KR20240051209A - 면역원성 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 면역원성 조성물 및 인간 대상체의 인플루엔자 질병 예방을 위한 백신으로서의 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인플루엔자 질환의 예방 또는 치료가 필요한 인간 대상체의 인플루엔자 질병 예방 또는 치료에서 백신 또는 면역요법으로서 면역원성 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이며, 상기 면역원성 조성물은
(i) 인플루엔자 핵단백질 항원 및,
(ii) C4bp 올리고머화 도메인으로부터 유래된 자가 조립 폴리펩티드 및 양전하를 띤 테일를 포함하는 운반체 단백질을 포함하며, 여기서 상기 융합 단백질의 180μg 이상의 양이 상기 인간 대상체에게 투여된다.
(i) 인플루엔자 핵단백질 항원 및,
(ii) C4bp 올리고머화 도메인으로부터 유래된 자가 조립 폴리펩티드 및 양전하를 띤 테일를 포함하는 운반체 단백질을 포함하며, 여기서 상기 융합 단백질의 180μg 이상의 양이 상기 인간 대상체에게 투여된다.
Description
본 출원은 면역원성 조성물 및 인간 대상의 인플루엔자 질환 예방을 위한 백신으로서의 용도에 관한 것이다.
계절성 인플루엔자는 매년 전 세계적으로 약 300만~500만 건의 중증 질환을 유발하고, 대부분 65세 이상에서 약 29만~65만 명이 사망하는 것으로 추정된다 [Iuliano AD, et al. Lancet. 2018; 391:1285-1300].
인플루엔자 예방을 위한 가장 효과적인 방법은 매년 백신을 접종하는 것이다. 미국 일반 인구의 계절성 3가 또는 4가 인플루엔자 백신 효과는 지난 10년간 평균 42%(노인의 경우 32%)에 그쳤다 [CDC - 지난 계절 백신 효과 추정치. 출처: https://www.cdc.gov/flu/vaccines-work/past-seasons-estimates.html. 2021년 5월 21일 액세스]. 유럽에서도 비슷한 데이터가 있다 [Krammer F, et al. Influ Respir Viruses. 2020; 14:237-24]. 2014-2015 시즌과 같이 순환하는 바이러스가 백신 바이러스와 일치하지 않으면 효과가 단지 10-20%로 떨어질 수 있다. 따라서 인플루엔자 백신의 효능을 개선해야 할 의학적 필요성이 있다.
바이러스 표면 혈구응집소(HA)과 뉴라미니다제(NA)에 대한 항체 역치 값은 대부분의 현재 백신 임상시험에서 효능의 대리/상관관계로 인정되지만, 세포 반응, 특히 CD4 및 CD8 매개 반응은 특히 노인 인구에서 백신 방어에 기여할 가능성이 매우 높다 [McElhaney JE, et al. Front Immunol. 2016; 7:41. Trombetta CM, et al. Expert Rev Vaccines. 2016; 15:967-976. Pleguezuelos O, et al. Clin Vaccine Immunol. 2015; 22:949-956; Savic M, et al. Immunology. 2016; 147:165-177].
T-세포 반응을 통해 현재 사용 가능한 인플루엔자 백신을 개선하려는 시도에서 바이러스 핵단백질(NP)이 선택의 대상으로 떠오르고 있다. 이 내부 단백질은 A형 균주뿐만 아니라 A형과 B형 균주 간에도 고도로 보존되어 있으며 바이러스 복제 메커니즘에 구조적, 기능적 지원을 제공한다 [Ye Q, Krug RM, Tao YJ. Nature. 2006; 444:1078-1082]. 인간의 경우, 인플루엔자 예방에서 보존된 내부 항원에 대한 T-세포 면역의 역할에 대한 증거가 증가하고 있다. 2009년 H1N1 대유행 기간 동안 수행된 전향적 코호트 연구에 따르면 보존된 CD8 에피토프에 특이적인 기존 T-세포의 빈도가 덜 심각한 질병을 앓은 개인에서 더 많이 발견되었다 [Sridhar S, et al. Nat Med. 2013; 19:1305-1312]. 독감 감시 코호트 연구에 따르면 내부 바이러스 단백질을 표적으로 하는 기존의 T-세포 반응이 대유행 및 계절성 인플루엔자에 대한 보호 면역을 제공한다고 한다. 바이러스에 노출되기 전에 NP-특이적 T-세포(임계치 20 스팟 형성 단위[SFC]/백만 말초혈액 단핵구[PBMC] 이상)가 있으면 대유행 및 계절성 인플루엔자 기간 동안 증상이 있는 중합효소연쇄반응(PCR) 양성 인플루엔자 A의 발생이 줄어드는 것과 상관관계가 있는 것으로 나타났다 [Hayward AC, et al. Am J Respir Crit Care Med. 2015; 191:1422-1431.] 이러한 결과는 인플루엔자에 대한 NP 기반 백신 개발의 근거를 제공한다.
OVX836(OSIVAX, Lyon, France)은 모든 인플루엔자 균주에 대한 광범위한 스펙트럼 백신으로 개발된 재조합 단백질이다. 항원 부분은 A/WSN/1933(H1N1) 인플루엔자 바이러스의 NP 서열에 해당한다. OVX836 단백질에는 각각 OVX313에 융합된 7개의 NP 카피가 포함되어 있다. OVX313 서열은 인간 C4b 결합 단백질(hC4BP)의 C-말단 올리고머화 도메인에서 유래되었지만[Hofmeyer T, et al. J Mol Biol. 2013 ; 425:1302-1317], 인간 서열과의 상동성을 최소화하도록 변형되었다(하이브리드 치킨 서열, 상동성 20% 미만). 데옥시리보핵산(DNA) 엔지니어링을 통해 항원에 융합되고 단백질이 발현된 후 OVX313은 항원을 헵타머화하여 면역계에 대한 항원의 접근성을 개선하고 체액성 및 세포성 면역 반응을 증가시키는 독특한 특성을 가지고 있다 [Del Campo J., et al. npj Vaccines. 2019; 4:4]. NP는 항원 변이의 영향을 받지 않기 때문에 현재의 계절성 인플루엔자 백신에서 요구되는 것처럼 OVX836을 매년 조정할 필요가 없다. 동물 실험에서는 OVX836이 폐의 - CD8+ T세포를 포함하는- 체액성 및 세포성 면역을 유도뿐만 아니라, 마우스[Del Campo J., et al. npj Vaccines. 2019; 4:4]와 페럿[Del Campo J, et al. Options X Control Influenza - Singapore 2019; Abstract No 10936:456]을 인플루엔자 감염으로부터 보호하는 능력도 입증하였다. 중요한 것은 OVX836이 수십 년 간격으로 분리된 세 가지 다른 인플루엔자 A 아형에 의한 바이러스 감염으로부터 마우스를 보호했으며, 바이러스 부하가 감소했다는 것이다. CD4+ 및 CD8+ T세포 모두 감염된 세포 파괴에 관여할 수 있지만, 최근 마우스를 대상으로 한 OVX836의 비임상 실험에서 가장 효과적인 면역 반응으로 CD8+ T세포를 지지하고 있다 [Del Campo J, et al. Front Immunol. 2021. https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2021.678483/abstract. Accessed 21 May 2021].
OVX836의 안전성과 면역원성을 평가하기 위해 최초의 인간 대상 임상 연구가 수행되었다.
OVX836 융합 단백질 또는 이들의 기능적 변이체를 포함하는 면역원성 조성물의 투여 요법 및 제형을 더욱 개선할 필요가 있다.
본 개시의 일 양태는 인플루엔자 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 백신 또는 면역 요법으로 사용하기 위한 면역원성 조성물에 관한 것으로,
상기 면역원성 조성물은
(i) 인플루엔자 핵단백질 항원 및,
(ii) C4bp 올리고머화 도메인로부터 유래된 자가 조립 폴리펩티드 및 양전하를 띤 테일을 포함하는 운반체 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하며.
상기 융합 단백질의 180㎍ 이상의 양, 예를 들어 180㎍ 내지 1000㎍으로 구성된 양을 상기 인간 대상체에 투여된다.
본 개시의 또 다른 양태는 특히 인플루엔자 질환이 필요한 인간 대상체의 인플루엔자 질환 예방 또는 치료에서 백신 또는 면역요법으로 사용하기 위한 300 μg/mL 이상의 농도로 상기 정의된 융합 단백질, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
도 1: 백신 접종 전 기준선(1일차)에 4개 치료 그룹에서 NP 특이적 IFNγ 스팟 형성 T 세포 수(SFC/백만 PBMC)의 평균, 중앙값 및 SD.
도 2: 백신 접종 후 8일째에 4개 치료 그룹에서 NP-특이적 IFNγ 스팟 형성 T세포 수(SFC/백만 PBMC)의 평균, 중앙값 및 SD.
도 3: 백신 접종 후 36일째(즉, 2차 접종 후 8일째)에 4개 치료 그룹에서 각 시점의 NP 특이적 IFNγ 스팟 형성 T세포 수(SFC/백만 PBMC)의 평균, 중앙값 및 SD.
도 4: 기준선(1일차, 백신 접종 전)부터 150일차(2차 접종 후 4개월)까지 풀링된 플라시보와 3개의 OVX836 백신 접종 그룹(30μg, 90μg, 180μg)에서의 NP 특이적 IFN-γ 스팟 형성 T세포(SFC)/106 세포 수의 시간 경과에 따른 변화. 결과는 산술 평균 ± 표준 오차로 표시된다. *p<0.05, ** p<0.01, Kruskal-Wallis 검정이 유의할 때 Dwass, Steel, Critchlow-Fligner의 사후검정은 플라시보 대비로 수행되었다.
도 5: 패널 A. 플라시보 풀과 3개의 OVX836 백신 접종 그룹(30μg, 90μg 및 180μg)의 기준선(1일차), 및 1차(8일차) 및 2차(36일차) 투여 8일 후에 NP 특이적 IFN-γ 스팟 형성 세포(SFC)/106 세포의 수. * p<0.05, ** p<0.01, Dwass, Steel, Critchlow-Fligner 테스트. D1 = 백신 접종 전 기준선, D8 = 1차 접종 후 8일, D36 = 2차 접종 후 8일.
패널 B. 8일차에 각 그룹의 SFC/106 세포 수. * p<0.05, ** p<0.01, Kruskal-Wallis 검정이 유의미할 때 Dwass, Steel, Critchlow-Fligner의 사후 검정(p=0.002). 두 패널 모두에서 결과는 중앙값(박스의 가로 막대), 사분위간 간격(박스의 끝) 및 최소값과 최대값(하단 및 상단 오차 막대)을 보여주는 박스형 플롯으로 표시된다.
도 6: 패널 A. 플라시보 풀과 3개의 OVX836 백신 접종 그룹(30μg, 90μg 및 180μg)의 기준선(백신 접종 1일차)부터 150일차(2차 투여 후 4개월)까지 NP 특이적 면역글로불린 G(IgG) 기하 평균 역가(GMT ± 95% 신뢰 구간[CI])의 시간 경과에 따른 변화 추이. * p<0.05; ** p<0.01 Dwass, Steel, Critchlow-Fligner의 사후 테스트는 Kruskal-Wallis 테스트와 마찬가지로 유의미하였다.
패널 B. 플라시보 풀과 3개의 OVX836 백신 접종 그룹(30μg, 90μg 및 180μg)의 기준선과 29일차 사이에 NP 특이적 IgG 역가가 4배 증가한 대상체의 백분율. * p<0.05; *** p<0.001 Fisher의 정확한 테스트.
도 7: OVX836 180μg 그룹에서 2명의 이상치 대상자(1일차에 높은 기준 값을 나타내는 대상자 128-095 및 232-365: 각각 957 및 1630)를 제거한 후 통합된 연령층 (ITT(치료 의도) 코호트에서 3개 치료 그룹의 각 1일 및 8일에 NP-특이적 IFNγ 스팟 형성 T 세포(SFC/백만 PBMC)의 평균 수.
도 8: 3개 치료 그룹의 기준선(1일), 8일, 29일 및 180일에 통합된 연령층(프로토콜에 따라 29일(PP-D29)) 코호트)에서 IFNγ에 대해 양성인 NP-특이적 CD4+ T 세포의 백분율.
도 9: 독감 시즌(2019년 12월 02일~2020년 3월 09일) 동안 백신 접종과 ILI 시작일 사이의 시간에 따른 비특이적 ILI의 누적 위험도 - ITT(Intent-To-Treat Cohort).
도 10: 독감 시즌(2019년 12월 02일~2020년 3월 09일) 동안 백신 접종과 ILI 시작일 사이의 시간에 따른 백신 접종 후 14일부터 발생한 비특이적 ILI의 누적 위험도 - ITT(Intent-To-Treat Cohort).
도 11: 독감 시즌(3월 9일 이전) 및 백신 접종 후 14일 이상 경과한 ILI 발생 건수 - ITT(Intent-To-Treat Cohort).
도 12: 기준선에서 CD8+ 반응의 최하위 사분위수에 속하는 대상체의 1일차 및 8일차에 최소 IFNγ에 양성 반응을 보인 NP 특이적 CD8+ T 세포의 중앙값 백분율.
도 13: 플라시보 및 3개의 OVX836 백신 그룹(180 μg, 300 μg 및 480 μg)에서 기준선(백신 접종 1일차)부터 29일차(면역화 후 1개월)까지 NP-특이적 면역글로불린 G(IgG) 기하 평균 역가(GMT)의 시간 경과에 따른 변화 *** p<0.001 플라시보와 비교하여 유의미함; Anova 테스트로서 post-hoc Bonferroni’s intergroup pairwise 비교는 유의미하였다.
도 14: 패널 A: 플라시보 그룹 및 3개의 OVX836 백신 그룹(180μg, 300μg 및 480μg)에 대해 8일차 대 1일차에 IFNγ ELISpot으로 평가한 NP 특이적 총 T 세포 반응의 평균 변화 - 통계: 그룹 간 ANOVA 테스트가 유의미하다는 확인 후 pairwise Fisher's LSD 비교 (p<0.05); 에러 막대는 표준 오차를 나타낸다. - 패널 B: 플라시보 그룹 및 3개의 OVX836 백신 그룹(180μg, 300μg 및 480μg)에 대한 8일 대 1일에 IFNγ에 대해 양성인 NP-특이적 CD4+ T 세포의 백분율 평균 변화 - 통계: 그룹 간 ANOVA 테스트가 유의미하다는 확인 후 pairwise Fisher's LSD 비교 (p<0.05); 에러 막대는 표준 에러를 나타낸다. 패널 C: 플라시보 그룹과 3개의 OVX836 백신 그룹(180μg, 300μg 및 480μg)에 대한 8일차 대 1일차에 최소 IFNγ에 대해 양성인 NP-특이적 CD8+ T 세포의 백분율 평균 변화 - 통계: 그룹 간 ANOVA 테스트가 유의미하다는 확인 후 pairwise Fisher's LSD 비교 (p<0.05); 에러 막대는 표준 에러를 나타낸다.
도 15: PCR로 확인된 ILI의 누적 위험 - OVX836-003 연구의 OVX836 그룹 풀(180μg, 300μg 및 480μg)과 무치료 풀(FLU-001 연구) 및 플라시보 그룹(OVX836-003 연구)에 대한 ITT - OVX836 및 FLU-001 연구의 통합된 코호트에 대한 치료 의도 시험.
도 2: 백신 접종 후 8일째에 4개 치료 그룹에서 NP-특이적 IFNγ 스팟 형성 T세포 수(SFC/백만 PBMC)의 평균, 중앙값 및 SD.
도 3: 백신 접종 후 36일째(즉, 2차 접종 후 8일째)에 4개 치료 그룹에서 각 시점의 NP 특이적 IFNγ 스팟 형성 T세포 수(SFC/백만 PBMC)의 평균, 중앙값 및 SD.
도 4: 기준선(1일차, 백신 접종 전)부터 150일차(2차 접종 후 4개월)까지 풀링된 플라시보와 3개의 OVX836 백신 접종 그룹(30μg, 90μg, 180μg)에서의 NP 특이적 IFN-γ 스팟 형성 T세포(SFC)/106 세포 수의 시간 경과에 따른 변화. 결과는 산술 평균 ± 표준 오차로 표시된다. *p<0.05, ** p<0.01, Kruskal-Wallis 검정이 유의할 때 Dwass, Steel, Critchlow-Fligner의 사후검정은 플라시보 대비로 수행되었다.
도 5: 패널 A. 플라시보 풀과 3개의 OVX836 백신 접종 그룹(30μg, 90μg 및 180μg)의 기준선(1일차), 및 1차(8일차) 및 2차(36일차) 투여 8일 후에 NP 특이적 IFN-γ 스팟 형성 세포(SFC)/106 세포의 수. * p<0.05, ** p<0.01, Dwass, Steel, Critchlow-Fligner 테스트. D1 = 백신 접종 전 기준선, D8 = 1차 접종 후 8일, D36 = 2차 접종 후 8일.
패널 B. 8일차에 각 그룹의 SFC/106 세포 수. * p<0.05, ** p<0.01, Kruskal-Wallis 검정이 유의미할 때 Dwass, Steel, Critchlow-Fligner의 사후 검정(p=0.002). 두 패널 모두에서 결과는 중앙값(박스의 가로 막대), 사분위간 간격(박스의 끝) 및 최소값과 최대값(하단 및 상단 오차 막대)을 보여주는 박스형 플롯으로 표시된다.
도 6: 패널 A. 플라시보 풀과 3개의 OVX836 백신 접종 그룹(30μg, 90μg 및 180μg)의 기준선(백신 접종 1일차)부터 150일차(2차 투여 후 4개월)까지 NP 특이적 면역글로불린 G(IgG) 기하 평균 역가(GMT ± 95% 신뢰 구간[CI])의 시간 경과에 따른 변화 추이. * p<0.05; ** p<0.01 Dwass, Steel, Critchlow-Fligner의 사후 테스트는 Kruskal-Wallis 테스트와 마찬가지로 유의미하였다.
패널 B. 플라시보 풀과 3개의 OVX836 백신 접종 그룹(30μg, 90μg 및 180μg)의 기준선과 29일차 사이에 NP 특이적 IgG 역가가 4배 증가한 대상체의 백분율. * p<0.05; *** p<0.001 Fisher의 정확한 테스트.
도 7: OVX836 180μg 그룹에서 2명의 이상치 대상자(1일차에 높은 기준 값을 나타내는 대상자 128-095 및 232-365: 각각 957 및 1630)를 제거한 후 통합된 연령층 (ITT(치료 의도) 코호트에서 3개 치료 그룹의 각 1일 및 8일에 NP-특이적 IFNγ 스팟 형성 T 세포(SFC/백만 PBMC)의 평균 수.
도 8: 3개 치료 그룹의 기준선(1일), 8일, 29일 및 180일에 통합된 연령층(프로토콜에 따라 29일(PP-D29)) 코호트)에서 IFNγ에 대해 양성인 NP-특이적 CD4+ T 세포의 백분율.
도 9: 독감 시즌(2019년 12월 02일~2020년 3월 09일) 동안 백신 접종과 ILI 시작일 사이의 시간에 따른 비특이적 ILI의 누적 위험도 - ITT(Intent-To-Treat Cohort).
도 10: 독감 시즌(2019년 12월 02일~2020년 3월 09일) 동안 백신 접종과 ILI 시작일 사이의 시간에 따른 백신 접종 후 14일부터 발생한 비특이적 ILI의 누적 위험도 - ITT(Intent-To-Treat Cohort).
도 11: 독감 시즌(3월 9일 이전) 및 백신 접종 후 14일 이상 경과한 ILI 발생 건수 - ITT(Intent-To-Treat Cohort).
도 12: 기준선에서 CD8+ 반응의 최하위 사분위수에 속하는 대상체의 1일차 및 8일차에 최소 IFNγ에 양성 반응을 보인 NP 특이적 CD8+ T 세포의 중앙값 백분율.
도 13: 플라시보 및 3개의 OVX836 백신 그룹(180 μg, 300 μg 및 480 μg)에서 기준선(백신 접종 1일차)부터 29일차(면역화 후 1개월)까지 NP-특이적 면역글로불린 G(IgG) 기하 평균 역가(GMT)의 시간 경과에 따른 변화 *** p<0.001 플라시보와 비교하여 유의미함; Anova 테스트로서 post-hoc Bonferroni’s intergroup pairwise 비교는 유의미하였다.
도 14: 패널 A: 플라시보 그룹 및 3개의 OVX836 백신 그룹(180μg, 300μg 및 480μg)에 대해 8일차 대 1일차에 IFNγ ELISpot으로 평가한 NP 특이적 총 T 세포 반응의 평균 변화 - 통계: 그룹 간 ANOVA 테스트가 유의미하다는 확인 후 pairwise Fisher's LSD 비교 (p<0.05); 에러 막대는 표준 오차를 나타낸다. - 패널 B: 플라시보 그룹 및 3개의 OVX836 백신 그룹(180μg, 300μg 및 480μg)에 대한 8일 대 1일에 IFNγ에 대해 양성인 NP-특이적 CD4+ T 세포의 백분율 평균 변화 - 통계: 그룹 간 ANOVA 테스트가 유의미하다는 확인 후 pairwise Fisher's LSD 비교 (p<0.05); 에러 막대는 표준 에러를 나타낸다. 패널 C: 플라시보 그룹과 3개의 OVX836 백신 그룹(180μg, 300μg 및 480μg)에 대한 8일차 대 1일차에 최소 IFNγ에 대해 양성인 NP-특이적 CD8+ T 세포의 백분율 평균 변화 - 통계: 그룹 간 ANOVA 테스트가 유의미하다는 확인 후 pairwise Fisher's LSD 비교 (p<0.05); 에러 막대는 표준 에러를 나타낸다.
도 15: PCR로 확인된 ILI의 누적 위험 - OVX836-003 연구의 OVX836 그룹 풀(180μg, 300μg 및 480μg)과 무치료 풀(FLU-001 연구) 및 플라시보 그룹(OVX836-003 연구)에 대한 ITT - OVX836 및 FLU-001 연구의 통합된 코호트에 대한 치료 의도 시험.
정의
본 개시를 보다 쉽게 이해할 수 있도록, 먼저 특정 용어를 정의한다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.
"아미노산"이라는 용어는 자연 발생 및 비자연 발생 아미노산(이하 "비-자연 발생 아미노산"이라고도 함), 예를 들어 자연 발생 아미노산과 유사하게 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩된 아미노산과 나중에 변형된 아미노산(예, 히드록시프롤린, 감마-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린)을 말한다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조(예, 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R기에 결합된 알파 탄소)를 가진 화합물(예, 호모세린, 노루이신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄)을 말한다. 이러한 유사체는 변형된 R기(예, 노루이신) 또는 변형된 펩티드 백본을 가질 수 있지만, 자연적으로 발생하는 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와는 다른 구조를 가지고 있지만 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 기능을 하는 화합물을 말한다. 여기서는 "아미노산"과 "아미노산 잔기"이라는 용어를 혼용하여 사용한다.
치환이란 자연적으로 발생하는 아미노산을 다른 자연적으로 발생하는 아미노산 또는 비자연적인 아미노산으로 대체하는 것을 말한다. 여기에서 사용되는 "단백질"이라는 용어는 하나 이상의 선형 사슬("폴리펩티드"라고도 함)로 배열되고 구형 형태로 접힌 아미노산으로 이루어진 모든 유기 화합물을 의미한다. 여기에는 단백질성 물질 또는 융합 단백질이 포함된다. 이러한 폴리펩티드 사슬의 아미노산은 인접한 아미노산 잔기의 카르복실기와 아미노기 사이의 펩티드 결합에 의해 함께 결합될 수 있다. "단백질"이라는 용어는 펩티드, 단일 사슬 폴리펩티드 또는 주로 두 개 이상의 아미노산 사슬로 구성된 복합 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한 당단백질 또는 기타 알려진 번역 후 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한 글리코엔지니어링, 페길화, 헤실화, 파실화 등과 같은 천연 단백질의 알려진 자연적 또는 인공적 화학적 변형, 비천연 아미노산의 결합, 화학적 접합 또는 기타 분자를 위한 아미노산 변형 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 "재조합 단백질"이라는 용어는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 단백질, 예컨대 해당 단백질을 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 분리된 융합 단백질, 예를 들어 트랜스펙토마 등으로부터 분리된 융합 단백질을 포함한다.
본원에 사용되는 "융합 단백질"이라는 용어는 유전자 융합에 의해 얻어지거나 얻어질 수 있는 적어도 하나의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 재조합 단백질, 예를 들어 서로 다른 단백질의 개별 기능 도메인을 코딩하는 적어도 두 개의 유전자 단편의 유전자 융합에 의해 얻어지거나 얻어질 수 있는 재조합 단백질을 지칭한다. 본 개시의 단백질 융합체는 예를 들어 적어도 인플루엔자 핵단백질 항원 및 적어도 하나의 다른 모이티를 포함하며, 다른 모이티는 아래에 설명된 바와 같이 C4bp 올리고머화 도메인으로부터 유래된 자가조립 폴리펩티드 및 이의 양전하를 띤 테일를 포함하는 운반체 단백질이다.
본원에 사용된 "항원성" 폴리펩티드는 적어도 그러한 항원성 폴리펩티드가 본원에 개시된 운반체 단백질에 융합된 경우 그러한 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응(예, NP 특이 면역 반응)을 유도할 수 있는 특정 폴리펩티드(예, 인플루엔자 바이러스의 핵 단백질 NP)의 면역원성 단편 및 에피토프를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 두 서열 사이의 동일성 백분율은 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 간격(gap) 수 및 각 간격의 길이를 고려하여 두 서열이 공유하는 동일한 위치의 수(즉, 동일성 백분율 = 동일한 위치의 수/총 위치의 수 x 100)의 함수이다. 염기서열 비교와 두 염기서열 간의 동일성 백분율 결정은 아래에 설명된 대로 수학적 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다.
두 아미노산 서열 간의 동일성 비율은 니들만과 분쉬 알고리즘(NEEDLEMAN, 및 Wunsch)을 사용하여 결정할 수 있다.
두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 예를 들어 EMBOSS Needle(pair wise alignment; available at www.ebi.ac.uk, Rice et al 2000 Trends Genet 16 :276-277)과 같은 알고리즘을 사용하여 결정할 수도 있다. 예를 들어, EMBOSS Needle은 BLOSUM62 매트릭스, "갭 오픈 페널티" 10, "갭 연장 페널티" 0.5, 거짓 "엔드 갭 페널티", "엔드 갭 오픈 페널티" 10, "엔드 갭 연장 페널티" 0.5와 함께 사용할 수 있다. 일반적으로 '동일성 백분율'은 일치하는 위치의 수를 비교된 위치의 수로 나눈 후 100을 곱한 값이다. 예를 들어, 정렬 후 비교한 두 시퀀스 위치 중 10개 중 6개가 동일하다면, 동일성은 60%이다. 동일성 %는 일반적으로 분석이 수행되는 쿼리 서열의 전체 길이에 걸쳐 결정된다. 동일한 주 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 가진 두 분자는 화학적 및/또는 생물학적 변형에 관계없이 동일하다.
본원에 사용된 "대상체"라는 용어는 인간 또는 비인간 동물을 모두 포함한다. "비인간 동물"이라는 용어는 바람직하게 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말 등과 같은 포유동물을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드의 "변이체"는 천연 또는 인공 돌연변이체일 수 있으며, 예를 들어 상응하는 천연 폴리펩티드와 비교하여 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 전형적으로 얻어지는 변이체일 수 있다. 특정 실시예에서, 변이체는 모 폴리펩티드와 비교하여 그 서열 전체에 걸쳐 아미노산 결실, 삽입 또는 치환의 조합을 가질 수 있다.
본 개시의 맥락에서, 보존적 치환은 다음과 같이 반영된 아미노산 클래스 내의 치환에 의해 정의될 수 있다:
지방족 잔기 I, L, V, M
시클로알케닐 관련 잔기 F, H, W, Y
소수성 잔기 A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W 및 Y
음전하를 띤 잔기 D 및 E
극성 잔기 C, D, E, H, K, N, Q, R, S, T
양전하를 띤 잔기 H, K, R
작은 잔기 A, C, D, G, N, P, S, T 및 V
매우 작은 잔기 A, G, S
턴 A, C, D, E, G, H, K, N, Q, R, S, P, 및 형성 T에 관여하는 잔기
유연한 잔기 Q, T, K, S, G, P, D, E 및 R
"기능적 변이체"는 천연 폴리펩티드의 관심 특성을 유지하는 변이체이다.
바람직한 실시예에서, 변이체는 천연 폴리펩티드 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 참조 서열과 관련하여 치환, 삽입 및/또는 추가, 결실 및 공유 변형을 포함하는 폴리펩티드, 특히 본원에 개시된 NP 융합 단백질은 본 개시의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 서열 태그 또는 하나 이상의 라이신과 같은 아미노산은 펩티드 서열(예, N-말단 또는 C-말단 끝)에 추가될 수 있다. 시퀀스 태그는 펩티드 검출, 정제 또는 위치 파악에 사용할 수 있다. 라이신은 펩티드 용해도를 높이거나 비오티닐화를 허용하는데 사용할 수 있다. 또는 펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열의 카르복시 및 아미노 말단 영역에 위치한 아미노산 잔기를 선택적으로 삭제하여 서열이 절단되도록 할 수 있다. 특정 아미노산(예, C-말단 잔기 또는 N-말단 잔기)은 예를 들어 용해성 또는 고체 지지체에 연결된 더 큰 서열의 일부로서 서열의 발현과 같이 서열의 용도에 따라 선택적으로 삭제될 수 있다.
인플루엔자 핵단백질 항원
본원에 사용된 "인플루엔자 핵단백질 항원"이라는 용어는 임의의 천연 인플루엔자 핵단백질 또는 이의 항원 변이체를 지칭한다.
천연 인플루엔자 핵단백질은 인플루엔자 바이러스의 세 가지 A형, B형 및 C형 중 임의의 핵단백질, 바람직하게 A형 핵단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵단백질 항원(NP)은 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B의 바이러스 균주 또는 이들의 조합으로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B의 계통은 조류, 돼지, 말, 개, 인간 또는 비인간 영장류와 연관된다. 일부 구현예에서, 바이러스 균주는 H1N1, H3N2, H7N9 및 H10N8로 이루어진 군에서 선택된다.
특정 구현예에서, 인플루엔자 핵단백질 항원은 SEQ ID NO: 1의 폴리펩티드를 포함하는 인플루엔자 바이러스 A, 보다 구체적으로 균주 A/Wilson-Smith/1933 H1N1로부터의 NP 항원이다.
특정 구현예에서, 항원 변이체는 인플루엔자 바이러스 A, B 또는 C의 야생형 핵단백질의 적어도 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 490개의 연속 아미노산 잔기를 갖는 인플루엔자 핵단백질 항원의 단편이며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1로부터 유래된다. 인플루엔자 핵단백질 항원의 단편은 정의상 인플루엔자 바이러스 A, B 또는 C의 전장 야생형 핵단백질보다 적어도 하나의 아미노산이 더 짧다.
특정 구현예에서, 인플루엔자 핵단백질 항원의 항원 변이체는 인플루엔자 바이러스 A, B, 또는 C의 핵단백질의 상응하는 야생형 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성을 갖는 항원 폴리펩티드 변이체이며, 바람직하게는, 인플루엔자 핵단백질 항원의 항원 변이체는 인플루엔자 바이러스 A, B, 또는 C의 핵단백질의 상응하는 야생형 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 인플루엔자 핵단백질 항원의 항원성 변이체는 SEQ ID NO:1에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성을 갖는 항원성 폴리펩티드 변이체이다.
특정 구현예에서, 상기 변이체는 천연 또는 비천연 아미노산, 바람직하게는 천연 아미노산으로 단지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환만을 통해, 특히 SEQ ID NO:1의 천연 인플루엔자 NP 항원과 비교하여 상응하는 인플루엔자 핵단백질 천연 항원과 상이하다. 특정 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:1의 천연 인플루엔자 NP 항원과 비교하여 천연 아미노산으로 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는 돌연변이 변이체이다.
보다 구체적인 구현예에서, 상기 돌연변이 변이체의 아미노산 서열은 대부분 보수적인 아미노산 치환을 통해 천연 인플루엔자 NP 항원과 다를 수 있다; 예를 들어, 변이체의 치환 중 적어도 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1과 같은 적어도 10개는 보존적 아미노산 잔기 치환이다.
보다 보존적 치환기에는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이 포함된다. 소수성/친수성 특성 및 잔기 중량/크기 측면에서 보존성은 임의의 인플루엔자 NP 항원, 일반적으로 SEQ ID NO: 1의 모 폴리펩티드와 비교하여 변이체 돌연변이 폴리펩티드에서 실질적으로 유지될 수도 있다.
특정 구현예에서, 돌연변이 변이체는 위에서 정의한 보존적 아미노산 치환에 의해 다른 천연 아미노산으로 대체된 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기를 제외하고는 SEQ ID NO:1과 동일한 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, NP 항원의 변이체는 예를 들어 www.IEDB.org에서 액세스 가능한 IEDB 데이터베이스(면역 에피토프 데이터베이스)에 기술된 바와 같이 인간 면역계에 의해 인식되는 에피토프에서 SEQ ID NO:1의 모 폴리펩티드와 비교하여 어떠한 돌연변이도 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, NP 항원의 변이체는 균주 A의 NP와 균주 B의 NP 사이의 보존된 아미노산 잔기에서 SEQ ID NO:1의 모 폴리펩티드와 비교하여 어떠한 돌연변이도 포함하지 않는다. 본원에서 사용되는 "보존된 아미노산 잔기"는 BLAST 알고리즘을 사용하는 것과 같은 표준 서열 단백질 정렬을 사용하여 정렬할 때 균주 A의 NP와 균주 B의 NP 사이에서 동일한 아미노산 잔기에 해당한다.
아미노산 잔기 E339 및 R416(N-말단 메티오닌, M1으로 넘버링)은 NP의 자가 조립에 필수적이며, 인플루엔자 A 바이러스의 유전적 다양성에 영향을 받지 않는다. 따라서, 특정 구현예에서, NP 항원의 변이체는 E339 및 R416을 포함한다.
운반체 단백질
본원에 사용된 "운반체 단백질"이라는 용어는 일반적으로 항원이 접합 또는 융합되어 면역원성이 높아지는 단백질을 의미한다. 여기서 이 용어는 특히 항원을 운반하는 단백질의 의미로 사용된다. 단백질의 기능은 그것이 접합되거나 융합된 항원의 면역원성을 증가시키는 것이다.
융합 단백질에 사용되는 운반체 단백질은 C4bp 올리고머화 도메인으로부터 유래한 자가조립 폴리펩티드 및 양전하를 띤 테일로 구성된다. 보체 억제제 C4 결합 단백질(C4bp)은 마우스에서 처음 발견된 풍부한 혈장 단백질이다. 이 단백질의 본래 기능은 보체 활성화의 고전적 경로와 렉틴 경로를 억제하는 것이다. C4bp 알파 사슬 유전자의 마지막 엑손은 보체 제어 단백질 계열에 속하지 않는 단백질의 유일한 도메인을 인코딩한다. 이 비보체 조절 단백질 도메인은 인간에서 57개의 아미노산 잔기와 생쥐에서 54개의 아미노산 잔기를 포함하고 있으며, C4bp의 올리고머화에 필요하면서도 충분하다. 항원에 융합될 때, 상기 자가 조립 폴리펩티드는 또한 결과 융합 단백질의 올리고머화에 필요하고 충분하다는 것이 밝혀졌다.
PCT/IB2004/002717 및 PCT/EP03/08926은 포유동물에서 항원의 면역원성을 증가시키기 위한 포유동물 C4bp 올리고머화 도메인의 사용을 기술하고 있다. WO2007/062819는 닭 종의 C4bp 올리고머화 도메인 및 이의 변이체를 추가로 기술하고 있다. 바람직한 구현예에서, 자가 면역 반응을 최소화하기 위해, 자가 조립 폴리펩티드는 인간 C4bp에 대해 30% 미만, 바람직하게는 20% 미만의 동일성을 갖는다.
특히, 특정 구현예에서, 상기 C4bp 올리고머화 도메인으로부터 유래된 자가-조립 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2를 포함하거나 본질적으로 이로 구성된다.
특정 구현예에서, 자가 조립 폴리펩티드의 기능적 변이체는 SEQ ID NO:2와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는다.
기능적 변이체는 SEQ ID NO:2의 폴리펩티드의 자가 조립 특성을 유지하는 서열번호 2와 비교하여 하나 이상의 아미노산 첨가, 결실 및/또는 치환을 갖는 임의의 변이체를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 변이체는 천연 또는 비천연 아미노산, 바람직하게는 천연 아미노산으로 단지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 통해 SEQ ID NO:2와 상이하다. 특정 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:2와 비교하여 천연 아미노산으로 1, 2 또는 3개의 아미노산이 치환을 갖는 돌연변이 변이체이다.
보다 구체적인 구현예에서, 상기 돌연변이 변이체의 아미노산 서열은 대부분 보존적 아미노산 치환을 통해 SEQ ID NO:2의 자가 조립 폴리펩티드와 다를 수 있으며; 예를 들어 변이체에서 치환 중 적어도 10개, 예를 들어 적어도 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개는 보존적 아미노산 잔기 치환이다.
운반체 단백질은 양전하를 띤 펩티드로 구성된 C-말단 테일을 추가로 포함한다. C-말단 테일은 6~10개의 아미노산으로 구성된 펩티드가 바람직하며, 양전하를 띤 아미노산이 적어도 50%인 것이 바람직하다. 양전하를 띠는 아미노산에는 아르기닌 또는 라이신이 포함된다. 이러한 양전하를 띤 펩티드의 예는 WO2014/090905 및 WO2014/147087에 개시되어 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 양전하를 띤 테일은 서열 ZXBBBBZ(SEQ ID NO:3)를 포함하며, 여기서 (i) Z가 부재하거나 임의의 아미노산이고, (ii) X가 임의의 아미노산이고, (iii) B가 아르기닌 또는 라이신, 바람직하게 상기 양전하를 띤 테일은 SEQ ID NO:4의 서열을 포함하거나 필수적으로 이로 구성된다.
보다 바람직한 구현예에서, 상기 운반체 단백질은 본질적으로 SEQ ID NO:5의 폴리펩티드에 상응하는 OVX313 폴리펩티드로 구성된다.
특정 구현예에서, 상기 운반체 단백질은 SEQ ID NO:5와 적어도 70%, 80%, 또는 더 바람직하게는 적어도 90%의 동일성을 갖는 SEQ ID NO:5의 OVX313 폴리펩티드의 기능적 변이체이다.
다른 구현예에서, 상기 운반체 단백질은 SEQ ID NO:5와 아미노산 치환에 의해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산에 의해서만 다른 SEQ ID NO:5의 OVX313 폴리펩티드의 기능적 변이체이다. 다른 구현예에서, 상기 운반체 단백질은 보존적 아미노산 치환에 의해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산에 의해서만 SEQ ID NO:5와 상이한 SEQ ID NO:5의 OVX313 폴리펩티드의 기능적 변이체이다.
NP 융합 단백질
본 개시에 따른 사용하기 위한 융합 단백질은
(i) 상기 정의된 인플루엔자 핵단백질 항원 및,
(ii) C4bp 올리고머화 도메인으로부터 유래된 자가 조립 폴리펩티드 및 양전하를 띤 테일을 포함하는, 상기 정의된 운반체 단백질을 포함한다.
생선된 핵단백질 항원과 융합 단백질은 읽기 용이하도록 이하에서 "NP 융합 단백질"이라 부른다.
특정 구현예에서, 운반체 단백질은 선택적으로 펩티드 링커를 통해 핵단백질 항원에 C-말단에 융합된다. 펩티드 링커는 융합 단백질에 일반적으로 사용되는 임의의 짧은 펩티드 링커일 수 있다. 바람직한 펩티드 링커는 디펩티드 글리-세린 링커, 예를 들어 디펩티드 gly-ser, gly-ser-ser-ser 또는 (gly-ser-ser-ser)n, 여기서 n은 1에서 4 사이의 정수이다.
특정 구현예에서, 상기 NP 융합 단백질은 자가 조립 후 헵타머 입자를 형성한다.
특정 구현예에서, 상기 NP 융합 단백질은 자가 조립 후에 직경이 15 내지 100 nm인 입자를 형성한다. 상기 입자의 직경은 예를 들어 동적 광산란(DLS)에 의해 측정될 수 있다. DLS는 대략 0.3 nm ~ 10 μm 크기 범위에서 입자의 유체역학적 직경을 측정한다. DLS 측정은 온도와 분산제 점도에 매우 민감하다. 따라서 온도를 25 ℃로 일정하게 유지해야 하며 분산제의 점도를 알아야 한다.
특정 구현예에서, 상기 NP 융합 단백질은 440 내지 2200 kDa의 분자량을 갖는 입자를 형성한다.
보다 바람직한 구현예에서, 상기 NP 융합 단백질은 본질적으로 SEQ ID NO:6의 폴리펩티드에 상응하는 OVX836 폴리펩티드로 구성된다.
특정 구현예에서, 상기 NP 융합 단백질은 SEQ ID NO:6과 적어도 70%, 80%, 또는 보다 바람직하게는 적어도 90% 동일성을 갖는 OVX836 폴리펩티드의 기능적 변이체이다.
다른 구현예에서, 상기 NP 융합 단백질은 아미노산 치환에 의해 단지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산이 SEQ ID NO:6과 다른 SEQ ID NO:6의 OVX836 폴리펩티드의 기능적 변이체이다. 다른 구현예에서, 상기 NP 융합 단백질은 보존적 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:6과 단지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산만 다른 OVX836 폴리펩티드의 기능적 변이체이다.
NP 융합 단백질의 제조 방법
본 개시에 따라 사용하기 위한 NP 융합 단백질은 유전자 코드를 사용하여 뉴클레오티드 서열을 쉽게 도출할 수 있고, 선택적으로 숙주 세포 종에 따른 코돈 편향을 고려하여 상기 NP 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 사용하여 재조합 단백질을 제조하기 위한 임의의 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
NP 융합 단백질을 제조하는데 사용될 수 있는 뉴클레오티드 서열의 예로는 일반적으로 표 2 및 3에 기재된 바와 같은 SEQ ID NO:1-6의 아미노산 서열을 코딩하는 것이다.
핵산 분자는 후자의 서열로부터 유래될 수 있고 원핵 세포, 예를 들어 대장균 박테리아 세포에서 단백질 발현을 위해 최적화될 수 있다.
핵산은 전체 세포, 세포 용해물에 존재할 수 있거나 부분적으로 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태의 핵산일 수 있다. 당분야에 잘 알려진 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 등을 포함한 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물질(예, 다른 세포 핵산 또는 단백질)로부터 정제될 때 "분리"되거나 "실질적으로 순수하게 된다". 본 개시의 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고 인트론 서열을 함유할 수도 있고 함유하지 않을 수도 있다. 일 구현예에서, 핵산은 재조합 플라스미드 벡터와 같은 벡터에 존재할 수 있다.
표준 분자 생물학 기술을 사용하여 핵산을 얻을 수 있다. 일단 핵단백질 항원을 코딩하는 DNA 단편이 얻어지면, 이들 DNA 단편은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작될 수 있다. 이들 조작에서, 예를 들어 핵단백질 항원을 코딩하는 DNA 단편은 또 다른 DNA 분자, 예를 들어 운반체 단백질을 코딩하는 단편 및 임의로 링커에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본 문맥에서 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편이 기능적 방식으로 결합되어, 예를 들어 2개의 DNA 단편에 의해 코딩된 아미노산 서열이 프레임 내(in-frame)에 유지되도록, 또는 단백질이 원하는 프로모터의 제어 하에 발현되도록 하는 것이다.
본 개시에 따라 사용하기 위한 NP 융합 단백질(특히 OVX836)은 예를 들어 당업계에 널리 공지된 바와 같이 재조합 DNA 기술과 유전자 형질감염 방법의 조합을 사용하여 트랜스펙토마에서 생산될 수 있다.
예를 들어, NP 융합 단백질(전형적으로 OVX836), 이의 상응하는 단편을 발현하기 위해, 표준 분자 생물학 또는 생화학 기술(예, DNA 화학적 합성, PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝)을 통해 부분 또는 전체 길이의 재조합 단백질을 코딩하는 DNA를 얻을 수 있다. DNA는 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 발현 벡터에 삽입될 수 있다.
이러한 맥락에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 코딩 폴리펩티드 서열이 벡터 내로 결찰되어 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 재조합 NP 융합 단백질의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 수행한다는 것을 의미하는 것으로 의도됩니다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 양립가능하도록 선택된다. 단백질 코딩 유전자는 표준에 따라 발현 벡터에 삽입된다.
재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 재조합 융합 단백질의 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. NP 융합 단백질 코딩 유전자는 신호 펩티드가 프레임 내에서 재조합 단백질의 아미노 말단에 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 C4bp의 천연 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드(즉, 비-C4bp 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다. 특정 구현예에서, 신호 펩티드는 메티오닌 아미노산이다.
본원에 개시된 재조합 발현 벡터는 NP 융합 단백질 코딩 서열 이외에, 숙주 세포에서 재조합 융합 단백질의 발현을 제어하는 조절 서열을 포함한다. "조절 서열"이라는 용어는 단백질 코딩 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소(예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하도록 의도된다. 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 요인에 따라 달라질 수 있음이 당업자라면 이해할 수 있을 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 조절 서열에는 거대세포바이러스(CMV), 유인원 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스(예, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서와 같이 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소가 포함된다. 대안적으로, 유비퀴틴 프로모터 또는 P-글로빈 프로모터와 같은 비바이러스 조절 서열이 사용될 수 있다. 또한, 조절 요소는 SV40 초기 프로모터의 서열과 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1형의 긴 말단 반복 서열을 포함하는 SRa 프로모터 시스템과 같은 다양한 소스의 서열로 구성된다.
본 개시의 재조합 발현 벡터는 NP 융합 단백질 코딩 서열 및 조절 서열 이외에, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예, 복제 기점) 및 선택가능한 마커 유전자와 같은 추가 서열을 포함할 수 있다. 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다 (예, Axel 등의 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 참조). 예를 들어, 일반적으로 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 선택 가능한 마커 유전자에는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭을 사용하는 dhfr-숙주 세포에서 사용) 및 neo 유전자(G418 선택용)가 포함된다.
NP 융합 단백질의 발현을 위해, 재조합 단백질을 코딩하는 발현 벡터(들)를 표준 기술에 의해 숙주 세포에 형질감염시킨다. 용어 "형질감염(transfection)"의 다양한 형태는 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 도입하기 위해 일반적으로 사용되는 다양한 기술, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄하도록 의도된다. 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 본 개시의 단백질을 발현시키는 것이 이론적으로 가능하다. NP 단백질의 발현은 원핵 세포, 예를 들어 E. coli 숙주 세포에서 수행될 수 있다. 이어서, NP 융합 단백질은 박테리아 세포의 용해 및 표준 정제 절차를 사용한 추가 정제에 의해 회수될 수 있다. 특정 구현예에서, NP 융합 단백질은 DelCampo 2021(Frontiers in Immunology, doi: 10/3389/fimm.2021.678483)에 개시된 방법에 따라 생산된다.
면역원성 조성물
또 다른 양태에서, 본 개시는 조성물, 예를 들어 이전 섹션에 기술된 300 μg/mL 이상의 농도에서의 NP 융합 단백질, 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
면역원성 조성물은 비경구, 비강내, 근육내 또는 피하 투여(예, 근육내 주사에 의함)에 적합한 임의의 수성 비히클을 포함한다. 이는 특히 등장성, 멸균 식염수 용액(인산일나트륨 또는 인산이나트륨, 염화나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 염화마그네슘 등 또는 이러한 염의 혼합물)일 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 NP 융합 단백질은 적어도 400개의 아미노산 잔기, 예를 들어 400 내지 600개의 아미노산 잔기, 예를 들어 540 내지 560개의 아미노산 잔기를 포함하고, 선택적으로 상기 NP 융합 단백질은 본원에 개시된 바와 같이 상기 면역원성 조성물에서 15 내지 100 nm 사이의 직경을 갖는 입자를 형성하고/하거나 440 내지 2200 kDa의 분자량을 갖는다.
예를 들어, 상기 면역원성 조성물은 SEQ ID NO:6(OVX836)의 폴리펩티드 또는 SEQ ID NO:6과 적어도 70%, 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일성을 갖는 변이체를 300μg/mL 이상의 농도로 포함하고, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 제형화되는 수성 조성물이다. 특정 구현예에서, 상기 면역원성 조성물은 버퍼, 염, 삼투질, 항산화제 및 계면활성제 또는 바이알 표면에서의 단백질 손실 및/또는 단백질 응집을 방지하기 위한 기타 제제와 같은 하나 이상의 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
약학적 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 요법은 당연히 치료할 상태, 질병의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 성별 등에 따라 달라진다.
예를 들어, 근육내 투여의 경우, 조성물은 필요하다면 적절하게 완충되어야 하는 수용액이고, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코스를 사용하여 등장성이 되도록 한다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시에 비추어 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1회 복용량은 등장성 NaCl 용액 1ml에 용해될 수 있다. 주사액 제제의 예는 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 23rd Edition, 2020에 제공된다. 치료 대상의 상태에 따라 복용량에 약간의 변화가 발생할 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 조성물의 pH는 6.0 내지 7.0, 바람직하게는 6.3 내지 6.6, 예를 들어 약 6.5이다.
특정 구현예에서, 상기 면역원성 조성물은 300 내지 600 mOsm/kg, 바람직하게는 400 내지 500 mOsm/kg, 예를 들어 약 450 mOsm/kg의 삼투압농도를 갖는다.
특정 구현예에서, 상기 면역원성 조성물은
(i) pH 6.0 내지 7.0, 바람직하게는 6.3 내지 6.6, 예를 들어 약 6.5의 버퍼 및
(ii) 300 내지 600mOsm/kg, 바람직하게는 400 내지 500mOsm/kg, 예를 들어 약 450mOsm/kg의 삼투질농도에 대한 삼투질의 유효량을 갖는다.
pH 6.0과 7.0 사이의 버퍼의 예로는 구연산나트륨 또는 인산나트륨/인산칼륨 버퍼가 포함된다.
특정 구현예에서, 상기 면역원성 조성물은 NP 융합 단백질(전형적으로 OVX836) 외에 적어도
ㆍ염, 예, 황산나트륨 또는 염화나트륨, 바람직하게는 황산나트륨,
ㆍ삼투질, 예, 트레할로스 또는 말토스와 같은 당, 바람직하게는 트레할로스,
ㆍ버퍼, 예, 인산염 버퍼 및/또는 구연산염 버퍼,
ㆍ선택적으로 항산화제, 예, 메티오닌,
ㆍ선택적으로 계면활성제, 예, 폴리소르베이트 80을 추가로 포함하며,
여기서, 조성물의 pH는 6.0 내지 7.0, 전형적으로 6.3 내지 6.6이고 삼투압농도는 300 내지 600 mOsm/kg이다.
특정 구현예에서,상기 면역원성 조성물은 NP 융합 단백질(전형적으로 OVX836) 외에 적어도
ㆍ염,
ㆍ트레할로스,
ㆍpH 6.0~7.0의 버퍼, 예, 인산염 버퍼 및/또는 구연산염 버퍼,
ㆍ선택적으로 항산화제, 예, 메티오닌,
ㆍ선택적으로 계면활성제, 예, 폴리소르베이트 80을 추가로 포함한다.
보다 구체적인 구현예에서, 본 개시의 면역원성 조성물은 적어도 NP 융합 단백질(전형적으로 OVX836) 외에 적어도 다음을 포함한다:
ㆍ황산나트륨 또는 염화나트륨, 바람직하게는 황산나트륨,
ㆍ슈가, 바람직하게는 트레할로스,
ㆍ인산염 버퍼 및/또는 구연산염 버퍼,
ㆍ선택적으로 항산화제, 예, 메티오닌,
ㆍ선택적으로 계면활성제, 예, 폴리소르베이트 80을 추가로 포함하며, 삼투압농도는 300 내지 600mOsm/kg, 바람직하게는 400 내지 500mOsm/kg, 일반적으로 450mOsm/kg이다.
바람직한 구현예에서, 본 개시의 면역원성 조성물은 적어도 NP 융합 단백질(전형적으로 OVX836) 외에 적어도 다음을 포함한다:
ㆍ약 75mM 농도의 황산나트륨,
ㆍ약 200mM 농도의 트레할로스,
ㆍ선택적으로 0.02% ~ 0.08%(vol/vol), 예: 약 0.04% 농도의 폴리소르베이트 80과 같은 계면활성제,
ㆍ 선택적으로 약 5mM 농도의 L-메티오닌과 같은 항산화제.
바람직한 구현예에서, 본 개시의 면역원성 조성물은 적어도 NP 융합 단백질(전형적으로 OVX836) 외에 적어도 다음을 포함한다:
ㆍ약 75mM 농도의 황산나트륨,
ㆍ약 200mM 농도의 트레할로스,
ㆍ0.02% ~ 0.08%(vol/vol), 예: 약 0.04% 농도의 폴리소르베이트 80,
ㆍ약 5mM 농도의 L-메티오닌.
특정 구현예에서, 상기 면역원성 조성물은 어떠한 보조제도 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 면역원성 조성물은 즉시 사용 가능한 멸균 주사용 용액으로 제제화된다.
멸균 주사용 용액은 활성 화합물, 즉 NP 융합 단백질을 필요에 따라 위에서 열거한 다양한 기타 성분과 함께 적절한 용매에 필요한 양으로 혼합한 후 여과 멸균하여 제조된다.
NP 융합 단백질 및 이의 면역원성 조성물의 사용 방법
이전 섹션에 기술된 NP 융합 단백질(특히 OVX836) 및 이의 면역원성 조성물(특히, 300μg/mL 이상의 OVX836을 포함함)은 이를 필요로 하는 인간 대상체의 인플루엔자 질환 예방 또는 치료용 백신 또는 면역요법으로서 유용하다.
따라서, 본 개시는 인간 및 다른 포유동물에서 인플루엔자 바이러스의 예방 및/또는 치료를 위한 조성물(예, 이전 섹션에 기재된 바와 같은 면역원성 조성물), 방법, 키트 및 시약을 제공한다. 본원에 개시된 면역원성 조성물은 치료제 또는 예방제로서 사용될 수 있다. 이는 인플루엔자 질환을 예방 및/또는 치료하기 위해 의학에서 사용될 수 있다. 예시적인 측면에서, 본 개시의 면역원성 조성물은 인플루엔자 바이러스로부터의 예방적 보호를 제공하기 위해 사용된다. 인플루엔자 바이러스로부터의 예방적 보호는 전형적으로 180μg 이상의 OVX836, 200μg 이상의 OVX836, 240μg 이상의 OVX836, 300μg 이상의 OVX836 또는 480μg 이상의 용량의 OVX836을 사용하여 본 개시의 면역원성 조성물을 투여한 후에 달성될 수 있다. 면역원성 조성물은 1회, 2회, 3회, 4회 이상, 바람직하게는 단일 용량으로 투여될 수 있다. 덜 바람직하기는 하지만, 치료 반응을 달성하기 위해 감염된 개체에게 면역원성 조성물을 투여하는 것이 가능하다. 이에 따라 복용량을 조정해야 할 수도 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 면역원성 조성물은 대상체에서 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하는 방법으로서 사용될 수 있으며, 이 방법은 상기 대상체에게 본원에 제공된 적어도 하나의 면역원성 조성물을 일반적으로 180μg 이상의 OVX836, 200μg 이상의 OVX836, 240μg 이상의 OVX836, 300μg 이상의 OVX836 또는 480μg 이상의 OVX836 용량으로 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 면역원성 조성물은 대상체에서 1차 인플루엔자 바이러스 감염을 억제하는 방법으로 사용될 수 있으며, 이 방법은 상기 대상체에게 본원에 제공된 바와 같은 적어도 하나의 면역원성 조성물을 일반적으로 180μg 이상의 OVX836, 200μg 이상의 OVX836, 240μg 이상의 OVX836, 300μg 이상의 OVX836 또는 480μg 이상의 OVX836 용량으로 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 면역원성 조성물은 대상체에서 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하는 방법으로 사용될 수 있으며, 이 방법은 상기 대상체에게 본원에 제공된 적어도 하나의 면역원성 조성물을 일반적으로 180μg 이상의 OVX836, 200μg 이상의 OVX836, 240μg 이상의 OVX836, 300μg 이상의 OVX836 또는 480μg 이상의 OVX836 용량으로 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 면역원성 조성물은 대상체에서 인플루엔자 바이러스 감염의 발생률을 감소시키는 방법으로 사용될 수 있으며, 이 방법은 상기 대상체에게 본원에 제공된 적어도 면역원성 조성물을 일반적으로 180μg 이상의 OVX836, 200μg 이상의 OVX836, 240μg 이상의 OVX836, 300μg 이상의 OVX836 또는 480μg 이상의 OVX836 용량으로 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 면역원성 조성물은 인플루엔자 바이러스에 감염된 제1 대상체로부터 인플루엔자 바이러스에 감염되지 않은 제2 대상체로 인플루엔자 바이러스의 확산을 억제하는 방법으로서 사용될 수 있으며, 이 방법은 상기 제1 대상체 및 상기 제2 대상체는 일반적으로 180μg 이상의 OVX836, 200μg 이상의 OVX836, 240μg 이상의 OVX836, 300μg 이상의 OVX836 또는 480μg 이상의 OVX836 용량을 포함하는 본원에 제공된 적어도 하나의 면역원성 조성물을 포함한다.
본 개시의 일부 구현예는 대상체에게 본원에 제공된 임의의 면역원성 조성물(바람직하게는 OVX836을 함유한 면역원성 조성물)을 NP-특이적 면역 반응을 생성하기에 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 항원 NP 특이적 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 항원 NP 특이적 면역 반응은 전체 T 세포 반응(특히 CD4 또는 CD8 NP 특이적 T 세포 반응) 또는 B 세포 반응(특이적 항-NP IgG 반응)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 NP-특이적 면역 반응을 생성하는 방법은 대상체에게 단일 용량(일반적으로 OVX836의 경우, 예를 들어 180μg 이상, 200μg 이상, 240μg 이상, 300μg 이상 또는 480μg 이상의 단일 용량)의 본 개시의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함한다..
일부 구현예에서, 면역원성 조성물(전형적으로 OVX836을 함유함)은 피내 주사, 근육내 주사 또는 비강내 투여에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 면역원성 조성물(전형적으로 OVX836을 함유함)은 근육내 주사에 의해 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 면역원성 조성물은 대상체에서 항원 NP-특이적 면역 반응을 생성하기 위해 유효량의 NP 융합 단백질(전형적으로 OVX836)로 제제화된다.
실시예에 제시된 데이터는 본원에 개시된 면역원성 조성물, 특히 180μg의 단일 용량의 OVX836을 사용하여 상당히 향상된 면역 반응을 입증한다.
일부 구현예에서, NP 융합 단백질(전형적으로 OVX836)의 유효량은 180μg 내지 1000μg, 200μg~1000μg, 240μg~1000μg, 또는 300μg~1000μg, 또는 480μg~1000μg의 단일 용량이다. 일부 구현예에서, NP 융합 단백질(전형적으로 OVX836)의 유효량은 인간 대상체에게 투여되는 180μg 보다 높은 단일 용량이다. 일부 구현예에서, NP 융합 단백질(전형적으로 OVX836)의 유효량은 인간 대상체에게 투여되는 200μg 이상이다. 일부 구현예에서, NP 융합 단백질(전형적으로 OVX836)의 유효량은 인간 대상체에게 투여되는 240μg 이상이다. 일부 구현예에서, NP 융합 단백질(전형적으로 OVX836)의 유효량은 인간 대상체에게 투여되는 300μg 이상이다. 일부 구현예에서, NP 융합 단백질(전형적으로 OVX836)의 유효량은 인간 대상체에게 투여되는 480μg 이상이다.
특정 구현예에서, 면역 반응은 주사 당일(1일)의 NP 특이적 IFN-γ 스팟 형성 세포(SFC)/106 PBMC의 기준 수와 비교하여 첫 번째 주사 후 최소 8일(8일 또는 29일)에 NP 특이적 IFN-γ 스팟 형성 세포(SFC)/106 PBMC의 증가를 측정하여 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 기준선(주사 전 1일차), 예를 들어 180 μg 이상의 OVX836을 포함하는 면역원성 조성물의 제1 용량과 비교하여 면역원성 조성물의 제1 용량의 8일 후에 NP-특이적 IFN-γ 스팟 형성 세포(SFC)/106 PBMC의 적어도 50%, 70%, 90%, 110%, 130% 증가를 나타낸다. .
특정 구현예에서, 면역 반응은 주사 당일(1일)의 기준 수와 비교하여 첫 번째 주사 후 적어도 8일(8일 또는 29일)에 NP 특이적 CD4+ T 스팟 형성 세포(SFC)/106 PBMC의 증가를 측정함으로써 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 기준선(주사 1일 전), 예를 들어 180μg 이상의 OVX836을 포함하는 면역원성 조성물의 제1 용량과 비교하여 면역원성 조성물의 제1 용량의 8일 후에 NP-특이적 CD4+ 스팟 형성 세포(SFC)/106 PBMC의 적어도 100%, 150%, 200%, 250%, 300% 또는 350% 증가를 나타낸다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 기준선(주사 1일 전), 예를 들어 180 μg 이상의 OVX836을 포함하는 면역원성 조성물의 제1 용량과 비교하여 면역원성 조성물의 제1 용량의 8일 후에 NP-특이적 CD8+ 스팟 형성 세포(SFC)/106 PBMC의 적어도 20%, 30%, 50%, 75% 또는 100% 증가를 나타낸다.
실시예에 제시된 데이터는 또한 본원에 개시된 면역원성 조성물을 사용하는 백신의 유의미하게 향상된 효능, 특히 OVX836을 180μg 이상의 단일 용량으로 투여하면 증상성 인플루엔자(ILI)의 새로운 발생을 예방할 수 있는 반면, 90μg의 단일 용량은 증상성 인플루엔자를 예방하지 못함을 입증한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 면역원성 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 인플루엔자 질환, 바람직하게는 중증 인플루엔자에 대한 효능을 제공하는 방법으로서 사용될 수 있으며, 이 방법은 상기 대상체에게 본원에 제공된 바와 같은 면역원성 조성물을 180 μg 이상, 200μg 이상, 240μg 이상, 300μg 이상 또는 480μg 이상의 (일반적으로 OVX836) 용량으로 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 백신 효능은 플라시보 또는 90μg의 용량과 비교하여 본 개시의 면역원성 조성물, 전형적으로 180 μg 이상, 200μg 이상, 240μg 이상, 300μg 이상 또는 480μg 이상의 OVX836 용량으로 치료된 환자 집단에서 주사 14일 후 인플루엔자 유사 질병의 수의 유의한 감소에 의해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "인플루엔자 유사 질환" 또는 "ILI"는 오한, 두통, 권태감, 근육통, 기침, 인두염 및 기타 호흡기 질환 중 하나 이상의 증상을 동반한 발열 또는 갑작스러운 발병의 임상적 관찰을 의미한다.
일부 구현예에서, 환자 집단은 플라시보 또는 OVX836 90μg을 투여받은 환자 집단과 비교하여, 본 개시의 면역원성 조성물, 전형적으로 180μg 이상의 OVX836 용량으로 치료할 때 주사 14일 후 인플루엔자 유사 질병의 적어도 20%, 40%, 60%, 80% 또는 95% 감소를 나타낸다.
일부 구현예에서, 백신으로 사용하기 위한 본 개시의 면역원성 조성물(전형적으로 OVX836을 포함함)은 중증 인플루엔자로부터 대상체를 보호한다.
본 명세서에 사용된 "중증 인플루엔자"라는 용어는 인플루엔자 유사 질환(ILI; 갑작스런 발열 및 기침 또는 인후통 발병)의 정의를 의미하며 다음 임상 증상 중 하나 이상을 나타낸다.
- 호흡 곤란, 빈호흡 또는 저산소증
- 하기도 질환의 방사선학적 징후
- 중추신경계 침범(예. 뇌병증, 뇌염)
- 심한 탈수
- 급성 신부전
- 패혈성 쇼크
- 천식, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 만성 간 또는 신부전, 당뇨병 또는 기타 심혈관 질환을 포함한 기저 만성 질환의 악화
- 병원 입원이 필요한 기타 인플루엔자 관련 상태 또는 임상 증상.
일부 구현예에서, 백신으로 사용하기 위한 본 개시의 면역원성 조성물(전형적으로 OVX836을 포함함)은 중증 인플루엔자 질환의 하나 이상의 중증 증상으로부터 대상체를 보호한다.
일부 구현예에서, 백신으로 사용하기 위한 면역원성 조성물은 최대 2년 동안 인플루엔자에 대해 대상체를 면역화시킨다. 일부 구현예에서, 백신으로 사용하기 위한 면역원성 조성물은 2년 초과, 3년 초과, 4년 초과 또는 5-10년 동안 인플루엔자에 대해 대상체를 면역화시킨다.
일부 구현예에서, 대상체는 약 20세 내지 약 50세(예, 약 20세, 25세, 30세, 35세, 40세, 45세 또는 50세)의 젊은 성인이다.
일부 구현예에서, 대상체는 50세 이상, 예를 들어 약 60세, 약 70세 또는 그 이상(예, 약 60세, 65세, 70세, 75세, 80세, 85세 또는 90세)인 노인 대상체이다.
일부 구현예에서, 대상체는 인플루엔자에 노출되었으며; 대상체는 인플루엔자에 감염되었고, 또는 대상체는 인플루엔자에 감염될 위험이 있다.
다른 양태에서, 본 개시는 백신으로 사용하기 위한 면역원성 조성물, 또는 전형적으로 OVX836을 포함하고, 보다 바람직하게는 적어도 300 μg/mL의 농도로 제제화된 본원에 개시된 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체의 백신접종 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 NP 융합 단백질, 전형적으로 OVX836의 180μg - 300μg, 300μg - 480μg, 또는 480μg - 1000μg의 단일 용량이 대상체에게 투여된다. 바람직하게는, 상기 방법에서, 상기 면역원성 백신은 근육내 주사에 의해 투여된다.
다른 양태에서, 본 개시는 인간 대상체에서 인플루엔자 예방에 사용하기 위한 백신의 제조에서 위에 기술된 융합 단백질의 용도에 관한 것이며, 여기서 상기 융합 단백질의 180μg 이상의 양, 예를 들어, 180μg에서 1000μg 사이의 양이 상기 인간 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 면역원성 조성물(전형적으로 OVX836과 함께)은 하나 이상의 불활성화된 인플루엔자 균주 및/또는 하나 이상의 인플루엔자 균주로부터의 유효량의 혈구응집소 HA 항원을 포함하는 인플루엔자에 대한 제2 면역원성 조성물과 동시에 또는 순차적으로, 바람직하게는 동시에 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 상기 제2 면역원성 조성물은 인플루엔자 바이러스 균주 A와 B의 불활성화된 균주의 혼합물, 예를 들어 균주 A H1N1, H3N2 및 B의 혼합물을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 제2 면역원성 조성물은 Fluarix이다.
본원에 사용된 용어 "조합", "조합된 투여" 또는 "병용 투여"는 적어도 2개의 활성 성분, 예를 들어 별개의 항원 또는 항원 결정기를 갖는 2개의 면역원성 조성물의 조합 투여를 의미하며, 본원에 개시된 NP 융합 단백질을 포함하는 제1 면역원성 조성물이 이를 필요로 하는 동일한 대상체에 제2 백신 또는 면역원성 조성물과 동시에 또는 시간 간격 내에 별도로 투여되며, 이러한 시간 간격을 통해 조합된 활성 성분은 면역 반응 또는 인플루엔자(일반적으로 독감 장애)에 대한 보호에 협력적 또는 시너지 효과를 나타낼 수 있다. 이는 면역원성 조성물이 동시에 투여되어야 하고/거나 전달을 위해 함께 제형화되어야 함을 암시하려는 의도는 아니지만, 이들 전달 방법은 본원에 기술된 범위 내에 있다. 이 용어는 또한 활성(면역원성) 제제가 반드시 동일한 투여 경로로 투여되지 않는 요법을 포괄하는 의미이다.
특정 구현예에서, 300 또는 480 ㎍의 OVX836의 1회 용량의 면역원성 조성물은 근육내 주사를 통해서도 투여될 수도 있는, 하나 이상의 불활성화된 인플루엔자 또는 인플루엔자 혈구응집소 항원(예, Fluarix 백신)을 포함하는 1회 용량의 제2 면역원성 조성물과 동시에 근육내 주사로 투여된다.
본 발명은 다음의 도면 및 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다. 그러나 이들 실시예 및 도면은 어떠한 방식으로든 본 개시의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
특정 구현예
E1. 인플루엔자 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 인간 대상체의 백신 또는 면역요법으로 사용하기 위한 면역원성 조성물로,
상기 면역원성 조성물은 다음을 포함하는 융합 단백질:
(i) 인플루엔자 핵단백질 항원 및,
(ii) C4bp 올리고머화 도메인으로부터 유래된 자가 조립 폴리펩티드 및 양전하를 띤 테일(tail)을 포함하는 운반체 단백질,
여기서 상기 융합 단백질의 180μg 이상의 양, 예를 들어 200μg, 240μg의 양이 상기 인간 대상체에게 투여된다.
E2. 구현예 E1에 따라 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 융합 단백질의 200μg 이상, 또는 240μg 이상의 양이 상기 인간 대상체에게 투여된다.
E3. 구현예 E1에 따라 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 융합 단백질의 300μg 이상의 양이 상기 인간 대상체에게 투여된다.
E4. 구현예 E1에 따라 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 융합 단백질의 480μg 이상의 양이 상기 인간 대상체에게 투여된다.
E5. 구현예 E1-E4 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 운반체 단백질은 선택적으로 글리신-세린 링커를 통해 핵단백질 항원에 C-말단에 융합된다.
E6. 구현예 E1-E5 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 융합 단백질은 자가 조립 후에 헵타머 입자(heptameric particle)를 형성한다.
E7. 구현예 E1-E6 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 인플루엔자 핵단백질 항원은 인플루엔자 균주 A, B 또는 C의 적어도 하나의 핵단백질 항원을 포함하며, 예를 들어 필수적으로 인플루엔자 바이러스 A/Wilson-Smith/1933 H1N1의 NP 항원으로 구성된다.
E8. 구현예 E1-E7 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 인플루엔자 핵단백질 항원은 다음을 포함한다:
(i) SEQ ID NO:1의 폴리펩티드, 또는
(ii) SEQ ID NO:1과 적어도 90% 동일성을 갖는 항원성 폴리펩티드 변이체.
E9. 구현예 E1-E8 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 면역원성 조성물로서,상기 C4bp 올리고머화 도메인으로부터 유래된 자가 조립 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:2와 적어도 90% 상동성을 갖는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
E10. 구현예 E1-E9 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 양전하를 띤 테일은 서열 ZXBBBBZ(SEQ ID NO: 3)를 포함하며, 여기서 (i) Z는 없거나 임의의 아미노산이고, (ii) X는 임의의 아미노산이며, (iii) B는 아르기닌 또는 라이신이고, 바람직하게는 상기 양전하를 띤 테일은 SEQ ID NO:4의 서열을 포함한다.
E11. 구현예 E1-E10 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 운반체 단백질은 필수적으로 SEQ ID NO:5로 구성되거나, 상기 운반체 단백질은 SEQ ID NO:5와 적어도 90% 상동성을 갖는 SEQ ID NO:5의 기능적 변이체이다.
E12. 구현예 E1-E11 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 융합 단백질은 SEQ ID NO:6을 포함하거나 필수적으로 이로 구성되거나, SEQ ID NO:6과 적어도 90% 상동성을 갖는 SEQ ID NO:6의 기능적 변이체이다.
E13. 구현예 E1-E12 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 융합 단백질의 양은 근육내 경로를 통해 투여된다.
E14. 구현예 E1-E13 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 융합 단백질의 양은 단일 주사로서, 바람직하게는 근육 내 경로를 통해 상기 인간 대상체에게 투여된다.
E15. 구현예 E1-E14 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 대상체는 50세 미만이다.
E16. 구현예 E1-E15 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 대상체는 적어도 50세 이상이다.
E17. 구현예 E1-E16 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 사용은 NP에 특이적인 전체 T 세포 반응, NP에 특이적인 CD4 T 세포 반응, NP에 특이적인 CD8 T 세포 반응, 항-NP IgG(항체 반응) 및/또는 인플루엔자 증상(유사 인플루엔자 증상), 특히 인플루엔자 균주 A 또는 B에 의한 인플루엔자 감염으로부터 보호 또는 교차-보호를 제공한다.
E18. 구현예 E1-E17 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 면역원성 조성물로서, 상기 면역원성 조성물은 하나 이상의 불활성화된 인플루엔자 균주 및/또는 하나 이상의 인플루엔자 균주로부터의 효율적인 양의 혈구응집소(hemagglutinin) HA 항원을 포함하는 인플루엔자에 대한 제2 면역원성 조성물과 병용 또는 순차적으로, 바람직하게는 병용 투여되고, 상기 제2 면역원성 조성물은 Fluarix 백신 조성물인 것이 바람직하다.
E19. 300 μg/mL 이상의 농도의 구현예 E1-E12 중 어느 하나에 정의된 융합 단백질, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물.
E20. 구현예 E19의 면역원성 조성물은 상기 융합 단백질이 적어도 400 아미노산 잔기, 예를 들어 400 내지 600 아미노산 잔기, 예를 들어 540 내지 560 아미노산 잔기를 포함하며, 선택적으로 상기 융합 단백질은 직경 20 내지 100 nm 및/또는 분자량 440 내지 200 kDa로 구성된 단백질 나노입자를 형성한다.
E21. 구현예 E19 또는 E20의 면역원성 조성물은, 적어도 다음을 추가로 포함한다:
i. 염, 예를 들어 황산나트륨 또는 염화나트륨, 바람직하게는 황산나트륨,
ii. 삼투질, 예를 들어 트레할로스와 같은 당,
iii. 버퍼, 예를 들어 인산염 버퍼 및/또는 구연산염 버퍼,
iv. 선택적으로 항산화제, 예를 들어 메티오닌,
v. 선택적으로 계면활성제, 예를 들어 폴리소르베이트 80,
여기서, 조성물의 pH는 6.0 내지 7.0, 일반적으로 6.3 내지 6.6이고 삼투압은 300 내지 600mOsm/kg, 바람직하게 400 내지 500mOsm/kg, 예를 들어 약 450mOsm/kg이다.
E22. 구현예 E19 - E21 중 어느 하나의 면역원성 조성물로서,
i. 약 75 mM 농도의 황산나트륨,
ii. 트레할로스(약 200mM 농도),
iii. 0.02% 내지 0.08%(vol/vol)의 농도, 예를 들어 약 0.04%의 폴리소르베이트 80
iv. 약 5mM 농도의 L-메티오닌을 포함한다.
E23. 구현예 E19-E22 중 어느 하나의 면역원성 조성물로서, 상기 조성물은 임의의 보조제를 포함하지 않는다.
E24. 구현예 E19-E23 중 어느 하나의 면역원성 조성물로서, 상기 조성물은 즉시 사용 가능한 멸균 용액으로 제형화된다.
E25. 구현예 E19-E24 중 어느 하나의 면역원성 조성물로서, 이를 필요로 하는 인간 대상체의 인플루엔자 질환의 예방 또는 치료에서 백신 또는 면역 요법으로 사용하기 위한, 특히 구현예 E1-E18 중 어느 하나에 정의된 대로 사용하기 위한 것이다.
실시예
실시예 1: 300μg/mL에서 OVX836의 안정적인 제제 개발
OVX836(SEQ ID NO: 6)은 OVX313 운반체 단백질(SEQ ID NO: 5)과 계절성 독감 핵단백질(NP 인플루엔자 바이러스 A/Wilson-Smith/1933)의 융합 단백질을 포함하는 후보 백신의 약물 물질이다.
OVX836 약물 성분은 안정화 제제 버퍼에 농축된 용액으로 공급된다. 첫 번째 목적은 근육내 경로를 통해 최대 180μg의 OVX836을 단일 주사할 수 있는 목표 농도를 갖는 안정적인 제제를 개발하는 것이었다.
개발 제제와 관련된 기술적인 문제 중 하나는 표적화되는 비정상적으로 높은 농도(300μg/mL)와 헵타머(440kDa)와 작은 올리고-헵타머(디-, 트리-, 테트라- 또는 펜타-헵타머)의 동적 평형인 OVX836의 4차 구성을 언급할 수 있다. 특징은 NP의 자기-결합 특성과 관련이 있다. 실제로 NP는 바이러스 복제 머시너리에 구조적, 기능적 지원을 제공하는 매우 기본적인 내부 단백질이다. 이 목표를 달성하기 위해 NP는 게놈 RNA 주위에 동종 올리고머와 NP 랩의 여러 복사본을 형성한다. 따라서 OVX836의 4차 구조는 작은 올리고-헵타머를 포함한 다양한 형태를 생성하여 응집체로 중합을 일으킬 수 있다. 이러한 응집 현상에 영향을 미칠 수 있는 온도, pH, 이온 강도, 단백질 농도와 같은 여러 요인이 있다.
첫 번째 개발 제제는 권장 pH 및 삼투압, 즉 각각 7.4에 가까운 pH와 300mOsm에 가까운 삼투압에 따라 제조되었다.
하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 제제 F1은 안정하지 않고 응집체를 형성하였다. 더 산성인 pH를 위해 다양한 버퍼를 사용하는 추가 제제를 유사한 삼투압으로 제조하였다(제제 F2, F3 및 F4 참조). 그러나 테스트된 모든 pH는 만족스럽지 못한 안정성과 올리고머화를 나타냈다.
표 1: 25℃의 가속 보관 조건에서 처음 3개월 동안 테스트한 OVX836 드러그의 품질 특성.
+++, 안정적; ++, 중간 정도 안정적; +, 매우 안정적이지 않음
그런 다음 제형의 삼투압을 높이는 방법을 선택하였다. 그 결과 pH 6.5에서 제품 분해와 제품 올리고머화가 모두 크게 개선된 것으로 나타났다.
+++, 안정적; ++, 중간 정도 안정적; +, 매우 안정적이지 않음
다양한 제제 버퍼, 부형제 및 pH를 스크리닝한 후 최종적으로 안정성을 위한 다음과 같은 최적의 제제가 개발되었다.
보다 구체적으로, 최적의 가용화는 5.5 내지 7.0 사이의 약산성 pH(pH 6.4 내지 6.6이 바람직함)에서 달성되었다. 또한 스크리닝 결과 20mM 구연산나트륨 기반 버퍼(최종 pH 값 6.6)을 사용하면 의약품에서 고분자량 올리고머의 발현을 방지하는 것으로 나타났다.
더욱이, 개발 연구에서 트레할로스의 존재는 주로 OVX836의 올리고머 형성을 늦추는 것으로 밝혀졌으며(크기 배제 크로마토그래피 분석으로 측정된 올리고머화 감소) 200mM의 농도가 최적인 것으로 밝혀졌다.
염화나트륨 또는 황산나트륨과 같은 염도 OVX836을 안정화할 수 있는 것으로 나타났으나 시차 주사 열량계(DSC 열분석도)에 의해 제안된 바와 같이 황산나트륨이 매우 바람직하였다.
선택된 최적 제제의 안정성 데이터는 5 ℃에서 보관했을 때 최소 36개월 동안, 25 ℃에서 3개월 동안 보관했을 때 OVX836 의약품의 현저한 분해가 없음을 보여주었다. 최종 제제의 삼투압 농도는 440~500mOsm/kg, 일반적으로 465~480Osm/kg이었다.
이러한 높은 삼투압 및 높은 단백질 농도를 갖는 제제는 인간 대상체에게 안전하지 않거나 잘 견디지 못할 수 있다. 이는 아래 실시예 2에 자세히 설명된 연구를 통해 평가되었다.
실시예 2: 1상 - 핵단백질 기반 인플루엔자 백신인 OVX836을 평가하기 위한 랜덤, 플라시보-대조, 용량 증량 연구: 근육 내 결과
방법
이 랜덤, 플라시보 대조, 관찰자 맹검, 순차적, 용량 증량 1상 연구는 Good Clinical Practice에 따라 앤트워프 대학교(벨기에 앤트워펜)에서 수행되었다. 이는 앤트워프 대학병원 윤리위원회와 앤트워프 대학교, 그리고 벨기에 연방 의약품 및 건강 제품청(FAMHP)의 승인을 받았다. 독립적인 데이터 및 안전 모니터링 위원회가 정기적으로 데이터를 검토했다. 모든 참여 대상자로부터 서면 동의를 얻었다. EudraCT 번호는 2018-000341-39이고 Clinicaltrials.gov 번호는 NCT03594890이었다.
18~49세의 건강한 성인, 체질량지수(BMI)가 18~25kg/m²인 사람이 연구 대상이었다. 주요 제외 기준은 선별검사 전 6개월 이내에 인플루엔자 예방접종을 받은 적이 있는 경우, 임신 또는 피임 의지가 없는 경우, 인체 면역결핍 바이러스 또는 B/C형 간염 바이러스에 대한 양성 검사, 예방접종 당일 급성 열성 질환이 있는 경우, 전신 코르티코스테로이드, 세포 독성 약물, 항염증제 및 기타 면역 조절 약물과 같은 면역 반응에 영향을 미칠 수 있는 치료, 자가면역 질환, 조절되지 않는 당뇨병 또는 고혈압, 심장, 신장 또는 간 질환이었다.
12명의 대상자가 3개의 순차적 코호트(저용량 30μg, 중간 용량 90μg, 고용량 180μg) 각각에 포함되었다. 각 코호트는 OVX836 백신(N=9)과 플라시보(N=3) 사이에 3:1 비율로 랜덤 배정되었다. 이 연구는 관찰자 맹검으로 진행되었다. 연구자와 대상자는 연구 종료 시점(5개월째)까지 대상자가 배정된 치료군(플라시보/백신)을 알지 못하도록 하였다. 연구 제품(플라시보 또는 백신)이 포함된 주사기는 눈가림이 해제된 팀이 준비하여 투여하였다.
백신(300 μg/mL 활성 물질) 또는 플라시보(염화나트륨 0.9%로 구성)을 주로 사용하지 않는 팔의 삼각근에 저용량(0.1mL에 30 μg), 중간 용량(0.3mL에 90 μg) 또는 고용량(0.6mL에 180 μg)으로 투여하였다. 이 연구는 두 단계로 나뉘어 진행되었으며, 1일차부터 57일차까지의 활성 치료 단계 2회 근육 내 백신 접종 후 각각 28일간의 추적 관찰, 그리고 1차 투여 후 58일차부터 150일차(5개월째)까지의 추적 관찰 단계로 이루어졌다.
다이어리 카드를 사용하여 각 투여 후 7일 이내에 발생한 국소(투여 부위 통증, 발적, 부종 및 발진) 및 전신(발열, 기침, 두통, 관절통, 근육통, 불쾌감/피곤함 및 구토) 증상을 수집하였다. 각 투여 후 28일 동안 공개 질문을 사용하여 원치 않는 이상반응(AE)을 기록하였다. AE의 강도는 경증, 중등증, 중증 또는 잠재적으로 생명을 위협할 수 있는 것으로 등급을 매겼으며 활성 단계 내내 모니터링하였다. 심각한 이상반응(SAE)은 5개월째까지 임상시험 기간 내내 모니터링하였다. 사전 정의된 일련의 안전성 실험실 분석(혈액학 및 임상화학(응고 매개변수 및 C반응성 단백질(CRP) 평가 포함))은 선별 시와 8, 29, 36, 57일에 수행하였다.
1일, 8일, 29일, 36일, 57일, 150일에 전혈 샘플을 수집하여 PBMC를 분리하고 효소결합 면역스팟 분석법(ELISPOT)을 사용하여 NP 특이 인터페론-감마(IFN-γ) T세포 반응을 측정하였다. 1일, 29일, 57일, 150일에 혈청 샘플을 수집하여 효소결합 면역 흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 항-NP, 항OVX313, 항-hC4BP IgG를 측정하였다. 면역 분석법은 보충 방법에 설명되어 있다.
연구의 순수한 탐색적 성격을 고려할 때 표본 크기는 충분한 것으로 간주되었다. 이 연구에는 통계적 가설 테스트로 활용되지 않았다. 모든 관련 매개변수를 요약하기 위해 기술 통계가 사용되다: 이산형 변수의 수와 백분율, 평균(산술 또는 기하), 중앙값, 표준 편차, 95% 신뢰 구간(CI), 연속형 변수의 최소값과 최대값. 면역원성 데이터에 대한 탐색적 추론 분석은 각 시점에 Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 치료 그룹 간의 전반적인 차이를 테스트하고, 유의한 경우 사후 Dwass, Steel, Critchlow-Fligner 테스트를 통해 각 쌍별 비교를 테스트하였다. 그룹 내 비교는 쌍을 이룬 Wilcoxon 테스트를 사용하여 수행하였다. 피셔의 정확한 테스트는 응답자 비율 측면에서 치료 그룹 간의 차이를 평가하는데 사용되었다. 평가변수와 비교 대상의 다양성을 고려하기 위해 보정을 적용하지 않았으므로 5% 미만의 p값은 통계적으로 유의미한 잠재적 차이를 나타내는 것으로만 간주해야 한다.
총 36명의 대상자가 참여했으며 33명(91.7%)의 대상자가 전체 연구를 완료하였다.
파트 1: 예비 분석
우리는 1단계 결과에 대한 1차 분석을 실시하였다. 모든 그룹은 백신 접종 전 1일에 유사한 기준선을 가졌으며, 이는 이를 비교할 수 있음을 의미한다(도 1).
8일째와 36일째에 모든 OVX836 그룹은 플라시보 보다 더 높은 반응을 보였다. 8일째에는 90μg 그룹과 180μg 그룹 간에 차이가 없었지만 30μg 그룹은 다소 미흡한 것으로 나타났다(도 2). 36일차(2차 접종 8일 후)에는 90μg과 180μg 사이에 통계적으로 유의미한 차이가 없었으며 90μg 그룹이 180μg 그룹 보다 약간 더 나은 반응을 보였다(도 3). 도 4는 기준선(1일차, 백신 접종 전)부터 150일차(2차 접종 후 4개월)까지 플라시보 그룹과 3개의 OVX836 백신 그룹(30μg, 90μg, 180μg)의 NP 특이 IFN-γ 스팟 형성 T세포(SFC)/106 세포 수의 시간에 따른 변화를 보여준다. 그 결과, 90μg은 1회 접종 후 29일까지 지속된 반응이 다른 그룹과 비교했을 때 180μg보다 더 나은 효과를 나타냈으며, 이는 90μg이 1회 접종 후에도 더 나은 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.
요약하면, 임상 1상 연구의 예비 분석 결과 다음과 같은 사실이 입증되었다:
- 30μg보다 더 많은 용량이 필요하다;
- 두 번째 주사의 유의미한 이점은 없었다;
- 90 및 180 μg 용량 모두 용량 효과 없이 안전하고 내약성이 우수하였다;
- 90μg 용량과 비교했을 때 180μg 용량에 대한 명확한 이점은 없었으며, 이는 90μg 용량에서 이미 효능의 안정기에 도달했을 수 있음을 시사한다;
- 90μg의 두 번째 용량은 180μg 보다 더 높은 T세포 면역 반응을 유발하여 90μg이 180μg 용량 수준 보다 더 좋을 수 있음을 시사한다.
파트 2: 1상 결과에 대한 상세한 분석
1상 결과에 대한 추가 분석을 통해 90 및 180μg의 제형 및 투여 요법의 안전성이 입증되었으며, 놀랍게도 이후에 자세히 설명된 바와 같이 90~180μg의 면역 반응에 대한 용량 반응 효과 경향이 추론되었다.
반응성 및 안전성
플라시보 대상자에서는 요청된 국소 증상이 보고되지 않은 반면, OVX836 백신을 접종한 대상자 대부분은 주사 부위에 일시적인 경증에서 중등도의 통증을 나타냈다. 요청된 국소 증상의 수와 영향을 받은 대상자의 수에서 OVX836의 용량-효과 관계는 명확하지 않았다: 30μg 투여 시 8명의 대상자에서 13가지 증상, 90μg 투여 시 7명의 대상자에서 22가지 증상, 180μg 투여 시 7명의 대상자에서 16가지 증상이 나타났다. 또한 1차 백신 접종에 비해 2차 백신 접종 후 국소 증상의 뚜렷한 증가도 나타나지 않았다. 1코호트(30μg)와 3코호트(180μg)에서 중증(3등급)의 국소 증상은 없었다. 코호트 2(90 μg)의 대상자 1명(11.1%)에서 두 가지 국소 증상(발진 및 부종)이 심각하게 나타났다. 두 백신 접종 후 관찰 기간이 끝날 때까지 국소 증상 중 어떤 것도 지속되지 않았다.
요청된 전신 증상의 수와 영향을 받은 대상자의 수에는 용량-효과 관계가 없었다: 30 μg을 투여한 4명의 대상자에게서 12가지 증상이, 90 μg을 투여한 6명의 대상자에게서 13가지 증상이, 180 μg을 투여한 6명의 대상자에게서 15가지 증상이 나타났다. 이에 비해 플라시보를 복용한 9명의 대상자 중 5명에게서 12가지 전신 증상이 보고되었다. OVX836을 접종한 2명의 대상자에서 각각 1차 접종 후 2가지 심각한 전신 증상이 보고되었다: 코호트 1(30 μg)에서 1건의 심한 불쾌감(피로), 코호트 3(180 μg)에서 1건의 심한 발열(≥39 ℃); 후자의 경우 2차 접종 중단으로 이어졌다. 두 백신 접종 후 관찰 기간이 끝날 때까지 요청된 전신 증상은 나타나지 않았다.
각 백신 접종 후 28일 동안 원치 않는 이상반응을 보고한 대상자의 비율이다: 명확한 OVX836 용량-효과 관계는 관찰되지 않았다. 또한 1차 접종과 비교하여 2차 접종 후 원치 않는 이상반응의 증가도 관찰되지 않았다.
전체적으로, 코호트 1(30 μg) 대상자 8명에서 23건의 원치 않는 이상반응이 보고되었고, 코호트 2(90 μg) 대상자 8명에서 21건, 코호트 3(180 μg) 대상자 8명에서 21건의 이상반응이 보고된 반면, 플라시보 풀 그룹의 6명에서 25건의 이상반응이 보고되었다. 백신과 관련된 것으로 간주된 이상반응은 다음과 같다: (i) 코호트 1 - 30 μg: 주사 부위 출혈, 백신 접종 부위 발진, 근골격계 경직, CRP 증가; (ii) 코호트 2 - 90 μg : 주사 부위 출혈, 메스꺼움 구인두 통증, 실신 전 2 건, CRP 증가, 호중구 수 감소 (중증), 백혈구 (WBC) 수 감소 및 (iii) 코호트 3 - 180 μg: 비인두염(중증), 근골격계 통증, 목 통증, 실신 전, 구인두 통증, 코막힘 2건, CRP 증가, 림프구 수 감소, 호중구 수 증가, WBC 수 증가.
한 명의 OVX836 90 μg 접종자에서 1건의 SAE가 보고되었는데, 이는 2차 접종 후 약 40일 후에 발생한 요로 감염으로 구성되었다. 이 SAE는 11일 동안 지속되었으며 백신과 관련이 없는 것으로 간주되었다.
결론적으로, OVX836은 30μg ~ 180μg 용량 범위에서 근육 내 투여 경로를 통해 안전하고 내약성이 우수한 후보 백신으로 나타났다. 명확한 용량-효과 관계는 입증되지 않았으며 180μg 용량은 최대 내약 용량이 아닌 것으로 나타났다.
NP 특이적 T세포 면역 반응
도 5에는 플라시보와 비교하여 OVX836 백신을 접종한 세 그룹에서 1일차, 8일차(1차 접종 1주 후), 36일차(2차 접종 1주 후)에 검출된 NP 특이적 IFN-γ 생성 T세포 수가 표시되어 있다. 모든 대상자는 기준선에서 5 ~ 478개의 NP-특이적 IFN-γ 생성 T세포(NP-특이적 IFN-γ 스팟 형성 세포(SFC)/106 PBMC)를 보유하고 있었으며 그룹 간 유의미한 차이는 없었다. 1차 백신 접종 후 8일째, 세 개의 OVX836 백신 그룹 각각에서 1일차(도 5A) 및 플라시보(도 5B)와 비교하여 평균 SFC/106 PBMC가 유의미하게 증가하였다. 8일째에 OVX836 용량 수준에 따라 반응이 증가하는 경향이 있었지만 이 효과는 유의하지 않았다. 36일차(2차 접종 1주 후)에는 OVX836 90μg 그룹을 제외하고는 2차 접종으로 더 이상 반응을 증가시키지 못하였다. 57일차(2차 접종 후 28일)에는 플라시보 대비 세 백신 그룹에서 유의미한 차이가 발견되었으며(전체 p=0.002, Kruskal-Wallis 테스트), OVX836 그룹 간에는 유의미한 차이가 없었다. 150일째(2차 접종 후 4개월), 세 OVX836 그룹에서 NP 특이적 IFN-γ 생성 T세포 수가 여전히 플라시보 보다 많았지만 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(전체 p=0.295; Kruskal-Wallis 테스트).
NP 특이적 체액성 면역 반응
3개의 OVX836 백신 및 플라시보 그룹에서 항-NP IgG 기하평균 역가(GMT)의 시간 경과에 따른 변화는 도 6(패널 A)에 나와 있다. 모든 대상자는 기준선에서 1,600~25,600 범위의 개별 역가를 보였으며, 그룹 간 유의미한 차이는 없었다. 1차 백신 접종 후 29일째에 세 백신 그룹에서 플라시보에 비해 GMT가 유의하게 증가했다(전체 p=0.0008, Kruskal-Wallis 테스트). 29 일째에 2차 백신을 접종해도 57 일째(2차 접종 후 28일)에는 항 NP IgG GMT가 더 증가하지 않았으며, 150 일째(2차 접종 후 4 개월)에도 세 백신 그룹에서 플라시보에 비해 여전히 유의하게 높았다(전체 p=0.001; Kruskal-Wallis 테스트). OVX836의 용량 수준에 따라 항-NP IgG GMT가 증가하는 경향이 있었지만 이 효과는 유의하지 않았다.
백신 접종 후 다양한 시점에 기준선 대비 항-NP IgG 역가가 4배 증가한 대상자의 비율은 도 6(패널 B)에 나와 있다. 29일차(1차 접종 후)와 57일차(2차 접종 후 28일)에 OVX836 백신 접종 대상자의 44.4%에서 87.5%가 기준치 대비 4배의 역가가 증가한 반면 플라시보 그룹에서는 0%의 역가가 나타났다. 이 두 시점에서 그룹 간의 전반적인 차이는 유의미했으며(29일째에 p=0.035, 57일째에 p=0.001, Kruskal-Wallis 테스트), 사후 통계 테스트 결과 OVX836 90 μg과 OVX836 180 μg은 플라시보과 유의미한 차이가 있는 것으로 나타났다. 150일째(2차 백신 접종 4개월 후)에도 OVX836 백신을 접종한 대상자의 37.5~50.0%가 여전히 기준 역가가 4배 증가한 반면 플라시보 그룹은 0%로 나타났지만 4개 그룹 간의 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(p=0.128, Kruskal-Wallis 테스트).
요약하면, 임상 1상 연구 결과를 자세히 분석한 결과 다음과 같은 사실이 입증되었다:
- 비강 내 경로 보다 근육 내 경로가 선호된다;
- 30μg 보다 더 높은 용량이 필요하다;
- 90 및 180 μg 용량 모두 용량 영향 없이 안전하고 내약성이 우수했다;
- 두 번째 주사의 유의미한 이점은 없었다;
- 90~180μg 사이에서 용량 반응 경향이 있었다.
실시예 3: 임상 2a상 연구
A. 연구 요약
B. 결과 요약
임상 1상 결과의 예비 분석과 달리, 임상 2a상에서는 90~180 μg의 용량에서 면역 반응에 대한 유의미한 용량 반응 효과가 명확하게 입증되었다.
특히, 90~180 μg의 용량 반응에서 주사 8일 후 NP 특이적 T 세포 반응, 특히 NP 특이적 CD4+T 세포 반응의 강력한 증가가 관찰되었다.
OVX836 180μg 그룹에서 두 명의 이상치(two outlier) 대상자(1일차에 높은 기준값을 나타내는 대상자 128-095 및 232-365: 957 및 1630, 각각)를 제거한 후 ITT 코호트(Intent-to-Treat 코호트)에서 OVX836 90μg 그룹의 반응 동역학(통합 연령층) 측면에서 평균은 기준선에서 130 SFC/million PBMC에서 8일차에 222 SFC/million PBMC로 증가했다. OVX836 180μg 그룹의 경우, 평균은 기준선에서 149에서 8일째에 288 SFC/million PBMC로 증가했다. 인플루백 테트라 그룹의 경우, 평균은 기준선에서 131 SFC/백만 PBMC, 8일째에 147 SFC/백만 PBMC로 비교적 안정적으로 유지되었다. 8일째에 OVX836 180μg은 OVX836 90μg과 유의미한 차이를 보였으며(p=0.035), 이는 모든 대상자에서 OVX836 그룹에서 용량-반응 관계를 뒷받침한다. 도 7은 1일째와 8일째의 결과를 보여준다.
프로토콜별(PP-D29) 코호트에서 반응 동역학(통합 연령층) 측면에서 OVX836 90μg 그룹은 기준선에서 90(131 ± 153) SFC/million PBMC에서 8일과 29일에 각각 167(223 ± 191) 및 163(208 ± 183) SFC/million PBMC로 중앙값(평균 ± SD)이 증가했다. OVX836 180μg 그룹의 중앙값(평균 ± SD)은 기준선에서 95(168 ± 242) SFC/백만 PBMC에서 8일째와 29일째 각각 200(294 ± 275) 및 190(278 ± 245) SFC/백만 PBMC로 증가했다. 그 후 두 OVX836 그룹 모두 180일째에 반응이 기준선까지 감소했다. 인플루백 테트라 그룹의 중앙값(평균 ± SD)은 기준선에서 96(137 ± 153) SFC/백만 PBMC, 8일, 29일, 180일에 각각 108(147 ± 149), 94(162 ± 206), 81(121 ± 131) SFC/백만 PBMC로 비교적 안정적으로 유지되었다. 18-49세 대상자, PP-D29 코호트: OVX836 90μg 그룹의 중앙값(평균 ± SD)은 기준선에서 102(138 ± 148) SFC/million PBMC에서 8일과 29일에 각각 198(252 ± 208) 및 175(205 ± 169) SFC/million PBMC로 증가했다. OVX836 180μg 그룹의 중앙값(평균 ± SD)은 기준선에서 97(152 ± 174) SFC/백만 PBMC에서 8일과 29일에 각각 198(275 ± 239) 및 202(260 ± 210) SFC/백만 PBMC로 증가했다. 인플루백 테트라 그룹의 중앙값(평균 ± SD)은 기준선에서 102(138 ± 155) SFC/백만 PBMC, 8일째와 29일째에 각각 108(137 ± 134) 및 106(169 ± 221) SFC/백만 PBMC로 비교적 안정적으로 유지되었다. 통계적 관점에서 볼 때, 시간(p<0.0001), 치료(p=0.0471), 시간-치료 상호작용(p<0.0001)의 효과가 유의미하였다. 1일차에는 그룹 평균 간에 유의미한 차이가 없었다(모두 p>0.05). 8일차에는 OVX836 90μg과 인플루백 테트라(p=0.0017), OVX836 180μg과 인플루백 테트라(p=0.0001) 사이의 차이가 유의미하였다. 29일차에는 OVX836 180μg과 인플루백 테트라 간의 차이만 유의미하였다(p=0.0202).
50~65세 대상자, PP-D29 코호트: OVX836 90μg 그룹은 기준선에서 62(114 ± 168) SFC/백만 PBMC에서 8일째와 29일째 각각 107(152 ± 113) 및 133(216 ± 219) SFC/백만 PBMC로 중앙값(평균 ± SD)이 증가했다. OVX836 180μg 그룹의 중앙값(평균 ± SD)은 기준선에서 93(209 ±370) SFC/백만 PBMC에서 8일째와 29일째 각각 222(345 ± 354), 171(328 ± 321) SFC/백만 PBMC로 증가했다. 인플루백 테트라 그룹의 중앙값(평균 ± SD)은 기준선에서 84(137 ± 151) SFC/백만 PBMC, 8일째와 29일째에 각각 103(172 ± 186) 및 79(144 ± 159) SFC/백만 PBMC로 비교적 안정적으로 유지되었다. 통계적 관점에서 볼 때, 시간(p=0.0004)과 시간-치료 상호작용(p=0.0479)의 효과가 유의미했다. 치료의 효과는 유의하지 않았다(p=0.0964). 1일차에는 그룹 평균 간에 유의미한 차이가 없었다(모두 p>0.05). 8일째에는 두 OVX836 용량 수준 간의 차이만 유의했다(p=0.0217). 29일째에는 OVX836 180μg과 인플루백 테트라의 차이만 유의미했다(p=0.0372).
프로토콜별 - D29(PP-D29) 코호트에서 IFNγ를 발현하는 NP 특이적 CD4+ T 세포의 기준선(백신 접종 전) 비율은 낮았으며 치료 그룹 간에 매우 유사했다. 인플루백 테트라 접종 그룹에서는 백신의 효과가 전혀 나타나지 않았다. OVX836 90μg 그룹의 중앙값(평균 ± SD)은 기준선에서 0.022%(0.034 ± 0.043%)에서 8일째에 0.075%(0.088 ± 0.063%)로, 29일째에 0.075%(0.089 ± 0.057%)로 증가했다. OVX836 180μg 그룹에서는 기준선 0.028%(0.034 ± 0.027%)에서 8일째 0.083%(0.106 ± 0.076%)로, 29일째 0.096%(0.107 ± 0.070%)로 증가했다. 그 후 두 그룹 모두 180일째에 기준선 보다 약간 높은 수치로 반응이 감소했다(OVX836 90μg 그룹은 0.040%[0.048% ± 0.028%], OVX836 180μg 그룹은 0.050%[0.055% ± 0.032%]로 감소했다). 도 8에서 볼 수 있듯이, 8일째와 29일째에 OVX836 180μg은 OVX836 90μg과 유의미한 차이를 보였으며(각각 p=0.0406 및 p=0.0353), 이는 앞서 언급한 총 T세포 반응에 대한 용량-반응 관계를 뒷받침한다(50세 미만과 그 이상의 연령층에서도 관찰됨). 이러한 NP 특이적 다기능성 CD4 T세포 반응은 백신 접종 후 6개월 동안 지속되었다. 또한 모든 용량의 OVX836에 대해 항-NP IgG가 강력하고 장기적으로 증가하는 것으로 나타났다.
안전성 결과
또한 2a상 임상시험에서 안전성에 대한 용량 반응 효과가 없는 것으로 확인되어 90 및 180 μg의 시험 용량 모두에서 허가된 계절성 독감 백신과 유사한 우수한 안전성 프로파일을 나타냈다.
효능 결과
가장 흥미로운 점은 인플루엔자 유사 질환(ILI) 증상에 대한 180μg의 OXV836의 보호 효능에 대해 역치 효과가 나타났다는 점이다.
보다 구체적으로, 카플란-마이어 생존 분석은 인플루엔자 시즌 동안 비특이적 ILI의 누적 위험도를 시간의 함수로 평가하는데 사용되었다. 두 가지 분석이 수행되었다. 첫 번째는 2019-2020년 독감 시즌 동안 2020년 3월 9일까지 발생한 모든 ILI를 고려했고(도 9), 두 번째는 같은 기간에 발생했지만 백신 접종 후 14일 이후부터 발생한 ILI를 고려했다(도 10). 실제로 백신은 접종 후 약 2주 후부터 대상자를 보호하기 시작한다는 것이 일반적으로 인정되고 있다. 세 치료 그룹을 비교하기 위해 로그-랭크 테스트를 사용했다. 독감 시즌에 발생한 모든 ILI를 고려했을 때, 치료 그룹 간의 모든 비교는 유의하지 않았다(p=0.325). 같은 기간에 발생했지만 백신 접종 후 14일 이후에 발생한 ILI를 고려했을 때, 통계적으로 유의하지는 않지만 세 그룹 간에 차이가 있는 경향이 있었으며(p=0.088), 특히 OVX836 90μg과 OVX836 180μg 간의 차이(p=0.054), OVX836 90μg과 인플루백 테트라 간의 차이(p=0.130), OVX836 180μg과 인플루백 테트라는 매우 유사한 프로파일(p=0.650)이 나타났다.
독감 시즌 동안과 백신 접종 후 14일 이상 경과한 후의 ILI 수에서 OVX836 90μg 그룹은 비슷한 프로파일을 보인 OVX836 180μg 및 인플루백 테트라 그룹에 비해 높은 수치를 보였다(독감 시즌 동안과 백신 접종 후 14일 후부터 각각 8개, 2개 및 3개의 ILI를 보인 OVX836 90μg, OVX836 180μg 및 인플루백 테트라 그룹, 도 11 참조). 이는 180μg 용량에서 OVX836의 효능에 대한 잠재적 신호를 나타낼 수 있다. 물론 이는 추가 임상시험을 통해 살펴볼 필요가 있다.
마지막으로, 하위 집단 분석에서 도 12는 기준선에서 CD8+ 반응의 최하위 사분위수(백신 접종 전 인플루엔자 바이러스에 최근 노출/감염되었을 가능성이 가장 낮은 집단)에 속하는 대상자의 경우 OVX836 180μg 그룹에서만 IFNγ를 발현하는 NP 특이 CD8+ T 세포의 중간 비율이 크게 증가(p=0.020)한 것으로 나타났다.
요약하면, 임상 2a상 결과는 180μg 보다 높은 용량의 OVX836을 테스트해야 하는 강력한 근거를 제시한다. 이 근거는 다음과 같이 요약할 수 있다:
1. 면역원성: NP 특이적 면역 반응의 강력한 증가
- NP 특이적 총 T세포(ELISpot), CD4 T세포(ICS) 및 IgG(후자의 경우 추세)에 대해 90μg 보다 우수한 180μg의 용량-반응 효과
- 기준선에서 CD8+ 반응의 최하위 사분위수에서 180μg으로 유의미한 용량-반응 효과(도 12의 하위집단 분석)
2.
효능: 독감 시즌 동안 OVX836 180μg이 90μg보다 우수한 ILI 감소 효과
- ILI의 누적 위험에 대한 180μg과 90μg의 차이 추세
- 독감 시즌 중 ILI 발생 건수 측면에서 180μg과 90μg 사이의 유의미한 차이
3. 안전성: OVX836은 모든 환자에게 모든 용량(최대 180μg)에서 내약성이 우수하다.
- 백신 관련 심각한 이상반응 없음
- 상용 백신과 유사
- 질병 개선에 대한 증거 발견되지 않음
이러한 데이터를 종합하면, 실시예 4에 설명된 대로 새로운 개발 프로그램으로서 고용량의 OVX836을 조사할 것을 제안한다.
실시예 4: 2차 임상 1상/임상 2a상 연구(OVX836-003)
결과
안전성: 모든 용량(180, 300, 480 μg)의 OVX836은 안전하고 내약성이 우수하며 계절성 4가 인플루엔자 백신인 인플루백 테트라(Influvac TetraTM)와 유사한 것으로 나타났다. "중증"(FDA 백신 임상시험 독성 등급 기준 3등급) 이상반응 발생률이 낮고 용량 제한 효과도 없었다.
면역원성: 임상 1상 결과의 예비 분석과 달리, 이번 2차 임상 2a상에서는 180μg 이상의 용량과 최대 480μg의 용량에서 유의미한 면역 반응 효과가 명확하게 입증되었다.
특히, 주사 8일 후 180~480μg의 용량 반응과 함께 NP 특이적 T세포 반응, 특히 NP 특이적 CD4+T세포 반응의 강한 증가가 관찰되었다. 또한 300μg 및 480μg 용량 수준에서 주사 8일 후 NP 특이적 CD8+ T세포 반응(IFNγ+/IL2+/TNFα- CD8 T세포)이 관찰되었으며, 이는 180μg 용량 수준에서 주사 8일 후 반응이 관찰되지 않은 것과는 다른 양상이다.
프로토콜별 Bonferroni의 그룹 간 쌍별 비교 통계를 사용한 결과, 8일째에 OVX836 480μg은 항-NP IgG 반응 측면에서 OVX836 180μg과 유의미한 차이가 있어 180μg 용량 수준 이상의 용량-반응 관계를 뒷받침했다(도 13). 통계적 관점에서는 유의미하지 않지만, 투여 8일째 대 1일째 양성 CD4 T-세포 비율, 특히 IFNγ+/IL2+TNFα-CD4 T세포(p=0.083)와 다양성 CD4 T세포(p=0.102)에 대해 OVX836 480μg과 180μg 그룹 간에 용량-효과 관계가 있는 경향이 있었다.
또한, 치료군 간 및 시점 간 차이를 테스트하기 위해 그룹 간 ANOVA 테스트를 사용하여 면역원성 데이터에 대한 탐색적 추론 분석을 적용했을 때 T세포 반응(총 T세포, CD4 및 CD8 T세포)의 1일차와 8일차 사이의 변화 측면에서 OVX836의 180μg과 더 높은 용량 수준 사이에서 용량-효과 관계가 관찰되었으며 유의한 경우(p<0.05) 쌍별 피셔의 LSD 비교를 통해 치료 그룹 간이 차이를 평가하였다. 종점과 비교의 다양성을 고려하기 위한 수정 사항이 적용되지 않았기 때문에, 5% 미만의 p값은 통계적으로 유의미한 잠재적 차이를 나타내는 것으로만 간주해야 한다:
- ELISpot IFNγ 반응(도 14A): 플라시보는 전혀 효과가 없었다. OVX836 180μg 그룹에서 1일차와 8일차 사이의 평균 변화는 백만 PBMC당 124 SFC(p=0.002 vs 플라시보)였으나, 300μg 및 480μg 용량 수준에서는 각각 백만 PBMC당 201 및 223 SFC 증가했다(두 용량 수준 모두에서 플라시보 대비 p<0.001 비교). 480μg과 180μg 사이에는 유의미한 차이가 관찰되었다(p=0.014).
- CD4 T세포 반응(도 14B): 플라시보는 전혀 효과가 없었다. OVX836 180μg 그룹에서 1일차와 8일차 사이에 IFNγ에 대한 양성인 CD4 T 세포의 % 평균 변화는 0.046 (p<0.001 vs 플라시보)이었으나, 300μg 및 480μg 용량 수준에서는 각각 0.048 및 0.065 (두 용량 수준 모두에서 플라시보 대비 p<0.001)로 증가했다. 480μg과 180μg(p=0.022), 480μg과 300μg(p=0.043) 용량 간에는 유의미한 차이가 관찰되었다.
- CD8 T 세포 반응(도 14C): 플라시보나 180μg 또는 300μg 용량 수준에서는 효과가 나타나지 않았다. OVX836 480μg 그룹에서 투여 1일째와 8일째 사이에 IFNγ 및 IL2에 대한 양성인 CD4 T 세포의 % 평균 변화는 0.034(p=0.006 vs 플라시보)였다. 1일차와 8일차 사이에 IFNγ 및 IL2에 대한 양성인 CD4 T 세포의 % 평균 변화 측면에서 480μg 그룹과 180μg 그룹 간에 유의미한 차이가 관찰되었다(p=0.036).
효능: 관찰 연구(FLU-001 연구)는 OVX836-003 연구(동일한 장소, 동일한 모집 시기, 동일한 포함/제외 기준)와 병행하여 관찰 연구를 진행하였는데, 이는 인플루엔자가 활발하게 순환하는 경우 두 코호트를 병합하여 평형화된 200명의 대상으로 구성된 세트(180μg 보다 높은 용량의 OVX836 50%, 플라시보 또는 치료받지 않은 대상의 50%)에 대한 ILI에 대한 분석을 목표로 했다
PCR로 확인된 증후성 인플루엔자(ILI)의 2건이 OVX836군(모든 용량 수준)에서 보고된 데 비해, 플라시보 + 미치료 코호트의 경우 9건이 보고되었으며, 이는 관찰된 효능이 79%를 반영한다 [5.4%; 95.4%] (도 15 참조).
실시예 5: 2a상 연구(OVX836-004)
결과
안전성: 모든 군(4가 불활성화 인플루엔자 백신(QIIV), OVX836 & QIIV, OVX836)은 "중증"(백신 임상 시험에 대한 FDA 독성 척도에 따라 3등급) 부작용 발생률이 낮고 안전하고 내약성이 우수한 것으로 나타났다(QIIV군에서는 중증 피로/근육통 1건, OVX836군에서는 중증 두통 1건)이 연구에서 보고되었지만 "중증"(백신 임상 시험에 대한 FDA 독성 등급에 따른 4등급) 이상반응은 보고되지 않았다.
효능: PCR로 확인된 증상성 인플루엔자(ILI) 사례는 QIIV군에서는 3건, OVX836군에서는 1건, OVX836 및 QIIV군에서는 2건이 보고되었다.
실시예 6: 발명 실시에 유용한 서열
표 2. 발명 실시에 유용한 서열
표 3: 서열 목록
Claims (15)
- 인플루엔자 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 백신 또는 면역요법으로 사용하기 위한 면역원성 조성물로,
상기 면역원성 조성물은,
(i) 인플루엔자 핵단백질 항원 및,
(ii) C4bp 올리고머화 도메인으로부터 유래된 자가 조립 폴리펩티드 및 양전하를 띤 테일(tail)을 포함하는 운반체 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하고,
여기서 상기 융합 단백질의 180μg 이상의 양, 예를 들어 200μg, 240μg의 양이 상기 인간 대상체에게 투여되는 면역원성 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 융합 단백질의 300μg 이상, 또는 480μg 이상의 양이 상기 인간 대상체에게 투여되는 면역원성 조성물.
- 제 1 항 내지 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 운반체 단백질은, 선택적으로 글리신-세린 링커를 통해, 핵단백질 항원에 C-말단에 융합되는 면역원성 조성물.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 융합 단백질은 자가-조립 후에 헵타머 입자(heptameric particle)를 형성하는 면역원성 조성물.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 인플루엔자 핵단백질 항원은 인플루엔자 균주 A, B 또는 C의 적어도 하나의 핵단백질 항원을 포함하며, 예를 들어 필수적으로 인플루엔자 바이러스 A/Wilson-Smith/1933 H1N1의 NP 항원으로 구성되는 면역원성 조성물.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 인플루엔자 핵단백질 항원은
(i) SEQ ID NO:1의 폴리펩티드, 또는
(ii) SEQ ID NO:1과 적어도 90% 동일성을 갖는 항원성 폴리펩티드 변이체
를 포함하는 면역원성 조성물.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 C4bp 올리고머화 도메인으로부터 유래된 자가-조립 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:2와 적어도 90% 동일성을 갖는 이의 기능적 변이체를 포함하는 면역원성 조성물.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 양전하를 띤 테일은 서열 ZXBBBBZ(SEQ ID NO: 3)를 포함하며,
여기서 (i) Z는 없거나 임의의 아미노산이고, (ii) X는 임의의 아미노산이며, (iii) B는 아르기닌 또는 라이신이고, 바람직하게 상기 양전하를 띤 테일은 SEQ ID NO:4의 서열을 포함하는 면역원성 조성물.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 운반체 단백질은 필수적으로 SEQ ID NO:5로 구성되거나, 상기 운반체 단백질은 SEQ ID NO:5와 적어도 90% 동일성을 갖는 SEQ ID NO:5의 기능적 변이체인 면역원성 조성물.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 융합 단백질은 SEQ ID NO:6을 포함하거나 필수적으로 이로 구성되거나, SEQ ID NO:6과 적어도 90% 동일성을 갖는 SEQ ID NO:6의 기능적 변이체인 면역원성 조성물.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 융합 단백질의 양은 근육내 경로를 통해 투여되는 면역원성 조성물.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 융합 단백질의 양은 단일 주사로, 바람직하게 근육내 경로를 통해 상기 인간 대상체에게 투여되는 면역원성 조성물.
- 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 대상체는 50세 미만인 면역원성 조성물.
- 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 대상체는 50세 이상인 면역원성 조성물.
- 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 사용은 NP에 특이적인 전체 T 세포 반응, NP에 특이적인 CD4 T 세포 반응, NP에 특이적인 CD8 T 세포 반응, 항-NP IgG(항체 반응) 및/또는 인플루엔자 증상(유사 인플루엔자 증상), 특히 인플루엔자 균주 A 또는 B에 의한 인플루엔자 감염으로부터 보호 또는 교차-보호를 제공하는 면역원성 조성물.
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