KR20220010478A

KR20220010478A - 기도 감염의 치료 또는 예방용 서브유닛 백신

Info

Publication number: KR20220010478A
Application number: KR1020217034461A
Authority: KR
Inventors: 파비앙 페루지; 클라우스 슈밤본; 볼프강 슈욀러; 울반 룬트베르크; 안드레아스 마인케
Original assignee: 발네바 에스이
Priority date: 2019-05-20
Filing date: 2020-05-19
Publication date: 2022-01-25
Also published as: MX2021013111A; US20220185847A1; PE20220400A1; IL287099A; ZA202106883B; JP2022533318A; AU2020277661A1; GB202114836D0; WO2020234300A1; CO2021014694A2; SG11202110646PA; CL2021002819A1; GB2598494A; EP3972639A1; CN114127101A; US20240067681A1; ECSP21079178A; CA3138064A1

Abstract

본 발명은 융합전 형태에서 안정화된 변형 메타뉴모바이러스(hMPV) F 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 기도 감염에 대한 인간 대상의 예방 및/또는 치료를 위한 이들 단백질을 포함하는 면역원성 조성물(백신)에 관한 것이다.

Description

기도 감염의 치료 또는 예방용 서브유닛 백신

인간 메타뉴모바이러스(hMPV)는 어린이(0 내지 4세), 면역 저하 환자 및 노인에서 급성 기도 감염의 주요 원인으로 이는 이러한 범주의 환자에게 치명적일 수 있다(문헌[Schildgen et al. 2011. Clinical Microbiology Reviews 24(4): 734―54]). 집중적인 노력에도 불구하고, 현재 hMPV 감염을 예방하거나 치료하기 위한 허가된 백신이나 항바이러스제는 없다. 조사된 여러 백신 접종 전략 중에서, 바이러스 단백질, 특히 hMPV F 단백질을 함유하는 서브유닛 백신이 가장 유망하다(문헌[Melero & Mas. 2015. Virus Res. 209: 128-35]).

hMPV는 파라믹소비리다에 계통의 뉴모바이러스 속의 엔벨로프, 단일 가닥 RNA 바이러스이다. hMPV 게놈은 3개의 표면 당단백질 F, G 및 SH를 포함하여 9개의 단백질을 코딩하는 8개의 유전자로 이루어진다. hMPV에 대한 보호는 주로 융합(F) 당단백질에 대한 항체를 중화함으로써 제공되며, 이는 상이한 유전자형 사이에서 고도로 보존되고 다른 파라믹소바이러스와 유사성을 공유한다(문헌[van den Hoogen et al. 2004. Emerging Infectious Diseases 10(4): 658―66]; 문헌[van den Hoogen et al. 2002. Virology 295(1): 119―32]를 참조).

파라믹소바이러스 F 단백질은 세포외막에 대해 엑토도메인을 표적으로 하는 신호 펩티드를 N-말단에 함유하고, 막에 한 번 걸치는 I형 통합 막 단백질이다. C-말단에서, 소수성 중지-전달 도메인(TM 도메인)은 단백질을 막에 고정시켜, 짧은 세포질 테일을 남긴다(도 1 참조).

천연 F 단백질은 신호 펩티드의 절단 후 F0로 지정된 불활성 전구체로서 합성된다(문헌[Yin et al. 2006. Nature 439 (7072): 38―44]; 문헌[Yin et al. 2005. Proc. Nat. Acad. Sci. 102(26): 9288―93]; 문헌[Russell et al. 1994. Virology 199(1): 160―8]). 생물학적으로 활성이 되기 위해, F0은 숙주 프로테아제에 의해 가공되어 F1 및 F2로 지칭된 2개의 사슬을 생성하고, 이는 디설파이드 결합에 의해 공유 결합된다(문헌[Schowalter et al. 2006. Journal of Virology 80(22): 10931―41]; 문헌[Biacchesi et al. 2006. Journal of Virology 80(12): 5798―806]; 문헌[Yun et al. 2015. Scientific Reports 5: 15584]). 3개의 F1-F2 이형이량체는 준안정 융합전 형태에서 비리온 엔벨로프로 혼입되는 성숙 F 단백질을 형성하고(문헌[(Battles et al. 2017. Nat. Commun. 8(1): 1528)]), 비리온 엔벨로프와 숙주 세포 혈장 막의 융합을 매개한다. 융합 과정 중, F 단백질은 불안정한 융합전 형태로부터 안정한 융합후 형태로 비가역적으로 다시 접힌다(도 2 참조).

인간 혈청에서 융합전 hMPV F 단백질 구조를 특이적으로 인식하는 중화 항체가 발견되어(문헌[Wen et al. 20012. Nat. Struct. Mol. Biol. 19: 461―463]; 문헌[Ngwuta et al. 2015. Science Translational Medicine 7(309): 309]; 문헌[Rossey et al. 2018. Trends in Microbiology 26(3): 209―19]), 융합전 F 단백질이 유리한 백신 후보가 될 수 있음을 나타낸다(문헌[Melero & Mas. 2015. Virus Res. 209: 128-35]). 융합후 F 단백질 형태에 대한 융합전 F 단백질 형태의 하나의 명백한 단점은 이의 불안정성이다. 안정화된 융합전 F 단백질을 생산하기 위한 이전의 시도들은 철저한 구조 분석 및 컴퓨터 모델링을 이용하였다. 특히, 한 그룹은 래트에서 보호 반응을 제공할 수 있는 매우 안정한 융합전 RSV F 단백질의 디자인을 설명했다(문헌[Krarup et al. 2015. Nat. Commun. 6: 8143]를 참조). 다른 그룹은 hMPV F 단백질로 면역화된 마우스에서 중화 항체를 유발한, 상기 단백질의 안정화된 융합전 형태의 구조를 개시했다(국제공개 WO2016/103238호 참조).

융합전 및 융합후 형태에서의 F 단백질의 결정 구조가 hMPV, RSV 및 다른 파라믹소바이러스에 대해 결정되었다(예를 들어, 문헌[Battles et al. 2017. Nat. Commun. 8(1): 1528]를 참조). 일반적인 구조 유사성에도 불구하고, 융합전 hMPV F 단백질이 hMPV와 RSV의 F 단백질 사이에 실질적인 기능적 및 면역학적 차이를 부여하는 독특한 구조적 특징을 가지고 있음이 밝혀졌다.

hMPV F 단백질의 작용 메커니즘, 구조 및 면역원성 특성을 이해하는 데 상당한 진전이 있었음에도 불구하고, F 단백질 기반 백신은 시판되지 않고 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 기도 감염에 대한 인간 백신의 개발을 위한 신규한 변형된 융합전 hMPV F 단백질 후보물질을 제공하는 것이다.

본 개시내용은 중화 항체를 유도하고, hMPV 감염에 대항하여 보호할 수 있는 재조합 면역원성 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) F 단백질 및 이의 단편(본원에서 hMPV F 단백질로 지칭됨)을 제공한다. hMPV F 단백질의 천연 코딩 서열은 안정한 융합전 형태를 생성하기 위해 변형되었다. 상기 변형은 본 발명의 일부로서 포함된 3차원(3D) 상동 모델을 기반으로 고안되었다. 추가로 본 발명은 재조합 면역원성 단백질의 제조 방법 및 인간에서 hMPV 감염의 예방 및/또는 치료용 면역원성 단백질의 사용 방법을 포함한다.

일 양태에서, 본 개시내용은 융합 단백질(FP)이 결여된 F1 도메인, 이종 펩티드 링커 및 F2 도메인으로 구성된 단일 사슬 폴리펩티드를 포함하는, 융합전 형태에서 안정화된 변형된 hMPV F 단백질 또는 이의 단편을 제공하고, 상기 링커는 F2 및 F1 도메인 사이에 위치하고, F1 도메인에 존재하는 시스테인 잔기와 비천연 디설파이드 결합을 각각 형성하는 하나 이상의 시스테인 잔기(들)를 함유한다.

일 실시형태에서, 단일-사슬 F 단백질은 F2 도메인과 F2의 C-말단이 F1의 N-말단과 근접하도록 연결된 F1 도메인을 포함한다. F2 및 F1 사이의 프로테아제 절단 부위는 단백질 전구체의 절단을 제거하기 위해 돌연변이화될 수 있다. 일부 실시형태에서, F1 도메인은 절단된 F1 도메인일 수 있고, 이에 따라 예를 들어 이에는 서열 번호 3의 천연 F1 도메인 서열의 잔기 1 내지 16에 해당하는, 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열의 위치 103 내지 118에서 아미노산 잔기에 걸친 융합 펩티드(FP)가 결여된다. 따라서, F1 도메인은 서열 번호 1의 잔기 119 내지 539 또는 서열 번호 3의 잔기 17 내지 437에 해당하는 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일-사슬 폴리펩티드는 서열 번호 1의 잔기 119 내지 490 또는 서열 번호 3의 잔기 17 내지 338에 해당하는 F1 도메인의 단편을 포함할 수 있고, 이는 고정 막관통(TM:transmembrane) 도메인과 세포질 테일을 이의 C-말단에 함유하지 않는다. 추가적으로, F1 및 F2 도메인은 예를 들어 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 5개의 잔기를 함유하는 이종 펩티드 링커, 바람직하게는 서열 번호 4의 링커를 통해 연결될 수 있다.

다른 일 실시형태에서, 본 발명의 단일-사슬 F 단백질은 안정한 융합전 형태를 갖는다. 한편, 융합전 형태는 F1과 F2 도메인 사이의 프로테아제 절단을 파괴하고, F1의 자유 N-말단의 결여에 의해 안정화된다. 안정화를 부여하는 또 다른 특징은 HRA 도메인을 삼량체화에 의해 형성된 공동 내부에 고정시키는, 적어도 하나의 추가적인 디설파이드 결합(비천연 포함)의 존재이다(도 3 참조). 일 실시형태에서, 비천연 디설파이드 결합은 F2 및 F1 사이에 삽입된 이종 펩티드 링커의 시스테인 잔기와 F1 도메인, 바람직하게는 이의 C-말단 영역에서 위치하고, 상기 공동 내 위치한 시스테인 잔기 사이에 형성될 수 있다. 예를 들어, 비천연 디설파이드 결합은 펩티드 링커의 시스테인 잔기와 서열 번호 3의 천연 F1 도메인 서열의 위치 236에 해당하는 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열의 위치 338에서의 F1 도메인에 존재하는 비천연 시스테인 잔기 사이에서 형성될 수 있다. 상기 실시형태에서, 단일-사슬 F 단백질에 존재하는 F1 도메인(예를 들어, 서열 번호 3의 잔기 1 내지 16의 융합 펩티드가 결여된 절단된 F1 도메인)은 서열 번호 3의 서열에서 A236C(서열 번호 1의 A338C에 해당함)와 같은 돌연변이를 포함할 수 있다. 펩티드 링커의 시스테인 잔기는 예를 들어 F2 도메인과 바로 인접할 수 있고, 예를 들어 이종 링커의 N-말단에서의 첫번째 잔기일 수 있고, F2 도메인의 C-말단과 인접할 수 있다. 예를 들어, 펩티드 링커의 시스테인 잔기는 서열 번호 1의 잔기 103과 동일한 위치에서 재조합 폴리펩티드에 존재할 수 있다.

추가의 실시형태에서, 단일-사슬 F 단백질은 단일-사슬 함유 F 삼량체의 변경된 기하구조를 보상하는 하나 이상의 추가의 변형(들)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 변형(들)은 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열의 위치 49, 51, 67, 80, 97, 137, 147, 159, 160, 161, 166, 177, 185, 258, 266, 294, 480 및/또는 481에 해당하는 위치에서의 치환(들)이다. 특히, 위치 97에서 아스파라긴은 글루타메이트에 대해 치환(N97Q)될 수 있거나, 위치 185에서 알라닌은 프롤린에 대해 치환(A185P)될 수 있다. 따라서, 재조합 폴리펩티드는 서열 번호 2의 위치 31, 33, 49, 62 및/또는 79에서의 하나 이상의 치환(들)을 포함하는 F2 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 폴리펩티드는 서열 번호 3의 위치 35, 45, 57, 58, 59, 64, 75, 83, 156, 164, 192, 378 및/또는 379에서의 하나 이상의 치환(들)을 포함하는 F1 도메인(예를 들어, 서열 번호 3의 잔기 1 내지 16이 결여된 절단된 F1 도메인)을 포함할 수 있다.

추가로, 일부 돌연변이(들)는 공동 충전의 결핍을 보상할 수 있다. 특히, 공동 충전 돌연변이는 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열의 위치 49, 67, 80, 137, 147, 159, 160, 161, 177 및 258에서의 아미노산 치환을 포함하는 목록으로부터 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, 공동 충전 돌연변이는 서열 번호 1에서의 T49M 치환, I67L 치환, I137W 치환, A147V 치환, A159V 치환, T160F 치환, A161M 치환 및/또는 I177L 치환을 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드는 서열 번호 2의 서열에서 T31M 또는 I49L 치환을 포함하는 F2 도메인을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드는 I35W, A45V, A57V, T58F, A59M, I75L 및/또는 F156I로부터 선택된, 서열 번호 3에서의 하나 이상의 치환을 포함하는 (예를 들어, 절단된) F1 도메인을 포함할 수 있다.

다른 실시형태에서, 재조합 단일-사슬 F 단백질은 비천연 수소 결합(들) 또는 염 브릿지(들)의 형성을 유도하는 하나 이상의 치환(들)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 치환은 서열 번호 1의 E80N 및 S266D를 포함한다. 따라서, 재조합 폴리펩티드는 서열 번호 2의 서열에서 E62N 치환을 포함하는 F2 도메인을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드는 서열 번호 3의 치환 S164D를 포함하는 (예를 들어, 절단된) F1 도메인을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 재조합 단일-사슬 F 단백질은 추가의 안정화 디설파이드 결합(들)의 생성을 위한 추가의 시스테인 치환(들)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 치환 E51C 및 K166C는 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열의 F2 도메인의 β-가닥의 위치 51에서의 시스테인 잔기와 HRA α4 요소의 위치 166에서의 시스테인 사이에서 비천연 디설파이드 결합을 형성할 수 있다. 이러한 변형은 HRA의 나선으로부터의 E51 및 K138 사이의 가능한 염 브릿지를 손상시킨다. 돌연변이 S266D은 상기 나선의 부착 손실을 보상하기 위해 K138에 비천연 염 브릿지를 도입한다. 추가로, 시스테인에 대한 서열 번호 1의 인접 잔기 I480 및 L481의 치환은 공유 결합 삼량체 단백질을 만들기 위해 3개의 프로모터에 걸쳐 3개의 디설파이드 결합을 도입할 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드는 서열 번호 2의 서열에서 E33C 치환을 포함하는 F2 도메인을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드는 서열 번호 3에서의 치환(들) K64C, S164D, I378C 및/또는 L379C를 포함하는 (예를 들어, 절단된) F1 도메인을 포함할 수 있다.

다른 실시형태에서, 재조합 단일-사슬 F 단백질은 가용성 재조합 단백질의 발현에 유용한 변형(들)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 글루탐산 잔기에 대한 글리신의 치환은 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열의 위치 294(G294E)에서 존재할 수 있으며, 이는 보다 높은 수율의 단백질 발현을 유도할 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드는 서열 번호 3에서의 치환 G192E를 포함하는 (예를 들어, 절단된) F1 도메인을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 재조합 단일-사슬 F 단백질은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산 치환 및/또는 다른 변형의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 단일-사슬 F 단백질은 단백질 삼량체의 형성을 허용하는, 폴드온 도메인으로 지칭된, 예를 들어 재조합 F 단백질 서브유닛의 C-말단에 연결된 삼량체화 헬퍼를 포함할 수 있다. 폴드온 도메인은 T4 박테리오파지의 피브리틴으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 재조합 hMPV F 단백질은 동형삼량체 또는 이형삼량체로서 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 hMPV F 단백질은 서열 번호 5 내지 9 또는 24 내지 28 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다. 재조합 단일 사슬 F 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 F2 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단일 사슬 F 단백질은 서열 번호 3의 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 F1 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 단일 사슬 F 단백질은 서열 번호 3의 아미노산 서열의 잔기 17 내지 437 또는 17 내지 388과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 절단된 F1 도메인을 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 hMPV F 단백질은 면역원성이고, 천연 hMPV F 단백질을 인식하는 중화 항체를 유도할 수 있다. 또한, 본 개시내용은 서열 번호 5 내지 9 또는 24 내지 28 중 어느 하나의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 재조합 hMPV 단백질의 면역원성 단편 및 면역원성 단백질을 포함한다.

본 개시내용은 또한 변형된 hMPV F 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 변형 hMPV F 단백질의 재조합 발현을 위한 숙주 세포를 제공한다.

본 개시내용은 또한 아쥬반트와 사용되거나 사용되지 않는, 본 발명의 재조합 hMPV F 단백질, 또는 hMPV F 단백질을 코딩하는 단리된 DNA 분자 또는 벡터를 포함하고, 추가로 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신을 제공한다. 특히, 본 개시내용은 대상에서 면역 반응, 특히 hMPV 감염에 대해 보호할 수 있고, hMPV 바이러스를 중화시킬 수 있는 면역 반응을 자극하기 위한 면역원성 조성물 또는 백신을 제공한다. 본 개시내용은 추가로 hMPV, RSV 또는 PIV3(파라인플루엔자 바이러스 유형 3) 유래의 추가 항원을 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신을 제공한다. 본원에 개시된 면역원성 단백질, 단리된 DNA 분자, 벡터 및 면역원성 조성물 또는 백신은 특히 바이러스 기도 감염 및 관련 질환, 특히 hMPV에 의해 야기된 감염 및 질환의 예방 및/또는 치료용 의약으로서 사용하기에 적합하다.

재조합 hMPV F 단백질, 또는 hMPV F 단백질을 코딩하는 단리된 DNA 분자 또는 면역원성 조성물(백신)의 제조 방법은 본 개시내용에 포함된다. 대상에서 면역 반응을 생성하는 방법, hMPV 감염의 치료, 저해 또는 예방 방법이 또한 포함된다.

추가의 양태에서, 본 발명은 천연 hMPV F 단백질 서열에 대한 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 융합전 형태에서 안정화된, 면역원성 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) 변형 F 단백질 또는 이의 단편을 제공하고, 상기 변형 F 단백질 또는 이의 단편은 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열의 위치 97에 해당하는 위치에서의 아스파라긴 잔기에 대해 치환된 글루타민 잔기(N97Q)를 포함한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 천연 hMPV F 단백질 서열에 대한 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 융합전 형태에서 안정화된, 면역원성 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) 변형 F 단백질 또는 이의 단편을 제공하고, 상기 변형 F 단백질 또는 이의 단편은 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열의 위치 294에 해당하는 위치에서의 글루탐산 잔기에 대해 치환된 글리신 잔기(G294E)를 포함한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 천연 hMPV F 단백질 서열에 대한 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 융합전 형태에서 안정화된, 면역원성 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) 변형 F 단백질 또는 이의 단편을 제공하고, 상기 변형 F 단백질 또는 이의 단편은 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열의 위치 49, 51, 67, 80, 137, 147, 159, 160, 161, 166, 177, 258, 266, 480 및/또는 481에 해당하는 위치에서의 하나 이상의 치환(들)을 포함한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 천연 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) F 단백질 서열에 대한 둘 이상의 아미노산 치환에 의해 융합전 형태에서 안정화된, 면역원성 hMPV 변형 F 단백질 또는 이의 단편을 제공하고, 상기 변형 F 단백질 또는 이의 단편은 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열에 대한 치환 E51C 및 K166C를 포함하고, 상기 치환된 시스테인 잔기는 비천연 디설파이드 결합을 형성한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 천연 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) F 단백질 서열에 대한 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 융합전 형태에서 안정화된, 면역원성 hMPV 변형 F 단백질 또는 이의 단편을 제공하고, 상기 변형 F 단백질 또는 이의 단편은 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열에 대한 T49M, E80N, I137W, A147V, A159V, T160F, A161M, I67L, I177L, F258I, S266D, I480C 및/또는 L481C로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함을 포함한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 천연 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) F 단백질 서열에 대한 셋 이상의 아미노산 치환에 의해 융합전 형태에서 안정화된, 면역원성 hMPV 변형 F 단백질 또는 이의 단편을 제공하고, 상기 변형 F 단백질 또는 이의 단편은 적어도 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열에 대한 치환 T49M, A161M 및 I67L 또는 I177L을 포함한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 천연 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) F 단백질 서열에 대한 셋 이상의 아미노산 치환에 의해 융합전 형태로 안정화된, 면역원성 hMPV 변형 F 단백질 또는 이의 단편을 제공하고, 상기 변형 F 단백질 또는 이의 단편은 하기 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열에 대한 치환 조합 중 하나를 포함한다:

N97Q, R102G 및 G294E;

N97Q, R102G, T160F, I177L 및 G294E;

N97Q, R102G, T49M, I67L, A161M, E80N, F258I 및 G294E;

N97Q, R102G, T49M, I67L, A161M, E51C, K166C, S266D, G294E, I480C 및 L481C; 또는

N97Q, R102G, T49M, A161M, I137W, A159V, A147V, I177L 및 G294E.

본원에 달리 구체화되지 않는 한, 본 명세서에 언급된 모든 아미노산 위치는 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열의 아미노산 위치에 해당한다. 서열 번호 2의 F2 도메인 및 서열 번호 3의 F1 도메인에서 상기 돌연변이의 해당 위치는 이로부터 바로 유래할 수 있다. 서열 번호 2의 F2 도메인은 서열 번호 1의 잔기 19 내지 102에 해당한다. 서열 번호 3의 F1 도메인은 서열 번호 1의 잔기 103 내지 539에 해당한다.

도 1은 제시된 도메인과 중요한 모티프를 갖는 천연 hMPV F 단백질의 개략도를 보여준다. F0: 단백질 전구체; F1, F2: F1 및 F2 도메인; SP: 신호 펩티드; FP: 융합 펩티드; HRA, HRB: 헵타드 반복 도메인 A 및 B, TM: 막관통 도메인; CYT: 세포질 테일; S-S: 디설파이드 결합.
도 2는 천연 hMPV F 단백질의 융합전 및 융합후 형태의 구조 변화를 보여준다. (A) HRB의 C-말단이 폴드온 도메인과 삼량체화되고, HRA가 헤드 도메인 상에서 접히는 융합전 F 도메인 삼량체의 리본 다이아그램. (B) HRA가 긴 평행 3-나선 번들을 형성하고, 배치된 HRB 나선과 함께 안정한 6-나선 번들을 형성하는 융합후 F 단백질 삼량체의 리본 다이아그램.
도 3은 제시된 돌연변이를 갖는 변형 융합전 hMPV F 단백질의 3차원 구조(리본 다이아그램)를 보여준다.
도 4는 SE-HPLC에 의한 재조합 hMPV F 단백질의 분석을 보여준다. 1 - sF_A1_K-E294, 2 - sF_A1_K_L7, 3 - L7F_A1_4.2, 4 - L7F_A1_31, 5 - L7F_A1_23, 6 - L7F_A1_33.
도 5는 하기 재조합 hMPV F 단백질에 대해 융합전 또는 융합후 특이적 항체로 수득된 ELISA 데이터를 보여준다: (A) sF_A1_K-E294; (B) sF_A1_K_L7; (C) L7F_A1_4.2; (D) L7F_A1_23; (E) L7F_A1_31; (F) L7F_A1_33; (G) L7F_A1_23.2. 모든 차트에서, (G)를 제외하고, 실선은 항-융합전 항체 MPE8 N113S의 상이한 희석물을 사용하여 수득된 신호를 나타내고, 점선은 항-융합후 항체 MF1의 상이한 희석물을 사용하여 수득된 신호를 나타낸다. (G)에서, 위의 선은 항-융합전 항체 MPE8 N113S를 사용하여 수득된 신호를 나타내고, 점선은 항-융합후 항체 MF1로 수득된 신호를 나타낸다.
도 6은 상이한 아쥬반트와 함께 재조합 F 단백질로 면역화된 마우스에서 혈청 IgG 역가를 보여준다. (A 및 B) 2 μg의 sF_A1_K_L7로 면역화된 마우스; (C 및 D) 2 μg의 sF_A1_MFur로 면역화된 마우스.
도 7은 Addavax^TM로 보강된 재조합 F 단백질로 면역화된 마우스에서 혈청 IgG 상호 희석 역가를 보여준다. 점선은 검출 한계를 나타낸다. (A) IgG_2a 상호 역가 희석물. (A) IgG1 상호 역가 희석물.
도 8은 IC31^®로 보강된 재조합 F 단백질로 면역화된 마우스에서 혈청 IgG 상호 희석 역가를 보여준다. 점선은 검출 한계를 나타낸다. (A) IgG_2a 상호 역가 희석물. (A) IgG1 상호 역가 희석물.
도 9는 상이한 아쥬반트와 함께 sF_A1_K_L7 단백질에 대해 마우스 혈청에서 중화 항체 역가(IC₅₀, 상호 희석 역가)가 상승하였음을 보여준다.
도 10은 (A) Addavax^TM 또는 (B) IC31^®에 의해 보강된 재조합 F 단백질에 대해 마우스 혈청에서 중화 항체 역가(IC₅₀, 상호 희석 역가)가 상승하였음을 보여준다.
도 11은 상이한 용량의 재조합 F 단백질에 대해 마우스 혈청에서 중화 항체 역가(IC₅₀, 상호 희석 역가)가 상승하였음을 보여준다. (A) 6 μg F 단백질로 면역화된 마우스, (B) 2 μg F 단백질로 면역화된 마우스, (C) 0.6 μg F 단백질로 면역화된 마우스, (D) 0.2 μg F 단백질로 면역화된 마우스 및 (E) 0.06 μg F 단백질로 면역화된 마우스.
도 12는 Addavax로 보강된 2 μg의 재조합 F 단백질로 면역화된 후 야생형 hMPV로 공격받은 마우스의 폐에서 바이러스 RNA 로드를 보여준다(RT-qPCR로 측정됨). A 및 B는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 13은 Addavax^TM로 보강된 재조합 F 단백질로 면역화한 후 야생형 hMPV로 공격받은 마우스에서의 보호를 보여준다(폐 콜로니화 검정). (A) 6 μg F 단백질로 면역화된 마우스, (B) 2 μg F 단백질로 면역화된 마우스, (C) 0.6 μg F 단백질로 면역화된 마우스, (D) 0.2 μg F 단백질로 면역화된 마우스 및 (E) 0.06 μg F 단백질로 면역화된 마우스.

정의

아쥬반트

"아쥬반트"란, 아마도 항원 제시 세포의 활성화를 통해, 항원-특이적 면역 반응을 특이적으로 또는 비특이적으로 강화하기 위해 사용되는 임의의 물질을 의미한다. 아쥬반트의 예는 오일 에멀젼(예를 들어, 완전 또는 불완전 프로인트 아쥬반트), 몬타니드 불완전 Seppic 아쥬반트, 예컨대 ISA51, 스쿠알렌-기반 수중유 에멀젼 아쥬반트, 예컨대 MF59^®(Novartis AG)(문헌[Ott G. et al. 1995. Pharm Biotechnol 6: 277-96]) 또는 AddaVax™(InvivoGen), 모노포스포릴 지질 A(MPL)(문헌[Cluff CW. 2010. Adv Exp Med Biol 667:111-23]), 알루미늄 염 아쥬반트(백반)(국제공개 WO2013/083726호에 기재된 것과 같음), 다가양이온성 중합체, 특히 다가양이온성 펩티드, 특히 폴리아르기닌 또는 적어도 2개의 LysLeuLys 모티프, 특히 KLKLLLLLKLK를 함유하는 펩티드, 정의된 염기 맥락(예를 들어, 국제공개 WO96/02555호에 기재된 것과 같음)에서, 비메틸화된 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG), 예를 들어 CpG 1018(Dynavax)을 함유하는 면역자극성 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN) 또는 이노신 및 시티딘(예를 들어, 국제공개 WO01/93903호에 기재된 것과 같음), 또는 데옥시이노신 및/또는 데옥시우리딘 잔기(국제공개 WO01/93905호 및 국제공개 WO02/095027호에 기재된 바와 같음)를 함유하는 데옥시핵산을 기반으로 하는 ODN, 특히 올리고 (dIdC)₁₃ 기반 아쥬반트 IC31^®(Valneva SE)(국제공개 WO04/084938호 및 문헌[Olafsdottir et al. 2009. Scand J Immunol. 69(3): 194-202]에 기재된 바와 같음), 신경활성 화합물, 특히 인간 성장 호르몬(국제공개 WO01/24822호에 기재된 것과 같음), 케모카인(예를 들어, 디페신 1 또는 2, RANTES, MIP1-α, MIP-2, 인터류킨-8), 또는 시토카인(예를 들어, 인터류킨-1β, -2, -6, -10 또는 -12; 인터페론-γ; 종양 괴사 인자-α; 또는 과립구 단핵구 콜로니 자극 인자), 무라밀 디펩티드(MDP) 변이체, 박테리아 독소의 비독성 변이체, QS-21(Antigenics Inc.), Quill A, N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타밀-L-알라닌-2-[1,2-디팔미토일-s-글리세로-3-(히드록시포르포릴옥시)]에틸아미드(MTP-PE) 및 문헌[Sarkar et al. 2019. Expert Rev Vaccine: 18(5): 505-521]에 기재된 것들뿐만 아니라, 조성물, 예를 들어 아쥬반트 시스템, 예컨대 AF03, AS01, AS03 및 AS04(문헌[Giudice et al. 2018. Seminars in Immunology 39: 14―21])를 포함한다. TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, 및 TLR9 수용체를 통해 면역 신호를 변환하는 아쥬반트는 Th1-편향된 면역력을 촉진하는 반면, TLR2/TLR1, TLR2/TLR6 및 TLR5를 통한 신호전달은 Th2-편향된 면역력을 촉진한다. 예를 들어, CpG ODN, polyIC 및 MPL과 같은 상기 아쥬반트는 주로 Th1 반응을 유도하고, 백반은 Th2 반응의 강한 유도자인 반면, MF59^®, Addavax^TM, 및 IC31^®은 혼합된 Th1 및 Th2 반응을 유도할 수 있다. 아쥬반트는 항원과 동일한 경로로 또는 항원과 상이한 경로로, 항원과 투여될 수 있거나 그 자체로 투여될 수 있다. 단일 아쥬반트 분자는 아쥬반트 및 항원 특성 둘 모두를 가질 수 있다.

아미노산 치환

아미노산 치환은 폴리펩티드 중 하나의 아미노산의 상이한 아미노산으로의 대체 또는 아미노산이 없도록 대체(즉, 결실)되는 것을 지칭한다. 본원에서 사용된 바, 보존적 치환은 단백질의 기본 구조 및 단백질의 기능, 예를 들어 단백질이 대상에 투여된 경우 면역 반응을 유도하는 능력을 변경하지 않는 치환이다.

하기 6개의 군은 서로 보존적 치환으로 간주된다:

1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T);

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(G);

4) 아르기닌(R), 리신(K);

5) 류신(L), 이소류신(I), 메티오닌(M), 발린(V); 및

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).

비보존적 치환은 변형 hMPV 단백질의 기능의 활성을 감소시켜, 대상에 투여된 경우 면역 반응을 유도하는 능력이 감소하는 것이다.

항체

항체는 hMPV F 단백질 또는 MPV F 단백질의 항원 단편과 같은 항원을 인식하고 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 단백질이다. 용어 "항체"는 본원에서 가장 광범위한 의미로 사용되고, 목적하는 항원 결합 활성을 나타내는 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다. 항체의 비제한적인 예는 예를 들어 항원에 대한 결합 친화도를 보유하는 당업계에 알려진 무손상 면역글로불린 및 이의 변이체 및 단편을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자(예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항체 단편은 전체 항체의 변형에 의해 생성되거나 재조합 DNA 방법을 사용하여 새로 합성된 항원 결합 단편을 포함한다(예를 들어, 문헌[Kontermann and Dubel (Ed), Antibody Engineering, Vols. 1-2, 2^nd Ed., Springer Press, 2010]을 참조).

하기 항체가 본 발명에서 사용되었다: MPE8 항체는 변형후 형태가 아닌 융합전 hMPV F 단백질의 표면에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체이다(문헌[Corti et al. 2013. Nature, 501:439-443]을 참조). MPE8 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열은 각각 수탁 번호 AGU13651.1 및 AGU13652.1으로 GenBank에 기탁되어 있다. MF1 항체는 문헌[Rodriguez, 2015(J Virol Methods 224: 1―8)]에 기재된 융합후 hMPV F 단백질의 6HB 도메인을 인식한다. 문헌[Williams et al., 2007(J Virology 81(15): 8315-24)]에 기재된 DS7 항체는 융합전 및 융합후 hMPV F 단백질 형태 둘 모두에 결합한다.

공동 충전 돌연변이(또는 치환)

공동 충전 돌연변이는 hMPV F 단백질의 단백질 코어 내의 공동을 충전하는 아미노산 치환이다. 공동은 본질적으로 아미노산 또는 아미노산 측쇄가 존재하지 않는 접힌 단백질 내의 공극이다. 여러 실시형태에서, 공동 충전 아미노산 치환은 융합전 형태에 존재하는 hMPV F 단백질 엑토도메인 코어의 공동을 충전하도록 도입된다.

폴드온 도메인

폴드온 도메인은 삼량체성 구조를 자연적으로 형성하는 아미노산 서열이고, 또한 삼량체화 헬퍼 도메인으로 지칭될 수 있다. 일부 예에서, 폴드온 도메인은 항원이 삼량체를 형성하도록 개시된 재조합 단백질의 아미노산 서열에 포함될 수 있다. 일 예에서, 폴드온 도메인은 예를 들어 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTF(서열 번호 10)에 제시된 아미노산 서열 세트를 포함하는 T4 박테리오파지 유래 폴드온 도메인이다. 폴드온 도메인은 예를 들어 폴드온 도메인에 인접한 트롬빈 절단 부위의 혼입에 의해 정제된 단백질로부터 절단될 수 있다.

글리코실화 부위

글리코실화 부위는 글리칸의 부착을 수용하는 단백질과 같은 폴리펩티드의 표면 상의 아미노산 서열이다. N-연결 글리코실화 부위는 NX(S/T)의 삼중 양성 서열이고, 여기서 N은 아스파라긴이고, X는 프롤린을 제외한 임의의 잔기이고, (S/T)는 세린 또는 트레오닌 잔기이다. 글리칸은 다당류 또는 올리고당류이다. 글리칸은 또한 당단백질, 당지질 또는 프로테오글리칸과 같은 글리코콘쥬게이트의 탄수화물 부분을 지칭하기 위해 사용될 수 있다.

이종기원

용어 "이종기원"은 상이한 유전적 공급원으로부터 유래함을 의미한다. 단백질 또는 바이러스와 이종기원인 아미노산 서열은 이들이 존재하거나 발현되는 단백질 또는 바이러스 이외의 공급원으로부터 유래되었다. 일 특정, 비제한적 예에서, 두 도메인 사이의 재조합 폴리펩티드에 존재하는 이종기원 펩티드 링커는 상기 두 도메인 사이의 야생형 폴리펩티드에 자연적으로 존재하지 않는 펩티드 서열을 지칭하고, 예를 들어 펩티드 링커는 재조합 폴리펩티드의 두 도메인을 연결하는 인공 서열이다.

동종기원

동종기원 단백질, 예를 들어 둘 이상의 종 또는 바이러스 균주에서 유사한 구조와 기능을 갖는 둘 이상의 종 또는 바이러스 균주로부터의 단백질은 유사한 구조 및 기능을 갖는다. 동종기원 단백질은 유사한 단백질 접힘 특징을 공유하고, 구조 동족체로 간주될 수 있다. 동종기원 단백질은 전형적으로 높은 서열 보존도, 예컨대 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 보존도, 및 높은 서열 동일도, 예컨대 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일도를 공유한다.

hMPV F 단백질

hMPV F(융합) 단백질은 바이러스 및 세포막의 융합을 촉진하는 엔벨로프 당단백질이다. 자연에서, hMPV F 단백질은 신호 펩티드가 절단 제거되는 소포체에 국소화를 유도하는 N-말단 신호 펩티드(대략, 먼저의 18개의 잔기)를 포함하는 대략 540개 아미노산 길이의 단일 폴리펩티드 전구체로서 합성된다. F0로 고안된 잔류 폴리펩티드는 F 단백질 단량체(프로모터)를 구성하고, 이는 서열 번호 1의 천연 F 단백질 서열의 위치 102 및 103 사이의 프로테아제 절단 부위에서 가공되어 2개의 디설파이드 연결 단편, F1 및 F2를 생성한다. F2 단편은 F 전구체의 N-말단 부분으로부터 유래하고, 대략 서열 번호 1의 잔기 19 내지 102를 포함한다. 이들 단편 중 더 큰 F1은 세포외/내강 영역(잔기 103 내지 490), 막관통 도메인(잔기 491 내지 513), 및 세포질 도메인(잔기 514 내지 539)을 C-말단에서 포함하는 F 전구체의 C-말단 부분(대략 서열 번호 1의 잔기 103 내지 539)을 포함한다. hMPV F 단백질의 세포외 부분은 F 엑토도메인이고, 이는 F2 도메인(대략 hMPV F 단백질 위치 19 내지 102)과 F1 엑토도메인(대략 hMPV F 단백질 위치 103 내지 490)을 포함한다. 3개의 F2-F1 프로모터는 성숙 F 단백질 삼량체에서 올리고화되고, 이는 표적 세포막과 접촉 시 융합후 형태로 구조적 변화를 수행하도록 촉발되는 준안정 융합전 형태를 채택한다. 이러한 형태 변화는 숙주 세포 막과 연관되고, 바이러스 또는 감염 세포의 막과 표적 세포 막의 융합을 촉진하는, F1 도메인의 N-말단에 위치한, 융합 펩티드(FP)로 알려진 소수성 서열을 노출시킨다. 3개의 hMPV F 엑토도메인은 3개의 hMPV F 프로모터의 단백질 착물을 형성할 수 있다. 본 발명은 변형된 hMPV F 단백질 또는 이의 단편, 즉 융합전 형태를 안정화시키는 야생형, 천연 또는 자연 발생 hMPV F 단백질 서열에 관한 하나 이상의 비자연 아미노산 돌연변이를 포함하는 재조합 폴리펩티드에 관한 것이다.

hMPV F0 폴리펩티드

F0 폴리펩티드는 F2 도메인 및 F1 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 사이토솔(cytosolic) 테일을 포함하는 F1 도메인으로 이루어지는 신호 펩티드의 절단 후 잔류한 hMPV F 단백질의 전구체이다. 천연 F0 폴리펩티드는 F1 및 F2를 분리하는 프로테아제 절단 부위(대략 서열 번호 1의 위치 102 및 103 사이)에서 가공되어, F1 및 F2 폴리펩티드 단편(도메인)을 유도한다.

hMPV F1 도메인

hMPV F1 도메인은 hMPV F 단백질의 아미노산 서열의 일부이다. 본원에서 사용된 바, "F1 도메인"은 천연 F1 서열 및 변형(예를 들어, 아미노산 치환, 삽입 또는 결실)을 포함하는 F1 서열 둘 모두를 지칭한다. 천연 F1 도메인(서열 번호 3)은 대략 천연 hMPV F 단백질의 잔기 103 내지 539를 포함하고, (N-에서 C-말단으로) 세포외/내강 영역(서열 번호 1의 잔기 103 내지 490), 막관통 도메인(서열 번호 1의 잔기 491 내지 513), 및 사이토솔 도메인(서열 번호 1의 잔기 514 내지 539)을 C-말단에서 포함한다. 여러 실시형태들은 천연 F1 서열로부터 변형된 F1 도메인, 예를 들어 융합 펩티드가 결여된 F1 도메인(예를 들어, 서열 번호 1의 잔기 103 내지 118)을 포함한다. 일부 실시형태에서, F1 도메인은 F1 엑토도메인이고, 즉 막관통 및 사이토솔 도메인이 결여되고, 예를 들어 F1 도메인은 서열 번호 1의 잔기 103 내지 490 또는 119 내지 490에 해당한다. 추가의 실시형태에서, F1 도메인은 융합전 형태의 재조합 단일 사슬 F 단백질(F1 도메인 함유)을 안정화하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.

hMPV F2 도메인

hMPV F2 도메인은 hMPV F 단백질의 아미노산 서열의 일부이다. 본원에서 사용된 바, "F2 도메인"은 천연 F2 폴리펩티드 및 천연 서열로부터의 변형(예를 들어, 아미노산 치환), 예를 들어 hMPV F 단백질 융합전 형태의 재조합 F 단백질을 안정화하도록 고안된 변형을 포함하는 F2 폴리펩티드(변형된 F2 폴리펩티드 포함) 둘 모두를 지칭한다. 천연 F2 도메인(서열 번호 2)은 대략 서열 번호 1의 잔기 19 내지 102를 포함한다. 천연 성숙 hMPV F 단백질에서, F2 도메인은 2개의 디설파이드 결합에 의해 F1 도메인에 연결된다.

hMPV 융합 펩티드(FP)

hMPV 융합 펩티드는 hMPV F 단백질의 아미노산 서열의 일부이다. 융합 펩티드는 서열 번호 1의 잔기 103 내지 118, 즉 서열 번호 3의 F1 도메인의 N-말단 잔기 1 내지 16일 수 있다.

hMPV F 단백질 융합전 형태

hMPV F 단백질 융합전 형태는 hMPV F 단백질이 융합후 형태로 전환되고, 분비계에서 성숙 hMPV F 단백질로 후속 가공을 유도하는 융합 발생 이벤트를 촉발하기 전에 hMPV F 단백질에 의해 채택된 구조적 형태이다. 융합전 형태의 예시적 hMPV F 단백질의 3차원 구조는 본원에 그리고 예를 들어 국제공개 WO2016/103238호에서 논의된다. hMPV F 단백질의 융합전 형태는 일부 유의한 차이를 갖지만 다른 파라믹소바이러스(예컨대, RSV)의 F 단백질의 융합전 형태에 대해 전체 구조가 유사하다. 여러 실시형태에서, 융합전 형태에서 안정화된 재조합 hMPV F 단백질은 융합전 형태이나 융합후 형태는 아닌 hMPV F 단백질의 삼량체 형태에 대해 특이적인 항체(예컨대, MPE8 항체, 국제공개 WO2016/103238호를 참조)에 특이적으로 결합한다.

단일 사슬 hMPV F 단백질

본 발명의 단일 사슬 hMPV F 단백질은 (변형된) hMPV F1 도메인과 (변형된) hMPV F2 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬로서 발현되는 재조합 hMPV F 단백질 엑토도메인(본원에서 단일 사슬 폴리펩티드로도 사용됨)이다. 단일 사슬 hMPV F 단백질은 전형적으로 삼량체화되어 바람직하게는 삼량체화 헬퍼 도메인, 예를 들어 폴드온에 융합되는 삼량체성 hMPV F 단백질 서브유닛을 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 단일 사슬 hMPV F 폴리펩티드는 F1 도메인과 F2 도메인 사이의 프로테아제 절단 부위를 포함하지 않고, 세포에서 생성될 때 개별 F1 도메인과 F2 도메인 폴리펩티드로 절단되지 않는다. 일 실시형태에서, F1 도메인과 F2 도메인은 단일 사슬 구조체를 생성하기 위해 이종 펩티드 링커와 연결된다.

면역 반응

면역 반응은 자극에 대한 B 세포, T 세포, 또는 단핵구와 같은 면역 시스템의 세포의 반응이다. 일 실시형태에서, 반응은 특정 항원에 대해 특이적이다("항원 특이적 반응"). 일 실시형태에서, 면역 반응은 T 세포 반응, 예컨대 CD4+ 반응 또는 CD8+ 반응이다. 또 다른 실시형태에서, 반응은 B 세포 반응이고, 특이적 항체 생성을 유도한다. "면역 반응 프라이밍"이란 이후 투여되는 면역원성 작용제에 대한 목적하는 면역 반응을 증가시키기 위해 아쥬반트로 대상을 전처리하는 것을 지칭한다. "면역 반응 향상"이란 아쥬반트와 면역원성 작용제의 동시 투여를 지칭하고, 상기 아쥬반트는 아쥬반트의 부재 하에서 대상에 면역원성 작용제를 투여하는 것에 비해 면역원성 작용제에 대한 목적하는 면역 반응을 증가시킨다.

면역원

면역원은 동물에서 항체 생성 또는 T 세포 반응을 자극할 수 있는 화합물, 조성물, 또는 물질, 예컨대 동물로 주입되거나 흡수되는 조성물이다. 면역원은 개시된 재조합 hMPV F 단백질과 같은 이종기원 항원에 의해 유도된 것을 포함하는 특정 체액성 또는 세포성 면역의 생성물과 반응한다. 면역원은 하나 이상의 에피토프를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역원은 병원체로 감염되거나 감염 위험이 있는 포유동물과 같은 포유동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 재조합 hMPV F 단백질 또는 이의 면역원성 단편, 재조합 hMPV F 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 단백질 나노입자 또는 바이러스 유사 입자, 또는 재조합 hMPV F 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 코딩하는 핵산 또는 벡터일 수 있다. 대상으로의 면역원의 투여는 논의되는 병원체에 대한 보호 면역 및/또는 사전 예방 면역을 유도할 수 있다.

면역원성 조성물

면역원성 조성물은 면역원에 포함되거나 면역원에 포함된 핵산 분자에 의해 코딩된, 항원에 대해 측정가능한 CTL 반응을 유도하거나, 항원에 대해 측정가능한 B 세포 반응(예컨대, 항체 생성)을 유도하는 면역원을 포함하는 조성물이다. 일 예에서, 면역원성 조성물은 대상에 투여될 때 hMPV 바이러스에 대해 측정가능한 CTL 반응을 유도하거나, hMPV F 단백질에 대해 측정가능한 B 세포 반응(예컨대, 항체 생성)을 유도하는, 개시된 재조합 hMPV F 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 조성물이다. 면역원성 조성물은 면역원성 단백질을 발현하고 이에 따라 이러한 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있는 면역원성 단백질을 코딩하는 단리된 핵산을 포함할 수 있다. 따라서, 다른 예에서, 면역원성 조성물은 대상에 투여될 때 hMPV 바이러스에 대해 측정가능한 CTL 반응을 유도하거나, hMPV F 폴리펩티드에 대해 측정가능한 B 세포 반응(예컨대, 항체 생성)을 유도하는, 개시된 재조합 hMPV F 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조성물이다. 생체 내 사용을 위해, 면역원성 조성물은 전형적으로 면역원성 폴리펩티드 또는 약학적으로 허용가능한 담체에 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함할 것이고, 또한 아쥬반트와 같은 다른 작용제를 포함할 수 있다. 임의의 특정 폴리펩티드, 예컨대 개시된 재조합 hMPV F 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산은 당업계에 알려진 검정에 의해 CTL 또는 B 세포 반응을 유도하는 능력에 대해 쉽게 시험될 수 있다.

단리됨

"단리된" 생물학적 성분은 실질적으로 예컨대 다른 염색체 및 염색체 외 DNA, RNA, 및 단백질과 같은 자연적으로 발생하는 다른 생물학적 성분으로부터 실질적으로 분리되거나 정제되었다. "단리된" 단백질, 펩티드 및 핵산은 표준 정제 방법에 의해 정제된 단백질을 포함한다. 용어는 또한 화학적으로 합성된 단백질, 펩티드 및 핵산 분자뿐만 아니라 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 단리는 완전한 순도를 요구하지 않고, 적어도 50% 단리, 예컨대 적어도 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 심지어 99.9% 단리되는 단백질, 펩티드, 또는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 융합전 형태로 안정화되는 본원에 개시된 변형된 hMPV F 단백질은 융합후 형태의 hMPV F 단백질로부터 단리되고, 예를 들어 융합후 형태의 hMPV F 단백질로부터 적어도 80%, 적어도 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 심지어 99.9% 단리된다.

링커

링커는 하나의 인접한 분자로 두 분자를 연결하도록, 예를 들어 단일 펩티드에서 두 도메인을 연결하도록 사용될 수 있는 이관능성 분자이다. 바람직하게는, 링커는 펩티드 링커이다. 링커는 예를 들어 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5개 이하의 아미노산 잔기의 임의의 적합한 길이일 수 있다. 링커는 예를 들어 알라닌, 세린, 글리신, 시스테인 및/또는 발린 잔기를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 링커는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함할 수 있다.

천연(또는 자연) 단백질, 서열, 또는 디설파이드 결합

천연 또는 자연(본원에서 상호교환적으로 사용됨) 폴리펩티드, 서열, 잔기 또는 디설파이드 결합은 예를 들어 항원의 항원성을 표적 에피토프에 집중시키거나, 천연 단백질에서 발생하지 않는 단백질에 디설파이드 결합을 도입하기 위한 선택적 돌연변이에 의해 변형되지 않은 것이다. 천연 또는 자연 단백질, 잔기 또는 서열은 또한 야생형 단백질, 잔기 또는 서열로 지칭된다. 비천연 또는 비자연 디설파이드 결합은 천연 단백질에 존재하지 않는 디설파이드 결합, 예를 들어 유전 공학에 의해 단백질에 하나 이상의 시스테인 잔기가 도입됨으로써 단백질에서 형성되는 디설파이드 결합이다. 마찬가지로, 도메인의 비자연 시스테인 잔기는 야생형, 천연 또는 자연 서열의 상기 위치에 존재하지 않는 시스테인 잔기이다.

중화 항체

중화 항체는 감염원의 특정 항원에 결합하여 감염원의 감염 역가를 감소시킨다. 일부 예에서, 감염원은 바이러스이다. 일부 예에서, hMPV F 단백질에 특이적인 항체는 hMPV의 감염 역가를 중화한다. 일부 실시형태에서, 중화 항체는 관련 항원, 예컨대 항원의 항원성 표면과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 공유하는 항원에 결합하고, 이의 기능을 억제한다. 바이러스와 같은 병원균으로부터의 항원에 관해, 항체는 병원균의 하나 초과의 부류 및/또는 하위부류로부터의 항원에 결합할 수 있고, 이의 기능을 억제할 수 있다. 예를 들어, hMPV에 관해, 항체는 하나 초과의 군으로부터 hMPV F 단백질과 같은 항원에 결합할 수 있고, 이의 기능을 억제할 수 있다. 일 실시형태에서, hMPV에 대한 광범위한 중화 항체는 순환 중인 높은 비율의 많은 유형의 hMPV를 중화시킨다는 점에서 hMPV에 대한 다른 항체와 구별된다.

약학적으로 허용가능한 담체

약학적으로 허용가능한 담체는 임상 투여를 위해 면역원성 hMPV F 단백질을 제형화하기 위해 사용된다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition, 1995]는 개시된 면역원의 약학적 전달에 적합한 조성물 및 제형을 기재한다. 일반적으로, 담체의 성질은 이용되는 특정 투여 방식에 의존할 것이다. 예를 들어, 비경구 제형은 통상적으로 비히클로서 물, 생리식염수, 평형 염액, 수성 덱스트로오스, 글리세롤 등을 같은 약학적으로 그리고 생리학적으로 허용가능한 유체를 포함하는 주사가능 유체를 포함한다. 고체 조성물(예를 들어, 분말, 알약, 정제 또는 캡슐 형태)의 경우, 종래의 비독성 고체 담체, 예를 들어 만니톨, 락토오스, 전분 또는 마그네슘 스테아레이트의 약학적 등급을 포함할 수 있다. 생물학적으로 중성인 담체 이외에, 투여될 약학 조성물은 소량의 비독성 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 에멀젼화제, 보존제, 및 pH 완충화제 등, 예를 들어 소듐 아세테이트 또는 소르비탄 모노라우레이트를 함유할 수 있다. 대상으로의 투여에 적합한 특정 실시형태에서, 담체는 무균일 수 있고/있거나 원하는 항-MPV 면역 반응을 유도하기에 적합한 조성물의 하나 이상의 측정된 용량을 함유하는 단위 투여 형태에 현탁되거나 아니면 이에 함유될 수 있다. 이는 또한 치료 목적으로 사용하기 위해 약물과 동반될 수 있다. 단위 투여 형태는 예를 들어 멸균 내용물을 함유하는 밀봉된 바이알에 있거나 대상에 주사하기 위한 시린지에 있거나, 후속 가용화 및 투여를 위해 동결건조되거나, 고체 또는 제어된 방출 투여량일 수 있다.

폴리펩티드

폴리펩티드는 길이 또는 후번역 변형(예를 들어, 글리코실화 또는 포스포릴화)과 무관한 임의의 아미노산의 사슬이다. "폴리펩티드"는 자연 발생 아미노산 중합체 및 비자연 발생 아미노산 중합체를 포함하는 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 비자연 아미노산, 예를 들어 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학 모방체인 아미노산 중합체에 적용된다. "잔기"는 아미드 결합 또는 아미드 결합 모방체에 의해 폴리펩티드에 혼입된 아미노산 또는 아미노산 모방체를 지칭한다. 폴리펩티드는 아미노 말단(N-말단)과 카르복시 말단(C-말단)을 갖는다. "폴리펩티드"는 펩티드 또는 단백질과 상호교환적으로 사용되고, 본원에서 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 사용된다. 다수의 경우, 하나 이상의 폴리펩티드는 표면 노출 아미노산 잔기와 비표면 노출 아미노산 잔기를 포함하는 특정 3차원 구조로 접힐 수 있다. 일부 경우에, 단백질은 기능성 단위로 함께 접히는 다중 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 표면 상의 성숙한 hMPV F 단백질은 다량체성 단백질로 삼량체화되는 3개의 F2/F1 이형이량체를 포함한다. "표면 노출 아미노산 잔기"는 예를 들어 단백질이 용액에 있을 때 용매와 접촉할 수 있도록 단백질의 표면 상에 어느 정도 노출된 아미노산이다. 대조적으로, "비표면 노출 아미노산"은 단백질이 용액에 있을 때 용액과 접촉하지 않도록 단백질의 표면 상에 노출되지 않는 아미노산 잔기이다. 일부 예에서, 비표면 노출 아미노산 잔기는 단백질 코어의 일부이다.

재조합 폴리펩티드 또는 단백질

재조합 폴리펩티드(또는 단백질)는 자연적으로 발생하지 않는 서열을 가지거나 두 개의 서열의 분리된 세그먼트의 인공적인 조합에 의해 만들어진 서열을 갖는 것이다. 이러한 인공적인 조합은 화학적 합성에 의해 달성될 수 있거나, 보다 일반적으로 예를 들어 유전 공학 기술에 의해 아미노산 잔기의 단리된 세그먼트의 인공적인 조작에 의해 달성될 수 있다. 여러 실시형태에서, 재조합 단일 사슬 폴리펩티드는 박테리아 또는 진핵 세포와 같은 숙주 세포로 도입된 이종기원(예를 들어, 재조합) 핵산에 의해 코딩된다. 핵산은 예를 들어 도입된 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현할 수 있는 신호를 갖는 발현 벡터 상에 도입될 수 있거나 핵산은 숙주 세포 염색체에 통합될 수 있다.

서열 동일성 서열 동일성은 백분율 동일성으로 흔히 측정되고: 백분율이 더 높을수록, 두 서열은 보다 동일하다. 폴리펩티드의 동족체, 동원체, 또는 변이체는 표준 방법을 사용하여 정렬될 때 비교적 높은 서열 동일도를 가질 것이다.

비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘은 하기에 기재되어 있고: 문헌[Smith & Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1981)]; 문헌[Needleman & Wunsch (Mol. Biol. 48:443, 1970)]; 문헌[Pearson & Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988)]; 문헌[Higgins & Sharp (Gene, 73:237-44, 1988)]; 문헌[Higgins & Sharp (CABIOS 5:151-3, 1989)]; 문헌[Corpet et al. (Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988)]; 문헌[Huang et al. (Computer Appls in the Biosciences 8:155-65, 1992)]; 문헌[Pearson et al. (Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994)] 및 문헌[Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)], 서열 정렬 방법 및 상동성 계산에 대한 자세한 고려 사항을 제공한다. 정렬되면, 매치수는 두 서열 모두에 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 존재하는 경우 위치의 개수를 계수함으로써 결정된다. 백분율 서열 동일성은 매치 수를 식별된 서열에 제시된 서열의 길이, 또는 명확한 길이(예컨대, 식별된 서열에 제시된 서열로부터의 100개의 연속 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기)로 나눈 다음 결과 값에 100을 곱하여 결정된다. 바람직하게는, 백분율 서열 동일성은 서열의 전장에 걸쳐 결정된다. 예를 들어, 1554개의 아미노산을 갖는 시험 서열로 정렬된 경우 1166개의 매치를 갖는 펩티드 서열은 시험 서열과 75.0% 동일하다(1166÷1554*100=75.0). 백분율 서열 동일성 값은 가장 근접한 1/10로 올림된다. 예를 들어, 75.11, 75.12, 75.13, 및 75.14은 75.1로 내림되는 반면 75.15, 75.16, 75.17, 75.18, 및 75.19는 75.2로 올림된다. 길이 값은 항상 정수일 것이다.

NCBI 기본 로컬 정렬 검색 도구(BLAST: Basic Local Alignment Search Tool)(문헌[Altschul et al. 1990. Mol. Biol. 215:403])는 서열 분석 프로그램 BLASTP, BLASTN, BLASTX, TBLASTN 및 TBLASTX와 관련하여 사용하기 위해 국립 생명 공학 정보 센터(NCBI, Bethesda, MD) 및 인터넷을 비롯한 여러 소스에서 이용가능하다. 이러한 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법에 대한 설명은 인터넷의 NCBI 웹사이트에서 이용가능하다. 또한 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 문헌[Altschul et al.(Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1977])에 기재되어 있다. BLAST 분석의 수행을 위한 소프트웨어는 국립 생명 공학 정보 센터(ncbi.nlm.nih.gov)를 통해 공개적으로 이용가능하다. (뉴클레오티드 서열에 대한) BLASTN 프로그램은 기본값으로서 11의 단어 길이(W), 50의 정렬(B), 10의 기대값(E), M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 사용한다. (아미노산 서열에 대한) BLASTP 프로그램은 기본값으로서 3의 단어 길이(W), 및 10의 기대값(E), 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 사용한다(문헌[Henikoff & Henikoff. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919]를 참조).

폴리펩티드의 동족체 및 변이체는 전형적으로 참조 서열의 적어도 50, 100, 150, 250, 500개의 아미노산 잔기에 걸쳐, 참조 서열의 전장에 걸쳐 또는 논의되는 참조 아미노산 서열로 병렬된 전장에 걸쳐 계수된, 적어도 약 75%, 예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 한다. 참조 서열에 대한 유사도가 보다 높은 단백질은 본 방법에 의해 평가된 경우 백분율 동일성의 증가, 예컨대 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 보일 것이다. 핵산 서열의 서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 참조 서열로서 작용하고, 이는 시험 서열과 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열은 컴퓨터로 입력되고, 필요에 따라 하위 시퀀스 좌표가 지정되고, 시퀀스 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 기본값 프로그램 매개변수가 사용된다.

유용한 알고리즘의 일 예는 PILEUP이다. PILEUP은 문헌[Feng & Doolittle (Mol. Evol. 35: 351-360, 1987)]의 점진적 정렬 방법의 단순화를 사용한다. 사용된 방법은 문헌[Higgins & Sharp(CABIOS 5:151-153, 1989)]에 기재된 방법과 유사하다. PILEUP을 사용하여, 참조 서열은 다른 시험 서열과 비교되어 하기 매개변수를 사용하여 백분율 서열 동일성 관계를 결정한다: 기본값 갭 가중치(3.00), 기본값 갭 길이 가중치(0.10), 및 가중된 말단 갭. PILEUP은 GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지, 예를 들어 7.0 버젼으로부터 입수될 수 있다(문헌[Devereaux et al. 1984. Nuc. Acids Res. 12: 387-395]).

본원에서 사용된 바, "적어도 80% 동일성"에 대한 언급은 특정 참조 서열, 예를 들어 참조 서열의 적어도 50, 100, 150, 250, 500개의 아미노산 잔기 또는 서열의 전장에 대한 "적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 심지어 100% 동일성"을 지칭한다. 본원에서 사용된 바, "적어도 90% 동일성"에 대한 언급은 특정 참조 서열, 예를 들어 참조 서열의 적어도 50, 100, 150, 250, 500개의 아미노산 잔기 또는 서열의 전장에 대한 "적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 심지어 100% 동일성"을 지칭한다.

치료적 유효량

치료적 유효량은 장애 또는 질환의 증상 및/또는 기저 원인을 방지, 치료(예방 포함), 감소 및/또는 완화하기에, 예를 들어 hMPV 감염을 방지, 억제 및/또는 치료하기에 충분한, 개시된 면역원 또는 면역원성 조성물과 같은 작용제의 양이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 hMPV 감염과 같은 질환의 증상을 감소시키거나 제거하기에 충분하다. 예를 들어, 이는 바이러스 복제를 억제 또는 예방하거나 바이러스 감염의 외부 증상을 측정가능하게 변경하는 데 필요한 양일 수 있다. 일반적으로, 이러한 양은 바이러스 복제 또는 감염성을 측정가능하게 억제하는데 충분할 것이다. 일 예에서, 목적하는 반응은 hMPV 감염을 억제, 감소 또는 예방하는 것이다. 방법이 효과적이기 위해 감염을 완전히 제거, 감소 또는 예방할 필요는 없다. 예를 들어, 치료적 유효량의 작용제의 투여는 적합한 대조군에 비해, 원하는 양으로, 예를 들어 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 100%(검출가능한 hMPV 감염의 제거 또는 예방)로 감염을 감소(세포 감염, 또는 감염된 대상의 수 또는 백분율에 의해 측정됨)시킬 수 있다.

병원균에 대해 보호 면역 반응을 얻는 것은 면역원성 조성물의 다중 투여를 요구할 수 있음이 이해된다. 따라서, 치료적 유효량은 보호 면역 반응을 달성하기 위해 이전 또는 후속 투여와 조합하여 제공되는 부분 용량을 포함한다. 예를 들어, 작용제의 치료적 유효량은 단일 용량, 또는 다중 용량으로, 예를 들어 치료 과정(예컨대 프라임-부스트 백신 치료) 도중 매일 투여될 수 있다. 그러나, 치료적 유효량은 치료되는 대상, 치료되는 상태의 중증도 및 유형, 및 투여 방식에 의존할 수 있다. 작용제의 단위 투여 형태는 치료적 양으로, 또는 치료적 양의 배수로, 예를 들어 멸균 성분을 갖는 바이알(예를 들어, 천공가능한 뚜껑을 가짐) 또는 시린지에 포장될 수 있다.

백신

백신은 대상에서 예방적 또는 치료적 면역 반응을 유도하는 약학 조성물이다. 일부 경우에, 면역 반응은 보호 면역 반응이다. 전형적으로, 백신은 병원균의 항원, 예를 들어 바이러스성 병원균, 또는 병리학적 상태와 관련된 세포 구성성분에 대한 항원 특이적 면역 반응을 유도한다. 백신은 폴리뉴클레오티드(예컨대, 개시된 항원을 코딩하는 핵산), 펩티드 또는 폴리펩티드(예컨대, 개시된 항원), 바이러스, 세포 또는 하나 이상의 세포 구성성분을 포함할 수 있다. 일 특정의 비제한적인 예에서, 백신은 hMPV 감염과 관련된 증상의 중증도를 감소시키고/시키거나 대조군에 비해 바이러스 로드를 감소시킨다. 또 다른 비제한적인 예에서, 백신은 대조군에 비해 hMPV 감염을 감소시킨다.

상동성 모델링

일 양태에서, 본 개시내용은 융합전 형태로 안정화된 신규의 변형 hMPV F 단백질을 제공한다. 본 개시내용은 또한 결정 구조 및 상동성 모델링을 기반으로 한 안정화된 융합전 F 단백질을 생성하는 방법을 제공한다. 안정화 변형(들)의 구조적 기초 분석을 위해, hMPV의 이용 가능한 융합 단백질 및 상동 융합 단백질의 일련의 구조를 사용하였다. 그 중에서, 융합전 hMPV F 단백질 엑토도메인(PDB:5WB0) 및 융합후 hMPV F 단백질 엑토도메인(PDB:5L1X)의 결정 구조 모델, 융합전 RSV F 단백질 엑토도메인(PDB:4DAB) 및 융합후 RSV F 단백질 엑토도메인(PDB:3RRR)의 결정 구조 모델. 폴드온 도메인을 사용한 소위 삼량체화 헬퍼 도메인은 PDB:2IBL, 1OX3 및 1AVY의 구조적 데이터를 기반으로 상동성 모델로 모델링되었다.

천연 성숙 hMPV F 단백질은 2개의 디설파이드 결합에 의해 공유 결합된 2개의 폴리펩티드 F2 및 F1로 구성된다. 성숙 과정은 트립신 유사 프로테아제에 의한 F0 전구체의 한 번의 절단을 포함하여, 표적 세포막과 상호작용하고 구조 변화를 촉발하는 F1 도메인의 자유 N-말단에 융합 단백질 FP를 생성한다. 절단 후, F1의 C-말단 부분의 내부 삼량체성 공동의 소수성 영역으로의 재배치가 발생한다. 이는 촉발 이벤트가 융합후 이형태체로 다시 접힐 때까지 준안정 융합전 상태의 안정성을 향상시킬 수 있다(도 2 참조). 융합전 형태에서, HRA-함유 영역은 구부러지고, 헤드 도메인에 결합되는 한편, 융합후 형태에서 이는 긴 돌출 나선의 일부이다. 융합전에서 융합후로의 전환은 F1 서브유닛의 헵타드 반복 A(HRA) 서열의 하나의 긴 α-나선으로의 재접힘, 및 이의 팁에서 HRA의 N-말단에 위치한 융합 펩티드(FP)의 세포막으로의 삽입을 포함한다. 이러한 재접힘은 막 융합을 구동하는 안정한 6-나선-다발로 HRA 및 HRB 서열의 어셈블리를 촉진한다.

단일 사슬 F 단백질

단일 사슬 F 단백질의 모델링은 안정화된 융합전 형태를 얻고 동시에 천연 hMPV F 단백질과 최대의 구조적 유사성을 유지하는 것을 목표로 수행되었다(도 3 참조). F1 및 F2 사이의 절단 부위의 결실은 융합전 이형태체를 안정화할 수 있는 것으로 추정되었다. 또한, 한 번의 절단 단계의 제거는 재조합 단백질의 제조 과정에 유리하다. 트립신-유사 인식 모티프 RQSR은 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열의 위치 99 내지 102를 포괄하고, 절단은 위치 102에서 두 번째 아르기닌 바로 다음에 발생한다(R102). 절단 제거는 절단 부위에서의 적어도 1회의 돌연변이, 바람직하게는 위치 102에서 아르기닌의 치환에 의해 달성될 수 있다. 특히, R102는 글리신 또는 또 다른 적합한 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 특히, 본 발명의 일 실시형태에서, 트립신 절단 부위는 글리신에 대해 위치 102에서의 아르기닌의 치환(R102G)에 의해 제거된다.

천연 융합전 hMPV F 단백질에 대한 단일 사슬 F 엑토도메인의 3D 구조 유사도 달성을 위해, F1 도메인과 F2 도메인 사이의 루프가 고안되었다. 일 실시형태에서, 루프는 이종 펩티드 링커의 삽입에 의해 구성된다. 바람직한 실시형태에서, 링커의 크기와 조성은 항원의 안정성, 항체 결합 품질 및 수율에 대해 최적화된다. 일 실시형태에서, 링커의 길이는 2 내지 10개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 2 내지 5개의 잔기, 보다 바람직하게는 3 내지 5개의 잔기, 보다 더욱 바람직하게는 4 또는 5개의 잔기, 가장 바람직하게는 5개의 잔기일 수 있다. 다른 실시형태에서, 링커는 서열 번호 1의 위치 95 내지 102에서, 바람직하게는 위치 102에서 아미노산 잔기 사이에, 가장 바람직하게는 위치 102에서의 글리신 잔기에 삽입될 수 있다.

일부 실시형태에서, 링커는 하나 이상의 시스테인, 글리신, 알라닌, 페닐알라닌, 발린 및/또는 세린 잔기(들)로 구성될 수 있다. 링커는 1, 2 또는 3개의 알라닌 잔기(들), 1 또는 2개의 발린 잔기(들) 및 1 또는 2개의 글리신 잔기(들)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 알라닌은 링커의 위치 1, 2, 3, 4, 및/또는 5일 수 있고; 글리신은 링커의 위치 2, 3, 및/또는 4일 수 있고; 발린은 바람직하게는 링커의 위치 3 및/또는 5일 수 있다. F2와 F1의 추가 변형과 링커의 일부 비제한적 예는 표 1에 제공된다.

바람직한 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의(예를 들어, 하나의) 시스테인 잔기를 포함한다. 시스테인은 링커의 임의의 위치에서, 바람직하게는 서열 번호 1의 위치 103 및 105에 해당하는 위치 1 또는 3일 수 있다. 보다 바람직하게는, 시스테인은 서열 번호 1의 천연 링커의 hMPV F 단백질 서열의 위치 103에 해당하는 링커의 위치 1(즉, 바람직하게는 F2 도메인에 인접한 링커의 N-말단)이다. 보다 더욱 바람직하게는, 링커는 CGAGA, CGAGV, CGAAV, AGCGA, CAAAV, CAAFV 또는 CGAGA이다. 가장 바람직한 실시형태에서, 링커는 CGAGA(서열 번호 4)이다.

일부 실시형태에서, 단일 사슬 F 단백질의 융합전 형태는 적어도 하나의 비자연 프로모터내 또는 프로모터 사이 디설파이드 결합을 도입함으로써 공유적으로 안정화될 수 있다. 예를 들어, 비자연 디설파이드 결합은 F2와 F1 도메인 사이에 위치한 이종 펩티드 링커의 시스테인 잔기 및 F1 도메인의 시스테인 잔기 사이에 도입될 수 있다. 첫번째 시스테인 잔기는 상기 링커의 임의의 위치, 예를 들어 위치 1, 2, 3 또는 4, 바람직하게는 서열 번호 1의 위치 103에 해당하는 위치 1일 수 있다. 대안적으로, 첫번째 시스테인 잔기는 서열 번호 1의 위치 96, 또는 101, 또는 102에서 F2 도메인에 도입될 수 있다. 가장 바람직한 실시형태에서, 위치 103에서 시스테인은 서열 번호 1의 천연 hMPV F 서열의 위치 338에서 알라닌의 시스테인 치환과 함께 비자연 디설파이드 결합을 형성한다. 이러한 S-S 결합은 소수성 삼량체성 공동 내에 F2와 F1 사이에 루프를 고정함으로써 단일 사슬 F 단백질의 융합전 형태를 안정화할 수 있다. 상기 루프 고정은 천연 hMPV 단백질의 F1의 내재화된 절단된 N-말단의 위치 지정 효과를 모방한다. 일부 실시형태에서, 단일 사슬 hMPV F 단백질은 예를 들어 단백질 삼량체를 공유적으로 연결함으로써 이를 안정화하도록 비천연 프로모터 사이 디설파이드 결합을 도입할 수 있는 추가의 시스테인 치환(들)을 포함할 수 있다.

추가의 일 실시형태에서, 단일 사슬 hMPV F 단백질은 융합 펩티드 FP의 전부 또는 일부 서열을 포함하는, 서열 번호 3의 F1 도메인의 N-말단에서 아미노산 잔기 1 내지 16이 결여되어 있다. 바람직하게는, 단일 사슬 hMPV F 단백질은 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열의 위치 103 내지 118에서 아미노산 잔기가 결여되어 있다. FP의 결실은 단일 사슬 hMPV F 단백질의 융합전 형태를 추가로 안정화한다.

일부 실시형태에서, 단일 사슬 hMPV F 단백질은 하나 이상의 추가의 변형(들)을 포함할 수 있다. 한편, 추가의 변형은 단일 사슬 hMPV F 단백질의 변경된 기하형상을 보충할 수 있다. 한편, 추가의 변형은 융합전 형태를 추가로 안정화할 수 있다. 추가의 변형은 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 변형 중에서, 보존적 치환이 반드시 그런 것은 아니지만 바람직할 수 있다. 하기 그룹의 치환이 보존적인 것으로 간주된다:

1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T);

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(G);

4) 아르기닌(R), 리신(K);

5) 류신(L), 이소류신(I), 메티오닌(M), 발린(V); 및

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).

일 실시형태에서, 단일 사슬 hMPV F 단백질을 안정화시킨 추가의 변형은 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열의 위치 97에서 아스파라긴 잔기에 대한 글루타민 잔기의 치환(N97Q)이다.

또 다른 실시형태에서, 단일 사슬 F 엑토도메인의 추가의 변형은 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열에 대한 위치 49, 67, 137, 159, 147, 160, 161 및/또는 177에서의 치환을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 공동 충전 치환(들)을 포함할 수 있다. 특히, 공동 충전 치환은 T49M 치환, I67L 치환, I137W 치환, A147V 치환, A159V 치환, T160F 치환, A161M 치환 또는 I177L 치환으로부터 선택될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 추가로, 둘 이상의 공동 충전 치환의 조합이 가능하다. 일 특정 실시형태에서, 조합은 T160F 및 I177L 치환을 포함한다. 또 다른 특정 실시형태에서, 조합은 T49M, I67L 및 A161M 치환을 포함한다. 또한 또 다른 특정 실시형태에서, 조합은 T49M, A161M, I137W, A147V, A159V 및 I177L 치환을 포함한다.

공동 충전에 의한 HRA α3의 견고화. 천연의 절단된 F 단백질에서, F1의 N-말단 부분은 열역학적으로 더 안정적인 융합후 F 단백질에서 길고 확장된 나선인 HRA 함유 도메인을 보유하지만, 융합전 형태에서 심지어 베타 헤어핀 요소를 포함하여, 몇 개의 뚜렷한 작은 나선으로 접힌다("로드 스프링(loaded spring)"). 이러한 요소의 추가의 접촉은 융합전 형태의 단백질의 안정화를 허용할 수 있다. HRA α3 하부의 공동을 충전하기 위해, 2개의 작은 잔기를 위치 T49M 및 A161M에서 공동 충전 지방족 잔기 메티오닌으로 대체하여 함께 패킹되는 상보적 쌍을 형성하고, 이 표면에 위치한 나선의 지방족 고정을 강화하였다. 위치 161에서 돌연변이가 문헌[Battles et al., 2017]에 의해 hMPV F 융합전 엑토도메인에 대해 보고되었고, 이는 비발현 F 단백질 서브유닛(A161F) 또는 MPE8 항체와 거의 반응하지 않는 서브유닛(A161L)을 유도하였다(문헌[Battles et al. 2017. Nat. Commun. 8(1): 1528] 참조).

디설파이드 결합에 의한 HRA α4의 공유적 부착. HRA α4는 F 단백질의 팁까지 확장되고, 융합전 구조에서 HRA α3 뒤 베타-헤어핀 요소의 C-말단에 위치한다. 모든 이들 요소는 바이러스의 융합 과정에서 헤드 도메인에서 숙주 세포막 쪽으로 이동하는 것을 포함하는 융합후 형태의 긴 알파 나선 요소로의 변형에 참여한다. 본원에서, 디설파이드 브릿지는 HRA α4 나선 요소(K166C) 사이에 F2 부분에 의해 제공된 긴 베타-가닥(E51C)으로 도입된다. 이러한 변화는 HRA α3에 대한 접촉을 포함하여 극성 네트워크에 참여하는 2개의 하전된 잔기를 변형시킨다. 추가의 변형, S266D가 이러한 디설파이드 결합 형성 돌연변이에 의한 염-브릿지 네트워크의 교란을 부분적으로 재구성할 수 있도록 도입되었다.

트립토판의 도입에 의한 HRA α2-α3의 견고화. HRA α2-α3은 융합전 hMPV F 단백질 상의 구부러진 서브구조를 형성한다(융합후 형태의 긴 나선의 일부임). 이러한 구부러짐의 견고화는 융합후 형태로의 변형을 방지할 수 있다. 이러한 구부러짐의 경우, 유사하게 접힌 서브구조가 관찰될 수 있고, 여기서 hMPV F 단백질 I137은 유사체 위치에서 트립토판이고, 예를 들어 헤파린에 결합된 절단된 단백질 C 억제제의 N-말단 부분(사슬 A의 PDB:3DY0, W271)의 결정 구조에서 보다 조밀하게 패킹된 서브구조를 제공한다. 상기 상동성 모델링과 분자 시뮬레이션을 기반으로, 2개의 추가 돌연변이 A147V 및 A159V를 도입하여 이러한 서브구조에 추가의 공간 충전을 제공하여 단백질 C 억제제 구조에서 관찰된 배향으로 트립토판 측쇄를 유도하였으며, 이는 S149(단백질 C 억제제의 아스파라긴)에 대한 극성 접촉으로 트립토판 측쇄 아미드의 추가적인 안정화를 허용한다. 또한, A147 및 A159에 대한 유사체 위치는 공간 충전 측쇄를 갖는 잔기를 제공한다.

일부 실시형태에서, 단일 사슬 hMPV F 단백질은 하나 이상의 추가의 안정화 치환(들), 예를 들어 비-자연 수소 결합(들), 변이체 코어 패킹 또는 염 브릿지(들)의 형성을 유도하는 치환을 포함할 수 있다. 특히, 변형된 단일 사슬 hMPV F 단백질은 E80N, F258I 및/또는 G294E 치환을 포함할 수 있다. E80N 치환은 D224'(프라임은 인접 프로모터를 의미함)에 대한 프로모터 사이 H-결합을 확립할 수 있고, D209로 반발을 감소시킨다. 반면, E80N 치환은 단일 사슬 hMPV F 단백질의 재조합 발현을 향상시킨다. 재조합 단백질의 수율을 증가시키기에 유용한 또 다른 변형은 G294E 치환이다.

일부 실시형태에서, 시스테인 잔기에 대한 인접 잔기 I480 및 L481의 치환은 공유 고리의 형태의 3개의 프로모터에 걸쳐 3개의 디설파이드 결합의 도입을 허용한다. 공유적으로 연결된 삼량체는 폴드온 삼량체화 입자보다 더 안정한 것으로 가정된다. 관능성 고리의 형성은 모든 3개의 디설파이드 결합, 또는 다중 고리의 경우, 적어도 하나의 디설파이드 결합이 각 프로모터 사이에 형성되는 것을 요구한다. 폴드온 도메인에 대한 고리의 거리는 짧고, 폴드온 부착 위치는 보다 견고한 기하형상을 위해 최적화된다.

바람직한 실시형태에서, 치환 조합은 하기와 같다:

N97Q, R102G 및 G294E(L7F_A1_23)(예를 들어, 서열 번호 5에 제시된 것과 같음)

N97Q, R102G, T160F, I177L 및 G294E(sF_A1_K_L7)(예를 들어, 서열 번호 6에 제시된 것과 같음)

N97Q, R102G, T49M, I67L, A161M, E80N, F258I 및 G294E(L7F_A1_31)(예를 들어, 서열 번호 7에 제시된 것과 같음)

N97Q, R102G, T49M, I67L, A161M, E51C, K166C, S266D, G294E, I480C 및 L481C(L7F_A1_33)(예를 들어, 서열 번호 8에 제시된 것과 같음), 및

N97Q, R102G, T49M, A161M, I137W, A159V, A147V I177L 및 G294E(L7F_A1_4.2)(예를 들어, 서열 번호 9에 제시된 것과 같음).

단백질 삼량체

일부 실시형태에서, 본 발명의 변형 단일 사슬 hMPV F 단백질은 막관통 도메인과 세포질 테일을 갖지 않는다는 점에서 천연 hMPV F 단백질과 상이하다. 그럼에도 불구하고, 일부 실시형태에서, 변형 단일 사슬 hMPV F 단백질은 모노- 또는 헤테로 삼량체를 형성할 수 있다. 삼량체를 형성하기 위해, 폴드온으로 지칭된 삼량체화 헬퍼 도메인이 F 엑토도메인의 C-말단 부분에 삽입될 수 있다. 서브유닛 엑토도메인의 C-말단에 대한 가용성 상태를 유지하는 삼량체화 헬퍼의 첨가는 안정한 삼량체성 및 가용성 단백질 삼량체의 형성을 지지한다.

일 실시형태에서, 폴드온 도메인은 T4 박테리오파지의 피브리틴으로부터 유래될 수 있고, 서열 번호 10의 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 피브리틴 폴드온은 하나 이상의 N-글리코실화 부위(들)(모티프 NxT/S, 여기서 "x"는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기임)의 삽입에 의해 변형될 수 있고, 이는 hMPV 비특이적 에피토프(들)를 숨기는 것을 보조할 수 있다. 변형된 폴드온 도메인 서열의 일부 비제한적 예는 하기와 같다:

폴드온 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (서열 번호 10)

폴드온-glyc-1 GYIPEAPRNGTAYVRKDGEWVLLSTFL (서열 번호 29)

폴드온-glyc-2 GYIPEAPRDGQAYVRKNGTWVLLSTFL (서열 번호 30)

폴드온-glyc-3 GYIPEAPRDGQAYVRKDGNWTLLSTFL (서열 번호 31)

폴드온-glyc-4 GYIPEAPRNGTAYVRKNGTWVLLSTFL (서열 번호 32)

폴드온-glyc-5 GYIPEAPRNGTAYVRKDGNWTLLSTFL (서열 번호 33).

대안적으로, 폴드온 도메인은 GCN4 류신 지퍼(문헌[Harbury et al. 1993. Science 262:1401]) 또는 C3 축 주변 부착을 허용하는 자기 어셈블리 나노입자의 단량체(예를 들어, 페리틴 및 루마신 신타아제)로부터의 구조 요소를 가질 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 폴드온 도메인은 F 단백질의 C-말단에 부착되어 이의 막관통 및 사이토솔 도메인을 대체한다. 폴드온의 N-말단에서 글리신 잔기는 F1 도메인에 직접 부착될 수 있거나, 적어도 하나의 프로테아제 부위를 포함할 수 있는 다양한 길이의 펩티드 링커를 통해 부착될 수 있다. 보다 긴 링커는 폴드온 도메인의 이동을 디커플링할 수 있지만, 정의된 위치에서 HRB 영역(스토크)의 나선을 유지하는 것을 지지하는 것에는 덜 강력하다. 나선은 입자의 주 c3 축의 축에서 벗어난 각도로 삼량체화 헬퍼 도메인의 횡방향 변위 및 굽힘의 변동을 진행할 수 있다. 보다 짧은 링커는 폴드온 도메인의 보다 견고한 부착을 허용하며, 스토크 도메인의 3개의 나선에 대해 더 강한 고정 효과를 허용한다.

특히, 폴드온 도메인은 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열의 S482 이후 삽입된 알라닌 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이는 C-말단 나선 캡으로 S482를 유지하고, 폴드온 계면의 국소 기하형상을 재현할 수 있다. 상기 기하형상은 짧은 링커, 예를 들어 서열 ILSA(서열 번호 34) 및 CCSA(서열 번호 35) 각각으로 이루어진 "VSL" 또는 "VSA"로 지칭된 짧은 링커를 통한 폴드온 부착에 의해 달성될 수 있다. 그 중 알라닌(A483)은 결정 구조 PDB:1AVY의 티로신에 대한 n-2 위치(서열 번호 10의 위치 2에 해당함)에서 알라닌에 대한 유사체 위치에 있으며, 구조 모델의 티로신 측쇄에 대한 유사 접촉을 보여준다. 부가적으로, 짧은 링커 "VSL" 또는 "VSA"는 다른 돌연변이, 예를 들어 링커 부근의 아미노산 치환과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 치환 C480과 C481과 링커 "VSA"의 조합은 3개의 프로모터에 걸친 디설파이드 고리의 형성을 통해 3개의 프로모터를 공유적으로 연결할 수 있다. 이러한 기하형상에서, 디설파이드 고리의 시스테인 잔기는 공간적으로 근접하게 유지되므로 프로토머 삼량체의 전체 안정성을 증가시키는 완전히 닫힌 고리의 형성이 지지된다. 덜 견고한 폴드온 부착의 예는 서열 번호 1의 잔기 483 내지 485를 보유한다(디설파이드 고리가 있는 ILSSAE 또는 CCSSAE). 하나 초과의 시스테인 고리를 형성하는 변형된 폴드온 링커의 일부 예가 하기에 나타나 있다:

480-CCKQTNECCKNLERAVSA-496 (서열 번호: 36)

480-CCRELKECCKNLENAVSA-496 (서열 번호: 37)

480-CCRELKDCCKNLENAVSA-496 (서열 번호: 38)

480-CCRELKDCCKNLERAVSA-496 (서열 번호: 39)

480-CCRELKDCCKQLNKAVSA-496 (서열 번호: 40)

480-CCRELKECCKQLNKAVSA-496 (서열 번호: 41)

짧은 링커의 다른 비제한적인 예는: GG, SG, GS, GGG, GGA, GGS, SGG, SSG, SGS, SGA, GGA, SSA 및 SGGS이다. 상기 링커는 예를 들어 A496의 대체에 의해 도입된 절단 부위와 함께 사용될 수 있다. 절단 부위는 바람직하게는 표 2에 개시된 트롬빈 절단 부위이고, TEV-절단 부위(담배 에치 바이러스 프로테아제) 또는 Xa-절단 부위(Xa 인자)이다.

일부 실시형태에서, 재조합 단백질의 보다 용이한 정제를 위해, 단일 사슬 폴리펩티드는 당업계에 알려진 임의의 정제 태그 서열을 포함할 수 있다. 정제를 보조하는 폴리펩티드의 예는 His-태그, myc-태그, S-펩티드 태그, MBP 태그, GST 태그, FLAG 태그, 티오레독신 태그, GFP 태그, BCCP, 칼모듈린 태그, 스트렙타비딘 태그, HSV-에피토프 태그, V5-에피토프 태그 및 CBP 태그를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 단백질은 바람직하게는 서열 번호 11 및 서열 번호 12 각각의 서열을 갖는 His 및/또는 스트렙타비딘 태그를 포함한다.

2개의 디설파이드 고리를 갖는 평행의 3개의 나선 번들을 형성할 수 있는 적용될 수 있는 조합의 비제한적인 예는 표 3에 나타나 있다. 삼량체화는 480 내지 495의 잔기를 함유하는 서열 부분으로 발생할 수 있지만, 폴드온 도메인의 존재에 의해 촉진될 수 있다. 시스테인 고리의 이용가능성은 디설파이드 결합을 형성하여 3개의 프로모터 사이에 공유 연결을 만들 수 있다. 그 후, 삼량체화 헬퍼 기능은 더 이상 사용되지 않게 되며, 폴더는 절단될 수 있고, 이종기원 서열(및 예를 들어, 비-hMPV)의 면역원성 부작용을 피할 수 있다는 이점을 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, 재조합 hMPV F 단백질은 서열 번호 5 내지 9 또는 24 내지 28 중 어느 것의 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있고, 예를 들어 백분율 서열 동일성은 참조 서열의 전장 길이에 걸쳐 결정된다. 재조합 단일 사슬 hMPV F 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 F2 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단일 사슬 F 단백질은 서열 번호 3의 아미노산 서열, 바람직하게는 적어도 서열 번호 3의 잔기 17 내지 437 또는 17 내지 388과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 F1 도메인을 포함할 수 있다.

핵산 및 벡터 코딩

본 명세서는 본 발명의 재조합 hMPV 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 핵산은 예를 들어, a) hMPV F 단백질의 (변형된) F1 도메인; b) hMPV F 단백질의 (변형된) F2 도메인, c) F1과 F2 사이에 위치한 이종 펩티드 링커; d) 삼량체화 헬퍼 도메인; 및 선택적으로 e) 정제 태그를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하고, F1과 F2 도메인은 링커의 시스테인과 F1 도메인의 시스테인 사이에 도입된 적어도 하나의 비-자연 디설파이드 결합에 의해 공유적으로 연결된다. 본 발명의 단백질을 코딩하는 핵산은 서열 번호 19 내지 23의 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다.

본 명세서는 또한 서열 번호 5 내지 9 또는 24 내지 28의 임의의 것의 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함한다. 본 명세서는 또한 서열 번호 19 내지 23의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 단리된 핵산 분자를 포함하고, 예를 들어 백분율 서열 동일성은 참조 서열의 전장 길이에 걸쳐 결정된다.

본 명세서는 또한 본 발명의 재조합 단백질의 발현을 위한 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 명세서는 또한 단리된 폴리펩티드를 발현하고 제공하는 것을 보조하기 위해 고안된 발현 시스템을 제공한다. 본 명세서는 또한 본 발명의 재조합 hMPV F 단백질의 발현을 위한 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 원핵생물일 수 있다. 원핵생물은 예를 들어 E. 콜라이일 수 있다. 숙주 세포는 진핵 세포일 수 있다.

면역원성 조성물 및 제형

본 발명의 재조합 단일 사슬 hMPV F 단백질은 면역원성이고, 천연 hMPV F 단백질을 인식하는 중화 항체를 유도할 수 있다. 본 개시내용은 또한 서열 번호 5 내지 9 또는 24 내지 28의 단백질과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 재조합 hMPV 단백질의 면역원성 단편 및 면역원성 단백질을 포함한다.

본 개시내용은 또한 본 발명의 재조합 hMPV F 단백질, 또는 hMPV F 단백질을 코딩하는 단리된 DNA 분자 또는 벡터를 포함하고, 당업계에 알려진 허용가능한 담체 및/또는 부형제 또는 안정화제를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신을 제공한다(일반적으로 문헌[Remington, 2005. The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams and Wilkins]를 참조). 면역원성 조성물은 면역원성 조성물이 주입되거나 아니면 도입된 경우 포유동물 숙주에서 면역 반응을 유도하는 임의의 물질의 조성물이다. 면역 반응은 체액성, 세포성 또는 둘 다일 수 있다. 부스터 효과는 동일한 면역원성 조성물에 대한 포유동물 숙주의 후속 노출 시 면역원성 조성물에 대한 증가된 면역 반응을 지칭한다. 체액 반응은 면역원성 조성물에 노출 시 포유동물 숙주에 의한 항체의 생성을 유도한다.

면역원성 조성물 또는 백신은 아쥬반트를 추가로 포함할 수 있다. 아쥬반트는 투여 방법을 기초로 선택될 수 있고, 미네랄 오일-기반 아쥬반트, 예컨대 프로인트 완전 및 불완전 아쥬반트, 몬타니드 불완전 Seppic 아쥬반트, 예컨대 ISA, 수중유 에멀젼 아쥬반트, 예컨대 리비 아쥬반트 시스템, 수중유 에멀젼 아쥬반트, 예컨대 MF59^®(Novartis AG) 또는 AddaVax™(InvivoGen)(문헌[Ott G. et al. 1995. Pharm Biotechnol 6: 277-96]), 모노포스포릴 지질 A(MPL)(문헌[Cluff CW. 2010. Adv Exp Med Biol 667:111-23]), 알루미늄 염 아쥬반트(백반)(예를 들어, 국제공개 WO2013/083726호에 기재된 것과 같음), 무라밀 디펩티드(MDP)를 함유하는 신택스 아쥬반트 제형, 다가양이온성 중합체, 특히 다가양이온성 펩티드, 특히 폴리아르기닌 또는 적어도 2개의 LysLeuLys 모티프, 특히 KLKLLLLLKLK를 함유하는 펩티드, 정의된 염기 맥락(예를 들어, 국제공개 WO96/02555호에 기재된 것과 같음)에서, 비메틸화된 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG), 예를 들어 CpG 1018(Dynavax)을 함유하는 면역자극성 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN) 또는 이노신 및 시티딘(예를 들어, 국제공개 WO01/93903호에 기재된 것과 같음), 또는 데옥시이노신 및/또는 데옥시우리딘 잔기(국제공개 WO01/93905호 및 국제공개 WO02/095027호에 기재된 바와 같음)를 함유하는 데옥시핵산, 특히 올리고 (dIdC)₁₃(국제공개 WO01/93903호 및 국제공개 WO01/93905에 기재된 바와 같음)을 기반으로 하는 ODN, 국제공개 WO04/084938호 및 문헌[Olafsdottir et al. 2009 (Scand J Immunol. 69(3): 194-202)]에 기재된 아쥬반트 IC31^®(Valneva SE), 신경자극성 화합물, 특히 인간 성장 호르몬(국제공개 WO01/24822호에 기재된 것과 같음), 및 문헌[Sarkar I. et al.(2019. Expert Rev Vaccine: 18(5): 505-521)]에 기재된 것, 또는 이의 조합, 예컨대 문헌[Giudice GD et al. 2018 (Seminars in Immunology 39: 14―21)]에 기재된 AF03, AS01, AS03 및 AS04를 포함할 수 있다. 일부 조합은 예를 들어 국제공개 WO01/93905호, 국제공개 WO02/32451호, 국제공개 WO01/54720호, 국제공개 WO01/93903호, 국제공개 WO02/13857호, 국제공개 WO02/095027호 및 국제공개 WO03/047602호에 기재된 것에 따른다. 일 바람직한 실시형태에서, 아쥬반트는 강한 항체와 Th2-편향된 면역 반응을 유도하는 알루미늄 히드록시드 또는 알루미늄 염이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 아쥬반트는 MF59^® 또는 Addavax^TM, MPL/백반 및 IC31^®과 같은 혼합된 Th1/Th2 반응을 유도하는 아쥬반트 또는 아쥬반트의 조성물이다.

본 개시내용은 또한 본 발명의 재조합 hMPV F 단백질을 포함하고, 추가로 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제는 완충액, 안정화제, 희석제, 보존제, 및 가용화제를 포함할 수 있다(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition, 1975]를 참조).

허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 투여되는 용량과 농도에서 수용자에게 무독성이다. 담체, 부형제 또는 안정화제는 완충액을 추가로 포함할 수 있다. 부형제의 예는, 탄수화물(예컨대, 단당류 및 이당류), 당류(예컨대, 수크로오스, 만니톨 및 소르비톨), 포스페이트, 시트레이트, 산화방지제(예컨대, 아스코르브산 및 메티오닌), 보존제(예컨대, 페놀, 부탄올, 벤자놀; 알킬 파라벤, 카테콜, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 레조르시놀, 시클로헥사놀, 3-펜타놀, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 및 m-크레졸), 저분자량 폴리펩티드, 단백질(예컨대, 혈청 알부민 또는 면역글로불린), 친수성 중합체 아미노산, 킬레이트제(예컨대, EDTA), 염형성 반대이온, 금속 착물(예컨대, Zn-단백질 착물), 및 비이온성 계면활성제(예컨대, TWEEN™ 및 폴리에틸렌 글리콜)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 면역원성 조성물은 인간을 포함한 포유동물 숙주에서 면역 반응을 유도한다. 면역 반응은 세포 의존성 반응 또는 항체 의존성 반응 또는 둘 다일 수 있다. 이러한 면역원성 조성물은 백신으로서 유용하고, hMPV 감염에 대해 보호성 반응을 제공할 수 있다.

본 개시내용은 적어도 하나의 상이한 감염 바이러스, 특히 기도 감염을 유발하는 바이러스, 예컨대 hMPV, RSV(호흡기 세포융합 바이러스), PIV3(파라인플루엔자 바이러스 유형 3), 인플루엔자 바이러스 또는 코로나바이러스(예컨대, SARS-CoV, SARS-CoV-2, MERS 등)로부터 유래된 하나 이상의 추가 항원(들)을 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신을 제공한다. 바람직하게는, 추가 항원은 RSV F 단백질, PIV3 F 단백질, 인플루엔자 헤마글루티닌 또는 코로나바이러스 S-단백질이다.

본원에 개시된 면역원성 재조합 단백질, 단리된 DNA 또는 RNA 분자, 벡터 및 면역원성 조성물 또는 백신은 특히 바이러스 기도 감염 및 관련 질환, 특히 hMPV에 의해 유발된 감염 및 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 의약으로서 사용하기에 적합하다.

재조합 hMPV F 단백질, 또는 hMPV F 단백질을 코딩하는 단리된 핵산(DNA 또는 RNA) 분자 또는 면역원성 조성물(백신)의 제조 방법이 본 개시내용에 포함된다. 대상에서 면역 반응을 생성하는 방법, 기도 감염, 특히 hMPV에 의해 유발된 기도 감염의 치료, 억제 또는 예방 방법이 또한 포함된다.

본 발명은 하기 비제한적인 실시형태들을 참조로 단지 예시로서 설명될 것이다.

실시예

실시예 1: 변형 F 단백질의 디자인

구조적 모델

안정화된 융합전 형태의 돌연변이된 hMPV F 단백질의 디자인은 융합전 RSV F(PDB:4JHW 및 4MMV, 또한 4MMU, 4MMS), 융합전 PIV-5 F(PDB:5GIP), 융합전 hMPV F(PDB:5WB0) 및 융합후 hMPV F(PDB:5L1X) 단백질의 이용가능한 결정 구조로부터 유래된 상동성 모델을 기반으로 수행되었고, 이는 융합 과정의 상이한 전환 단계의 모델을 나타낸다. 폴드온 도메인을 모델 PDB:2IBL로부터 채택하였다. 모델 구성 및 구조적 분석을 PyMol 구조 에디터 패키지의 오픈소스 버젼을 사용하여 수행하였다(Schrodinger LLC, https://github.com/schrodinger/pymol-open-source). 모델은 NAMD 모델링 패키지(문헌[Phillips et al. 2005. J Comput Chem. 26(16):1781-802]) 및 charmm36 forcefield(문헌[McKerell et al. 1998. J Phys Chem B. 102(18):3586-3616]) 또는 Gromacs(문헌[Berendsen et al. 1995. Comp. Phys. Comm. 91:43-56]; 문헌[Hess et al. 2008, J. Chem Theory Comput. 4, 435-447]; www.gromacs.org)/OPLS-AA (Jorgensen WL, Yale Univ.)로 정밀화하였다. 후보 모델은 전형적으로 총 13 ns 동안의 NVT, NPT 시뮬레이션 시퀀스 내에서 진공 이완 후 적용하는 프로토콜에서 정밀화되었으며, 대칭 어닐링(문헌[Anishkin et al. 2010. Proteins. 78(4): 932―949]로부터 채택됨)의 세 주기 적용 후 자유 샘플링 및 에너지 최소화가 적용되었다.

실시예 2: 재조합 F 단백질의 생성

균주

천연 hMPV F 단백질은 서열 번호 1, 13 내지 18의 서열로 제시된 임의의 hMPV 균주 및 임의의 항원형, 또는 이의 변이체로부터 선택될 수 있다. 특정한 예시적인 실시형태에서, hMPV F 단백질은 서열 번호 1로 제시된 균주 NL/1/00, 항원형 A1 및 서열 번호 14로 제시된 균주 CAN97-83, 항원형 A2로부터 유래된다.

발현 벡터

클로닝에 사용된 플라스미드 pVVS 1371은 하기를 함유한다:

- 치킨 β- 글로빈 유전자좌로부터의 HS4 인슐레이터 서열,

- 2개의 CMV 프로모터,

- 분지 및 인간 β-글로빈 유전자의 첫번째 인트론으로부터의 5'-공여체 부위 및 면역글로불린 유전자 중쇄 가변 영역의 인트론으로부터의 3'-수용체 부위로 구성된, CMV 프로모터의 다운스트림의 2개의 키메릭 인트론. 분지 포인트 부위와 함께 공여체와 수용체 부위의 서열은 스플라이싱을 위한 공통 염기 서열과 일치하도록 조정되었다. 인트론은 cDNA 서열,

- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 서열(bGH A),

- SV40 인핸서 및 초기 프로모터 영역의 조절 하에 Tn5로부터의 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 내에서 가능한 잠복 5'-공여체 스플라이스 부위의 이용을 방지하기 위해 cDNA 삽입물의 업스트림에 위치하고,

- 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나아제 유전자의 HSV TK 폴리아데닐화 신호는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자,

- 박테리아 프로모터의 조절 하 카나마이신 저항 유전자, 및

- 복제의 pUC 복제원점의 다운스트림에 위치한다.

야생형 F 단백질의 코딩 서열은 hMPV 균주 NL/1/00, 하위계통 A1으로부터 단리되었고, CHO 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 야생형 및 변형된 F 단백질의 코딩 서열은 CHO 세포에서의 일시적인 또는 안정한 단백질 발현을 위한 pVVS1371 플라스미드로 클로닝되었다.

간략하게, 코딩 서열은 제한 부위 SalI 및 PacI를 사용하여 pVVS1371 벡터의 키메릭 인트론과 bGH A 폴리아데닐화 부위 사이에서 클로닝되었다. 벡터와 합성된 코딩 서열(합성은 GeneArt에 의해 수행되었음)은 아가로오스 겔에서의 정제 전에 SalI 및 PacI로 분해되었다. 단편은 T4 DNA 리가아제로 결찰되었고, 결찰 생성물은 최대 효율 DH5α 활성화 세포를 형질전환하는 데 사용되었다. 선택된 클론은 서열 분석에 의해 고안된 돌연변이에 대해 시험되었다.

CHO 세포에서의 발현

단백질 발현은 MaxCyte® STX 측정가능 형질감염 시스템 장치와 공급사의 후속 실험 권장사항을 사용하여 CHO 세포의 일시성 형질감염을 기반으로 한다. 간략하게, 전기천공 전, CHO 세포를 펠렛화하고, MaxCyte® 전기천공 완충액에서 현탁시키고, 해당 발현 플라스미드 DNA와 혼합한다. 세포-DNA 혼합물을 카세트 가공 어셈블리로 이동시키고, MaxCyte® STX 측정가능 형질감염 시스템 상에 로딩한다. 세포를 장치에 예비로딩된 "CHO" 프로토콜을 사용하여 전기천공하고, 배양물 플라스크로 즉시 이동시키고, 37℃에서 8% CO₂로 30 내지 40분 동안 배양한다. 회수 기간 이후, 세포를 EX-CELL ACF CHO 배지(Sigma Aldrich)에서 고밀도로 재현탁한다. 전기천공 후 세포 배양을 37℃에서 8% CO₂로 오비탈 셰이킹과 함께 수행한다.

생산 동역학은 배양 온도를 32℃로 낮추고, CHO 세포(Yeastolate, 글루코오스 및 glutaMax가 보충된 CHO CD EfficientFeed™ A(ThermoFischer Scientific))에서 일시성 단백질 발현을 위해 형질감염된 세포에 개발된 유가식 배지를 매일 공급하는 것으로 이루어진다. 약 7 내지 14일의 배양 후, 세포 생존력을 확인하고, 10분 동안 최대 속도로 2회의 원심분리에 해당하는 세포 정화 후 컨디셔닝된 배지를 수확한다. 정화된 생성물은 0.22 μm 멸균 막을 통해 여과되고, 단백질 정제 전 -80℃에서 보관된다.

세포내 면역염색에 의한 단백질 검출

7일의 형질감염 후, 세포를 PBS에서 1회 세척하고, 실온에서 4% 파라포름알데히드에서 10분 동안 고정한다. 고정 세포를 실온에서 15분 동안 BD Perm 세척에서 투과화하고, 4℃에서 1시간 동안 BD Perm 세척에서 희석된 1차 항체와 배양한다. 최종적으로, 형광 마커에 결합된 2차 항체를 4℃에서 1시간 동안 첨가하고, 유세포 분석에 의한 분석(MacsQuant Analyzer, Miltenyi Biotec)까지 4℃에서 PBS 중에 저장한다. 1차 항체로서, 특이적으로 hMPV F 단백질의 융합전 형태를 인식하는 MPE8-N113S 항체(PRO-2015-026-01) 또는 융합전 및 융합후 hMPV F 단백질을 인식하는 DS7 IgG1 항체(PRO-2016-003)가 사용되었다. 형광 FITC 2차 항체는 염소 항마우스 IgG + IgM(JIR 115-096-068)이었다.

단백질 정제

동결된 상청액을 실온으로 만들고, PBS에 대해 표준 등급 재생 셀룰로오스 투석막 Spectra/Por® 1-7 CR(MWCO: 3.5 kDa)(Spectrum)을 이용하여 투석하였다. 이후, 이를 pH 8.0에서 50 mM Na₂HPO₄ 완충액, 300 mM NaCl로 평형화하고, 고정화 금속 이온 친화도 크로마토그래피(IMAC: Immobilized Metal ion Affinity Chromatography) 이후 겔 투과 크로마토그래피에 의해 단백질의 정제를 수행한다.

IMAC의 경우, Ni²⁺를 함유하는 아가로오스 수지(His GraviTrap)를 제조사(GE Healthcare)에 의해 크로마토그래피 컬럼으로 패킹한다. 제조사의 지침에 따라 수지를 2 부피의 탈이온수로 세척하고, 3 부피의 평형 및 세척 완충액(20 mM 소듐 포스페이트, pH 7.4와, 0.5 M 소듐 클로라이드 및 20 mM 이미다졸)으로 평형화시킨다. 샘플 로딩 후, 컬럼을 10 mL의 세척 완충액으로 세척한다. 제조사의 지침에 따라 3 내지 10 컬럼 부피의 용출 완충액을 사용하여 His-태깅된 단백질을 컬럼으로부터 용출한다(50 mM 소듐 포스페이트, pH 8.0과, 0.5 M 소듐 클로라이드 및 500 mM 이미다졸). 이후, 용출액을 0.22 μm 필터에서 여과하고, 저장 완충액(50 mM Na₂HPO₄, 300 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8.0)에 대해 Slide-A-lyzer™ 투석 카세트에서 2회 투석한 후 이는 분취되고 -20℃에서 저장된다.

재조합 단백질의 순도, 크기 및 응집 분석은 크기 배제 크로마토그래피(SE-HPLC) 및 SDS-PAGE에 의해 수행된다. SE-HPLC(Shimadzu)는 컬럼 SUPERDEX200(GE Healthcare) 상에서 수행된다. SDS-PAGE의 경우, 단백질을 샘플 완충액(pH 8.8에서 0.08 M Tris-HCl 2% SDS, 10% 글리세롤, 0.01% 브로모페놀 블루)에서 희석하고, 베타-메르캅토에탄올(또는 DTT)의 존재 하에서 5분 동안 끓이고, Criterion XT 4-12% 비스-Tris 글리신 폴리아크릴아미드 겔(BioRad)에서 전기영동으로 분리한다(SDS-PAGE). 겔은 쿠마시 블루(인스턴트 블루, Sigma Aldrich) 용액에서 염색된다. 과량의 염색을 물로 제거하고, Imager 600(Amersham)을 사용하여 밴드를 가시화한다. 도 4는 정제된 재조합 F 단백질의 SE-HPLC 분석을 보여준다. 재조합 F 단백질의 예시적 수율을 표 4에 나타낸다.

실시예 3: 재조합 hMPV F 단백질의 형태

샌드위치 ELISA에 의한 형태 프로파일 결정

배지 결합 플레이트(Greiner)를 200 ng/웰에서 인간 IgG1 DS7 포획 항체(문헌[Williams et al., 2007])로 코팅하고, 4℃에서 밤새 배양한다. PBS 0.05% Tween 20 및 5% 건조 스킴 밀크로, 진탕 하에서(포화 완충액) 37℃에서 2시간 동안 플레이트를 포화시킨다. 웰로부터 액체를 제거하고, 포화 완충액에서 희석된 2.5 ng/웰의 논의되는 정제 단백질로 37℃에서 1시간 동안 플레이트를 배양한다. 세척 후, 융합전 hMPV F 단백질에 대해 유도된 마우스 항체 MPE8 N113S(문헌[Corti et al., 2013]) 또는 융합후 hMPV F 단백질에 대해 유도된 마우스 항체 MF1(Melero, personal communications)의 포화 완충액 중 5배 연속 희석물을 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 이후, 퍼옥시다아제 HRP 염소 항마우스 IgG(Covalab # lab0252)와 콘쥬게이트된 2차 α-Ig 종 특이적 항체 이후 50 μL의 퍼옥시다아제 기질(TMB, Sigma)로 37℃에서 1시간 동안 배양함으로써 면역 착물을 검출한다. 3 N H₂SO₄를 첨가하여 비색 반응을 중단하고 분광 광도계(MultiSkan)를 사용하여 490 nm에서 각 웰의 흡광도를 측정한다.

도 5는 융합전 또는 융합후 특이적 항체를 갖는 재조합 F 단백질에 대해 수행된 ELISA 결과를 보여준다. 모든 시험된 후보물질은 융합전 및 융합후 형태 모두에 존재하는, 하나의 후보물질 L7F_A1_4.2를 제외하고, 융합전 프로파일의 풍부도를 나타낸다. 재조합 단백질 L7F_A1_23.3은 이종 링커에서 단 하나의 아미노산 잔기가 L7F_A1_23과 상이하고, 즉 이는 서열 번호 1의 위치 118에서의 발린 잔기에 해당하는, 링커(CGAGV)의 위치 5에서 발린을 포함한다.

실시예 4: 면역원성 연구

마우스에서 면역원성

5 내지 10개의 BALB/c 마우스 그룹을 3주 간격(예를 들어, 0, 14 또는 21 및 28 또는 42일)으로, 상이한 아쥬반트, 특히 백반, 백반+MPL, IC31^®, Addavax^TM(InvivoGen)를 포함하거나 미포함하여, 재조합 F 단백질(마우스당 0.06 μg 내지 6.0 μg의 양으로 상이한 실험에서 사용됨)로 3회 피하로 면역화된다. 혈청을 안와후 출혈에 의해 수집한다. 마지막 백신접종 1 내지 4주 후, 혈액을 회수하고 혈청을 준비한다. 하기 기재된 간접적 ELISA에 의해 혈청에서 IgG₁/IgG_2a 하위유형을 결정함으로써 Th₁/Th₂형 면역 반응 평가를 수행한다.

하위부류 IgG ELISA

재조합 F 단백질을 pH 9.6에서 카르보네이트/바이카르보네이트 완충액에서 희석하고, 웰당 50 ng의 단백질을 96웰 고결합 플레이트(50 μL/웰, Greiner)에 첨가한다. 플레이트를 4℃에서 밤새 배양한다. 150 μL의 PBS 0.05% Tween 20 및 5% 건조된 스킴 밀크(포화 완충액)로 실온에서 30분 동안 웰을 포화시킨다. 웰로부터 액체를 제거하고, 포화 완충액 중 상이한 희석물(5배 연속 희석)에서 50 μL/웰의 면역화된 마우스의 혈청으로 실온에서 1시간 동안 플레이트를 배양한다. PBS 0.05% Tween 20으로 3회 세척 후, 퍼옥시다아제와 콘쥬게이트된 50 μl의 2차 항-IgG₁ 또는 IgG_2a 마우스 특이적 항체 이후 50 μL의 퍼옥시다아제 기질(TMB, Sigma)로 실온에서 1시간 동안 배양함으로써 면역 착물을 검출한다. 오르토인산을 첨가하여 비색 반응을 중단하고, 분광 광도계(MultiSkan)를 사용하여 490 nm에서 각 웰의 흡광도를 측정한다.

도 6은 상이한 아쥬반트와 함께 투여된 마우스당 2 μg의 재조합 단백질 sF_A1_K_L7(서열 번호 6) 또는 sF_A1_MFur(서열 번호 53)로 면역화된 마우스로부터의 혈청을 시험함으로써 수득된 IgG ELISA의 결과를 보여준다. 고 IgG₁/IgG_2a 역가의 유도는 어떤 아쥬반트가 사용되었는지에 관계없이 두 F 단백질 모두에 대해 입증된다.

도 7은 Addavax^TM 혼합 1:1 (v/v)로 보강된 하나의 재조합 F 단백질(2 μg)로 면역화된 마우스에서 측정된 IgG₁ 및 IgG_2a 역가 결과를 보여준다.

또한, 도 8은 IC31^®로 보강된 하나의 재조합 F 단백질(2 μg)로 면역화된 마우스에서 측정된 혈청 IgG₁ 및 IgG_2a 역가를 보여준다. 일부 변동성에도 불구하고, 데이터는 모든 백신 후보물질이 고도로 면역원성이고, IgG₁/IgG_2a 항체를 유도할 수 있다는 것을 명백히 보여준다.

실시예 5: 중화 항체의 유도

중화 검정

간략하게, 플라크 감소 중화 시험(PRNT: plaque reduction neutralization test)을 사용하여, 대조 혈청/항체에 비해 50%로 hMPV 바이러스 플라크 수를 감소(PRNT50)시키기 위해 요구된 면역화된 대상의 혈청/항체 역가를 결정한다. PRNT50은 hMPV로 감염될 수 있는 세포의 단일층을 사용하여 수행된다. 대상으로부터의 혈청을 희석하고, 살아 있는 hMPV 바이러스로 배양한다. 세포 단일층에 형성된 플라크를 계수하고, 혈청 또는 대조 항체의 부재 하에서 바이러스에 의해 형성된 플라크의 수와 비교한다. PRNT50에서 혈청의 1:10 희석물의 혈청 중화 항체의 역치는 일반적으로 보호의 증거로 수용된다(문헌[Hombach et. al. 2005. Vaccine 23: 5205-5211]).

PRNT 프로토콜

1 mL의 EMEM(Lonza), 2 mM의 L-Gln(Ozyme), 5% FBS 및 1% NeAA(Ozyme) 완충액 하에서, 웰당 1.2 x 10⁵개의 LLC-MK2 세포로 24-웰 플레이트를 파종하고, 37℃ 및 5% CO₂에서 24시간 동안 배양한다. hMPV A1 바이러스(Valneva MVB 1611-009 뱅크)를 50 pfu/62.5 μL(웰당) 또는 800 pfu/mL로 희석한다. 동등한 부피의 바이러스와 혈청 희석물(2 x 62.5 μL)을 조합하고, 37℃ 및 5% CO₂에서 대략 1시간 동안 배양한다. PBS로의 플레이트 세척 후, 125 μL의 바이러스/혈청 혼합물을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 진탕(100 rpm) 하 37℃에서 2시간 동안 배양한다. 이후, 225 μL/웰의 오버레이 용액(EMEM, 2 mM Gln, 0.75% 메틸셀룰로오스)을 첨가하고, 플레이트를 37℃ 및 5% CO₂에서 5일 배양한다. 세포 고정을 위해, 225 μL/웰의 4% PFA/PBS를 첨가하고, 실온에서 10분 동안 배양한 후 PBS로 3회 세척한다. 세포 투과화를 위해, 0.5 ml의 PBS, 0.5%의 Tween, 0.1%의 BSA를 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 30분 배양한다. 1차 항체(인간 DS7- PRO-2016-003)(0.91 μg/mL)를 5 μL/mL의 최종 농도로 PBS에서 희석시키고, 150 μL의 1차 항체 희석물을 웰당 첨가하고, 진탕 하 37℃에서 45분 배양한다. 1차 항체를 제거하고, 블로킹 완충액으로 3회 플레이트를 세척한 후, 150 μL/웰의 희석된 2차 항체 - 항-인간 HRP(UP783493) -를 첨가하고, 플레이트를 진탕 하 37℃에서 추가 45분 동안 배양한다. 이후, 2차 항체를 제거하고, 플레이트를 블로킹 완충액으로 3회 세척한다. 염색을 위해, 웰당 150 μL의 DAB 1x기질을 첨가한다. 실온에서 1시간 배양 후, 세포를 현미경 아래에서 수동적으로 계수한다.

도 9는 상이한 아쥬반트의 맥락에서 재조합 단백질 sF_A1_K_L7(2 μg)로 면역화된 마우스로부터 57일째에 수확된 혈청으로 수득된 중화 검정 결과를 보여준다. 일반적으로, 시험된 F 단백질에 대한 중화 항체는 사용된 아쥬반트와 관계없이 마우스 혈청에 존재한다.

모든 단백질 후보물질이 시험된 실험에서, IC₅₀ 값은 Addavax^TM로 보강된 L7F_A1_23 후보물질에 대해 가장 높았고, IC31^®로 보강된 L7F_A1_23 후보물질에 대해 가장 높았다(도 10 및 표 5 참조). 사용된 아쥬반트와 독립적으로 가장 낮은 IC₅₀ 값을 L7F_A1_31 후보물질에 대해 계산하였다.

도 11은 Addavax^TM와 함께 마우스에 접종된 경우, 재조합 F 단백질의 면역원성을 평가하기 위해 수행된 용량-반응 연구를 입증한다. 플라시보 군(데이터는 나타내지 않음)과 대조적으로, 중화 항체는 0.06 μg 내지 6.0 μg의 재조합 F 단백질로 면역화된 마우스 혈청에서 검출된다. 구조체 중에서 IC₅₀의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.

실시예 6: 마우스에서의 보호

바이러스 플라크(병소) 면역염색

문헌[Williams et al., 2005. J Virology 79(17):10944-51]; 문헌[Williams et al., 2007. J Virology 81(15):8315-24]; 및 문헌[Cox et al., 2012. J. Virology 86(22):12148-60]에서 공개된 방법을 기반으로 hMPV 병소 정량화를 위한 검정을 개발하였다. 간략하게, 24-웰 플레이트에서 베로 세포 또는 LLC-MK2 세포의 융합성 배양물을, 배지에서 희석된 마우스 혈청의 존재 하 또는 부재 하에서, 실온에서 30분 동안 사전배양된 50 μL/웰의 hMPV 바이러스로 감염시킨다. 마우스 IgG_2aDS7 단일클론성 항체를 hMPV의 검출을 위해 사용한다. 37℃에서 2시간의 바이러스 흡착 후, 2 mM의 L-Gln 및 20 내지 50 μg/mL의 트립신이 보충된 1.5% 메틸셀룰로오스 오버레이 함유 EMEM 배지를 첨가한다. 감염 후 6일째에, 상청액을 제거하고, 세포를 PBS로 2회 세척한다. 세포 단일층을 고정하고, 인간 IgG₁ DS7 항체로 염색한다. 병소를 계수하고, 관련 음성 및 양성 대조군을 고려하여 50% 플라크 감소 역가를 계수한다. 세포 이미지를 2.5x 또는 10x 대물렌즈를 사용하여 Zeiss 현미경으로 캡쳐한다. 면역염색의 결과는 밀리리터당 병소 형성 단위 또는 FFU(focus forming unit)/mL로서 표현된다.

챌린지 프로토콜

LLC-MK2 세포에서 성장한 hMPV A1 및 A2 단리물을 동물 챌린지 실험에서 사용한다. 상기 기재된 바와 같은 아쥬반트화된 재조합 F 단백질을 이용하여 2주 간격으로 3회 BALB/c 마우스를 면역화하고, 면역화 후 42일째에, 이들은 대략 1x10⁶ pfu의 hMPV로 비강 내에서 면역성이 시험된다. 4 내지 5일 후, 동물을 희생시키고, 개별 혈청 샘플을 취하고, 동결시킨다. 바이러스 역가의 결정을 위해 폐 조직 샘플을 수확하고, 칭량하고 균질화한다. 폐 조직에서의 바이러스 로드는 상기 기재된 바와 같은 바이러스 병소 면역염색에 의해 결정된다. 대안적으로 또는 부가적으로, RT-qPCR을 사용하여 수확된 조직 중 바이러스 로드를 결정한다.

도 12는 RT-qPCR에 의해 수행된 야생형 hMPV로의 챌린지 후, 보강된 재조합 F 단백질로 면역화된 마우스의 폐에서의 바이러스 RNA 로드(GCE)를 입증한다. 가장 높은 hMPV RNA 로드가 플라시보 군에서 관찰되는 반면, 면역화된 마우스의 폐에서는 바이러스 로드의 상당한 감소가 관찰되어 백신 후보물질에 의한 보호를 입증한다.보호 효과는 바이러스 플라크(병소) 면역염색이 사용되는 경우에 보다 더욱 명백하다. 도 13에 나타난 바와 같이, 모든 시험된 hMPV F 단백질 후보물질에 대해, 플라시보 군과 비교하여 상이한 단백질 용량(마우스당 0.06 내지 6.0 μg)으로 면역화된 마우스에서 FFU/mL로 계산된 바이러스 로드의 상당한 감소(4 log 이하)가 관찰된다.

기재된 방법 또는 조성물의 정확한 세부사항은 기재된 실시형태들의 개념으로부터 벗어나지 않으면서 변경 또는 변형될 수 있다. 본 발명은 하기 청구범위의 범위 및 개념 내에 속하는 모든 상기 변형 및 변경을 주장한다. 본 명세서에 기재된 모든 공개물은 본원에 참조로 포함된다.

서열

서열 번호 1

균주 NL/1/00, 항원형 유전자형 A1의 천연 hMPV F 단백질 서열(GenBank: AAK62968.2)

MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAVLGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN

서열 번호 2

균주 NL/1/00, 항원형 A1의 천연 hMPV F2 도메인 서열

LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQSR

서열 번호 3

균주 NL/1/00, 항원형 A1의 천연 hMPV F1 도메인 서열

FVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAVLGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN

서열 번호 4

이종 펩티드 링커

CGAGA

서열 번호 5

L7F_A1_23 단백질 서열

MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIEQPRQSGCGAGATAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTCAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSAGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK

서열 번호 6

sF_A1_K_L7 단백질 서열

MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIEQPRQSGCGAGATAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLAFAVRELKDFVSKNLTRALNKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTCAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAESAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK

서열 번호 7

L7F_A1_31 단백질 서열

MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFMLEVGDVENLTCADGPSLLKTELDLTKSALRNLRTVSADQLAREEQIEQPRQSGCGAGATAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLATMVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTCAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSAGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK

서열 번호 8

L7F_A1_33 단백질 서열

MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFMLCVGDVENLTCADGPSLLKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIEQPRQSGCGAGATAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLATMVRELCDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGFLIGVYGSDVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTCAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRCCSAGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK

서열 번호 9

L7F_A1_4.2 단백질 서열

MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFMLEVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIEQPRQSGCGAGATAGVAIAKTIRLESEVTAWKNALKKTNEVVSTLGNGVRVLVTMVRELKDFVSKNLTRALNKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTCAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAESAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK

서열 번호 10

T4 박테리오파지의 피브리틴으로부터의 삼량체 헬퍼 도메인(폴드온)

GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL

서열 번호 11

링커로서 선두 GS를 갖는 His-태그 서열

GSHHHHHH

서열 번호 12

스트렙타비딘-태그 서열

SAWSHPQFEK

서열 번호 13

균주 NL/17/00, 항원형 A2의 천연 hMPV F 단백질 서열(GenBank: AY304360.1)

MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCSDGPS LIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRL ESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIDDLKMAVSFSQ FNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILI GVYGSSVIYTVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKD CETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSC SIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPEDQ FNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAVLGSSMILVSIFIIIKKTKKP TGAPPELSGVTNNGFIPHS

서열 번호 14

균주 CAN97-83, 항원형 A2의 천연 hMPV F 단백질 서열(Uniprot Q6WB98)

MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCSDGPS LIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRL ESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIDDLKMAVSFSQ FNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILI GVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKD CETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSC SIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPEDQ FNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAVLGSSMILVSIFIIIKKTKKP TGAPPELSGVTNNGFIPHS

서열 번호 15

균주 NCL174, 항원형 A2의 천연 hMPV F 단백질 서열(Uniprot G0ZRI7)

MSWKVVIIFSLLITPQHSLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCADGPS LIKTELDLTKSALRELKPVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRL ESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIDDLKMAVSFSQ FNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTAAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILI GVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKD CETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSC SIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQ FNVALDQVFENIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAVLGSSMILVSVFIIIKKTRKP TGAPPELSGVTNNGFIPHS

서열 번호 16

균주 NL/1/99 항원형 B1의 천연 hMPV F 단백질 서열(GenBank: AY304361.1)

MSWKVMIIISLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCTDGPS LIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVATAAAVTAGIAIAKTIRL ESEVNAIKGALKQTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKEFVSKNLTSAINRNKCDIADLKMAVSFSQ FNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSYMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILI GVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIIKAAPSCSEKNGNYACLLREDQGWYCKNAGSTVYYPNEKD CETRGDHVFCDTAAGINVAEQSRECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSC SIGSNWVGIIKQLPKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPEDQ FNVALDQVFESIENSQALVDQSNKILNSAEKGNTGFIIVVILVAVLGLTMISVSIIIIIKKTRKP TGAPPELNGVTNGGFIPHS

서열 번호 17

균주 NDL00-1, 항원형 B1의 천연 hMPV F 단백질 서열(GenBank: AAK62968.2)

MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCADGPS LIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRL ESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQ FNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGFLI GVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKD CETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSC SIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQ FNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAVLGSTMILVSVFIIIKKTKKP TGAPPELSGVTNNGFIPHN

서열 번호 18

균주 CAN98-75, 항원형 B2의 천연 hMPV F 단백질 서열(Uniprot: 6WBA7)

MSWKVMIIISLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCTDGPS LIKTELDLTKSALRELKTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVATAAAVTAGIAIAKTIRL ESEVNAIKGALKTTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKEFVSKNLTSAINKNKCDIADLKMAVSFSQ FNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSYMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILI GVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIIKAAPSCSEKDGNYACLLREDQGWYCKNAGSTVYYPNKKD CETRGDHVFCDTAAGINVAEQSRECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSC SIGSNRVGIIKQLPKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPIKFPEDQ FNVALDQVFESIENSQALVDQSNKILNSAEKGNTGFIIVIILIAVLGLTMISVSIIIIIKKTRKP TGAPPELNGVTNGGFIPHS

서열 번호 19

sF_A1_K_L7 코딩 뉴클레오티드 서열, 코돈 최적화됨

ATGTCTTGGAAGGTGGTCATCATCTTCTCCCTGCTGATCACCCCTCAGCACGGCCTGAAAGAGTCCTACCTGGAAGAGAGCTGCTCCACCATCACCGAGGGCTACCTGTCTGTGCTGAGAACCGGCTGGTACACCAACGTGTTCACCCTGGAAGTGGGCGACGTGGAAAACCTGACCTGTGCTGATGGCCCCAGCCTGATCAAGACCGAGCTGGACCTGACCAAGTCTGCCCTGAGAGAACTGAGGACCGTGTCTGCCGATCAGCTGGCCAGAGAGGAACAGATCGAGCAGCCTAGACAGTCCGGATGTGGTGCTGGTGCTACAGCTGGCGTGGCCATTGCCAAGACCATCCGGCTGGAATCTGAAGTGACCGCCATCAAGAACGCCCTGAAAAAGACCAACGAGGCCGTGTCTACCCTCGGCAATGGCGTTAGAGTGCTGGCCTTTGCTGTGCGCGAGCTGAAGGACTTCGTGTCCAAGAACCTGACCAGGGCTCTGAACAAGAACAAGTGTGATATCGCCGACCTGAAGATGGCCGTGTCCTTTAGCCAGTTCAACCGGCGGTTCCTGAACGTCGTGCGGCAGTTCTCTGATAACGCCGGCATCACCCCTGCCATCAGCCTGGATCTGATGACCGATGCCGAGCTGGCTAGAGCCGTGTCCAACATGCCTACCTCTGCCGGCCAGATCAAGCTGATGCTGGAAAACAGAGCCATGGTCCGACGGAAAGGCTTCGGCTTTCTGATCGGCGTGTACGGCTCCTCCGTGATCTACATGGTGCAGCTGCCTATCTTCGGCGTGATCGACACCCCTTGCTGGATCGTGAAGGCCGCTCCTAGCTGCTCTGAGAAGAAGGGCAACTACGCCTGCCTGCTGAGAGAGGACCAAGGCTGGTACTGTCAGAACGCCGGCTCCACCGTGTACTACCCCAACGAGAAGGACTGCGAGACAAGAGGCGACCACGTGTTCTGCGATACCTGCGCTGGCATCAATGTGGCCGAGCAGTCCAAAGAGTGCAACATCAACATCTCCACCACCAACTATCCCTGCAAGGTGTCCACCGGCAGGCACCCTATTTCCATGGTGGCTCTGTCTCCACTGGGCGCCCTGGTGGCTTGTTATAAGGGCGTGTCCTGCTCCATCGGCTCCAACAGAGTGGGCATCATCAAGCAGCTGAACAAGGGCTGCAGCTACATCACCAACCAGGACGCCGATACCGTGACCATCGACAATACCGTGTATCAGCTGTCCAAGGTGGAAGGCGAGCAGCACGTGATCAAGGGCAGACCTGTGTCCTCCAGCTTCGACCCCGTGAAGTTCCCTGAGGATCAGTTCAACGTGGCCCTGGACCAGGTGTTCGAGTCCATCGAGAACTCTCAGGCTCTGGTGGACCAGTCCAACCGGATCCTGTCCTCTGCCGAGTCTGCTATCGGCGGCTATATCCCCGAGGCTCCTAGAGATGGCCAGGCCTATGTTCGGAAGGATGGCGAATGGGTGCTGCTGTCTACCTTCCTCGGAGGCCTGGTGCCTAGAGGCTCTCACCACCATCATCACCACTCCGCTTGGTCCCATCCACAGTTCGAGAAGTGA

서열 번호 20

L7F_A1_23 코딩 뉴클레오티드 서열, 코돈 최적화됨

ATGTCTTGGAAGGTGGTCATCATCTTCTCCCTGCTGATCACCCCTCAGCACGGCCTGAAAGAGTCCTACCTGGAAGAGAGCTGCTCCACCATCACCGAGGGCTACCTGTCTGTGCTGAGAACCGGCTGGTACACCAACGTGTTCACCCTGGAAGTGGGCGACGTGGAAAACCTGACCTGTGCTGATGGCCCCAGCCTGATCAAGACCGAGCTGGACCTGACCAAGTCTGCCCTGAGAGAACTGAGGACCGTGTCTGCCGATCAGCTGGCCAGAGAGGAACAGATCGAGCAGCCTAGACAGTCCGGATGTGGTGCTGGTGCTACAGCTGGCGTGGCCATTGCCAAGACCATCCGGCTGGAATCTGAAGTGACCGCCATCAAGAACGCCCTGAAAAAGACCAACGAGGCCGTGTCTACCCTCGGCAATGGCGTTAGAGTGCTGGCCACAGCCGTGCGCGAGCTGAAGGATTTCGTGTCCAAGAACCTGACCAGGGCCATCAACAAGAACAAGTGTGATATCGCCGACCTGAAGATGGCCGTGTCCTTCAGCCAGTTCAACCGGCGGTTCCTGAATGTCGTGCGGCAGTTCTCTGACAACGCCGGCATCACCCCTGCCATCAGCCTGGATCTGATGACCGATGCCGAGCTGGCTAGAGCCGTGTCCAACATGCCTACCTCTGCCGGCCAGATCAAGCTGATGCTGGAAAACAGAGCCATGGTCCGACGGAAAGGCTTCGGCTTTCTGATCGGCGTGTACGGCTCCTCCGTGATCTACATGGTGCAGCTGCCTATCTTCGGCGTGATCGACACCCCTTGCTGGATCGTGAAGGCCGCTCCTAGCTGCTCTGAGAAGAAGGGCAACTACGCCTGCCTGCTGAGAGAGGACCAAGGCTGGTACTGTCAGAACGCCGGCTCCACCGTGTACTACCCCAACGAGAAGGACTGCGAGACAAGAGGCGACCACGTGTTCTGCGATACCTGCGCTGGCATCAATGTGGCCGAGCAGTCCAAAGAGTGCAACATCAACATCTCCACCACCAACTATCCCTGCAAGGTGTCCACCGGCAGGCACCCTATTTCCATGGTGGCTCTGTCTCCACTGGGCGCCCTGGTGGCTTGTTATAAGGGCGTGTCCTGCTCCATCGGCTCCAACAGAGTGGGCATCATCAAGCAGCTGAACAAGGGCTGCAGCTACATCACCAACCAGGACGCCGATACCGTGACCATCGACAATACCGTGTATCAGCTGTCCAAGGTGGAAGGCGAGCAGCACGTGATCAAGGGCAGACCTGTGTCCTCCAGCTTCGACCCCGTGAAGTTCCCTGAGGATCAGTTCAACGTGGCCCTGGACCAGGTGTTCGAGTCCATCGAGAACTCTCAGGCTCTGGTGGACCAGTCCAACCGGATTCTGTCTGCCGGCTACATCCCCGAGGCTCCTAGAGATGGACAGGCCTACGTCAGAAAGGACGGCGAATGGGTGCTGCTGTCTACCTTTCTCGGAGGCCTGGTGCCTAGAGGCTCTCACCACCATCATCACCACTCCGCTTGGTCCCATCCACAGTTCGAGAAGTGA

서열 번호 21

L7F_A1_31 코딩 뉴클레오티드 서열, 코돈 최적화됨

ATGTCTTGGAAGGTGGTCATCATCTTCTCCCTGCTGATCACCCCTCAGCACGGCCTGAAAGAGTCCTACCTGGAAGAGAGCTGCTCCACCATCACCGAGGGCTACCTGTCTGTGCTGAGAACCGGCTGGTACACCAACGTGTTCATGCTGGAAGTGGGCGACGTGGAAAACCTGACCTGTGCTGATGGCCCCAGCCTGCTGAAAACAGAGCTGGACCTGACCAAGAGCGCCCTGAGAAATCTGAGGACCGTGTCTGCCGATCAGCTGGCCAGAGAGGAACAGATCGAGCAGCCTAGACAGTCCGGATGTGGTGCTGGTGCTACAGCTGGCGTGGCCATTGCCAAGACCATCCGGCTGGAATCTGAAGTGACCGCCATCAAGAATGCCCTGAAAAAGACCAACGAGGCCGTGTCTACCCTCGGCAATGGCGTTAGAGTGCTGGCCACAATGGTCCGAGAGCTGAAGGACTTCGTGTCCAAGAACCTGACCAGGGCCATCAACAAGAACAAGTGTGATATCGCCGACCTGAAGATGGCCGTGTCCTTTAGCCAGTTCAACCGGCGGTTCCTGAACGTCGTGCGGCAGTTCTCTGATAACGCCGGCATCACCCCTGCCATCAGCCTGGATCTGATGACCGATGCCGAGCTGGCTAGAGCCGTGTCCAACATGCCTACCTCTGCCGGCCAGATCAAGCTGATGCTCGAGAACAGAGCTATGGTCCGACGGAAAGGCTTCGGCATCCTGATCGGCGTGTACGGCTCCTCCGTGATCTACATGGTGCAGCTGCCTATCTTCGGCGTGATCGACACCCCTTGCTGGATCGTGAAGGCCGCTCCTAGCTGCTCTGAGAAGAAGGGCAACTACGCCTGCCTGCTGAGAGAGGACCAAGGCTGGTACTGTCAGAACGCCGGCTCCACCGTGTACTACCCCAACGAGAAGGACTGCGAGACAAGAGGCGACCACGTGTTCTGCGATACCTGCGCTGGCATCAATGTGGCCGAGCAGTCCAAAGAGTGCAACATCAACATCTCCACCACCAACTATCCCTGCAAGGTGTCCACCGGCAGGCACCCTATTTCCATGGTGGCTCTGTCTCCACTGGGCGCCCTGGTGGCTTGTTATAAGGGCGTGTCCTGCTCCATCGGCTCCAACAGAGTGGGCATCATCAAGCAGCTGAACAAGGGCTGCAGCTACATCACCAACCAGGACGCCGATACCGTGACCATCGACAATACCGTGTATCAGCTGTCCAAGGTGGAAGGCGAGCAGCACGTGATCAAGGGCAGACCTGTGTCCTCCAGCTTCGACCCCGTGAAGTTCCCTGAGGATCAGTTCAACGTGGCCCTGGACCAGGTGTTCGAGTCCATCGAGAACTCTCAGGCTCTGGTGGACCAGTCCAACCGGATTCTGTCTGCCGGCTACATCCCCGAGGCTCCTAGAGATGGACAGGCCTACGTCAGAAAGGACGGCGAATGGGTGCTGCTGTCTACCTTTCTCGGAGGCCTGGTGCCTAGAGGCTCTCACCACCATCATCACCACTCCGCTTGGTCCCATCCTCAGTTCGAGAAGTGA

서열 번호 22

L7F_A1_33 코딩 뉴클레오티드 서열, 코돈 최적화됨

ATGTCTTGGAAGGTGGTCATCATCTTCTCCCTGCTGATCACCCCTCAGCACGGCCTGAAAGAGTCCTACCTGGAAGAGAGCTGCTCCACCATCACCGAGGGCTACCTGTCTGTGCTGAGAACCGGCTGGTACACCAACGTGTTCATGCTGTGTGTGGGCGACGTGGAAAACCTGACCTGTGCTGATGGCCCCAGCCTGCTGAAAACAGAGCTGGACCTGACCAAGAGCGCCCTGAGAGAACTGAGGACCGTGTCTGCAGATCAGCTGGCCAGAGAGGAACAGATCGAGCAGCCTAGACAGTCCGGATGTGGTGCTGGTGCTACAGCTGGCGTGGCCATTGCCAAGACCATCCGGCTGGAATCTGAAGTGACCGCCATCAAGAATGCCCTGAAAAAGACCAACGAGGCCGTGTCTACCCTCGGCAATGGCGTTAGAGTGCTGGCCACAATGGTCCGAGAGCTGTGCGACTTCGTGTCCAAGAATCTGACCCGGGCCATCAACAAGAACAAGTGTGATATCGCCGACCTGAAGATGGCCGTGTCCTTCAGCCAGTTCAACCGGCGGTTCCTGAATGTCGTGCGGCAGTTCTCTGACAACGCCGGCATCACCCCTGCCATCAGCCTGGATCTGATGACCGATGCCGAGCTGGCTAGAGCCGTGTCCAACATGCCTACCTCTGCCGGCCAGATCAAGCTGATGCTCGAGAACAGAGCTATGGTCCGACGGAAAGGCTTCGGCTTCCTGATCGGCGTGTACGGCTCTGACGTGATCTACATGGTGCAGCTGCCTATCTTCGGCGTGATCGACACCCCTTGCTGGATCGTGAAGGCCGCTCCTAGCTGCTCTGAGAAGAAGGGCAACTACGCCTGCCTGCTGAGAGAGGACCAAGGCTGGTACTGTCAGAACGCCGGCTCCACCGTGTACTACCCCAACGAGAAGGACTGCGAGACAAGAGGCGACCACGTGTTCTGCGATACCTGCGCTGGCATCAATGTGGCCGAGCAGTCCAAAGAGTGCAACATCAACATCTCCACCACCAACTATCCCTGCAAGGTGTCCACCGGCAGACACCCCATTTCCATGGTGGCTCTGTCTCCACTGGGTGCCCTGGTGGCTTGTTATAAGGGCGTGTCCTGCTCCATCGGCTCCAACAGAGTGGGCATCATCAAGCAGCTGAACAAGGGCTGCAGCTACATCACCAACCAGGACGCCGATACCGTGACCATCGACAATACCGTGTATCAGCTGTCCAAGGTGGAAGGCGAGCAGCACGTGATCAAGGGCAGACCTGTGTCCTCCAGCTTCGACCCCGTGAAGTTCCCTGAGGATCAGTTCAACGTGGCCCTGGACCAGGTGTTCGAGTCCATCGAGAACTCTCAGGCTCTGGTGGACCAGTCCAACAGATGCTGTTCCGCCGGCTACATCCCCGAGGCTCCTAGAGATGGACAGGCCTACGTCAGAAAGGACGGCGAATGGGTGCTGCTGTCTACCTTTCTCGGAGGCCTGGTGCCTAGAGGCTCTCACCACCATCATCACCACTCCGCTTGGTCCCATCCACAGTTCGAGAAGTGA

서열 번호 23

L7F_A1_4.2 코딩 뉴클레오티드 서열, 코돈 최적화됨

ATGTCTTGGAAGGTGGTCATCATCTTCTCCCTGCTGATCACCCCTCAGCACGGCCTGAAAGAGTCCTACCTGGAAGAGAGCTGCTCCACCATCACCGAGGGCTACCTGTCTGTGCTGAGAACCGGCTGGTACACCAACGTGTTCATGCTGGAAGTGGGCGACGTGGAAAACCTGACCTGTGCTGATGGCCCCAGCCTGATCAAGACCGAGCTGGACCTGACCAAGTCTGCCCTGAGAGAACTGAGGACCGTGTCTGCCGATCAGCTGGCCAGAGAGGAACAGATCGAGCAGCCTAGACAGTCCGGATGTGGTGCTGGTGCTACAGCTGGCGTGGCCATTGCCAAGACCATCCGGCTGGAATCTGAAGTGACCGCCTGGAAGAACGCCCTGAAAAAGACCAACGAGGTGGTGTCTACCCTCGGCAACGGCGTCAGAGTGCTGGTCACAATGGTCCGAGAGCTGAAGGACTTCGTGTCCAAGAACCTGACCAGGGCTCTGAACAAGAACAAGTGTGATATCGCCGACCTGAAGATGGCCGTGTCTTTCAGCCAGTTCAACCGGCGGTTCCTGAACGTCGTGCGGCAGTTCTCTGATAACGCCGGCATCACCCCTGCCATCAGCCTGGATCTGATGACCGATGCCGAGCTGGCTAGAGCCGTGTCCAACATGCCTACCTCTGCCGGCCAGATCAAGCTGATGCTGGAAAACAGAGCCATGGTCCGACGGAAAGGCTTCGGCTTTCTGATCGGCGTGTACGGCTCCTCCGTGATCTACATGGTGCAGCTGCCTATCTTCGGCGTGATCGACACCCCTTGCTGGATCGTGAAGGCCGCTCCTAGCTGCTCTGAGAAGAAGGGCAACTACGCCTGCCTGCTGAGAGAGGACCAAGGCTGGTACTGTCAGAACGCCGGCTCCACCGTGTACTACCCCAACGAGAAGGACTGCGAGACAAGAGGCGACCACGTGTTCTGCGATACCTGCGCTGGCATCAATGTGGCCGAGCAGTCCAAAGAGTGCAACATCAACATCTCCACCACCAACTATCCCTGCAAGGTGTCCACCGGCAGGCACCCTATTTCCATGGTGGCTCTGTCTCCACTGGGCGCCCTGGTGGCTTGTTATAAGGGCGTGTCCTGCTCCATCGGCTCCAACAGAGTGGGCATCATCAAGCAGCTGAACAAGGGCTGCAGCTACATCACCAACCAGGACGCCGATACCGTGACCATCGACAATACCGTGTATCAGCTGTCCAAGGTGGAAGGCGAGCAGCACGTGATCAAGGGCAGACCTGTGTCCTCCAGCTTCGACCCCGTGAAGTTCCCTGAGGATCAGTTCAACGTGGCCCTGGACCAGGTGTTCGAGTCCATCGAGAACTCTCAGGCTCTGGTGGACCAGTCCAACCGGATCCTGTCCTCTGCCGAGTCTGCTATCGGCGGCTATATCCCCGAGGCTCCTAGAGATGGCCAGGCCTATGTTCGGAAGGATGGCGAATGGGTGCTGCTGTCTACCTTCCTCGGAGGCCTGGTGCCTAGAGGCTCTCACCACCATCATCACCACTCCGCTTGGTCCCATCCACAGTTCGAGAAGTGA

서열 번호 24

정제 태그를 갖지 않는 sF_A1_K_L7 성숙 단백질 서열

LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIEQPRQSGCGAGATAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLAFAVRELKDFVSKNLTRALNKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTCAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAESAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL

서열 번호 25

정제 태그를 갖지 않는 L7F_A1_23 성숙 단백질 서열

LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIEQPRQSGCGAGATAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTCAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSAGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL

서열 번호 26

정제 태그를 갖지 않는 L7F_A1_31 성숙 단백질 서열

LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFMLEVGDVENLTCADGPSLLKTELDLTKSALRNLRTVSADQLAREEQIEQPRQSGCGAGATAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLATMVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGILIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTCAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSAGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL

서열 번호 27

정제 태그를 갖지 않는 L7F_A1_33 성숙 단백질 서열

LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFMLCVGDVENLTCADGPSLLKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIEQPRQSGCGAGATAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLATMVRELCDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGFLIGVYGSDVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTCAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRCCSAGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL

서열 번호 28

정제 태그를 갖지 않는 L7F_A1_4.2 성숙 단백질 서열

LKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFMLEVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIEQPRQSGCGAGATAGVAIAKTIRLESEVTAWKNALKKTNEVVSTLGNGVRVLVTMVRELKDFVSKNLTRALNKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTCAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAESAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL

서열 번호 29

폴드온-gly-1

GYIPEAPRNGTAYVRKDGEWVLLSTFL

서열 번호 30

폴드온-glyc-2

GYIPEAPRDGQAYVRKNGTWVLLSTFL

서열 번호 31

폴드온-glyc-3

GYIPEAPRDGQAYVRKDGNWTLLSTFL

서열 번호 32

폴드온-glyc-4

GYIPEAPRNGTAYVRKNGTWVLLSTFL

서열 번호 33

폴드온-glyc-5

GYIPEAPRNGTAYVRKDGNWTLLSTFL

서열 번호 34

삼량체화 헬퍼 VSL 모티프

ILSA

서열 번호 35

삼량체화 헬퍼 VSA 모티프

CCSA

서열 번호 36

CCKQTNECCKNLERAVSA

서열 번호 37

CCRELKECCKNLENAVSA

서열 번호 38

CCRELKDCCKNLENAVSA

서열 번호 39

CCRELKDCCKNLERAVSA

서열 번호 40

CCRELKDCCKQLNKAVSA

서열 번호 41

CCRELKECCKQLNKAVSA

서열 번호 42

트롬빈 절단 부위

LVPRGS

서열 번호 43

TEV-절단 부위

ENLYFQG

서열 번호 44

Xa 인자 절단 부위

IEGR

서열 번호 45

CCKQTNECCKNLERAVS

서열 번호 46

CCKQTNECCKNLERAVS

서열 번호 47

CCKQTNECCKNLERAVS

서열 번호 48

CCRELKECCKNLENAVS

서열 번호 49

CCRELKECCKNLENAVS

서열 번호 50

CCRELKECCKNLENAVS

서열 번호 51

치환 A113C, A339C, T160F, I177L과 삼량체화 헬퍼 KLL을 갖는 sF_A1_K-E294 단백질 서열

MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVCTAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLAFAVRELKDFVSKNLTRALNKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTACGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAESAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK

서열 번호 52

sF_A1_K-E294 코딩 뉴클레오티드 서열, 코돈 최적화됨

ATGTCTTGGAAGGTGGTCATCATCTTCTCCCTGCTGATCACCCCTCAGCACGGCCTGAAAGAGTCCTACCTGGAAGAGAGCTGCTCCACCATCACCGAGGGCTACCTGTCTGTGCTGAGAACCGGCTGGTACACCAACGTGTTCACCCTGGAAGTGGGCGACGTGGAAAACCTGACCTGTGCTGATGGCCCCAGCCTGATCAAGACCGAGCTGGACCTGACCAAGTCTGCCCTGAGAGAACTGAGGACCGTGTCTGCCGATCAGCTGGCCAGAGAGGAACAGATCGAGAACCCTCGGCAGTCCAGATTCGTGCTGGGAGCTATTGCTCTGGGCGTGTGTACAGCCGCTGCTGTGACAGCTGGTGTCGCTATCGCCAAGACCATCCGGCTGGAATCTGAAGTGACCGCCATCAAGAACGCCCTGAAAAAGACCAACGAGGCCGTGTCCACACTCGGCAATGGCGTTAGAGTGCTGGCCTTTGCTGTGCGCGAGCTGAAGGACTTCGTGTCCAAGAACCTGACCAGGGCTCTGAACAAGAACAAGTGTGATATCGCCGACCTGAAGATGGCCGTGTCTTTCAGCCAGTTCAACCGGCGGTTCCTGAACGTCGTGCGGCAGTTCTCTGATAACGCCGGCATCACCCCTGCCATCAGCCTGGATCTGATGACCGATGCCGAGCTGGCTAGAGCCGTGTCTAACATGCCTACCTCTGCCGGCCAGATCAAGCTGATGCTGGAAAACAGAGCCATGGTCCGACGGAAAGGCTTCGGCTTTCTGATCGGCGTGTACGGCTCCTCCGTGATCTACATGGTGCAGCTGCCTATCTTCGGCGTGATCGACACCCCTTGCTGGATCGTGAAGGCCGCTCCTAGCTGCTCTGAGAAGAAGGGCAACTACGCCTGCCTGCTGAGAGAGGACCAAGGCTGGTACTGTCAGAACGCCGGCTCCACCGTGTACTACCCCAACGAGAAGGACTGCGAGACAAGAGGCGACCACGTGTTCTGCGATACCGCCTGTGGCATCAATGTGGCCGAGCAGTCCAAAGAGTGCAACATCAACATCTCCACCACCAACTATCCCTGCAAGGTGTCCACCGGCAGGCACCCTATTTCCATGGTGGCTCTGTCTCCACTGGGCGCCCTGGTGGCTTGTTATAAGGGCGTGTCCTGCTCCATCGGCTCCAACAGAGTGGGCATCATCAAGCAGCTGAACAAGGGCTGCAGCTACATCACCAACCAGGACGCCGATACCGTGACCATCGACAATACCGTGTATCAGCTGTCCAAGGTGGAAGGCGAGCAGCACGTGATCAAGGGCAGACCTGTGTCCTCCAGCTTCGACCCCGTGAAGTTCCCTGAGGATCAGTTCAACGTGGCCCTGGACCAGGTGTTCGAGTCCATCGAGAACTCTCAGGCTCTGGTGGACCAGTCCAACCGGATCCTGTCCTCTGCCGAGTCTGCTATCGGCGGCTATATCCCCGAGGCTCCTAGAGATGGCCAGGCCTATGTTCGGAAGGATGGCGAATGGGTGCTGCTGTCTACCTTCCTCGGAGGCCTGGTGCCTAGAGGCTCTCACCACCATCATCACCACTCCGCTTGGTCCCATCCACAGTTCGAGAAGTGA

서열 번호 53

위치 103 내지 111에서의 아미노산의 결실, 푸린 부위 KKRKRR에 의한 R102의 대체 및 치환 G294E를 갖는, 융합후 형태에서 안정화된 sF_A1_MFur 단백질 서열

MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQSKKRKRRVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAMVRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSEKKGNYACLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTSGRENLYFQGGGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRHHHHHH

서열 번호 54

sF_A1_MFur 코딩 뉴클레오티드 서열, 코돈 최적화됨

ATGTCCTGGAAGGTCGTGATCATCTTCTCCCTGCTGATCACCCCCCAGCACGGCCTGAAAGAGTCCTACCTGGAAGAGAGCTGCTCCACCATCACCGAGGGCTACCTGTCTGTGCTGCGGACCGGCTGGTACACCAACGTGTTCACCCTGGAAGTGGGCGACGTGGAAAACCTGACCTGCGCCGATGGCCCCAGCCTGATCAAGACCGAGCTGGACCTGACCAAGTCCGCCCTGCGGGAACTGAGAACCGTGTCTGCCGATCAGCTGGCCAGAGAGGAACAGATCGAGAACCCCCGGCAGTCCAAGAAACGGAAGCGGAGAGTGGCCACCGCCGCTGCTGTGACAGCTGGCGTGGCCATTGCCAAGACCATCCGGCTGGAATCCGAAGTGACCGCCATCAAGAACGCCCTGAAAAAGACCAACGAGGCCGTGTCTACCCTGGGCAATGGCGTGCGAGTGCTGGCTACAGCTGTGCGCGAGCTGAAGGACTTCGTGTCCAAGAACCTGACCCGGGCCATCAACAAGAACAAGTGTGATATCGCCGACCTGAAGATGGCCGTGTCCTTTAGCCAGTTCAACCGGCGGTTCCTGAACGTCGTGCGGCAGTTCTCTGACAACGCCGGCATCACCCCTGCCATCTCCCTGGATCTGATGACCGACGCCGAGCTGGCTAGAGCCGTGTCCAACATGCCTACCTCTGCCGGCCAGATCAAGCTGATGCTGGAAAACCGGGCCATGGTGCGACGGAAGGGCTTCGGCTTTCTGATCGGCGTGTACGGCTCCTCCGTGATCTACATGGTGCAGCTGCCTATCTTCGGCGTGATCGACACCCCCTGCTGGATCGTGAAGGCCGCTCCTAGCTGCTCCGAGAAGAAGGGCAACTACGCCTGCCTGCTGAGAGAGGACCAGGGCTGGTACTGTCAGAACGCCGGCTCCACCGTGTACTACCCCAACGAGAAGGACTGCGAGACACGGGGCGACCACGTGTTCTGTGATACCGCTGCTGGCATCAACGTGGCCGAGCAGTCCAAAGAGTGCAACATCAACATCTCCACCACCAACTACCCCTGCAAGGTGTCCACCGGCAGGCACCCCATCTCTATGGTGGCCCTGTCTCCTCTGGGCGCCCTGGTGGCTTGTTACAAGGGCGTGTCCTGCTCCATCGGCTCCAACAGAGTGGGCATCATCAAGCAGCTGAACAAGGGCTGCAGCTACATCACCAACCAGGACGCCGACACCGTGACCATCGACAATACCGTGTATCAGCTGTCCAAGGTGGAAGGCGAGCAGCACGTGATCAAGGGCAGACCCGTGTCCTCCAGCTTCGACCCCGTGAAGTTCCCCGAGGATCAGTTCAATGTGGCCCTGGACCAGGTGTTCGAGTCCATCGAGAACTCCCAGGCTCTGGTGGACCAGTCCAACCGGATCCTGTCCTCTGCCGAGAAGGGAAACACCTCCGGCAGAGAGAACCTGTATTTTCAAGGCGGCGGAGGCTCCGGCTACATCCCTGAGGCTCCTAGAGATGGCCAGGCCTACGTGCGGAAGGATGGCGAATGGGTGCTGCTGTCCACCTTCCTGGGCGGCATCGAGGGCAGACACCACCATCATCACCACTGA

SEQUENCE LISTING <110> Valneva SE <120> A SUBUNIT VACCINE FOR TREATMENT OR PREVENTION OF A RESPIRATORY TRACT INFECTION <130> WO2020234300 <140> PAT040/PCT <141> 2020-05-15 <150> EP/19175413.4 <151> 2019-05-20 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 539 <212> PRT <213> Human metapneumovirus <400> 1 Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu 85 90 95 Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala Lys Thr Ile 115 120 125 Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn Ala Leu Lys Lys Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala 165 170 175 Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly Phe Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gln 260 265 270 Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Val Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Ser Cys Ser Gly Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp 325 330 335 Thr Ala Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn Ile 340 345 350 Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365 Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile 385 390 395 400 Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp 405 410 415 Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430 Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro 435 440 445 Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg Ile 465 470 475 480 Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe Ile Ile Val Ile Ile 485 490 495 Leu Ile Ala Val Leu Gly Ser Thr Met Ile Leu Val Ser Val Phe Ile 500 505 510 Ile Ile Lys Lys Thr Lys Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser 515 520 525 Gly Val Thr Asn Asn Gly Phe Ile Pro His Asn 530 535 <210> 2 <211> 84 <212> PRT <213> Human metapneumovirus <400> 2 Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr Glu Gly 1 5 10 15 Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe Thr Leu 20 25 30 Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro Ser Leu 35 40 45 Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu Leu Arg 50 55 60 Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu Asn Pro 65 70 75 80 Arg Gln Ser Arg <210> 3 <211> 437 <212> PRT <213> Human metapneumovirus <400> 3 Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala Lys Thr Ile Arg Leu Glu Ser Glu Val 20 25 30 Thr Ala Ile Lys Asn Ala Leu Lys Lys Thr Asn Glu Ala Val Ser Thr 35 40 45 Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr Ala Val Arg Glu Leu Lys 50 55 60 Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala Ile Asn Lys Asn Lys Cys 65 70 75 80 Asp Ile Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser Phe Ser Gln Phe Asn Arg 85 90 95 Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser Asp Asn Ala Gly Ile Thr 100 105 110 Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp Ala Glu Leu Ala Arg Ala 115 120 125 Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln Ile Lys Leu Met Leu Glu 130 135 140 Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe Gly Phe Leu Ile Gly Val 145 150 155 160 Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gln Leu Pro Ile Phe Gly Val 165 170 175 Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Val Lys Ala Ala Pro Ser Cys Ser Gly 180 185 190 Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln Gly Trp Tyr 195 200 205 Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu Lys Asp Cys 210 215 220 Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala Gly Ile Asn 225 230 235 240 Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn Ile Asn Ile Ser Thr Thr Asn 245 250 255 Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro Ile Ser Met Val Ala 260 265 270 Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly Val Ser Cys 275 280 285 Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile Lys Gln Leu Asn Lys Gly 290 295 300 Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp Thr Val Thr Ile Asp Asn 305 310 315 320 Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly Glu Gln His Val Ile Lys 325 330 335 Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro Val Lys Phe Pro Glu Asp 340 345 350 Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe Glu Ser Ile Glu Asn Ser 355 360 365 Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg Ile Leu Ser Ser Ala Glu Lys 370 375 380 Gly Asn Thr Gly Phe Ile Ile Val Ile Ile Leu Ile Ala Val Leu Gly 385 390 395 400 Ser Thr Met Ile Leu Val Ser Val Phe Ile Ile Ile Lys Lys Thr Lys 405 410 415 Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser Gly Val Thr Asn Asn Gly 420 425 430 Phe Ile Pro His Asn 435 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial <400> 4 Cys Gly Ala Gly Ala 1 5 <210> 5 <211> 523 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 5 Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu 85 90 95 Gln Pro Arg Gln Ser Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly Val Ala 100 105 110 Ile Ala Lys Thr Ile Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn 115 120 125 Ala Leu Lys Lys Thr Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val 130 135 140 Arg Val Leu Ala Thr Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys 145 150 155 160 Asn Leu Thr Arg Ala Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu 165 170 175 Lys Met Ala Val Ser Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val 180 185 190 Val Arg Gln Phe Ser Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu 195 200 205 Asp Leu Met Thr Asp Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro 210 215 220 Thr Ser Ala Gly Gln Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val 225 230 235 240 Arg Arg Lys Gly Phe Gly Phe Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val 245 250 255 Ile Tyr Met Val Gln Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys 260 265 270 Trp Ile Val Lys Ala Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr 275 280 285 Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly 290 295 300 Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp 305 310 315 320 His Val Phe Cys Asp Thr Cys Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser 325 330 335 Lys Glu Cys Asn Ile Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val 340 345 350 Ser Thr Gly Arg His Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly 355 360 365 Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn 370 375 380 Arg Val Gly Ile Ile Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr 385 390 395 400 Asn Gln Asp Ala Asp Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu 405 410 415 Ser Lys Val Glu Gly Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser 420 425 430 Ser Ser Phe Asp Pro Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala 435 440 445 Leu Asp Gln Val Phe Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp 450 455 460 Gln Ser Asn Arg Ile Leu Ser Ala Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg 465 470 475 480 Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser 485 490 495 Thr Phe Leu Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His His His His His 500 505 510 His Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 515 520 <210> 6 <211> 529 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 6 Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu 85 90 95 Gln Pro Arg Gln Ser Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly Val Ala 100 105 110 Ile Ala Lys Thr Ile Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn 115 120 125 Ala Leu Lys Lys Thr Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val 130 135 140 Arg Val Leu Ala Phe Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys 145 150 155 160 Asn Leu Thr Arg Ala Leu Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu 165 170 175 Lys Met Ala Val Ser Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val 180 185 190 Val Arg Gln Phe Ser Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu 195 200 205 Asp Leu Met Thr Asp Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro 210 215 220 Thr Ser Ala Gly Gln Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val 225 230 235 240 Arg Arg Lys Gly Phe Gly Phe Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val 245 250 255 Ile Tyr Met Val Gln Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys 260 265 270 Trp Ile Val Lys Ala Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr 275 280 285 Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly 290 295 300 Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp 305 310 315 320 His Val Phe Cys Asp Thr Cys Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser 325 330 335 Lys Glu Cys Asn Ile Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val 340 345 350 Ser Thr Gly Arg His Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly 355 360 365 Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn 370 375 380 Arg Val Gly Ile Ile Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr 385 390 395 400 Asn Gln Asp Ala Asp Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu 405 410 415 Ser Lys Val Glu Gly Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser 420 425 430 Ser Ser Phe Asp Pro Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala 435 440 445 Leu Asp Gln Val Phe Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp 450 455 460 Gln Ser Asn Arg Ile Leu Ser Ser Ala Glu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr 465 470 475 480 Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly 485 490 495 Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly 500 505 510 Ser His His His His His His Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu 515 520 525 Lys <210> 7 <211> 523 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 7 Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Met Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu Leu Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Asn 65 70 75 80 Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu 85 90 95 Gln Pro Arg Gln Ser Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly Val Ala 100 105 110 Ile Ala Lys Thr Ile Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn 115 120 125 Ala Leu Lys Lys Thr Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val 130 135 140 Arg Val Leu Ala Thr Met Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys 145 150 155 160 Asn Leu Thr Arg Ala Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu 165 170 175 Lys Met Ala Val Ser Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val 180 185 190 Val Arg Gln Phe Ser Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu 195 200 205 Asp Leu Met Thr Asp Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro 210 215 220 Thr Ser Ala Gly Gln Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val 225 230 235 240 Arg Arg Lys Gly Phe Gly Ile Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val 245 250 255 Ile Tyr Met Val Gln Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys 260 265 270 Trp Ile Val Lys Ala Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr 275 280 285 Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly 290 295 300 Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp 305 310 315 320 His Val Phe Cys Asp Thr Cys Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser 325 330 335 Lys Glu Cys Asn Ile Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val 340 345 350 Ser Thr Gly Arg His Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly 355 360 365 Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn 370 375 380 Arg Val Gly Ile Ile Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr 385 390 395 400 Asn Gln Asp Ala Asp Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu 405 410 415 Ser Lys Val Glu Gly Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser 420 425 430 Ser Ser Phe Asp Pro Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala 435 440 445 Leu Asp Gln Val Phe Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp 450 455 460 Gln Ser Asn Arg Ile Leu Ser Ala Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg 465 470 475 480 Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser 485 490 495 Thr Phe Leu Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His His His His His 500 505 510 His Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 515 520 <210> 8 <211> 523 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 8 Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Met Leu Cys Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu Leu Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu 85 90 95 Gln Pro Arg Gln Ser Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly Val Ala 100 105 110 Ile Ala Lys Thr Ile Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn 115 120 125 Ala Leu Lys Lys Thr Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val 130 135 140 Arg Val Leu Ala Thr Met Val Arg Glu Leu Cys Asp Phe Val Ser Lys 145 150 155 160 Asn Leu Thr Arg Ala Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu 165 170 175 Lys Met Ala Val Ser Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val 180 185 190 Val Arg Gln Phe Ser Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu 195 200 205 Asp Leu Met Thr Asp Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro 210 215 220 Thr Ser Ala Gly Gln Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val 225 230 235 240 Arg Arg Lys Gly Phe Gly Phe Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Asp Val 245 250 255 Ile Tyr Met Val Gln Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys 260 265 270 Trp Ile Val Lys Ala Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr 275 280 285 Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly 290 295 300 Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp 305 310 315 320 His Val Phe Cys Asp Thr Cys Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser 325 330 335 Lys Glu Cys Asn Ile Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val 340 345 350 Ser Thr Gly Arg His Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly 355 360 365 Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn 370 375 380 Arg Val Gly Ile Ile Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr 385 390 395 400 Asn Gln Asp Ala Asp Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu 405 410 415 Ser Lys Val Glu Gly Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser 420 425 430 Ser Ser Phe Asp Pro Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala 435 440 445 Leu Asp Gln Val Phe Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp 450 455 460 Gln Ser Asn Arg Cys Cys Ser Ala Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg 465 470 475 480 Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser 485 490 495 Thr Phe Leu Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His His His His His 500 505 510 His Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 515 520 <210> 9 <211> 529 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 9 Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Met Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu 85 90 95 Gln Pro Arg Gln Ser Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly Val Ala 100 105 110 Ile Ala Lys Thr Ile Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Trp Lys Asn 115 120 125 Ala Leu Lys Lys Thr Asn Glu Val Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val 130 135 140 Arg Val Leu Val Thr Met Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys 145 150 155 160 Asn Leu Thr Arg Ala Leu Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu 165 170 175 Lys Met Ala Val Ser Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val 180 185 190 Val Arg Gln Phe Ser Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu 195 200 205 Asp Leu Met Thr Asp Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro 210 215 220 Thr Ser Ala Gly Gln Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val 225 230 235 240 Arg Arg Lys Gly Phe Gly Phe Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val 245 250 255 Ile Tyr Met Val Gln Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys 260 265 270 Trp Ile Val Lys Ala Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr 275 280 285 Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly 290 295 300 Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp 305 310 315 320 His Val Phe Cys Asp Thr Cys Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser 325 330 335 Lys Glu Cys Asn Ile Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val 340 345 350 Ser Thr Gly Arg His Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly 355 360 365 Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn 370 375 380 Arg Val Gly Ile Ile Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr 385 390 395 400 Asn Gln Asp Ala Asp Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu 405 410 415 Ser Lys Val Glu Gly Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser 420 425 430 Ser Ser Phe Asp Pro Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala 435 440 445 Leu Asp Gln Val Phe Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp 450 455 460 Gln Ser Asn Arg Ile Leu Ser Ser Ala Glu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr 465 470 475 480 Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly 485 490 495 Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly 500 505 510 Ser His His His His His His Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu 515 520 525 Lys <210> 10 <211> 27 <212> PRT <213> T4 bacteriophage <400> 10 Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys 1 5 10 15 Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 20 25 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificiial <400> 11 Gly Ser His His His His His His 1 5 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 12 Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 10 <210> 13 <211> 539 <212> PRT <213> Human metapneumovirus <400> 13 Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ser Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu 85 90 95 Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala Lys Thr Ile 115 120 125 Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn Ala Leu Lys Thr Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala 165 170 175 Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Asp Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly Ile Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Thr Val Gln 260 265 270 Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Val Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp 325 330 335 Thr Ala Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn Ile 340 345 350 Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365 Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile 385 390 395 400 Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp 405 410 415 Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430 Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro 435 440 445 Ile Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Asn Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg Ile 465 470 475 480 Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe Ile Ile Val Ile Ile 485 490 495 Leu Ile Ala Val Leu Gly Ser Ser Met Ile Leu Val Ser Ile Phe Ile 500 505 510 Ile Ile Lys Lys Thr Lys Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser 515 520 525 Gly Val Thr Asn Asn Gly Phe Ile Pro His Ser 530 535 <210> 14 <211> 539 <212> PRT <213> Human metapneumovirus <400> 14 Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ser Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu 85 90 95 Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala Lys Thr Ile 115 120 125 Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn Ala Leu Lys Thr Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala 165 170 175 Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Asp Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly Ile Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gln 260 265 270 Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Val Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Ser Cys Ser Gly Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp 325 330 335 Thr Ala Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn Ile 340 345 350 Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365 Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile 385 390 395 400 Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp 405 410 415 Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430 Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro 435 440 445 Ile Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Asn Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg Ile 465 470 475 480 Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe Ile Ile Val Ile Ile 485 490 495 Leu Ile Ala Val Leu Gly Ser Ser Met Ile Leu Val Ser Ile Phe Ile 500 505 510 Ile Ile Lys Lys Thr Lys Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser 515 520 525 Gly Val Thr Asn Asn Gly Phe Ile Pro His Ser 530 535 <210> 15 <211> 539 <212> PRT <213> Human metapneumovirus <400> 15 Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Ser Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Lys Pro Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu 85 90 95 Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala Lys Thr Ile 115 120 125 Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn Ala Leu Lys Lys Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala 165 170 175 Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Asp Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ala Ala Gly Gln 225 230 235 240 Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly Ile Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gln 260 265 270 Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Val Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp 325 330 335 Thr Ala Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn Ile 340 345 350 Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365 Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile 385 390 395 400 Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp 405 410 415 Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430 Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro 435 440 445 Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Asn Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg Ile 465 470 475 480 Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe Ile Ile Val Ile Ile 485 490 495 Leu Ile Ala Val Leu Gly Ser Ser Met Ile Leu Val Ser Val Phe Ile 500 505 510 Ile Ile Lys Lys Thr Arg Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser 515 520 525 Gly Val Thr Asn Asn Gly Phe Ile Pro His Ser 530 535 <210> 16 <211> 539 <212> PRT <213> Human metapneumovirus <400> 16 Met Ser Trp Lys Val Met Ile Ile Ile Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Thr Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu 85 90 95 Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Ile Ala Ile Ala Lys Thr Ile 115 120 125 Arg Leu Glu Ser Glu Val Asn Ala Ile Lys Gly Ala Leu Lys Gln Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Arg Glu Leu Lys Glu Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Ser Ala 165 170 175 Ile Asn Arg Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Tyr Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly Ile Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gln 260 265 270 Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Ile Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp 325 330 335 Thr Ala Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn Ile 340 345 350 Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365 Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Trp Val Gly Ile Ile 385 390 395 400 Lys Gln Leu Pro Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp 405 410 415 Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430 Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro 435 440 445 Ile Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Lys Ile 465 470 475 480 Leu Asn Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe Ile Ile Val Val Ile 485 490 495 Leu Val Ala Val Leu Gly Leu Thr Met Ile Ser Val Ser Ile Ile Ile 500 505 510 Ile Ile Lys Lys Thr Arg Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Asn 515 520 525 Gly Val Thr Asn Gly Gly Phe Ile Pro His Ser 530 535 <210> 17 <211> 539 <212> PRT <213> Human metapneumovirus <400> 17 Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu 85 90 95 Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala Lys Thr Ile 115 120 125 Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn Ala Leu Lys Lys Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala 165 170 175 Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly Phe Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gln 260 265 270 Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Val Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Ser Cys Ser Gly Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp 325 330 335 Thr Ala Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn Ile 340 345 350 Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365 Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile 385 390 395 400 Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp 405 410 415 Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430 Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro 435 440 445 Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg Ile 465 470 475 480 Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe Ile Ile Val Ile Ile 485 490 495 Leu Ile Ala Val Leu Gly Ser Thr Met Ile Leu Val Ser Val Phe Ile 500 505 510 Ile Ile Lys Lys Thr Lys Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser 515 520 525 Gly Val Thr Asn Asn Gly Phe Ile Pro His Asn 530 535 <210> 18 <211> 539 <212> PRT <213> Human metapneumovirus <400> 18 Met Ser Trp Lys Val Met Ile Ile Ile Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Thr Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu 85 90 95 Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Ile Ala Ile Ala Lys Thr Ile 115 120 125 Arg Leu Glu Ser Glu Val Asn Ala Ile Lys Gly Ala Leu Lys Thr Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Arg Glu Leu Lys Glu Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Ser Ala 165 170 175 Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Tyr Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly Ile Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gln 260 265 270 Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Ile Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Lys Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp 325 330 335 Thr Ala Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Arg Glu Cys Asn Ile 340 345 350 Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365 Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile 385 390 395 400 Lys Gln Leu Pro Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp 405 410 415 Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430 Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro 435 440 445 Ile Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Lys Ile 465 470 475 480 Leu Asn Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe Ile Ile Val Ile Ile 485 490 495 Leu Ile Ala Val Leu Gly Leu Thr Met Ile Ser Val Ser Ile Ile Ile 500 505 510 Ile Ile Lys Lys Thr Arg Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Asn 515 520 525 Gly Val Thr Asn Gly Gly Phe Ile Pro His Ser 530 535 <210> 19 <211> 1590 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 19 atgtcttgga aggtggtcat catcttctcc ctgctgatca cccctcagca cggcctgaaa 60 gagtcctacc tggaagagag ctgctccacc atcaccgagg gctacctgtc tgtgctgaga 120 accggctggt acaccaacgt gttcaccctg gaagtgggcg acgtggaaaa cctgacctgt 180 gctgatggcc ccagcctgat caagaccgag ctggacctga ccaagtctgc cctgagagaa 240 ctgaggaccg tgtctgccga tcagctggcc agagaggaac agatcgagca gcctagacag 300 tccggatgtg gtgctggtgc tacagctggc gtggccattg ccaagaccat ccggctggaa 360 tctgaagtga ccgccatcaa gaacgccctg aaaaagacca acgaggccgt gtctaccctc 420 ggcaatggcg ttagagtgct ggcctttgct gtgcgcgagc tgaaggactt cgtgtccaag 480 aacctgacca gggctctgaa caagaacaag tgtgatatcg ccgacctgaa gatggccgtg 540 tcctttagcc agttcaaccg gcggttcctg aacgtcgtgc ggcagttctc tgataacgcc 600 ggcatcaccc ctgccatcag cctggatctg atgaccgatg ccgagctggc tagagccgtg 660 tccaacatgc ctacctctgc cggccagatc aagctgatgc tggaaaacag agccatggtc 720 cgacggaaag gcttcggctt tctgatcggc gtgtacggct cctccgtgat ctacatggtg 780 cagctgccta tcttcggcgt gatcgacacc ccttgctgga tcgtgaaggc cgctcctagc 840 tgctctgaga agaagggcaa ctacgcctgc ctgctgagag aggaccaagg ctggtactgt 900 cagaacgccg gctccaccgt gtactacccc aacgagaagg actgcgagac aagaggcgac 960 cacgtgttct gcgatacctg cgctggcatc aatgtggccg agcagtccaa agagtgcaac 1020 atcaacatct ccaccaccaa ctatccctgc aaggtgtcca ccggcaggca ccctatttcc 1080 atggtggctc tgtctccact gggcgccctg gtggcttgtt ataagggcgt gtcctgctcc 1140 atcggctcca acagagtggg catcatcaag cagctgaaca agggctgcag ctacatcacc 1200 aaccaggacg ccgataccgt gaccatcgac aataccgtgt atcagctgtc caaggtggaa 1260 ggcgagcagc acgtgatcaa gggcagacct gtgtcctcca gcttcgaccc cgtgaagttc 1320 cctgaggatc agttcaacgt ggccctggac caggtgttcg agtccatcga gaactctcag 1380 gctctggtgg accagtccaa ccggatcctg tcctctgccg agtctgctat cggcggctat 1440 atccccgagg ctcctagaga tggccaggcc tatgttcgga aggatggcga atgggtgctg 1500 ctgtctacct tcctcggagg cctggtgcct agaggctctc accaccatca tcaccactcc 1560 gcttggtccc atccacagtt cgagaagtga 1590 <210> 20 <211> 1572 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 20 atgtcttgga aggtggtcat catcttctcc ctgctgatca cccctcagca cggcctgaaa 60 gagtcctacc tggaagagag ctgctccacc atcaccgagg gctacctgtc tgtgctgaga 120 accggctggt acaccaacgt gttcaccctg gaagtgggcg acgtggaaaa cctgacctgt 180 gctgatggcc ccagcctgat caagaccgag ctggacctga ccaagtctgc cctgagagaa 240 ctgaggaccg tgtctgccga tcagctggcc agagaggaac agatcgagca gcctagacag 300 tccggatgtg gtgctggtgc tacagctggc gtggccattg ccaagaccat ccggctggaa 360 tctgaagtga ccgccatcaa gaacgccctg aaaaagacca acgaggccgt gtctaccctc 420 ggcaatggcg ttagagtgct ggccacagcc gtgcgcgagc tgaaggattt cgtgtccaag 480 aacctgacca gggccatcaa caagaacaag tgtgatatcg ccgacctgaa gatggccgtg 540 tccttcagcc agttcaaccg gcggttcctg aatgtcgtgc ggcagttctc tgacaacgcc 600 ggcatcaccc ctgccatcag cctggatctg atgaccgatg ccgagctggc tagagccgtg 660 tccaacatgc ctacctctgc cggccagatc aagctgatgc tggaaaacag agccatggtc 720 cgacggaaag gcttcggctt tctgatcggc gtgtacggct cctccgtgat ctacatggtg 780 cagctgccta tcttcggcgt gatcgacacc ccttgctgga tcgtgaaggc cgctcctagc 840 tgctctgaga agaagggcaa ctacgcctgc ctgctgagag aggaccaagg ctggtactgt 900 cagaacgccg gctccaccgt gtactacccc aacgagaagg actgcgagac aagaggcgac 960 cacgtgttct gcgatacctg cgctggcatc aatgtggccg agcagtccaa agagtgcaac 1020 atcaacatct ccaccaccaa ctatccctgc aaggtgtcca ccggcaggca ccctatttcc 1080 atggtggctc tgtctccact gggcgccctg gtggcttgtt ataagggcgt gtcctgctcc 1140 atcggctcca acagagtggg catcatcaag cagctgaaca agggctgcag ctacatcacc 1200 aaccaggacg ccgataccgt gaccatcgac aataccgtgt atcagctgtc caaggtggaa 1260 ggcgagcagc acgtgatcaa gggcagacct gtgtcctcca gcttcgaccc cgtgaagttc 1320 cctgaggatc agttcaacgt ggccctggac caggtgttcg agtccatcga gaactctcag 1380 gctctggtgg accagtccaa ccggattctg tctgccggct acatccccga ggctcctaga 1440 gatggacagg cctacgtcag aaaggacggc gaatgggtgc tgctgtctac ctttctcgga 1500 ggcctggtgc ctagaggctc tcaccaccat catcaccact ccgcttggtc ccatccacag 1560 ttcgagaagt ga 1572 <210> 21 <211> 1572 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 21 atgtcttgga aggtggtcat catcttctcc ctgctgatca cccctcagca cggcctgaaa 60 gagtcctacc tggaagagag ctgctccacc atcaccgagg gctacctgtc tgtgctgaga 120 accggctggt acaccaacgt gttcatgctg gaagtgggcg acgtggaaaa cctgacctgt 180 gctgatggcc ccagcctgct gaaaacagag ctggacctga ccaagagcgc cctgagaaat 240 ctgaggaccg tgtctgccga tcagctggcc agagaggaac agatcgagca gcctagacag 300 tccggatgtg gtgctggtgc tacagctggc gtggccattg ccaagaccat ccggctggaa 360 tctgaagtga ccgccatcaa gaatgccctg aaaaagacca acgaggccgt gtctaccctc 420 ggcaatggcg ttagagtgct ggccacaatg gtccgagagc tgaaggactt cgtgtccaag 480 aacctgacca gggccatcaa caagaacaag tgtgatatcg ccgacctgaa gatggccgtg 540 tcctttagcc agttcaaccg gcggttcctg aacgtcgtgc ggcagttctc tgataacgcc 600 ggcatcaccc ctgccatcag cctggatctg atgaccgatg ccgagctggc tagagccgtg 660 tccaacatgc ctacctctgc cggccagatc aagctgatgc tcgagaacag agctatggtc 720 cgacggaaag gcttcggcat cctgatcggc gtgtacggct cctccgtgat ctacatggtg 780 cagctgccta tcttcggcgt gatcgacacc ccttgctgga tcgtgaaggc cgctcctagc 840 tgctctgaga agaagggcaa ctacgcctgc ctgctgagag aggaccaagg ctggtactgt 900 cagaacgccg gctccaccgt gtactacccc aacgagaagg actgcgagac aagaggcgac 960 cacgtgttct gcgatacctg cgctggcatc aatgtggccg agcagtccaa agagtgcaac 1020 atcaacatct ccaccaccaa ctatccctgc aaggtgtcca ccggcaggca ccctatttcc 1080 atggtggctc tgtctccact gggcgccctg gtggcttgtt ataagggcgt gtcctgctcc 1140 atcggctcca acagagtggg catcatcaag cagctgaaca agggctgcag ctacatcacc 1200 aaccaggacg ccgataccgt gaccatcgac aataccgtgt atcagctgtc caaggtggaa 1260 ggcgagcagc acgtgatcaa gggcagacct gtgtcctcca gcttcgaccc cgtgaagttc 1320 cctgaggatc agttcaacgt ggccctggac caggtgttcg agtccatcga gaactctcag 1380 gctctggtgg accagtccaa ccggattctg tctgccggct acatccccga ggctcctaga 1440 gatggacagg cctacgtcag aaaggacggc gaatgggtgc tgctgtctac ctttctcgga 1500 ggcctggtgc ctagaggctc tcaccaccat catcaccact ccgcttggtc ccatcctcag 1560 ttcgagaagt ga 1572 <210> 22 <211> 1572 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 22 atgtcttgga aggtggtcat catcttctcc ctgctgatca cccctcagca cggcctgaaa 60 gagtcctacc tggaagagag ctgctccacc atcaccgagg gctacctgtc tgtgctgaga 120 accggctggt acaccaacgt gttcatgctg tgtgtgggcg acgtggaaaa cctgacctgt 180 gctgatggcc ccagcctgct gaaaacagag ctggacctga ccaagagcgc cctgagagaa 240 ctgaggaccg tgtctgcaga tcagctggcc agagaggaac agatcgagca gcctagacag 300 tccggatgtg gtgctggtgc tacagctggc gtggccattg ccaagaccat ccggctggaa 360 tctgaagtga ccgccatcaa gaatgccctg aaaaagacca acgaggccgt gtctaccctc 420 ggcaatggcg ttagagtgct ggccacaatg gtccgagagc tgtgcgactt cgtgtccaag 480 aatctgaccc gggccatcaa caagaacaag tgtgatatcg ccgacctgaa gatggccgtg 540 tccttcagcc agttcaaccg gcggttcctg aatgtcgtgc ggcagttctc tgacaacgcc 600 ggcatcaccc ctgccatcag cctggatctg atgaccgatg ccgagctggc tagagccgtg 660 tccaacatgc ctacctctgc cggccagatc aagctgatgc tcgagaacag agctatggtc 720 cgacggaaag gcttcggctt cctgatcggc gtgtacggct ctgacgtgat ctacatggtg 780 cagctgccta tcttcggcgt gatcgacacc ccttgctgga tcgtgaaggc cgctcctagc 840 tgctctgaga agaagggcaa ctacgcctgc ctgctgagag aggaccaagg ctggtactgt 900 cagaacgccg gctccaccgt gtactacccc aacgagaagg actgcgagac aagaggcgac 960 cacgtgttct gcgatacctg cgctggcatc aatgtggccg agcagtccaa agagtgcaac 1020 atcaacatct ccaccaccaa ctatccctgc aaggtgtcca ccggcagaca ccccatttcc 1080 atggtggctc tgtctccact gggtgccctg gtggcttgtt ataagggcgt gtcctgctcc 1140 atcggctcca acagagtggg catcatcaag cagctgaaca agggctgcag ctacatcacc 1200 aaccaggacg ccgataccgt gaccatcgac aataccgtgt atcagctgtc caaggtggaa 1260 ggcgagcagc acgtgatcaa gggcagacct gtgtcctcca gcttcgaccc cgtgaagttc 1320 cctgaggatc agttcaacgt ggccctggac caggtgttcg agtccatcga gaactctcag 1380 gctctggtgg accagtccaa cagatgctgt tccgccggct acatccccga ggctcctaga 1440 gatggacagg cctacgtcag aaaggacggc gaatgggtgc tgctgtctac ctttctcgga 1500 ggcctggtgc ctagaggctc tcaccaccat catcaccact ccgcttggtc ccatccacag 1560 ttcgagaagt ga 1572 <210> 23 <211> 1590 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 23 atgtcttgga aggtggtcat catcttctcc ctgctgatca cccctcagca cggcctgaaa 60 gagtcctacc tggaagagag ctgctccacc atcaccgagg gctacctgtc tgtgctgaga 120 accggctggt acaccaacgt gttcatgctg gaagtgggcg acgtggaaaa cctgacctgt 180 gctgatggcc ccagcctgat caagaccgag ctggacctga ccaagtctgc cctgagagaa 240 ctgaggaccg tgtctgccga tcagctggcc agagaggaac agatcgagca gcctagacag 300 tccggatgtg gtgctggtgc tacagctggc gtggccattg ccaagaccat ccggctggaa 360 tctgaagtga ccgcctggaa gaacgccctg aaaaagacca acgaggtggt gtctaccctc 420 ggcaacggcg tcagagtgct ggtcacaatg gtccgagagc tgaaggactt cgtgtccaag 480 aacctgacca gggctctgaa caagaacaag tgtgatatcg ccgacctgaa gatggccgtg 540 tctttcagcc agttcaaccg gcggttcctg aacgtcgtgc ggcagttctc tgataacgcc 600 ggcatcaccc ctgccatcag cctggatctg atgaccgatg ccgagctggc tagagccgtg 660 tccaacatgc ctacctctgc cggccagatc aagctgatgc tggaaaacag agccatggtc 720 cgacggaaag gcttcggctt tctgatcggc gtgtacggct cctccgtgat ctacatggtg 780 cagctgccta tcttcggcgt gatcgacacc ccttgctgga tcgtgaaggc cgctcctagc 840 tgctctgaga agaagggcaa ctacgcctgc ctgctgagag aggaccaagg ctggtactgt 900 cagaacgccg gctccaccgt gtactacccc aacgagaagg actgcgagac aagaggcgac 960 cacgtgttct gcgatacctg cgctggcatc aatgtggccg agcagtccaa agagtgcaac 1020 atcaacatct ccaccaccaa ctatccctgc aaggtgtcca ccggcaggca ccctatttcc 1080 atggtggctc tgtctccact gggcgccctg gtggcttgtt ataagggcgt gtcctgctcc 1140 atcggctcca acagagtggg catcatcaag cagctgaaca agggctgcag ctacatcacc 1200 aaccaggacg ccgataccgt gaccatcgac aataccgtgt atcagctgtc caaggtggaa 1260 ggcgagcagc acgtgatcaa gggcagacct gtgtcctcca gcttcgaccc cgtgaagttc 1320 cctgaggatc agttcaacgt ggccctggac caggtgttcg agtccatcga gaactctcag 1380 gctctggtgg accagtccaa ccggatcctg tcctctgccg agtctgctat cggcggctat 1440 atccccgagg ctcctagaga tggccaggcc tatgttcgga aggatggcga atgggtgctg 1500 ctgtctacct tcctcggagg cctggtgcct agaggctctc accaccatca tcaccactcc 1560 gcttggtccc atccacagtt cgagaagtga 1590 <210> 24 <211> 487 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Artificial <400> 24 Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr Glu Gly 1 5 10 15 Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe Thr Leu 20 25 30 Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro Ser Leu 35 40 45 Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu Leu Arg 50 55 60 Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu Gln Pro 65 70 75 80 Arg Gln Ser Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala 85 90 95 Lys Thr Ile Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn Ala Leu 100 105 110 Lys Lys Thr Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val 115 120 125 Leu Ala Phe Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu 130 135 140 Thr Arg Ala Leu Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu Lys Met 145 150 155 160 Ala Val Ser Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg 165 170 175 Gln Phe Ser Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu 180 185 190 Met Thr Asp Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser 195 200 205 Ala Gly Gln Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg 210 215 220 Lys Gly Phe Gly Phe Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr 225 230 235 240 Met Val Gln Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile 245 250 255 Val Lys Ala Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys 260 265 270 Leu Leu Arg Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr 275 280 285 Val Tyr Tyr Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val 290 295 300 Phe Cys Asp Thr Cys Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu 305 310 315 320 Cys Asn Ile Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr 325 330 335 Gly Arg His Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu 340 345 350 Val Ala Cys Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val 355 360 365 Gly Ile Ile Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln 370 375 380 Asp Ala Asp Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys 385 390 395 400 Val Glu Gly Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser 405 410 415 Phe Asp Pro Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp 420 425 430 Gln Val Phe Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser 435 440 445 Asn Arg Ile Leu Ser Ser Ala Glu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr Ile Pro 450 455 460 Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp 465 470 475 480 Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 485 <210> 25 <211> 481 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 25 Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr Glu Gly 1 5 10 15 Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe Thr Leu 20 25 30 Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro Ser Leu 35 40 45 Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu Leu Arg 50 55 60 Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu Gln Pro 65 70 75 80 Arg Gln Ser Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala 85 90 95 Lys Thr Ile Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn Ala Leu 100 105 110 Lys Lys Thr Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val 115 120 125 Leu Ala Thr Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu 130 135 140 Thr Arg Ala Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu Lys Met 145 150 155 160 Ala Val Ser Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg 165 170 175 Gln Phe Ser Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu 180 185 190 Met Thr Asp Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser 195 200 205 Ala Gly Gln Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg 210 215 220 Lys Gly Phe Gly Phe Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr 225 230 235 240 Met Val Gln Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile 245 250 255 Val Lys Ala Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys 260 265 270 Leu Leu Arg Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr 275 280 285 Val Tyr Tyr Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val 290 295 300 Phe Cys Asp Thr Cys Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu 305 310 315 320 Cys Asn Ile Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr 325 330 335 Gly Arg His Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu 340 345 350 Val Ala Cys Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val 355 360 365 Gly Ile Ile Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln 370 375 380 Asp Ala Asp Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys 385 390 395 400 Val Glu Gly Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser 405 410 415 Phe Asp Pro Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp 420 425 430 Gln Val Phe Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser 435 440 445 Asn Arg Ile Leu Ser Ala Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly 450 455 460 Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe 465 470 475 480 Leu <210> 26 <211> 481 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 26 Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr Glu Gly 1 5 10 15 Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe Met Leu 20 25 30 Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro Ser Leu 35 40 45 Leu Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Asn Leu Arg 50 55 60 Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu Gln Pro 65 70 75 80 Arg Gln Ser Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala 85 90 95 Lys Thr Ile Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn Ala Leu 100 105 110 Lys Lys Thr Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val 115 120 125 Leu Ala Thr Met Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu 130 135 140 Thr Arg Ala Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu Lys Met 145 150 155 160 Ala Val Ser Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg 165 170 175 Gln Phe Ser Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu 180 185 190 Met Thr Asp Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser 195 200 205 Ala Gly Gln Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg 210 215 220 Lys Gly Phe Gly Ile Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr 225 230 235 240 Met Val Gln Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile 245 250 255 Val Lys Ala Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys 260 265 270 Leu Leu Arg Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr 275 280 285 Val Tyr Tyr Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val 290 295 300 Phe Cys Asp Thr Cys Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu 305 310 315 320 Cys Asn Ile Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr 325 330 335 Gly Arg His Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu 340 345 350 Val Ala Cys Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val 355 360 365 Gly Ile Ile Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln 370 375 380 Asp Ala Asp Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys 385 390 395 400 Val Glu Gly Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser 405 410 415 Phe Asp Pro Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp 420 425 430 Gln Val Phe Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser 435 440 445 Asn Arg Ile Leu Ser Ala Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly 450 455 460 Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe 465 470 475 480 Leu <210> 27 <211> 481 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 27 Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr Glu Gly 1 5 10 15 Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe Met Leu 20 25 30 Cys Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro Ser Leu 35 40 45 Leu Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu Leu Arg 50 55 60 Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu Gln Pro 65 70 75 80 Arg Gln Ser Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala 85 90 95 Lys Thr Ile Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn Ala Leu 100 105 110 Lys Lys Thr Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val 115 120 125 Leu Ala Thr Met Val Arg Glu Leu Cys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu 130 135 140 Thr Arg Ala Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu Lys Met 145 150 155 160 Ala Val Ser Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg 165 170 175 Gln Phe Ser Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu 180 185 190 Met Thr Asp Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser 195 200 205 Ala Gly Gln Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg 210 215 220 Lys Gly Phe Gly Phe Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Asp Val Ile Tyr 225 230 235 240 Met Val Gln Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile 245 250 255 Val Lys Ala Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys 260 265 270 Leu Leu Arg Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr 275 280 285 Val Tyr Tyr Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val 290 295 300 Phe Cys Asp Thr Cys Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu 305 310 315 320 Cys Asn Ile Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr 325 330 335 Gly Arg His Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu 340 345 350 Val Ala Cys Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val 355 360 365 Gly Ile Ile Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln 370 375 380 Asp Ala Asp Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys 385 390 395 400 Val Glu Gly Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser 405 410 415 Phe Asp Pro Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp 420 425 430 Gln Val Phe Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser 435 440 445 Asn Arg Cys Cys Ser Ala Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly 450 455 460 Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe 465 470 475 480 Leu <210> 28 <211> 487 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 28 Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr Glu Gly 1 5 10 15 Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe Met Leu 20 25 30 Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro Ser Leu 35 40 45 Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu Leu Arg 50 55 60 Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu Gln Pro 65 70 75 80 Arg Gln Ser Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala 85 90 95 Lys Thr Ile Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Trp Lys Asn Ala Leu 100 105 110 Lys Lys Thr Asn Glu Val Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val 115 120 125 Leu Val Thr Met Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu 130 135 140 Thr Arg Ala Leu Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu Lys Met 145 150 155 160 Ala Val Ser Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg 165 170 175 Gln Phe Ser Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu 180 185 190 Met Thr Asp Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser 195 200 205 Ala Gly Gln Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg 210 215 220 Lys Gly Phe Gly Phe Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr 225 230 235 240 Met Val Gln Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile 245 250 255 Val Lys Ala Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys 260 265 270 Leu Leu Arg Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr 275 280 285 Val Tyr Tyr Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val 290 295 300 Phe Cys Asp Thr Cys Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu 305 310 315 320 Cys Asn Ile Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr 325 330 335 Gly Arg His Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu 340 345 350 Val Ala Cys Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val 355 360 365 Gly Ile Ile Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln 370 375 380 Asp Ala Asp Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys 385 390 395 400 Val Glu Gly Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser 405 410 415 Phe Asp Pro Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp 420 425 430 Gln Val Phe Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser 435 440 445 Asn Arg Ile Leu Ser Ser Ala Glu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr Ile Pro 450 455 460 Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp 465 470 475 480 Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 485 <210> 29 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 29 Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asn Gly Thr Ala Tyr Val Arg Lys 1 5 10 15 Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 20 25 <210> 30 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 30 Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys 1 5 10 15 Asn Gly Thr Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 20 25 <210> 31 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 31 Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys 1 5 10 15 Asp Gly Asn Trp Thr Leu Leu Ser Thr Phe Leu 20 25 <210> 32 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 32 Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asn Gly Thr Ala Tyr Val Arg Lys 1 5 10 15 Asn Gly Thr Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 20 25 <210> 33 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 33 Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asn Gly Thr Ala Tyr Val Arg Lys 1 5 10 15 Asp Gly Asn Trp Thr Leu Leu Ser Thr Phe Leu 20 25 <210> 34 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 34 Ile Leu Ser Ala 1 <210> 35 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 35 Cys Cys Ser Ala 1 <210> 36 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 36 Cys Cys Lys Gln Thr Asn Glu Cys Cys Lys Asn Leu Glu Arg Ala Val 1 5 10 15 Ser Ala <210> 37 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 37 Cys Cys Arg Glu Leu Lys Glu Cys Cys Lys Asn Leu Glu Asn Ala Val 1 5 10 15 Ser Ala <210> 38 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 38 Cys Cys Arg Glu Leu Lys Asp Cys Cys Lys Asn Leu Glu Asn Ala Val 1 5 10 15 Ser Ala <210> 39 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 39 Cys Cys Arg Glu Leu Lys Asp Cys Cys Lys Asn Leu Glu Arg Ala Val 1 5 10 15 Ser Ala <210> 40 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 40 Cys Cys Arg Glu Leu Lys Asp Cys Cys Lys Gln Leu Asn Lys Ala Val 1 5 10 15 Ser Ala <210> 41 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 41 Cys Cys Arg Glu Leu Lys Glu Cys Cys Lys Gln Leu Asn Lys Ala Val 1 5 10 15 Ser Ala <210> 42 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 42 Leu Val Pro Arg Gly Ser 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 43 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 44 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 44 Ile Glu Gly Arg 1 <210> 45 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 45 Cys Cys Lys Gln Thr Asn Glu Cys Cys Lys Asn Leu Glu Arg Ala Val 1 5 10 15 Ser <210> 46 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 46 Cys Cys Lys Gln Thr Asn Glu Cys Cys Lys Asn Leu Glu Arg Ala Val 1 5 10 15 Ser <210> 47 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 47 Cys Cys Lys Gln Thr Asn Glu Cys Cys Lys Asn Leu Glu Arg Ala Val 1 5 10 15 Ser <210> 48 <211> 17 <212> PRT <213> Artficial <400> 48 Cys Cys Arg Glu Leu Lys Glu Cys Cys Lys Asn Leu Glu Asn Ala Val 1 5 10 15 Ser <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 49 Cys Cys Arg Glu Leu Lys Glu Cys Cys Lys Asn Leu Glu Asn Ala Val 1 5 10 15 Ser <210> 50 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 50 Cys Cys Arg Glu Leu Lys Glu Cys Cys Lys Asn Leu Glu Asn Ala Val 1 5 10 15 Ser <210> 51 <211> 540 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 51 Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu 85 90 95 Asn Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val 100 105 110 Cys Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala Lys Thr Ile 115 120 125 Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn Ala Leu Lys Lys Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Phe 145 150 155 160 Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala 165 170 175 Leu Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser 195 200 205 Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255 Gly Phe Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gln 260 265 270 Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Val Lys Ala 275 280 285 Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp 325 330 335 Thr Ala Cys Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn Ile 340 345 350 Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365 Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380 Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile 385 390 395 400 Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp 405 410 415 Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430 Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro 435 440 445 Val Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe 450 455 460 Glu Ser Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg Ile 465 470 475 480 Leu Ser Ser Ala Glu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro 485 490 495 Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu 500 505 510 Ser Thr Phe Leu Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His His His His 515 520 525 His His Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 530 535 540 <210> 52 <211> 1623 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 52 atgtcttgga aggtggtcat catcttctcc ctgctgatca cccctcagca cggcctgaaa 60 gagtcctacc tggaagagag ctgctccacc atcaccgagg gctacctgtc tgtgctgaga 120 accggctggt acaccaacgt gttcaccctg gaagtgggcg acgtggaaaa cctgacctgt 180 gctgatggcc ccagcctgat caagaccgag ctggacctga ccaagtctgc cctgagagaa 240 ctgaggaccg tgtctgccga tcagctggcc agagaggaac agatcgagaa ccctcggcag 300 tccagattcg tgctgggagc tattgctctg ggcgtgtgta cagccgctgc tgtgacagct 360 ggtgtcgcta tcgccaagac catccggctg gaatctgaag tgaccgccat caagaacgcc 420 ctgaaaaaga ccaacgaggc cgtgtccaca ctcggcaatg gcgttagagt gctggccttt 480 gctgtgcgcg agctgaagga cttcgtgtcc aagaacctga ccagggctct gaacaagaac 540 aagtgtgata tcgccgacct gaagatggcc gtgtctttca gccagttcaa ccggcggttc 600 ctgaacgtcg tgcggcagtt ctctgataac gccggcatca cccctgccat cagcctggat 660 ctgatgaccg atgccgagct ggctagagcc gtgtctaaca tgcctacctc tgccggccag 720 atcaagctga tgctggaaaa cagagccatg gtccgacgga aaggcttcgg ctttctgatc 780 ggcgtgtacg gctcctccgt gatctacatg gtgcagctgc ctatcttcgg cgtgatcgac 840 accccttgct ggatcgtgaa ggccgctcct agctgctctg agaagaaggg caactacgcc 900 tgcctgctga gagaggacca aggctggtac tgtcagaacg ccggctccac cgtgtactac 960 cccaacgaga aggactgcga gacaagaggc gaccacgtgt tctgcgatac cgcctgtggc 1020 atcaatgtgg ccgagcagtc caaagagtgc aacatcaaca tctccaccac caactatccc 1080 tgcaaggtgt ccaccggcag gcaccctatt tccatggtgg ctctgtctcc actgggcgcc 1140 ctggtggctt gttataaggg cgtgtcctgc tccatcggct ccaacagagt gggcatcatc 1200 aagcagctga acaagggctg cagctacatc accaaccagg acgccgatac cgtgaccatc 1260 gacaataccg tgtatcagct gtccaaggtg gaaggcgagc agcacgtgat caagggcaga 1320 cctgtgtcct ccagcttcga ccccgtgaag ttccctgagg atcagttcaa cgtggccctg 1380 gaccaggtgt tcgagtccat cgagaactct caggctctgg tggaccagtc caaccggatc 1440 ctgtcctctg ccgagtctgc tatcggcggc tatatccccg aggctcctag agatggccag 1500 gcctatgttc ggaaggatgg cgaatgggtg ctgctgtcta ccttcctcgg aggcctggtg 1560 cctagaggct ctcaccacca tcatcaccac tccgcttggt cccatccaca gttcgagaag 1620 tga 1623 <210> 53 <211> 538 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 53 Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln 1 5 10 15 His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr 20 25 30 Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ala Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu 85 90 95 Asn Pro Arg Gln Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Val Ala Thr Ala Ala 100 105 110 Ala Val Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala Lys Thr Ile Arg Leu Glu Ser 115 120 125 Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn Ala Leu Lys Lys Thr Asn Glu Ala Val 130 135 140 Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr Ala Val Arg Glu 145 150 155 160 Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala Ile Asn Lys Asn 165 170 175 Lys Cys Asp Ile Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser Phe Ser Gln Phe 180 185 190 Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser Asp Asn Ala Gly 195 200 205 Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp Ala Glu Leu Ala 210 215 220 Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln Ile Lys Leu Met 225 230 235 240 Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe Gly Phe Leu Ile 245 250 255 Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gln Leu Pro Ile Phe 260 265 270 Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Val Lys Ala Ala Pro Ser Cys 275 280 285 Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg Glu Asp Gln Gly 290 295 300 Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Pro Asn Glu Lys 305 310 315 320 Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp Thr Ala Ala Gly 325 330 335 Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn Ile Asn Ile Ser Thr 340 345 350 Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His Pro Ile Ser Met 355 360 365 Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys Tyr Lys Gly Val 370 375 380 Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile Lys Gln Leu Asn 385 390 395 400 Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp Thr Val Thr Ile 405 410 415 Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly Glu Gln His Val 420 425 430 Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro Val Lys Phe Pro 435 440 445 Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe Glu Ser Ile Glu 450 455 460 Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg Ile Leu Ser Ser Ala 465 470 475 480 Glu Lys Gly Asn Thr Ser Gly Arg Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly 485 490 495 Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr 500 505 510 Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly Gly 515 520 525 Ile Glu Gly Arg His His His His His His 530 535 <210> 54 <211> 1617 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 54 atgtcctgga aggtcgtgat catcttctcc ctgctgatca ccccccagca cggcctgaaa 60 gagtcctacc tggaagagag ctgctccacc atcaccgagg gctacctgtc tgtgctgcgg 120 accggctggt acaccaacgt gttcaccctg gaagtgggcg acgtggaaaa cctgacctgc 180 gccgatggcc ccagcctgat caagaccgag ctggacctga ccaagtccgc cctgcgggaa 240 ctgagaaccg tgtctgccga tcagctggcc agagaggaac agatcgagaa cccccggcag 300 tccaagaaac ggaagcggag agtggccacc gccgctgctg tgacagctgg cgtggccatt 360 gccaagacca tccggctgga atccgaagtg accgccatca agaacgccct gaaaaagacc 420 aacgaggccg tgtctaccct gggcaatggc gtgcgagtgc tggctacagc tgtgcgcgag 480 ctgaaggact tcgtgtccaa gaacctgacc cgggccatca acaagaacaa gtgtgatatc 540 gccgacctga agatggccgt gtcctttagc cagttcaacc ggcggttcct gaacgtcgtg 600 cggcagttct ctgacaacgc cggcatcacc cctgccatct ccctggatct gatgaccgac 660 gccgagctgg ctagagccgt gtccaacatg cctacctctg ccggccagat caagctgatg 720 ctggaaaacc gggccatggt gcgacggaag ggcttcggct ttctgatcgg cgtgtacggc 780 tcctccgtga tctacatggt gcagctgcct atcttcggcg tgatcgacac cccctgctgg 840 atcgtgaagg ccgctcctag ctgctccgag aagaagggca actacgcctg cctgctgaga 900 gaggaccagg gctggtactg tcagaacgcc ggctccaccg tgtactaccc caacgagaag 960 gactgcgaga cacggggcga ccacgtgttc tgtgataccg ctgctggcat caacgtggcc 1020 gagcagtcca aagagtgcaa catcaacatc tccaccacca actacccctg caaggtgtcc 1080 accggcaggc accccatctc tatggtggcc ctgtctcctc tgggcgccct ggtggcttgt 1140 tacaagggcg tgtcctgctc catcggctcc aacagagtgg gcatcatcaa gcagctgaac 1200 aagggctgca gctacatcac caaccaggac gccgacaccg tgaccatcga caataccgtg 1260 tatcagctgt ccaaggtgga aggcgagcag cacgtgatca agggcagacc cgtgtcctcc 1320 agcttcgacc ccgtgaagtt ccccgaggat cagttcaatg tggccctgga ccaggtgttc 1380 gagtccatcg agaactccca ggctctggtg gaccagtcca accggatcct gtcctctgcc 1440 gagaagggaa acacctccgg cagagagaac ctgtattttc aaggcggcgg aggctccggc 1500 tacatccctg aggctcctag agatggccag gcctacgtgc ggaaggatgg cgaatgggtg 1560 ctgctgtcca ccttcctggg cggcatcgag ggcagacacc accatcatca ccactga 1617

Claims

융합전 형태에서 안정화된 면역원성 인간 메타뉴모바이러스(hMPV) 변형 F 단백질 또는 이의 단편으로서,
융합 단백질(FP)이 결여되고, F2 도메인, 이종 펩티드 링커 및 F1 도메인을 포함하는 재조합 단일 사슬 폴리펩티드를 포함하되,
상기 링커는 F2 및 F1 도메인 사이에 위치하고, F1 도메인에 존재하는 비천연 시스테인 잔기와 디설파이드 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 함유하는, 단백질 또는 이의 단편.
제1항에 있어서, 상기 재조합 단일 사슬 폴리펩티드는 F2 및 F1 도메인 사이에 트립신 유사 절단 부위가 결여된, 단백질 또는 이의 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재조합 단일 사슬 폴리펩티드는 F2 및 F1 도메인 사이에 푸린 유사 절단 부위가 결여된, 단백질 또는 이의 단편.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 F2 도메인은 서열 번호 2와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 단백질 또는 이의 단편.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 F1 도메인은 서열 번호 3 또는 이의 잔기 17 내지 388과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 단백질 또는 이의 단편.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 상기 F1 도메인은 서열 번호 3의 위치 236에서 치환된 시스테인 잔기를 포함하고;
(b) 상기 재조합 단일 사슬 폴리펩티드는 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열의 아미노산 위치에 대해 위치 338에서 치환된 시스테인 잔기를 포함하고;
(c) 상기 링커는 서열 번호 3의 F1 도메인의 위치 236에서 치환된 비천연 시스테인 잔기와 디설파이드 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 포함하고/하거나;
(d) 상기 링커는 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열의 아미노산 위치에 대해 위치 338에서 치환된 비천연 시스테인 잔기와 디설파이드 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 포함하는, 단백질 또는 이의 단편.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 F2 도메인의 C-말단은 F1 도메인의 N-말단과 근접한, 단백질 또는 이의 단편.
제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열의 F1 및 F2 도메인 사이에 존재하는 트립신 절단 부위는 다른 아미노산 잔기에 대한 서열 번호 1의 위치 102에서의 아르기닌 잔기의 치환에 의해 재조합 단일 사슬 폴리펩티드에서 제거되는, 단백질 또는 이의 단편.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단일 사슬 폴리펩티드는 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열의 위치 103 내지 118에서의 아미노산 잔기에 걸쳐 있는 융합 펩티드가 결여된, 단백질 또는 이의 단편.
제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 재조합 단일 사슬 폴리펩티드는 막관통 도메인 및/또는 세포질 도메인이 결여된, 단백질 또는 이의 단편.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1의 위치 102에서의 상기 아르기닌 잔기는 글리신 잔기로 치환되는, 단백질 또는 이의 단편.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 1 내지 5개, 바람직하게는 5개의 아미노산으로 이루어지는, 단백질 또는 이의 단편.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스테인 잔기는 링커의 위치 1 또는 3, 바람직하게는 위치 1에 있는, 단백질 또는 이의 단편.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 적어도 하나의 알라닌, 글리신 또는 발린 잔기를 포함하는, 단백질 또는 이의 단편.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 CGAGA, CGAGV, CGAAV, AGCGA, CAAAV, CAAFV 및 CGAGA로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 단백질 또는 이의 단편.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 서열 CGAGA(서열 번호 4)를 포함하는, 단백질 또는 이의 단편.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단일 사슬 폴리펩티드는 추가로 융합전 형태를 안정화시키는, 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열의 위치 97에 상응하는 위치에서 아스파라긴 잔기에 대해 치환된 글루타민 잔기(N97Q)를 포함하는, 단백질.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단일 사슬 폴리펩티드는 단백질 발현을 개선하는, 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열의 위치 294에 상응하는 위치에서 글루탐산 잔기에 대해 치환된 글리신 잔기(G294E)를 추가로 포함하는, 단백질.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단일 사슬 폴리펩티드는 융합전 형태를 안정화시키는, 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열에 대한 하나 이상의 치환(들)을 추가로 포함하는, 단백질.
제19항에 있어서, 상기 재조합 단일 사슬 폴리펩티드는 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열의 위치 49, 51, 67, 80, 137, 147, 159, 160, 161, 166, 177, 258, 266, 480 및/또는 481에 상응하는 위치에서의 하나 이상의 치환(들)을 포함하는, 단백질.
제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 재조합 단일 사슬 폴리펩티드는 비천연 디설파이드 결합을 생성하는, 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열에 대해 치환된 적어도 2개의 추가의 시스테인 잔기를 포함하는, 단백질.
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치환은 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열에 대해 E51C 및 K166C인, 단백질.
제20항에 있어서, 상기 치환은 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열에 대해 T49M, E80N, I137W, A147V, A159V, T160F, A161M, I67L, I177L, F258I, S266D, I480C 및/또는 L481C로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 단백질.
제23항에 있어서, 상기 재조합 단일 사슬 폴리펩티드는 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열에 대해 적어도 3개의 치환 T49M, A161M 및 I67L 또는 I177L을 포함하는, 단백질.
제23항에 있어서, 상기 치환 E80N은 수소 결합을 도입한, 단백질.
제23항에 있어서, 상기 재조합 단일 사슬 폴리펩티드는 치환 E51C, K166C 및 S266D를 포함하고, 상기 치환 S266D는 염 브릿지를 도입한, 단백질.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단일 사슬 폴리펩티드는 서열 번호 1의 천연 hMPV F 단백질 서열에 대해 하기 치환 조합 중 하나를 추가로 포함하는, 단백질:
N97Q, R102G 및 G294E(L7F_A1_23);
N97Q, R102G, T160F, I177L 및 G294E(sF_A1_K_L7);
N97Q, R102G, T49M, I67L, A161M, E80N, F258I 및 G294E(L7F_A1_31);
N97Q, R102G, T49M, I67L, A161M, E51C, K166C, S266D, G294E, I480C 및 L481C(L7F_A1_33); 또는
N97Q, R102G, T49M, A161M, I137W, A159V, A147V, I177L 및 G294E (L7F_A1_4.2).
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단일 사슬 폴리펩티드는 삼량체화 헬퍼 도메인(폴드온(foldon))을 포함하는, 단백질.
제28항에 있어서, 상기 삼량체화 헬퍼 도메인은 서열 번호 10 또는 서열 번호 29 내지 33 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 재조합 단일 사슬 폴리펩티드는 폴드온 도메인의 상류에 서열 번호 34 또는 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단일 사슬 폴리펩티드는 정제용 His 또는 스트렙타비딘 태그를 추가로 포함하는, 단백질.
제31항에 있어서, 상기 His 태그는 서열 번호 11의 서열을 포함하는, 단백질.
제31항에 있어서, 상기 스트렙타비딘 태그는 서열 번호 12의 서열을 포함하는, 단백질.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단일 사슬 폴리펩티드는 His 또는 스트렙타비딘 태그에 대한 상류에 서열 번호 42 내지 44 중 임의의 것의 서열을 포함하는 절단 부위를 추가로 포함하는, 단백질.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단일 사슬 폴리펩티드는 서열 번호 5 내지 9 또는 24 내지 28 중 임의의 것의 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 단백질.
서열 번호 5 또는 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열(L7F_A1_23)과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는, 상기 아미노산 서열, 또는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어지는 면역원성 단백질.
서열 번호 6 또는 서열 번호 24에 제시된 아미노산 서열(sF_A1_K_L7)과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는, 상기 아미노산 서열, 또는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어지는 면역원성 단백질.
서열 번호 7 또는 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열(L7F_A1_31)과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는, 상기 아미노산 서열, 또는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어지는 면역원성 단백질.
서열 번호 8 또는 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열(L7F_A1_33)과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는, 상기 아미노산 서열, 또는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어지는 면역원성 단백질.
서열 번호 9 또는 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열(L7F_A1_4.2)과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는, 상기 아미노산 서열, 또는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어지는 면역원성 단백질.
제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 가용성 형태로 생성된 재조합 단백질인, 단백질.
제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 동형삼량체 또는 이형삼량체를 형성할 수 있는, 단백질.
제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 특이적 항-융합전 MPE8 항체에 결합하고, 특이적 항-융합후 MF1 항체에는 약간 결합하거나 결합하지 않는, 단백질.
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 천연 hMPV F 단백질을 인식하는 중화 항체를 유도할 수 있는, 단백질.
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
제45항에 있어서, 상기 핵산은 서열 번호 19 내지 23 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 핵산.
제45항 또는 제46항의 핵산을 포함하는 바이러스 벡터.
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 면역원성 단백질 또는 제45항 또는 제46항의 핵산 분자, 또는 제47항의 바이러스 벡터를 포함하고, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물 또는 백신.
제48항에 있어서, 아쥬반트를 추가로 포함하고, 바람직하게는 상기 아쥬반트는 백반이거나 백반을 포함하는, 면역원성 조성물 또는 백신.
제48항에 있어서, 혼합된 Th1/Th2 면역 반응을 유도하는 아쥬반트를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물 또는 백신.
제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 임의의 호흡기 바이러스, 특히 hMPV, RSV, PIV3, 인플루엔자 바이러스 또는 코로나바이러스 유래의 적어도 하나의 추가 항원을 추가로 포함하는, 면역원성 조성물 또는 백신.
제51항에 있어서, 상기 추가 항원은 RSV F 단백질, PIV3 F 단백질, 인플루엔자 헤마글루티닌 또는 코로나바이러스 S 단백질인, 면역원성 조성물 또는 백신.
유효량의 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 단백질, 또는 제45항 또는 제46항의 핵산 분자, 또는 제47항의 바이러스 벡터, 또는 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상에서 기도 감염에 대한 면역 반응을 생성하는 방법.
유효량의 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 단백질, 또는 제45항 또는 제46항의 핵산 분자, 또는 제47항의 바이러스 벡터, 또는 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상에서 기도 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 대상은 적어도 하나의 기도 감염, 특히 hMPV, RSV, PIV3, 인플루엔자 및/또는 코로나바이러스 감염을 갖거나 가질 위험이 있는, 방법.
인간 대상에서 hMPV 감염의 예방 및/또는 치료를 위한, 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 단백질, 또는 제45항 또는 제46항의 핵산 분자, 또는 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 백신의 용도.
제45항 또는 제46항에 따른 핵산 분자 또는 제47항에 따른 바이러스 벡터로부터 단백질을 발현하는 단계, 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제와 발현된 단백질을 조합하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 단백질 또는 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 백신을 제조하는 방법.