda centrifugação a 18K durante 15 minutos. Mais uma vez, IMX495 foi encontrada no sobrenadante, que foi dialisado contra um tampão de 50 mM de MES pH 6. O sobrenadante foi carregado em uma coluna de 5ml Hi Trap SP FF e eluído com um gradiente de NaCl. Finalmente, a proteína IMX495 foi polida por filtração em gel em PBS em uma coluna Hi prep 26/60 sefacril S-100 HR.

[138] Para produzir os vetores pIMX497 que codificam a proteína de fusão PAm-IMX313T, o vetor pIMX494 foi modificado por mutação sinonimamente da sequência que codifica os últimos dois aminoácidos leucina e glutamina a partir de TTGCAA para CTGCAG, e, em seguida, a clonagem entre o recém-criado local Pst I e o local Hind sobrepondo- se ao segundo códon de terminação, os oligonucleotídeos: SEQ ID NO 23- 5’ GTCTCCGCGTCGCCGTCGCTCCTAATA 3’ e SEQ ID NO 24- 5’ AGCTTATTAGGAGCGACGGCGACGCGGAGACTGCA 3’ alterando o C-terminal de IMX313 de LQ** para LQSPRRRRS** (SEQ ID NO 11).

[139] A proteína codificada IMX497 foi então expressa na cepa C43(DE3) e purificada por lise do sedimento bacteriano em fosfato de sódio de 50 mM pH 7,4 e centrifugação a 18K rpm. A proteína de fusão foi encontrada no pellet e foi ressuspensa por sonicação em fosfato de sódio 50 mM, ureia 8 M, pH 7,4. Após uma nova centrifugação, o sobrenadante foi dialisado contra fosfato de sódio 50 mM pH 7,4, e o dialisado foi centrifugado. O sobrenadante foi aquecido a 75°C durante 15 minutos e depois centrifugado novamente. O sobrenadante foi purificado em uma coluna Hi Trap SP FF desenvolvida com um gradiente de NaCl a 2 M, e as frações contendo a proteína de fusão IMX497 foram reunidas, dialisadas contra PBS e polidas por meio de filtração em gel em uma coluna Hi Load 26/60 superdex 75.

7. Ligação de ligantes de TLR intracelulares

[140] Para determinar se essas proteínas podem ligar ligantes TLR intracelulares, ensaios de mudança de mobilidade eletroforética (EMSAs) foram realizados.

[141] Foram preparadas diferentes combinações de ligantes de TLR intracelulares e a proteína IMX497 (PAm- IMX313T), e a formação do complexo foi analisada por eletroforese em gel de agarose.

[142] Os ligantes de TLR utilizados foram como se segue: - Para TLR3: poli I:C sendo um duplex de um polinucleotídeo do ácido poliinosínico hibridado com ácido policitidílico, um análogo de RNA de cadeia dupla. O comprimento da cadeia era de vinte nucleotídeos para cada cadeia. - Para TLR7: um oligonucleotídeo, denominado ssRNA40, com a sequência 5’ GsCsCsCsGsUsCsUsGsUsUsGsUsGsUsGsAsCsUsC 3’onde “s” representa uma ligação de fosforotioato (SEQ ID NO 25); - Para TLR9: um oligonucleotídeo denominado ODN1826 com a sequência: 5’ tccatgacgttcctgacgtt 3’ (SEQ ID NO 26).

[143] Para os ligantes de TLR9, os resultados são apresentados na figura 2. Da esquerda para a direita: Faixa 1: Baixa escala de massa molecular (NEB); Faixa 2: Proteína IMX497 (1mg/ml); Faixa 3: FITC CpG ODN (Eurogentec) 10μM; Faixa 4: Proteína IMX497 (1 mg/ml) & FITC CpG ODN 10μM; Faixa 5: Proteína IMX497 (0,5 mg/ml) & FITC CpG ODN 10μM; Faixa 6: Proteína IMX497 (0,25 mg/ml) & FITC CpG ODN 10μM; Faixa 7: Proteína IMX497 (0,125 mg/ml) & FITC CpG ODN 10μM.

[144] A formação do complexo foi claramente detectável, porque os complexos migraram mais lentamente do que o ligante não complexado, assim “deslocando” o ligante sobre o gel. À medida que a concentração da proteína foi diminuída, os complexos observados tornaram-se mais difusos, e uma banda de ligante não ligado TLR tornou-se visível (migrou à mesma distância que a amostra contendo apenas o ligante de TLR usado como um controle).

[145] Combinações da proteína IMX497 com ligantes TLR7 e TLR3 são mostradas na figura 3; estes ácidos nucleicos também formaram complexos que foram facilmente detectados por EMSAs.

[146] Legenda da figura 3 (ligantes TLR7 ou ligantes TLR3 + IMX497): Faixa 1: escala de massa baixa (NEB); Faixa 2: Proteína IMX497(1mg/ml); Faixa 3: FITC ssRNA (Eurogentec) 10μM; Faixa 4: Proteína IMX497 (1,5 mg/ml)/ FITC ssRNA 10M; Faixa 5: Proteína IMX497 (1 mg/ml)/ FITC ssRNA 10M; Faixa 6: Proteína IMX497 (0,5 mg/ml)/ FITC ssRNA 10M; Faixa 7: Proteína IMX497 (0,25 mg/ml)/ FITC ssRNA 10M; Faixa 8: Proteína IMX497 (0,125 mg/ml)/ FITC ssRNA 10M; Faixa 9: FITC ssRNA 10M; Faixa 10: Controle negativo; Faixa 11: Poli (I:C)(R&D TOCRIS Bioscience) 0,5 mg/ml; Faixa 12: Proteína IMX497 (1,5 mg/ml)/ Poli (I:C) 0,5 mg/ml; Faixa 13: Proteína IMX497 (1 mg/ml)/ Poli (I:C) 0,5 mg/ml; Faixa 14: Proteína IMX497 (1 mg/ml)/ Poli (I:C) 0,25 mg/ml; Faixa 15: Proteína IMX497 (0,5 mg/ml)/ Poli (I:C) 0,5 mg/ml; Faixa 16: Proteína IMX497 (0,5 mg/ml)/ Poli (I:C) 0,25 mg/ml Faixa 17: Proteína IMX497 (0,25 mg/ml)/ Poli (I:C) 0,5 mg/ml

[147] Nós também examinamos se IMX494 (PAmIMX313) e IMX495 (PAm) também poderiam produzir tais mudanças de gel com o oligonucleotídeo CpG (ligantes TLR9). Os resultados são mostrados na figura 4.

[148] Legenda da figura 4: Faixa 1: escala massa molecular baixa (NEB); Faixa 2: Proteína IMX497 (1mg/ml); Faixa 3: Proteína IMX494 (1mg/ml) Faixa 4: Proteína IMX495 (1mg/ml) Faixa 5: FITC CpG ODN (Eurogentec) 10μM; Faixa 6: Proteína IMX497 (1,5 mg/ml) & FITC CpG ODN 10μM; Faixa 7: Proteína IMX497 (1 mg/ml) & FITC CpG ODN 10μM; Faixa 8: Proteína IMX497 (0,5 mg/ml)& FITC CpG ODN 10μM; Faixa 9: Proteína IMX497 (0,25 mg/ml) & FITC CpG ODN 10μM; Faixa 10: Proteína IMX494 (1 mg/ml) & FITC CpG ODN 10μM; Faixa 11: Proteína IMX494 (0,5 mg/ml) & FITC CpG ODN 10μM; Faixa 12: Proteína IMX494 (0,25mg/ml) & FITC CpG ODN 10μM; Faixa 13: Proteína IMX495 (1 mg/ml) & FITC CpG ODN 10μM; Faixa 14: Proteína IMX495 (0,5 mg/ml)& FITC CpG ODN 10μM; Faixa 15: Proteína IMX495 (0,25 mg/ml) & FITC CpG ODN 10μM

[149] O gel na Figura 4 mostra que o desvio em gel é reprodutível com IMX497, mas que IMX495 (faixas 13-15) produz nenhum deslocamento em gel detectável e que as mudanças de gel observadas com IMX494 (faixas 10-12) são dificilmente detectáveis, e muito menos marcadas do que as observadas com IMX497.

[150] A diferença entre IMX494 e IMX497 é a presença da sequência SPRRRRS presente em IMX497, fundida com o terminal C da coiled-coil da proteína.

[151] Conclusão: sem o peptídeo, a proteína de fusão IMX313 e antígeno PAM é incapaz de ligar ligantes de ácidos nucleicos para receptores TLR.

8. A imunogenicidade de antígenos associados com IMX313T

[152] As imunizações de camundongos foram, em seguida, realizadas para determinar a imunogenicidade de PAm, por si só ou fundida com IMX313 ou IMX313T, e com ou sem formulação com os ligantes de TLR intracelulares. PAm formulada com adjuvante de Freund completo ou incompleto (CFA/IFA) foi utilizada como um controle.

[153] Para este fim, camundongos fêmea BALB/C foram imunizados por via subcutânea, duas vezes, com um intervalo de 14 dias, usando 2 nanomoles de cada proteína por injecão, com o PPAm, PAm-IMX313, PAm-IMX313T ou PAm formulados em CFA primeiro e, em seguida, em IFA. Vinte e oito dias após a primeira imunização, os títulos de IgG específicos do PAM em soros foram determinados utilizando um teste ELISA, em que as placas foram revestidas com PAm. Os resultados são expressos como a densidade ótica das amostras medidas em 405 nm + SEM. As diferenças significativas entre as médias dos diferentes grupos foi determinada por ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. Um valor-p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. e é representado por * diferente, ao passo que *** representa p <0,001 e ** representa p <0,01.

[154] Os resultados são apresentados na figura 5. Os camundongos imunizados com o PAm sozinho não tiveram nenhum ou muito baixos níveis de anticorpo anti-PAM IgG nos seus soros. Os camundongos imunizados com PAM-IMX313 ou PAM-IMX313T por outro lado, mostraram níveis elevados de respostas de anticorpos IgG específicos de PAm sistêmicos; no entanto, os camundongos imunizados PAm-IMX313T tinham respostas de anticorpos IgG significativamente mais elevadas (p <0,001) em comparação com as dos camundongos imunizados PAM-IMX313; respostas semelhantes para PAm- IMX313T foram obtidss com o PAm+CFA/IFA, como adjuvantes.

[155] Isto mostra que a adição dos peptídeos SPRRRRS confere uma imunogenicidade melhorada significativamente ao antígeno em comparação com a sequência IMX313 parental.

[156] Quando o antígeno PAm foi formulado com os ligantes de TLR intracelulares (ou DNA de cadeia simples ou RNA ou RNA de cadeia dupla), a sua imunogenicidade foi melhorada substancialmente, e melhorias semelhantes foram observadas quando o antígeno foi fundido com IMX313 antes da formulação. No entanto, claramente os melhores resultados foram observados quando o antígeno foi fundido com IMX313T antes de ser formulado com os ligantes de TLR.

[157] Os resultados são apresentados aqui e mostrados a seguir em diagrama. Tabela 1: Títulos de Diluição de Ponto Final de IgG contra PAm

[158] Uma questão interessante é se estas melhorias modificam os tipos de respostas imunitárias obtidas contra o antígeno, neste caso PAm. As respostas de Th1 e Th2 são melhoradas significativamente? Para responder a isso, nós comparamos as respostas de IgG1 com respostas de IgG2a, como títulos de IgG1 são representativas de respostas do tipo Th2, enquanto IgG2a representa respostas do tipo Th1. Os resultados são apresentados na tabela 2.

[159] É claro que a PAm por si próprio quase igualmente induz respostas Th1 e Th2, mas a sua formulação com adjuvante de Freund altera isto dramaticamente, com a resposta de Th2 (IgG1) sendo agora predominante. Fusão de PAM para IMX313 mostra que ambas as respostas Th1 e Th2 são ambas aumentadas, e não há nenhuma mudança significativa no tipo de resposta. Com IMX313T, a resposta Th1 (IgG2a) começa a predominar, mas o efeito é muito menos acentuado do que com adjuvante de Freund e na direção oposta. O consenso entre os imunologistas é que as respostas Th1 são preferíveis às respostas Th2.

[160] Tomando ainda mais esta análise, nós examinamos se a formulação com ligantes de TLR intracelulares pode ser utilizada para re-direcionar o sistema imunitário para a produção ou de respostas Th1 ou Th2. Dados de anticorpo do isotipo IgG foram utilizados para avaliar o tipo de resposta Th, com uma predominância de anticorpos IgG2a ou IgG1, indicando uma resposta tipo Th1 ou Th2, respectivamente. As respostas de tipo Th1 tinham proporções de IgG2a-a-IgG1 muito elevadas, de tal modo que a média do grupo era também elevada. Razão IgG2a/IgG1 foi usada como um indicador de uma resposta de Th1 predominantemente (IgG2a> IgG1), de Th2 predominantemente (IgG1> IgG2a), ou uma misturada de Th1/Th2 (Th0, IgG1 = IgG2a).

[161] Os resultados são mostrados na tabela 2 abaixo:

[162] É imediatamente evidente que a formulação de PAM-IMX313T com os ligantes de TLR aumenta a tendência da resposta de Th1 para predominar, com cada um dos três ligantes; O efeito é mais marcado com o ligante de TLR3 poli I: C e quase tão marcado com o ligante TLR9.

9. Respostas de células T

[163] Para determinar se a modificação da coiled- coil IMX313 com o peptídeo carregado positivamente também poderia melhorar as respostas de células T, foi utilizado o antígeno micobacteriano 85A como um modelo, porque IMX313 foi mostrado para melhorar as respostas das células T a esse antígeno em camundongos e macacos (28). Uma série de plasmídeos recombinantes que expressam o antígeno 85A sozinho ou fundido com IMX313T ou duas versões truncadas de IMX313, contendo apenas catorze ou dezoito aminoácidos do mesmo, foi feita por subclonagem da primeira sequência de codificação 85A-IMX313 do vetor pSG2-85A-IMX313 descrita por Spencer et al. (28) para o plasmídeo Gateway pENTR4-LP. Nesta estrutura de pENTR4, derivados foram feitos tanto para apagar ou modificar IMX313.

[164] As sequências de aminoácidos das variantes IMX313 são mostradas aqui: IR14 IRKLFLEIQKLKVE* (SEQ ID NO 27) TL18 TLLEIRKLFLEIQKLKVE* (SEQ ID NO 28) IMX313 KKQGDADVCGEVAYIQSVVSDCHVPTAELRTLLEIRKLFLEIQKLKVELQGL SKE* (SEQ ID NO 6) IMX313T KKQGDADVCGEVAYIQSVVSDCHVPTAELRTLLEIRKLFLEIQKLKVELQSP RRRRS* (SEQ ID NO 7)

[165] Os fragmentos 14-mer e 18-mer de IMX313 foram escolhidos porque eles permaneceram heptaméricos a 37°C, (e mesmo 42°C), e devem, portanto, formar proteínas de fusão heptaméricas quando expressos após a vacinação de DNA. As modificações de IMX313 foram realizadas como se segue:

[166] Os primers IMX043 e IMX044 e o primer inverso IMX045 foram utilizados para amplificar os fragmentos de IMX313 e este produto de PCR foi utilizado (29) para substituir IMX313 no plasmídeo parental. IMX043: 5 ’gaagcccgacctgcaacgtggatccATACGAAAACTCTTCCTGGAGA 3’ (SEQ ID NO 29) IMX044: 5’ gaagcccgacctgcaacgtggatccACTCTGCTGGAAATACGA 3’ (SEQ ID NO 30) IMX045: 5’ agggccctctagatgcatgctcgagcggccgcttattaTTCCACCTTCAGTTTTTG 3’ (SEQ ID NO 31)

[167] A sequência de codificação IMX313 foi excluída usando os primers IMX037 e IMX047 e o plasmídeo parental como um modelo; o produto de PCR resultante foi então usado (29) para substituir a sequência IMX313. IMX037: 5’ cagaatagaatgacacctactcag 3’ (SEQ ID NO 32) IMX047: 5’ GAAGCCCGACCTGCAACGTTAATAAgcggccgctcgagcatg 3’ (SEQ ID NO 33)

[168] Para fazer 85A-IMX313T, os seguintes oligos foram utilizados para amplificar IMX313T do plasmídeo pIMX497; o produto de PCR foi depois inserido (29) no plasmídeo parental: IMX1030: 5’ GTGCCTACAGAGGACGTGAAAATGCTGCTGGAAATACGAAAACTCTTCCTGG 3’ (SEQ ID NO 34) IMX046: 5’ AgggccctctagatgcatgctcgagcggccgcttattaGGAGCGACGGCGACGCGGAGA 3’ (SEQ ID NO 35)

[169] Estes cinco plasmídeos (codificando 85A, 85A-IR14, 85A-TL18, 85A-85A-IMX313 e IMX313T) foram então usados para imunização de DNA.

[170] Cincos grupos de camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com cada um dos cinco plasmídeos nos dias 0 e 14, utilizando 25 μg por injeção. A indução de respostas de células T específicas de antígeno foram medidas por ELISPOTs, utilizando esplenócitos, no dia 28. As células do baço purificadas CD4+, CD8+ e T totais isoladas a partir de camundongos imunizados foram co- cultivadas com ou proteína recombinante 85A (Clinibiosciences) ou os peptídeos de p11 ou p15 (26) adquiridos de Eurogentec.

[171] Ensaios ELISPOT: De fundo plano, placas de nitrocelulose de 96 poços (Millititer, Millipore) foram revestidas com IFN-Y mAb (15μg/ml; MABTECH, Stockholm) e incubadas durante a noite a 4°C. Após lavagem com PBS, as placas foram bloqueadas com 10% de soro fetal bovino durante uma hora a 37°C. 2x106 células por cavidade foram estimuladas com peptídeos relevantes a uma concentração final de 2 μg/ml (p11 epítopos de CD8, CD4 epítopo p15 ou da proteína 85A) sobre membranas de HPIV revestidas com 15 μg/ml de IFN- anti-humano e incubadas durante 20 horas. Após a incubação, as placas foram lavadas exaustivamente com PBS para remover as células, e IFN-Y mAb (1μg/ml de biotina, MABTECH) foi adicionado a cada poço. Após incubação durante 2 h a 37°C, as placas foram lavadas e desenvolvidas com estreptavidina-HRP (1 μg/ml; MABTECH) durante uma hora à temperatura ambiente. Após a lavagem, o substrato (3-amino-9-eticarbazol (Sigma)) e foi incubado durante 15 minutos. Após nova lavagem, as manchas vermelhas foram contadas sob o microscópio.

[172] Baço purificado CD4+ T, CD8+ T e as células T totais isoladas a partir de camundongos imunizados 85A- IMX313, 85A-IR14 or 85A-TL18 ou 85A-IMX313T apresentaram respostas de IFNy significativamente mais elevadas em comparação com aquelas dos camundongos 85A imunizados, e confirmaram a capacidade de IMX313 e das outras sequências modificadas para aumentar as respostas das células T. Além disso, as células do baço CD4+, CD8+ e T totais dos camundongos 85A-IMX313T vacinados produziram um número significativamente maior de IFNy do que as de qualquer um dos outros grupos imunizados (p <0,001) (Figuras 6, 7, 8).

[173] As células T CD8+ demonstraram um perfil de citocina diferente em comparação com as células T CD4+; a população de produção de citocina predominante observada foram células T CD8+ que produziram IFNy (Figuras 7 e 8).

[174] É interessante notar que ambas as células T específicas de antígenos CD4+ e CD8+ são melhoradas quando IMX313 é substituída por IMX313T.

[175] Em conclusão, as respostas das células T para o antígeno 85A, as quais são melhoradas pelo IMX313 são ainda melhoradas pela utilização de IMX313T.

10. Respostas de células B induzidas por vacinação com DNA

[176] Os títulos de anticorpos para o antígeno 85A foram medidos por ELISA no soro dos camundongos que foram imunizados com vacinas de DNA (Figura 9).

[177] Os camundongos imunizados com o plasmídeo 85A-IMX313, o plasmídeo 85A-IMX313T e as versões mais curtas de IMX313 (IR14 e TL18) desenvolveram títulos significativamente mais elevados de IgG total específica de antígeno (Figura 9) do que os imunizados com o plasmídeo que expressa 85A. O grupo imunizado com 85A-IMX313T mostrou as maiores respostas de IgG (p <0,001). Os camundongos imunizados com 85A apenas tinham níveis muito baixos de anti-anticorpo IgG 85A nos seus soros.

[178] O redirecionamento das respostas imunes sentido Th1 quando o peptídeo curto carregado positivamente SPRRRRS é adicionado também foi observado quando o DNA é usado para vacinação. Medimos os isotipos de IgG específicos para a proteína 85A de ELISA (tabela 3). O isotipo IgG2a está associado com um Th1 e o isotipo IgG1 está associado com uma resposta imunitária do tipo Th2 em camundongos BALB/c.

[179] É de se notar, a utilização de ambos IMX313 ou IMx 313T levou a uma mudança na direção de T helper tipo 1 (Th1) associado com IgGs específicas para o antígeno, com níveis significativamente elevados de IgG2a e níveis reduzidos de IgG 1, em comparação com o antígeno 85A sozinho (tabela 3) e estes resultados constituem evidência direta de uma polarização de Th1; estes resultados são consistentes com os resultados observados com as respostas imunes celulares.

[180] Tabela 3. Grupos de camundongos fêmea BALB/C (n = 5) foram imunizados por via intramuscular duas vezes, com 14 dias de intervalo, com os plasmídeos que expressam 85A-IMX313, 85A-IMX313T, as sequências mais curtas IMX313, 85A-IR14 e 85A-TL18, e 85A sozinha. Vinte e oito dias após a primeira imunização, os níveis de IgG1 e IgG2a específicos de 85A no soro foram determinados utilizando um ELISA específico 85A. Os resultados são expressos como a densidade ótica das amostras medidas em 405 nm + SEM. Quando os mesmos dados para classificar esses dados de isotipo foram analisados como acima, foi observado: Tabela 3:

[181] Claramente, todas as versões do IMX313 tendem a aumentar preferencialmente as respostas de Th1, e o efeito é mais marcado com a versão de IMX313T que tem o peptídeo carregado positivamente curto fundido com a coiled-coil.

11. O uso de uma proteína de fusão específica IMX313T + antígeno de nucleoproteína (NP) de Influenza

[182] Para vacinas de DNA, o plasmídeo progenitor pcDNA3-NP, como se mostra na figura 10, foi modificado como descrito no exemplo abaixo.

11.1 - Inserção de IMX313 em plasmídeos codificando NP

[183] A sequência de codificação IMX313 foi amplificada a partir do plasmídeo pIMX494 utilizando os primers de oligonucleotídeos IIMX1289 5’ caatgcagaggagtacgacaatggatccaagaagcaaggtgatgctgatg 3’ (SEQ ID NO 53) e IMX1290 5’ GTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTtattactccttgctcagtccttgc 3’(SEQ ID NO 54) e inserida no plasmídeo pcDNA3-NP, como descrito por Geiser (29).

11.2 - Inserção do peptídeo de sinal de tPA

[184] O peptídeo de sinal de tPA foi amplificado a partir do vetor pSG2-85A (28), utilizando os oligonucleotídeos IMX1305 5’ cactgagtgacatcaaaatcatgGATGCAATGAAGAGAGGGC 3’ (SEQ ID NO 55) e IMX1306 5’ cgtaagaccgtttggtgccttggctagctcttctgaatcgggcatggatttcc 3’ (SEQ ID NO 56) e inserido em quadro com o N-terminal da sequência de codificação NP em uma série de plasmídeos, tal como descrito por Geiser (29).

11.3 - Criação de duas mutações pontuais de NP para torná-lo monomérico

[185] Os primers oligonucleotídicos IMX1287 5’ ccattctgccgcatttgCagatctaagag 3’ (SEQ ID NO 57) e IMX1288 5’ CAAAAGGGAGATTTGCCTGTACTGAGAAC 3’ (SEQ ID NO 58) foram utilizados para amplificar um fragmento interno do gene de NP, e o produto de PCR resultante foi inserido no NP- que codifica plasmídeos como descrito por Geiser. Porque ambos os oligonucleotídeos foram combinados de forma imperfeita com o gene NP, a inserção do produto de PCR gerou duas mutações pontuais. O primer IMX1287 criou a mutação E339A (GAA para GCA), ao passo que o primer IMX1288 criou a mutação R416A no gene de NP (AGA para GCA).

11.4 - Inserção de IMX313T

[186] A sequência de codificação IMX313T foi amplificada a partir do plasmídeo pIMX497 utilizando os primers oligonucleotídicos IMX1289 (SEQ ID NO 53) e IIMX051 5’ GTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTtattaggagcgacggcgacgc 3’ (SEQ ID NO 59) e inserida nos vários plasmídeos derivados pcDNA3- NP-, tal como descrito por Geiser.

11,5 - Imunizações de DNA com os ácidos nucleicos de acordo com a invenção 11.5.1. Protocolo

[187] Grupos de cinco camundongos fêmea BALB/C foram imunizados intramuscularmente duas vezes, com 14 dias de intervalo, com vários DNAs de plasmídeo, utilizando-se 20g de cada plasmídeo por injeção. As respostas imunes foram medidas no dia 28, para determinar a influência de várias modificações: +/- IMX313 ou IMX313T; +/- o peptídeo sinal tPA ; +/- as mutações de monomerização.

[188] Respostas de células T específicas para antígenos foram medidas por ELISPOTs, utilizando esplenócitos, no dia 28. As células do baço purificadas CD4+, CD8+ e T totais isoladas a partir de camundongos imunizados foram co-cultivadas com peptídeo NP A de Influenza (aminoácidos 366-374) adquiridos de Eurogentec.

[189] Ensaios ELISPOT: De fundo plano, placas de nitrocelulose de 96 poços (Millititer, Millipore) foram revestidas com IFN-y mAb (15μg/ml; MABTECH, Stockholm) e incubadas durante a noite a 4°C. Após lavagem com PBS, as placas foram bloqueadas com 10% de soro fetal bovino durante uma hora a 37 C. 2x106 células por cavidade foram estimuladas com peptídeos relevantes a uma concentração final de 2 μg/ml (peptídeo de NP A Influenza) nas membranas revestidas IPVH com 15 g/ml de IFN- anti-humano e incubadas durante 20 horas. Após a incubação, as placas foram lavadas exaustivamente com PBS para remover as células, e IFN- mAb (1 g/ml de biotina, MABTECH) foi adicionado a cada poço. Após incubação durante 2 h a 37°C, as placas foram lavadas e desenvolvidas com estreptavidina-HRP (1g/ml; MABTECH) durante uma hora à temperatura ambiente. Após a lavagem, o substrato (3-amino-9-eticarbazol (Sigma)) e foi incubado durante 15 minutos. Após nova lavagem, as manchas vermelhas foram contadas sob o microscópio.

[190] Para estudar as respostas imunitárias humorais, foram avaliados os níveis de anticorpos específicos por ELISA para IgG total, e separadamente para IgG1 e IgG2a para avaliar as proporções relativas de Th1 e Th2, camundongos BALB/c tipicamente respondem às vacinas de influenza com uma resposta imunitária de tipo Th2, que está associada com a estimulação de anticorpos IgG1. No entanto, o principal isotipo de anticorpo presente no soro de camundongos que sobrevivem a infecções virais é IgG2a, o que é estimulado durante as respostas imunes de tipo Th1 (32). A estimulação de anticorpos IgG2a foi associada com o aumento da eficácia da vacinação contra a gripe.

[191] Para os ELISAs, antígenos foram diluídos para uma concentração de 5 mg/ml em 0,1 M de carbonato de sódio/bicarbonato (pH 9,6) e foram depois utilizados para revestir os poços de placas MaxiSorb (Nunc-Immulon, Denmark). Diluições em série de duas vezes dos soros de teste foram adicionadas aos poços, e após lavagem, os anticorpos ligados foram detectados com IgG anti- camundongo, ou IgG1 de anti-camundongo ou IgG2a de anti- camundongo (Sigma) conjugado com peroxidase de rábano. A absorvância a 490 nm foi determinada depois de o- fenilenodiamina (Sigma) e H2O2, forem adicionados; as reações foram paradas com 1 M de ácido sulfúrico.

[192] Os resultados são mostrados nas figuras 11 a 14.

[193] 11.5.2. Em experiências preliminares, foram testadas as respostas de células T totais para NP induzidos por vacinas de DNA que codificam ou NP ou NP fundido com IMX313. As células T totais isoladas a partir de camundongos imunizados NP-IMX313 mostraram respostas de IFN significativamente maiores em comparação com as dos camundongos imunizados NP e confirmaram a capacidade de IMX313 para aumentar as respostas das células T.

[194] A Figura 11 mostra que a fusão do gene do antígeno NP parental para o gene IMX313 melhora as respostas das células T a NP.

[195] 11.5.3. Para determinar se o IFN-D detectado nos ELISPOTs foi produzido por células T CD4 ou células CD8 T, foram purficadas as células T CD4+ e CD8+ do baço a partir de camundongos imunizados, e estas foram co- cultivadas com um peptídeo NP. de Influenza A. Um aumento significativo na produção de IFN- a partir de células T CD8+ foi detectado no grupo imunizado com NP-IMX313. A percentagem de células específicas de antígeno CD8+ produtoras de IFN- foi maior do que a população correspondente de células T CD4+ (Fig. 12).

[196] A Figura 12 mostra que a fusão do gene do antígeno NP com o gene IMX313 melhora ambas as repostas de CD4+ e CD8+ ao antígeno NP.

[197] 11.5.4. Em seguida, examinamos a resposta de anticorpos à NP após a imunização e 14 dias após a última imunização, as respostas de IgG Ab específicos de NP nos soros foram medidas. Camundongos de controle NP e ratos dados NP-IMX313 mostraram IgG Abs específico de NP moderados (Fig. 13), que foram maiores no grupo imunizado com NP-IMX313.

[198] A Figura 13 mostra que a fusão do gene NP ao gene IMX313 melhora as respostas de anticorpos IgG contra o antígeno NP.

[199] 11.5.5. Os soros foram também examinados quanto à presença de anticorpos IgG1 and IgG2a específicos de NP (representante de tipos Th2 e Th1 de resposta em camundongos Balb/C, respectivamente). Os isotipos de anticorpos IgG1 e IgG2a específicos de NP foram detectados nos soros dos camundongos imunizados NP-IMX313; no entanto as amostras de soro de camundongos que receberam NP sozinho mostraram apenas baixos níveis de IgG1 e IgG2a Ab (Fig. 14).

[200] A Figura 14 mostra as distribuições das subclasses dos anticorpos induzidos contra o antígeno NP. Fusão para o gene IMX313 melhorou a resposta de IgG2A mais do que a resposta de IgG1, convertendo uma resposta Th2- tendenciosa contra NP para uma resposta de Th1 tendenciosa contra NP-IMX313.

11.6 - Produção de proteína NP-M-IMX313T recombinante

[201] Um gene sintético que codifica para a proteína NP-H-IMX313T foi sintetizado com códons otimizados para a expressão em Escherichia coli. Este gene sintético foi clonado em um vetor de expressão pIMX04 baseado em T7 (este é o vetor pRSETC de Invitrogen em que a origem f1 foi substituída pelo lócus par do plasmídeo pSC101). A expressão foi induzida em vários meios padrão (LB, meio de Auto-Indução de Studier) e a proteína sobrexpressa foi purificada inicialmente como descrito por Ye (30) e por Tarus (31) para as etapas de clarificação e de permuta de íons, mas em uma etapa final a proteína de fusão foi purificada por afinidade em Heparina-sepharose, como descrito acima.

[202] 11,7. A proteína recombinante NP-M-IMX313T é usada para imunizações como se segue:

[203] Grupos de cinco camundongos fêmea BALB/C foram imunizados intramuscularmente duas vezes, com 14 dias de intervalo, com diferentes preparações de proteína (com ou sem formulação com ligantes de TLR), usando 2 nanomoles de proteína por injeção. As respostas imunitárias são medidas no dia 28, para determinar as respostas de células T específicas do antígeno, (medidas por ELISPOTs), utilizando esplenócitos. As respostas de anticorpos pré- imunes e do dia 28 foram medidas por ELISA com NP como antígeno.

Resultados:

[204] A Figura 15 mostra que a monomerisação de NP melhora ligeiramente a sua imunogenicidade, que esta é ainda melhorada através da fusão com o gene IMX313, mas que a maior melhoria é obtida através da fusão de NP monomérica para o gene IMX313T.

[205] A Figura 16 mostra que, na análise das respostas das células CD4+ e CD8+, a mesma ordem de classificação, como na Figura 6 é vista: monomerisação de NP melhora a imunogenicidade de NPs ligeiramente; isto é ainda melhorado por fusão com o gene IMX313, mas que a maior melhoria é obtida através da fusão de NP monomérica para o gene IMX313T.

[206] A Figura 17 mostra que a mesma ordem de classificação é vista para respostas de células B, tal como foi observado para respostas de células T (CD4+ e CD8+) nas Figuras 6 e 7. Total de respostas IgG contra NP foram maiores com IMX313T do que com IMX313.

[207] A Figura 18 mostra as distribuições das subclasses dos anticorpos induzidos contra o antígeno NP monomérico. Como com NP, a fusão do gene IMX313 para a resposta aumentou a resposta de IgG2A mais do que a resposta de IgG1, convertendo uma resposta Th2-tendenciosa contra NP para uma resposta tendenciosa de tipo Th1 contra NP-IMX313. De particular interesse, esta inversão de uma polarização Th2 para uma Th1 foi amplificada por fusão para IMX313T em vez de IMX313. Expressão de anticorpos IgG2a nas vacinas contra a gripe é uma correlacionada com a depuração do vírus e uma maior proteção contra o desafio letal da gripe. O aumento da indução de ambos os isotipos de anticorpos como medida por ELISA, foi uma melhor correlação para a eficácia da vacina do que a neutralização por si só (32).

11.8 - A secreção do antígeno NP melhorou a sua imunogenicidade

[208] Uma série de construções de vacina de NP DNA contendo a sequência de sinal de secreção ativadora do plasminogênio tecidual (tPA)foi feita: tPA-NP, tPA-NP-M, tPA-NP-M-IMX313, e tPA-NP-M-IMX313T. Foram analisados os efeitos da fusão de tPA a NP nas respostas imunitárias humoral e celular dos animais imunizados.

[209] Os camundongos imunizados com tPA contendo construções mostraram respostas significativamente maiores de IFN em comparação com as dos camundongos imunizados NP e confirmaram a capacidade de IMX313T e das mutações de monomerização para aumentar as respostas das células T.

[210] A Figura 19 mostra que forçar a secreção do antígeno NP melhorou a sua imunogenicidade (NP versus tPA- NP), se era monomérica ou não (tPA-NP contra tPA-NP-H). No entanto, a fusão de IMX313 mostrou que a utilização de uma versão monomérica de NP foi mais imunogênica do que o uso do antígeno não modificado (tPA-NP-IMX313 contra tPA-NP-H- IMX313). E a substituição de IMX313 por IMX313T melhorou ainda mais a imunogenicidade de NP (tPA-NP-M-IMX313 contra tPA-NP-M-IMX313T).

[211] A Figura 20 mostra as respostas de CD8+ e CD4+ para as diferentes versões segregadas de NP. A mesma ordem de classificação, como na Figura 19 é vista, e a utilidade da monomerisação do antígeno é uma vez mais pronunciada quando IMX313 é adicionada. Tal como nas figuras precedentes, as maiores respostas imunes são vistas quando IMX313T é usada em vez de IMX313.

[212] A Figura 21 mostra o total de respostas de IgG para o antígeno NP e convida as mesmas conclusões que a Figura 20 para respostas de células T: as maiores respostas são vistas quando IMX313T é usada, mas a secreção (NP contra tPA-NP) e monomerisação (tPA-NP-IMX313 contra tPA- NP-M-IMX313) são também importantes contribuições.

[213] Os camundongos imunizados com o NP sozinho não tiveram nenhum ou muito baixos níveis de anticorpo IgG anti-NP nos seus soros (Figura 21). Os camundongos imunizados com NP-M-IMX313, tPA-NP-M-IMX313, NP-M-IMX313T or tPA-NP-M-IMX313T, por outro lado, mostraram níveis elevados de respostas de anticorpos IgG específicas de NP sistêmicas; no entanto, os camundongos imunizados tPA-NP-H- IMX313T tinham respostas de anticorpos IgG significativamente mais elevadas (p <0,001) em comparação com todos os grupos de camundongos imunizados. Isto mostra que a combinação de todas as modificações (mutações de monomerização, tPA e IMX313T) conferem uma imunogenicidade melhorada significativamente ao antígeno em comparação com a sequência parental ou outras combinações.

[214] A Figura 22 mostra a análise das respostas de subclasse de células B para NP, e ilustra que a polarização de Th2 inicial com NP sozinho é invertida por IMX313 e por IMX313T. Embora a secreção tenha pouco efeito por si própria (NP contra tPA-NP), a monomerização (tPA-NP- IMX313 contra tPA-NP-H-IMX313) e, em seguida, a substituição de IMX313 por IMX313T (tPA-NP-H-IMX313 contra tPA np-M-IMX313T) contribuem todas as respostas melhoradas de Th1 (IgG2a) versus Th2 (IgG1).

[215] É muito importante que tPA-NP-H-IMX313T por si próprio melhore as respostas de Th1 e Th2 quase equivalentes. Fusão de NP para IMX313 mostra que ambas as respostas de Th1 e Th2 são ambas aumentadas, e não há nenhuma mudança significativa no tipo de resposta. Mas com IMX313T e as mutações de monomerização, a resposta de Th1 (IgG2a) começa a predominar. O consenso entre os imunologistas é que as respostas de Th1 são preferíveis às respostas de Th2 (Figura 22).

11.9 - IMX313T não é degradado por proteases na passagem através de vias de secreção

[216] Os resultados obtidos por imunizações de DNA com os plasmídeos contendo IMX313T sugerem fortemente que a cauda da molécula não é clivada por proteases que passam através da via de secreção, em que as proteases são abundantes. Para examinar esta questão mais diretamente, a transfecção de células CHO K1 foi realizada com o plasmídeo utilizado para expressar NP-H-IMX313T in vivo. A transfecção foi realizada como descrito (33).

[217] Dezoito a vinte e quatro horas mais tarde, os sobrenadantes das células transfectadas foram recuperados por centrifugação e filtrados, antes de serem carregados em uma coluna de Heparina-sepharose, como descrito acima.

[218] Um pequeno “pico C” foi observado que provou por SDS-PAGE e Western Blot em conter a proteína NP-H- IMX313T.

12 Modificação de uma coiled-coil trimérica

[219] Para determinar se a modificação de uma coiled-coil trimérica pode melhorar a imunogenicidade do antígeno, foram construídos dois plasmídeos utilizando um gene sintético HA2 que codifica para a coiled-coil trimérica da hemaglutinina de influenza.

[220] O primeiro plasmídeo foi pIMX743, em que a coiled-coil HA2 foi modificada pela fusão de um peptídeo: SPRRRRRRRRRS (SEQ ID NO 37)

[221] O fragmento de restrição seguinte Nde I a HindIII foi clonado em um vetor de expressão T7: CATATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATCATCATGGTAGTGGTTATGCA GCCGATCAGAAAAGCACGCAAAATGCGATTAACGGCATTACCAACAAAGTCAATTCTGT GATCGAAAAGATGAATATCCAGTTTACTGCTGTAGGCAAAGAGTTCAACAAACTGGAGA AACGCATGGAAAACCTGAACAAGAAAGTGGATGATGGGTTTCTGGATATTTGGACCTAT AACGCGGAATTACTTGTGCTCTTAGAAAACGAACGGACATTGGACTTCCATGATTCGAA CGTCAAGAACCTGTATGAGAAAGTGAAAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCTCACCACGTC GCCGTCGTCGCCGTCGCCGTCGCAGTTAATAAGCTT (SEQ ID NO 60)

[222] A sequência da proteína codificada era: MRGSHHHHHHHHGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNIQFTAVGKEFNKLEKRM ENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNASPRRRR RRRRRS** (SEQ ID NO 61)

[223] O plasmídeo de controle pIMX744foi criado por exclusão do peptídeo utilizando os primers oligonucleotídicos IMX203:5’ GTTAGCAGCCGGATCAAGCTTATTAGGCATTGTTCTTCAGCTGGC 3’ (SEQ ID NO 62) e T7Fpara amplificar a inserção de HA2, que foi em seguida reinserida no plasmídeo parental.

[224] A sequência de nucleotídeos foi: CATATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTAGTGGTTATGCAGCCGAT CAGAAAAGCACGCAAAATGCGATTAACGGCATTACCAACAAAGTCAATTCTGTGATCGA AAAGATGAATATCCAGTTTACTGCTGTAGGCAAAGAGTTCAACAAACTGGAGAAACGCA TGGAAAACCTGAACAAGAAAGTGGATGATGGGTTTCTGGATATTTGGACCTATAACGCG GAATTACTTGTGCTCTTAGAAAACGAACGGACATTGGACTTCCATGATTCGAACGTCAA GAACCTGTATGAGAAAGTGAAAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCTAATAAGCTT (SEQ ID NO 63)

[225] E a sequência da proteína codificada era: MRGSHHHHHHGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNIQFTAVGKEFNKLE KRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNA** (SEQ ID NO 64)

[226] Ambas as proteínas foram então purificadas primeiro em uma coluna de afinidade de IMAC e em seguida sobre uma coluna de Sefarose de heparina. A proteína IMX743 eluiu a uma concentração mais elevada de sal (NaCl) do que a proteína IMX744: a proteína IMX743 eluiu a uma concentração de sal de 1,4 M (sic), enquanto que a proteína IMX744 eluiu a uma concentração de sal de 600 mM.

[227] Ambas as proteínas foram então usadas para imunizar quatro grupos de camundongos fêmeas de 5 a 6 semanas de idade BALB/c, no dia 0 e 14, com 20 μg por injeção. Soro e os baços foram recolhidos para os testes ELISA e ELISPOTs no dia 21. Dois grupos receberam a proteína no adjuvante Addavax, enquanto os outros dois grupos foram imunizados sem um adjuvante. A proteína IMX744 foi usada como o antígeno de ELISA, e também para estimular as células esplênicas.

[228] Os resultados são mostrados na Tabela 4 abaixo:

[229] Os resultados mostram claramente que o peptídeo carregado positivamente (SEQ ID NO 37), presente apenas na proteína IMX743 -, torna a proteína IMX743 muito mais imunogênica do que de outro lado idêntica proteína IMX744, se um adjuvante é usado ou não. Além disso, o uso de um adjuvante melhora ainda mais a imunogenicidade da coiled-coil contendo antígeno.

13. Modificação do domínio IMX108 de oligomerização murina C4bp

[230] A coiled-coil da proteína de fusão DsbA- IMX108, descrita na referência 16, foi modificada para se determinar se a mesma também adquiriu propriedades melhoradas conferidas em IMX313. Para modificá-la, o gene DsbA-IMX108 foi amplificado com o oligonucleotídeo IMX212: 5’ GGAGCGACGGCGACGCGGAGActggagctgtagtagttcaacctcc 3’ (SEQ ID NO 65) e T7F, e inserido (29) para o plasmídeo que expressa IMX313T, no lugar de IMX313. A proteína foi purificada por cromatografia de troca iônica, e em seguida sobre uma coluna de heparina-sepharose, a qual foi ligada, ao passo que a construção parental DsbA-IMX108 não o fez.

[231] A sequência IMX108 parental (SEQ ID NO 66) está alinhada aqui com a sequência IMX108T (SEQ ID NO 67); IMX108: EASEDLKPALTGNKTMQYVPNSHDVKMALEIYKLTLEVELLQLQIQKEKHTEAH* IMX108T: EASEDLKPALTGNKTMQYVPNSHDVKMALEIYKLTLEVELLQLQSPRRRRS*

[232] A proteína IMX108 modificada é útil para a imunização de aves domésticas, em que devem ser evitados efeitos auto-imunes potenciais da utilização de proteínas de fusão IMX313 modificadas (16). Outros domínios de oligomerização C4bp de mamíferos (listados na referência 16, e WO 2007/062819) também podem ser modificados tais como aqui descritos para este efeito.

14. Proteínas de fusão que compreendem o N-terminal de hemolisina alfa estafilocócica e proteínas modificadas IMX313

[233] Para demonstrar que a fusão para as proteínas IMX313 modificadas poderiam melhorar a imunogenicidade do domínio N-terminal da alfa-toxina de hemolisina estafilocócica (Hla), o gene da hemolisina truncado foi amplificado a partir do DNA genômico da cepa de Newman e clonado em um vetor de expressão de T7. Os oligonucleotídeos utilizados foram: IMX056: 5’ GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAcatatggcagattctgatattaatattaaaaccgg 3’ (SEQ ID NO 68) e IMX057: 5’ GTTAGCAGCCGGATCAAGCTTATTAatcgattttatatctttctgaagaacgatctgtc 3’ (SEQ ID NO 69).

[234] Para fundir os sessenta e três aminoácidos N-terminais da toxina madura para uma proteína modificada IMX313, IMX313T foi amplificado com os primes: IMX110: 5’ AGAACGAAAGGTACCATTGCTGGATCCAAGAAGCAAGGTGATGCT 3’ (SEQ ID NO 70) e IMX139: 5 'GGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGC 3' (SEQ ID NO 44) a partir do plasmídeo de expressão IMX313T e o produto de PCR foi utilizado para truncar ainda o gene da toxina Hla, enquanto fundindo o aminoácido 63 para o gene IMX313 modificado. O plasmídeo resultante expressa a proteína de fusão, denominada Hla63-IMX313T, que tem a seguinte sequência de proteína: ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLV IRTKGTIAGSKKQGDADVCGEVAYIQSVVSDCHVPTAELRTLLEIRKLFLEIQKLKVEL QSPRRRRS (SEQ ID NO 71) e é codificada pela sequência de nucleotídeos seguinte: ATGGCAGATTCTGATATTAATATTAAAACCGGTACTACAGATATTGGAAGCAAT ACTACAGTAAAAACAGGTGATTTAGTCACTTATGATAAAGAAAATGGCATGCACAAAAA AGTATTTTATAGTTTTATCGATGATAAAAAT CATAATAAAAAACTGCTAGTTATTAGAA CGAAAGGTACCATTGCTGGATCCAAGAAGCAAGGTGATGCTGATGTGTGCGGAGAGGTT GCTTATATTCAGAGCGTCGTCTCCGATTGCCACGTGCCTACAGCGGAACTGCGTACTCT GCTGGAAATACGAAAACTCTTCCTGGAGATTCAAAAACTGAAGGTGGAACTGCAGTCTC CGCGTCGCCGTCGCTCCTAA (SEQ ID NO 72).

[235] Para produzir esta proteína, uma cultura de 500 ml da cepa C43 (DE3) foi induzida com 1 mM de IPTG, e cresceu durante a noite. As bactérias lisadas foram colhidas por sonicação, e a proteína insolúvel foi ressuspensa em Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM e ureia 6 M (tampão A). Esta foi carregada em uma coluna Hi-Trap SP FF, e eluída com Tampão A contendo 1 M de NaCl. A proteína parcialmente purificada foi dialisada contra o tampão de 50 mM de Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl e carregada em uma coluna de Heparina-sepharose, a partir da qual foi eluída com um gradiente de NaCl (50 mM Tris pH 7,5, 1 M NaCl). A proteína eluída foi dialisada contra PBS e ainda purificada por filtração em gel.

[236] O fragmento N-terminal (IMX313T falta) foi modificado através da clonagem de um marcador 6 His no terminal C, e purificado por cromatografia de afinidade ao níquel IMAC e filtração em gel.

[237] Ambas as proteínas purificadas foram então usadas para imunizar os camundongos, na presença e na ausência de um adjuvante.

[238] Quatro grupos de cinco camundongos fêmea BALB/c, com 5 a 6 semanas foram imunizados com 5 mmol de ou a proteína Hla63 ou o mesmo antígeno fundido com IMX313T nos dias 0 e 14. No dia 28, o soro e os baços foram recolhidos para os testes de ELISA e ELISPOTs. A proteína de 63 Hla 6 His foi usada como antígeno de ELISA, e também para estimular as células esplênicas.

[239] Os resultados são mostrados na Tabela 5:

[240] Os resultados mostram claramente que a extremidade N-terminal da hemolisina alfa (HLA) é mais imunogênico quando fundida com a proteína IMX313T, se um adjuvante é usado ou não.

15. Comprimento Completo da Proteína A Estafilocócica fundida com proteínas modificadas IMX313

[241] Para determinar se IMX313T e IMX313P poderiam melhorar a imunogenicidade do antígeno da proteína A de comprimento completo estafilocócica (SpA), um gene sintético que codifica os cinco domínios homólogos (mutados, tal como descrito na referência 44) foi clonado como um fragmento de Nde I-Hind III em um vetor de expressão T7. A sequência de nucleotídeos foi como se segue: CATATGGCGCAACACGATGAAGCTCAAGCGAATGCATTCTACCAGGTTCTGAAC ATGCCGAATTTGAATGCGGACCAACGTAATGGCTTTATTCAATCCCTGAAGGACGCACC GTCCCAAAGCGCAAACGTTCTGGGTGAAGCGCAAAAACTGAATGATAGCCAGGCCCCGA AAGCCGATGCCCAGCAGAACAAGTTCAATAAGGATCAGGCCTCTGCGTTCTATGAGATT TTGAATATGCCGAACTTGAATGAGGAGCAACGCAACGGCTTTATCCAAAGCCTGAAAGA TGCACCAAGCCAAAGCACGAACGTCCTGGGTGAGGCAAAGAAACTGAACGAGAGCCAGG CGCCGAAAGCGGACAACAATTTCAATAAAGAGCAAGCGAACGCCTTTTACGAAATTCTG AATATGCCTAACCTGAACGAAGAACAACGTAACGGCTTCATCCAGAGCTTGAAGGACGC GCCGTCGCAAAGCGCGAATCTGCTGGCCGAGGCGAAAAAGCTGAATGAGAGCCAAGCGC CGAAGGCGGACAATAAGTTTAACAAAGAACAGGCGAACGCATTCTATGAAATCCTGCAT CTGCCGAATCTGAATGAAGAACAGCGCAATGGTTTTATCCAGAGCCTGAAGGATGCGCC AAGCCAGAGCGCAAACCTGTTGGCTGAGGCCAAGAAGCTGAACGATGCGCAGGCTCCGA AAGCTGACAACAAATTCAACAAAGAGCAGGCCAACGCTTTTTACGAGATTCTGCACTTG CCGAACCTGACCGAAGAACAGCGTAATGGTTTCATCCAGTCTCTGAAAGACGCACCGAG CGTGAGCAAAGAGATTCTGGCAGAGGCGAAGAAGTTGAACGACGCGCAGGCACCGAAAG GATCCCATCACCACCACCATCACTAATAAGCTT (SEQ ID NO 73)

[242] E a sequência da proteína codificada era: MAQHDEAQANAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDAPSQSANVLGEAQKLNDSQ APKADAQQNKFNKDQASAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDAPSQSTNVLGEAKKLNE SQAPKADNNFNKEQANAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDAPSQSANLLAEAKKLNES QAPKADNKFNKEQANAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDAPSQSANLLAEAKKLNDAQ APKADNKFNKEQANAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDAPSVSKEILAEAKKLNDAQA PKGSHHHHHH* (SEQ ID NO 74)

[243] Para fundir o antígeno para as proteínas IMX313T e IMX313P, o fragmento BamH I-Hind III que codifica o marcador His de C-terminal His foi substituído por fragmentos BamHI-Hind III que codificam as 313 proteínas.

[244] As proteínas foram purificadas como se segue: SPA-6His foi produzida na cepa BLR bacteriana, e o pellet bacteriano foi lisada em tampão A (1xPBS, 1M NaCl, 20 mM de imidazol, 1 mM de PMSF), o lisado bacteriano foi aquecido a 75°C durante 15 minutos, e depois clarificado por centrifugação antes de ser carregado em uma coluna de afinidade ao níquel IMAC. A proteína foi eluída com um gradiente de Imidazol em tampão B (1xPBS, 500 mM de imidazol). A proteína foi ainda purificada por filtração em gel.

[245] SpA-IMX313T e SpA-IMX313P também foram expressos na cepa BLR, e os lisados bacterianos foram aquecidos a 75°C durante 15 minutos, e clarificados por centrifugação. Ambas as proteínas foram então purificadas sobre uma coluna de troca iônica SP, e, em seguida, sobre uma coluna de Sefarose de heparina.

[246] Estas três proteínas foram utilizadas para imunizar seis grupos de camundongos fêmea Balb/c de 5 a 6 semanas de idade nos dias 0 e 14. 5 mmoles de cada proteína foi usada por imunização, com ou sem o adjuvante AddaVax. No dia 28, o soro e os baços foram recolhidos para os testes de ELISA e ELISPOTs. A proteína SpA-6His foi utilizada como o antígeno ELISA, e também para estimular as células esplênicas.

[247] Os resultados são apresentados na tabela 6 abaixo. O antígeno SpA fundido com IMX313T ou P é claramente mais imunogênico do que o antígeno não fundido, e a versão IMX313P é ligeiramente mais imunogênica do que a versão IMX313T. Tabela 6

16. As proteínas de fusão de proteínas ClfB e IMX313 modificadas

[248] Para melhorar a imunogenicidade do antígeno ClfB estafilocócico, o domínio N2N3 foi amplificado com os seguintes oligos: IMX239: 5’ CATCATCATCATCATCACggtGCTGAACCGGTAGTAAATGCTGCTGATGCTAAAGG 3’ (SEQ ID NO 75) e IMX240: 5’ ccccaaggggttatgctagttaATTTACTGCTGAATCACCATCagcacttccaccacc 3’ (SEQ ID NO 76) e o produto de PCR foi clonado em um vetor de expressão T7 com um marcador His de N-terminal (27).

[249] A sequência de nucleotídeos do fragmento N2N3 é: ATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATCATCATGGTgctgaaccggtagta aatgctgctgatgctaaaggtacaaatgtaaatgataaagttacggcaagtaatttcaa gttagaaaagactacatttgaccctaatcaaagtggtaacacatttatggcggcaaatt ttacagtgacagataaagtgaaatcaggggattattttacagcgaagttaccagatagt ttaactggtaatggagacgtggattattctaattcaaataatacgatgccaattgcaga cattaaaagtacgaatggcgatgttgtagctaaagcaacatatgatatcttgactaaga cgtatacatttgtctttacagattatgtaaataataaagaaaatattaacggacaattt tcattacctttatttacagaccgagcaaaggcacctaaatcaggaacatatgatgcgaa tattaatattgcggatgaaatgtttaataataaaattacttataactatagttcgccaa ttgcaggaattgataaaccaaatggcgcgaacatttcttctcaaattattggtgtagat acagcttcaggtcaaaacacatacaagcaaacagtatttgttaaccctaagcaacgagt tttaggtaatacgtgggtgtatattaaaggctaccaagataaaatcgaagaaagtagcg gtaaagtaagtgctacagatacaaaactgagaatttttgaagtgaatgatacatctaaa ttatcagatagctactatgcagatccaaatgactctaaccttaaagaagtaacagacca atttaaaaatagaatctattatgagcatccaaatgtagctagtattaaatttggtgata ttactaaaacatatgtagtattagtagaagggcattacgacaatacaggtaagaactta aaaactcaggttattcaagaaaatgttgatcctgtaacaaatagagactacagtatttt cggttggaataatgagaatgttgtacgttatggtggtggaagtgctgatggtgattcag cagtaaattaa (SEQ ID NO 77) e a sequência de proteínas é: MRGSHHHHHHHHGAEPVVNAADAKGTNVNDKVTASNFKLEKTTFDPNQSGNTFM AANFTVTDKVKSGDYFTAKLPDSLTGNGDVDYSNSNNTMPIADIKSTNGDVVAKATYDI LTKTYTFVFTDYVNNKENINGQFSLPLFTDRAKAPKSGTYDANINIADEMFNNKITYNY SSPIAGIDKPNGANISSQIIGVDTASGQNTYKQTVFVNPKQRVLGNTWVYIKGYQDKIE ESSGKVSATDTKLRIFEVNDTSKLSDSYYADPNDSNLKEVTDQFKNRIYYEHPNVASIK FGDITKTYVVLVEGHYDNTGKNLKTQVIQENVDPVTNRDYSIFGWNNENVVRYGGGSAD GDSAVN* (SEQ ID NO 78)

[250] Subsequentemente, os domínios IMX313T e IMX313P foram amplificados com os oligonucleotídeos: IMX248: 5’ gctgatggtgattcagcagtaaatggatccaagaagcaaggtgatgctgatg 3’ (SEQ ID NO 79) e IMX139 e C-terminal clonado ao domínio N3. Os domínios N2N3 não modificados, e as proteínas de fusão N2N3-IMX313T e IMX313P são expressas como se segue:

[251] 500 ml de culturas da cepa C43 (DE3) foram induzidas com IPTG 1 mM durante a noite e após a indução, os sedimentos bacterianos foram lisadus em tampão A (1xPBS, 1M NaCl, 20 mM de imidazol, 1 mM de PMSF), e depois clarificados por centrifugação antes de serem carregados em uma coluna de afinidade ao níquel IMAC. A proteína foi eluída com uma gradiente de Imidazol em tampão B (1xPBS, 500 mM de imidazol). As proteínas de fusão são posteriormente purificadas por cromatografia de afinidade em heparina-sepharose, seguida de filtração em gel Sefacril S-300 HR, enquanto que a proteína não fundida é ainda purificada por filtração em gel em uma coluna de filtração em gel S-75.

17. PROTEÍNAS DE FUSÃO DE SORTASE A E PROTEÍNAS IMX313 MODIFICADAS

[252] Para melhorar a imunogenicidade da protease estafilocócica conhecida como sortase A, ou SrtA, uma versão inativada foi clonada em quadro para IMX313, IMX313T e IMX313P como se segue: o gene de tipo selvagem da sortase A foi amplificado a partir de DNA genômico cepa Newman com os oligonucleotídeos: IMX005 5’ GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATatgCAAGCTAAACCTCAAATTCC 3’ (SEQ ID NO 80) e IMX1275 5’ GTTAGCAGCCGGATCAAGCTTATTATTTGACTTCTGTAGCTACAA 3’ (SEQ ID NO 81) e clonado em um vetor de expressão T7. O resíduo de cisteína do sítio ativo foi então mutado para serina com o oligonucleotídeo IMX215: 5’ GATAAACAATTAACATTAATTACTTCTGATGATTACAATGAAAAGACAGGCG 3’ (SEQ ID N0 82).

[253] Os genes IMX313, 313T e 313P foram depois amplificados com os oligonucleotídeos IMX006: 5’ TTGTAGCTACAGAAGTCAAAAAGAAGCAAGGTGATGCTGATG 3’ (SEQ ID NO 83) e IMX139: 5 'GGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGC 3' (SEQ ID NO 44) dos respectivos vetores de expressão, e inseridos em quadro com o gene da protease inativado (29).

[254] As proteínas de fusão IMX313T e IMX313P foram purificadas por troca iônica em uma coluna de SP, e, em seguida, em uma coluna de Heparina-sepharose.

18. IMUNIZAÇÃO DE CP15 DNA

[255] Para determinar se as proteínas IMX313 modificadas podem melhorar ainda mais a imunogenicidade do antígeno criptosporídico CP15 para além da melhoria obtida usando-se IMX313, três plasmídeos concebidos para expressar CP15, CP15-IMX313 e IMX313T em Escherichia coli foram utilizados para preparar vetores pcDNA3 como vacinas de DNA. Os primers utilizados para amplificar os três genes dos vetores de expressão T7 para inserção em pcDNA3 a jusante do peptídeo de sinal de tPA foram: IMX092: 5’ ggaaatccatgcccgattcagaaga GCGCGTGTTCTGATCAAAGAGAAGC 3’ (SEQ ID NO 84) e IMX093: 5’ gccagtgtgatggatggcggtagttattgctcagcggtgg 3’ (SEQ ID NO 85).

[256] Os três produtos de PCR foram inseridos separadamente em um vetor pcDNA3, que continha um peptídeo sinal N-terminal de tPA.

[257] As três sequências de codificação foram: Para CP15: ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTC TTCGTTTCGCCCAGCCAggaaatccatgcccgattcagaagaGCGCGTGTTCTGATCAA AGAGAAGCAGAATATGGGCAATCTCAAAAGCTGTTGTTCCTTTGCTGACGAACACTCAT TGACCAGCACTCAACTGGTTGTAGGAAATGGCTCTGGTGCCTCTGAAACCGCAAGCAAT CATCCACAGGAAGAAGTGAACGACATTAACACGTTTAACGTGAAACTGATCATGCAAGA TCGCTCCAAACTGGATTGTGAGGTCGTCTTTGACAGTACCAGCATCAGTCTGAGTGGTG ATGGCAAATGCCGCAATATCGCGTTAGACGAGATTCACCAGCTTCTGTATTCGAAGGAG GAATTAAGCCGTGTGGAATCTTCAGCTGGGATTTCCGATAGCGATAACTGCGTAGCCAT TCACCTGAAAGAATCGGGTAACTGCATTCCGTTGTTCTTCAACAATTCGCAGGATAAAG AACGCTTTGTGGCAACAGCGAATAAGTTCAAACCGAACTTTAACCATCATCACCATCAT CATTAA (SEQ ID NO 86)

[258] Para CP15-IMX313: ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTC TTCGTTTCGCCCAGCCAggaaatccatgcccgattcagaagaGCGCGTGTTCTGATCAA AGAGAAGCAGAATATGGGCAATCTCAAAAGCTGTTGTTCCTTTGCTGACGAACACTCAT TGACCAGCACTCAACTGGTTGTAGGAAATGGCTCTGGTGCCTCTGAAACCGCAAGCAAT CATCCACAGGAAGAAGTGAACGACATTAACACGTTTAACGTGAAACTGATCATGCAAGA TCGCTCCAAACTGGATTGTGAGGTCGTCTTTGACAGTACCAGCATCAGTCTGAGTGGTG ATGGCAAATGCCGCAATATCGCGTTAGACGAGATTCACCAGCTTCTGTATTCGAAGGAG GAATTAAGCCGTGTGGAATCTTCAGCTGGGATTTCCGATAGCGATAACTGCGTAGCCAT TCACCTGAAAGAATCGGGTAACTGCATTCCGTTGTTCTTCAACAATTCGCAGGATAAAG AACGCTTTGTGGCAACAGCGAATAAGTTCAAACCGAACTTTAACGGATCCAAGAAGCAA GGTGATGCTGATGTGTGCGGAGAGGTTGCTTATATTCAGAGCGTCGTCTCCGATTGCCA CGTGCCTACAGCGGAACTGCGTACTCTGCTGGAAATACGAAAACTCTTCCTGGAGATTC AAAAACTGAAGGTGCACCATCACCATTAA (SEQ ID NO 87)

[259] E para CP15-IMX313T: ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTC TTCGTTTCGCCCAGCCAggaaatccatgcccgattcagaagaGCGCGTGTTCTGATCAA AGAGAAGCAGAATATGGGCAATCTCAAAAGCTGTTGTTCCTTTGCTGACGAACACTCAT TGACCAGCACTCAACTGGTTGTAGGAAATGGCTCTGGTGCCTCTGAAACCGCAAGCAAT CATCCACAGGAAGAAGTGAACGACATTAACACGTTTAACGTGAAACTGATCATGCAAGA TCGCTCCAAACTGGATTGTGAGGTCGTCTTTGACAGTACCAGCATCAGTCTGAGTGGTG ATGGCAAATGCCGCAATATCGCGTTAGACGAGATTCACCAGCTTCTGTATTCGAAGGAG GAATTAAGCCGTGTGGAATCTTCAGCTGGGATTTCCGATAGCGATAACTGCGTAGCCAT TCACCTGAAAGAATCGGGTAACTGCATTCCGTTGTTCTTCAACAATTCGCAGGATAAAG AACGCTTTGTGGCAACAGCGAATAAGTTCAAACCGAACTTTAACGGATCCAAGAAGCAA GGTGATGCTGATGTGTGCGGAGAGGTTGCTTATATTCAGAGCGTCGTCTCCGATTGCCA CGTGCCTACAGCGGAACTGCGTACTCTGCTGGAAATACGAAAACTCTTCCTGGAGATTC AAAAACTGAAGGTGGAACTGCAGTCTCCGCGTCGCCGTCGCTCCTAA (SEQ ID NO 88)

[260] O vetor pcDNA3 sem inserção foi usado como um plasmídeo de controle. Estes quatro plasmídeos foram utilizados para imunizar quatro grupos de c camundongos fêmea Balb/c de 5 a 6 semanas de idade nos dias 0 e 14. Vinte e cinco microgramas de cada plasmídeo foram injetados por via intramuscular, por cada imunização. No dia 28, o soro e os baços foram recolhidos para os testes de ELISA e ELISPOTs. A proteína Cp15-6His, purificada a partir de Escherichia coli foi usada como o antígeno de ELISA, e também para estimular as células esplênicas.

[261] Os resultados dos testes ELISA e ELISPOTs são mostrados na Tabela 7, abaixo.

[262] Estes resultados mostram que IMX313 melhora ambos os títulos de anticorpos e respostas de interferón y para o antígeno CP15, mas essas respostas são melhoradas pelo uso de IMX313T, em vez de IMX313.

19. A imunização com auto-antígenos e proteínas e fusão IMX313 modificadas: GnRH-IMX313T

[263] Para melhorar ainda mais a resposta de anticorpos induzida pelo auto-antígeno GnRH quando fundidos com IMX313, a proteína GnRH-IMX313T foi preparada. A sequência de codificação da proteína foi: ATGGAACATTGGAGCTATGGCCTGCGTCCGGGCGGATCCAAGAAGCAAGGTGAT GCTGATGTGTGCGGAGAGGTTGCTTATATTCAGAGCGTCGTCTCCGATTGCCACGTGCC TACAGCGGAACTGCGTACTCTGCTGGAAATACGAAAACTCTTCCTGGAGATTCAAAAAC TGAAGGTGGAACTGCAGTCTCCGCGTCGCCGTCGCTCCTAATAA (SEQ ID NO 89) e a sequência da proteína foi: MEHWSYGLRPGGSKKQGDADVCGEVAYIQSVVSDCHVPTAELRTLLEIRKLFLE IQKLKVELQSPRRRRS** (SEQ ID NO 90)

20. A sinergia de adjuvantes com proteínas modificadas IMX313 e antígenos

[264] Para determinar se a imunogenicidade melhorada obtida pela utilização de proteínas IMX313 modificadas pode ser ainda melhorada pela utilização de um adjuvante clássico, e na verdade, pela utilização de dois adjuvantes, as seguintes proteínas foram formuladas: PAm, PAm-IMX313 e PAm-IMX313T (preparadas tal como descrito no Exemplo 6 acima), tal como indicado na coluna “Adjuvante” na tabela abaixo. As proteínas formuladas foram em seguida utilizadas para imunizar sete grupos de camundongos fêmea Balb/c de 5 a 6 semanas de idade nos dias 0 e 14. 5 mmoles de cada proteína foi usado por imunização, com ou sem o adjuvante AddaVax, e com ou sem o ligante de TLR poli I: C. No sétimo grupo, o ligante TLR poli I: C foi formulado com a primeira proteína PAm-IMX313T, e, em seguida, com o adjuvante AddaVax.

[265] No dia 28, o soro e os baços foram recolhidos para os testes de ELISA e ELISPOTs. A proteína PAm foi utilizada como o antígeno ELISA, e também para estimular as células esplênicas.

[266] Os resultados estão tabelados abaixo (Tabela 8).

[267] Claramente, existe uma vantagem de se utilizar um adjuvante com a proteína IMX313 modificada, e a imunogenicidade pode ser ainda melhorada pela utilização de um segundo adjuvante, poli I:C. Referências 1) Odgren PR, Harvie LW Jr, Fey EG. 1996. Ocorrência filogenética de proteínas em dupla espiral: implicações para a estrutura do tecido em metazoan via matriz de tecido dupla espiral. Proteínas 24: 467-484. 2) Rose A , Schraegle SJ, Stahlberg EA, Meier I. 2005. Enrolada-espiral composição de proteína de 22 proteomes - diferenças e temas comuns em infra-estrutura subcelular e controle de tráfego. BMC Evol Biol. 5: 66. 3) Burkhard P, J Stetefeld, Strelkov SV. 2001. Espirais enroladas: um altamente versátil motivo dobramento de proteínas. Trends Cell Biol. 11: 82-88. 4) Tavano R, Capecchi B, Montanari P, Franzoso S, Marin O, Sztukowska M, Cecchini P, Segat D, Scarselli M, Aricò B, Papini E. 2011. 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Referências de Patentes WO 2007/062819 WO 2007/100908 WO 2011/045612 WO 2008/122817

Claims

1. Proteína modificada caracterizada pelo fato de que compreende (i) uma proteína possuindo um domínio coiled-coil e (ii) pelo menos um peptídeo carregado positivamente ligado ao domínio coiled-coil, o peptídeo carregado positivamente possuindo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências representadas em SEQ ID NO 2 (SPRRRRS) ou SEQ ID NO 36 (GRRRRRS), a referida proteína modificada compreendendo os polipeptídeos possuindo a sequência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 42 ou SEQ ID NO 67.

2. Proteína modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína possuindo o domínio coiled-coil é um antígeno.

3. Proteína modificada, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em: proteína de hemaglutinina da influenza HA2, a glicoproteína F do vírus sincicial respiratório, as glicoproteínas gp41 de HIV-1, as glicoproteínas gp41 de HIV-2, gp1, 2 de Ebolavírus, NadA de Neisseria meningitidis, YadA de Yersinia enterocolitica, UspA2 de Moraxella catarrhalis, BadA de Bartonella henselae e HadA de Haemophilus influenza.

4. Proteína de fusão caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína transportadora modificada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e um ou mais antígenos.

5. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em proteína A de Staphylococcus aureus, o antígeno microbacteriano 85A e o antígeno da nucleoproteína da influenza.

6. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais antígenos de estafilococos fundidos com uma proteína modificada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

7. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que os referidos um ou mais antígenos de estafilococos são selecionados a partir do grupo que consiste em SpA, Hla, ClfB e sortase A.

8. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais antígenos da influenza, tal como nucleoproteína da influenza, fundidos com proteínas modificadas conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

9. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais auto-antígenos, tais como GnRH, fundidos a uma proteína modificada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

10. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que compreende um antígeno fundido a uma proteína modificada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

11. Composição imunogênica caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína modificada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou uma proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 10, e os ligantes de ácidos nucleicos para TLRs intracelulares.

12. Método para aumentar a imunogenicidade de um antígeno compreendendo um domínio coiled-coil ou uma proteína transportadora compreendendo um domínio coiled- coil caracterizado pelo fato de que compreende a ligação de pelo menos um peptídeo carregado positivamente ao domínio coiled-coil, o peptídeo carregado positivamente possuindo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências representadas em SEQ ID NO 2 (SPRRRRS) ou SEQ ID NO 36 (GRRRRRS), e em que a referida proteína transportadora possui a sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 42 ou SEQ ID NO 67.

13. Método para aumentar a imunogenicidade de um antígeno, em particular a imunogenicidade de Th1, caracterizado pelo fato de que compreende: • preparar uma proteína transportadora modificada conforme o método definido na reivindicação 12; e • associar o referido antígeno à referida proteína transportadora modificada, e aos polímeros carregados negativamente, tais como ligantes de ácidos nucleicos para TLRs intracelulares ou heparina.

14. Moléculas de ácido nucleico caracterizadas pelo fato de que codificam as proteínas modificadas conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou que codificam a proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 10.

15. Composição de vacina caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 14.

16. Uso de uma proteína modificada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou de uma proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 10, ou de uma composição imunogênica conforme definida na reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que é para preparar uma vacina.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a vacina é para o tratamento ou prevenção de infecções, particularmente por Staphylococcus e infecções por influenza.

18. Uso de proteína de fusão conforme definida na reivindicação 4, em que a referida proteína de fusão compreende um antígeno fundido a uma proteína modificada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para preparar uma composição para a imunização de aves.