ES2269371T3

ES2269371T3 - Proteinas de fusion con el antigeno de la nucleocapsida de la hepatitis b.

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Publication number: ES2269371T3
Application number: ES01919645T
Authority: ES
Inventors: A. School of Biochem. and Molecular Biology GEHIN; R. Univ. of Oxford Div. of Struc. Biology GILBERT; D. Univ. of Oxford Div. of Struc. Biology STUART; D. School of Biochem. and Molecular Bio. ROWLANDS
Original assignee: University of Leeds
Current assignee: University of Leeds
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-04-09
Publication date: 2007-04-01
Anticipated expiration: 2021-04-09
Also published as: EP1268530A1; EA200201077A1; KR20030009429A; EP1268530B1; DE60122300T2; AP1836A; CA2405438C; PT1268530E; MXPA02009895A; AU4670601A; AP2002002658A0; US20040223965A1; US7270821B2; CA2405438A1; BR0109919A; JP4713809B2; JP2003530123A; AU784345B2; CN1441807A; ZA200208967B

Abstract

Una proteína que comprende copias en tándem del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B (HBcAg), en la que el extremo C-terminal de una primera copia del HBcAg está unido al extremo N-terminal de una segunda copia del HBcAg.

Description

Proteínas de fusión con el antígeno de la nucleocápsida de la hepatitis B.

La invención se refiere a proteínas de fusión con el antígeno de la nucleocápsida (del inglés "core") del virus la hepatitis B, a partículas que contienen estas proteínas, a moléculas de ácido nucleico que codifican estas proteínas, a procedimientos para producir estas proteínas, a composiciones farmacéuticas que contienen estas proteínas y al uso de estas proteínas para vacunación profiláctica y terapéutica.

Antecedentes de la invención

La hepatitis B constituye un importante problema sanitario tanto en el mundo desarrollado como en el mundo en vías de desarrollo. La infección con el virus de la hepatitis B (HBV) puede producir una enfermedad aguda o crónica que en una proporción de casos puede desembocar en un carcinoma hepatocelular y llevar a la muerte. El virus tiene una doble cubierta, y su DNA se encuentra protegido dentro de una estructura proteica denominada antígeno de la nucleocápsida (HBcAg) (del inglés, " Hepatitis B core Antigen"). La nucleocápsida está rodeada por la proteína de la envuelta, conocida como antígeno de superficie o antígeno S (HBsAg). El HBcAg es un antígeno inusual que se puede usar como vehículo de administración de péptidos específicos al sistema inmunitario. Este antígeno se ha utilizado para presentar epítopos procedentes de diversos patógenos víricos y bacterianos a linfocitos T auxiliares, linfocitos B y lifocitos T citotóxicos (CTL), que incluyen epítopos del antígeno de superficie del HBV, de proteínas de la envuelta del virus de la hepatitis A y de antígenos del virus de la hepatitis C. Para una revisión, véase Ulrich y col. (1988) Advances in Virus Research, 50 141-142.

El HBcAg es un vehículo excelente para la presentación de epítopos debido a la estructura molecular de esta proteína, que se autoensambla formando partículas. Cada partícula se genera a partir de 180 ó 240 copias de un polipéptido monomérico. El monómero, cuando alcanza una concentración adecuada dentro de la célula hospedadora, forma una partícula de aproximadamente 27 nm de diámetro. Estudios estructurales han mostrado que los aminoácidos incluidos en la región de los residuos del 68 al 90 forman una estructura en espículas sobre la superficie de la partícula que se conoce como bucle e1. Dos monómeros unidos mediante enlaces disulfuro se ligan para formar una espícula dimérica, siendo el aminoácido más expuesto el situado en la posición 80 (en el centro del bucle e1).

El documento EP-A-421635 (The Wellcome Foundation Limited) describe una modificación del gen de la nucleocápsida de HBV que permite la inserción de epítopos extraños en el bucle e1 sin que se altere el potencial de la proteína para formar partículas. La inserción en este sitio permite la exposición máxima del epítopo insertado en la punta de cada una de las espículas creadas por los dímeros de la proteína. Debido a que hay aproximadamente 180 ó 240 copias de cada monómero por partícula, cada partícula es capaz de presentar 180 ó 240 copias del epítopo de interés.

Sumario de la invención

En los dímeros de HBcAg que forman los sillares estructurales de las partículas de la nucleocápsida, los bucles e1 adyacentes están estrechamente yuxtapuestos. Esto sugiere que las secuencias insertadas en el bucle e1 están conformacionalmente confinadas en las partículas ensambladas cuando están presentes en la proteína monomérica de la nucleocápsida. La invención busca resolver este problema uniendo covalentemente las proteínas de la nucleocápsida en forma de copias en tándem, p. ej., en forma de dímeros, de manera que las inserciones se puedan realizar independientemente en cada una de las copias. Esto es particularmente útil para la inserción de secuencias grandes en el bucle e1 porque permite que esas secuencias se inserten en solamente una de las copias de la proteína de la nucleocápsida por cada repetición en tándem, disminuyendo de este modo los potenciales conflictos conformacionales en el ensamblaje. Como alternativa, se puede insertar una secuencia diferente en cada bucle e1 de una repetición en tándem, aumentando de este modo la flexibilidad de las partículas HBcAg como sistema de presentación de epítopos.

Así pues, la invención proporciona una proteína que comprende copias en tándem del HBcAg. Esta proteína generalmente es un dímero que comprende dos copias del HBcAg. Un epítopo heterólogo se puede insertar en el bucle e1 de una o más de las copias de HBcAg. La proteína se ensambla en forma de partículas que presentan el epítopo heterólogo insertado en el bucle e1 sobre sus superficies y son útiles para la vacunación profiláctica y terapéutica de seres humanos y animales.

Descripción detallada de la invención La proteína

El sillar de la proteína de la invención es el HBcAg, que tiene 183 ó 185 aminoácidos (aa) dependiendo del subtipo del HBV. La secuencia de la proteína de 183 aminoácidos del subtipo ayw más una presecuencia de 29 aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 2. El HBcAg maduro va desde el residuo de Met de la posición 30 hasta el residuo de Cys en el extremo C-terminal, siendo la secuencia de las posiciones de 1 a 29 una presecuencia.

Esta proteína generalmente comprende sólo dos copias de HBcAg que forman un dímero porque los dímeros de HBcAg forman los sillares estructurales de las partículas de la nucleocápsida. Sin embargo, la proteína puede comprender más copias del HBcAg. Así, la proteína puede comprender de 2 a 8 copias, o de 2 a 4 copias del HBcAg. El uso de más de dos copias aumenta la flexibilidad del sistema; por ejemplo, el uso de tres copias permite que tres epítopos diferentes se inserten en tres bucles e1 de la proteína de la invención y de esta manera aumenta el alcance de la inmunorrespuesta inducida por la proteína de la invención.

El extremo C-terminal de una primera copia de HBcAg se une al extremo N-terminal de una segunda copia de HBcAg. De este modo, las unidades de HBcAg generalmente están unidas unas con otras de una manera extremo con extremo, es decir, el extremo C-terminal de una de las unidades está unido al extremo N-terminal de la unidad adyacente. Las unidades pueden estar unidas directamente mediante un enlace covalente (p. ej., un enlace peptídico), pero preferiblemente están unidas por una secuencia enlazadora que distancia las unidades adyacentes y de este modo previene cualquier problema de ruptura del empaquetamiento de unidades adyacentes. La naturaleza de la secuencia enlazadora se tratará más adelante.

Una o más de las unidades de HBcAg en la proteína de la invención puede ser el HBcAg natural de longitud completa. Sin embargo, generalmente al menos una de las unidades es una forma modificada del HBcAg, por ejemplo un HBcAg modificado mediante inserción de un epítopo heterólogo en el bucle e1. En los dímeros según la invención, una de las unidades de HBcAg puede estar modificada y la otra puede ser el HBcAg natural.

Como regla general, todas las modificaciones se eligen de manera que no interfieran con la conformación del HBcAg ni con su capacidad para ensamblarse en forma de partículas. Esas modificaciones se hacen en sitios de la proteína que no son importantes para el mantenimiento de su conformación, por ejemplo en el bucle e1, en el extremo C-terminal y/o en el extremo N-terminal. El bucle e1 de HBcAg puede tolerar inserciones p. ej. de 1 a 120 aminoácidos sin destruir la capacidad formadora de partículas de la proteína.

La secuencia de HBcAg se puede modificar mediante sustitución, inserción, deleción o extensión. El tamaño de la inserción, deleción o extensión puede ser, por ejemplo, de 1 a 200 aa, de 3 a 100 aa o de 6 a 50 aa. Las sustituciones pueden involucrar un número de aminoácidos, por ejemplo, de hasta 1, 2, 5, 10, 20 ó 50 aminoácidos a lo largo de la secuencia del HBcAg. Puede haber una extensión en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal del HBcAg. Puede haber una deleción en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal o en un sitio interno de la proteína. Se pueden hacer sustituciones en cualquier posición de la secuencia de la proteína, también se pueden hacer inserciones en cualquier punto de la secuencia de la proteína, pero típicamente se hacen en las regiones expuestas en la superficie de la proteína tales como el bucle e1. Una secuencia insertada puede portar un epítopo heterólogo. En cada unidad de HBcAg se puede hacer más de una modificación. Así, es posible hacer una extensión o deleción terminal y también una inserción interna. Por ejemplo, se puede hacer un truncamiento en el extremo C-terminal y una inserción en el bucle e1.

Las sustituciones generalmente serán conservadoras y se pueden hacer, conforme a la siguiente Tabla, en la que los aminoácidos que se encuentran en el mismo bloque de la segunda columna, y preferiblemente en la misma línea de la tercera columna, se pueden sustituir entre sí.

Alifáticos	No polares	G A P
		I L V
	Polares sin carga	C S T M
		N Q
	Polares con carga	D E
		K R
Aromáticos	H F W Y

Cada una de las partes de la secuencia de HBcAg presente en la proteína de la invención preferiblemente presenta una identidad de secuencia de al menos el 70 % con la secuencia correspondiente de una proteína HBcAg natural, tal como la proteína que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2. Más preferiblemente, la identidad es de al menos el 80%, de al menos el 90%, de al menos el 98%, de al menos el 97% o de al menos el 99%. Los métodos para medir la identidad de secuencias de proteínas (y de secuencias de ácidos nucleicos) son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, el Paquete de programas UWGCG proporciona el Programa BESTFIT (Devereux y col. (1984) Nucleic Acids Research 12, págs. 387-395). De manera similar, los algoritmos PILEUP y BLAST se pueden usar para alinear secuencias (por ejemplo según se describe en Altschul S.F. (1993) J. Mol. Evol. 36: 290-300 y en Altschul, S.F. y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410).

El bucle e1 de HBcAg se encuentra en las posiciones de 68 a 90, y se puede insertar un epítopo heterólogo en un lugar cualquiera entre estas posiciones. Preferiblemente, el epítopo se inserta en la región de las posiciones de 69 a 90, de 71 a 90 o de 75 a 85. Es más preferido insertar el epítopo entre los residuos de aminoácido 79 y 80 o entre los residuos 80 y 81. Cuando se inserta un epítopo heterólogo, la secuencia completa de HBcAg puede mantenerse, o como alternativa la totalidad o una parte de la secuencia del bucle e1 se puede delecionar y reemplazar por la secuencia heteróloga. Así, los residuos de aminoácido de 69 a 90, de 71 a 90 o de 75 a 85 pueden ser reemplazados por un epítopo heterólogo. Cuando un epítopo heterólogo reemplaza a la secuencia del bucle e1, el epítopo por lo general no es más corto que la secuencia a la que reemplaza.

Un truncamiento C-terminal de HBcAg generalmente no será de más de 144 aa porque si se hace un truncamiento de mayor tamaño, las partículas pueden no formarse. Por lo tanto, los aminoácidos delecionados pueden, por ejemplo, comprender 144 aa en dirección al aa C-terminal (el aa 183 o el aa 185), 150 aa en dirección al aa C-terminal, 164 aa en dirección al aminoácido C-terminal o 172 aa en dirección al aa C-terminal. El extremo C-terminal de HBcAg se une a DNA y el truncamiento del extremo C-terminal por consiguiente disminuye o elimina por completo el DNA de las preparaciones de HBcAg y de proteínas híbridas de HBcAg.

La proteína de la invención forma partículas que preferiblemente se asemejan a las partículas formadas por el HBcAG natural. Las partículas de la invención típicamente tienen al menos 10 nm de diámetro, por ejemplo, de 10 nm a 50 nm, o de 20 nm a 40 nm de diámetro, pero preferiblemente tienen un diámetro de 27 nm (que es el tamaño de las partículas naturales del HBcAg. Comprenden múltiples unidades de HBcAg, por ejemplo, de 150 a 300 unidades, pero generalmente, se establecen en aproximadamente 180 unidades o a aproximadamente 240 unidades (que es el número de unidades que hay en las partículas de HBcAg natural). Cuando la proteína de la invención es un dímero, esto significa que el número de monómeros de la proteína presentes en las partículas puede ser de 75 a 150 pero generalmente es de aproximadamente 90 o de aproximadamente 120.

La secuencia enlazadora situada entre unidades adyacentes de HBcAg, generalmente es una cadena de aminoácidos de al menos 1,5 nm (15 Å) de longitud, por ejemplo de 1,5 nm a 10 nm, de 1,5 nm a 5 nm, o de 1,5 nm a 3 nm. Puede comprender, por ejemplo, de 4 aa a 40 aa o de 10 aa a 30 aa, preferiblemente de 15 aa a 21 aa. La secuencia enlazadora generalmente es flexible. Los aminoácidos de la secuencia enlazadora pueden, por ejemplo, incluir, o componerse en su totalidad de glicina, serina y/o prolina. Una secuencia enlazadora preferida comprende una o más repeticiones de la secuencia GlyGlySer (GGS). Como alternativa, la secuencia enlazadora puede comprender uno o más repeticiones del dipéptido GlyPro (GP). El número de repeticiones puede ser, por ejemplo, de 1 a 18, preferiblemente de 3 a 12. En el caso de repeticiones de GGS, se ha encontrado que el uso de 5, 6, ó 7 repeticiones permite la formación de partículas. La secuencia enlazadora puede corresponder a la región bisagra de un anticuerpo; esta región bisagra se piensa que proporciona una junta flexible entre el dominio de unión a antígeno y el dominio de la cola de los anticuerpos.

Según se ha indicado anteriormente, se puede insertar un epítopo heterólogo en una o más de las copias de HBcAg en la proteína de la invención, preferiblemente en el bucle e1. Un epítopo "heterólogo" es un epítopo que normalmente no está situado en la posición en la que está situado en el HBcAg; generalmente procede de una proteína diferente del HBcAg pero puede proceder de un lugar diferente de HBcAg. El epítopo comprende una secuencia de aminoácidos que provoca una inmunorrespuesta. El epítopo puede ser conformacional o lineal. Puede estar, por ejemplo, en una secuencia de 6 aa a 120 aa, de 6 aa a 50 aa o de 6 aa a 20 aa. Una ventaja importante de la invención es que permite que epítopos portados en secuencias de gran tamaño se inserten en el bucle e1, por ejemplo portados en secuencias de 30 aa a 120 aa, de 40 aa a 120 aa o de 60 aa a 120 aa.

La proteína de la invención puede contener más de un epítopo heterólogo, por ejemplo puede contener hasta 2, 3, 5 ó 8 epítopos heterólogos, y en este caso los epítopos pueden estar presentes en la misma unidad de HBcAg o en unidades diferentes de HBcAg. En cada una de las unidades de HBcAg se puede insertar más de una copia de un epítopo, por ejemplo, se pueden insertar de 2 a 8 copias. Cuando hay dos o más epítopos heterólogos en la proteína de la invención, pueden proceder del mismo organismo o de organismos diferentes, o pueden proceder de la misma proteína o de proteínas diferentes.

El epítopo puede ser un epítopo para células T o un epítopo para células B. Si es un epítopo para células T, puede ser un epítopo para linfocitos T citotóxicos (CTL) o un epítopo para células T auxiliares (Th) (del inglés, " T-helper") (p. ej., un epítopo para Th1 o un epítopo para Th2). En una realización preferida de la invención, uno de los epítopos es un epítopo para células T auxiliares y otro de los epítopos es un epítopo para células B o un epítopo para CTL. La presencia del epítopo para células T auxiliares aumenta la inmunorrespuesta frente al epítopo para células B o para CTL.

La elección del epítopo depende de la enfermedad contra la que se desea vacunar. El epítopo puede proceder, por ejemplo, de un organismo patógeno, de un antígeno asociado al cáncer o de un alergeno. El organismo patógeno puede ser, por ejemplo, un virus, una bacteria o un protozoo.

Ejemplos de patógenos cuyos epítopos pueden ser insertados incluyen el virus de la hepatitis A (HAV), HBV, HCV, virus de la gripe, virus de la fiebre aftosa, poliovirus, virus del herpes simple, virus de la rabia, virus de la leucenmia felina, virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (HIV1), virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 2 (HIV2), virus de la inmunodeficiencia simia (SIV), rinovirus humano, virus del dengue, virus de la fiebre amarilla, virus del papiloma humana, virus respiratorio sincitial, Plasmodium falciparum (causante de la malaria), y bacterias tales como Mycobacteria, Bordetella, Salmonella, Escherichia, Vibrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia y Brucella. Concretamente, las bacterias pueden ser Mycobacterium tuberculosis - causante de la tuberculosis; Bordetella pertussis o Bordatella parapertussis-causantes de la tosferina; Salmonella typhimurium - causante de salmonelosis en varias especies animales; Salmonella typhi - causante de la fiebre tifoidea humana; Salmonella enteriditis - causante de intoxicaciones alimentarias en seres humanos; Salmonella choleraesuis - causante de salmonelosis en cerdos; Salmonella dublin - causante tanto de la enfermedad sistémica como de enfermedad diarreica en ganado vacuno, especialmente en terneros recién nacidos; Escherichia coli - causante de intoxicaciones alimentarias en seres humanos; Haemophilus influenzae - causante de la meningitis; Neisseria gonorrhoeae - causante de la gonorrea; Yersinia enterocolitica - causante
de un espectro de enfermedades en seres humanos que van desde la gastroenteritis hasta la enfermedad septicémica mortal; y Brucella abortus - causante de abortos y esterilidad en ganado vacuno y de una enfermedad conocida como fiebre de Malta en seres humanos.

Ejemplos de epítopos candidatos para usar en la invención incluyen epítopos procedentes de los siguientes antígenos: los antígenos gp120, gp 160, gag, pol, Nef, Tat y Ref de HIV; los antígenos proteína CS y proteína 2 de la superficie del Esporozoito de la malaria; los antígenos HA, NP y NA del virus de la gripe; los antígenos de virus herpes gp340 de EBV, gp85 de EBV, gB de HSV, gD de HSV, gH de HSV, producto proteico temprano de HSV, gB de citomegalovirus, gH de citomegalovirus y proteína gp72 de IE; los antígenos E4, E6 y E7 del virus del papiloma humano; los antígenos proteína F, proteína G y proteína N del virus respiratorio sincitial; antígeno pertactina de B. pertussis; los antígenos tumorales CEA de carcinoma, mucina asociada a carcinoma, P53 de carcinoma, MPG de melanoma, P97 de melanoma, antígeno MAGE, producto del oncogén Neu de carcinoma, antígeno específico de la próstata (PSA) (del inglés, " Prostate Specific Antigen"), antígeno asociado a la próstata, proteína ras y myc; alergeno de ácaros del polvo doméstico.

Son epítopos especialmente preferidos los procedentes de la región pre-S1, región pre-S2, región S, o del antígeno de la nucleocápsida de HBV. Es posible insertar la totalidad de la región pre-S1 y/o la totalidad de la región pre-S2 en el HBcAg, pero generalmente se inserta solamente una parte de una de estas regiones. La parte insertada tiene típicamente una longitud de al menos 6 aminoácidos, por ejemplo de 6 aa a 120 aa, de 20 aa a 80 aa o de 20 a 50 aa. El inserto puede incluir, por ejemplo, los residuos situados en las posiciones 1-9, 10-19, 20-29, 30-39, 40-49, 50-59, 60-69, 70-79, 80-89, 90-99, 100-109 ó 110-119 de la región pre-S1, o los residuos situados en las posiciones 120-129, 130-139, 140-149, 150-159, 160-169 ó 170-174 de la región pre-S2. Los insertos particularmente preferidos son los residuos 20-47 de la región pre-S1 y los residuos 139-174 de la región pre-S2.

Preparación de las proteínas de la invención

Las proteínas de la invención en general se preparan mediante la tecnología del DNA recombinante. La invención incluye una molécula de ácido nucleico (p. ej. DNA o RNA) que codifica una proteína de la invención, tal como un vector de expresión. Las moléculas de ácido nucleico se pueden preparar usando técnicas conocidas de manipulación de ácidos nucleicos. Típicamente, se preparan dos construcciones de DNA diferentes que codifican dos unidades del HBcAg y luego se unen entre sí mediante una PCR solapante.

Se puede producir una proteína de la invención cultivando una célula hospedadora que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína en las condiciones en las que esa proteína se expresa, y recuperando la proteína. Células hospedadoras adecuadas incluyen bacterias tales como E. coli, levaduras, células de mamíferos y otras células eucariotas, por ejemplo las células Sf9 de insectos.

Los vectores que constituyen moléculas de ácido nucleico según la invención, pueden ser, por ejemplo, vectores plasmídicos o vectores víricos. Pueden contener un origen de replicación, un promotor para la expresión de la secuencia que codifica la proteína, una secuencia reguladora del promotor tal como una secuencia estimuladora de la transcripción, una señal de terminación de la transcripción, una señal de iniciación de la traducción y/o una señal de terminación de la traducción. Los vectores también pueden contener uno o más genes marcadores de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano o un gen de resistencia a neomicina en el caso de un vector de expresión en mamíferos. Los vectores se pueden usar in vitro, por ejemplo, para la producción de RNA, o se pueden usar para transformar o transfectar una célula hospedadora. El vector se puede también adaptar para usar in vivo, por ejemplo, en un método de terapia génica o en una vacunación con DNA.

Los promotores, secuencias estimuladoras de la transcripción y otras señales reguladoras de la expresión se pueden seleccionar para que sean compatibles con la célula hospedadora con respecto a la que el vector de expresión se diseña. Por ejemplo, se pueden usar promotores procariotas, en particular los que son adecuados para usar en cepas de E. coli (tal como E. coli HB101). Se puede usar un promotor cuya actividad es inducida en respuesta a un cambio en el medio entorno circundante, tal como unas condiciones anaerobias. Preferiblemente se puede usar un promotor htrA o nirB. Estos promotores se pueden usar en particular para expresar la proteína en una bacteria atenuada, por ejemplo para usar como una vacuna. Cuando la expresión de la proteína de la invención se lleva a cabo en células de mamíferos, ya sea in vitro o in vivo, se pueden usar promotores de mamíferos. También se pueden usar promotores específicos de tejido, por ejemplo promotores específicos de hepatocitos. También se pueden usar promotores víricos, por ejemplo, la repetición terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLVLTR), el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), el promotor de SV40, el promotor de IE de citomegalovirus (CMV) para seres humanos, promotores del virus del herpes simple y promotores de adenovirus. Todos estos promotores se encuentran fácilmente disponibles en la técnica.

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Una proteína según la invención se puede purificar usando técnicas convencionales para la purificación de proteínas. La proteína, por ejemplo, se puede proporcionar en forma purificada, pura o aislada. Para su uso en una vacuna, la proteína por lo general se debe proporcionar con un nivel alto de pureza, por ejemplo, con un nivel en el que la vacuna constituye más del 80%, más del 90%, más del 95%, o más del 98% de la proteína contenida en la preparación. Sin embargo, puede ser conveniente mezclar la proteína con otras proteínas en la formulación final de la vacuna.

Vacunación contra enfermedades

El uso principal de las proteínas de la invención es como vacunas terapéuticas o profilácticas. La invención incluye una composición farmacéutica (p. ej. una composición de vacuna) que comprende una proteína de la invención, una partícula de la invención o una molécula de ácido nucleico de la invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

El principio que respalda la vacunación profiláctica es inducir una inmunorrespuesta en un hospedador de manera que se genere una memoria inmunológica en el hospedador. Esto significa que, cuando el hospedador se expone al patógeno virulento, eleva una inmunorrespuesta efectiva (protectora), es decir, una inmunorrespuesta que inactiva y/o mata al patógeno. La invención podría constituir la base de una vacuna profiláctica contra una variedad de enfermedades y estados, tales como infección por HBV, infección por HAV, infección por HCV, gripe, fiebre aftosa, polio, herpes, rabia, SIDA, fiebre del dengue, fiebre amarilla, malaria, tuberculosis, tosferina, fiebre tifoidea, intoxicaciones alimentarias, diarrea, meningitis y gonorrea. Los epítopos de la proteína de la invención se eligen de manera que sean adecuados en relación con la enfermedad contra la que la vacuna quiere proporcionar protección.

El principio que respalda la vacunación terapéutica es estimular el sistema inmunitario del hospedador para aliviar o erradicar una enfermedad o estado. Existen varias enfermedades o estados que pueden ser susceptibles a una vacunación terapéutica, tales como las enfermedades víricas crónicas que incluyen la infección crónica por HBV y la infección crónica por HCV, cáncer y alergias tales como asma, atopia, eccema, rinitis y alergias alimentarias.

Las enfermedades víricas crónicas aparecen cuando el sistema inmunitario de un hospedador infectado es incapaz de eliminar el virus, permitiendo que el virus persista en el hospedador durante un largo período de tiempo. La invención se puede usar para inducir al sistema inmunitario del individuo que padece una infección crónica a que elimine el virus. Por ejemplo, se cree que pacientes con hepatitis crónica presentan una respuesta inadecuada de las células T, y que la estimulación de una respuesta apropiada de células T puede eliminar el virus. Por lo tanto, con el fin de tratar la hepatitis vírica crónica usando la invención, se pueden insertar epítopos para células T en la proteína de la invención, tales como epítopos para células T procedentes de las regiones pre-S1 y pre-S2 del HBV.

De manera similar, en el caso del cáncer, se piensa que la estimulación de la respuesta de células T frente a antígenos tumorales puede ayudar al sistema inmunitario a destruir el tumor. Se piensa que las enfermedades alérgicas están causadas al menos en parte por una respuesta desequilibrada de las células T en la que la respuesta Th2 de tipo inflamatorio domina sobre una respuesta Th1 de tipo antagonista y que las alergias pueden por lo tanto tratarse estimulando la respuesta Th1. Esto se puede realizar según la invención usando una proteína que contenga un epítopo heterólogo que estimule una respuesta Th1.

Los vehículos y diluyentes adecuados pasa su inclusión en las composiciones farmacéuticas de la invención son disoluciones isotónicas salinas, por ejemplo la disolución salina tamponada con fosfato. La composición normalmente incluirá un adyuvante, tal como hidróxido de aluminio. La composición se puede formular en forma líquida para inyección. La composición comprende la proteína, partículas o un ácido nucleico en una cantidad profilácticamente o terapéuticamente efectiva. Típicamente, la proteína o las partículas se administran en una dosis de 0,1 \mug a 20 \mug, preferiblemente de 1 \mug a 100 \mug, más preferiblemente de 10 \mug a 50 \mug por kg de peso corporal. El ácido nucleico de la invención se puede administrar directamente en forma de una construcción de ácido nucleico desnudo usando métodos conocidos en la técnica o usando vectores conocidos en la técnica. La cantidad de ácido nucleico administrado está típicamente en el intervalo de 1 \mug a 10 mg, preferiblemente de 100 \mug a 1 mg. La vacuna se puede administrar con un régimen de una dosis única o con un régimen de dosis múltiples. Por ejemplo, de 2 a 32 dosis o de 4 a 16 dosis. Las vías de administración y las dosis anteriormente mencionadas, quieren ser solamente una guía, y la vía y la dosis en último término pueden estar bajo criterio del médico.

Parte experimental Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Modelo hipotético que muestra la posibilidad de un dímero unido AB de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B.

Figura 2: Representación esquemática de la construcción de nucleocápsidas en hetero-tándem y en homo-tándem. Las barras representan las estructuras primarias de las proteínas. Dentro del dominio de ensamblaje de HBcAg (aminoácidos 1-144), aparecen indicados el bucle e1 (rectángulo negro) y las regiones implicadas en los contactos intradímero (sombreado claro) y en los contactos interdímeros (sombreado oscuro). El dominio de unión a ácido nucleico, rico en Arg, está simbolizado con +. Los cebadores (Tabla 1) aparecen indicados en forma de flechas.

Figura 3: SDS-PAGE al 12% de las fracciones resultantes de una separación en un gradiente de densidad de sacarosa de partículas de nucleocápsidas en homo-tándem.

Figura 4: Microfotografía electrónica de partículas de nucleocápsidas en hetero-tándem con una secuencia enlazadora que contiene cinco repeticiones GGS.

Figura 5: Transferencia Western que muestra la expresión eficiente de nucleocápsidas en hetero-tándem en E. coli. Las nucleocápsidas contenían respectivamente 5, 6 y 7 repeticiones de GGS como secuencia enlazadora (GGS5, GGS6 y GGGS7).

Figura 6: Resultados de una criomicroscopía electrónica de partículas de nucleocápsidas en tándem. La Figura
6(a) muestra una partícula de nucleocápsidas en tándem (la partícula de la izquierda) en comparación con una partícula natural (la partícula del centro). La parte derecha de la Figura 6(a) muestra la parte C-terminal del antígeno de la nucleocápsida en una partícula de nucleocápsidas en tándem. La Figura 6(b) muestra el encaje de una porción de la estructura de una partícula de nucleocápsidas en tándem con una partícula natural.

Métodos

El examen de la estructura de las partículas de nucleocápsidas de HBV sugirió que una secuencia enlazadora flexible de al menos 1,5 nm (15 Å) podría usarse para enlazar las dos proteínas en un par dímero sin romper su integridad estructural (Figura 1). Por consiguiente, se prepararon construcciones mediante PCR solapantes en las que la proteína de la nucleocápsida en dirección aguas arriba se truncó hasta el residuo 149 y luego se ligó a una copia aguas abajo a través de 5, 6 ó 7 copias de una secuencia de repetición GlyGlySer (GGS) (Figura 2). La copia aguas abajo fue, o la proteína de la nucleocápsida de longitud completa, o se truncó en el aminoácido 149 para retirar la región C-terminal rica en Arg. La Tabla 1 proporciona las secuencias de oligonucleótidos usadas para construir las diferentes nucleocápsidas en tándem de HBV.

Las construcciones se clonaron en el vector de expresión ptrc99A, se utilizaron para transformar E. coli JM 109 y se hizo una inducción con IPTG. Las células se recogieron luego mediante centrifugación, se resuspendieron en PBS y sonicaron dos veces. Los lisados que contenían las nucleocápsidas en tándem solubles que habían sido expresadas se llevaron a una concentración del 30% de sulfato amónico con sulfato amónico saturado y las proteínas precipitadas se recogieron mediante centrifugación, se resuspendieron en PBS y se dializaron frente a disolución salina tamponada con fosfato. El lisado clarificado se cargó sobre gradientes lineales de sacarosa del 15% - 45% y se centrifugó a 28.000 rpm durante 4 horas a 4ºC. Los gradientes se separaron en fracciones desde el fondo del tubo en partes alícuotas de 2 ml y se analizaron mediante SDS-PAGE y Transferencia Western usando un anticuerpo monoclonal primario dirigido contra la proteína de la nucleocápsida de HBV (mAb13).

Las preparaciones de partículas de nucleocápsidas de HBV se aplicaron en forma de manchas sobre rejillas recubiertas de carbono, se sometieron a tinción negativa con acetato de uracilo y se visualizaron mediante microscopía electrónica de transmisión. Las estructuras de las partículas de nucleocápsidas se determinaron usando criomicroscopia electrónica.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Secuencias de los cebadores oligonucleotídicos usados para clonar genes de nucleocápsidas en tándem de HBV en ptrc99A

1

Resultados

Las proteínas de nucleocápsidas en tándem de HBV con 5, 6 ó 7 copias de GGS se expresaron todas ellas satisfactoriamente y se demostró que migraban en geles de poliacrilamida con las movilidades esperadas. Cada una de ellas se ensambló formando partículas de nucleocápsidas según se evidenció por sus sedimentaciones en gradientes de densidad de sacarosa (Figura 3) y por sus aspectos al microscopio electrónico (Figura 4). Las partículas conservaron sus propiedades antigénicas según se demostró por sus reactividades en un ensayo ELISA y en transferencias Western (Figura 5). Además, las estructuras de las partículas formadas por las proteínas de nucleocápsidas en tándem fueron indistinguibles de la estructura de las partículas formadas por nucleocápsidas naturales observadas por criomicroscopía electrónica (Figura 6).

<110> MEDEVA EUROPE LIMITED

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<120> PROTEÍNAS DE FUSIÓN CON EL ANTÍGENO DE LA NUCLEOCÁPSIDA DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B

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<130> N79405

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<160> 2

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 639

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<212> DNA

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<213> Virus de la hepatitis B

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(639)

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<400> 1

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2

3

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<210> 2

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Virus de la hepatitis B

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<400> 2

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4

5

Claims

1. Una proteína que comprende copias en tándem del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B (HBcAg), en la que el extremo C-terminal de una primera copia del HBcAg está unido al extremo N-terminal de una segunda copia del HBcAg.

2. Una proteína según la reivindicación 1, que es un dímero de dos copias del HBcAg.

3. Una proteína según la reivindicación 1 ó 2, en la que una o más de las copias del HBcAg contiene un epítopo heterólogo en el bucle e1.

4. Una proteína según la reivindicación 3, en la que todas las copias del HBcAg contienen un epítopo heterólogo en el bucle e1.

5. Una proteína según la reivindicación 4, en la que todas las copias contienen el mismo epítopo heterólogo en el bucle e1.

6. Una proteína según la reivindicación 4, en la que cada una de las copias contiene un epítopo heterólogo diferente en el bucle e1.

7. Una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones de 3 a 6, en la que el epítopo heterólogo o cada uno de los epítopos heterólogos procede de la región pre-S1 o de la región pre-S2 del virus de la hepatitis B (HBV).

8. Una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones de 3 a 7, en la que el epítopo heterólogo o cada uno de los epítopos heterólogos está en una secuencia heteróloga de 10 a 120 residuos de aminoácidos en el bucle
e1.

9. Una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que una o más de las copias del HBcAg está truncada en el extremo C-terminal.

10. Una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que las copias en tándem del HBcAg están unidas por una secuencia enlazadora.

11. Una proteína según la reivindicación 10, en la que la secuencia enlazadora tiene una longitud de al menos 1,5 nm.

12. Una proteína según la reivindicación 10 ó 11, en la que la secuencia enlazadora comprende múltiples copias de la secuencia GlyGlySer (GGS).

13. Una proteína según la reivindicación 12, en la que la secuencia enlazadora comprende 5, 6 ó 7 copias de la secuencia GGS.

14. Una partícula que comprende múltiples copias de una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

15. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 13.

16. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 15, que es un vector de expresión.

17. Una célula hospedadora que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 15 ó 16.

18. Un procedimiento para producir una proteína como la reivindicada en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 13, procedimiento que comprende cultivar una célula hospedadora que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína, en condiciones en las que la proteína se expresa, y recuperar la proteína.

19. Una composición farmacéutica que comprende una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 13, una partícula según la reivindicación 14 o una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 15 ó 16, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

20. Una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 13, una partícula según la reivindicación 14 o una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 15 ó 16, para usar en un método de vacunación profiláctica o terapéutica de un organismo humano o animal.

21. Una proteína, una partícula o una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 20, para usar en un método de vacunación profiláctica o terapéutica de un organismo humano o animal contra HBV.

22. Uso de una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 13, de una partícula según la reivindicación 14 o de una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 15 ó 16, en la fabricación de un medicamento para la vacunación profiláctica o terapéutica de un organismo humano o animal contra HBV.