JP2022533318A - 気道感染の治療または予防のためのサブユニットワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、融合前コンフォメーションで安定化された、改変メタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質に関する。本発明はまた、気道感染に対してヒト対象を予防および／または治療するためのこれらのタンパク質を含む免疫原性組成物（ワクチン）に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、融合前コンフォメーションで安定化された、改変メタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質に関する。本発明はまた、気道感染に対してヒト対象を予防および／または治療するためのこれらのタンパク質を含む免疫原性組成物（ワクチン）に関する。

ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）は、幼児（０～４歳）、免疫低下患者、および高齢者における、これらのカテゴリーの患者にとって致命的であり得る急性気道感染の主な原因である（Ｓｃｈｉｌｄｇｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２４（４）：７３４－５４）。集約的な努力にかかわらず、現在、ｈＭＰＶ感染を予防または治療するための認可されたワクチンまたは抗ウイルス薬は存在しない。精査されたいくつかのワクチン接種ストラテジーの中で、ウイルスタンパク質、特にｈＭＰＶ Ｆタンパク質を含むサブユニットワクチンが最も有望である（Ｍｅｌｅｒｏ ＆ Ｍａｓ．２０１５．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．２０９：１２８－３５）。

ｈＭＰＶは、パラミクソウイルス科のニューモウイルス属のエンベロープ一本鎖ＲＮＡウイルスである。ｈＭＰＶゲノムは、３つの表面糖タンパク質Ｆ、ＧおよびＳＨを含む９つのタンパク質をコードする８つの遺伝子で構成される。ｈＭＰＶに対する防御は、主に、異なる遺伝子型の間で高度に保存され、他のパラミクソウイルスに対する類似を共有する融合（Ｆ）糖タンパク質に対する中和抗体によってもたらされる（ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｏｇｅｎ ｅｔ ａｌ．２００４．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １０（４）：６５８－６６；ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｏｇｅｎ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９５（１）：１１９－３２を参照）。

パラミクソウイルスＦタンパク質は、膜を１回横切り、そのＮ末端にシグナルペプチドを含む、Ｉ型内在性膜タンパク質であり、このシグナルペプチドは、外部ドメインを細胞外膜に標的化する。Ｃ末端において、疎水性移行停止ドメイン（ｓｔｏｐ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｏｍａｉｎ）（ＴＭドメイン）はタンパク質を膜中にアンカーし、短い細胞質側末端を残す（図１を参照）。

ネイティブＦタンパク質は、シグナルペプチドの切断後に、Ｆ０と名付けられる不活性な前駆体として合成される（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｎａｔｕｒｅ ４３９（７０７２）：３８－４４、Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．２００５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０２（２６）：９２８８－９３、Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．１９９４．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９（１）：１６０－８）。生物学的に活性になるために、Ｆ０は宿主プロテアーゼによってプロセシングされ、Ｆ１およびＦ２と称する２つの鎖を生成し、これらは、ジスルフィド結合によって共有結合されたままである（Ｓｃｈｏｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８０（２２）：１０９３１－４１、Ｂｉａｃｃｈｅｓｉ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８０（１２）：５７９８－８０６、Ｙｕｎ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：１５５８４）。３つのＦ１－Ｆ２ヘテロ二量体は成熟Ｆタンパク質を形成し、これは準安定融合前コンフォメーションのビリオンエンベロープ中に組み込まれ（Ｂａｔｔｌｅｓ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８（１）：１５２８）、ビリオンエンベロープと宿主細胞原形質膜との融合を媒介する。融合プロセスの間、Ｆタンパク質は、不安定な融合前コンフォメーションから安定な融合後コンフォメーションへの不可逆的な再折りたたみを経る（図２を参照）。

融合前ｈＭＰＶ Ｆタンパク質構造を特異的に認識する中和抗体がヒト血清において見出され（Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．２００１２．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：４６１－４６３、Ｎｇｗｕｔａ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７（３０９）：３０９、Ｒｏｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．２０１８．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２６（３）：２０９－１９）、このことは、融合前Ｆタンパク質が好都合なワクチン候補であり得ることを示す（Ｍｅｌｅｒｏ ＆ Ｍａｓ．２０１５．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．２０９：１２８－３５）。融合後Ｆタンパク質コンフォメーションに対する融合前Ｆタンパク質コンフォメーションの１つの明らかな不利益は、その不安定性である。安定化された融合前Ｆタンパク質を産生しようとする以前の試みには、徹底的な構造分析およびコンピューターモデリングが用いられた。特に、１つのグループは、ラットにおいて防御応答を提供することができる、高度に安定な融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質の設計を記載した（Ｋｒａｒｕｐ ｅｔ ａｌ．２０１５）．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６：８１４３を参照）。別のグループは、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の安定化された融合前形態の構築を開示し、これは、そのタンパク質で免疫されたマウスにおいて中和抗体を誘発した（ＷＯ２０１６／１０３２３８を参照）。

融合前コンフォメーションおよび融合後コンフォメーションのＦタンパク質の結晶構造が、ｈＭＰＶ、ＲＳＶおよび他のパラミクソウイルスについて決定された（例えば、Ｂａｔｔｌｅｓ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８（１）：１５２８を参照）。一般的構造類似性にもかかわらず、融合前ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、ｈＭＰＶおよびＲＳＶのＦタンパク質の間に実質的な機能的および免疫学的差異を与える特有の構造的特徴を持つことが明らかになった。

ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の作用機序、構造および免疫原性特性の理解における著しい前進にもかかわらず、Ｆタンパク質ベースのワクチンは市場に出されていない。したがって、本発明の目的は、気道感染に対するヒトワクチンの開発のための新規な改変融合前ｈＭＰＶ Ｆタンパク質候補を提供することである。

本開示は、中和抗体を誘発し、ｈＭＰＶ感染に対して防御することができる、組換え免疫原性ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質およびそのフラグメント（本明細書において、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質という）を提供する。ｈＭＰＶ Ｆタンパク質のネイティブコード配列を、安定な融合前コンフォメーションを生成するように改変した。そのような改変を、本発明の一部として含まれる三次元（３Ｄ）ホモロジーモデルに基づいて設計した。本発明は、組換え免疫原性タンパク質を生産する方法、およびヒトにおけるｈＭＰＶ感染の予防および／または治療のために免疫原性タンパク質を使用する方法をさらに含む。

一態様では、本開示は、融合前コンフォメーションで安定化された、改変ｈＭＰＶ Ｆタンパク質またはそのフラグメントであって、Ｆ２ドメイン、異種ペプチドリンカー、および融合ペプチド（ＦＰ）を欠くＦ１ドメインから構成される単鎖ポリペプチドを含み、リンカーはＦ２ドメインとＦ１ドメインとの間に配置され、その各々がＦ１ドメイン中に存在するシステイン残基と非天然ジスルフィド結合を形成する１つ以上のシステイン残基を含む、タンパク質またはそのフラグメントを提供する。

一実施形態では、単鎖Ｆタンパク質は、Ｆ２のＣ末端がＦ１のＮ末端に対して近位であるように接続されたＦ２ドメインおよびＦ１ドメインを含む。Ｆ２とＦ１との間のプロテアーゼ切断部位は、タンパク質前駆体の切断を除去するように変異され得る。いくつかの実施形態では、Ｆ１ドメインは、例えば、配列番号３のネイティブＦ１ドメイン配列の残基１～１６に対応する、配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列の１０３位～１１８位のアミノ酸残基にわたる融合ペプチド（ＦＰ）を欠くように、短縮型にされたＦ１ドメインであり得る。したがって、Ｆ１ドメインは、配列番号１の残基１１９～５３９または配列番号３の残基１７～４３７に対応するフラグメントを含み得る。いくつかの実施形態では、単鎖ポリペプチドは、アンカー膜貫通（ＴＭ）ドメインおよびそのＣ末端の細胞質側末端を含まない、配列番号１の残基１１９～４９０または配列番号３の残基１７～３３８に対応するＦ１ドメインのフラグメントを含み得る。さらに、Ｆ１ドメインおよびＦ２ドメインは、例えば、少なくとも１つのシステイン残基を含む５つの残基を含む異種ペプチドリンカー、好ましくは配列番号４のリンカーを介して連結され得る。

さらに１つの実施形態では、本発明の単鎖Ｆタンパク質は、安定な融合前コンフォメーションを有する。一面では、融合前コンフォメーションは、Ｆ１ドメインとＦ２ドメインとの間のプロテアーゼ切断の廃止およびＦ１の遊離Ｎ末端の欠如によって安定化される。安定化を与える別の特徴は、三量体化によって形成される空洞の内側にＨＲＡドメインを固定する、少なくとも１つの追加の（非天然を含む）ジスルフィド結合の存在である（図３を参照）。一実施形態では、非天然ジスルフィド結合は、Ｆ２とＦ１との間に挿入された異種ペプチドリンカーのシステイン残基と、Ｆ１ドメイン中に、好ましくはそのＣ末端領域中に位置し、当該空洞内に位置するシステイン残基との間に形成され得る。例えば、非天然ジスルフィド結合は、ペプチドリンカー中のシステイン残基と、Ｆ１ドメイン中、配列番号３のネイティブＦ１ドメイン配列の２３６位に対応する配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列の３３８位に存在する非天然システイン残基との間に形成され得る。そのような実施形態では、単鎖Ｆタンパク質中に存在するＦ１ドメイン（例えば、配列番号３の残基１～１６の融合ペプチドを欠く短縮型Ｆ１ドメイン）は、配列番号３の配列におけるＡ２３６Ｃ（配列番号１におけるＡ３３８Ｃに対応）などの変異を含み得る。ペプチドリンカー中のシステイン残基は、例えば、Ｆ２ドメインにすぐ隣接し得、例えば、Ｆ２ドメインのＣ末端に隣接する、異種リンカーのＮ末端の最初の残基であり得る。例えば、ペプチドリンカー中のシステイン残基は、組換えポリペプチド中、配列番号１の残基１０３に相当する位置に存在し得る。

さらなる実施形態では、単鎖Ｆタンパク質は、単鎖含有Ｆ三量体の変更されたジオメトリを補償する１つ以上の追加の改変を含み得る。好ましくは、当該改変は、配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列の４９位、５１位、６７位、８０位、９７位、１３７位、１４７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６６位、１７７位、１８５位、２５８位、２６６位、２９４位、４８０位および／または４８１位に対応する位置での置換である。特に、９７位のアスパラギンは、グルタメートに置換され得るか（Ｎ９７Ｑ）、または１８５位のアラニンは、プロリンに置換され得る（Ａ１８５Ｐ）。したがって、組換えポリペプチドは、配列番号２の３１位、３３位、４９位、６２位および／または７９位に１つ以上の置換を含むＦ２ドメインを含み得る。組換えポリペプチドは、配列番号３の３５位、４５位、５７位、５８位、５９位、６４位、７５位、８３位、１５６位、１６４位、１９２位、３７８位および／または３７９位に１つ以上の置換を含むＦ１ドメイン（例えば、配列番号３の残基１～１６を欠く短縮型Ｆ１ドメイン）を含み得る。

さらに、いくつかの変異は、空洞充填の欠乏を補償し得る。特に、空洞充填変異は、配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列の４９位、６７位、８０位、１３７位、１４７位、１５９位、１６０位、１６１位、１７７位および２５８位のアミノ酸置換を含むリストから選択され得る。一実施形態では、空洞充填変異には、配列番号１におけるＴ４９Ｍ置換、Ｉ６７Ｌ置換、Ｉ１３７Ｗ置換、Ａ１４７Ｖ置換、Ａ１５９Ｖ置換、Ｔ１６０Ｆ置換、Ａ１６１Ｍ置換、および／またはＩ１７７Ｌ置換が含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号２の配列におけるＴ３１ＭまたはＩ４９Ｌ置換を含むＦ２ドメインを含み得る。他の実施形態では、組換えポリペプチドは、Ｉ３５Ｗ、Ａ４５Ｖ、Ａ５７Ｖ、Ｔ５８Ｆ、Ａ５９Ｍ、Ｉ７５Ｌおよび／またはＦ１５６Ｉから選択される配列番号３における１つ以上の置換を含む（例えば、短縮型の）Ｆ１ドメインを含み得る。

別の実施形態では、組換え単鎖Ｆタンパク質は、非天然水素結合または塩橋の形成を導く１つ以上の置換を含み得る。例えば、そのような置換には、配列番号１におけるＥ８０ＮおよびＳ２６６Ｄが含まれる。したがって、組換えポリペプチドは、配列番号２の配列におけるＥ６２Ｎ置換を含むＦ２ドメインを含み得る。他の実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号３における置換Ｓ１６４Ｄを含む（例えば、短縮型の）Ｆ１ドメインを含み得る。

いくつかの実施形態では、組換え単鎖Ｆタンパク質は、追加の安定化ジスルフィド結合を作製するためにさらなるシステイン置換を含み得る。例えば、置換Ｅ５１ＣおよびＫ１６６Ｃは、Ｆ２ドメインのβストランドの５１位のシステイン残基と、配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質のＨＲＡ α４エレメントの１６６位のシステインとの間に非天然ジスルフィド結合を形成し得る。この改変により、ＨＲＡ中のヘリックスからのＥ５１とＫ１３８との間の可能な塩橋が損なわれる。変異Ｓ２６６Ｄは、Ｋ１３８への非天然塩橋を導入して、このヘリックスの付着の喪失を補償する。さらに、配列番号１の近接する残基Ｉ４８０およびＬ４８１のシステインへの置換は、３つのプロトマーにわたる３つのジスルフィド結合の導入を可能にして、共有結合した三量体タンパク質を作製する。したがって、一実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号２の配列におけるＥ３３Ｃ置換を含むＦ２ドメインを含み得る。他の実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号３における置換Ｋ６４Ｃ、Ｓ１６４Ｄ、Ｉ３７８Ｃおよび／またはＬ３７９Ｃを含む（例えば、短縮型の）Ｆ１ドメインを含み得る。

別の実施形態では、組換え単鎖Ｆタンパク質は、可溶性組換えタンパク質の発現を補助する改変を含み得る。例えば、グリシンのグルタミン酸残基への置換が、配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列の２９４位に存在し得（Ｇ２９４Ｅ）、これは、タンパク質発現のより高い収量を導き得る。したがって、一実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号３における置換Ｇ１９２Ｅを含む（例えば、短縮型の）Ｆ１ドメインを含み得る。

いくつかの実施形態では、組換え単鎖Ｆタンパク質は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上のアミノ酸置換および／または他の改変の組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態では、組換え単鎖Ｆタンパク質は、タンパク質三量体の形成を可能にする、例えば組換えＦタンパク質サブユニットのＣ末端に連結された、三量体化ヘルパー、いわゆるフォールドン（ｆｏｌｄｏｎ）ドメインを含み得る。フォールドンドメインは、Ｔ４バクテリオファージのフィブリチン（ｆｉｂｒｉｔｉｎ）に由来し得る。本発明の組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、モノ三量体またはヘテロ三量体として産生され得る。
いくつかの実施形態では、組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、配列番号５～９または２４～２８のいずれか１つのアミノ酸配列に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。組換え単鎖Ｆタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＦ２ドメインを含み得る。組換え単鎖Ｆタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＦ１ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、組換え単鎖Ｆタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列の残基１７～４３７または１７～３８８に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる短縮型Ｆ１ドメインを含み得る。

本発明の組換えｈＭＰＶタンパク質は、免疫原性であり、ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質を認識する中和抗体を誘導することができる。本開示はまた、配列番号５～９または２４～２８のいずれか１つの配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する組換えｈＭＰＶタンパク質の免疫原性フラグメントおよび免疫原性タンパク質を含む。

本開示はまた、改変ｈＭＰＶ Ｆタンパク質をコードする単離された核酸分子、単離された核酸分子を含むベクター、改変ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の組換え発現のための宿主細胞を提供する。

本開示はまた、本発明の組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質、またはｈＭＰＶ Ｆタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ分子、またはベクターを含み、薬学的に許容される担体および／または賦形剤をさらに含み、アジュバント有りまたは無しで使用される、免疫原性組成物またはワクチンを提供する。特に、本開示は、対象において免疫応答、特に、ｈＭＰＶウイルスを中和し、ｈＭＰＶ感染に対して防御することができる免疫応答を刺激するための免疫原性組成物またはワクチンを提供する。本開示は、ｈＭＰＶ、ＲＳＶまたはＰＩＶ３（パラインフルエンザウイルス３型）に由来する追加の抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンをさらに提供する。本明細書に開示される免疫原性タンパク質、単離されたＤＮＡ分子、ベクター、および免疫原性組成物またはワクチンは、医薬、特にウイルス性気道感染および関連疾患、特にｈＭＰＶによって引き起こされる感染および疾患の予防的および／または治療的処置のための医薬としての使用に適切である。

組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質、またはｈＭＰＶ Ｆタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ分子、または免疫原性組成物（ワクチン）の生産方法は、本開示に包含される。対象において免疫応答を生成する方法、およびｈＭＰＶ感染を治療、抑制または予防する方法も含まれる。

さらなる態様では、本発明は、ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列に対する１つ以上のアミノ酸置換によって融合前コンフォメーションで安定化された、免疫原性ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）改変Ｆタンパク質またはそのフラグメントを提供し、ここで、改変Ｆタンパク質またはそのフラグメントは、配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列の９７位に対応する位置でのアスパラギン残基のグルタミン残基への置換（Ｎ９７Ｑ）を含む。

さらなる態様では、本発明は、ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列に対する１つ以上のアミノ酸置換によって融合前コンフォメーションで安定化された、免疫原性ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）改変Ｆタンパク質またはそのフラグメントを提供し、ここで、改変Ｆタンパク質またはそのフラグメントは、配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列の２９４位に対応する位置でのグリシン残基のグルタミン酸残基への置換（Ｇ２９４Ｅ）を含む。

さらなる態様では、本発明は、ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列に対する１つ以上のアミノ酸置換によって融合前コンフォメーションで安定化された、免疫原性ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）改変Ｆタンパク質またはそのフラグメントを提供し、ここで、改変Ｆタンパク質またはそのフラグメントは、配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列の４９位、５１位、６７位、８０位、１３７位、１４７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６６位、１７７位、２５８位、２６６位、４８０位および／または４８１位に対応する位置での１つ以上の置換を含む。

さらなる態様では、本発明は、ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列に対する２つ以上のアミノ酸置換によって融合前コンフォメーションで安定化された、免疫原性ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）改変Ｆタンパク質またはそのフラグメントを提供し、ここで、改変Ｆタンパク質またはそのフラグメントは、配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列に対する置換Ｅ５１ＣおよびＫ１６６Ｃを含み、置換されたシステイン残基は、非ネイティブジスルフィド結合を形成する。

さらなる態様では、本発明は、ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列に対する１つ以上のアミノ酸置換によって融合前コンフォメーションで安定化された、免疫原性ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）改変Ｆタンパク質またはそのフラグメントを提供し、ここで、改変Ｆタンパク質またはそのフラグメントは、配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列に対するＴ４９Ｍ、Ｅ８０Ｎ、Ｉ１３７Ｗ、Ａ１４７Ｖ、Ａ１５９Ｖ、Ｔ１６０Ｆ、Ａ１６１Ｍ、Ｉ６７Ｌ、Ｉ１７７Ｌ、Ｆ２５８Ｉ、Ｓ２６６Ｄ、Ｉ４８０Ｃおよび／またはＬ４８１Ｃからなる群から選択される１つ以上の置換を含む。

さらなる態様では、本発明は、ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列に対する３つ以上のアミノ酸置換によって融合前コンフォメーションで安定化された、免疫原性ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）改変Ｆタンパク質またはそのフラグメントを提供し、ここで、改変Ｆタンパク質またはそのフラグメントは、配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列に対する少なくとも置換Ｔ４９Ｍ、Ａ１６１Ｍ、およびＩ６７ＬまたはＩ１７７Ｌを含む。

さらなる態様では、本発明は、ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列に対する３つ以上のアミノ酸置換によって融合前コンフォメーションで安定化された、免疫原性ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）改変Ｆタンパク質またはそのフラグメントを提供し、ここで、改変Ｆタンパク質またはそのフラグメントは、配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列に対する以下の置換の組み合わせのうちの１つを含む：
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２ＧおよびＧ２９４Ｅ、
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７ＬおよびＧ２９４Ｅ、
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ４９Ｍ、Ｉ６７Ｌ、Ａ１６１Ｍ、Ｅ８０Ｎ、Ｆ２５８ＩおよびＧ２９４Ｅ、
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ４９Ｍ、Ｉ６７Ｌ、Ａ１６１Ｍ、Ｅ５１Ｃ、Ｋ１６６Ｃ、Ｓ２６６Ｄ、Ｇ２９４Ｅ、Ｉ４８０ＣおよびＬ４８１Ｃ、または
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ４９Ｍ、Ａ１６１Ｍ、Ｉ１３７Ｗ、Ａ１５９Ｖ、Ａ１４７Ｖ、Ｉ１７７ＬおよびＧ２９４Ｅ。

本明細書において別段特定されない限り、本明細書において言及されるすべてのアミノ酸位置は、配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列のアミノ酸位置に対応する。配列番号２のＦ２ドメインおよび配列番号３のＦ１ドメインにおけるそのような変異の対応する位置は、そこから直接導き出すことができる。配列番号２のＦ２ドメインは、配列番号１の残基１９～１０２に対応する。配列番号３のＦ１ドメインは、配列番号１の残基１０３～５３９に対応する。

表示されるドメインおよび重要なモチーフとともにネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質の模式図を示す。Ｆ０：タンパク質前駆体、Ｆ１、Ｆ２：Ｆ１およびＦ２ドメイン、ＳＰ：シグナルペプチド、ＦＰ：融合ペプチド、ＨＲＡ、ＨＲＢ：ヘプタッドリピートドメインＡおよびＢ、ＴＭ：膜貫通ドメイン、ＣＹＴ：細胞質側末端、ＳＳ：ジスルフィド結合。 ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質の融合前および融合後コンフォメーションにおける構造変化を示す。（Ａ）ＨＲＢのＣ末端がフォールドンドメインとともに三量体化され、ＨＲＡがヘッドドメイン上に折りたたまれている、融合前Ｆタンパク質三量体のリボンダイアグラム。（Ｂ）融合後Ｆタンパク質三量体のリボンダイアグラムであり、ここで、ＨＲＡは長い平行な３ヘリックスバンドルを形成し、これは、移動させられたＨＲＢヘリックスと一緒に安定な６ヘリックスバンドルを形成する。 表示される変異とともに改変融合前ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の三次元構造（リボンダイアグラム）を示す。 ＳＥ－ＨＰＬＣによる組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質の分析を示す。１－ｓＦ＿Ａ１＿Ｋ－Ｅ２９４、２－ｓＦ＿Ａ１＿Ｋ＿Ｌ７、３－Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿４．２、４－Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３１、５－Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３、６－Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３３。 組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質に対する融合前または融合後特異的抗体を用いて得られたＥＬＩＳＡデータを示す。（Ａ）ｓＦ＿Ａ１＿Ｋ－Ｅ２９４、（Ｂ）ｓＦ＿Ａ１＿Ｋ＿Ｌ７、（Ｃ）Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿４．２、（Ｄ）Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３、（Ｅ）Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３１、（Ｆ）Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３３、（Ｇ）Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３．２。（Ｇ）を除くすべてのチャートにおいて、実線は抗融合前抗体ＭＰＥ８ Ｎ１１３Ｓの様々な希釈を使用することによって得られたシグナルを示し、点線は抗融合後抗体ＭＦ１の様々な希釈を使用することによって得られたシグナルを示す。（Ｇ）において、上方の線は抗融合前抗体ＭＰＥ８ Ｎ１１３Ｓを用いて得られたシグナルを示し、下方の線は抗融合後抗体ＭＦ１を用いて得られたシグナルを示す。 同上。 同上。 同上。 様々なアジュバントと組み合わせた組換えＦタンパク質で免疫したマウスにおける血清ＩｇＧ力価を示す。（ＡおよびＢ）２μｇのｓＦ＿Ａ１＿Ｋ＿Ｌ７で免疫したマウス、（ＣおよびＤ）２μｇのｓＦ＿Ａ１＿ＭＦｕｒで免疫したマウス。 同上。 Ａｄｄａｖａｘ（商標）でアジュバント化した組換えＦタンパク質で免疫したマウスにおける血清ＩｇＧ逆数希釈力価を示す。点線は検出限界を表す。（Ａ）ＩｇＧ_２ａ逆数力価希釈。（Ｂ）ＩｇＧ１逆数力価希釈。 ＩＣ３１（登録商標）でアジュバント化した組換えＦタンパク質で免疫したマウスにおける血清ＩｇＧ逆数希釈力価を示す。点線は検出限界を表す。（Ａ）ＩｇＧ_２ａ逆数力価希釈。（Ｂ）ＩｇＧ１逆数力価希釈。 様々なアジュバントと組み合わせたｓＦ＿Ａ１＿Ｋ＿Ｌ７タンパク質に対して惹起されたマウス血清中の中和抗体力価（ＩＣ_５０、逆数希釈力価）を示す。 （Ａ）Ａｄｄａｖａｘ（商標）または（Ｂ）ＩＣ３１（登録商標）でアジュバント化した組換えＦタンパク質に対して惹起されたマウス血清中の中和抗体力価（ＩＣ_５０、逆数希釈力価）を示す。 組換えＦタンパク質の様々な用量に対して惹起されたマウス血清中の中和抗体力価（ＩＣ_５０、逆数希釈力価）を示す。（Ａ）６μｇのＦタンパク質で免疫したマウス、（Ｂ）２μｇのＦタンパク質で免疫したマウス、（Ｃ）０．６μｇのＦタンパク質で免疫したマウス、（Ｄ）０．２μｇのＦタンパク質で免疫したマウス、および（Ｅ）０．０６μｇのＦタンパク質で免疫したマウス。 Ａｄｄａｖａｘでアジュバント化した２μｇの組換えＦタンパク質で免疫し、その後、野生型ｈＭＰＶでチャレンジしたマウスの肺におけるウイルスＲＮＡ負荷を示す（ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定）。ＡおよびＢは２つの独立した実験を表す。 Ａｄｄａｖａｘ（商標）でアジュバント化した組換えＦタンパク質で免疫し、その後、野生型ｈＭＰＶでチャレンジした後のマウスにおける防御を示す（肺コロニー形成アッセイ）。（Ａ）６μｇのＦタンパク質で免疫したマウス、（Ｂ）２μｇのＦタンパク質で免疫したマウス、（Ｃ）０．６μｇのＦタンパク質で免疫したマウス、（Ｄ）０．２μｇのＦタンパク質で免疫したマウス、および（Ｅ）０．０６μｇのＦタンパク質で免疫したマウス。 同上。 同上。

定義
アジュバント
「アジュバント」によって、おそらく抗原提示細胞の活性化を通じて、抗原特異的免疫応答を特異的または非特異的に強めるために使用される任意の物質が意味される。アジュバントの例には、油エマルジョン（例えば、フロイント完全または不完全アジュバント）、ＩＳＡ５１などのｍｏｎｔａｎｉｄｅ不完全Ｓｅｐｐｉｃアジュバント、ＭＦ５９（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＡＧ）（Ｏｔｔ Ｇ．ｅｔ ａｌ．１９９５．Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ６：２７７－９６）またはＡｄｄａＶａｘ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）などのスクアレンベースの水中油型エマルジョンアジュバント、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）（Ｃｌｕｆｆ ＣＷ．２０１０．Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ６６７：１１１－２３）、アルミニウム塩アジュバント（アラム）（ＷＯ２０１３／０８３７２６に記載されるような）、ポリカチオン性ポリマー、特にポリカチオン性ペプチド、特にポリアルギニンまたは少なくとも２つのＬｙｓＬｅｕＬｙｓモチーフを含むペプチド、特にＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ、規定された塩基の前後関係で、非メチル化シトシン－グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含む免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、例えば、ＣｐＧ １０１８（Ｄｙｎａｖａｘ）（例えば、ＷＯ９６／０２５５５に記載されるような）またはイノシンおよびシチジンに基づくＯＤＮ（例えば、ＷＯ０１／９３９０３に記載されるような）、またはデオキシイノシンおよび／またはデオキシウリジン残基を含むデオキシ核酸（ＷＯ０１／９３９０５およびＷＯ０２／０９５０２７に記載されるような）、特にオリゴ（ｄＩｄＣ）_１３ベースのアジュバントＩＣ３１（登録商標）（Ｖａｌｎｅｖａ ＳＥ）（ＷＯ０４／０８４９３８およびＯｌａｆｓｄｏｔｔｉｒ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６９（３）：１９４－２０２に記載されるような）、向神経活性化合物、特にヒト成長ホルモン（ＷＯ０１／２４８２２に記載される）、ケモカイン（例えば、デフェンシン１または２、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１－α、ＭＩＰ－２、インターロイキン８、またはサイトカイン（例えば、インターロイキン１β、２、６、１０または１２；インターフェロンγ；腫瘍壊死因子α；または顆粒球単球コロニー刺激因子）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）バリアント、細菌毒素の非毒性バリアント、ＱＳ－２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ Ｉｎｃ．）、Ｑｕｉｌｌ Ａ、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミル－Ｌ－アラニン－２－［１，２－ジパルミトイル－ｓ－グリセロ－３－（ヒドロキシホスホリルオキシ）］エチルアミド（ＭＴＰ－ＰＥ）およびＳａｒｋａｒ ｅｔ ａｌ．２０１９．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅ：１８（５）：５０５－５２１に記載されるような他のもの、ならびに組成物、例えば、ＡＦ０３、ＡＳ０１、ＡＳ０３およびＡＳ０４などのアジュバントシステム（Ｇｉｕｄｉｃｅ ｅｔ ａｌ．２０１８．Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３９：１４－２１）が含まれる。ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９受容体を介して免疫学的シグナルを伝達するアジュバントは、Ｔｈ１偏向免疫を促進し、一方、ＴＬＲ２／ＴＬＲ１、ＴＬＲ２／ＴＬＲ６、およびＴＬＲ５を介したシグナル伝達は、Ｔｈ２偏向免疫を促進する。例えば、ＣｐＧ ＯＤＮ、ポリＩＣおよびＭＰＬなどのアジュバントは、優勢にＴｈ１応答を誘導し、アラムは、Ｔｈ２応答の強い誘導物質であり、一方、ＭＦ５９（登録商標）、Ａｄｄａｖａｘ（商標）、およびＩＣ３１（登録商標）は、混合Ｔｈ１およびＴｈ２応答を誘導し得る。アジュバントは、抗原の経路と同じ経路によって、または抗原の経路とは異なる経路によって、抗原とともに投与され得るか、または単独で投与され得る。単一のアジュバント分子は、アジュバントおよび抗原の両方の特性を有し得る。

アミノ酸置換
アミノ酸置換は、ポリペプチド中の１つのアミノ酸の異なるアミノ酸での置き換え、またはアミノ酸なしの置き換え（すなわち、欠失）を指す。本明細書で使用される場合、保存的置換は、例えば、対象に投与されたときに免疫応答を誘導するタンパク質の能力のような、タンパク質の基本的な構造および機能を変更しない置換である。
以下の６つのグループは、互いに保守的置換と考えられる。
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｇ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、
５）ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
非保存的置換は、対象に投与されたときに免疫応答を誘導する能力などの、改変ｈＭＰＶタンパク質の機能の活性を低下させるものである。

抗体
抗体は、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質またはＭＰＶ Ｆタンパク質の抗原性フラグメントなどの抗原に特異的に結合し、それを認識するポリペプチドまたはタンパク質である。「抗体」という用語は、本明細書において最も広義で使用され、それが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体フラグメントを含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。抗体の非限定的な例には、例えば、インタクトな免疫グロブリンおよび抗原に対する結合親和性を保持する当技術分野で知られているそのバリアントおよびフラグメントが含まれる。抗体フラグメントの例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。抗体フラグメントには、抗体全体の改変によって産生された抗原結合フラグメント、または組換えＤＮＡ方法を使用してデノボ合成されたもののいずれもが含まれる（例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ（Ｅｄ），Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌｓ．１－２，２^ｎｄ Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ，２０１０を参照）。

以下の抗体が本発明において使用されている：ＭＰＥ８抗体は、融合後コンフォメーションではなく融合前コンフォメーションのｈＭＰＶ Ｆタンパク質の表面上に存在するエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体である（Ｃｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎａｔｕｒｅ，５０１：４３９－４４３を参照）。ＭＰＥ８抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列は、ＧｅｎＢａｎｋにそれぞれアクセッション番号ＡＧＵ１３６５１．１およびＡＧＵ１３６５２．１で寄託されている。ＭＦ１抗体は、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，２０１５（Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２４：１－８）に記載されているように、融合後ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の６ＨＢドメインを認識する。Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２００７（Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１（１５）：８３１５－２４）に記載されるＤＳ７抗体は、融合前および融合後の両方のｈＭＰＶ Ｆタンパク質コンフォメーションに結合する。

空洞充填変異（または置換）
空洞充填変異は、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質のタンパク質コア内の空洞を充填するアミノ酸置換である。空洞は、本質的に、アミノ酸またはアミノ酸側鎖が存在しない、折りたたまれたタンパク質内の空隙である。いくつかの実施形態では、空洞充填アミノ酸置換は、融合前コンフォメーションに存在するｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインコア中の空洞を充填するために導入される。

フォールドンドメイン
フォールドンドメインは、三量体構造を天然に形成するアミノ酸配列であり、三量体化ヘルパードメインともいわれ得る。いくつかの例では、フォールドンドメインは、抗原が三量体を形成するように、開示される組換えタンパク質のアミノ酸配列中に含まれ得る。一例では、フォールドンドメインは、例えば、ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦ（配列番号１０）と記載されるアミノ酸配列を含むＴ４バクテリオファージ由来フォールドンドメインである。例えば、フォールドンドメインは、例えばフォールドンドメインに隣接するトロンビン切断部位の組み込みによって、精製タンパク質から切断され得る。

グリコシル化部位
グリコシル化部位は、グリカンの付着を受ける、タンパク質などのポリペプチドの表面上のアミノ酸配列である。Ｎ結合型グリコシル化部位は、ＮＸ（Ｓ／Ｔ）のトリプレット配列であり、ここで、Ｎはアスパラギンであり、Ｘはプロリン以外の任意の残基であり、（Ｓ／Ｔ）はセリンまたはスレオニン残基である。グリカンは、多糖またはオリゴ糖である。グリカンはまた、糖タンパク質、糖脂質、またはプロテオグリカンなどの複合糖質の糖質部分を指すために使用され得る。

異種
「異種」という用語は、異なる遺伝源を起源とすることを意味する。タンパク質またはウイルスに対して異種のアミノ酸配列は、その中でそれが存在するかまたは発現されるタンパク質またはウイルス以外の供給源を起源とする。１つの特定の非限定的な例では、組換えポリペプチドにおいて２つのドメインの間に存在する異種ペプチドリンカーは、野生型ポリペプチドにおいてそれら２つのドメインの間の天然には存在しないペプチド配列を指し、例えば、ペプチドリンカーは、組換えポリペプチドにおいて２つのドメインを連結する人工配列である。

相同
相同タンパク質は、類似の構造および機能を有し、例えば、２つ以上の種またはウイルス株において類似の構造および機能を有する２つ以上の種またはウイルス株からのタンパク質である。相同タンパク質は、類似のタンパク質折りたたみ特性を共有し、構造ホモログとみなされ得る。相同タンパク質は、典型的には、高度の配列保存、例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、または少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列保存、および高度の配列同一性、例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、または少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有する。

ｈＭＰＶ Ｆタンパク質
ｈＭＰＶ Ｆ（融合）タンパク質は、ウイルス膜と細胞膜との融合を促進するエンベロープ糖タンパク質である。天然では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、およそ５４０アミノ酸長の単一ポリペプチド前駆体として合成され、これには、そこでシグナルペプチドが切断される小胞体への局在化を指示するＮ末端シグナルペプチド（およそ最初の１８残基）が含まれる。Ｆ０と名付けられる残りのポリペプチドは、Ｆタンパク質単量体（プロトマー）を構成し、これは、配列番号１のネイティブＦタンパク質配列における１０２位と１０３位との間のプロテアーゼ切断部位でプロセシングされ、２つのジスルフィド結合されたフラグメント、Ｆ１およびＦ２を生成する。Ｆ２フラグメントは、Ｆ前駆体のＮ末端部分を起源とし、配列番号１のおよそ残基１９～１０２を含む。これらのフラグメントのうちの大きい方であるＦ１は、細胞外／管腔領域（残基１０３～４９０）、膜貫通ドメイン（残基４９１～５１３）、およびＣ末端の細胞質ドメイン（残基５１４～５３９）を含むＦ前駆体のＣ末端部分（配列番号１のおよそ残基１０３～５３９）を含む。ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の細胞外部分はＦ外部ドメインであり、これにはＦ２ドメイン（およそｈＭＰＶ Ｆタンパク質の１９位～１０２位）およびＦ１外部ドメイン（およそｈＭＰＶ Ｆタンパク質の１０３位～４９０位）が含まれる。３つのＦ２－Ｆ１プロトマーは、成熟Ｆタンパク質三量体においてオリゴマー化し、これは、標的細胞膜との接触に際して融合後コンフォメーションへのコンフォメーション変化を受けるように誘発される準安定融合前コンフォメーションを取る。このコンフォメーション変化は、Ｆ１ドメインのＮ末端に位置する融合ペプチド（ＦＰ）として知られる疎水性配列を露出させ、これは宿主細胞膜と結合し、ウイルスまたは感染細胞の、膜の標的細胞膜との融合を促進する。３つのｈＭＰＶ Ｆ外部ドメインは、３つのｈＭＰＶ Ｆプロトマーのタンパク質複合体を形成し得る。本発明は、改変ｈＭＰＶ Ｆタンパク質またはそのフラグメント、すなわち、融合前コンフォメーションを安定化させる、野生型の、ネイティブなまたは天然起源のｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列に関して非天然のアミノ酸変異を１つ以上含む組換えポリペプチドに関する。

ｈＭＰＶ Ｆ０ポリペプチド
Ｆ０ポリペプチドは、シグナルペプチドの切断後に残るｈＭＰＶ Ｆタンパク質の前駆体であり、これは、Ｆ１細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびサイトゾル側末端を含むＦ２ドメインおよびＦ１ドメインで構成される。ネイティブＦ０ポリペプチドは、Ｆ１とＦ２とを分離するプロテアーゼ切断部位（配列番号１のおよそ１０２位と１０３位との間）でプロセシングされ、Ｆ１およびＦ２ポリペプチドフラグメント（ドメイン）をもたらす。

ｈＭＰＶ Ｆ１ドメイン
ｈＭＰＶ Ｆ１ドメインは、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質のアミノ酸配列の一部である。本明細書で使用される場合、「Ｆ１ドメイン」は、ネイティブＦ１配列、および、改変（例えば、アミノ酸の置換、挿入、または欠失）を含むＦ１配列の両方を指す。ネイティブＦ１ドメイン（配列番号３）は、ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質のおよそ残基１０３～５３９を含み、（Ｎ末端からＣ末端へ）細胞外／管腔領域（配列番号１の残基１０３～４９０）、膜貫通ドメイン（配列番号１の残基４９１～５１３）、およびＣ末端のサイトゾルドメイン（配列番号１の残基５１４～５３９）を含む。いくつかの実施形態は、ネイティブＦ１配列から改変されたＦ１ドメイン、例えば、融合ペプチド（例えば、配列番号１の残基１０３～１１８）を欠くＦ１ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆ１ドメインは、Ｆ１外部ドメインであり、すなわち、膜貫通およびサイトゾルドメインを欠き、例えば、Ｆ１ドメインは、配列番号１の残基１０３～４９０または１１９～４９０に対応する。さらなる実施形態では、Ｆ１ドメインは、融合前コンフォメーションの組換え単鎖Ｆタンパク質（Ｆ１ドメインを含む）を安定化させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。

ｈＭＰＶ Ｆ２ドメイン
ｈＭＰＶ Ｆ２ドメインは、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質のアミノ酸配列の一部である。本明細書で使用される場合、「Ｆ２ドメイン」は、ネイティブＦ２ポリペプチド、および、ネイティブ配列からの改変（例えば、アミノ酸置換）、例えば、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質融合前コンフォメーションの組換えＦタンパク質（改変Ｆ２ポリペプチドを含む）を安定化させるように設計された改変を含むＦ２ポリペプチドの両方を指す。ネイティブＦ２ドメイン（配列番号２）は、配列番号１のおよそ残基１９～１０２を含む。ネイティブ成熟ｈＭＰＶ Ｆタンパク質において、Ｆ２ドメインは２つのジスルフィド結合によってＦ１ドメインに連結される。

ｈＭＰＶ融合ペプチド（ＦＰ）
ｈＭＰＶ融合ペプチドは、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質のアミノ酸配列の一部である。融合ペプチドは、配列番号１の残基１０３～１１８、すなわち、配列番号３のＦ１ドメインのＮ末端の残基１～１６であり得る。

ｈＭＰＶ Ｆタンパク質融合前コンフォメーション
ｈＭＰＶ Ｆタンパク質融合前コンフォメーションは、融合後コンフォメーションへのｈＭＰＶ Ｆタンパク質の移行および分泌系における成熟ｈＭＰＶ Ｆタンパク質へのその後のプロセシングを導く融合事象の誘発前に、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質によって取られる構造コンフォメーションである。例示的な融合前コンフォメーションのｈＭＰＶ Ｆタンパク質の三次元構造は、本明細書において、そして例えばＷＯ２０１６／１０３２３８において考察されている。ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションは、他のパラミクソウイルス（ＲＳＶなど）のＦタンパク質の融合前コンフォメーションと全体構造が類似しているが、いくつかの重要な差異がある。いくつかの実施形態では、融合前コンフォメーションで安定化された組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、融合後コンフォメーションではなく融合前コンフォメーションのｈＭＰＶ Ｆタンパク質の三量体形態に特異的な抗体（ＭＰＥ８抗体など、ＷＯ２０１６／１０３２３８を参照）に特異的に結合する。

単鎖ｈＭＰＶ Ｆタンパク質
本発明の単鎖ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、（改変）ｈＭＰＶ Ｆ１ドメインおよび（改変）ｈＭＰＶ Ｆ２ドメインを含む単一のポリペプチド鎖として発現される組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメイン（本明細書で単鎖ポリペプチドとしても使用される）である。単鎖ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、典型的には、三量体化して、三量体ｈＭＰＶ Ｆタンパク質サブユニットを形成し得、これは優先的に三量体化ヘルパードメイン、例えばフォールドンに融合される。いくつかの実施形態では、組換え単鎖ｈＭＰＶ Ｆポリペプチドは、Ｆ１ドメインとＦ２ドメインとの間のプロテアーゼ切断部位を含まず、細胞中で産生されたときに別個のＦ１ドメインおよびＦ２ドメインポリペプチドに切断されない。一実施形態では、Ｆ１ドメインおよびＦ２ドメインは、異種ペプチドリンカーと連結されて、単鎖構築物を生成する。

免疫応答
免疫応答は、刺激に対するＢ細胞、Ｔ細胞、または単球などの免疫系の細胞の応答である。一実施形態では、応答は特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。一実施形態では、免疫応答は、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答などのＴ細胞応答である。別の実施形態では、応答は、Ｂ細胞応答であり、特異的抗体の産生をもたらす。「免疫応答のプライミング」は、後に投与される免疫原性薬剤に対する所望の免疫応答を増加させるための、アジュバントでの対象の前処置を指す。「免疫応答の増強」は、アジュバントおよび免疫原性薬剤の同時投与を指し、ここで、アジュバントは、アジュバントの非存在下での対象への免疫原性薬剤の投与と比較して、免疫原性薬剤に対する所望の免疫応答を増加させる。

免疫原
免疫原は、動物における抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質であり、動物中に注射または吸収される組成物を含む。免疫原は、開示される組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質などの異種抗原によって誘導されるものを含む、特異的体液性または細胞性免疫の産物と反応する。免疫原は、１つ以上のエピトープを含み得る。いくつかの実施形態では、免疫原は、病原体に感染したかまたは感染するリスクのある哺乳動物などの哺乳動物において免疫応答を誘導することができる、組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質もしくはその免疫原性フラグメント、組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質もしくはその免疫原性フラグメントを含むタンパク質ナノ粒子もしくはウイルス様粒子、または組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質もしくはその免疫原性フラグメントをコードする核酸もしくはベクターであり得る。対象への免疫原の投与は、目的の病原体に対する防御免疫および／または先取的免疫を導き得る。

免疫原性組成物
免疫原性組成物は、免疫原上に含まれるか、または免疫原中に含まれる核酸分子によってコードされる、抗原に対する測定可能なＣＴＬ応答を誘導するか、または抗原に対する測定可能なＢ細胞応答（抗体の産生など）を誘導する免疫原を含む組成物である。一例では、免疫原性組成物は、対象に投与されたときに、ｈＭＰＶウイルスに対する測定可能なＣＴＬ応答を誘導するか、またはｈＭＰＶ Ｆタンパク質に対する測定可能なＢ細胞応答（抗体の産生など）を誘導する、開示される組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質またはその免疫原性フラグメントを含む組成物である。免疫原性組成物は、免疫原性タンパク質を発現させるために、したがってこのタンパク質に対する免疫応答を誘発するために使用され得る免疫原性タンパク質をコードする単離された核酸を含み得る。したがって、別の例では、免疫原性組成物は、対象に投与されたときに、ｈＭＰＶウイルスに対する測定可能なＣＴＬ応答を誘導するか、またはｈＭＰＶ Ｆポリペプチドに対する測定可能なＢ細胞応答（抗体の産生など）を誘導する、開示される組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質またはその免疫原性フラグメントをコードする核酸分子を含む組成物である。インビボでの使用のために、免疫原性組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体中に、免疫原性ポリペプチド、または免疫原性ポリペプチドをコードする核酸分子を含み、アジュバントなどの他の薬剤も含み得る。開示される組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質などの任意の特定のポリペプチド、またはこのタンパク質をコードする核酸は、当技術分野で認められているアッセイによって、ＣＴＬまたはＢ細胞応答を誘導するその能力について容易に試験され得る。

単離
「単離」された生物学的構成要素は、他の染色体および染色体外ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質などの、それにおいてその構成要素が天然に生じる他の生物学的構成要素などの、他の生物学的構成要素から実質的に分離または精製されている。「単離」されたタンパク質、ペプチドおよび核酸には、標準的な精製方法によって精製されたタンパク質が含まれる。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製されたタンパク質またはペプチド、ならびに化学合成されたタンパク質、ペプチドおよび核酸分子を包含する。単離は絶対的な純度を必要とせず、少なくとも５０％単離された、例えば、少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはさらには９９．９％単離されたがタンパク質、ペプチド、または核酸分子を含み得る。融合前コンフォメーションで安定化された本明細書に開示される改変ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、融合後コンフォメーションのｈＭＰＶ Ｆタンパク質から単離されており、例えば、融合後コンフォメーションのｈＭＰＶ Ｆタンパク質から少なくとも８０％単離されており、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、またはさらには９９．９％単離されている。

リンカー
リンカーは、２つの分子を１つの連続した分子に連結するために、例えば、２つのドメインを単一のポリペプチド中に連結するために使用され得る二機能性分子である。好ましくは、リンカーはペプチドリンカーである。リンカーは、任意の適切な長さ、例えば、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個またはそれ以下のアミノ酸残基であり得る。リンカーは、例えば、アラニン、セリン、グリシン、システインおよび／またはバリン残基を含み得るかまたはそれからなり得る。好ましくは、リンカーは少なくとも１つのシステイン残基を含み得る。

ネイティブ（または天然）タンパク質、配列、またはジスルフィド結合
ネイティブまたは天然（本明細書で交換可能に使用される）ポリペプチド、配列、残基またはジスルフィド結合は、例えば、抗原の抗原性を標的エピトープに集中させるための、またはネイティブタンパク質中には生じないジスルフィド結合をタンパク質に導入するための選択的変異によって改変されていないものである。ネイティブまたは天然タンパク質、残基または配列を、野生型タンパク質、残基または配列ともいう。非ネイティブまたは非天然ジスルフィド結合は、ネイティブタンパク質中に存在しないジスルフィド結合、例えば、遺伝子操作によるタンパク質中への１つ以上のシステイン残基の導入に起因してタンパク質において形成されるジスルフィド結合である。同様に、ドメイン中の非天然システイン残基は、野生型、ネイティブまたは天然配列中のその位置に存在しないシステイン残基である。

中和抗体
中和抗体は、感染性病原体上の特異的抗原に結合することによって感染性病原体の感染力価を低下させる。いくつかの例では、感染性病原体はウイルスである。いくつかの例では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質に特異的な抗体は、ｈＭＰＶの感染力価を中和する。いくつかの実施形態では、中和抗体は、抗原の抗原性表面と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を共有する抗原などの、関連する抗原に結合し、その機能を阻害する。ウイルスなどの病原体由来の抗原に関して、抗体は、病原体の１つより多いクラスおよび／またはサブクラス由来の抗原に結合し、その機能を阻害し得る。例えば、ｈＭＰＶに関して、抗体は、１つより多いグループからのｈＭＰＶ Ｆタンパク質などの抗原に結合し、その機能を阻害し得る。一実施形態では、ｈＭＰＶに対する広く中和する抗体は、それが、循環中の多くの型のｈＭＰＶのうちの高い割合を中和するという点で、ｈＭＰＶに対する他の抗体と異なる。

薬学的に許容される担体
薬学的に許容される担体は、臨床的な投与のために免疫原性ｈＭＰＶ Ｆタンパク質を処方するために使用される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５には、開示される免疫原の医薬送達のために適切な組成物および製剤が記載されている。一般に、担体の性質は、用いられる特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的および生理学的に許容される流体を含む注射用流体を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル形態）について、従来の非毒性固体担体には、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなどの少量の非毒性補助物質を含み得る。対象への投与のために適切な、特定の実施形態では、担体は、所望の抗ＭＰＶ免疫応答を誘導するために適切な組成物の１つ以上の測定された用量を含む単位剤形において無菌であり得、かつ／または、それに懸濁もしくはそうでなければ含有され得る。それはまた、治療目的のためのその使用ための処方を伴い得る。単位剤形は、例えば、無菌内容物を含む密封バイアルもしくは対象中への注射のためのシリンジ中にあるか、またはその後の可溶化および投与のために凍結乾燥されているか、または固体もしくは徐放剤中にあり得る。

ポリペプチド
ポリペプチドは、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化もしくはリン酸化）にかかわらず、任意のアミノ酸鎖である。「ポリペプチド」は、天然起源のアミノ酸ポリマー、および非天然起源のアミノ酸ポリマー、ならびに、その中で１つ以上のアミノ酸残基が非天然アミノ酸、例えば、対応する天然起源のアミノ酸の人工化学模倣物であるものを含むアミノ酸ポリマーに適用される。「残基」は、アミド結合またはアミド結合模倣物によってポリペプチド中に組み込まれるアミノ酸またはアミノ酸模倣物を指す。ポリペプチドは、アミノ末端（Ｎ末端）およびカルボキシ末端（Ｃ末端）を有する。「ポリペプチド」は、ペプチドまたはタンパク質と交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で使用される。多くの場合では、１つ以上のポリペプチドは、表面露出アミノ酸残基および非表面露出アミノ酸残基を含む特定の三次元構造に折りたたまれ得る。いくつかの場合では、タンパク質は、機能単位中に一緒に折りたたまれる複数のポリペプチドを含み得る。例えば、細胞表面上の成熟ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、多量体タンパク質に三量体化する３つのＦ２／Ｆ１ヘテロ二量体を含む。「表面露出アミノ酸残基」は、例えば、タンパク質が溶液中にあるときにそれが溶媒と接触できるように、タンパク質の表面上でのある程度の露出を有するアミノ酸である。対照的に、非表面露出アミノ酸は、タンパク質が溶液中にあるときにそれが溶液と接触しないように、タンパク質の表面上に露出されないアミノ酸残基である。いくつかの例では、非表面露出アミノ酸残基は、タンパク質コアの一部である。

組換えポリペプチドまたはタンパク質
組換えポリペプチド（またはタンパク質）は、天然起源でない配列を有するか、または２つのそうでなければ分離されている配列セグメントの人工的な組み合わせによって作製される配列を有するものである。この人工的な組み合わせは、化学合成によって、またはより一般的には、例えば遺伝子操作技術による、アミノ酸残基の単離されたセグメントの人工的な操作によって達成され得る。いくつかの実施形態では、組換え単鎖ポリペプチドは、細菌細胞または真核細胞などの宿主細胞中に導入された異種（例えば、組換え）核酸によってコードされる。核酸は、例えば、導入された核酸によってコードされるタンパク質を発現することができるシグナルを有する発現ベクター上で導入され得るか、または核酸は、宿主細胞染色体中に組み込まれ得る。

配列同一性 配列同一性は、パーセンテージ同一性に関して頻繁に測定され、パーセンテージが高ければ高いほど、２つの配列はより同一である。ポリペプチドのホモログ、オルソログ、またはバリアントは、標準的な方法を使用して整列されたときに比較的高度の配列同一性を持つ。

比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野でよく知られている。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４，１９８８）、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ（Ｇｅｎｅ，７３：２３７－４４，１９８８）、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ（ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－３，１９８９）、Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０８８１－９０，１９８８）、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８：１５５－６５，１９９２）、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２４：３０７－３１，１９９４）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０）に記載されており、これらは配列アラインメント方法およびホモロジー計算の詳細な考察を提示している。一旦整列されると、一致の数は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を計数することによって決定される。パーセント配列同一性は、一致の数を、同定された配列において示された配列の長さ、または明示された長さ（同定された配列において示された配列からの１００個の連続するヌクレオチドもしくはアミノ酸残基など）のいずれかで割り、続いて、得られる値に１００を掛けることによって決定される。好ましくは、パーセンテージ配列同一性は、配列の全長にわたって決定される。例えば、１５５４個のアミノ酸を有する試験配列と整列させられたときに１１６６個の一致を有するペプチド配列は、試験配列に対して７５．０パーセント同一である（１１６６÷１５５４＊１００＝７５．０）。パーセント配列同一性の値は、最も近い１０分の１に四捨五入される。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３、および７５．１４は、７５．１に切り捨てられ、一方、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８、および７５．１９は、７５．２に切り上げられる。長さの値は常に整数である。

ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．１９９０．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３）は、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を含むいくつかの供給源から、そしてインターネット上で、配列分析プログラムＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮおよびＴＢＬＡＳＴＸに関連した使用のために利用可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は、インターネット上のＮＣＢＩ Ｗｅｂサイトで入手可能である。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムはまた、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９７７）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センターを通じて公開されている（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較を使用する。ＢＬＡＳＴＰプログラム（アミノ酸配列用）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、および期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ．１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９を参照）。

ポリペプチドのホモログおよびバリアントは、典型的には、参照配列の少なくとも５０個、１００個、１５０個、２５０個、５００個のアミノ酸残基にわたって、参照配列の全長にわたって、または目的の参照アミノ酸配列との全長アラインメントにわたって計数される、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を持つことによって特徴付けられる。参照配列に対するさらに高い類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価されたときに、漸増するパーセンテージの同一性、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を示す。核酸配列の配列比較について、典型的には、１つの配列は、それに対して試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列と参照配列とがコンピューターに入力され、必要に応じてサブシーケンス座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォルトのプログラムパラメータが使用される。

有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１－３６０，１９８７）のプログレッシブアラインメント方法の簡易化を使用する。使用される方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ（ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３，１９８９）によって記載される方法と類似している。ＰＩＬＥＵＰを使用して、参照配列は他の試験配列と比較されて、以下のパラメーターを使用してパーセント配列同一性関係が決定される：デフォルトギャップ重み（３．００）、デフォルトギャップ長重み（０．１０）、および重み付きエンドギャップ。ＰＩＬＥＵＰは、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージ、例えば、バージョン７．０から入手することができる（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．１９８４．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７－３９５）。

本明細書で使用される場合、「少なくとも８０％の同一性」への言及は、特定される参照配列に対する、例えば、参照配列の少なくとも５０個、１００個、１５０個、２５０個、５００個のアミノ酸残基に対する、または配列の全長に対する、「少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはさらには１００％の同一性」を指す。本明細書で使用される場合、「少なくとも９０％の同一性」への言及は、特定される参照配列に対する、例えば、参照配列の少なくとも５０個、１００個、１５０個、２５０個、５００個のアミノ酸残基に対する、または配列の全長に対する、「少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはさらには１００％の同一性」を指す。

治療有効量
治療有効量は、開示される免疫原または免疫原性組成物などの薬剤の、障害または疾患の症状および／または基礎をなす原因を予防する、治療する（予防を含む）、軽減するかつ／または寛解させるために、例えば、ｈＭＰＶ感染を予防、抑制、および／または治療するために十分な量である。いくつかの実施形態では、治療有効量は、ｈＭＰＶ感染などの疾患の症状を軽減または除去するために十分である。例えば、これは、ウイルス複製を阻害または防止するために、またはウイルス感染の外観上の症状を測定可能に変更するために必要な量であり得る。一般に、この量は、ウイルスの複製または感染性を測定可能に阻害するために十分である。一例では、所望の応答は、ｈＭＰＶ感染を抑制、低減、または予防することである。方法が有効であるためには、感染が完全に除去、軽減、または予防される必要はない。例えば、治療有効量の薬剤の投与は、感染（細胞の感染によって、または感染した対象の数もしくはパーセンテージによって測定される）を所望の量だけ、例えば、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらには少なくとも１００％（検出可能なｈＭＰＶ感染の除去または予防）だけ減少させることができる。

病原体に対する防御免疫応答を得るために、免疫原性組成物の複数の投与が必要とされ得ることが理解される。したがって、治療有効量は、防御免疫応答の達成に、その前または後の投与との組み合わせで寄与する、分割用量を包含する。例えば、治療有効量の薬剤を、治療（プライムブーストワクチン接種治療など）の過程の間に、例えば毎日、単一の用量で、またはいくつかの用量で投与することができる。しかしながら、治療有効量は、治療される対象、治療される状態の重症度および型、ならびに投与方法に依存し得る。薬剤の単位剤形は、治療量で、または治療量の倍数で、例えば、バイアル（例えば、貫通可能な蓋付き）または無菌構成要素を有するシリンジ中に包装され得る。

ワクチン
ワクチンは、対象において予防的または治療的免疫応答を誘発する医薬組成物である。いくつかの場合では、免疫応答は防御免疫応答である。典型的には、ワクチンは、病原体、例えばウイルス病原体の抗原に対する、または病態と相関する細胞成分に対する抗原特異的免疫応答を誘発する。ワクチンは、ポリヌクレオチド（開示される抗原をコードする核酸など）、ペプチドもしくはポリペプチド（開示される抗原など）、ウイルス、細胞または１つ以上の細胞成分を含み得る。１つの特定の非限定的な例では、ワクチンは、対照と比較して、ｈＭＰＶ感染に関連する症状の重症度を軽減し、かつ／またはウイルス負荷を減少させる。別の非限定的な例では、ワクチンは、対照と比較して、ｈＭＰＶ感染を低下させる。

ホモロジーモデリング
一態様では、本開示は、融合前コンフォメーションで安定化された新規な改変ｈＭＰＶ Ｆタンパク質を提供する。本開示はまた、結晶構造およびホモロジーモデリングに基づいて、安定化された融合前Ｆタンパク質を生成するための方法を提供する。安定化させる改変の構造基盤の分析のために、ｈＭＰＶの利用可能な融合タンパク質および相同融合タンパク質の一連の構造を使用した。とりわけ、融合前ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメイン（ＰＤＢ：５ＷＢ０）および融合後ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメイン（ＰＤＢ：５Ｌ１Ｘ）の結晶構造モデル、融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質外部ドメイン（ＰＤＢ：４ＤＡＢ）および融合後ＲＳＶ Ｆタンパク質外部ドメイン（ＰＤＢ：３ＲＲＲ）の結晶構造モデル。フォールドンドメインの使用によるいわゆる三量体化ヘルパードメインを、ＰＤＢ：２ＩＢＬ、１ＯＸ３、および１ＡＶＹにおける構造データに基づくホモロジーモデルにモデル化した。

ネイティブ成熟ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、２つのジスルフィド結合によって共有結合される２つのポリペプチドＦ２およびＦ１から構成される。成熟プロセスには、トリプシン様プロテアーゼによるＦ０前駆体の１つの切断が含まれ、その結果、Ｆ１ドメインの遊離Ｎ末端、融合ペプチドＦＰが生成され、これは、標的細胞膜と相互作用し、コンフォメーション変化を誘発する。切断後、Ｆ１のＣ末端部分の、内部三量体空洞の疎水性領域中への再配置が起こる。これにより、誘発事象が融合後コンフォーマーへのリフォールディングを開始するまで、準安定融合前状態の安定性が増強され得る（図２を参照）。融合前コンフォメーションにおいて、ＨＲＡ含有領域は屈曲させられ、ヘッドドメインに結合し、一方、融合後コンフォメーションにおいて、それは長い突出したヘリックスの一部である。融合前から融合後への移行には、Ｆ１サブユニットのヘプタッドリピートＡ（ＨＲＡ）配列の、１つの長いαヘリックスへのリフォールディング、およびＨＲＡのＮ末端の先端に位置する融合ペプチド（ＦＰ）の細胞膜中への挿入が含まれる。このリフォールディングは、ＨＲＡおよびＨＲＢ配列の安定な６ヘリックスバンドルへのアセンブリを促進し、これは、膜融合を推進する。

単鎖Ｆタンパク質
安定化された融合前コンフォメーションを取得し、同時にネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質に対する最大の構造類似性を維持することを目指して、単鎖Ｆタンパク質のモデリングを実行した（図３を参照）。Ｆ１とＦ２との間の切断部位の欠失は、融合前コンフォーマーを安定化させるであろうことが推定された。また、１つの切断ステップの除去は、組換えタンパク質の産生プロセスのために有利である。トリプシン様認識モチーフＲＱＳＲは、配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列の９９位～１０２位にわたり、切断は、１０２位の第２のアルギニン（Ｒ１０２）の直後で起こる。切断の除去は、切断部位における少なくとも１つの変異によって、好ましくは１０２位のアルギニンの置換によって達成され得る。特に、Ｒ１０２は、グリシンまたは別の適切なアミノ酸残基に置換され得る。特に、本発明の一実施形態では、トリプシン切断部位は、１０２位のアルギニンのグリシンへの置換（Ｒ１０２Ｇ）によって除去される。

単鎖Ｆ外部ドメインのネイティブ融合前ｈＭＰＶ Ｆタンパク質に対する３Ｄ構造類似性を達成するために、Ｆ１ドメインとＦ２ドメインとの間のループを設計した。一実施形態では、ループは、異種ペプチドリンカーの挿入によって構築される。好ましい実施形態では、リンカーのサイズおよび組成は、抗原の安定性、抗体結合の質および収量について最適化される。一実施形態では、リンカーの長さは、２～１０アミノ酸残基、好ましくは２～５残基、より好ましくは３～５残基、さらにより好ましくは４または５残基、最も好ましくは５残基であり得る。別の実施形態では、リンカーは、配列番号１の９５位～１０２位のアミノ酸残基の間に、好ましくは１０２位に、最も好ましくは１０２位におけるグリシン残基に挿入され得る。

いくつかの実施形態では、リンカーは、１つ以上のシステイン、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、バリンおよび／またはセリン残基から構成され得る。リンカーは、１つ、２つ、または３つのアラニン残基、１つまたは２つのバリン残基、および１つまたは２つのグリシン残基を含み得る。例えば、アラニンはリンカーの１位、２位、３位、４位、および／または５位にあり得、グリシンはリンカーの２位、３位および／または４位にあり得、バリンは、好ましくは、リンカーの３位および／または５位にあり得る。リンカーのいくつかの非限定的な例を、Ｆ２およびＦ１の追加の改変と一緒に表１に提供する。

好ましい実施形態では、リンカーは、少なくとも１つの（例えば、１つの）システイン残基を含む。システインは、リンカーの任意の位置、好ましくは配列番号１の１０３位および１０５位に対応する１位または３位にあり得る。より好ましくは、システインは、配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列の１０３位に対応するリンカーの１位（すなわち、リンカーのＮ末端、好ましくはＦ２ドメインに隣接する）にある。さらにより好ましくは、リンカーは、ＣＧＡＧＡ、ＣＧＡＧＶ、ＣＧＡＡＶ、ＡＧＣＧＡ、ＣＡＡＡＶ、ＣＡＡＦＶまたはＣＧＡＧＡである。最も好ましい実施形態では、リンカーはＣＧＡＧＡ（配列番号４）である。

いくつかの実施形態では、単鎖Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションは、少なくとも１つの非天然プロトマー内またはプロトマー間ジスルフィド結合を導入することによって共有結合的に安定化され得る。例えば、非天然ジスルフィド結合は、Ｆ２ドメインとＦ１ドメインとの間に位置する異種ペプチドリンカーのシステイン残基とＦ１ドメインのシステイン残基との間に導入され得る。第１のシステイン残基は、当該リンカーの任意の位置、例えば、１位、２位、３位または４位、好ましくは、配列番号１の１０３位に対応する１位にあり得る。あるいは、第１のシステイン残基は、Ｆ２ドメイン中、配列番号１の９６位、または１０１位、または１０２位に導入され得る。最も好ましい実施形態では、１０３位のシステインは、配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆ配列の３３８位のアラニンのシステイン置換と非天然ジスルフィド結合を形成する。このＳＳ結合は、疎水性三量体空洞内にＦ２とＦ１との間のループを固定することによって単鎖Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションを安定化させ得る。そのようなループ固定は、ネイティブｈＭＰＶタンパク質におけるＦ１のインターナライズされ切断されたＮ末端のポジショニング効果を模倣する。いくつかの実施形態では、単鎖ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、非ネイティブプロトマー間ジスルフィド結合を導入して、例えば、それを共有結合することによってタンパク質三量体を安定化させることができるさらなるシステイン置換を含み得る。

さらに１つの実施形態では、単鎖ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、融合ペプチドＦＰの全体または部分配列を包含する、配列番号３のＦ１ドメインのＮ末端におけるアミノ酸残基１～１６を欠く。好ましくは、単鎖ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列の１０３位～１１８位のアミノ酸残基を欠く。ＦＰの欠失は、単鎖ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションをさらに安定化させる。

いくつかの実施形態では、単鎖ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、１つ以上のさらなる改変を含み得る。一方で、追加の改変は、単鎖ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の変更されたジオメトリを補償し得る。他方で、追加の改変は、融合前コンフォメーションをさらに安定化させ得る。追加の改変は、１つ以上のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を含み得る。改変の中で、保守的置換が（必ずしもそうではないが）好ましくあり得る。以下の置換のグループは保守的と考えられる。
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｇ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、
５）ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

一実施形態では、単鎖ｈＭＰＶ Ｆタンパク質を安定化させる追加の改変は、配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列の９７位のアスパラギン残基のグルタミン残基への置換（Ｎ９７Ｑ）である。

別の実施形態では、単鎖Ｆ外部ドメインの追加の改変は、配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列に対する４９位、６７位、１３７位、１５９位、１４７位、１６０位、１６１位および／または１７７位での置換を含むがこれらに限定されない、１つ以上の空洞充填置換を含み得る。特に、空洞充填置換は、Ｔ４９Ｍ置換、Ｉ６７Ｌ置換、Ｉ１３７Ｗ置換、Ａ１４７Ｖ置換、Ａ１５９Ｖ置換、Ｔ１６０Ｆ置換、Ａ１６１Ｍ置換、またはＩ１７７Ｌ置換から選択され得るが、これらに限定されない。さらに、２つ以上の空洞充填置換の組み合わせが可能である。１つの特定の実施形態では、組み合わせは、Ｔ１６０ＦおよびＩ１７７Ｌ置換を含む。別の特定の実施形態では、組み合わせは、Ｔ４９Ｍ、Ｉ６７ＬおよびＡ１６１Ｍ置換を含む。さらなる特定の実施形態では、組み合わせは、Ｔ４９Ｍ、Ａ１６１Ｍ、Ｉ１３７Ｗ、Ａ１４７Ｖ、Ａ１５９ＶおよびＩ１７７Ｌ置換を含む。

空洞充填によるＨＲＡα３の剛性化。ネイティブな切断されたＦタンパク質において、Ｆ１のＮ末端部分は、ＨＲＡ含有ドメインを有し、これは、熱力学的により安定な融合後Ｆタンパク質においては長く伸びたヘリックスであるが、融合前コンフォメーションにおいては、ベータヘアピンエレメントを有していても、いくつかの異なる小さなヘリックスを有して折りたたまれている（「荷重されたばね」）。このエレメントのさらなる接触は、融合前コンフォメーションでのタンパク質の安定化を可能にし得る。ＨＲＡα３の下の空洞を充填するために、２つの小さな残基をＴ４９ＭおよびＡ１６１Ｍの位置で空間充填脂肪族残基であるメチオニンに置き換えて、一緒にパックする相補的ペアを形成し、この表面に位置するヘリックスの脂肪族固定を強化した。１６１位での変異は、ｈＭＰＶ Ｆ融合前外部ドメインについて、Ｂａｔｔｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７によって、非発現Ｆタンパク質サブユニット（Ａ１６１Ｆ）、またはＭＰＥ８抗体と弱く反応するサブユニット（Ａ１６１Ｌ）のいずれかを導くことが報告されている（Ｂａｔｔｌｅｓ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８（１）：１５２８）。

ジスルフィド結合によるＨＲＡα４の共有結合。ＨＲＡα４は、Ｆタンパク質の先端まで伸び、融合前構造においてＨＲＡα３に続くベータヘアピンエレメントのＣ末端に位置している。これらのエレメントはすべて、融合後コンフォメーションにおける長いアルファヘリックスエレメントへの変換に関与し、これは、ウイルスの融合プロセスにおけるヘッドドメインから宿主細胞膜に向けての移動を含む。ここで、ジスルフィド架橋を、ＨＲＡα４ヘリックスエレメント（Ｋ１６６Ｃ）からＦ２部分によって提供される長いベータストランド（Ｅ５１Ｃ）への間に導入する。この変化は、ＨＲＡα３への接触を含む極性ネットワークに関与する２つの荷電残基を改変する。追加の改変、Ｓ２６６Ｄを導入して、このジスルフィド結合形成変異による塩橋ネットワークの障害の部分的な再構成を可能にした。

トリプトファンの導入によるＨＲＡα２－α３の剛性化。ＨＲＡα２－α３は、融合前ｈＭＰＶ Ｆタンパク質上に屈曲した下部構造を形成する（融合後コンフォメーションでは一部長いヘリックスであるが）。この屈曲の剛性化は、融合後コンフォメーションへの変換を妨害するであろう。この屈曲について、例えば、ヘパリンに結合している切断されたプロテインＣ阻害剤のＮ末端部分の結晶構造において、同様に折りたたまれた下部構造が観察され得、ここで、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質のＩ１３７は、アナログの位置においてトリプトファンであり、より密にパックされた下部構造を提供する（ＰＤＢ：３ＤＹ０、Ａ鎖のＷ２７１）。ホモロジーモデリングおよび分子シミュレーションに基づいて、２つのさらなる変異Ａ１４７ＶおよびＡ１５９Ｖを導入して、この下部構造における追加の空間補充を提供して、トリプトファン側鎖をプロテインＣ阻害剤の構造において観察される方向に強制した。これは、Ｓ１４９（プロテインＣ阻害剤においてはアスパラギン）への極性接触によるトリプトファン側鎖アミドのさらなる安定化を可能にする。また、Ａ１４７およびＡ１５９に対するアナログの位置は、空間充填側鎖を有する残基を提供する。

いくつかの実施形態では、単鎖ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、１つ以上のさらなる安定化置換、例えば、非天然水素結合、バリアントコアパッキングまたは塩橋の形成を導く置換を含み得る。特に、改変単鎖ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、Ｅ８０Ｎ、Ｆ２５８Ｉおよび／またはＧ２９４Ｅ置換を含み得る。Ｅ８０Ｎ置換は、Ｄ２２４’（プライムは隣接するプロトマーを示す）へのプロトマー間Ｈ結合を確立し、Ｄ２０９との反発を低下させ得る。一方、Ｅ８０Ｎ置換は、単鎖ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の組換え発現を増強する。組換えタンパク質の収量の増加を補助する別の改変は、Ｇ２９４Ｅ置換である。

いくつかの実施形態では、近接する残基Ｉ４８０およびＬ４８１のシステイン残基への置換は、共有環の形態の３つのプロトマーにわたる３つのジスルフィド結合の導入を可能にする。共有結合した三量体は、フォールドン三量体化粒子よりも安定であると考えられる。機能的な環の形成は、３つすべてのジスルフィド結合が、または複数の環の場合は各プロトマー間の少なくとも１つのジスルフィド結合が、形成されることを必要とする。フォールドンドメインまでのリングの距離は短く、フォールドンの付着位置は、より剛性のジオメトリのために最適化される。

好ましい実施形態では、置換の組み合わせは以下の通りである：
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２ＧおよびＧ２９４Ｅ（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３）（例えば、配列番号５に存在するような）
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７ＬおよびＧ２９４Ｅ（ｓＦ＿Ａ１＿Ｋ＿Ｌ７）（例えば、配列番号６に存在するような）、
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ４９Ｍ、Ｉ６７Ｌ、Ａ１６１Ｍ、Ｅ８０Ｎ、Ｆ２５８ＩおよびＧ２９４Ｅ（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３１）（例えば、配列番号７に存在するような）、
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ４９Ｍ、Ｉ６７Ｌ、Ａ１６１Ｍ、Ｅ５１Ｃ、Ｋ１６６Ｃ、Ｓ２６６Ｄ、Ｇ２９４Ｅ、Ｉ４８０ＣおよびＬ４８１Ｃ（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３３）（例えば、配列番号８に存在するような）、ならびに
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ４９Ｍ、Ａ１６１Ｍ、Ｉ１３７Ｗ、Ａ１５９Ｖ、Ａ１４７Ｖ Ｉ１７７ＬおよびＧ２９４Ｅ（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿４．２）（例えば、配列番号９に存在するような）。

タンパク質三量体
いくつかの実施形態では、本発明の改変単鎖ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、それが膜貫通ドメインおよび細胞質側末端を持たないという点で、ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質と異なる。それにもかかわらず、いくつかの実施形態では、改変単鎖ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、モノ三量体またはヘテロ三量体を形成することができる。三量体を形成するために、三量体化ヘルパードメイン、いわゆるフォールドンを、Ｆ外部ドメインのＣ末端部分中に挿入し得る。サブユニット外部ドメインのＣ末端に対して可溶性状態を保持する三量体化ヘルパーの付加は、安定な三量体かつ可溶性のタンパク質三量体の形成を支持する。

一実施形態では、フォールドンドメインは、Ｔ４バクテリオファージのフィブリチンに由来し得、配列番号１０の配列を含む。別の実施形態では、フィブリチンフォールドンは、１つ以上のＮ－グリコシル化部位（モチーフＮｘＴ／Ｓ、ここで、「ｘ」はプロリン以外の任意のアミノ酸残基である）の挿入によって改変され得、これは、ｈＭＰＶ非特異的エピトープを隠すことを補助し得る。改変フォールドンドメイン配列のいくつかの非限定的な例は以下の通りである。

あるいは、フォールドンドメインは、ＧＣＮ４ロイシンジッパーからの構造エレメント（Ｈａｒｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４０１）またはＣ３軸の周囲の付着を可能にする自己組織化ナノ粒子の単量体（例えば、フェリチンおよびルマシン（ｌｕｍａｃｉｎｅ）シンターゼ）を持ち得る。

別の実施形態では、フォールドンドメインを、Ｆタンパク質のＣ末端に付着させ、その膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを置き換える。フォールドンのＮ末端のグリシン残基は、直接、または少なくとも１つのプロテアーゼ部位を含み得る様々な長さのペプチドリンカーを介して、Ｆ１ドメインに付着され得る。より長いリンカーは、フォールドンドメインの動きを離すことを可能にするが、ＨＲＢ領域（茎）のヘリックスを規定された位置で維持することを支持する力は低い。ヘリックスは、粒子の主要なｃ３軸の軸外の角度への三量体化ヘルパードメインの横方向変位および屈曲を伴う動きを受け得る。より短いリンカーは、茎ドメインの３つのヘリックスに対するより強い固定効果により、フォールドンドメインのより剛性の付着を可能にする。

特に、フォールドンドメインは、配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列のＳ４８２の後に挿入されるアラニン残基を介して付着され得る。これにより、Ｓ４８２をＣ末端ヘリックスキャップとして維持し、フォールドン境界面の局所的ジオメトリを再現することが可能になる。そのようなジオメトリは、短いリンカー、例えば、それぞれ配列ＩＬＳＡ（配列番号３４）およびＣＣＳＡ（配列番号３５）からなる「ＶＳＬ」または「ＶＳＡ」と称する短いリンカーを介したフォールドンの付着によって達成され得る。そこでのアラニン（Ａ４８３）は、結晶構造ＰＤＢ：１ＡＶＹにおけるチロシン（配列番号１０における２位に対応）に対してｎ－２位のアラニンに対するアナログの位置にあり、構造モデルにおいてチロシン側鎖と類似の接触を示す。さらに、短いリンカー「ＶＳＬ」または「ＶＳＡ」は、他の変異、例えばリンカーに近接するアミノ酸置換と組み合わせて使用され得る。例えば、リンカー「ＶＳＡ」と置換Ｃ４８０およびＣ４８１との組み合わせは、３つのプロトマーにわたるジスルフィド環の形成を介して３つのプロトマーを共有結合させることを可能にする。このジオメトリにおいて、ジスルフィド環のシステイン残基は空間的近接に維持され、したがって、プロトマー三量体の全体的な安定性を向上させる完全に閉じた環の形成が支持される。剛性の低いフォールドン付着の例は、配列番号１の残基４８３～４８５を保持する（ＩＬＳＳＡＥまたはジスルフィド環を有するＣＣＳＳＡＥ）。１つより多いシステイン環を形成する改変フォールドンリンカーのいくつかの例を以下に示す。
４８０－ＣＣＫＱＴＮＥＣＣＫＮＬＥＲＡＶＳＡ－４９６（配列番号３６）
４８０－ＣＣＲＥＬＫＥＣＣＫＮＬＥＮＡＶＳＡ－４９６（配列番号３７）
４８０－ＣＣＲＥＬＫＤＣＣＫＮＬＥＮＡＶＳＡ－４９６（配列番号３８）
４８０－ＣＣＲＥＬＫＤＣＣＫＮＬＥＲＡＶＳＡ－４９６（配列番号３９）
４８０－ＣＣＲＥＬＫＤＣＣＫＱＬＮＫＡＶＳＡ－４９６（配列番号４０）
４８０－ＣＣＲＥＬＫＥＣＣＫＱＬＮＫＡＶＳＡ－４９６（配列番号４１）

短いリンカーの他の非限定的な例は、ＧＧ、ＳＧ、ＧＳ、ＧＧＧ、ＧＧＡ、ＧＧＳ、ＳＧＧ、ＳＳＧ、ＳＧＳ、ＳＧＡ、ＧＧＡ、ＳＳＡおよびＳＧＧＳである。そのようなリンカーは、例えば、Ａ４９６の置き換えによって導入される、切断部位と組み合わせて使用され得る。切断部位は、好ましくは、表２に開示されるトロンビン切断部位、ＴＥＶ切断部位（タバコエッチウイルスプロテアーゼ）またはＸａ切断部位（第Ｘａ因子）である。

いくつかの実施形態では、組換えタンパク質のより容易な精製のために、単鎖ポリペプチドは、先行技術において知られている任意の精製タグ配列を含み得る。精製を補助するポリペプチドの例には、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、Ｓペプチドタグ、ＭＢＰタグ、ＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ、チオレドキシンタグ、ＧＦＰタグ、ＢＣＣＰ、カルモジュリンタグ、ストレプトアビジンタグ、ＨＳＶエピトープタグ、Ｖ５エピトープタグ、ＣＢＰタグが含まれるが、これらに限定されない。本発明のタンパク質は、好ましくは、それぞれ配列番号１１および配列番号１２の配列を有するＨｉｓタグおよび／またはストレプトアビジンタグを含む。

２つのジスルフィド環を有する平行な３ヘリックスバンドルの形成を可能にし得る、適用され得る組み合わせの非限定的な例を表３に示す。三量体化は、４８０～４９５残基を含む配列部分で生じ得るが、フォールドンドメインの存在によって促進され得る。システイン環の利用可能性は、３つのプロトマー間の共有結合を作製するジスルフィド結合の形成を可能にする。その後、三量体化ヘルパー機能は不用になり、異種配列（および、例えば、非ｈＭＰＶ）からの免疫原性副作用が回避され得るという利点で、フォルダーは切断され得る。

いくつかの実施形態では、組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、配列番号５～９または２４～２８のいずれかのアミノ酸配列に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得、例えば、ここで、パーセンテージ配列同一性は、参照配列の全長にわたって決定される。組換え単鎖ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＦ２ドメインを含み得る。組換え単鎖Ｆタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列に対する、好ましくは、配列番号３の少なくとも残基１７～４３７または１７～３８８に関しての、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＦ１ドメインを含み得る。

コードする核酸およびベクター
本出願は、本発明の組換えｈＭＰＶタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。核酸は、例えば、ａ）ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の（改変）Ｆ１ドメイン、ｂ）ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の（改変）Ｆ２ドメイン、ｃ）Ｆ１ドメインとＦ２ドメインとの間に位置する異種ペプチドリンカー、ｄ）三量体化ヘルパードメイン、および、任意に、ｅ）精製タグを含むポリペプチドをコードし得、ここで、Ｆ１ドメインとＦ２ドメインとは、リンカー中のシステインとＦ１ドメイン中のシステインとの間に導入された少なくとも１つの非天然ジスルフィド結合によって共有結合される。本発明のタンパク質をコードする核酸は、配列番号１９～２３の配列を含み得るかまたはそれからなり得る。

本出願はまた、配列番号５～９または２４～２８のいずれかのアミノ酸配列に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードする単離された核酸分子を含む。本出願はまた、配列番号１９～２３の配列に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する単離された核酸分子を含み、例えば、ここで、パーセンテージ配列同一性は、参照配列の全長にわたって決定される。

本出願はまた、本発明の組換えタンパク質の発現のための単離された核酸分子を含むベクターを提供する。本発明はまた、単離されたポリペプチドの発現および提供を支援するように設計された発現システムを提供する。本出願はまた、本発明の組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質の発現のための宿主細胞を提供する。宿主細胞は原核生物であり得る。原核生物は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉであり得る。宿主細胞は真核細胞であり得る。

免疫原性組成物および製剤
本発明の組換え単鎖ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、免疫原性であり、ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質を認識する中和抗体を誘導することができる。本開示はまた、配列番号５～９または２４～２８のタンパク質に対する少なくとも８５％の配列同一性を有する、組換えｈＭＰＶタンパク質の免疫原性フラグメントおよび免疫原性タンパク質を含む。

本開示はまた、本発明の組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質、またはｈＭＰＶ Ｆタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ分子、またはベクターを含み、当技術分野で知られている許容される担体および／または賦形剤または安定剤を含む免疫原性組成物またはワクチンを提供する（一般にＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，２００５．Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓを参照）。免疫原性組成物は、免疫原性組成物が注射されるかまたはそうでなければ導入されるときに、哺乳動物宿主において免疫応答を誘発する材料の任意の組成物である。免疫応答は、体液性、細胞性、またはその両方であり得る。ブースター効果は、同じ免疫原性組成物への哺乳動物宿主の後の曝露に際しての免疫原性組成物に対する免疫応答の増加を指す。体液性応答は、免疫原性組成物への曝露に際して哺乳動物宿主による抗体の産生をもたらす。

免疫原性組成物またはワクチンは、アジュバントをさらに含み得る。アジュバントは、投与方法に基づいて選択され得、フロイント完全および不完全アジュバントなどのミネラルオイルベースのアジュバント、ＩＳＡなどのＭｏｎｔａｎｉｄｅ不完全Ｓｅｐｐｉｃアジュバント、Ｒｉｂｉアジュバントシステムなどの水中油型エマルジョンアジュバント、ＭＦ５９（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＡＧ）またはＡｄｄａｖａｘ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）（Ｏｔｔ Ｇ．ｅｔ ａｌ．１９９５．Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ６：２７７－９６）などの水中油型エマルジョンアジュバント、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）（Ｃｌｕｆｆ ＣＷ．２０１０．Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ６６７：１１１－２３）、アルミニウム塩アジュバント（アラム）（例えば、ＷＯ２０１３／０８３７２６に記載されるような）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）を含むシンタックス（ｓｙｎｔａｘ）アジュバント製剤、ポリカチオン性ポリマー、特にポリカチオン性ペプチド、特にポリアルギニンまたは少なくとも２つのＬｙｓＬｅｕＬｙｓモチーフを含むペプチド、特にＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ、規定された塩基の前後関係で、非メチル化シトシン－グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含む免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、例えば、ＣｐＧ １０１８（Ｄｙｎａｖａｘ）（例えば、ＷＯ９６／０２５５５に記載されるような）またはイノシンおよびシチジンに基づくＯＤＮ（例えば、ＷＯ０１／９３９０３に記載されるような）、またはデオキシイノシンおよび／またはデオキシウリジン残基を含むデオキシ核酸（ＷＯ０１／９３９０５およびＷＯ０２／０９５０２７に記載されるような）、特にオリゴ（ｄＩｄＣ）_１３（ＷＯ０１／９３９０３およびＷＯ０１／９３９０５に記載されるような）、ＷＯ０４／０８４９３８およびＯｌａｆｓｄｏｔｔｉｒ ｅｔ ａｌ．２００９（Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６９（３）：１９４－２０２）に記載されるようなＩＣ３１（登録商標）（Ｖａｌｎｅｖａ ＳＥ）、向神経活性化合物、特にヒト成長ホルモン（ＷＯ０１／２４８２２に記載されるような）およびＳａｒｋａｒ Ｉ．ｅｔ ａｌ．２０１９（Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅ：１８（５）：５０５－５２１）に記載される他のもの、またはＧｉｕｄｉｃｅ ＧＤ ｅｔ ａｌ．２０１８（Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３９：１４－２１）に記載されるＡＦ０３、ＡＳ０１、ＡＳ０３およびＡＳ０４などのその組み合わせを含み得る。いくつかの組み合わせは、例えば、ＷＯ０１／９３９０５、ＷＯ０２／３２４５１、ＷＯ０１／５４７２０、ＷＯ０１／９３９０３、ＷＯ０２／１３８５７、ＷＯ０２／０９５０２７、およびＷＯ０３／０４７６０２に記載されているものに従う。１つの好ましい実施形態では、アジュバントは、強い抗体およびＴｈ２偏向免疫応答を誘導する水酸化アルミニウムまたはアルミニウム塩である。別の好ましい実施形態では、アジュバントは、ＭＦ５９（登録商標）またはＡｄｄａｖａｘ（商標）、ＭＰＬ／アラムおよびＩＣ３１（登録商標）などの、混合Ｔｈ１／Ｔｈ２応答を誘導するアジュバントまたはアジュバントの組成物である。

本開示はまた、本発明の組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質を含み、薬学的に許容される担体および／または賦形剤をさらに含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、薬学的に許容される担体および／または賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される担体および／または賦形剤には、緩衝剤、安定剤、希釈剤、保存剤、および可溶化剤が含まれ得る（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５を参照）。

許容される担体、賦形剤、または安定剤は、投与される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性である。担体、賦形剤または安定剤は、緩衝剤をさらに含み得る。賦形剤の例には、炭水化物（単糖および二糖など）、糖（スクロース、マンニトール、およびソルビトールなど）、リン酸塩、クエン酸塩、抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンなど）、保存剤（フェノール、ブタノール、ベンザノール；アルキルパラベン、カテコール、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、およびｍ－クレゾールなど）、低分子量ポリペプチド、タンパク質（血清アルブミンまたは免疫グロブリンなど）、親水性ポリマー、アミノ酸、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、塩形成対イオン、金属錯体（Ｚｎ－タンパク質錯体など）、ならびに非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（商標）およびポリエチレングリコールなど）が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の免疫原性組成物は、ヒトを含む哺乳動物宿主において免疫応答を誘発する。免疫応答は、細胞依存性応答もしくは抗体依存性応答のいずれか、またはその両方であり得る。これらの免疫原性組成物は、ワクチンとして有用であり、ｈＭＰＶ感染に対する防御応答を提供し得る。

本開示は、少なくとも１つの異なる感染性ウイルス、特に気道感染を引き起こすウイルス、例えば、ｈＭＰＶ、ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）、ＰＩＶ３（パラインフルエンザウイルス３型）、インフルエンザウイルスまたはコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳなど）に由来する１つ以上の追加の抗原を含む免疫原性組成物またはワクチンをさらに提供する。好ましくは、追加の抗原は、ＲＳＶ Ｆタンパク質、ＰＩＶ３ Ｆタンパク質、インフルエンザ血球凝集素またはコロナウイルスＳタンパク質である。

本明細書に開示される免疫原性組換えタンパク質、単離されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子、ベクター、および免疫原性組成物またはワクチンは、医薬、特にウイルス性気道感染および関連疾患、特にｈＭＰＶによって引き起こされる感染および疾患の予防的および／または治療的処置のための医薬としての使用に適切である。

組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質またはｈＭＰＶ Ｆタンパク質をコードする単離された核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）分子または免疫原性組成物（ワクチン）の生産方法は本開示に含まれる。対象において免疫応答を生成する方法、および気道感染、特にｈＭＰＶによって引き起こされる気道感染を治療、抑制または予防する方法も含まれる。

ここで、本発明を、例のみとして以下の非限定的な実施形態を参照して説明する。

実施例１：改変Ｆタンパク質の設計
構造モデル
安定化された融合前コンフォメーションの変異ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の設計を、融合プロセスの様々な移行期のモデルを表す、融合前ＲＳＶ Ｆ（ＰＤＢ：４ＪＨＷおよび４ＭＭＶ、また、４ＭＭＵ、４ＭＭＳ）、融合前ＰＩＶ－５ Ｆ（ＰＤＢ：５ＧＩＰ）、融合前ｈＭＰＶ Ｆ（ＰＤＢ：５ＷＢ０）および融合後ｈＭＰＶ Ｆ（ＰＤＢ：５Ｌ１Ｘ）タンパク質の利用可能な結晶構造から誘導されたホモロジーモデルに基づいて行った。フォールドンドメインを、モデルＰＤＢ：２ＩＢＬから適合させた。モデル構築および構造解析を、ＰｙＭｏｌ構造エディターパッケージのオープンソースバージョンを使用することによって実行した（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ ＬＬＣ、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ／ｐｙｍｏｌ－ｏｐｅｎ－ｓｏｕｒｃｅ）。モデルを、ＮＡＭＤモデリングパッケージ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．２００５．Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ．２６（１６）：１７８１－８０２）およびｃｈａｒｍｍ３６フォースフィールド（ＭｃＫｅｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ｂ．１０２（１８）：３５８６－３６１６）またはＧｒｏｍａｃｓ（Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９５．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓ．Ｃｏｍｍ．９１：４３－５６、Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．２００８，Ｊ．Ｃｈｅｍ Ｔｈｅｏｒｙ Ｃｏｍｐｕｔ．４，４３５－４４７、ｗｗｗ．ｇｒｏｍａｃｓ．ｏｒｇ）／ＯＰＬＳ－ＡＡ（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ ＷＬ，Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖ．）を用いて精緻化した。候補モデルを、典型的には、合計１３ｎｓについてのＮＶＴ、ＮＰＴシミュレーションシーケンスにおける真空リラクゼーションの後に、３サイクルの対称アニーリング（Ａｎｉｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．７８（４）：９３２－９４９からから適合）を適用し、続いて自由サンプリングおよびエネルギー最小化を行うプロトコルにおいて精緻化した。

実施例２：組換えＦタンパク質の産生
株
ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質を、配列番号１、１３～１８の配列によって表される任意のｈＭＰＶ株および任意の血清型、またはそのバリアントから選択することができる。特定の例示的な実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、配列番号１によって表されるＮＬ／１／００株、血清型Ａ１、および配列番号１４によって表されるＣＡＮ９７－８３株、血清型Ａ２に由来する。

発現ベクター
クローニングのために使用したプラスミドｐＶＶＳ１３７１は以下を含む。
－ニワトリβグロビン遺伝子座からのＨＳ４インスレーター配列、
－２つのＣＭＶプロモーター、
－ＣＭＶプロモーターの下流にあり、ヒトβグロビン遺伝子の第１イントロンからの５’ドナー部位と、免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロンからの分枝および３’アクセプター部位から構成される２つのキメライントロン。ドナーおよびアクセプター部位の配列を、分枝部位とともに、スプライシングのためのコンセンサス配列と一致するように適合させた。ｃＤＮＡ配列内の可能な潜在的５’ドナースプライス部位の利用を防止するために、イントロンはｃＤＮＡインサートの上流に位置する。
－ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列（ｂＧＨ Ａ）、
－ＳＶ４０エンハンサーおよび初期プロモーター領域の制御下にあるＴｎ５からのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、
－ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子のＨＳＶ ＴＫポリアデニル化シグナルは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の下流に位置する。
－細菌プロモーターの制御下にあるカナマイシン耐性遺伝子、および
－ｐＵＣ複製起点。

野生型Ｆタンパク質のコード配列を、ｈＭＰＶ ＮＬ／１／００株、サブリネージＡ１から単離し、ＣＨＯ細胞における発現のためにコドン最適化した。野生型および改変Ｆタンパク質のコード配列を、ＣＨＯ細胞における一過性または安定タンパク質発現のためにｐＶＶＳ１３７１プラスミド中にクローン化した。

簡単に説明すると、コード配列を、制限部位ＳａｌＩおよびＰａｃＩを使用して、ｐＶＶＳ１３７１ベクターのキメライントロンとｂＧＨ Ａポリアデニル化部位との間にクローン化した。ベクターおよび合成したコード配列（合成はＧｅｎｅＡｒｔによって行われた）をＳａｌＩおよびＰａｃＩで消化した後、アガロースゲル上で精製した。フラグメントをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションし、ライゲーション産物を使用して、Ｍａｘ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換した。選択したクローンを、設計した変異について配列分析によって試験した。

ＣＨＯ細胞における発現
タンパク質発現は、ＭａｘＣｙｔｅ（登録商標）ＳＴＸ Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍデバイスを使用し、供給者の実験推奨に従う、ＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションに基づく。簡単に説明すると、エレクトロポレーションの前に、ＣＨＯ細胞を、ペレット化し、ＭａｘＣｙｔｅ（登録商標）エレクトロポレーションバッファー中に懸濁し、対応する発現プラスミドＤＮＡと混合する。細胞－ＤＮＡ混合物を、カセット処理アセンブリに移し、ＭａｘＣｙｔｅ（登録商標）ＳＴＸ Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍにロードする。細胞を、デバイスにプレロードされた「ＣＨＯ」プロトコルを使用してエレクトロポレーションし、すぐに培養フラスコに移し、３０～４０分間３７℃、８％ＣＯ_２でインキュベートする。回復期間の後、細胞をＥＸ－ＣＥＬＬ ＡＣＦ ＣＨＯ培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中に高密度で再懸濁する。エレクトロポレーション後の細胞培養を、３７℃、８％ＣＯ_２およびオービタルシェークで実施する。

産生速度論は、培養温度の３２℃への低下、およびトランスフェクトした細胞への、ＣＨＯ細胞における一過性タンパク質発現用に開発された流加培地（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ、グルコース、およびｇｌｕｔａＭａｘを補充したＣＨＯ ＣＤ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ（商標）Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））の毎日の供給で構成される。培養の約７～１４日後に、細胞生存率をチェックし、最大速度で１０分間の遠心分離２回に対応する細胞清澄化後に馴化培地を回収する。清澄化した生成物を０．２２μｍ滅菌メンブレンを通してろ過し、タンパク質精製の前に－８０℃で貯蔵する。

細胞内免疫染色によるタンパク質検出
トランスフェクション後７日目に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１０分間４％パラホルムアルデヒド中室温で固定する。固定した細胞をＢＤ Ｐｅｒｍ ｗａｓｈ中１５分間室温で透過処理し、ＢＤ Ｐｅｒｍ ｗａｓｈ中で希釈した一次抗体とともに１時間４℃でインキュベートする。最後に、蛍光マーカーに結合した二次抗体を１時間４℃で添加し、フローサイトメトリー（ＭａｃｓＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）による分析までＰＢＳ中４℃で貯蔵する。一次抗体として、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションを特異的に認識するＭＰＥ８ Ｎ１１３Ｓ抗体（ＰＲＯ－２０１５－０２６－０１）、または融合前および融合後の両方のｈＭＰＶ Ｆタンパク質を認識するＤＳ７ ＩｇＧ１抗体（ＰＲＯ－２０１６－００３）を使用した。蛍光ＦＩＴＣ二次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（ＪＩＲ １１５－０９６－０６８）であった。

タンパク質精製
凍結した上清を室温にし、標準グレードの再生セルロース透析メンブレンＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）１－７ＣＲ（ＭＷＣＯ：３．５ｋＤａ）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を用いてＰＢＳに対して透析する。その後、これを５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４バッファー（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化し、タンパク質の精製を、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、続いてゲルろ過クロマトグラフィーを使用して行う。

ＩＭＡＣのために、Ｎｉ^２＋を含むアガロース樹脂（Ｈｉｓ ＧｒａｖｉＴｒａｐ）は、製造業者（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってクロマトグラフィーカラム中に充填されている。樹脂を、２倍量の脱イオン水で洗浄し、３倍量の製造業者によって指示される平衡化および洗浄バッファー（０．５Ｍ塩化ナトリウムおよび２０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で平衡化する。サンプルをロードした後、カラムを１０ｍＬの洗浄バッファーで洗浄する。Ｈｉｓタグを付したタンパク質を、３～１０カラム容量の製造業者によって指示される溶出バッファー（０．５Ｍ塩化ナトリウムおよび５００ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）を使用してカラムから溶出させる。次いで、溶出物を０．２２μｍフィルター上でろ過し、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－ｌｙｚｅｒ（商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓカセット中で２回、貯蔵バッファー（５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に対して透析し、その後、アリコートに分け、－２０℃で貯蔵する。

組換えタンパク質の純度、サイズ、および凝集の分析を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）およびＳＤＳ－ＰＡＧＥによって行う。ＳＥ－ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を、カラムＳＵＰＥＲＤＥＸ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で行う。ＳＤＳ－ＰＡＳＧＥのために、タンパク質をサンプルバッファー（０．０８Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー）中で希釈し、ベータメルカプトエタノール（またはＤＴＴ）の存在下で５分間煮沸し、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＸＴ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓグリシンポリアクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ）（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）上で電気泳動的に分離する。ゲルをクマシーブルー（Ｉｎｓｔａｎｔ ｂｌｕｅ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液中で染色する。余分の染色を水で除去し、バンドをＩｍａｇｅｒ ６００（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して可視化する。図４は、精製組換えＦタンパク質のＳＥ－ＨＰＬＣ分析を示す。組換えＦタンパク質の例示的な収量を表４に示す。

実施例３：組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質のコンフォメーション
サンドイッチＥＬＩＳＡによるコンフォメーションプロファイルの決定
Ｍｅｄｉｕｍ ｂｉｎｇｉｎｇプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、２００ｎｇ／ウェルのヒトＩｇＧ１ ＤＳ７捕捉抗体（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２００７）を用いてコーティングし、一晩４℃でインキュベートする。プレートを、２時間３７℃で、攪拌下でＰＢＳ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０および５％乾燥スキムミルクを用いて飽和させる（飽和バッファー）。液体をウェルから除去し、プレートを、飽和バッファー中で希釈した２．５ｎｇ／ウェルの目的の精製タンパク質とともに１時間３７℃でインキュベートする。洗浄後、融合前ｈＭＰＶ Ｆタンパク質に対するマウス抗体ＭＰＥ８ Ｎ１１３Ｓ（Ｃｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）または融合後ｈＭＰＶ Ｆタンパク質に対するマウス抗体ＭＦ１（Ｍｅｌｅｒｏ、私信）の、飽和バッファー中での５倍段階希釈を、１時間３７℃でインキュベートする。次いで、ペルオキシダーゼＨＲＰヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｃｏｖａｌａｂ ＃ｌａｂ０２５２）とコンジュゲートした二次α－Ｉｇ種特異的抗体、続いて５０μＬのペルオキシダーゼ基質（ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ）との１時間３７℃でのインキュベーションによって、免疫複合体を検出する。３Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することによって比色反応を停止し、各ウェルの吸光度を分光光度計（ＭｕｌｔｉＳｋａｎ）を用いて４９０ｎｍで測定する。

図５は、融合前または融合後特異的抗体を用いて組換えＦタンパク質について行ったＥＬＩＳＡの結果を示す。融合前および融合後の両方のコンフォメーションで存在する１つの候補Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿４．２を除いて、試験したすべての候補は、融合前プロファイルの豊富さを示す。組換えタンパク質Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３．３は、異種リンカー中の１つのアミノ酸残基のみがＬ７Ｆ＿Ａ１＿２３と異なる。すなわち、それはリンカーの５位にバリンを含み（ＣＧＡＧＶ）、これは配列番号１の１１８位のバリン残基に対応する。

実施例４：免疫原性研究
マウスにおける免疫原性
５～１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、３回、３週間間隔で（例えば、０、１４または２１および２８または４２日目）、皮下で、組換えＦタンパク質（異なる実験においてマウス当たり０．０６μｇ～６．０μｇの量で使用）を用いて、様々なアジュバント、特にアラム、アラム＋ＭＰＬ、ＩＣ３１（登録商標）、Ａｄｄａｖａｘ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）有りまたは無しで免疫する。血清を、後眼窩放血によって収集する。最後のワクチン接種の１～４週間後に、採血し、血清を調製する。Ｔｈ_１／Ｔｈ_２型免疫応答の評価を、下記ように間接ＥＬＩＳＡによって血清中のＩｇＧ_１／ＩｇＧ_２ａサブタイプを決定することによって行う。

サブクラスＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
組換えＦタンパク質を、ｐＨ９．６の炭酸／炭酸水素バッファー中で希釈し、ウェル当たり５０ｎｇのタンパク質を９６ウェルｈｉｇｈ ｂｉｎｄｉｎｇプレートに添加する（５０μＬ／ウェル、Ｇｒｅｉｎｅｒ）。プレートを一晩４℃でインキュベートする。ウェルを、３０分間室温で１５０μＬのＰＢＳ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０および５％乾燥スキムミルク（飽和バッファー）を用いて飽和させる。液体をウェルから除去し、プレートを、飽和バッファー中の様々な希釈（５倍段階希釈）の免疫したマウスの血清５０μＬ／ウェルとともに１時間室温でインキュベートする。ＰＢＳ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄した後、５０μＬのペルオキシダーゼとコンジュゲートした二次抗ＩｇＧ_１またはＩｇＧ_２ａマウス特異的抗体、続いて５０μＬのペルオキシダーゼ基質（ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ）との１時間室温でのインキュベーションによって、免疫複合体を検出する。 オルトリン酸を添加することによって比色反応を停止し、各ウェルの吸光度を分光光度計（ＭｕｌｔｉＳｋａｎ）を用いて４９０ｎｍで測定する。

図６は、様々なアジュバントとの組み合わせで投与した、マウス当たり２μｇの組換えタンパク質ｓＦ＿Ａ１＿Ｋ＿Ｌ７（配列番号６）またはｓＦ＿Ａ１＿ＭＦｕｒ（配列番号５３）で免疫したマウスからの血清を試験することによって得たＩｇＧ ＥＬＩＳＡの結果を示す。高ＩｇＧ_１／ＩｇＧ_２ａ力価の誘導が、どのアジュバントを使用したかにかかわらず両方のＦタンパク質について実証されている。
図７は、１：１（ｖ／ｖ）混合したＡｄｄａｖａｘ（商標）でアジュバント化した組換えＦタンパク質（２μｇ）のうちの１つで免疫したマウスにおいて測定したＩｇＧ_１およびＩｇＧ_２ａ力価の結果を示す。
図８はまた、ＩＣ３１（登録商標）でアジュバント化した組換えＦタンパク質（２μｇ）の１つで免疫したマウスにおいて測定した血清ＩｇＧ_１およびＩｇＧ_２ａ力価を示す。いくらかの変動性にかかわらず、データは、すべてのワクチン候補が、高度に免疫原性であり、ＩｇＧ_１／ＩｇＧ_２Ａ抗体を誘発することができることを明らかに示す。

実施例５：中和抗体の誘導
中和アッセイ
簡単に説明すると、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）を使用して、対照血清／抗体と比較してｈＭＰＶウイルスプラークの数を５０％減少させるために必要とされる免疫された対象の血清／抗体力価を決定する（ＰＲＮＴ５０）。ＰＲＮＴ５０を、ｈＭＰＶに感染することができる細胞の単層を使用することによって実施する。対象からの血清を希釈し、生ｈＭＰＶウイルスとともにインキュベートする。細胞単層上に形成されるプラークを計数し、血清または対照抗体の非存在下でウイルスによって形成されるプラークの数と比較する。ＰＲＮＴ５０における血清の１：１０希釈の中和抗体の閾値は、防御の証拠として一般的に受け入れられている（Ｈｏｍｂａｃｈ ｅｔ．ａｌ．２００５．Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：５２０５－５２１１）。

ＰＲＮＴプロトコル
２４ウェルプレートに、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞を、ウェル当たり１．２×１０^５細胞で、１ｍＬのＥＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）、２ｍＭ Ｌ－Ｇｌｎ（Ｏｚｙｍｅ）、５％ＦＢＳおよび１％ＮｅＡＡ（Ｏｚｙｍｅ）バッファー下で播種し、２４時間３７℃および５％ＣＯ_２でインキュベートする。ｈＭＰＶ Ａ１ウイルス（Ｖａｌｎｅｖａ ＭＶＢ １６１１－００９バンク）を、５０ｐｆｕ／６２．５μＬ（ウェル当たり）または８００ｐｆｕ／ｍＬに希釈する。等量のウイルスおよび血清希釈（２×６２．５μＬ）を合わせ、３７℃、５％ＣＯ_２で約１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳで洗浄した後、１２５μＬのウイルス／血清混合物を各ウェルに添加し、プレートを振とう（１００ｒｐｍ）下で２時間３７℃でインキュベートする。次いで、２２５μＬ／ウェルの重層溶液（ＥＭＥＭ、２ｍＭ Ｇｌｎ、０．７５％メチルセルロース）を添加し、プレートを５日間３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートする。細胞固定のために、２２５μＬ／ウェルの４％ＰＦＡ／ＰＢＳを添加し、１０分間室温でインキュベートし、その後、ＰＢＳで３回洗浄する。細胞透過処理のために、０．５ｍｌのＰＢＳ、０．５％Ｔｗｅｅｎ、０．１％ＢＳＡを各ウェルに添加し、３０分間４℃でインキュベートする。一次抗体（ヒトＤＳ７－ＰＲＯ－２０１６－００３）（０．９１μｇ／ｍＬ）をＰＢＳ中で５μＬ／ｍＬの最終濃度に希釈し、ウェル当たり１５０μＬの一次抗体希釈を添加し、振とう下で４５分間３７℃でインキュベートする。一次抗体を除去し、プレートをブロッキングバッファーで３回洗浄した後、１５０μＬ／ウェルの希釈した二次抗体（抗ヒトＨＲＰ（ＵＰ７８３４９３））を添加し、プレートを振とう下でさらに４５分間３７℃でインキュベートする。次いで、二次抗体を除去し、プレートをブロッキングバッファーで３回洗浄する。染色のために、ウェル当たり１５０μＬのＤＡＢ １×基質を添加する。１時間室温でインキュベートした後、細胞を顕微鏡下で手動で計数する。

図９は、様々なアジュバントとの関係で組換えタンパク質ｓＦ＿Ａ１＿Ｋ＿Ｌ７（２μｇ）で免疫したマウスから５７日目に採取した血清について得た中和アッセイの結果を示す。一般に、試験したＦタンパク質に対する中和抗体は、使用したアジュバントにかかわらずマウス血清中に存在する。

すべてのタンパク質候補を並行して試験した実験において、ＩＣ_５０値は、Ａｄｄａｖａｘ（商標）でアジュバント化したＬ７Ｆ＿Ａ１＿２３候補およびＩＣ３１（登録商標）でアジュバント化したＬ７Ｆ＿Ａ１＿２３候補について最も高かった（図１０および表５を参照）。最も低いＩＣ_５０値は、使用したアジュバントとは無関係にＬ７Ｆ＿Ａ１＿３１候補について計算された。

図１１は、Ａｄｄａｖａｘ（商標）と組み合わせてマウス中に接種したときの組換えＦタンパク質の免疫原性を評価するために行った用量反応研究を示す。プラセボ群（データは示していない）とは対照的に、中和抗体は、０．０６μｇ～６．０μｇの組換えＦタンパク質で免疫したマウスの血清において検出される。構築物間でＩＣ_５０の有意差は観察されなかった。

実施例６：マウスにおける防御
ウイルスプラーク（フォーカス）免疫染色
ｈＭＰＶフォーカス定量のためのアッセイを、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９（１７）：１０９４４－５１、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２００７．Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１（１５）：８３１５－２４、およびＣｏｘ ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８６（２２）：１２１４８－６０において公開された方法に基づいて開発した。簡単に説明すると、２４ウェルプレート中のＶｅｒｏ細胞またはＬＬＣ－ＭＫ２細胞のコンフルエントな培養物に、培地中で希釈したマウス血清の存在下または非存在下で３０分間室温でプレインキュベートした５０μＬ／ウェルのｈＭＰＶウイルスを感染させる。マウスＩｇＧ_２ａ ＤＳ７モノクローナル抗体を、ｈＭＰＶの検出のために使用する。３７℃でのウイルス吸着の２時間の期間の後、２ｍＭ Ｌ－Ｇｌｎおよび２０～５０μｇ／ｍＬのトリプシンを補充したＥＭＥＭ培地を含む１．５％メチルセルロース重層を添加する。感染後６日目に、上清を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄する。細胞単層を固定し、ヒトＩｇＧ_１ ＤＳ７抗体で染色する。フォーカスを計数し、５０％プラーク減少力価を、関連する陰性および陽性対照を考慮して計算する。細胞画像を、２．５×または１０×の対物レンズを使用してＺｅｉｓｓ顕微鏡を用いて捕える。免疫染色の結果を、ミリリットル当たりのフォーカス形成単位、またはＦＦＵ／ｍＬとして表す。

チャレンジプロトコル
ＬＬＣ－ＭＫ２細胞上で増殖させたｈＭＰＶ Ａ１およびＡ２単離物を、動物チャレンジ実験において使用する。ＢＡＬＢ／ｃマウスを前述のように３回、２週間間隔でアジュバント化した組換えＦタンパク質で免疫し、免疫後４２日目にそれをおよそ１×１０^６ｐｆｕのｈＭＰＶを用いて鼻腔内でチャレンジする。４～５日後、動物を屠殺し、個々の血清サンプルを採取し凍結する。肺組織サンプルを採取し、秤量し、ウイルス力価の決定のためにホモジナイズする。肺組織におけるウイルス負荷を、上記のようなウイルスフォーカス免疫染色によって決定する。あるいはまたはさらに、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して、採取した組織におけるウイルス負荷を測定する。

図１２は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって行った、野生型ｈＭＰＶを用いたチャレンジの後に、アジュバント化した組換えＦタンパク質で免疫したマウスの肺におけるウイルスＲＮＡ負荷（ＧＣＥ）を示す。最も高いｈＭＰＶ ＲＮＡ負荷はプラセボ群において観察され、一方、ウイルス負荷の強い低下は免疫したマウスの肺において見られ、このことは、ワクチン候補による防御を実証する。防御効果は、ウイルスプラーク（フォーカス）免疫染色を使用すると、よりさらに明白である。図１３に示すように、ＦＦＵ／ｍＬで計算されるウイルス負荷の強い低下（４ｌｏｇまで）が、試験したすべてのｈＭＰＶ Ｆタンパク質候補について、プラセボ群と比較して、様々なタンパク質用量（マウス当たり０．０６～６．０μｇ）で免疫したマウスにおいて観察される。

記載される方法または組成物の正確な詳細が、記載される実施形態の趣旨から逸脱することなく、変形または改変され得ることは明らかであろう。以下の特許請求の範囲の範囲および趣旨内に入るすべてのそのような改変および変形を請求する。本出願に記載されるすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列
配列番号１
ＮＬ／１／００株、血清型遺伝子型Ａ１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＫ６２９６８．２）
［配列表１］

配列番号２
ＮＬ／１／００株、血清型Ａ１のネイティブｈＭＰＶ Ｆ２ドメイン配列
［配列表２］

配列番号３
ＮＬ／１／００株、血清型Ａ１のネイティブｈＭＰＶ Ｆ１ドメイン配列
［配列表３］

配列番号４
異種ペプチドリンカー
［配列表４］

配列番号５
Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３タンパク質配列
［配列表５］

配列番号６
ｓＦ＿Ａ１＿Ｋ＿Ｌ７タンパク質配列
［配列表６］

配列番号７
Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３１タンパク質配列
［配列表７］

配列番号８
Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３３タンパク質配列
［配列表８］

配列番号９
Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿４．２タンパク質配列
［配列表９］

配列番号１０
Ｔ４バクテリオファージのフィブリチンからの三量体化ヘルパードメイン（フォールドン）
［配列表１０］

配列番号１１
リンカーとしての先頭のＧＳを有するＨｉｓタグ配列
［配列表１１］

配列番号１２
ストレプトアビジンタグ配列
［配列表１２］

配列番号１３
ＮＬ／１７／００株、血清型Ａ２のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ３０４３６０．１）
［配列表１３］

配列番号１４
ＣＡＮ９７－８３株、血清型Ａ２のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６ＷＢ９８）
［配列表１４］

配列番号１５
ＮＣＬ１７４株、血清型Ａ２のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｇ０ＺＲＩ７）
［配列表１５］

配列番号１６
ＮＬ／１／９９株、血清型Ｂ１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ３０４３６１．１）
［配列表１６］

配列番号１７
ＮＤＬ００－１株、血清型Ｂ１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＫ６２９６８．２）
［配列表１７］

配列番号１８
ＣＡＮ９８－７５株、血清型Ｂ２のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ：６ＷＢＡ７）
［配列表１８］

配列番号１９
ｓＦ＿Ａ１＿Ｋ＿Ｌ７コードヌクレオチド配列、コドン最適化
［配列表１９］

配列番号２０
Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３コードヌクレオチド配列、コドン最適化
［配列表２０］

配列番号２１
Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３１コードヌクレオチド配列、コドン最適化
［配列表２１］

配列番号２２
Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３３コードヌクレオチド配列、コドン最適化
［配列表２２］

配列番号２３
Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿４．２コードヌクレオチド配列、コドン最適化
［配列表２３］

配列番号２４
精製タグなしのｓＦ＿Ａ１＿Ｋ＿Ｌ７成熟タンパク質配列
［配列表２４］

配列番号２５
精製タグなしのＬ７Ｆ＿Ａ１＿２３成熟タンパク質配列
［配列表２５］

配列番号２６
精製タグなしのＬ７Ｆ＿Ａ１＿３１成熟タンパク質配列
［配列表２６］

配列番号２７
精製タグなしのＬ７Ｆ＿Ａ１＿３３成熟タンパク質配列
［配列表２７］

配列番号２８
精製タグなしのＬ７Ｆ＿Ａ１＿４．２成熟タンパク質配列
［配列表２８］

配列番号２９
Ｆｏｌｄｏｎ－ｇｌｙｃ－１
［配列表２９］

配列番号３０
Ｆｏｌｄｏｎ－ｇｌｙｃ－２
［配列表３０］

配列番号３１
Ｆｏｌｄｏｎ－ｇｌｙｃ－３
［配列表３１］

配列番号３２
Ｆｏｌｄｏｎ－ｇｌｙｃ－４
［配列表３２］

配列番号３３
Ｆｏｌｄｏｎ－ｇｌｙｃ－５
［配列表３３］

配列番号３４
三量体化ヘルパーＶＳＬモチーフ
［配列表３４］

配列番号３５
三量体化ヘルパーＶＳＡモチーフ
［配列表３５］

配列番号３６
［配列表３６］

配列番号３７
［配列表３７］

配列番号３８
［配列表３８］

配列番号３９
［配列表３９］

配列番号４０
［配列表４０］

配列番号４１
［配列表４１］

配列番号４２
トロンビン切断部位
［配列表４２］

配列番号４３
ＴＥＶ切断部位
［配列表４３］

配列番号４４
第Ｘａ因子切断部位
［配列表４４］

配列番号４５
［配列表４５］

配列番号４６
［配列表４６］

配列番号４７
［配列表４７］

配列番号４８
［配列表４８］

配列番号４９
［配列表４９］

配列番号５０
［配列表５０］

配列番号５１
置換Ａ１１３Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌおよび三量体化ヘルパーＫＬＬを有するｓＦ＿Ａ１＿Ｋ－Ｅ２９４タンパク質配列
［配列表５１］

配列番号５２
ｓＦ＿Ａ１＿Ｋ－Ｅ２９４コードヌクレオチド配列、コドン最適化
［配列表５２］

配列番号５３
融合後コンフォメーションで安定化された、１０３位～１１１位のアミノ酸の欠失、フューリン部位ＫＫＲＫＲＲによるＲ１０２の置き換え、および置換Ｇ２９４Ｅを有する、ｓＦ＿Ａ１＿ＭＦｕｒタンパク質配列
［配列表５３］

配列番号５４
［配列表５４］
ｓＦ＿Ａ１＿ＭＦｕｒコードヌクレオチド配列、コドン最適化

Claims (57)

1. 融合前コンフォメーションで安定化された、免疫原性ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）改変Ｆタンパク質またはそのフラグメントであって、融合ペプチド（ＦＰ）を欠き、Ｆ２ドメイン、異種ペプチドリンカーおよびＦ１ドメインを含む組換え単鎖ポリペプチドを含み、前記リンカーは前記Ｆ２ドメインと前記Ｆ１ドメインとの間に配置され、前記Ｆ１ドメイン中に存在する非天然システイン残基とジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含む、タンパク質またはそのフラグメント。
2. 前記組換え単鎖ポリペプチドが、前記Ｆ２ドメインと前記Ｆ１ドメインとの間のトリプシン様切断部位を欠く、請求項１に記載のタンパク質またはそのフラグメント。
3. 前記組換え単鎖ポリペプチドが、前記Ｆ２ドメインと前記Ｆ１ドメインとの間のフューリン様切断部位を欠く、請求項１または２に記載のタンパク質またはそのフラグメント。
4. 前記Ｆ２ドメインが、配列番号２に対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質またはそのフラグメント。
5. 前記Ｆ１ドメインが、配列番号３またはその残基１７～３８８に対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質またはそのフラグメント。
6. （ａ）前記Ｆ１ドメインが、配列番号３の２３６位で置換されたシステイン残基を含み、
   （ｂ）前記組換え単鎖ポリペプチドが、配列番号１のネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列のアミノ酸位置に対して３３８位で置換されたシステイン残基を含み、
   （ｃ）前記リンカーが、配列番号３の前記Ｆ１ドメインにおける２３６位で置換された非天然システイン残基とジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含み、かつ／または
   （ｄ）前記リンカーは、配列番号１の前記ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列のアミノ酸位置に対して３３８位で置換された非天然システイン残基とジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質またはそのフラグメント。
7. 前記Ｆ２ドメインのＣ末端が、前記Ｆ１ドメインのＮ末端に対して近位である、先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質またはそのフラグメント。
8. 配列番号１の前記ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列の前記Ｆ１ドメインと前記Ｆ２ドメインとの間に存在するトリプシン切断部位が、配列番号１の１０２位のアルギニン残基の別のアミノ酸残基への置換によって前記組換え単鎖ポリペプチドにおいて除去される、請求項２～７のいずれか一項に記載のタンパク質またはそのフラグメント。
9. 前記組換え単鎖ポリペプチドが、配列番号１の前記ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列の１０３位～１１８位のアミノ酸残基にわたる前記融合ペプチドを欠く、先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質またはそのフラグメント。
10. 前記組換え単鎖ポリペプチドが、膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインを欠く、請求項８または９に記載のタンパク質またはそのフラグメント。
11. 配列番号１の１０２位のアルギニン残基がグリシン残基によって置換されている、請求項８～１０のいずれか一項に記載のタンパク質またはそのフラグメント。
12. 前記リンカーが１～５個、好ましくは５個のアミノ酸からなる、先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質またはそのフラグメント。
13. 前記システイン残基が、前記リンカーの１位または３位、好ましくは１位にある、先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質またはそのフラグメント。
14. 前記リンカーが、少なくとも１つのアラニン、グリシン、またはバリン残基を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質またはそのフラグメント。
15. 前記リンカーが、ＣＧＡＧＡ、ＣＧＡＧＶ、ＣＧＡＡＶ、ＡＧＣＧＡ、ＣＡＡＡＶ、ＣＡＡＦＶおよびＣＧＡＧＡからなる群から選択される配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質またはそのフラグメント。
16. 前記リンカーが、配列ＣＧＡＧＡ（配列番号４）を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質またはそのフラグメント。
17. 前記組換え単鎖ポリペプチドが、前記融合前コンフォメーションをさらに安定化させる、配列番号１の前記ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列の９７位に対応する位置でのアスパラギン残基のグルタミン残基への置換（Ｎ９７Ｑ）を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
18. 前記組換え単鎖ポリペプチドが、タンパク質発現を向上させる、配列番号１の前記ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列の２９４位に対応する位置でのグリシン残基のグルタミン酸残基への置換（Ｇ２９４Ｅ）をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
19. 前記組換え単鎖ポリペプチドが、前記融合前コンフォメーションを安定化させる、配列番号１の前記ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列に対する１つ以上の置換をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
20. 前記組換え単鎖ポリペプチドが、配列番号１の前記ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列の４９位、５１位、６７位、８０位、１３７位、１４７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６６位、１７７位、２５８位、２６６位、４８０位および／または４８１位に対応する位置での１つ以上の置換を含む、請求項１９に記載のタンパク質。
21. 前記組換え単鎖ポリペプチドが、配列番号１の前記ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列に対して置換された少なくとも２つのさらなるシステイン残基を含み、非ネイティブジスルフィド結合を作製する、請求項１９または２０に記載のタンパク質。
22. 前記置換が、配列番号１の前記ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列に対するＥ５１ＣおよびＫ１６６Ｃである、請求項１９～２１のいずれか一項に記載のタンパク質。
23. 前記置換が、配列番号１の前記ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列に対するＴ４９Ｍ、Ｅ８０Ｎ、Ｉ１３７Ｗ、Ａ１４７Ｖ、Ａ１５９Ｖ、Ｔ１６０Ｆ、Ａ１６１Ｍ、Ｉ６７Ｌ、Ｉ１７７Ｌ、Ｆ２５８Ｉ、Ｓ２６６Ｄ、Ｉ４８０Ｃおよび／またはＬ４８１Ｃからなる群から選択される、請求項２０に記載のタンパク質。
24. 前記組換え単鎖ポリペプチドが、配列番号１の前記ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列に対する少なくとも３つの置換Ｔ４９Ｍ、Ａ１６１Ｍ、およびＩ６７ＬまたはＩ１７７Ｌを含む、請求項２３に記載のタンパク質。
25. 前記置換Ｅ８０Ｎが、水素結合を導入する、請求項２３に記載のタンパク質。
26. 前記組換え単鎖ポリペプチドが、置換Ｅ５１Ｃ、Ｋ１６６ＣおよびＳ２６６Ｄを含み、前記置換Ｓ２６６Ｄが、塩橋を導入する、請求項２３に記載のタンパク質。
27. 前記組換え単鎖ポリペプチドが、配列番号１の前記ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列に対する以下の置換の組み合わせ：
    Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２ＧおよびＧ２９４Ｅ（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３）、
    Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７ＬおよびＧ２９４Ｅ（ｓＦ＿Ａ１＿Ｋ＿Ｌ７）、
    Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ４９Ｍ、Ｉ６７Ｌ、Ａ１６１Ｍ、Ｅ８０Ｎ、Ｆ２５８ＩおよびＧ２９４Ｅ（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３１）、
    Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ４９Ｍ、Ｉ６７Ｌ、Ａ１６１Ｍ、Ｅ５１Ｃ、Ｋ１６６Ｃ、Ｓ２６６Ｄ、Ｇ２９４Ｅ、Ｉ４８０ＣおよびＬ４８１Ｃ（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３３）、または
    Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ４９Ｍ、Ａ１６１Ｍ、Ｉ１３７Ｗ、Ａ１５９Ｖ、Ａ１４７Ｖ、Ｉ１７７ＬおよびＧ２９４Ｅ（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿４．２）のうちの１つをさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のタンパク質。
28. 前記組換え単鎖ポリペプチドが、三量体化ヘルパードメイン（フォールドン）を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
29. 前記三量体化ヘルパードメインが、配列番号１０または配列番号２９～３３のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載のタンパク質。
30. 前記組換え単鎖ポリペプチドが、前記フォールドンドメインの上流に配列番号３４または配列番号３５のアミノ酸配列を含む、請求項２８または２９に記載のタンパク質。
31. 前記組換え単鎖ポリペプチドが、精製のためのＨｉｓタグまたはストレプトアビジンタグをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
32. 前記Ｈｉｓタグが、配列番号１１の配列を含む、請求項３１に記載のタンパク質。
33. 前記ストレプトアビジンタグが、配列番号１２の配列を含む、請求項３１に記載のタンパク質。
34. 前記組換え単鎖ポリペプチドが、前記Ｈｉｓタグまたは前記ストレプトアビジンタグの上流に配列番号４２～４４のいずれかの配列を含む切断部位をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
35. 前記組換え単鎖ポリペプチドが、配列番号５～９または２４～２８のいずれかのアミノ酸配列に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
36. 配列番号５または配列番号２５に記載のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３）、またはそれに対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含むかまたはそれからなる免疫原性タンパク質。
37. 配列番号６または配列番号２４に記載のアミノ酸配列（ｓＦ＿Ａ１＿Ｋ＿Ｌ７）、またはそれに対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含むかまたはそれからなる免疫原性タンパク質。
38. 配列番号７または配列番号２６に記載のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３１）、またはそれに対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含むかまたはそれからなる免疫原性タンパク質。
39. 配列番号８または配列番号２７に記載のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３３）、またはそれに対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含むまたはそれからなる免疫原性タンパク質。
40. 配列番号９または配列番号２８に記載のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿４．２）、またはそれに対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含むまたはそれからなる免疫原性タンパク質。
41. 前記タンパク質が、可溶性形態で産生される組換えタンパク質である、先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
42. 前記タンパク質が、ホモ三量体またはヘテロ三量体を形成することができる、先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
43. 前記タンパク質が、特異的抗融合前ＭＰＥ８抗体に結合し、かつ特異的抗融合後ＭＦ１抗体に非常に弱く結合するかまたは結合しない、先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
44. 前記タンパク質が、前記ネイティブｈＭＰＶ Ｆタンパク質を認識する中和抗体を誘発することができる、先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
45. 先行請求項のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする単離された核酸分子。
46. 前記核酸が、配列番号１９～２３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド配列、またはそれに対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項４５に記載の核酸。
47. 請求項４５または４６に記載の核酸を含むウイルスベクター。
48. 請求項１～４４のいずれか一項に記載の免疫原性タンパク質、または請求項４５もしくは４６に記載の核酸分子、または請求項４７に記載のウイルスベクターを含み、任意に、薬学的に許容される担体および／または賦形剤をさらに含む、免疫原性組成物またはワクチン。
49. アジュバントをさらに含み、好ましくは前記アジュバントがアラムであるかまたはアラムを含む、請求項４８に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
50. 混合Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫応答を誘導するアジュバントをさらに含む、請求項４８に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
51. 少なくとも１つの追加の抗原、好ましくは任意の呼吸器ウイルス、特にｈＭＰＶ、ＲＳＶ、ＰＩＶ３、インフルエンザウイルスまたはコロナウイルスに由来する少なくとも１つの追加の抗原をさらに含む、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
52. 前記追加の抗原が、ＲＳＶ Ｆタンパク質、ＰＩＶ３ Ｆタンパク質、インフルエンザ血球凝集素またはコロナウイルスＳタンパク質である、請求項５１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
53. ヒト対象において気道感染に対する免疫応答を生成するための方法であって、有効量の請求項１～４４のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項４５もしくは４６に記載の核酸分子、または請求項４７に記載のウイルスベクター、または請求項４８～５２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
54. ヒト対象において気道感染を治療または予防するための方法であって、有効量の請求項１～４４のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項４５もしくは４６に記載の核酸分子、または請求項４７に記載のウイルスベクター、または請求項４８～５２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
55. 前記対象が、少なくとも１つの気道感染、特にｈＭＰＶ、ＲＳＶ、ＰＩＶ３、インフルエンザおよび／またはコロナウイルス感染のリスクがあるかまたはそれを有する、請求項５３または５４に記載の方法。
56. ヒト対象におけるｈＭＰＶ感染の予防および／または治療のための、請求項１～４４のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項４５もしくは４６に記載の核酸分子、または請求項４８～５２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物もしくはワクチンの使用。
57. 請求項１～４４のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項４８～５２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物もしくはワクチンを生産するための方法であって、請求項４５もしくは請求項４６に記載の核酸分子または請求項４７に記載のウイルスベクターから前記タンパク質を発現させることと、任意に、発現された前記タンパク質を薬学的に許容される担体および／または賦形剤と合わせることと、を含む、方法。

Images