ES2121000T5 - Composicion utilizada como agente terapeutico contra enfermedades hepaticas virales cronicas. - Google Patents
Composicion utilizada como agente terapeutico contra enfermedades hepaticas virales cronicas. Download PDFInfo
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Abstract
SE DA A CONOCER UNA COMBINACION, QUE COMPRENDE POR LO MENOS UNA SECUENCIA POLIPEPTIDA, MEDIADORA DE LA ANTIGENICIDAD DE UNO O MAS EPITOPES Y UN PORTADOR, CAPAZ DE PRESENTAR ESTA/ESTAS SECUENCIA(S) POLIPEPTIDA, LA CUAL ES UTIL PARA LA PREPARACION DE UN MEDICAMENTO PARA EL TRATAMIENTO DE HEPATITIS VIRAL CRONICA.
Description
Composición utilizada como agente terapéutico
contra enfermedades hepáticas virales crónicas.
La presente invención se refiere a una
composición que comprende una secuencia de polipéptidos y a un
portador para proporcionar un agente para curar las enfermedades
hepáticas crónicas causadas por el virus de la hepatitis B.
Al menos cinco virus diferentes, esto es el
virus de la Hepatitis A, B, C, D y E, son susceptibles de
desencadenar el aspecto clínico de una hepatitis aguda. A
diferencia de la hepatitis A y E, que son transferidas entéricamente
y pueden producir la muerte del paciente, la hepatitis B, C
(denominada antes hepatitis parenteral No-A
No-B), y D pueden progresar a un estado de
inflamación crónica, que a su vez puede producir una cirrosis
hepática y un carcinoma hepatocelular primario.
Hay relativamente pocos datos disponibles sobre
la hepatitis C y D, sobre los métodos para la diagnosis y su
tratamiento y sobre los respectivos virus. El virus de la hepatitis
D es un virus con ARN que se sabe que es incompleto. Por lo tanto,
necesita un virus coadyuvante para desarrollarse en pacientes y se
encuentra solamente en individuos infectados con HBV. Solo muy
recientemente el virus de la hepatitis C ha sido detectado, y se ha
desarrollado un ensayo con anticuerpo (anti-HCV) que
facilita la diagnosis de las infecciones de hepatitis C crónica. No
obstante, existe una necesidad cada vez más urgente de un
tratamiento para curar esta enfermedad.
Lo mismo es cierto por lo que se refiere a la
hepatitis B crónica, una enfermedad mucho mejor estudiada con
respecto a su reconocimiento mediante métodos inmunológicos, su
virus causante y el ciclo de vida viral y la secuencia de ADN. Se
dice que los pacientes son portadores crónicos del virus de la
hepatitis B si el ADN viral perdura más de diez semanas, el
antígeno HBe (HBeAg) durante más de 12 semanas, o si el antígeno de
superficie de la hepatitis B (HBsAg) es persistente durante más de
seis meses.
Se considera que aproximadamente trescientos
millones de personas padecen hepatitis B crónica, la mayoría de las
cuales viven en el Extremo Oriente. Para estas personas el principal
riesgo de ser infectado parece ser durante o inmediatamente después
del nacimiento, puesto que una madre infectada crónicamente
transfiere el virus a su recién nacido. El 90 por ciento de los
niños infectados de este modo se volverán crónicamente infectados,
también, durante su vida posterior. En el Mundo Oriental la
infección tiene lugar más comúnmente más tarde en la vida, durante
la infancia o incluso en la edad adulta, principalmente por
transmisión parenteral o sexual. En estos casos de infección por
hepatitis B tras el nacimiento sólo del cinco al diez por ciento de
los infectados se vuelven portadores crónicos. El virus
transfectado, no obstante, no es responsable de las distintas
reacciones mostradas por las personas infectadas ya sea para
eliminar el virus ya sea para retenerlo en el organismo toda la
vida. Por consiguiente, parece ser cuestión del estado inmunológico
que determina el futuro estado físico.
El virión HB (partícula de Dane) está compuesto
por diferentes proteínas estructurales, las proteínas del núcleo y
las proteínas de la superficie (S). Las últimas son productos de la
traducción de un marco de lectura abierto que abarca la secuencia
codificadora de los tres dominios de tipo S, cada uno de las cuales
empieza en un triplete AG susceptible de iniciar la traducción
in vivo. Los dominios son referidos como preS1, preS2 y S en
orden 5' al extremo 3' de la molécula. Existen seis productos
proteicos derivados de este ORF (por Open Reading Frame = Marco de
Lectura Abierto): una forma glicosilada y una no glicosilada de la
proteína principal (gp27 y p24) traducidas a partir del dominio S
solo (226 aminoácidos) (referidas de aquí en adelante como péptidos
S de HBV), una proteína intermedia (281 aminoácidos) que tiene una o
dos cadenas laterales de polisacáridos (gp33 y gp36,
respectivamente), esto es codificada por la región preS2 y S
(referida de aquí en adelante como péptidos S2 de HBV), y
finalmente, tanto una forma glicosilada (gp42) como una no
glicosilada (p39) de la gran proteína (389-400
aminoácidos, dependiendo del serotipo viral), que está formada por
la traducción de preS1, preS2 y S (referidas de aquí en adelante
como péptidos S1 de HBV). Las proteínas del núcleo son HBcAg y
HBeAg, siendo la última posiblemente un producto de la maduración de
HBcAg. La proteína del núcleo puede portar un
pre-péptido del núcleo.
La partícula de Dane, que es el virión
infeccioso, comprende las proteínas tanto del núcleo como de la
superficie, mientras los filamentos constan de una mezcla de los
seis antígenos de superficie. Los péptidos S, S2 y S1 de HBV (como
se han definido aquí), se ensamblan solos para formar las
denominadas partículas de 20 nm, que no son en absoluto
infecciosas.
Los pacientes infectados con el virus de la HB
pasan a través de diversas fases de la hepatitis, antes de que se
considere que están crónicamente infectados por HBV. Inmediatamente
después de la infección seguirá una fase infecciosa, caracterizada
por la presencia de HBeAg en el suero. A pesar de la replicación
inhibida del HBV, la antigenemia continuada de la HB indica la
presencia de secuencias del ADN viral integradas en el genoma
celular del paciente. Las secuencias virales integradas no permiten
que la célula huésped sintetice el virus completo. No obstante, las
células del hígado que tienen las secuencias del HBV integradas son
susceptibles de producir sólo HBsAg, que a su vez es detectable en
el suero del paciente y es un indicador de la hepatitis B crónica.
Muy probablemente los hepatocitos transformados no son lisados por
las células T citotóxicas, pero proliferan e inducen o bien la
hepatitis persistente crónica (HPC) o bien la hepatitis activa
crónica (HAC), que pueden después derivar en cirrosis del hígado o
en carcinoma hepatocelular primario dando como resultado la muerte
prematura del
paciente.
paciente.
Recientemente se ha verificado que los pacientes
que están crónicamente infectados por HBV muestran un defecto en la
producción de interferón endógeno (Abb et al., 1.985: J. Med.
Virol 16. 171-176). Esta fue la razón
fundamental para tratar los pacientes que padecen hepatitis B
crónica, como indica la presencia de HBeAg y ADN de HBV en el
suero, con interferón \alpha (IFN\alpha). Pruebas controladas
con gran número de pacientes demostraron que la administración de
interferón \alpha daba como resultado un aumento significativo de
la eliminación del virus de la hepatitis B, cuando se comparaban
con los controles. Sin embargo, las personas infectadas en el
momento del nacimiento o próximo a él no parecían producir
seroconversión en respuesta a esta terapia. Este fenómeno
desafortunadamente excluye alrededor del 75% de los portadores de la
terapia con IFN\alpha.
En la actualidad, el modo exacto de acción del
interferón \alpha sobre la hepatitis B permanece poco claro. Su
actividad antiviral podría proteger células no infectadas de la
infección por HBV o reducir la transcripción, traducción y
replicación virales en las células infectadas por HBV.
Adicionalmente el interferón tiene efectos inmunomoduladores
activando células T, macrófagos y células NK e induciendo la
expresión de las proteínas del MHC de clase
I.
I.
Otro enfoque para tratar la hepatitis B crónica
se basa en la idea de inhibir la replicación del virus, deteriorando
de ese modo su defensa suficientemente para hacer el sistema inmune
del huésped susceptible de eliminar el virus. Esto condujo a otros
fármacos antivirales tales como el adeninarabinósido y el
adeninarabinósido monofosfato para el tratamiento de los individuos
infectados por HBV crónicamente. No obstante, menos de la mitad de
los pacientes respondían a esta terapia, mediante seroconversión o
bien sostenida o bien transitoria (HBeAg^{+} a
anti-HBe^{+}). Un aspecto negativo adicional de
estos fármacos antivirales son sus propiedades inmunosupresoras.
Entre otros fármacos que se han sometido a
ensayo para el tratamiento de portadores crónicos se incluyen el
interferón \beta y la acicloguanosina (aciclovir), la
interleuquina 2, los esteroides, tales como la prednisolona, y las
combinaciones de los mismos. Pero ninguno de ellos pudo proporcionar
mejores resultados que el tratamiento con interferón \alpha. Sólo
una terapia de combinación, incluyendo la administración inicial de
esteroides seguido de la de IFN \alpha puede aumentar la
velocidad de respuesta en los pacientes seleccionados.
Es sabido a partir de la técnica anterior, que
los chimpancés infectados crónicamente por HBV no pueden ser
curados mediante tratamiento con HBsAg (unido a un toxoide de
tétanos) ni con anticuerpos anti-HBs. Además, se ha
intentado inmunizar pacientes crónicamente infectados por HBV
mediante la administración de los péptidos S, S2 y S1 de HBV (como
se ha definido aquí). Este tratamiento no dio ni siquiera como
resultado la formación de anticuerpos anti-HBs en
estas personas.
En WO88/10300 se describe la utilización de
epitopos de HBV, es decir péptidos del núcleo de HBV, regiones
pre-S1 y Pre-S2, portados sobre una
partícula inmunogénica formada a partir de un péptido secretado que
causa la producción de anticuerpos en un modelo animal. En
EP-A-243913 se describe la
utilización de péptidos a partir de las regiones codificadoras de
pre-S1 y/o pre-S2 del genoma de HBV
sobre un portador para lograr la producción de anticuerpo. No
obstante en ninguna de las aplicaciones anteriormente mencionadas se
describió si la producción de estos anticuerpos tendría efecto
alguno al eliminar las partículas del virus durmientes o latentes
de los hepatocitos de animales infectados con hepatitis. A la luz de
la técnica anterior mencionada previamente en la que los
anticuerpos anti-HBV no curaban chimpancés
infectados, parecía poco probable un efecto curativo.
Adicionalmente, según la definición, los
portadores crónicos del virus de la hepatitis B se caracterizan
porque es detectable el HBsAg en su suero. Por lo tanto, ha sido
absolutamente imprevisible, que una combinación, que comprende un
epitopo activador de las células T codificado por la región
preS1-preS2 del genoma de HBV, según la presente
invención, sea susceptible de inducir una inmunización y una
curación final de portadores crónicos del virus de la hepatitis
B.
Considerando el estado de la técnica
anteriormente discutido el objetivo de la presente invención es
proporcionar un agente terapéutico eficaz para el tratamiento de
enfermedades de la hepátitis B crónicas que conduzca a una
respuesta completa (es decir a la inhibición sostenida de la
replicación del HBV, la pérdida del ADN de HBV y la ADN polimerasa
y a una disminución y finalmente desaparición de HBeAg y HBsAg en el
suero de los pacientes).
Según la presente invención esta meta se logra
mediante la combinación de
a) al menos una secuencia de polipéptidos que
tiene uno o más epitopos activadores de las células T antigénicas
del virus de la hepatitis B y
b) un portador susceptible de presentar la
secuencia o secuencias del epitopo a), donde la secuencia o
secuencias de polipéptidos a) están unidas al portador b) mediante
un enlace covalente o hidrofóbico.
Esta invención está dirigida a la utilización de
esta combinación para la producción de un medicamento para el
tratamiento de la hepatitis viral crónica.
Es importante que la secuencia de polipéptidos
a), que pueden ser uno o más polipéptidos diferentes, medie la
antigenicidad de un epitopo activador de células T en un sentido
directo o indirecto.
Según la presente invención la secuencia o
secuencias de polipéptidos a) pueden ser un polipéptido o una
combinación de dos o más polipéptidos del virus de la hepatitis B
de cualquier subtipo, concretamente adw, ayw, adr y ady. La
secuencia o secuencias de polipéptidos a) pueden por lo tanto ser la
secuencia de aminoácidos de uno o más miembros seleccionados entre
los péptidos preS1, preS2 o S virales de HB (como se ha definido
aquí) y los antígenos del núcleo de HB.
Además cualquiera de los polipéptidos
anteriormente comentados o una combinación de dos o más polipéptidos
que estén modificados o bien por deleciones de aminoácidos, con lo
que al menos se puede conservar un epitopo que comprenda al menos
seis restos aminoácido consecutivos, o bien añadiendo aminoácidos
adicionales ya sea en el extremo N, o en el extremo C o bien por
inserciones en la secuencia o secuencias de polipéptidos a) son
útiles como secuencia o secuencias de polipéptidos a). En cada uno
de estos casos es esencial, sin embargo, que se mantenga la
actividad biológica. De ese modo la secuencia o secuencias de
polipéptidos a) pueden ser un polipéptido del virus de la hepatitis
B modificado:
- i)
- por tener deleciones arbitrarias, con lo que se conserva un epitopo que comprende al menos seis restos aminoácido consecutivos,
- ii)
- por tener sustituciones de uno o varios aminoácidos, o
- iii)
- por llevar una secuencia de aminoácidos adicional en su extremo N, su extremo C o en forma de inserción.
Más específicamente, la secuencia o secuencias
de polipéptidos a) pueden ser la secuencia de aminoácidos de uno o
más miembros seleccionados entre los péptidos
pre-S1, pre-S2 y S virales de HB y
los antígenos del núcleo de HB, modificados como antes.
Para ayudar al enlace o anclaje hidrofóbico, la
secuencia o secuencias de polipéptidos son ventajosamente
miristiladas.
Con el fin de desplegar la actividad
farmacológica apropiada es necesario que la combinación de la
secuencia o secuencias polipeptídicas de la presente invención a)
se encuentre presente sobre un portador b). Este portador consta de
una sustancia concreta que por ejemplo puede constar de partículas
de un polímero hidrofóbico, de partículas orgánicas, o de
partículas de un polisacárido. Preferiblemente, el portador b) es
una segunda secuencia polipeptídica que forma partículas después de
la secreción, teniendo dichas partículas preferiblemente un diámetro
de al menos
10 nm.
10 nm.
Se prefiere que la secuencia polipeptídica b)
formadora de partículas sea una parte sustancial de o una secuencia
de aminoácidos completa de un polipéptido que puede ser seleccionado
entre el péptido S de HBV (como se ha definido aquí), el antígeno
del núcleo de HBV, el antígeno del núcleo de HAV, el antígeno de
superficie de HAV, el antígeno de superficie de HIV y el antígeno
del núcleo de HIV así como el antígeno de superficie del virus de
la polio. Como portador formador de partículas b) se prefiere el
péptido S de HBV y/o el péptido del núcleo.
Cuando se utilizan como secuencia portadora b)
los polipéptidos anteriormente comentados pueden ser modificados
mediante deleciones arbitrarias de aminoácidos, mediante
sustituciones de uno o más aminoácidos o añadiendo uno o más
aminoácidos ya sea en el extremo N, en el extremo C o mediante
inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia polipeptídica
b), siempre que se conserve la capacidad formadora de partículas. De
ese modo, la secuencia polipeptídica b) puede ser una parte
sustancial o la secuencia completa de aminoácidos de un polipéptido
seleccionado entre el péptido S de HBV; los antígenos del núcleo de
HBV, del núcleo de HAV y del núcleo de HIV; y los antígenos de
superficie del virus de la polio, HAV o HIV; modificados
- i)
- por tener deleciones arbitrarias, con lo que se conserva la capacidad formadora de partículas,
- ii)
- por tener sustituciones de uno o varios aminoácidos, o
- iii)
- por llevar una secuencia de aminoácidos adicional en su extremo N, su extremo C o en forma de inserción.
Para ayudar al enlace hidrofóbico, la secuencia
polipeptídica b) es ventajosamente miristilada.
Si el portador b) es una secuencia
polipeptídica, ambas secuencia a) y b) pueden ser enlazadas vía una
o más de las siguientes interacciones: anclaje hidrofóbico (mediado
por ácido mirístico), formación de puentes disulfuro, o ambas
secuencias pueden ser conectadas mediante un enlace peptídico para
formar un péptido de fusión. En el último caso se puede insertar
opcionalmente una secuencia espaciadora entre la secuencia o
secuencias polpeptídicas a) y la secuencia b), cuya secuencia
espaciadora está enlazada a ambos polipéptidos vía enlaces
peptídicos.
La secuencia o secuencias polipeptídicas a) y b)
pueden ser producidas respectivamente mediante la expresión de una
molécula de ADN recombinante. La molécula de ADN recombinante puede
codificar para la combinación de la secuencia o las secuencias
polipeptídicas a) y b). La molécula de ADN recombinante puede
comprender por lo tanto al menos una primera secuencia de ADN y
opcionalmente una segunda, una tercera y/o una cuarta secuencia de
ADN donde
- i)
- al menos dicha primera secuencia de ADN codifica al menos para una secuencia polipeptídica a) como se ha definido antes,
- ii)
- dicha segunda secuencia de ADN codifica para una secuencia polipeptídica b) según la definición anterior del péptido formador de partículas,
- iii)
- dicha tercera secuencia de ADN codifica para una secuencia espaciadora, y
- iv)
- dicha cuarta secuencia de ADN codifica para un marcador de selección
y donde las secuencias de ADN son
controladas por elementos de ADN esenciales para la expresión, y
opcionalmente tienen un marco de lectura
común.
La secuencia o secuencias polipeptídicas a) y la
secuencia o secuencias polipeptídicas b) pueden por lo tanto ser
codificadas en tándem sobre la misma molécula de ADN recombinante.
La secuencia o secuencias polipeptídicas y la secuencia o
secuencias polipeptídicas b) pueden de ese modo ser expresadas a
partir de un único marco de lectura abierto sobre dicha molécula de
ADN y están opcionalmente separadas por una secuencia polipeptídica
espaciadora también codificada en el único marco de lectura
abierto.
Debido al hecho de que los aminoácidos están
designados por más de un triplete, existen diversas secuencias de
ADN que codifican para las secuencias peptídicas a) y b)
anteriormente definidas.
Aparte de esto, se pueden utilizar moléculas de
ADN recombinante, que difieren de las moléculas de ADN recombinante
anteriormente definidas por el hecho de que hasta el 30% de los
nucleótidos pueden ser sustituidos.
Una célula huésped es transfectada con una
molécula de ADN recombinante que codifica para la combinación
anterior, que es útil para el tratamiento de pacientes infectados
crónicamente por HBV. Esta célula huésped puede ser una célula de
mamífero, de levadura o bacteriana. Para el propósito de esta
invención se prefiere, que esta célula no produzca proteína de
suero humano alguna o proteína de suero de primate alguna distintas
del polipéptido o los polipéptidos que están siendo incluidos en la
combinación anterior.
El término "péptido S de HBV" utilizado
aquí hace referencia al péptido codificado por la región S completa
del genoma de HBV es decir excluyendo las regiones
pre-S1 y pre-S2. El término
"péptido pre-S2 de HBV" utilizado aquí hace
referencia al péptido codificado por las regiones
pre-S2 y S completas del genoma de HBV. El término
"péptido pre-S1 de HBV" utilizado aquí hace
referencia al polipéptido codificado por las regiones
pre-S1, pre-S2 y S completas del
genoma de HBV. El término "epitopo" utilizado aquí hace
referencia a una secuencia de la menos seis aminoácidos
consecutivos codificada por la región de genoma designada (v.g. un
"epitopo pre-S2 de HBV" hace referencia a una
secuencia de al menos seis aminoácidos codificada por la región
pre-S2 del genoma de HBV). El término "epitopo de
la célula T" utilizado aquí hace referencia a un epitopo que
interacciona con los receptores de la superficie de las células T
para intensificar o efectuar de otro modo una respuesta inmune.
Utilizado aquí "antigenicidad" representa la capacidad para
provocar una respuesta inmune (v.g. actuando como antígeno), la
capacidad para causar la producción de anticuerpos (v.g. actuando
como antígeno) y/o la capacidad para interaccionar con un receptor
de la superficie celular con el fin de intensificar una respuesta
inmune o producción de anticuerpos.
El término "HBV" representa cualquier
subtipo del virus, concretamente adw, ayw, adr y ayr, descritos en
la literatura (P. Valenzuela, Nature Vol. 280, pág. 815 (1.979),
Gerlich, EP-A-85.111.361, Neurath,
EP-A-85.102.250). Los ejemplos de
las secuencias peptídicas de los mismos, que constituyen la
secuencia o secuencias polipeptídicas a), que median la
antigenicidad de uno o más epitopos, se muestran en el Listado de
Secuencias (SEC ID Núm. 17-20, 22).
Las realizaciones preferidas de la presente
invención son las siguientes combinaciones:
- -
- partículas del antígeno S de HBV con epitopos específicos (determinantes) de los péptidos pre-S1, pre-S2 y/o del núcleo;
- -
- partículas del antígeno del núcleo de HBV con epitopos específicos (determinantes) de los péptidos pre-S1, pre-S2, S y/o de los antígenos del núcleo;
- -
- partículas del antígeno de la hepatitis A con epitopos específicos (determinantes) de los péptidos S, pre-S1, pre-S2 y/o del núcleo de la hepatitis B.
Las moléculas de ADN recombinante preferidas
para la presente invención se caracterizan por la presencia de
secuencias que codifican para la secuencia o secuencias
polipeptídicas a), que median la antigenicidad de uno o más
epitopos de las células T, y para el polipéptido b), que tras la
secreción forma partículas que tienen un diámetro de 10 nm o más,
de las cuales ambas están bajo el control de un promotor adecuado.
Como ejemplos de las secuencias que codifican para a) se pueden
mencionar cualquiera de las secuencias enumeradas bajo los Núm. de
ID 1 a 24 del Listado de Secuencias. Los ejemplos de la secuencia de
ADN que codifica para la secuencia b) están representados por
cualquiera de las secuencias de ID 25 a 27 o 35 del Listado de
Secuencias.
Cualquiera de las 24 secuencias (números de ID 1
a 24) puede ser combinada con cualquier secuencia descrita bajo el
número de ID 25 a 27 del Listado de Secuencia, en éste están
incluidos los órdenes tanto a-b como
b-a.
Una realización preferida concreta de la
presente invención consiste en una combinación de la secuencia del
epitopo Núm. ID 28 (correspondiente a la secuencia que incluye los
aminoácidos 9 a 28 de la secuencia S1 de HBV) combinada con la
secuencia ID Núm. 26 y/o 27 como un formador de partículas.
Las secuencias del virus de la hepatitis
utilizadas en el constructo de ADN recombinante puede ser formadas
o aisladas por cualquier medio incluyendo el aislamiento y la
ligadura de los fragmentos de restricción, la síntesis química de
oligonucleótidos utilizando un sintetizador (Cyclon,
Bio-Search), y la síntesis mediante el método de la
PCR (T.J. White, N. Arnleim, H.E. Erlich, 1.989; The Polymerase
Chain Reaction, Technical Focus 5 (6)).
Las moléculas de ADN recombinante preferidas
fueron formadas mediante ligadura de oligonucleótidos sintéticos a
un fragmento 5' XbaI-BglII 3' (número ID 27) de la
región S del genoma de HBV, que está derivado de un fragmento
BglII-BglII de HBV incluyendo la región
pre-S1-pre-S2-S
completa, o la ligadura a la región S completa. Los
oligonucleótidos utilizados en la elaboración de tales constructos
se resumen en la siguiente Tabla I.
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Otras moléculas de ADN preferidas fueron
formadas mediante la ligadura de secuencias del núcleo, que se
preparan mediante el método de PCR y que codifican para los
epitopos de las células T, a la secuencia del núcleo de HBV (SEC ID
Núm. 25) que funciona como secuencia polipeptídica b). Los
oligonucleótidos utilizados en la preparación de estos constructos
se dan en la Tabla II-1.
La Tabla II-2 muestra diversos
ejemplos, en los que las secuencias de ADN que codifican para el
epitopo de las células T han sido aisladas mediante fragmentación
mediante restricción del genoma de HBV y han sido ligadas a la
secuencia de ADN que codifica para la secuencia polipeptídica b)
como se ha definido antes.
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En la Tabla II-3 se enumeran las
moléculas de ADN recombinante específicas. El procedimiento para su
construcción se describirá con más detalle en los Ejemplos.
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Las moléculas de ADN recombinante preferidas
según la presente invención comprenden, aparte de las regiones que
codifican para los polipéptidos a) y b), una secuencia de ADN
adicional que codifica para un marcador de selección. Además,
comprenden todos los elementos habituales esenciales para la
expresión, tales como una secuencia promotora, un codon de
iniciación y una señal de poliadenilación.
Los ejemplos de los promotores adecuados son el
promotor de la metalotioneína (MT), U2 y H2K en caso de utilizar
células de mamífero como célula huésped. Si se van a emplear células
de levadura o bacterianas, se pueden utilizar promotores de
levadura y bacterianos apropiados, tales como el promotor GCN4- y
GAL 1/10 o los promotores trp- y tac procarióticos,
respectivamente.
Con el fin de producir la combinación de
polipéptido o polipéptidos a) y polipéptido b) según esta solicitud
la molécula de ADN recombinante es insertada en las células huésped
mediante transfección (en el caso de células de mamífero), mediante
transformación (en el caso de células de levadura y bacterianas), o
por otros medios. En cuanto al huésped, se pueden utilizar células
de cualquier organismo que sean susceptibles de transcribir y
traducir las moléculas de ADN recombinante, tales como células de
mamífero, bacterianas y de levadura.
Las células de mamífero adecuadas según esta
invención son por ejemplo las células VERO (una línea celular de
riñón de mono), 3T3-C127 y las células L (líneas
celulares de fibroblastos murinos), y las células CHO (ovario de
hámster Chino), que son o bien positivas o bien negativas en
deshidrofolato reductasa.
Según una realización específica de la presente
invención es posible además que la primera secuencia de ADN
definida anteriormente y la segunda secuencia de ADN definida
anteriormente, que codifican para una secuencia o secuencias
polipeptídicas a) y para una secuencia polipeptídica b),
respectivamente, estén presentes en diferentes moléculas de ADN
recombinante, en cuyo caso las células huésped son
co-transfectadas con ambas moléculas de ADN
recombinante.
\newpage
La Tabla III da una visión de conjunto sobre
cómo combinar secuencias de ADN adecuadas para obtener constructos
de ADN según la presente invención. Se debe observar que cualquiera
de los constituyentes descritos en esta tabla puede ser combinado
para proporcionar una secuencia de ADN que puede ser tomada, si es
transfectada a una célula huésped, para producir una combinación
(que comprende el polipéptido o polipéptidos a) y b)) como
medicamento para el tratamiento de la hepatitis B crónica. Las
secuencias de ADN que codifican para las secuencias del epitopo de
las células T han sido preparadas sintéticamente (SIN) con un
sintetizador Biosearch Cyclon, mediante el procedimiento de la PCR
(PCR), o mediante fragmentación con enzimas de restricción del
genoma viral (GEN).
Para el tratamiento de los pacientes que padecen
hepatitis viral crónica se puede formular la combinación de la
secuencia o secuencias polipeptídicas a) y un portador b) en
cualquier tipo de composición farmacéutica, que además comprende un
diluyente adecuado o un material portador farmacéutico, tal como una
solución tampón.
La administración puede ser efectuada mediante
cualquier método, es decir mediante administración parenteral (v.g.
intravenosa o intramuscular) u oral (v.g. utilizando células
bacterianas tifoideas para encapsular la sustancia activa).
La preparación farmacéutica comprende la
combinación anteriormente descrita en una concentración suficiente
para lograr una respuesta tras la administración.
Figura I muestra un constructo de ADN, que
codifica para un promotor, una secuencia formadora de partículas y
un gen de selección (descrito en el Ejemplo 3/4).
Figura II muestra un constructo de un
gen-ADN que contiene un promotor, un epitopo con
HB-S-Ag completo y un gen de
selección (descrito en el Ejemplo 3/18).
Figura III muestra un constructo de ADN que
presenta un promotor, un epitopo de célula T con un resto formador
de partículas y un gen de selección (descrito en el Ejemplo
3/21).
Figura IV muestra los valores AST de chimpancé
1 durante el tratamiento con Hepa-Care (descrito en
el Ejemplo 10/1).
Figura V muestra los valores de antígeno de
chimpancé 1 durante el tratamiento con Hepa-Care
(descrito en el Ejemplo 10/1).
Figura VI muestra los valores de las enzimas
del hígado ALT y GGT de chimpancé 1 con tratamiento de refuerzo
tres veces con Hepa-Care (descrito en el Ejemplo
10/2).
Figura VII muestra los valores de las enzimas
del hígado ALT, AST, y GGT y de un antígeno de chimpancé 2 durante
el tratamiento con Hepa-Care (descrito en el Ejemplo
10/3).
Figura VIII muestra las enzimas del hígado
determinadas para un chimpancé de control no tratado (descrito en
el Ejemplo 10/3).
Figuras IX & X muestran los títulos de
antígeno y
anticuerpo del paciente 1 durante el tratamiento
con Hepa-Care, respectivamente (descrito en el
Ejemplo 11).
Figuras XI & XII muestran los títulos de
antígeno y
anticuerpo del paciente 2 durante el tratamiento
con Hepa-Care, respectivamente (descrito en el
Ejemplo 11).
Figuras XIII & XIV muestran los títulos de
antígeno y
anticuerpo del paciente 2 durante el tratamiento
con Hepa-Care, respectivamente (descrito en el
Ejemplo 11).
La invención es descrita más específicamente
mediante los siguientes ejemplos.
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Se recogió el sobrenadante de cultivos
productores de proteína de HBV y se separó en porciones de 2.400 ml.
A cada porción se añadieron 144 g de PEG 6000 (Serva) y se
disolvieron agitando a la temperatura ambiente durante otras 6
horas a 4ºC. El precipitado se separó por centrifugación en botellas
de 500 ml en un Rotor GS 3 a 9.000 rpm (15.000 x g) durante 30
minutos a 10ºC. El sobrenadante se recogió y se añadieron 144 g de
PEG 6000 y se disolvieron como se ha descrito antes. La solución se
agitó a 4ºC durante 3 horas. El precipitado de esta solución fue
cosechado como se ha descrito antes excepto que la centrifugación
continuó durante 60 minutos.
El material obtenido tras la precipitación con
PEG se redisolvió en 20 ml de PBS y se sometió a cromatografía en
gel sobre A-5m (BioRad). Las dimensiones de la
columna eran de 25 x 1000 mm y el volumen del lecho de 480 ml. En
un ciclo de fraccionamiento típico se cargaron 1.000 \mug de
proteína de HBV precipitada con PEG en 10 a 15 ml y se hicieron
eluir con PBS a una velocidad de 6 gotas/minuto (18 ml/hora). Se
recogieron fracciones de 3 ml. La proteína de HBV eluía con el
primer pico. Las fracciones recogidas se sometieron a un gradiente
de CsCl.
Se recogieron aproximadamente 30 fracciones que
cubrían el primer pico en la cromatografía en columna
A-5m y que contenían la proteína de HBV
prepurificada hasta aproximadamente 100 ml. Esta solución se ajustó
a una densidad de 1,30 g/cc con CsCl y con posterioridad se
transfirió a un tubo de polialómero que encajaba en un rotor SW
27/28 (Beckman). Se ajustó un gradiente extendiendo por debajo 4 ml
de una solución de CsCl de 1,35 g/cc y cubriendo con 4 ml de 1,25
g/cc seguido de 4 ml de 1,20 g/cc de densidad. Este gradiente se
había mantenido a 28.000 rpm durante 50 horas a 10ºC. Después de
eso el gradiente fue fraccionado, y se recogió la proteína de HBV
purificada que flotaba en la capa de 1,20 g/cc de densidad. La
solución se desaló mediante tres ciclos de diálisis en bolsas
frente a agua.
En el radioinmunoanálisis "sándwich" AUSRIA
II-125 (asequible comercialmente de Abbot), se
incubaron bolitas revestidas con anticuerpo de cobaya para el
antígeno de superficie de la Hepatitis B (Anti-HBs)
con suero o plasma o proteína purificada y controles apropiados.
Cualquier HBsAg presente se unía al anticuerpo en fase sólida. Tras
la aspiración del material no unido y el lavado de las bolitas, se
dejó que Anti-HBs-T125 humano
reaccionara con el complejo anticuerpo-antígeno de
la bolita. Las bolitas se lavaron después para separar el
Anti-HBs-I^{125} no unido.
)-Anti-HBs
HBsAg
)-Anti-HBs
\cdot HBsAg
Anti-HBs-I^{125}
)-Anti-HBs
\cdot HBsAg \cdot
Anti-HBs-I^{125}
La radioactividad que permanecía en las bolitas
fue contada en un contador de centelleo gamma.
En el análisis "sándwich" Enzignost HBsAg
micro (asequible comercialmente de Behring), se revistieron los
pocillos con anti-HBs. Se añadieron a los pocillos
suero, plasma o proteína purificada y se añadieron los controles
apropiados a los pocillos y se incubaron. Después de lavar, se
hicieron reaccionar anticuerpos para HBsAg marcados con peroxidasa
con los determinantes antigénicos restantes. Los anticuerpos
enlazados a enzima no unidos se separan lavando y se determinó la
actividad de la enzima sobre la fase sólida. La reacción catalizada
enzimáticamente de peróxido de hidrógeno y cromógeno se detuvo
añadiendo ácido sulfúrico diluido. La intensidad de color era
proporcional a la concentración de HBsAg de la muestra y se obtuvo
mediante comparación fotométrica de la intensidad de color de las
muestras no conocidas con las intensidades de color de los sueros de
control negativo y positivo adjuntos.
El plásmido
pBPV-342-12 (ATCC 37224) fue
digerido con las endonucleasas BglII y BamHI. Se generaron tres
moléculas de ADN. El fragmento de interés contiene el promotor de
la metalotioneína y una secuencia pBR322 que comprende 4,5 kb y es
fácilmente detectable a partir de los otros fragmentos (2,0 kb y 7,6
kb).
La reacción se realizó en un volumen total de
200 \mul de tampón de reacción a una concentración final de 0,5
\mug/\mul de ADN incluyendo 100 unidades de cada enzima de
restricción. La conclusión de la digestión fue verificada tras la
incubación a 37ºC durante tres horas mediante electroforesis en gel
de agarosa a un 0,8% de gel de agarosa. La reacción se detuvo
añadiendo 4 \mul de EDTA 0,5 M.
El fragmento de 4,5 kb fue separado de los otros
fragmentos mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,2%
preparativa. El ADN se hizo eluir del gel de agarosa en un papel de
filtro DE-81 Whatman del que se separó el ADN en un
tampón altamente salino. El ADN se purificó mediante extracción con
fenol-cloroformo y dos precipitaciones en
etanol.
Se aisló un fragmento
BamHI-BamHI de 1,8 kb, que contenía las regiones
codificadoras del núcleo de HBV a partir de HBV que contenía ADN.
Este fragmento fue ligado junto con el fragmento de 4,5 kb que
contenía el promotor de MT y el resto pBR (descrito en el apartado
1).
Se mezclaron 2 \mul del fragmento de 1,8 kb
con 3 \mul del fragmento de 4,5 kb y se ligaron juntos en un
volumen total de 10 \mul de tampón de ligadura, que contenía 2
unidades de ADN ligasa de T4 y ATP 2 mM a 14ºC durante la
noche.
La mezcla de ligadura se añadió a 150 \mul de
una suspensión celular bacteriana competente para la absorción de
ADN. Tras la absorción de ADN las células bacterianas fueron
esparcidas sobre placas de agar LB que contenían 50 \mul de
ampicilina a volúmenes de 50 a 300 \mul de suspensión celular por
placa. Las placas de agar fueron incubadas a 37ºC durante la noche.
Se rastreó la presencia de un plásmido que contuviera los fragmentos
deseados en las colonias bacterianas aisladas sencillas.
Se escogieron colonias sencillas con un palillo
y se transfirieron a un tubo que contenía medio
LB-ampicilina (5 ml). Los tubos fueron incubados
durante la noche a 37ºC en un medio ambiente con sacudimiento
rápido. Se hizo una minipreparación del plásmido de cada suspensión
bacteriana en desarrollo. Se comprobaron los diferentes ADN
resultantes mediante digestión con la endonucleasa de restricción
BglII. Se esperaban dos moléculas, un fragmento de 400 pb y un
fragmento de 5,9 kb. La digestión fue analizada mediante
electroforesis en gel de agarosa. El ADN del plásmido fue aislado
de las células bacterianas.
El plásmido resultante del apartado (3) anterior
fue linealizado mediante digestión con la enzima de restricción
EcoRI. La reacción se realizó en un volumen total de 50 \mul y una
concentración final de 1 \mug/\mul de ADN del plásmido. Se
añadieron 50 unidades de EcoRI y se comprobó la digestión tras la
incubación a 37ºC durante tres horas mediante electroforesis en gel
de agarosa. La reacción se detuvo añadiendo 1 \mul de EDTA 0,5 M
y el ADN se hizo precipitar con una concentración final de acetato
de sodio 0,3 M y 3-4 volúmenes de etanol a -80ºC
durante 30 minutos. El ADN precipitado se disolvió en 50 \mul de
agua destilada.
Se mezclaron 2 \mul del plásmido linealizado
con 3 \mul del fragmento de ADN que contenía el promotor de la
metalotioneína y el gen de selección de la neomicina (aislado del
plásmido pMT-neo-E (asequible de
ATCC/Exogene) mediante digestión con la endonucleasa EcoRI como un
fragmento de 3,9 kb), y se ligaron entre sí. Se rastreó la
presencia del plásmido deseado en las colonias bacterianas
sencillas.
El plásmido
pUC-8-42 (asequible de Exogene) fue
digerido con las endonucleasas de restricción EcoRI y ApaI. Se
generaron dos moléculas de ADN. El fragmento de interés contiene el
promotor de U2 que comprende 340 pb y es fácilmente detectable
respecto al otro fragmento (3160 pb). La digestión fue realizada en
un volumen total de 200 \mul de tampón de reacción a una
concentración final de 0,5 \mug/\mul de ADN incluyendo 100
unidades de cada enzima de restricción. La conclusión de la
digestión fue verificada tras la incubación a 37ºC durante tres
horas mediante electroforesis en gel de agarosa en un gel de agarosa
al 0,7%. La reacción se detuvo añadiendo 4 \mul de EDTA 0,5 M. El
fragmento de 340 pb fue separado del ADN del plásmido mediante
electroforesis preparativa en gel de agarosa al 1,2%. El ADN se hizo
eluir del gel de agarosa sobre un papel de filtro
DE-81 Whatman del que se separó el ADN en un tampón
altamente salino. El ADN fue purificado mediante extracción en
fenol/cloroformo y dos precipitaciones en etanol.
El plásmido pSP165 (asequible comercialmente de
Promega Biotec) que contiene una secuencia policonectora (que
contiene los siguientes sitios de restricción: EcoRI, SacI, SmaI,
AvaI, BamHI, BglII, SalI, PstI, HindIII) fue linealizado con la
enzima de restricción EcoRI. La reacción se realizó en un volumen
total de 50 \mul y una concentración final de 1 \mug/\mul de
ADN plasmídico. Se añadieron 50 unidades de EcoRI y la digestión se
comprobó tras la incubación a 37ºC durante tres horas mediante
electroforesis en gel de agarosa. La reacción se detuvo añadiendo 1
\mul de EDTA 0,5 M y el ADN se hizo precipitar con una
concentración final de acetato de sodio 0,3 M y 3-4
volúmenes de etanol a -80ºC durante 30 minutos. El ADN precipitado
se disolvió en 50 \mul de agua destilada.
Se mezclaron 2 \mul de ADN plasmídico con 10
\mul del ADN del fragmento que contenía la secuencia promotora de
U2, y se ligaron entre sí en un volumen total de 25 \mul de tampón
de ligadura que contenía 2 unidades de ADN ligasa de T4 y ATP 2 mM
a 14ºC durante la noche. Después de eso, el ADN se purificó mediante
extracciones con fenol/cloroformo seguido de dos precipitaciones en
etanol y se disolvió en 10 \mul de agua destilada. Los extremos
cohesivos resultantes de EcoRI y ApaI tuvieron que ser convertidos
en extremos romos y ligados. Los extremos cohesivos fueron
convertidos en extremos romos mediante reacción con la nucleasa de
haba de Mung como sigue: a 25 \mul de ADN (concentración 1
\mug/\mul) en tampón de reacción se añadieron 20 unidades de
enzima para dar una concentración final de glicerol al 1% y un
volumen de reacción final de 35 \mul. Tras incubar durante 30
minutos a 30ºC el ADN fue purificado mediante extracciones con
fenol-cloroformo seguido de dos precipitaciones en
etanol. El ADN fue disuelto de nuevo en 5 \mul de agua destilada.
Los extremos romos resultantes fueron ligados entre sí en 15 \mul
de volumen de reacción que contenía 10 veces más ligasa de T4 que
la utilizada antes y ATP 2 mM a 14ºC durante la noche.
La mezcla de ligadura fue añadida a 150 \mul
de suspensión de células bacterianas competentes para la absorción
de ADN. Tras la absorción del ADN las células bacterianas fueron
esparcidas sobre placas de agar LB que contenían 50 \mug/ml de
ampicilina a volúmenes de 50 a 300 \mul de suspensión celular por
placa. Las placas de agar fueron incubadas a 37ºC durante la noche.
Se rastreó la presencia de un plásmido que contenía el fragmento
promotor de U2 deseado en las colonias bacterianas aisladas
sencillas. El plásmido resultante fue aislado de las células
bacterianas y caracterizado mediante análisis con enzimas de
restricción.
El fragmento de 4,5 kb (descrito en el apartado
1) que contenía el promotor de MT y un resto pBR fueron ligados
entre sí con el oligonucleótido sintético 89 (SEC ID Núm.:30). La
mezcla de ligadura se añadió a 150 \mul de suspensión celular de
bacterias competentes para la absorción de ADN. Se rastreó la
presencia del plásmido deseado en las colonias bacterianas aisladas
sencillas. El nuevo plásmido fue comprobado mediante digestión con
las endonucleasas de restricción EcoRI y XbaI. Se esperaban dos
moléculas, una de 2,0 kb y una de 2,6 kb.
El plásmido (descrito en 7) fue digerido con
BglII y BamHI y se separó un fragmento de 13 nucleótidos (descrito
en 1). El fragmento resultante que contenía el primer
oligonucleótido 89 (SEC ID Núm.:30), fue ligado al oligonucleótido
101 (SEC ID Núm.:32), un fragmento BglII-BamHI. Tras
la absorción de ADN se rastreó la presencia del plásmido deseado en
las células sencillas. Se comprobó el nuevo plásmido mediante
digestión con las endonucleasas EcoRI y XbaI, o EcoRI y BglII.
El fragmento de 4,5 kb
(BglII-BamHI) fue ligado con el oligonucleótido de
ADN 99 (SEC ID Núm.:31). Después de rastrear las colonias
bacterianas sencillas, que contenían diferentes ADN, se caracterizó
el plásmido deseado mediante digestión con EcoRI, dando como
resultado dos fragmentos, de 1,9 kb y 2,7 kb, y mediante la
linealización positiva con BglII o BamHI.
El nuevo plásmido fue digerido después con PstI
y BamHI. Se esperaban dos moléculas, un fragmento de 2,6 kb, que
contenía un resto pBR, el promotor de MT y el oligonucleótido y un
resto pBR de 2,0 kb. El fragmento de 2,6 kb fue aislado.
El plásmido (descrito en el apartado 8) que
contenía los oligonucleótidos de ADN 89 y 101 (SEC ID Núm.:30 y 32,
respectivamente) fueron digeridos con PstI y BglII. Se esperaban dos
fragmentos. Un fragmento de 2,5 kb que contenía un resto pBR y el
promotor de MT y un fragmento de 2,2 kb, que contenía un resto pBR y
ambos
oligos.
oligos.
Este fragmento de 2,2 kb se ligó con el
fragmento de 2,6 kb, que contenía el resto pBR, el promotor de MT y
oligo 99 (SEC ID Núm.:31) descrito en el apartado 8.
Después de rastrear el plásmido deseado, este
fue caracterizado mediante digestión con endonucleasas de
restricción con BglII-XbaI. Se esperaban dos
fragmentos, un fragmento de 270 pb de los oligonucleótidos de ADN y
un fragmento de 4,5 kb del promotor de MT y el pBR.
Un fragmento BglII-BglII de 2,3
kb que contenía las regiones codificadoras de
pre-S1, pre-S2 y S de HBV fue
aislado de HBV que contenía ADN. El fragmento de 2,3 kb fue ligado
con el fragmento de 4,5 kb (obtenido como se ha descrito en el
apartado 1) que contenía el promotor de la metalotioneína.
Se mezclaron 2 \mul del fragmento de 2,3 kb
con 3 \mul del fragmento de 4,5 kb y se ligaron entre sí en un
volumen total de 10 \mul de tampón de ligadura, que contenía 2
unidades de ADN ligasa de T4 y ATP 2 mM a 14ºC durante la noche.
La mezcla de ligadura fue añadida a 150 \mul
de suspensión celular de bacterias competentes para la absorción de
ADN. Tras la absorción de ADN las células bacterianas fueron
esparcidas sobre una placa de agar LB que contenía 50 \mug/ml de
ampicilina a volúmenes de 50 a 300 \mul de suspensión celular por
placa. Las placas de agar fueron incubadas a 37ºC durante la noche.
Se rastreó la presencia de un plásmido que contenía el fragmento
deseado en las colonias bacterianas aisladas sencillas.
El plásmido resultante del apartado 11 anterior
fue digerido con las endonucleasas BglII y XbaI. Se esperaban dos
moléculas, un fragmento de 550 pb y un fragmento de 6,25 kb que se
había aislado tras electroforesis en gel de agarosa.
El fragmento de 6,25 kb fue ligado al fragmento
de 270 pb (tras la digestión con BglII y XbaI y aislamiento del
fragmento como se ha descrito antes) del plásmido descrito en el
apartado 10, que codifica para una parte del epitopo del gen del
núcleo de HBV.
La mezcla de ligadura fue añadida a 150 \mul
de suspensión celular de bacterias competentes para la absorción
del ADN. Se rastreó la presencia del plásmido deseado en las
colonias bacterianas aisladas sencillas. El nuevo plásmido fue
comprobado mediante digestión con BamHI. Se esperaban tres
moléculas, un fragmento de 950 pb, uno de 450 pb y uno de 5.150
pb.
El plásmido (descrito en el apartado 11) fue
digerido con EcoRI y XbaI. Se esperaban dos moléculas, un fragmento
de 2.450 pb y un fragmento de 4.350 pb que había sido aislado tras
electroforesis en gel.
Este fragmento de 4.350 pb fue ligado al
oligo-nucleótido de ADN 39 (SEC ID Núm.:29) que
codificaba para la secuencia de ADN completa del gen S de HBV desde
ATG hasta el sitio XbaI, donde el ATG era cambiado por ATA.
Este plásmido "vehículo" fue después
digerido con PstI y XbaI, se esperaban dos moléculas, un resto del
plásmido de 600 pb y un fragmento de 3.850 pb que fue aislado y
ligado con un fragmento PstI-XbaI de 2.800 pb (2.700
pb) aislado tras la digestión del plásmido descrito en el apartado
10.
Tras rastrear el plásmido deseado, este fue
caracterizado mediante digestión con las endonucleasas de
restricción EcoRI y XbaI, EcoRI y BglII y BamHI.
El plásmido (descrito en el apartado 14) fue
linealizado con EcoRI. La reacción se llevó a cabo en un volumen
total de 50 \mul y a una concentración final de 1 \mug/\mul de
ADN plasmídico. Se añadieron 50 unidades de EcoRI y la digestión
fue comprobada tras incubación a 37ºC durante tres horas mediante
electroforesis en gel de agarosa.
La reacción se detuvo añadiendo 1 \mul de EDTA
0,5 M y el ADN fue precipitado con una concentración final de
acetato de sodio 0,3 M y 3-4 volúmenes de etanol a
-80ºC durante 30 minutos. El ADN precipitado fue disuelto en 50
\mul de agua destilada.
Se mezclaron 2 \mul del plásmido linealizado
con 3 \mul del fragmento de ADN que contenía el promotor de la
metalotioneína y el gen de selección de la neomicina (descrito en el
apartado 4) y se ligaron entre sí. Se rastreó el plásmido deseado
en las colonias bacterianas sencillas el cual fue aislado,
purificado y caracterizado.
Cada constructo génico descrito antes puede ser
construido también con el promotor de U2 con lo cual el fragmento
de ADN que contiene el promotor de MT, tras la digestión con EcoRI y
BglII, es reemplazado por un fragmento de ADN que contiene el
promotor de U2 aislado tras la digestión con EcoRI y BglII.
El fragmento que contenía el gen de selección
egpt fue aislado tras la digestión del plásmido pMSG con BamHI y
BglII (1,8 kb) y ligado con un fragmento de 4,5 kb
(BglII-BamHI, descrito en el apartado 1) que
contenía el promotor de MT.
Tras rastrear el plásmido deseado éste fue
aislado, purificado y finalizado mediante una conversión del sitio
BamHI en un sitio EcoRI.
Se aisló un fragmento de ADN (400 pb) tras
electroforesis en gel. Este fue generado mediante el método de la
PCR (descrito en el Ejemplo 5) utilizando los oligonucleótidos
específicos 131 y 132 (SEC ID Núm.:33 y 34) como cebadores.
El fragmento de ADN fue digerido con las
endonucleasas BamHI y XbaI y purificado después mediante
electroforesis en gel. El fragmento aislado mediante PCR fue ligado
con un fragmento de 6,25 kb que había sido aislado del plásmido
(descrito en el apartado 13) tras la digestión con BglII y XbaI.
Tras la absorción de ADN y la transformación bacteriana se rastreó
el plásmido deseado en las colonias bacterianas sencillas.
El plásmido (descrito en el apartado 17) fue
finalizado añadiendo un gen de selección al plásmido (descrito en
el apartado 15).
El promotor H2K fue aislado en forma de un
fragmento EcoRI y BglII (2kb) de pSP65H2 (asequible de Exogene).
En todos los constructos descritos todos los
promotores son reemplazables como fragmentos EcoRI/BglII.
El plásmido resultante del apartado 11 anterior
fue digerido con las endonucleasas BglII y XbaI. Se esperaban dos
moléculas, una de las cuales es un fragmento de 6.250 kb que había
sido aislado tras la electroforesis en gel de agarosa.
El fragmento de 6.250 kb fue ligado con el
oligo-nucleótido de ADN 23 (SEC ID Núm.:28). La
mezcla de ligadura fue añadida a 150 \mul de suspensión celular
de bacterias competentes para la absorción del ADN. Se rastreó la
presencia del plásmido deseado en las colonias bacterianas aisladas
sencillas. El nuevo plásmido fue comprobado mediante digestión con
las endonucleasas EcoRI y BglII. Se esperaban dos moléculas, una de
1,9 kb y una de 4.450 kb.
El plásmido (descrito en el apartado 20) fue
linealizado con EcoRI. La reacción se realizó en un volumen total
de 100 \mul y una concentración final de 0,6 \mug/\mul de ADN
plasmídico. Se añadieron 60 unidades de EcoRI y la digestión se
comprobó tras incubación a 37ºC durante tres horas mediante
electroforesis en gel de agarosa. La reacción se detuvo añadiendo 2
\mul de EDTA 0,5 M y el ADN se hizo precipitar con una
concentración final de acetato de sodio 0,3 M y 4 volúmenes de
etanol a -80ºC durante 1 hora. El ADN precipitado se disolvió en 50
\mul de agua destilada.
Se mezclaron 2 \mul del plásmido linealizado
con 3 \mul del fragmento de ADN (3,7 kb) que contenía el promotor
de la metalotioneína y el gen de selección egpt (descrito en el
apartado 16) mediante digestión con EcoRI y se ligaron entre sí. Se
rastreó la presencia del plásmido deseado en las calles sencillas.
Cada uno de los constructos génicos descritos en la Tabla III son
preparables de la misma manera que se ha descrito antes.
Con el fin de lograr la secreción de cantidades
sustanciales de los péptidos de HBV codificados por los constructos
de la presente invención, deben ser transfectadas células de
mamífero con un constructo de ADN de la presente invención. La
co-transfección se realizó en dos etapas (es decir
una transfección separada para cada constructo) o en una sola etapa
(es decir una transfección utilizando una preparación de ambos
constructos). La co-transfección fue confirmada o
bien mediante el uso de diferentes marcadores de selección sobre los
dos constructos o bien mediante detección de la secreción de los
productos de expresión de ambos constructos mediante
inmunoanálisis.
Alternativamente, pudieron ser combinadas en un
único constructo una secuencia que codificaba la secuencia
peptídica del HBV de la presente invención y una secuencia separada
que codificaba la proteína S o del núcleo o de HAV completa.
La reacción en cadena de la polimerasa permite
amplificar secuencias nucleotídicas de ADN específicas de una
región seleccionada de secuencia genómica conocida in vitro
en más de un millón de veces (Thomas J. White, Norman Arnleim,
Henry A. Erlich 1.989: The polymerase chainreaction. Technical
Focus, Vol. 5. Núm. 6; S. Kwok y R. Higuchi 1.989: Avoiding false
positives with PCR. Nature, Vol. 339, pág.
237-238).
El ADN aislado de células o el ADN de plásmidos
es tratado para separar sus hebras complementarias. Estas hebras
son después templadas con un exceso de dos oligonucleótidos de ADN
(cada uno de una longitud de 20-25 pares de bases)
que han sido sintetizados químicamente para emparejar secuencias
separadas por X nucleótidos (donde X es generalmente entre 50 y
20.000 pares de bases).
Los dos oligonucleótidos sirven como cebadores
específicos para la síntesis de ADN in vitro catalizada por
ADN polimerasa que copia el ADN entre las secuencias
correspondientes a los dos oligonucleótidos. Si los dos
oligonucleótidos cebadores contienen la secuencia correcta es
posible crear nuevos sitios de digestión en 5' y 3'.
Después de múltiples ciclos de reacción, se
obtenía una gran cantidad de un fragmento de ADN de la longitud
deseada, se purificaba mediante electroforesis en gel y se
caracterizaba mediante digestión con enzimas de restricción y
electroforesis en gel de agarosa. El fragmento de ADN purificado,
amplificado era utilizado después para ligarlo con otros fragmentos
es decir plásmidos.
Los fragmentos de ADN de la PCR eran
amplificados con el extremo romo. Para obtener un extremo cohesivo
(para el procedimiento de ligadura) el fragmento tiene que ser
digerido con las endonucleasas deseadas y purificado de nuevo.
La reacción de la PCR funcionará durante 20 a 30
ciclos. Un ciclo se divide en tres etapas con diferentes tiempos de
reacción y diferentes temperaturas de reacción que se controlan
mediante un termo-ciclador de PCR. La primera etapa
es la "Desnaturalización" del ADN matriz (1
min-95ºC), la segunda etapa es la "Hibridación"
del ADN matriz y los cebadores (1 min/55ºC) seguida de la
"Polimerización" (2 min/72ºC).
El volumen final para un análisis es de 30
\mul por ejemplo, que contiene las siguientes concentraciones
finales: tampón de PCR (1 x), mezcla de nucleótidos con 200 \muM
de cada uno de los cuatro nucleótidos, 200 ng para 30 \mul de
cada uno de los dos cebadores, 0,5 unidades de
Taq-Polymerase por 30 \mul de agua bidest.
Las células receptoras (células C127 o CHO
asequibles de la ATTC) fueron sembradas en medio de crecimiento
normal (DMEM + Suero Bovino Fetal al 10%, Glucosa y Glutamina) en
placas de Petri (1-2 x 10^{6} células por placa,
10 cm de diámetro) el día 1. Al día siguiente se separó el medio (4
horas antes se añadió el precipitado de ADN a las células), y las
células se lavaron dos veces con 1 x PBS. Después se añadieron 8 ml
de DMEM sin FCS, 4 horas más tarde el precipitado de ADN (preparado
como se describe más abajo) se añadió a las células. De nuevo al
cabo de 4 horas se separó el medio, se añadieron 3 ml de
Glycerol-Mix (50 ml x 2 tampón TBS, 30 ml de
glicerol, 120 ml de agua destilada). El Glycerol-mix
fue separado inmediatamente tras una incubación a 37ºC durante 3
minutos y las células se lavaron con 1 x PBS. Las células fueron
cultivadas durante la noche con 8 ml de DMEM con FCS al 10%.
Al cabo de 48 horas, las células fueron
recuperadas de la placa mediante tratamiento con Solución de
Tripsina-EDTA (0,025% Tripsina + EDTA 1mM). Poco
después, para separar la Tripsina-EDTA se lavaron
las células con 1 x PBS, se suspendieron en DMEM con FCS al 10% y
se distribuyeron en placas de 24 pocillos costar (células de una
placa en cuatro placas de 24 pocillos).
Cuando las células habían crecido bien, se
añadió medio de selección (concentración 0,5 - 1 mg/ml de neomicina
o: xantina (250 \mug/ml), hipoxantina (15 \mug/ml) o adenina (25
\mug/ml), timidina (10 \mug/ml), aminopterina (2 \mug/ml),
ácido micofenólico (25 \mug/ml) para eco-gpt, por
ejemplo). El medió fue cambiado cada semana. Las primeras colonias
celulares en crecimiento fueron observadas después de 2 semanas.
A 10 \mug de ADN plasmídico y 20 \mug de ADN
portador (ADN de esperma de salmón, ADN de timo de ternera) se
añadió tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH
7,05) hasta un volumen final de 440 \mul y se mezcló junto con 60
\mul de CaCl_{2} 2 M. Después se añadió la misma cantidad de 2 x
TBS (Hepes 50 mM, NaCl 280 mM, NaHPO_{4} 1,5 mM, pH 7,05) y se
mezcló bien. La solución de precipitación se incubó durante 30
minutos y se añadió directamente a las células que iban a ser
transfectadas.
A la concentración deseada de antígeno
suspendido en solución salina estéril, se añadieron 1 : 10.000
volúmenes de Thimerosol, 1/10 volúmenes de
KAl(SO_{4})_{2}\diameter12 H_{2}O esterilizado
por filtración. El pH se ajustó a 5,0 con NaOH 1 N estéril y la
suspensión se agitó a la temperatura ambiente durante 3 horas. El
antígeno precipitado con alum fue recuperado mediante centrifugación
durante 10 minutos a 2.000 rpm, resuspendido en solución salina
normal estéril que contenía Thimerosol 1:10.000 y se tomaron
alícuotas en condiciones estériles.
Se recogió el sobrenadante celular de las
células secretoras de antígeno del núcleo de HB y se concentró por
ultrafiltración. El producto concentrado se aclaró mediante
centrifugación a 20.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC en un rotor
Beckman SW28.
La formación de partículas fue sometida a ensayo
mediante centrifugación por densidad en sacarosa (sacarosa
0-45%) en un rotor Beckman SW28 durante 24 horas a
28.000 rpm y a 4ºC. El gradiente fue fraccionado y las fracciones
sencillas fueron analizadas mediante Elisa.
Las siguientes tablas dan algunos resultados del
análisis de ELISA de partículas inmunogénicas de la presente
invención como se describe más abajo:
La Tabla IV muestra los datos de Elisa de la
partícula de antígeno de HBs purificada producida a partir de
cualquier constructo de secuencia de HBV de la presente invención
incluyendo los epitopos de pre-S1 y la región S con
el anticuerpo monoclonal anti-pre-S1
MA 18/7 y el anticuerpo monoclonal anti-HBs
GO22.
La Tabla IV muestra las fracciones (21)
recogidas después del gradiente de densidad en CsCl.
La Tabla V muestra los datos de Elisa de las
partículas de antígeno del núcleo de HB purificadas producidas a
partir de cualquier constructo de la secuencia del núcleo de HB de
la presente invención con anticuerpos policlonales contra al núcleo
de HB y con anticuerpo monoclonal GO22 contra
HB-S-Ag.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Hepa-Care son partículas que
presentan antígenos de superficie de la hepatitis B (S1 y S) en una
formulación específica (proporción 50:50), que se utilizan para el
tratamiento de portadores crónicos del virus de la hepatitis.
Experimento 1
Un chimpancé 1 portador de hepatitis B fue
tratado (intramuscularmente) con Hepa-Care a 0, 4, y
8 semanas de tiempo con una dosificación de 18 \mug por
inyección.
Se registraron las enzimas de hígado (Fig IV)
así como el nivel de antígeno de hepatitis B (Fig. V).
\newpage
Experimento 2
Se administró al chimpancé 1 tras el tratamiento
descrito antes un tratamiento de refuerzo a las 30, 34, y 38
semanas. Los resultados se muestran en la Fig. VI.
Experimento 3
Se trató el chimpancé 2 con
Hepa-Care, pero al contrario que al chimpancé 1 se
le administró intravenosamente. La dosificación fue de 2 mg. Los
resultados se muestran en la Fig. VII.
Asimismo se registraron las enzimas del hígado
de un chimpancé de control 3 y se muestra en la Fig. VIII.
\vskip1.000000\baselineskip
El paciente 1 (macho, edad = 65 años, enfermedad
durante 2 años):
\vskip1.000000\baselineskip
fue tratado (i.m.) con
Hepa-Care a 0, 1, 6, y 7 meses. Los resultados de
las mediciones de antígeno y anticuerpo se dan en la Fig. IX y
X.
El paciente 2 (hembra edad = 48 años, enfermedad
durante 12 años):
\vskip1.000000\baselineskip
fue tratado (i.m.) con
Hepa-Care a 0, 1, y 6 meses. Los resultados de las
mediciones de antígeno y anticuerpo se dan en la Fig. XI y
XII.
El paciente 3 (hembra, edad = 41 años,
enfermedad durante 5 años):
\vskip1.000000\baselineskip
fue tratado a 0, 1, 2, y 5 meses
(i.m.) con Hepa-Care. Los valores medidos de
antígeno HBs y anticuerpos anti-HBs se muestran en
la Fig. XIII y
XIV.
SEC ID NUM: 1
| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 558 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | amplificación PCR |
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\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEC ID NUM: 2
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 504 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | amplificación PCR |
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\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEC ID NUM: 3
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 504 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | amplificación PCR |
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\vskip1.000000\baselineskip
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SEC ID NUM: 4
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 534 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | amplificación PCR |
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SEC ID NUM: 5
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 534 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | amplificación PCR |
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SEC ID NUM: 6
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 87 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
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SEC ID NUM: 7
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 81 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
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SEC ID NUM: 8
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 114 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
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SEC ID NUM: 9
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 90 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
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SEC ID NUM: 10
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 261 PB |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
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SEC ID NUM: 11
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 291 PB |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
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SEC ID NUM: 12
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 123 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
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SEC ID NUM: 13
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 138 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
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SEC ID NUM: 14
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 294 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | S2 HBV ayw/adw |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | ADN de HBV |
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SEC ID NUM: 15
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 99 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
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SEC ID NUM: 16
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 390 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | amplificación PCR |
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SEC ID NUM: 17
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido con proteína correspondiente |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 60 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | S1 de HBV ay |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
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SEC ID NUM: 18
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SEC: | Nucleótido con proteína correspondiente |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 63 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | S1 de HBV ay |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
\vskip1.000000\baselineskip
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SEC ID NUM: 19
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SEC: | Nucleótido con proteína correspondiente |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 63 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | S1 de HBV ay |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
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\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID NUM: 20
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SEC: | Nucleótido con proteína correspondiente |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 108 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | S1 de HBV ay |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID NUM: 21
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 63 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | S1 de HBV ad |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
SEC ID NUM: 22
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido con proteína correspondiente |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 108 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | S1 de HBV ad |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
SEC ID NUM: 23
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 60 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | S2 de HBV ay |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
SEC ID NUM: 24
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 60 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | S2 de HBV ay |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
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SEC ID NUM: 25
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 558 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV adw |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | amplificación PCR |
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SEC ID NUM: 26
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 678 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | S de HBV adw/ayw |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | ADN de HBV |
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SEC ID NUM: 27
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 585 pb |
| DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | S de HBV adw/ayw |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | ADN de HBV |
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SEC ID NUM: 28
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 106 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | S1 de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
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SEC ID NUM: 29
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| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 115 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | S de HBV |
| EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID NUM: 30
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 108 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID NUM: 31
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 106 pb |
| DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEC ID NUM: 32
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 89 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID NUM: 33
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 25 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID NUM: 34
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 25 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | sintetizado químicamente |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEC ID NUM: 35
\vskip1.000000\baselineskip
| TIPO DE SEC: | Nucleótido |
| LONGITUD DE SECUENCIA: | 588 pb |
| CUALIDAD DE LA HEBRA: | sencilla |
| TOPOLOGIA: | lineal |
| TIPO DE MOLECULA: | ADN genómico |
| FUENTE ORIGINAL: | núcleo de HBV |
| FUENTE EXPERIMENTAL INMEDIATA: | amplificación PCR |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (19)
1. Un procedimiento para la producción de una
composición para el tratamiento de la hepatitis crónica causado por
el virus de la hepatitis B, cuyo procedimiento comprende
combinar
a) al menos una secuencia polipeptídica que
tiene uno o más epitopos activadores de las células T antigénicas
del virus de la hepatitis B y
b) un portador susceptible de presentar la
secuencia o secuencias del epitopo a), donde la secuencia o
secuencias polipeptídicas a) se unen a un portador b) mediante un
enlace covalente o hidrofóbico.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1,
donde dicha secuencia o secuencias polipeptídicas a) son la
secuencia de aminoácidos de uno o más miembros seleccionados entre
los péptidos pre-S1, pre-S2 y S
virales de HB y los antígenos del núcleo de HB.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1,
donde dicha secuencia o secuencias polipeptídicas a) son un
polipéptido del virus de la hepatitis B modificado:
i) por tener deleciones arbitrarias, con lo cual
se conserva un epitopo que comprende al menos seis restos
aminoácido consecutivos,
ii) por tener sustituciones de uno o varios
aminoácidos, o
iii) por llevar una secuencia de aminoácidos
adicional en su extremo N, en su extremo C o en forma de
inserción.
4. Un procedimiento según la reivindicación 3,
donde dicha secuencia polipeptídica a) es la secuencia de
aminoácidos de uno o más miembros seleccionados entre los péptidos
pre-S1, pre-S2 y S virales de HB y
los antígenos del núcleo de HB, modificados como se define en la
reivindicación 3.
5. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde dicha secuencia o secuencias
polipeptídicas a) están miristiladas.
6. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde dicha secuencia o secuencias
polipeptídicas a) están producidas mediante la expresión de una
molécula de ADN recombinante.
7. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde dicho portador b) es un
polisacárido, un polímero hidrofóbico o una molécula inorgánica que
tiene forma de partícula.
8. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde dicho portador b) es una segunda
secuencia polipeptídica.
9. Un procedimiento según la reivindicación 8,
donde dicha secuencia polipeptídica b) tras la secreción forma
partículas que tienen un diámetro de al menos 10 nm.
10. Un procedimiento según la reivindicación 8 o
9, donde dicha secuencia polipeptídica b) es una parte sustancial o
una secuencia de aminoácidos completa de un polipéptido seleccionado
entre el péptido S de HBV; los antígenos del núcleo de HBV, del
núcleo de HAV y del núcleo de HIV; y los antígenos de superficie del
virus de la polio, HAV o HIV.
11. Un procedimiento según la reivindicación 8 o
9, donde dicha secuencia polipeptídica b) es una parte sustancial o
una secuencia de aminoácidos completa de un polipéptido seleccionado
entre el péptido S de HBV; los antígenos del núcleo de HBV, del
núcleo de HAV y del núcleo de HIV; y los antígenos de superficie del
virus de la polio, HAV o HIV modificados
i) por tener deleciones arbitrarias, con lo cual
se conserva la capacidad formadora de partículas,
ii) por tener sustituciones de uno o varios
aminoácidos, o
iii) por llevar una secuencia de aminoácidos
adicional en su extremo N, en su extremo C o en forma de
inserción.
12. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 11, donde dicha secuencia polipeptídica b)
está miristilada.
13. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 12, donde dicha secuencia polipeptídica b) está
producida mediante la expresión de una molécula de ADN
recombinante.
\newpage
14. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 13, donde dichas secuencias polipeptídicas a) y
b) están enlazadas vía puentes disulfuro.
15. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 13, donde dichas secuencias polipeptídicas a) y
b) están enlazadas vía "anclaje hidrofóbico" (mediado por ácido
mirístico).
16. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 13, donde dichas secuencias polipeptídicas a) y
b) están enlazadas mediante un enlace peptídico, donde opcionalmente
se inserta una secuencia espaciadora entre la secuencia o
secuencias polipeptídicas a) y la secuencia polipeptídica b),
estando enlazada dicha secuencia espaciadora vía enlaces peptídicos
a las secuencias polipeptídicas a) y b).
17. Un procedimiento según la reivindicación 16,
donde dicha secuencia o secuencias polipeptídicas a) y dicha
secuencia polipeptídica b) han sido producidas mediante la expresión
a partir de la misma molécula de ADN recombinante en la cual las
secuencias están codificadas en tándem.
18. Un procedimiento según la reivindicación 17,
donde dicha secuencia o secuencias polipeptídicas a) y dicha
secuencia polipeptídica b) son expresadas a partir de un marco de
lectura abierto sencillo sobre dicha molécula de ADN y están
opcionalmente separadas por una secuencia polipeptídica espaciadora
también codificada en el marco de lectura abierto sencillo.
19. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde dicha composición es para la
administración mediante inyección intravenosa o intramuscular.
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