PT1268530E

PT1268530E - Proteínas de fusão do antigénio do core da hepatite b

Info

Publication number: PT1268530E
Application number: PT01919645T
Authority: PT
Inventors: A Gehin; R Gilbert; D Stuart; D Rowlands
Original assignee: Univ Leeds
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-04-09
Publication date: 2006-12-29
Also published as: US20040223965A1; US7270821B2; CA2405438C; KR20030009429A; DE60122300D1; DK1268530T3; AU784345B2; CA2405438A1; MXPA02009895A; ZA200208967B; CN1441807A; KR100808313B1; AU4670601A; WO2001077158A1; JP2003530123A; CN100360556C; DE60122300T2; ES2269371T3; BR0109919A; EP1268530A1

Description

Descrição "PROTEÍNAS DE FUSÃO DO ANTIGÉNIO DO CORE DA HEPATITE B" A invenção é relativa a proteínas de fusão do antigénio do core da hepatite B, partículas contendo as proteínas, moléculas de ácido nucleico que codificam as proteínas, processos para a produção das proteínas, composições farmacêuticas contendo as proteínas e utilização das proteínas em vacinação profilática e terapêutica.

Antecedentes da invenção A hepatite B é um problema de saúde de extrema importância, tanto. em todo o mundo desenvolvido como em todo o mundo em desenvolvimento. A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) pode resultar numa doença aguda ou crónica que numa parte dos casos pode conduzir a carcinoma hepatocelular e à morte. 0 vírus possui dupla membrana e o seu ADN encontra-se protegido, no interior de uma estrutura proteica designada por antigénio do core (AgHBc). O core encontra-se envolvido por uma proteína envelope designada por antigénio de superfície ou S (AgHBs). 0 AgHBc é um antigénio invulgar o qual pode ser utilizado como veículo de distribuição de péptidos específicos ao sistema imunitário. 0 antigénio foi utilizado para proporcionar epítopos de linfócito T auxiliar, B e citotóxico (CTL) provenientes de uma variedade de patogénios virais e bacterianos, incluindo epítopos do antigénio de superfície do VHB, proteínas envelope do vírus da hepatite A e antigénios do vírus da hepatite C. Para uma revisão veja-se Ulrich et al (1998) Advances in Vírus Research 50 141-182. 0 AgHBc é um excelente veículo para a apresentação de epítopos devido à estrutura molecular da proteína, a qual por auto-montagem forma partículas'. Cada partícula é gerada 2 a partir de 180 ou 240 cópias de um polipéptido monomérico. O monómero, ao atingir uma concentração apropriada no interior da célula hospedeira, forma uma partícula com aproximadamente 27 nm de diâmetro. Estudos estruturais mostraram que os aminoácidos na região dos resíduos 68 a 90 formam uma estrutura com picos na superfície da partícula que é designada por loop el. Dois monómeros ligados por ligações dissulfureto ligam-se para formar um pico de dímeros, sendo o aminoácido mais exposto o da posição 80 (no centro do loop el). A EP-A-421635 (The Welcome Foundation Limited) descreve uma modificação do gene do core do VHB para permitir a inserção de epítopos estranhos no loop el sem alterar o potencial da proteína para formar partículas. A inserção neste local permite exposição máxima do epítopo inserido na ponta de cada pico criada por dímeros da proteína. Como há aproximadamente 180 ou 240 cópias de cada monómero por partícula, cada partícula pode apresentar 180 ou 240 cópias do epítopo com interesse.

Sumário da invenção

Nos dímeros de AgHBc que formam os elementos estruturais das partículas do core, os loops el adjacentes encontram-se exactamente justapostos. É proposto que sequências inseridas no loop el tenham restrições conformacíonais nas partículas formadas, quando se apresentam em proteína do core monomérica. A invenção pretende resolver este problema ligando as proteínas do core por ligação covalente, como cópias tandem, por exemplo como dímeros, de modo a que se possam realizar, independentemente, inserções em cada cópia. Isto é particularmente útil para a inserção de grandes sequências no loop el porque permite que tais 3 sequências sejam introduzidas em apenas uma cópia da proteína do core por cada repetição de tandem, reduzindo assim potenciais conflitos de conformação durante a montagem. Alternativamente, uma sequência diferente poderá ser introduzida em cada loop el de repetição tandem, aumentando assim a flexibilidade das partículas de AgHBc como sistema de administração de epítopos.

Assim, a invenção fornece uma proteína que compreende cópias tandem de AgHBc. A proteína é geralmente um dimero compreendendo duas cópias de AgHBc. Um epítopo heterólogo pode ser inserido no loop el de uma ou mais das cópias de AgHBc. A proteína por montagem forma partículas que apresentam o epítopo heterólogo inserido no loop el das suas superfícies e são utilizáveis na vacinação profilática e terapêutica de homens e animais.

Descrição detalhada da invenção A proteína 0 elemento constitutivo fundamental da proteína da invenção é AgHBc, que contém 183 ou 185 aminoácidos (aa) dependendo do subtipo de VHB. A sequência da proteína com 183 aminoácidos do subtipo ayw bem como uma pré-sequência de 29 aminoácidos é exibida em SEQ ID No. 2. 0 AgHBc maduro vai do resíduo Met na posição 30 até ao resíduo Cys no C-terminal extremo, com a sequência das posições 1 a 29 a ser uma pré-sequência. A proteína compreende, geralmente, apenas duas cópias de AgHBc, formando um dimero, porque os dímeros de AgHBc formam os elementos constitutivos das partículas do core. No entanto, a proteína pode compreender mais cópias de 4

AgHBc. Assim, a proteína pode compreender de 2 a 8 cópias ou de 2 a 4 cópias de AgHBc. A utilização de mais do que duas cópias aumenta a flexibilidade do sistema; por exemplo, a utilização de três cópias permite que três epitopos diferentes sejam inseridos em três loops el na proteína da invenção e, assim, aumenta a extensão da resposta imunitária induzida pela proteína da invenção. 0 C-terminal de uma primeira unidade de AgHBc encontra-se ligado ao N-terminal de uma segunda unidade de AgHBc. Assim, as unidades AgHBc encontram-se geralmente ligadas de um modo cabeça com pés, isto é, 0 C-terminal de uma unidade encontra-se lig,ado ao N-terminal da unidade adjacente. As unidades podem estar ligadas directamente através de uma ligação covalente (por exemplo uma ligação peptídica), mas de preferência encontram-se ligadas por um linker que cria espaço entre as unidades adjacentes e assim previne quaisquer problemas de interrupção da montagem de unidades adjacentes. A natureza do linker é discutida abaixo.

Uma ou mais das unidades AgHBc, na proteína da invenção, podem ser nativas em toda a extensão do AgHBc. No entanto, geralmente pelo menos uma das unidades é uma forma modificada de AgHBc, por exemplo AgHBc modificado por inserção de um epítopo heterólogo no loop el. Nos dímeros, de acordo com a invenção, uma das unidades AgHBc pode ser modificada e a outra pode ser AgHBc nativo.

Regra geral, quaisquer modificações são escolhidas de modo a não interferir com a conformação do AgHBc e a sua capacidade de montagem para formar partículas. Taís modificações são realizadas em locais da proteína que não são importantes para a manutenção da sua conformação, por 5 exemplo no loop el, no C-terminal e/ou no N-terminal. 0 loop el do AgHBc pode tolerar inserções de, por exemplo, 1 a 120 aminoácidos sem destruir a capacidade de formar partículas da proteína. A sequência do AgHBc pode ser modificada por uma substituição, inserção, delecção ou extensão. A extensão da inserção, delecção ou extensão pode, por exemplo, ser de 1 a 200 aa, de 3 a 100 aa ou de 6 a 50 aa. As substituições podem envolver um número de aminoácidos até, por exemplo, 1, 2, 5, 10, 20 ou 50 aminoácidos na extensão da sequência do AgHBc. Uma extensão pode ser no N-ou C-terminal do AgHBc. Uma delecção pode ser no N-terminal, C-terminal ou num local interno da proteína. As substituições podem ser efectuadas em qualquer posição na sequência da proteína. As inserções podem, também, ser efectuadas em qualquer ponto na sequência da proteína, mas são tipicamente efectuadas em regiões de superfície exposta da proteína, tal como o loop el. Uma sequência inserida pode ser portadora de um epitopo heterólogo. Pode ser efectuada mais do que uma modificação em cada unidade de AgHBc. Assim, é possível realizar uma extensão ou delecção terminal e também uma inserção interna. Por exemplo, uma truncagem pode ser efectuada no C-terminal e uma inserção pode ser efectuada no loop el.

As substituições serão geralmente conservadoras e podem ser efectuadas, por exemplo, de acordo com a Tabela seguinte, na qual os aminoácidos no mesmo segmento na segunda coluna e, de preferência, na mesma linha na terceira coluna podem ser substituídos entre si. 6

Cada parte da sequência do AgHBc na proteína da invenção tem, de preferência, pelo menos 70% da sequência idêntica à da correspondente sequência de uma proteína AgHBc natural, tal como a proteína que possui a sequência apresentada em SEQ ID NO: 2. De maior preferência, a identidade é de pelo menos de 80%, pelo menos 90%, pelo menos 98%, pelo menos 97% ou pelo menos 99%. Os métodos para medir a identidade da sequência da proteína (e a sequência dos ácidos nucleicos) são bem conhecidos na arte. Por exemplo, a solução UWGCG fornece o programa BESTFIT (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, pg. 387-395). De modo similar, os algoritmos PILEUP e BLAST podem ser utilizados para alinhar sequências (por exemplo como descrito em Altschul S. F. (1993) J. Mol. Evol. 36: 290-300 e Altschul, S. F. et al (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10). O loop el do AgHBc encontra-se nas posições 68 a 90, e um epítopo heterólogo pode ser inserido em qualquer ponto entre estas posições. De preferência, o epítopo é inserido na região entre as posições 69 a 90, 71 a 90 ou 75 a 85. Mais preferida é a inserção do epítopo entre os resíduos dos aminoácidos 79 e 80 ou entre cs resíduos 80 e 81. Quando um epítopo heterólogo é inserido toda a sequência do AgHBc pode ser mantida ou, alternativamente, toda ou uma 7 parte da sequência do loop el pode ser deletada e substituída pela sequência heteróloga. Assim, os resíduos de aminoácidos 69 a 90, 71 a 90 ou 75 a 85 podem ser substituídos por um epítopo heterólogo. Quando um epítopo heterólogo substitui a sequência loop el, o epítopo não é geralmente mais curto do que a sequência que substitui.

Uma truncagem C-terminal do AgHBc não passará, geralmente, o aa 144, porque se qualquer outra truncagem for feita as partículas poderão não se formar. Assim, os aminoácidos eliminados poderão compreender, por exemplo, o aa 144 ao aa C-terminal (aa 183 ou 185), aa 150 ao aa C-terminal, aa 164 ao aa C-terminal ou aa 172 ao aa C-terminal. O C-terminal do AgHBc liga-se ao ADN e a truncagem do C-terminal reduz, assim, ou remove completamente o ADN das preparações de AgHBc e de proteínas híbridas de AgHBc. A proteína da invenção forma partículas que, de preferência, se assemelham a partículas formadas por AgHBc nativo. As partículas da invenção têm, tipicamente, pelo menos 10 nm de diâmetro, por exemplo de 10 a 50 nm ou de 20 a 40 nm de diâmetro, mas de preferência têm cerca de 27 nm de diâmetro (que é a dimensão das partículas de AgHBc nativo). Compreendem múltiplas unidades de AgHBc, por exemplo de 150 a 300 unidades, mas geralmente estão fixas a cerca de 180 ou cerca de 240 unidades (que são os números de unidades nas partículas de AgHBc nativas). Quando a proteína da invenção for um dímero, isso significa que o número de monómeros de proteína nas partículas pode ser de 75 a 150, mas é geralmente de cerca de 90 ou de cerca de 120. O linker entre unidades AgHBc adjacentes é geralmente uma cadeia de aminoácidos de pelo menos 1,5 nm (15 Â) de 8 comprimento, por exemplo de 1,5 a 10 nm, de 1,5 a 5 nm ou de 1,5 a 3 nm. Pode, por exemplo, compreender 4 a 40 aa ou 10 a 30 aa, de preferência 15 a 21 aa. O linker é geralmente flexível. Os aminoácidos no linker podem, por exemplo, incluir ou ser ínteiramente compostos por glicina, serina e/ou prolina. Um linker preferido compreende uma ou mais repetições da sequência GlyGlySer (GGS). Alternativamente, o linker pode compreender uma ou mais repetições do dipéptido GlyPro (GP). 0 número de repetições pode, por exemplo, ser de 1 a 18, de preferência de 3 a 12. No caso de repetições GGS, a utilização de 5, 6 ou 7 repetições verificou-se que permitia a formação de partículas. 0 linker pode corresponder à região charneira de um anticorpo; esta região charneira pensa-se que forneça uma ligação flexível entre os domínios de ligação a antigénio e da cauda, dos anticorpos.

Tal como indicado acima, um epítopo heterólogo poderá ser inserido numa ou mais das cópias do AgHBc na proteína da invenção, de preferência no loop el. Um epitopo "heterólogo" é um epítopo que normalmente não se encontra localizado na posição em que está localizado no AgHBc; é geralmente de uma proteína diferente do AgHBc, mas poderá ser de uma localização diferente no AgHBc. 0 epítopo compreende uma sequência de aminoácidos que provoca uma resposta imunitária. 0 epítopo poderá ser conformacional ou linear. Poderá encontrar-se, por exemplo, numa sequência de 6 a 120 aa, ' de 6 a 50 aa ou de 6 a 20 aa. Uma vantagem fundamental da invenção é a de permitir que epítopos aplicados em sequências longas sejam inseridos no loop el, por exemplo em sequências de 30 a 120 aa, 40 a 120 aa ou 60 a 120 aa. 9 A proteína da invenção poderá conter mais do que um epítopo heterólogo, por exemplo até 2, 3, 5 ou 8 epítopos heterólogos, e neste caso os epítopos poderão estar presentes na mesma ou em diferentes unidades de AgHBc. Mais do que uma cópia de um epítopo poderá ser inserida em cada unidade AgHBc; por exemplo, de 2 a 8 cópias poderão ser inseridas. Onde existam dois ou mais epítopos heterólogos na proteína da invenção, estes poderão ser do mesmo ou de diferentes organismos e da mesma ou de diferentes proteínas. 0 epítopo poderá ser um epítopo de célula T ou de célula B. Se for um epítopo de célula T, poderá ser um epítopo de linfócito T citotóxico (CTL) ou um epítopo de célula T auxiliar (Th) (por exemplo, um epítopo Thl ou Th2) . Numa concretização preferida da invenção, um dos epítopos é um epítopo de célula T auxiliar e o outro é um epítopo CTL ou de célula B. A presença do epítopo de célula T auxiliar aumenta a resposta imunitária contra o epítopo CTL ou de célula B. A escolha de epítopo depende da doença contra a qual se pretende vacinar. 0 epítopo poderá, por exemplo, ser de um organismo patogénico, um antigénio associado ao cancro ou um alergénio. O organismo patogénico poderá, por exemplo, ser um vírus, uma bactéria ou um protozoário.

Exemplos de patogénios, cujos epítopos poderão ser inseridos incluem o vírus da hepatite A (HAV), VHB, HCV, o vírus influenza, o vírus da febre aftosa, o vírus da poliomielite, o vírus herpes simplex, o vírus da raiva, o vírus da leucemia dos felinos, o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV 1), o vírus da imunodeficiêncía humana tipo 2 (HIV 2), o vírus da 10 imunodeficiência dos síirdos (SIV) , o rinovirus humano, o vírus do dengue, o vírus da febre-amarela, o papiloma vírus humano, o vírus sincicial respiratório, o Plasmodium falcíparum (uma causa da malária), e bactérias como Mycobacteria, Bordetella, Salmonella, Escherichia, Tribrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia e Brucella. Especificamente, a bactéria poderá ser Mycobacterium tuberculosis a causa da tuberculose; Bordetella pertussis ou Bordetella parapertussis - causas da tosse convulsa; Salmonella typhimurium - a causa da salmonelose em várias espécies animais; Salmonella typhimurium - a causa da febre tifoide humana; Salmonella enteritidis - uma causa de intoxicações alimentares em humanos; Salmonella choleraesuis - uma causa de salmonelose em porcos; Salmonella dublin - uma causa quer de uma doença sistémica quer de uma doença diarreica no gado, especialmente em vitelos recém-nascidos; Escherichia coli - uma causa de intoxicações alimentares em humanos; Haemophilus influenzae - uma causa de meningite; Neisseria gonorrhoeae - uma causa de gonorreia; Yersinia enterocolitica - a causa de um espectro de doenças em humanos que vão desde a gastroenterite até à septicémia fatal; e Brucella abortus -uma causa de aborto e infertilidade no gado e de uma situação conhecida como febre ondulante em humanos.

Exemplos de epitopos candidatos a utilização na invenção incluem epitopos dos seguintes antigénios: os antigénios do HIV gpl20, gp 160, gag, pol, Nef, Tat e Ref; os antigénios da malária proteína CS e proteína de superfície 2 de Esporozoíto; os antigénios da influenza HA, NP e NA; os antigénios do vírus herpes EBV gp340, EBV gp85, HSV gB, HSV gD, HSV gH, HSV "early protein product", citomegalovírus gB, citomegalovírus gH, e proteína IE gP72; os antigénios do papiloma vírus humano E4, E6 e E7; a 11 proteína F, proteína G e proteína N dos antigénios do vírus sincícial respiratório; o antigénio pertactína de B. pertussís; os antigénios tumorais de carcinoma ACE, mucína associada a carcinoma, carcinoma P53, melanoma MPG, melanoma P97, antigénio MAGE, produto oncogénico carcinoma Neu, antigénio específico da próstata (PSA), antigénio associado à próstata, proteína ras e myc; e alergénio de ácaros do pó da casa.

Epítopos especialmente preferidos são os da região thepre-S 1, da região pre-S2, da região S ou antigénio do core do VHB. É possível inserir a totalidade da região thepre-S 1 e/ou a totalidade da região pre-S2 no AgHBc, mas geralmente apenas é inserida uma parte de uma das regiões. A parte inserida tem, tipicamente, pelo menos 6 aminoácidos de comprimento, por exemplo de 6 a 120 aa, 20 a 80 aa ou 20 a 50 aa. A inserção pode incluir, por exemplo, os resíduos nas posições pre-Sl 1-9, 10-19, 20-29, 30-39, 40-49, 50-59, 60-69, 70-79, 80-89, 90-99, 100-109 ou 110-119 ou os resíduos nas posições pre-S2 120-129, 130-139, 140-149, 150-159, 160-169 ou 170-174. Inserções particularmente preferidas são os resíduos pre-Sl 20-47 e os resíduos pre-S2 139-174.

Preparação das proteínas da Invenção

As proteínas da invenção são geralmente produzidas por tecnologia ADN recombinante. A invenção inclui uma molécula de ácido nucleico (por exemplo ADN ou ARN) que codifica uma proteína da invenção, tal como um vector de expressão. As moléculas de ácido nucleico poderão ser produzidas utilizando técnicas conhecidas para manipular ácidos nucleicos. Tipicamente, são produzidos dois constructos 12 separados de ADN que codificam duas unidades de AgHBe e depois são unidos por "overlapping" PCR.

Uma proteína da invenção poderá ser produzida por cultura de uma célula hospedeira que contenha uma molécula nucleica que codifica a proteína sob condições em que a proteína é expressa, e isolamento da proteína. Células hospedeiras adequadas incluem bactérias tais como E. coli, levedura, células de mamífero e outras células eucariotas, por exemplo células de insecto Sf9.

Os vectores constituindo moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção poderão ser, por exemplo, vectores de vírus ou de plasmídeo. Poderão conter uma origem de replicação, um promotor para expressão da sequência que codifica a proteína, um regulador do promotor tal como um estimulador, um sinal stop da transcrição, um sinal de start da translação e/ou um sinal stop da translação. Os vectores poderão conter, também, um ou mais genes marcadores seleccionáveis, por exemplo um gene de resistência à ampícilina no caso de um plasmídeo bacteriano ou um gene de resistência à neomicina no caso de um vectcr de mamífero. Os vectores poderão ser utilizados in vitro, por exemplo para a produção de ARN ou utilizados para a transformação ou transfecção de uma célula hospedeira. 0 vector pode também ser adaptado para ser utilizado in vivo, por exemplo num método de terapia genética ou vacinação ADN.

Os promotores, estimuladores e outros sinais de regulação da expressão poderão ser seleccíonados para serem compatíveis com a célula hospedeira para a qual o vector de expressão é desenhado. Por exemplo, promotores procariotas poderão ser utilizados, em particular os adequados à 13 utilização em estirpes E. coli (tal como E. coli HB101) . Poderá ser utilizado um promotor, cuja actividade seja induzida em resposta a uma alteração no ambiente circundante, tais como condições anaeróbicas. De preferência poderá utilizar-se um promotor htrÃ ou nirB. Estes promoters poderão ser utilizados, em particular para expressar a proteína numa bactéria atenuada, por exemplo para utilização como vacina. Quando a expressão da proteína da invenção é realizada em células de mamífero, quer ín vitro quer in vivo, poderão utilizar-se promotores de mamífero. Também se poderão utilizar promotores específicos de tecidos, por exemplo promotores específicos da célula hepatócito. Também se poderão utilizar promotores virais, por exemplo a repetição terminal longa do vírus da leucemia murina de Moloney (MMLV LTR) , o promotor LTR do vírus do sarcoma de Rous (RSV) , o promotor SV40, o promotor IE do citomegalovírus (CMV) humano, promotores de vírus de herpes simplex e promotores de adenovírus. Todos estes promotores se encontram facilmente disponíveis na arte.

Uma proteína, de acordo com a invenção, poderá ser purificada utilizando técnicas convencionais para a purificação de proteínas. A proteína poderá, por exemplo, ser fornecida em forma purificada, pura ou isolada. Para utilização numa vacina, a proteína tem geralmente de ser fornecida com um alto grau de pureza, por exemplo num grau em que constitua mais do que 80%, mais do que 90%, mais do que 95% ou mais do que 98% da proteína na preparação. No entanto, poderá ser desejável misturar a proteína com outras proteínas na formulação final da vacina. 14

Vacinação contra doenças A utilização principal das proteínas da invenção é como vacinas terapêuticas ou profilácticas. A invenção inclui uma composição farmacêutica (por exemplo, uma composição vacina) compreendendo uma proteína da invenção, uma partícula da invenção ou uma molécula de ácido nucleico da invenção e um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável. 0 princípio subjacente à vacinação profiláctica é o de induzir uma resposta imunológica no hospedeiro de modo a gerar uma memória imunológica no hospedeiro. Isto significa que, quando o hospedeiro é exposto a um agente patogénico virulento, monta uma resposta imunológica eficaz (protectora), isto é, uma resposta que inactiva e/ou provoca a morte do agente patogénico. A invenção poderia formar a base de uma vacina profiláctica contra um leque de doenças e situações, tais como VHB, HAV, HCV, influenza, febre aftosa, poliomielite, herpes, raiva, SIDA, febre de dengue, febre-amarela, malária, tuberculose, tosse convulsa, febre tifoide, intoxicação alimentar, diarreia, meningite e gonorreia. Os epítopos na proteína da invenção são escolhidos de modo a serem apropriados à doença contra a qual a vacina pretende proporcionar protecção. 0 princípio subjacente à vacinação terapêutica é o de estimular o sistema imunitário do hospedeiro para aliviar ou erradicar a doença ou situação. Há numerosas doenças e situações que poderão ser susceptíveis de vacinação terapêutica, tais como doenças virais crónicas, incluindo VHB crónica e HCV crónica, cancro e alergias, tais como asma, atopia, eczema, rinite e alergias alimentares. 15

As doenças virais crónicas surgem quando o sistema imunitário de um hospedeiro infectado falha na eliminação do vírus, permitindo que o vírus persista no hospedeiro durante um longo período de tempo. A invenção pode ser utilizada para induzir o sistema imunitário do indivíduo portador de infecção crónica a eliminar o vírus. Por exemplo, pensa-se que os doentes com hepatite crónica apresentam uma resposta inadequada das células T e que a estimulação de uma resposta apropriada das células T pode eliminar o vírus. Assim, para se tratar a hepatite virai crónica, utilizando a invenção, podem inserír-se epítopos das células T na proteína da invenção, tais como epítopos das células T das regiões pre-Sl e pre-S2 do VHB.

De modo similar, em caso de cancro, pensa-se que uma estimulação da resposta das células T a antigénios tumorais poderá auxiliar o sistema imunitário a destruir o tumor. Pensa-se que as doenças alérgicas são causadas pelo menos em parte por uma resposta desproporcionada das células T em que predomina uma resposta inflamatória Th2 sobre uma resposta antagonista Thl, e que as alergias poderão, assim, ser tratadas por estimulação da resposta Thl. Isto pode ser alcançado, de acordo com a invenção, utilizando uma proteína contendo um epítopo heterólogo que estimule a resposta Thl.

Veículos e diluentes adequados para inclusão em composições farmacêuticas da invenção são soluções salinas isotónicas, por exemplo solução salina tamponada com fosfato. A composição incluirá normalmente um adjuvante, tal como hidróxido de alumínio. A composição poderá ser formulada na forma de líquido para injecçâo. A composição compreende a proteína, partículas ou ácido nucleico numa quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz. Tipicamente, a 16 proteína ou as partículas são administradas numa dose de 0,1 a 200 pq, de preferência de 1 a 100 pg, de maior preferência de 10 a 50 pg peso corporal. O ácido nucleico da invenção pode ser administrado directamente como um constructo de ácido nucleico nu, utilizando técnicas conhecidas na arte ou utilizando vectores conhecidos na arte. A quantidade de ácido nucleico administrada é tipicamente da ordem de 1 pg a 10 mg, de preferência de 100 pg a 1 mg. A vacina pode ser administrada num esquema de dose única ou num esquema de dose múltipla, por exemplo de 2 a 32 ou de 4 a 16 doses. As vias de administração e as doses acima indicadas servem apenas como orientação e a via de administração e a dose poderão ficar, em última análise, ao critério do médico.

Sgc9%° E^erimental,

Breve descrição dos desenhos

Figura 1: Um modelo hipotético que mostra a viabilidade de um dímero AB ligado do core da hepatite B.

Figura 2: Uma representação esquemática da construção de cores hetero- e homo-tandem. As barras representam as estruturas primárias das proteínas. No domínio de ligação do AgHBc (aminoácidos 1-144), são indicados o loop el (rectângulo preto) e as regiões envolvidas em contactos intradímero (sombreado claro) e ínterdimero (sombreado escuro). O domínio de ligação de ácido nucleico, rico em Arg, é simbolizado por +. Os iniciadores (Tabela 1) são indicados como setas.

Figura 3: Um 12% SDS-PAGE de fracções de uma separação de 17 partículas do core homo-tandem por gradiente de densidade de sacarose.

Figura 4: Micrografia electrónica de partículas do core hetero-tandem com um linker que compreende cinco repetições de GGS.

Figura 5: Um Western blot mostrando a expressão eficiente de cores hetero-tandem em E. coli. Os cores continham 5, 6 e 7 repetições de GGS como linker respectivamente (GGS5, GGS6 e GGS7).

Figura 6: Os resultados da crio-microscopia electrónica de partículas do core tandem. A Figura 6(a) mostra a partícula do core tandem (a partícula da esquerda) em comparação com uma partícula nativa (a partícula do meio). A parte da direita da Figura 6(a) mostra a parte C-terminal do antigénio do core numa partícula de core tandem. A Figura 6 (b) mostra o encaixe de uma porção da estrutura de uma partícula de core tandem com uma partícula nativa. Métodos

Um exame da estrutura da partícula do core do VHB sugeriu que poderia ser utilizado um linker flexível com pelo menos 1,5 nm (15 Ã) para ligar as duas proteínas num par dímero sem afectar a sua integridade estrutural (Figura 1). Consequentemente, foram produzidos constructos por overlapping PCRs em que a proteína do core "upstream" foi truncada pelo resíduo 149 e depois ligada a uma cópia "downstream" via 5, 6 ou 7 cópias de uma sequência de repetição GlyGlySer (GGS) (Figura 2). A cópia "downstream" era a proteína do core no seu comprimento total ou encontrava-se truncada no aminoácido 149 para remover a 18 região C-terminal, rica em Arg. A Tabela 1 apresenta as sequências de oligonucleótidos utilizadas para construir os diversos cores tandem VHB.

Os constructos foram clonados num factor de expressão ptrc99A, transformado em E. coli JM 109 e induzido com IPTG. As células foram então colhidas por centrifugação, ressuspensas em PBS e sonicadas duas vezes. Os lisados contendo cores tandem expressos solúveis foram tornados 30% saturados em sulfato de amónio e as proteínas que precipitaram foram recolhidas por centrifugação, ressuspensas em PBS e dialisadas contra solução salina tamponada com fosfato. O lisado clarificado foi adicionado a gradientes lineares de sacarose 15-45% e centrifugado a 28000 rpm durante 4 horas a 4°C. Os gradientes foram fraccionados a partir do fundo do tubo em alíquotas de 2 ml e analisados por SDS-PAGE e Western Blotting utilizando um anticorpo monoclonal primário contra proteína do core do VHB (mAb 13).

As preparações de partículas do core do VHB foram aplicadas em redes revestidas a carbono, coradas negativamente com acetato de uracilo e visualizadas por microscopia electrónica de transmissão. As estruturas das partículas do core foram determinadas utilizando crio-microscopía electrónica. 19

Tabela 1: Sequências dos iniciadores de oligonucleótidos utilizados para clonagem de genes do core tandem do VHB em ptrc99A.

Iniciadores Sequências (5'-.3') 1 GTTACCATGGACATTGACCCTTAT a 2 GTCCATAGA (ACCACCAGA) 5AACAACAGTAGTTTCCGG 3 GTCCATAGA (ACCACCAGA) 6AACAACAGTAGTTTCCGG 4 GTCCATAGA (ACCACCAGA) 7AACAACAGTAGTTTCCGG 5 GTTGTT (GGTGGTCT) 5ATGGACATTGACCCTTAT 6 GTTGTT(GGTGGTCT)6ATGGACATTGACCCTTAT 7 GTTGTT (GGTGGTCT) 7ATGGACATTGACCCTTAT 8 TATGAAGCTTATGAGTCCAAGGAb 9 TATGAAGCTTCCGTCGTCAAACAAb a o local de restrição Ncol encontra-se a negrito b o local de restrição HindIII encontra-se a negrito

Resultados

As proteínas do core do VHB tandem com 5, 6 ou 7 cópias de GGS foram todas expressas com sucesso e mostrou-se que migravam em geles de poliacrilamida com as mobilidades esperadas. Cada uma formou partículas do core como foi evidenciado pela sua sedimentação em gradientes de densidade de sacarose (Figura 3) e pelo seu aspecto ao microscópio electrónico (Figura 4). As partículas retiveram as suas propriedades antígénicas, tal como demonstrado pela sua reactividade em ELISA e Western blots (Figura 5). Além disso, em crio-microscopia electrónica, as estruturas das partículas formadas pelas proteínas do core tandem eram 20 indistinguíveis da estrutura das partículas do core nativas (Figura 6). 21

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> MEDEVA EUROPE LIMITED <120> PROTEÍNAS DE FUSÃO DO ANTÍGÉNIO DO CORE DA HEPATITE B <130 N79405 <16Q> 2 <170> Patentln Ver. 2.1

<210 1 <211> 639 <212> ADN

<213> Vírus da hepatite B <220

<221> CDS <222> (1)..(639) <400> 1 atg caa ctt ttt cac ctc tgc cta ate ate tct tgt tca tgt cct act 48 Met Gin Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr 1 5 10 15 gtt caa gcc tcc aag ctg tgc ctt ggg tgg ctt tgg ggc atg gac ate 96 Vai Gin Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile 20 25 30 gac cct tat aaa gaa ttt gga gct act gtg gag tta ctc teg ttt ttg 144 Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly AI a Thr Vai Glu Leu Leu Ser Phe Leu 35 40 45 cct tct gac ttc ttt cct tca gta cga gat ctt cta gat acc gcc tca 192 Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Vai Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser 50 55 60 gct ctg tat cgg gaa gcc tta gag tct cct gag cat tgt tca cct cac 240 Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His 65 70 75 80 cat act gca ctc agg caa gca att ctt tgç tgg ggg gaa cta atg act 288 His Thr Ala Leu Arg Gin Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr 22 85 cta gct acc tgg gtg ggt gtt aat ttg Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu 100 105 cta gta gtc agt tat gtc aac act aat Leu Vai Vai Ser Tyr Val Asn Thr Asn 115 120 ctc ttg tgg ttt cac att tct tgt ctc Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu 130 135 ata gag tat ttg gtg tct ttc gga gtg Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val 145 150 tat aga cca cca aat gcc cct ate cta Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu 165 gtt gtt aga cga cga ggc agg tcc cct Vai Vai Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro 180 185 cgc aga cga agg tct caa tcg ccg cgt Arg Arg Arg Arg Ser Gin Ser Pro Arg 195 200 gaa tct caa tgt tag Glu Ser Gin Cys 210 90 95 gaa gat cca gcg tct aga gac 336 Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp 110 atg ggc cta aag ttc agg caa 3Θ4 Met Gly Leu Lys Phe Arg Gin 125 act ttt 99a aga gaa aca gtt 432 Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val 140 tgg att cgc act cct cca gct 480 Trp Ile Arg Thr Pro Pro. Ala 155 160 tea a ca ctt ccg gag act act 528 Ser Thr Leu Pro G1 u Thr Thr 170 175 aga aga aga act ccc tcg cct 576 Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro 190 cgc aga aga tct caa tct cgg 624 Arg Arg Arg Ser Gin Ser Arg 205 639

<210> 2 <211> 212 <212> PRT <213> Vírus da Hepatite Β <400> 2

Met Gin Leu Phe His Leu Cys Leu Πe Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr 15 10 15

Vai Gin Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile 23 20 25 30 .ÀSp Pro iyr Lys Glu Phe Gly AI a Thr Vai Glu Leu Leu Ser Phe Leu 35 40 45 Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Vai Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser 50 55 60 Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His 65 70 75 80 His Thr AI a Leu Arg G1 n AI d Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Het Thr 85 90 95 Leu Ais Thr Trp Vai Gly Vai Asn Leu Glu Asp Pro AI a Ser Arg Asp 100 105 110 Leu Vai Vai Ser Tyr Vai Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gin 115 120 125 Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Vai 130 135 140 Ile Glu Tyr Leu Vai Ser Phe Gly Vai Trp Ile Arg Thr Pro Pr o Ala 145 150 155 160 Tyr Arg Pro Pro Asn AI a Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr 165 170 175 Vai Vai Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro 180 185 190 Arg Ara Arg' Arg Ser Gin Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gin Ser Arg 195 · 200 205

Glu Ser Gin Cys 210

Lisboa, 6 de Novembro de 2006

Claims

Reivindicações 1. Uma proteína que compreende cópias tandem do antigénio do core da hepatite B (AgHBc).
2. Uma proteína, de acordo com a reivindicação 1, que é um dímero de duas cópias do AgHBc.
3. Uma proteína, de acordo com as reivindicações 1 e 2, em que uma ou mais das cópias do AgHBc têm um epítopo heterólogo no loop el.
4. Uma proteína, de acordo com a reivindicação 3, em que todas as cópias do AgHBc têm um epítopo heterólogo no loop el.
5. Uma proteína, de acordo com a reivindicação 4, em que todas as cópias têm o mesmo epítopo heterólogo no loop el.
6. Uma proteína, de acordo com a reivindicação 4, em que cada cópia tem um epítopo heterólogo diferente no loop el.
7. Uma proteína, de acordo com as reivindicações 3 a 6, em que o ou cada epítopo heterólogo é da região pré-Sl ou pré-S2 do vírus da hepatite B (VHB).
8. Uma proteína, de acordo com as reivindicações 3 a 7, em que o ou cada epítopo heterólogo se encontra numa sequência heteróloga de 10 a 120 resíduos de aminoácidos no loop el.
9. Uma proteína, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, em que uma ou mais das cópias do AgHBc se encontram truncadas no C-terminal. 2
10. Uma proteína, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, em que as cópias tandem do AgHBc se encontram ligadas por um linker.
11. Uma proteína, de acordo com a reivindícação 10, em que o linker tem pelo menos 1,5 nm de comprimento.
12. Uma proteína, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que o linker compreende múltiplas cópias da sequência GlyGlySer (GGS).
13. Uma proteína, de acordo com a reivindicação 12, em que o linker compreende 5, 6 ou 7 cópias da sequência GGS.
14. Uma partícula, compreendendo múltiplas cópias de uma proteína, tal como reivindicado em qualquer das reivindicações precedentes.
15. Uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína, tal como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 13.
16. Uma molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, que é um vector de expressão.
17. Uma célula hospedeira, compreendendo uma molécula de ácido nucleico, tal como reivindicado na reivindicação 15 ou 16.
18. Um processo para a produção de uma proteína, tal como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 13, o qual compreende a cultura de uma célula hospedeira que contenha uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína sob 3 condições em que a proteína é expressa, e o isolamento da proteína.
19. Uma composição farmacêutica, compreendendo uma proteína, tal como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a'13, uma partícula, tal como reivindicado na reivindicação 14, ou uma molécula de ácido nucleico, tal como reivindicado na reivindicação 15 ou 16, e um veículo ou diluente farraaceuticamente aceitável.
20. Uma proteína, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13, uma partícula, de acordo com a reivindicação 14, ou uma molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, para utilização num método de vacinação profilática ou terapêutica do corpo humano ou animal.
21. Uma proteína, partícula ou molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 20, para utilização num método de vacinação profilática ou terapêutica do corpo humano ou animal contra o VHB.
22. Utilização de uma proteína, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13, de uma partícula, de acordo com a reivindicação 14, ou de uma molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, para a produção de um medicamento para a vacinação profilática ou terapêutica do corpo humano ou animal contra o VHB. Lisboa, 6 de Novembro de 2006