HU216301B - Eljárás krónikus vírusos hepatitisz kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására - Google Patents

Eljárás krónikus vírusos hepatitisz kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU216301B
HU216301B HU9301794A HU179493A HU216301B HU 216301 B HU216301 B HU 216301B HU 9301794 A HU9301794 A HU 9301794A HU 179493 A HU179493 A HU 179493A HU 216301 B HU216301 B HU 216301B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
sequence
dna
hbv
polypeptide sequence
polypeptide
Prior art date
Application number
HU9301794A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT66437A (en
HU9301794D0 (en
Inventor
Hans A. Thoma
Original Assignee
Medeva Holdings Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8204863&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU216301(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Medeva Holdings Bv filed Critical Medeva Holdings Bv
Publication of HU9301794D0 publication Critical patent/HU9301794D0/hu
Publication of HUT66437A publication Critical patent/HUT66437A/hu
Publication of HU216301B publication Critical patent/HU216301B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

A találmány tárgyát egy őlyan készítmény előállítási eljárása képezi,amely legalább egy őlyan pőlipeptidszekvenciát, amely képesbefőlyásőlni egy vagy több epitóp antigenicitását, valamint gy őlyanhőrdőzót tartalmaz, amely képes beműtatni ez(eke)t a pőlipeptid-szekvenciá(ka)t, amelyek nagyőn hasznősak krónikűs virális hepatitiskezelésére. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás olyan gyógyszerkészítmények előállítására, amelyekkel krónikus virális hepatitises betegségeket lehet gyógyítani.
Legalább öt különböző vírus, nevezetesen a Hepatitis A, B, C, D és E képes akut hepatitises klinikai tüneteket okozni. A Hepatitis A és E megbetegedések, amelyek enterálisan terjednek, nem alakulnak át krónikus fertőzéssé, míg a Hepatitis B és C (korábban parenterális non-A, non-B Hepatitisnek hívták), valamint a D krónikus gyulladásos állapotba megy át, amely azután májcirrózist és primer hepatocelluláris karcinómát okoz.
Viszonylag kevés adat hozzáférhető a Hepatitis Cről és D-ről, a diagnosztikai módszereikről, kezelésükről, valamint a betegséget okozó vírusokról. A Hepatitis D vírus egy RNS vírus, amelyről ismert, hogy inkomplett. Ennélfogva helper vírusra van szüksége ahhoz, hogy a betegben kifejlődjön, és csak HBV-vel (Hepatitis B vírussal) fertőzött egyénekben található meg. Csak az utóbbi időben mutatták ki a Hepatitis C vírust (HCVt), és fejlesztettek ki egy antitest tesztet (anti-HCV), amely megkönnyíti a Hepatitis C fertőzések kimutatását. Egyre növekvő igény van azonban ennek a betegségnek a kezelésére.
Ugyanez igaz a krónikus Hepatitis B-re is, amely sokkal jobban kivizsgált betegség, ami az immunológiai módszerekkel való felismerését, a kórokozó vírust, a vírus életciklusát és DNS-szekvenciáját illeti. Betegekről akkor mondják, hogy a Hepatitis B vírus hordozói, ha a virális DNS tíz hétnél tovább marad fenn, a Hepatitis B e-antigén (HBeAg) 12 hétnél tovább marad fenn, vagy a Hepatitis B felszíni antigén (HBsAg) hat hónapnál tovább marad fenn.
Durván hárommillió emberről tételezhető fel, hogy a krónikus Hepatitis B-ben szenved, legtöbbjük a Távol-Keleten él.
Ezen népességnek a fertőzés fő veszélye a születés során vagy közvetlenül utána a legnagyobb, mivel egy krónikusan fertőzött anya átadja a vírust az újszülöttjének. Az ily módon fertőzött gyermekek 90 százaléka krónikusan fertőzötté is válik későbbi életében. A nyugati világban a fertőzés sokkal gyakrabban fordul elő az élet későbbi szakaszában vagy éppen a felnőttkorban, és főleg parenterális vagy szexuális úton terjed. Ezekben az esetekben a születés utáni Hepatitis B fertőzést kapottaknak csak 5-10 százaléka lesz krónikus hordozója a betegségnek. Az átvitt vírus azonban nem felelős a fertőzött emberekben mutatkozó különböző reakciókért, amelyek során a vírus vagy eliminálódik, vagy az egész életükben megmarad a testükben. Ennek következtében valószínűleg az immunológiai állapot határozza meg a jövőbeni fizikai állapotot.
A Hepatitis B virion (Dane-részecske) különböző szerkezeti fehérjékből, a magfehérjékből és a felületi (S) fehéijékből áll. Az utóbbiak egy olyan nyitott leolvasási keret (ORF) transzlációjának az eredményei, amely három S típusú dómén kódolószekvenciájára terjed ki, és ezek mindegyike olyan ATG triplettel indul, amely képes in vivő transzlációt iniciálni. A domének jelzése preSl, preS2 és S, a molekulákat 5’-3’ sorrendben említve. Ebből az ORF-ből hat fehéijetermék származik: egy glikozilezett és egy nem glikozilezett formája a fő fehérjének (gp27 és p24), amely csak az S doménből transzlálódik (226 aminosav), egy középső fehérje (281 aminosav), amely egy vagy két poliszacharid oldallánccal rendelkezik (gp33 és gp36), amelyet a preS2 és S régió kódol, és végezetül, a nagy fehérjének (389-400 aminosav, a vírus szerotípusától függően) mind egy glikozilezett (gp42), mind egy nem glikozilezett (p39) formája, amely a preSl, preS2 és az S transzlációjával jön létre. A magfehérjék jele HBeAg és HBeAg, az utóbbi végezetül a HBeAg feldolgozási terméke.
A Dane-részecske, amely a fertőzőképes virion, mind mag-, mind felszíni fehérjéket tartalmaz, míg a fonalak a hat felszíni antigén keverékéből jönnek létre. Az S peptid egyedül alakítja ki az úgynevezett 20 nm-es részecskét, amely teljesen fertőzésképtelen.
A HBV-vel fertőzött betegek a hepatitis különböző állapotain mennek keresztül, mielőtt krónikusan HBVvel fertőzötteknek tekintik őket. Közvetlenül a fertőzés után egy fertőzési állapot következik, amelyet a HBeAg jelenléte jellemez a szérumban. A folytatódó HB antigenémia, a gátolt HBV replikáció ellenére, azt jelzi, hogy virális DNS-szekvenciák integrálódtak a beteg celluláris genomjába. Az integrálódott virális szekvenciák nem teszik lehetővé a gazdasejt számára, hogy a teljes vírust szintetizálja. Az integrálódott HBV-szekvenciákat tartalmazó májsejtek azonban képesek arra, hogy csak HBsAg-t termeljenek, amely kimutatható a beteg szérumában és a krónikus Hepatitis B indikátora. A transzformált hepatociták a legnagyobb valószínűséggel nem lizálódnak a citotoxikus T-sejtek hatására, hanem szaporodnak, és vagy krónikus perzisztens hepatitist (CPH) vagy krónikus aktív hepatitist (CAH) indukálnak, amelyek azután a máj cirrózisához vagy primer hepatocelluláris karcinómához vezet, és ez a beteg idő előtti halálát okozza.
Újabban kimutatták, hogy azok a betegek, akik krónikusan fertőzöttek HBV-vel, nem képesek endogén interferont termelni [Abb et al., J. Med. Virol., 16, 171-176 (1985)]. Ez adta az alapját annak, hogy azokat a betegeket, akik krónikus hepatitisben szenvednek, amit a HBeAg és a HBV DNS szérumbeli jelenlétével lehet igazolni, interferon α-val (IFNa) kezeljenek. Nagyszámú betegen végzett ellenőrzött vizsgálatok azt mutatták, hogy az interferon a adagolása a kontrolihoz viszonyítva a Hepatitis B vírus jelentősen megnövekedett eliminálását okozza. A születéskor vagy akörül fertőződött személyeknél azonban nem lép fel szerokonverzió erre a terápiára adott válaszként. Ez a jelenség sajnálatos módon a hordozók 75%-át kizárja az IFNa terápiából.
Jelenleg az interferon a pontos hatásmódja a krónikus Hepatitis B-re nem ismert. Antivirális aktivitása megvédheti a fertőzött sejteket a fertőzéstől vagy csökkentheti a virális transzkripciót, transzlációt és replikációt a HBVvel fertőzött sejtekben. Az interferonnak immunmoduláló hatása van a T-sejtek, a makrofágok és az NK-sejtek aktiválása következtében, valamint azért, mert indukálja az MHCI osztályba tartozó fehérjék expresszióját.
A Hepatitis B kezelésének egy másik megközelítése azon az elképzelésen alapul, hogy a vírus replikációját
HU216301 Β gátolni kell, ezáltal a védekezését annyira le kell gyöngíteni, hogy a gazdaszervezet immunrendszere képes legyen eliminálni a vírust. Ez az elképzelés vezetett oda, hogy antivirális anyagokat, azaz például adeninarabinozidot és adenin-arabinozid-monofoszfátot vizsgáltak meg abból a szempontból, hogy lehet-e velük HBV-vel krónikusan fertőzött egyéneket kezelni. A betegeknek azonban kevesebb mint a fele reagált erre a terápiára, akár hosszan tartó, akár tranziens szerokonverzióval (HBeAg+-ról HBe+-ra). Ezeknek az antivirális anyagoknak egy további negatív tulajdonsága az, hogy immunszuppresszívek.
Más, a krónikus betegek kezelésének vizsgálatában alkalmazott hatóanyag az interferon B, az acikloguanozin (aciklovir), az interleukin 2, a szteroidok, például a prednizolon és ezek kombinációja. De egyikkel sem lehetett jobb eredményt elérni, mint az interferon a-val. Csak egy kombinációs terápia, amelynek során először szteroidokat adtak be, majd interferon α-t, növelte meg a reagálók arányát a kiválasztott betegekben.
A WO 88/10300 számú dokumentum olyan immunogén részecskéket ismertet, amelyek kétféle pepiid monomerből állnak. Az egyik fajta peptid monomerek tartalmaznak egy olyan aminosav-szekvenciát, amely egy olyan peptid lényegi részének felel meg, amely a szekréció során legalább 10 nm átmérőjű részecskéket képez, valamint egy olyan aminosav-szekvenciát, amely egy heterológ epitópnak felel meg. A másik fajta peptid monomerek szintén tartalmaznak egy olyan aminosav-szekvenciát, amely egy olyan peptid lényegi részének felel meg, amely a szekréció során legalább 10 nm átmérőjű részecskéket képez, de nem tartalmaznak heterológ epitópnak megfelelő aminosav-szekvenciát. Az első és a második peptid monomer nem azonos, de képes egymáshoz kapcsolódni.
Az EP-A-271 302 számú dokumentum HBV Tsejt epitópokat ismertet, valamint egy olyan módszert, amellyel egy immunogén immunogenitását fokozzák, oly módon, hogy az immunogént magprotein-részecskékhez kapcsolják.
Az EP-A-175261 számú dokumentum olyan immunogén kompozíciókat ismertet, amelyek egy részecskeképző proteinből és legalább egy fontos epitóppal rendelkező polipeptidből álló virális részecskéket tartalmaznak.
Az EP-A-250253 számú dokumentum a HBV pre-S régiójában előforduló T-sejt és B-sejt epitópokat ismertet.
Az EP-A-385 610 számú dokumentum HBV magantigén részecskék vakcinaként történő alkalmazását ismerteti, ahol a részecskék olyan polipeptidet hordoznak, amely egy epitópot mutat be.
Az EP-A-243 913 számú dokumentum a HBV pre-S kódoló régióját, valamint a pre-S régió vakcinákban történő alkalmazását ismerteti.
A T/52556 számon nyilvánosságra hozott magyar szabadalmi bejelentés HBV pre-S2 protein élesztőben történő kifejezésére szolgáló eljárást ismertet.
A szakirodalomból ismert, hogy a HBV-vel krónikusan fertőzött csimpánzok nem gyógyíthatók sem
HBsAg-vel végzett kezeléssel (tetanusz toxoidhoz kapcsolva), sem anti-HBs antitestekkel végzett kezeléssel. Továbbá, megpróbálták azt is, hogy HBV-vel krónikusan fertőzött betegeket S peptidek beadásával immunizáljanak. Ez a kezelés még anti-HBs antitestek képződését sem eredményezte ezekben a személyekben.
Emellett a Hepatitis B vírus krónikus hordozóit - a meghatározás szerint - az jellemzi, hogy a HBsAg kimutatható a szérumukban. Ennélfogva, előre nem volt látható az, hogy egy kombináció, amely a virális S peptid T-sejteket aktiváló epitópját tartalmazza a találmány szerint, képes immunizálást indukálni Hepatitis B vírus krónikus hordozóiban, és ezzel a végső gyógyulásukat előidézni.
A fentiekben megtárgyalt szakirodalmi helyzetet figyelembe véve a találmány célja egy hatékony terápiás ágens kidolgozása a virális krónikus hepatikus betegségek kezelésére, amely teljes reakciót eredményez (azaz a HBV replikáció kitartó gátlását, a HBV DNS és DNSpolimeráz elvesztését, és a HBeAg, valamint a HBsAg csökkenését és végezetül az eltűnését a betegek szérumából).
A találmány szerinti célkitűzést úgy lehet elérni, hogy olyan, krónikus vírusos hepatitis kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményeket állítunk elő, amelyek - farmakológiailag elfogadható hígító-, hordozó- és/vagy egyéb segédanyagok mellett - hatóanyagként a következő komponensek kombinációját tartalmazzák:
a) legalább egy, valamely hepatitis vírus egy vagy több antigén T-sejtaktiváló epitópját tartalmazó polipeptid-szekvencia, valamint
b) egy olyan hordozó, amely képes az a) epitópszekvenciá(ka)t bemutatni, és az a) polipeptid-szekvencia(ák) kovalens vagy hidrofób kötéssel kapcsolódik(nak) a b) hordozóhoz.
A találmány értelmében a polipeptid-szekvencia lehet egy polipeptid, illetve a Hepatitis B vírus bármely altípusa két vagy több polipeptidjének a kombinációja, különösen az adw, adr és az ady. Ezek a Hepatitis B vírusból származó polipeptidek lehetnek a preSl, preS2 vagy S HBV peptidek, illetve a HBV magantigén.
Az a) pontban említett, hasznos polipeptid-szekvenciák lehetnek az előzőekben említett polipeptidek kombinációi, illetve egy vagy több olyan polipeptid kombinációi, amelyeket i) tetszőleges deléciókkal ii) egy vagy több aminosav helyettesítésével, iíí) egy aminosav-szekvenciának az N-terminálison, a C-terminálison vagy inszercióként történő hozzáadásával módosítottunk, és a módosítás során egy legalább hat egymás utáni aminosavat tartalmazó epitópot megtartunk.
Az a) polipeptid-szekvencia előnyösen mirisztilezve van.
Abból a célból, hogy a megfelelő farmakológiai aktivitást kapjuk, szükséges, hogy a találmány szerinti kombinációban az a) polipeptid-szekvencia egy b) hordozóhoz kötve forduljon elő. Ez a hordozó egy olyan anyagot tartalmaz, amely például hidrofób polimer részecskéket, szervetlen részecskéket vagy poliszacharid részecskéket tartalmaz. A b) hordozó előnyösen egy második polipeptid-szekvencia, amely a szekréció so3
HU 216 301 Β rán részecskéket képez, amely részecskéknek előnyösen legalább 10 nm az átmérőjük.
Előnyös, ha a b) részecskeképző polipeptid-szekvencia egy polipeptid komplett aminosav-szekvenciájának a lényeges részét képezi, amely polipeptid lehet a HBV S peptidje, a HBV magantigénje, a HAV mag-antigénje, a HAV felületi antigénje, a HÍV felületi antigénje és a HÍV mag-antigénje, valamint a gyermekbénulás vírus felületi antigénje. A b) részecsekeképző antigén előnyösen a HBV S peptid és/vagy a magpeptid.
Ha az előzőekben említett polipeptideket hordozószekvenciákként alkalmazzuk, akkor ezek módosíthatók i) tetszőleges deléciókkal, ii) egy vagy több aminosav helyettesítésével, iii) egy aminosav-szekvenciának az Nterminálison, a C-terminálison vagy inszercióként történő hozzáadásával, azzal a feltétellel, hogy a módosítás során a részecskeképző képességet megtartjuk. A b) polipeptid-szekvencia előnyösen mirisztilezve van.
Ha a b) hordozó egy polipeptid-szekvencia, akkor az a) és b) szekvenciákat az alábbi kölcsönhatások közül egynek vagy többnek az alkalmazásával kapcsolhatjuk össze: hidrofób lehorgonyzás (a mirisztilsav segítségével), diszulfid-híd képzése, illetve a két szekvenciát egy peptidkötéssel kapcsolhatjuk össze, ezzel egy fúziós peptidet hozva létre. Az utóbbi esetben adott esetben egy térköz-szekvenciát illeszthetünk az a) és b) polipeptid-szekvenciák közé, amely térköz-szekvencia a két polipeptidhez peptidkötések révén kapcsolódik.
Az a) és b) polipeptid olyan rekombináns DNS-molekuláról expresszáltatható, amely a polipeptidek kombinációját kódolja. A DNS-molekula egy gazdasejtben expresszáltatható. Ez a gazdasejt lehet emlőssejt, élesztő vagy baktériumsejt. A találmány szempontjából előnyös, ha ez a sejt nem termel semmilyen humán szérumfehérjét vagy főemlős szérumfehérjét, csak azokat a polipeptide(ke)t, amelyek az előzőekben említett kombinációban megtalálható(k).
A „HBV S peptid” kifejezés jelentése a továbbiakban olyan peptid, amelyet a teljes HBV genom kódol. A „HBV pre-S2 peptid” kifejezés jelentése a továbbiakban olyan peptid, melyet a HBV genom teljes pre-S2 és S régiója kódol. A „HBV pre-Sl peptid” jelentése a továbbiakban olyan polipeptid, amelyet a HBV genom teljes pre-Sl, pre-S2 és S régiója kódol. Az „epitóp” kifejezés jelentése a továbbiakban legalább hat egymást követő aminosavra vonatkozik, amelyet a jelzett genomrégió kódol (például egy „HBV pre-S2 epitóp” egy olyan, legalább hat aminosavból álló szekvenciára vonatkozik, amelyet a HBV genom pre-S2 régiója kódol). A „T-sejt epitóp” kifejezés jelentése a továbbiakban olyan epitópra vonatkozik, amely a T-sejteken található receptorokkal lép kölcsönhatásba, hogy ezzel fokozza, vagy más módon befolyásolja az immunválaszt.
Az „antigenicitás” kifejezés a továbbiakban azt a képességet jelenti, hogy képes immunválaszt kiváltani (azaz képes antigénként működni), képes antitestek termelését kiváltani (azaz képes antigénként működni) és/vagy képes kölcsönhatásba lépni egy sejtfelszíni receptorral, hogy ezzel fokozza az immunválaszt, illetve az antitestek termelődését.
A „HBV” kifejezés jelentése a vírus bármely altípusa, de főleg az adw, ayw, adr és ayr, amelyek leírása megtalálható a szakirodalomban [P. Valenzuela, Natúré, 280, 815 (1979); Gerlich, EP-A-85111361, Neurath, EP-A-85-102-250]. Az említett szakirodalmakban szereplő peptid-szekvenciákra vonatkozó példákat, amelyek tartalmazzák az a) polipeptid-szekvenciákat, és amelyek befolyásolják egy vagy több epitóp antigenicitását, a szekvencialisták között mutatjuk be (SEQ ID NO. 17-20,22).
A találmány szerinti előnyös megvalósítási módoknak az alábbi kombinációk felelnek meg:
- a pre-Sl-, pre-S2 és/vagy magpeptidek specifikus epitópjaival (determinánsok) rendelkező HB Santigén részecskék;
- a pre-Sl-, pre-S2, S-peptid és/vagy magpeptidek specifikus epitópjaival (determinánsok) rendelkező HB mag-antigén részecskék;
- a Hepatitis B S-, pre-Sl-, pre-S2- és/vagy magpeptidjeinek specifikus epitópjaival (determinánsok) rendelkező Hepatitis A antigén részecskék.
A találmány szerinti előnyös rekombináns DNS-molekulákat az a) polipeptid-szekvenciá(ka)t kódoló szekvenciák jelenléte jellemzi, amely polipeptid-szekvenciák befolyásolják egy vagy több T-sejt epitóp antigenicitását, valamint a b) polipeptid-szekvenciákat kódoló szekvenciák jelenléte jellemzi, amely a szekréció során 10 nm vagy annál nagyobb átmérőjű részecskéket hoz létre, és mind a két DNS-szekvencia egy alkalmas promoter szabályozása alatt áll. Az a)-t kódoló szekvencia lehet például bármely, a listában szereplő 1. és 24. közötti számú szekvencia. A b) polipeptid-szekvenciát kódoló DNS-szekvencia lehet például a szekvencialistában szereplő 25-27-es számú szekvencia.
A 24 szekvencia bármelyikét (1 és 24 közötti számú szekvencia) kombinálhatjuk bármelyik, a szekvencialistában 25-27-es számon szereplő szekvenciával, amelybe mind az a-b, mind a b-a elrendezések beleértendők.
A találmány egy különös előnyös megvalósítási módja szerint a 28. számú epitóp-szekvenciát (amely megfelel a HBV SÍ szekvencia 9-28. aminosavának) kombináljuk a 26. és/vagy 27. szekvenciával, mint részecskeformáló elemmel.
A találmány szerinti rekombináns DNS-konstrukciókban alkalmazott Hepatitis B vírus szekvenciákat bármely ismert módon elkészíthetjük, beleértve a restrikciós fragmensek izolálását és ligálását, oligonukleotidok kémiai szintézisét egy szintetizátor felhasználásával [Cyclon, Bio-Search], valamint a PCR módszerrel való szintézisét [T. J. White, N. Amiéin, Η. E. Erlich, The Polymerase Chain Reaction, Technical Focus 5 (6) (1989)].
Az előnyös rekombináns DNS-molekulákat úgy állítjuk elő, hogy szintetikus oligonukleotidokat Egálunk a HBV-genom S régiójából származó 5’XbaI-BglII3’ fragmenshez (27. számú szekvencia), amely egy BglIIBglII HBV ffagmensből származik, amely a teljes preSl-pre-S2-S-régiót tartalmazza, illetve a teljes S régióhoz Egáljuk a szintetikus oligonukleotidokat. Az ilyen konstrukciók készítésében használt oligonukleotidokat az alábbi, I. táblázatban foglaljuk össze.
HU 216 301 Β
I. táblázat
Funkció Definíció Szekvencia száma
mag (adw) aa* 59-87 6
mag (adw) aa 2-28 7
mag (adw) aa -10-28 8
mag (adw) aa 29-58 9
mag (adw) aa 1-87 10
mag (adw) aa -10-87 11
mag (adw) aa 70-110 12
mag (adw) aa 80-125 13
mag (adw) aa 88-120 15
SÍ (ayw) aa 9-28 17
SÍ (ayw) aa 83-103 18
SÍ (ayw) aa 20-40 19
SÍ (ayw) aa 59-94 20
SÍ (ayw) aa 94-114 21
SÍ (ayw) aa 70-105 22
SÍ (ayw) aa 2-21 23
SÍ (ayw) aa 14-33 24
*aa=aminosav
Más előnyös DNS-molekulákat PCR módszerrel készített, T-sejt epitópokat kódoló magszekvenciák HBV magszekvenciához (25. számú szekvencia) történő ligálásával állítunk elő, amely b) polipeptidként működik. Az ezeknek a konstrukcióknak a készítésében használt oligonukleotidokat a II -1. táblázatban adjuk meg.
II-1. táblázat
Funkció Definíció Szekvencia száma
mag komplett, 1901-2500 bp 1
mag C-terminális deléció, 2
1901-2405 bp mag C-terminális deléció és stop kodon beillesztés 1901-2405 mag/premag 10 así premag, C-terminális deléció, 1871-2405 bp mag/premag 10 as. premag, C-terminális deléció és stop kodon beillesztés 1871-2405 bp
mag as. (-10-120) 16
mag/premag 10 as. premag, komplett mag 35
1871-2500 bp
*aa=aminosav
A II—2. táblázatban néhány olyan példát mutatunk be, amelyekben a T-sejt epitópot kódoló DNS-szekvenciákat a HBV genom restrikciós emésztésével izoláltuk, és a fentiekben meghatározott b) polipeptid-szekvenciát kódoló DNS-szekvenciához ligáltuk.
HU 216 301 Β
II—2. táblázat Definíció
Funkció
Szekvencia száma
mag/premag komplett, 1403-31 bp •k-k
S2 ay/ad **
S2 (K) ay/ad S2-S- 7 kodon deléciő, az ATG startkodon ATA-ra változtatva 14
** A szekvenciákat Galibert, F. és munkatársai [Natúré, 281. 646-650 (1979)], valamint Ono, Y. és munkatársai közölték [Nucleic Acids Research,
11(6), 1747-1757 (1983)].
A II—3. táblázatban a specifikus rekombináns szolgáló eljárásokat a példák között részletesen megDNS-molekulákat soroljuk fel. Az előállításukra 20 adjuk.
II-3. táblázat
VégsS konstrukció T-sejt epitop Részecskeformáló Szelekciós gén
MT-mag (-10-120) +SAg + neo core(as-10-12 0) S adw/ayw vagy S/Xbal/BglII neo
MT-S1 (as 9-28) —S + egpt SÍ (as 9-28)ay S adw/ayw vagy S/Xbal/BglII egpt#
MT-mag-neo mag/premag 1403-31 bp mag adw neo
MT-mag (1-87) + HBsAg - neo mag (as 1-87) S adw/ayw vagy S/Xbal/BglII neo
# egpt = Escherichia coli xantin-guanin-foszforibozil-£ranszferáz
Az előnyös DNS-molekulák az a) és b) polipeptidet kódoló régiók mellett további, szelekciós markert kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak. Ezenkívül tartalmazzák az összes, az expresszióhoz szükséges lényeges elemet, azaz a promoter-szekvenciát, startkodont és egy poliadenilezési szignált.
Alkalmas promoter lehet például a metallotionein (MT), az U2 és a H2K promoter, ha gazdasejtként emlőssejteket használunk. Ha élesztő- vagy baktériumsejteket használunk, akkor a megfelelő élesztő- és baktériumpromotereket, azaz a GCN4- és a GÁL 1/10 promotert, illetve a prokarióta trp- és tac-promotert lehet használni.
Ahhoz, hogy a találmány szerinti a) és b) polipeptidek kombinációját előállítsuk, a rekombináns molekulát gazdasejtekbe juttatjuk be transzfekcióval (emlőssejtek esetében), illetve transzformációval (élesztőés baktériumsejtek esetében), illetve más eszközök alkalmazásával. Gazdasejtként bármely szervezet hasz45 nálható, amely képes a rekombináns DNS-molekulát átírni és lefordítani, azaz emlős-, baktérium- és élesztősejtek.
Alkalmas emlőssejtek lehetnek például a VERO-sejtek (majomvese sejtvonal), 3T3-, C127- és L-sejtek (rág50 csáló fibroblaszt sejtvonalak), valamint CHO (aranyhörcsög-petefészek) sejtek, amelyek a dihidrofolát-reduktázra nézve vagy pozitívak, vagy negatívak.
A találmány egy specifikus megvalósítási módja szerint lehetséges továbbá, hogy az előzőekben megha55 tározott első DNS-szekvencia, illetve az előzőekben meghatározott második DNS-szekvencia, amelyek az a), illetve a b) polipeptid-szekvenciá(ka)t kódolják, különböző rekombináns DNS-molekulán találhatók, amely esetben a gazdasejteket a két rekombináns DNS60 molekulával kontranszfektáljuk.
HU 216 301 B
1--- ! <*> τ—- 1 1 Λ 1
1 ι α 1 Ο Ό ϋ
I Ν 'β I 00 Φ
ι ο Ρ | β a u
ι ·Ρ >ι ω
! Β Ρ ι C ο Ν
< MD ffl lehetséges összetétel-változatok a T-sejt epitopokat tartalmazó részecskékre, amelyekkel a krónikus Hepatitisz hordozókat célozzuk meg
'φ 1 Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ
θ' 1 α 04 α 04 04 0« 04 04 α α
φ 1 ο» Οΐ Οΐ Οι θ' 0ΐ θ' 0» σι θ'
Ρ η 1 ·*». \ \ ''s.
φ Ό | 0 0 ο 0 0 0 Ο ο ο 0
Ν Ή φ φ φ φ φ φ Φ φ φ φ
0) Ο 1 | c β β C β β β β c α
Η Μ Η H
Φ Η Ρ Ρ Ρ
Λ! Ό | «Μ» W Ρ W Ρ ÜJ Ρ W Ρ
α Ρ 3 3 3 3 3 θ' 3 θ' 3 θ' 3 θ'
ο Μΰ 1 Ό Ό Ό Ό Ό Ό η S η π >ι ο ίο S C0 ο S η
φ ε 1 β β β β β β φ β Φ β φ β -χ. Φ β
Μ ρ 1 «·— >«—' ’W» «—« -ο >>. η ·ηχ Η τη Ρ τη Ρ
(0 0 I Ο> Ο» Οι θ' Οι θ' ρ 3 β Ρ 3 β ρ 3 β Ρ 3 β
'Φ Μ-4 I β β β β β β Φ Ό Λ Φ Ό Λ Φ Ό χ> Φ Ό Δ
Ρί X X X X X X Ρ β Μ Ρ β X Ρ β X Ρ β X
»·»»
W W w W
β 'Φ
Ü .Ω rp β Ή σ> ω & ι σι β <*> 2 ε ο S I Φ Ρ
I Ό 0. •
·· »Ρ 04 ·« l—t
ι Ή Ρ Ο X) Ρ 04 Ρ
! :3 :3 χφ :3 04 β
04 X 04 X Ρ ΐΛ χ η Ρ Λ a β 04 ► 04
0 1 Ρ Λ Ρ φ ο Ρ Ρ β Ρ 0 *β X)
Ρ | Ό Μϋ Ό Ό Ρ ► m θ' 0ι Ο 04 Ο» Ρ τη
•Ρ ι β Ο β ΟΙ C %β \β ο β β •Η 04 β Q Ό 10
04 ι ο η β τη ε ε Ρ * X) ε + •Ρ Ο
Φ θ' ΙΛ Ο» Ρ Ρ θ' Ρ Ό 04 Λβ Ρ 1 Φ 0 «ί
X 1 β ΟΙ β Ρ Ο β ε Ρ φ φ β β ιθ φ Ρ Μΰ 04
Ρ ϋ ι ε ι ε «ο σι ε ρ Ü Ρ Ρ Ρ Ρ > Ο Ρ Ρ Ρ 1
τη 04 ι ι β Ρ 1 Φ MJ) Ο 04 S 04 Ε \β β· 04 *β φ Ρ
Φ I Φ Ο φ Ρ a Φ Ρ ι-1 σι ο Ρ τη οι β Ό
Ο ι Μ σι ρ ε Ρ Ρ 1 Φ Ρ η Ρ Q Φ Ό α ρ C0
04 Ρ 04 Ρ 04 04 U Ό < ιφ χφ Ρ Ρ Ρ Μΰ Ε Ρ Ρ
Η 1 · φ Ρ Ο Ο· Ρ «ΰ
1 θ' Ρ 01 Ρ «“1 θ' β 04 0ι Οι ·* \φ C0 θ' Φ β a
1 β 04 β 1 β β β β X -ι Ρ β Ρ ο» Ρ
1 % X ο > X X X Ο Φ X 1 Ρ 04
I \β Ρ Ό υ Ν
1 ι β τη α
ο»
C0 ιη
X ο
ΟΙ
I
ΟΙ +
c0 ιη ι
σχ οι
X <Ν
Μ
V
Ρ ε
ο ρ
λ
Οι β X 0» β X 0ΐ β X θ' β X
οι 04 ΟΙ 04 οι οι οι οι 04 οι
Ο Ο Ο Ö Ο □ Ο Ο & Ο
''χ \ ’***. --S ’-s.
οι οι οι 04 οι οι οι οι ΟΙ οι
X X X X X X X X X X
*>. **S. \ 'χ *«>,
ε* Η Η Η Η Η £-» Η
X X X X X X X X X X
0
to ρ η η ο* c Μφ ο > 44
0) β I ο» β
ε
I
X
HU 216 301 B m ι « N vttí ra 4-» —I '«4 A P
A* 0 1 •ö Λ4
Ö> ’O Φ
«0 X M
>1 φ
C tt N
< MD O
XD 1 P P P p P P P P XI P P
cn 1 CM CM CM CM CM CM CM CM CM Λ CM
V 1 θ' cn Ο» θ' & 0» σ> Ο» θ' 0 σ'
r-4 a 1 •x. •Χχ, Χχχ, ·*«*, \ *Χχ **X *χχ \ ·*>»
Φ Ό I 0 0 0 0 O 0 0 0 O 0 0
N •rl 1 0) φ Φ Φ Φ Φ φ Φ Φ Φ φ
Ül o 1 G c G G G G c G c G G
1 H H hí H H w hí Hl Hl w Hí
φ 1 H K Hl M K K Hl Hl Hl 1-4 Hl
'0 ( w r-l Ül H ül r-4 W ι—1 W r-l ül r-4 Ül r4 ül r4 ül r4 Ül r-l ül r-4
a r4 I 5 θ' 3 Ο» 3 0» 3 θ' 3 cn 3 σ» 3 σ 3 σ* 3 θ' 3 θ' 3 σ'
u vtí 1 0) S m o S CQ o >1 CQ (0 ca a X CQ (0 X n n s n » X CQ a S CQ CQ X CQ 01 >1 CQ
Φ 6 1 Φ tg o <0 Φ rd \ Φ a Φ ni ~-χ Φ <0 Χχ. Φ rö -x Φ Φ Φ <e \ <D c0 \ Φ r0 “Χχ.
N w 1 •m \ Hí -r> hí -n Χχ„ Hl •n X hí •o H •fi w f> H •r> **x Hl •n -χ H -r-> X K ·Γ> \ Hl
a 0 r-4 3 <0 r-4 Φ r-4 3 <e f-4 3 (β >-4 3 <0 r4 3 Φ r4 3 <0 r4 3 Φ r-l 3 (0 r-4 3 <0 -4 3 <0
xu ή 1 Φ •σ XI Φ •o Δ Φ Ό -Q Φ Ό Φ Ό Λ Φ •ö Λ Φ Ό Λ Φ Ό Λ W Ό P Φ TJ Λ Φ Ό P
tó P <0 X P tű X P Φ X X» «0 X X» cd X XI rd X P «0 X Ρ <0 X x> <d X P <0 X P <0 X
-x x. *Χχ Χχ χχ. χ. —x —x —x
1 w Ül Ül ül Ül ül Ül Ül ül ül ül
III. táblázat (folytatás) &
O
P ••4
0« tó Φ u 0« P •ΓΊ Φ a ι
H
O
Ol rl σ» + <0 I x o rí
I
X
t r- o O
1 1 Γ- ΙΛ o o co CO r4
I ΟΟ CM <N OJ J n 1 1 1
1 XX + r4 r-4 r-4 04 1 m o σ»
z t Γ- l X σ» a — 04 in «-*
X 1 ΟΟ ο o o G0 X X X X X X X X X
ül 1 ι—ί Γ» 00 co X 0 10 — (0 40 —* (0
r4 o H 1 1 | I ««F
1 2 X X X «-4 t-4 t-4 r4 r-4
í í ül CO ül w CO
σ' σ' θ' θ' σ' 0
(0 (0 (0 10 (0 10
ni s S X X X X
P
Φ 04 οι 04 04 04 04 04 ΟΙ 04 ΟΙ ΟΙ
P 0 0 0 ο 0 Ρ □ 0 0 Ρ 0
0 -*», -Χχ, 'χ. —X» ·*Χ» S. *Χχ -Χχ χ>χ
s 04 04 04 04 OJ 04 04 04 04 04 04
0 X 3! X S X κ X X X X 2
)4 *Χχ. Χχ, Χχ. *Χχ. *Χχ -Χχ *Χχ
CM 1 F4 Ε4 Η Η Η Η Η Η Η Η Η
1 s Γ- S X X X X X X 2 X 2
1 GO 1 0 σ' -¾ Ü1
r-4 φ (0 Ο ι-4 1
w G ε 04 0 Ü1 «-Χ
1 σ» γ4 0) 1 00
(0 θ' Η + G Η m
>0 U ε < X 1 X 2 ι Ρ
<0 CQ ι η Ο σ* σν CM
O G r4 Η η 04 <Ώ ιη νθ Γ* Η ω 0 σ' ο γ4
'Φ 0 r4 X X τ-4 r4 r-l »-4 γ4 »-4 Ü1 Η X <υ rí 04 04
X ± 4-
HU 216 301 B m ( n N XÖ ra •d \d H P
c » P P 44 44 P 44 P
XV 1 0« a a a a a a
44 Ο» O> σι oi Oi o· σ* Oi
Ű) i
rd a 0 0 0 0 0 0 0
0) < 1 Φ <v Φ φ Φ φ Φ
H *d 1 c c C c c c c
1 H H
I K rd hd K 3
Φ 1 w rd w θ' CQ H CQ K *0
44 Ό 3 0» 3 (8 3 3 rd 3 rd ti
ö) rd ! O >i CQ 01 •d Ό (0 >i Oi co S Oi «S.
υ Mti 1 Φ ti Φ ti ►d ti Φ ti CQ Φ ti CQ 3
Φ 6 I -Γ-» \ H •m ''s* gj •n -s. -ΓΊ >.
N M 1 rd 2 ti id ű Oi rd 3 w rd 3 H ti
W 0 Φ Ό A Φ Ό >< ti Φ Ό ti Φ Ό ti
XV Md 44 ti x 44 ti ε 4> ti XI 44 ti 43 CQ
Z w X X
1 w •«S. \
1 CQ CQ
III. táblázat (folytatás)
3 X
>1
ti 7
Cd cd
CQ CQ
a o
P •d a (A φ u a P •n Ql ffi I ω
d
B rd ti
Λ4
H ti· in
rd o 00 rd m ti
rd rd Cd Cd n r4 Φ
z ti· o öl cd ti· Jd P
X σ> >» r» >1 fd >t rd >» Φ 0
CQ Z ti Z ti Z ti Z ti z ti P g
'T' ** a tat 0
rd 1 rd 1 rd ín 1 cd <0 Ό P
CQ CQ CQ CQ CQ X 0*
4J
rd 44 +4
M Cd cd cd cd cd cd Cd Φ ti
Φ p P p P p P P íÖ -P
44 Ss, *«««. ~'Sx Ό xö
0 Cd cd Cd cd <d Cd Cd p-d pd Ό
B Z S S a a a a XD g rd
0 \ ιφ
U E-< Eh Ed Ed Ej Ed 04 Φ
a Z Z Z Z Z Z Z 04
• >1
r> rd (0
Φ
Ό g Ό
W k in
r* • χσ xö XÖ
to 44 i-“l Λ rd
0 a
Öi c ín fO ti· m V0 c* 00
XV 0 1 Cd Cd Cd Cd Cd cd cd ·· ·*
> M
HU 216 301 Β
AIII. táblázatban egy áttekintést kapunk arról, hogy a megfelelő DNS-szekvenciákat miként kombinálhatjuk. Meg kell jegyeznünk, hogy bármelyik, az ebben a táblázatban jelzett komponens kombinálható, hogy egy olyan DNS-szekvenciát kapjunk, amelyet, ha egy gazdasejtbe transzfektálunk, akkor egy olyan kombinációt kapunk, amely az a) és b) polipeptide(ke)t tartalmazza, és ez a kombináció krónikus virális hepatitis kezelésében gyógyszerként használható. A T-sejt epitóp-szekvenciákat vagy szintetikusan (SYN) állítottuk elő egy Biosearch Cyclon szintetizátorral, vagy PCR módszerrel (PCR), vagy a virális genom restrikciós enzimes fragmentálásával (GENE).
A krónikus virális hepatitisben szenvedő betegek kezelésére az a) polipeptid-szekvencia és a b) hordozó kombinációját bármely típusú gyógyászati készítménynek megfelelően formulázhatjuk, amely emellett tartalmaz egy megfelelő vivőanyagot vagy gyógyászati hordozót, például pufferoldatot.
A beadást végezhetjük bármely ismert módszerrel, azaz parenterálisan (például intravénásán vagy intramuszkulárisan), orálisan (például typhoid baktériumsejteket alkalmazva az aktív adalékanyag kapszulázására).
A gyógyászati készítmény az előzőekben említett kombinációkat megfelelő koncentrációban tartalmazza ahhoz, hogy a beadással választ váltsunk ki.
Az alábbiakban megadjuk a mellékletben csatolt ábrák leírását.
I. ábra egy olyan DNS-konstrukciót mutat, amely egy promotert, egy részecskeképző szekvenciát és egy szelekciós gént kódol (a 3/4 példában van leírva).
II. ábra egy olyan DNS-génkonstrukciót mutat, amely egy promotert és egy epitópot tartalmaz a teljes HB-S-Ag-vel, valamint egy szelekciós gént (a 3/18-as példában van leírva).
III. ábra egy olyan DNS-konstrukciót mutat, amelyben egy promoter, valamint egy T-sejt epitóp található egy részecskeképző maradékkal és egy szelekciós génnel (a 3/21-es példában leírva).
IV. ábra az I-es csimpánz AST értékeit mutatja a
Hepa-Care kezelés során (a 10/1-es példában van leírva).
V. ábra az I-es csimpánz antigén értékeit mutatja a
Hepa-Care kezelés során (a 10/1-es példában van leírva).
VI. ábra a háromszor Hepa-Care-rel booster kezelt
I-es csimpánz ALT és GGT májenzimeinek értékeit mutatja (a 10/2-es példában van leírva).
VII. ábra a háromszor Hepa-Care-rel booster kezelt
ΙΙ-es csimpánz ALT és GGT májenzimeinek értékeit mutatja (a 10/3-as példában van leírva).
VIII. ábra egy kezeletlen kontroll csimpánznál meghatározott májenzimeket mutatja (a 10/3-as példában van leírva).
IX. és X. ábra az első beteg antigén és antitest titerét mutatja a Hepa-Care kezelés során (all. példában van leírva).
XI. és XII. ábra a második beteg antigén és antitest titerét mutatja a Hepa-Care kezelés során (a 11. példában van leírva).
XIII. és XIV. ábra a harmadik beteg antigén és antitest titerét mutatja a Hepa-Care kezelés során (a 11. példában van leírva).
A találmányt közelebbről az alábbi példákon keresztül mutatjuk be.
1. példa
1. Frakciónak kicsapás polietilén-glikollal (PEG)
A HBV fehérjét termelő tenyészetek felülúszóit összegyűjtjük, majd 2400 ml-es részekre osztjuk. Mindegyik részhez 144 g PEG6000-et adunk (SERVA), majd szobahőmérsékleten kevertetve 20 perc alatt feloldjuk, majd további hat óra hosszat kevertetjük 4 °C-on. A csapadékot centrilügálással elválasztjuk GS 3 rotorban, 500 ml-es palackokban (9000/perc, 15000xg, 30 perc, 10 °C). A felülúszót összegyűjtjük és 144 g PEG6000-et adunk hozzá, majd a fentiekben leírt módon feloldjuk. Az oldatot 3 óra hosszat kevertetjük 4 °C-on. Az ebből az oldatból származó csapadékot a fentiekben leírt módon kinyerjük, azzal a különbséggel, hogy a centrifügálást 60 percig folytatjuk.
2. Gélkromatográfia
A PEG-es kicsapás után kapott anyagot 20 ml PBSben újra oldjuk, és A-5m tölteten (BioRad) gélkromatográfiának vetjük alá. Az oszlop mérete 25 χ 1000 mm, ágytérfogata 480 ml. Egy tipikus frakcionálás során 1000 pg PEG-gel kicsapott HBV fehérjét (10-15 ml térfogatban) viszünk fel az oszlopra, majd PBS-sel eluáljuk 6 csepp/perc (18 ml/ó) sebességgel. 3 ml-es frakciókat szedünk. A HBV fehérje az első csúcsban jön le. Az összegyűjtött frakciókat CsCl gradiensen tisztítjuk.
3. Ülepítés CsCl gradiensen
Körülbelül 30, az A-5m oszlopkromatográfia első csúcsából származó frakciót, amelyek előre tisztított HBV fehérjét tartalmaznak, összegyűjtünk, térfogata körülbelül 100 ml. Ennek az oldatnak a sűrűségét 1,30 g/cm3-re állítjuk CsCl-dal, majd egy SW 27/28 rotorba való poliallomer csőbe (Beckman) visszük át. A gradienst úgy állítjuk elő, hogy az oldat alá rétegzünk 4 ml 1,35 g/cm3 sűrűségű CsCl oldatot, föléje pedig 4 ml 1,25 g/cm3 sűrűségű oldatot, majd pedig 4 ml 1,20 g/cm3 sűrűségű oldatot. Ezt a gradienst 28000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk 50 óra hosszat 10 °C-on. Ezután a gradienst frakcionáljuk, és az 1,20 g/cm3-es sűrűségrétegen úszó tisztított HBV fehérjét összegyűjtjük. Az oldatot három dialízisciklusban zacskókban sómentesítjük vízzel szemben.
2. példa
A HBVfehérje mennyiségi meghatározása
1. Meghatározás radioimmunesszével
Az AUSRIA11-125 „szendvics” radíoimmunesszében (kereskedelmi forgalomban kapható az Abbottól) a Hepatitis B felületi antigénje elleni aranyhörcsög-anti10
HU 216 301 Β testekkel (Anti-HBs) borított gyöngyöket inkubálunk szérummal vagy plazmával vagy tisztított fehérjével és a megfelelő kontrollokkal. Minden jelen levő HBsAg a szilárd fázisban levő antitesthez kötődik. A megkötetlen anyag leszívása, majd a gyöngyök mosása után humán 125T-Anti-HBs-t hagyunk reagálni a gyöngyön levő antitest-antigén komplexszel. A gyöngyöket azután mossuk, a megkötetlen 125I-Anti-HBs eltávolítására.
)-Anti-Hbs HBsAg )-Anti-Hbs HBsAg i25i.Anti-HBs )-Anti-HBs HBsAg l25I-Anti-HBs
A gyöngyökön maradó radioaktivitást gamma szcintillációs számlálóval határozzuk meg.
2. Meghatározás ELISA-val
Az Enzygnost HBsAg mikro „szendvics” vizsgálatban (kereskedelmi forgalomban kapható a Behringtől) a mélyedéseket anti-HBsAg borítja. A mélyedésekhez szérumplazmát vagy tisztított fehérjét és a megfelelő kontrollokat adjuk, majd inkubáljuk. Mosás után peroxidázzal jelzett HBsAg elleni antitesteket reagáltatunk a megmaradt antigén determinánsokkal. A megkötetlen enzimhez kapcsolt antitesteket mosással eltávolítjuk, majd a szilárd fázison megmaradó enzimaktivitást meghatározzuk. A hidrogén-peroxid és a kromogén enzimesen katalizált reakcióját hígított kénsav hozzáadásával állítjuk le. A szín intenzitása arányos a mintában levő HBsAg koncentrációjával, a koncentrációt úgy kapjuk meg, hogy fotometriásan összehasonlítjuk az ismeretlen minták színintenzitását a negatív és a pozitív kontroll szérumok színintenzitásával.
3. példa
A találmány szerinti génkonstrukciók készítése, amelyekpromotert, a kiválasztott antigén-szekvenciákat és szelekciós gént tartalmaznak
1. Az MT-promoter izolálása
A pBPV-342-12 plazmidot (ATCC 37224) BglII és BamHI restrikciós enzimmel emésztjük. Három DNS-molekulát kapunk. A számunkra érdekes fragmens tartalmazza a metallotionein promotert és egy pBR322 szekvenciát, amely 4,5 kb méretű, és könnyen megkülönböztethető a többi fragmenstől (2,0 kb, illetve
7,6 kb).
A reakciót 200 μΐ-es össztérfogatú reakciópufferben hajtjuk végre, amelyben a DNS végkoncentrációja 0,5 pg/μΐ, és 100 egységet tartalmaz az egyes restrikciós enzimekből. Az emésztés teljes lejátszódását háromórás, 37 °C-on végzett inkubálás után vizsgáljuk meg agaróz gélelektroforézissel, 0,8%-os agarózgélben. A reakciót 4 μΐ 0,5 mol/1 EDTA hozzáadásával állítjuk le.
A 4,5 kb méretű fragmenst 1,2%-os preparatív gélen végzett gélelektroforézissel választjuk el a többi fragmenstől. A DNS-t kioldjuk a gélből egy DE-81 Whatman szűrőpapírra, amelyről a DNS-t magas sótartalmú pufferrel oldjuk le. A DNS-t fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extrahálva, majd két etanolos kicsapással tisztítjuk.
2. Egy 1,8 kb méretű, a HBV magantigént kódoló fragmens ligálása
Egy 1,8 kb méretű BamHI-BamHI fragmenst, amely a HBV-mag kódoló régiókat tartalmazza, HBVtartalmú DNS-ből izolálunk. Ezt a fragmenst ligáljunk egy 4,5 kb méretű fragmenssel, amely az MT-promotert és a pBR maradékot tartalmazza (leírása az 1. pontban).
Az 1,8 kb méretű fragmensből 2 μΐ-t keverünk 3 μΐ
4,5 kb méretű fragmenssel, majd 10 μΐ össztérfogatban Egáljuk, amely 2 egység T4-DNS ligázt és 2 mmol/1 ATP-t tartalmaz (14 °C, éjszakát át).
A ligáló elegyet 150 μΐ kompetens baktériumsejtszuszpenzióhoz adjuk, a DNS baktériumsejtekbe való juttatása céljából. A DNS felvétele után a baktériumsejteket LB agarlemezekre szélesztjük, amelyek 50 pg/ml ampicillint tartalmaznak, a szélesztett szuszpenzió térfogata lemezenként 50-300 μΐ. Az agarlemezeket egy éjszakán át inkubáljuk 37 °C-on. A különálló, izolált baktériumtelepeket átvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e a keresett fragmenst hordozó plazmidot.
3. A keresett plazmidot tartalmazó baktériumtelepek keresése
Különálló telepeket izolálunk steril fogpiszkálóval, majd LB-ampicillint tartalmazó csövekbe visszük át őket (5 ml). A csöveket egy éjszakán át inkubáljuk 37 °C-on, erős rázatás közben. Az egyes baktériumszuszpenziókból mini plazmidpreparátumokat készítünk. A kapott különböző DNS-eket megvizsgáljuk, BglII restrikciós enzimmel végzett emésztéssel. Két molekulát várunk, az egyik 400 bp, a másik 5,9 kb méretű. Az emésztést agaróz gélelektroforézissel végezzük. A plazmid DNS-t izoláljuk a baktériumsejtekből.
4. Neomicin szelekciós marker beépítése
A 3. pontban kapott plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel emésztve linearizáljuk. A reakciót 50 μΐ össztérfogatban végezzük, a végkoncentráció 1 pg/μΐ plazmid DNS. 50 egység EcoRI restrikciós enzimet adunk hozzá, majd az emésztés megtörténtét (3 órán át 37 °C-on végzett inkubálás után) agaróz gélelektroforézissel igazoljuk. A reakciót 1 μΐ 0,5 mol/1 EDTA hozzáadásával állítjuk le, majd a DNS-t 0,3 mol/1 végkoncentrációjú nátrium-acetáttal és 3-4-szeres térfogatú etanollal kicsapjuk (-80 °C, 30 perc). A kicsapott DNS-t 50 μΐ desztillált vízben oldjuk.
A linearizált plazmidból 2 μΐ-t 3 μΐ olyan DNS-fragmenssel keverünk össze, amely a metallotionein promotert és a neomicin szelekciós gént tartalmazza [izolálva a pMT-neo-E plazmidból (hozzáférhető az ATCC/ Exogene-nél) EcoRI restrikciós enzimmel végzett emésztéssel, egy 3,9 kb méretű fragmens formájában], majd Egáljuk őket. Egyedi telepeket izolálunk, és megvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e a keresett plazmidot.
5. Az U2 promoter-szekvenciát tartalmazó fragmens izolálása
A pUC-8-42 plazmidot (hozzáférhető az Exogene-nél) EcoRI és Apai restrikciós enzimmel emésztjük. Két DNS-molekula jön létre. A számunkra érdekes fragmens tartalmazza az U2 promotert, amelynek mérete 340 bp, és könnyen megkülönböztethető a másik fragmenstől (3160 bp). Az emésztést 200 μΐ össztérfogatú reakciópufferben végezzük, a DNS végkoncentrációja 0,5 pg/ml, és 100 egységet tartalmaz az egyes
HU 216 301 Β restrikciós enzimekből. Az emésztés teljes lejátszódását (három órán át 37 °C-on végzett emésztés után) agaróz gélelektroforézíssel ellenőrizzük, 0,7%-os agarózgélben. A reakciót 4 μΐ 0,5 mol/1 EDTA hozzáadásával állítjuk le. A 340 bp méretű fragmenst a plazmid DNS-től preparatív agaróz gélelektroforézíssel választjuk el, 1,2%-os gélben. A DNS-t kioldjuk a gélből egy DE-81 Whatman szűrőpapírra, amelyről a DNS-t magas sótartalmú pufferrel oldjuk le. A DNS-t fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd két etanolos kicsapással tisztítjuk.
6. A promoter-szekvenciát tartalmazó fragmens beépítése egy polilinker plazmidba
A pSP165 plazmidot (kereskedelmi forgalomban hozzáférhető a Promega Biotec-nál), amely egy polilinker-szekvenciát tartalmaz (ebben az alábbi restrikciós hasítási helyek találhatók meg: EcoRI, SacI, Smal, Aval, BamHI, BglII, Sáli, PstI, HindlII) EcoRI restrikciós enzimmel linearizáljuk. A reakciót 50 μΐ végtérfogatban hajtjuk végre, 1 μg/μl plazmid DNS végkoncentráció mellett. 50 egység EcoRI restrikciós enzimet adunk hozzá, majd az emésztés megtörténtét (3 órán át 37 °C-on végzett inkubálás után) agaróz gélelektroforézissel ellenőrizzük. A reakciót 1 μΐ 0,5 mol/1 EDTA hozzáadásával állítjuk le, majd a DNS-t 0,3 mol/1 végkoncentrációjú nátrium-acetáttal és 3-4-szeres térfogatú etanollal kicsapjuk (-80 °C, 30 perc). A kicsapott DNS-t 50 μΐ desztillált vízben oldjuk.
μΐ plazmid DNS-t elegyítünk 10 μΐ fragmens DNS-sel, amely tartalmazza az U2 promoter-szekvenciát, majd 25 μΐ össztérfogatú ligáló pufferben ligáljuk a fragmenseket, amely 2 egység T4 DNS ligázt és 2 mmol/1 ATP-t tartalmaz (14 °C, egy éjszakán át). Ezután a DNS-t fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, etanollal kétszer kicsapjuk, végül 10 μΐ desztillált vízben oldjuk. A kapott tapadós EcoRI és Apai végeket tompa végekké kell konvertálni, és ligálni kell. A tapadós végeket tompa végekké Mung bean nukleázzal alakítjuk át, az alábbiak szerint: 25 μΐ DNShez (1 μg/μl koncentráció) reakcióelegyben 20 egység enzimet adunk, és annyi glicerint, hogy végkoncentrációja 1% legyen, a végső reakciótérfogat pedig 35 μΐ legyen. 30 percig 30 °C-on végzett inkubálás után a DNS-t fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk és etanollal kétszer kicsapjuk. A DNS-t ismét 5 μΐ desztillált vízben oldjuk. A kapott tompa végeket ligáljuk 15 μΐ reakcióelegyben, amely tízszer több T4 ligázt tartalmaz, mint amennyit az előzőekben használtunk, valamint 2 mmol/1 ATP-t (14 °C, éjszakán át). A ligáló elegyet 150 μΐ kompetens baktériumsejt-szuszpenzióhoz adjuk, a DNS baktériumsejtekbe való juttatása céljából. A DNS felvétele után a baktériumsejteket LB agarlemezekre szélesztjük, amelyek 50 pg/ml ampicillint tartalmaznak, a szélesztett szuszpenzió térfogata lemezenként 50-300 μΐ. Az agarlemezeket egy éjszakán át inkubáljuk 37 °C-on. A különálló, izolált baktériumtelepeket átvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e az U2 promoter fragmenst hordozó plazmidot. A kapott plazmidokat izoláljuk a baktériumsejtekből és restrikciós enzimes elemzéssel jellemezzük.
7. A 89. számú szintetikus DNS oligonukleotid (30. számú szekvencia) ligálása a 4,5 kb méretű MT-promoter fragmenssel
Az 1. pontban ismertetett 4,5 kb méretű fragmenst, amely az MT-promotert és egy pBR maradékot tartalmaz, a 89. számú szintetikus oligonukleotiddal (30. szekvencia) ligáljuk. A ligáló elegyet 150 μΐ kompetens baktériumsejt-szuszpenzióhoz adjuk, a DNS baktériumsejtekbe való juttatása céljából. Különálló baktériumtelepeket vizsgálunk át, hogy megtalálható-e bennük a keresett plazmid. Az új plazmid szerkezetét EcoRI és Xbal restrikciós enzimmel emésztve igazoljuk. Két molekulát várunk, az egyik mérete 2,0 kb, a másik mérete
2,6 kb.
8. A 101. számú szintetikus oligonukleotid (32. számú szekvencia) ligálása a 7. pontban közölt plazmiddal
A 7. pontban ismertetett plazmidot BglII és BamHI restrikciós enzimmel emésztjük, majd egy 13 nukleotidból álló fragmenst (az 1. pontban közöltük) eltávolítunk. A kapott fragmenst, amely az első 89. számú oligonukleotidot tartalmazza (30. szekvencia) a 101. számú oligonukleotiddal (32. szekvencia) ligáljuk, amely egy BglII-BamHI fragmens. A DNS felvétele után az egyedi sejteket megvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e a keresett plazmidot. Az új plazmid szerkezetét EcoRI és Xbal vagy EcoRI és BglII restrikciós enzimmel emésztve igazoljuk.
9. A 99. számú szintetikus DNS oligonukleotid (31. szekvencia) ligálása az 1. pontban ismertetett 4,5 kb méretű fragmenssel
A 4,5 kb méretű BglII-BamHI fragmenst a 99. számú DNS oligonukleotiddal (31. szekvencia) ligáljuk össze. Miután a különböző DNS-eket tartalmazó egyedi baktériumtelepeket átvizsgáltuk, a keresett plazmid szerkezetét EcoRI restrikciós enzimmel emésztve igazoljuk, mikor is két fragmenst kapunk, méretük 1,9 kb és 2,7 kb, illetve azon az alapon azonosítjuk, hogy a BglII vagy BamHI enzimekkel linearizálni tudjuk a plazmidot.
Az új plazmidot PstI és BamHI restrikciós enzimmel emésztjük. Két molekulát várunk, az egyik egy
2,6 kb méretű fragmens, amely egy pBR maradékot, az MT-promotert és az oligonukleotidot tartalmazza, valamint egy 2,0 kb méretű pBR maradékot tartalmaz. A 2,6 kb méretű fragmenst izoláljuk.
10. A 9. pontban ismertetett plazmid 2,6 kb méretű fragmensének ligálása egy, a 8. pontban ismertetett plazmid fragmensével
A 8. pontban ismertetett plazmidot, amely a 89. és 101. számú oligonukleotidokat (30. és 32. szekvencia) tartalmazza, PstI és BglII restrikciós enzimmel emésztjük. Két fragmenst várunk. Egy 2,5 kb méretű fragmenst, amely egy pBR csoportot és az MT-promotert tartalmazza, valamint egy 2,2 kb méretű fragmenst, amely egy pBR csoportot és mindkét oligonukleotidot tartalmazza.
Ezt a 2,2 kb méretű fragmenst a 2,6 kb méretű fragmenssel ligáljuk, amely a pBR maradékot, az MTpromotert és a 99. számú oligonukleotidot (31. szekvencia) tartalmazza, a 8. pontban ismertetettek szerint.
HU 216 301 Β
11. A 2,3 kb méretű HBV BglII—BglII fragmens ligálása
Egy 2,3 kb méretű BglII—BglII fragmenst, amely a pre-Sl, pre-S2 és S kódoló régiókat tartalmazza, a HBV-t tartalmazó DNS-ből izoláljuk. A 2,3 kb méretű fragmenst a 4,5 kb méretű fragmenssel Egáljuk (az 1. pontban ismertetettük az előállítását), amely a metallotionein promotert tartalmazza.
A 2,3 kb méretű fragmensből 2 μΐ-t elegyítünk 3 μΐ
4,5 kb fragmenssel, majd 10 μΐ össztérfogatú ligáló pufferben Egáljuk, amely 2 egység T4 DNS ligázt és 2 mmol/1 ATP-t tartalmaz (14 °C, egy éjszakán át).
A ligáié elegyet 150 μΐ kompetens baktériumsejtszuszpenzióhoz adjuk, a DNS baktériumsejtekbe való juttatása céljából. A DNS felvétele után a baktériumsejteket LB agarlemezekre szélesztjük, amelyek 50 pg/ml ampicillint tartalmaznak, a szélesztett szuszpenzió térfogata lemezenként 50-300 μΐ. Az agarlemezeket egy éjszakán át inkubáljuk 37 °C-on. A különálló, izolált baktériumtelepeket átvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e a keresett fragmenst hordozó plazmidot.
12. A HBV génszekvencia egy részének konverziója a HBV-mag epitópokkal
Az előző, 11. pontból származó plazmidot BglII és Xbal restrikciós enzimmel emésztjük. Két molekulát várunk, az egyiknek a mérete 550 bp, a másik mérete 6,25 kb, amelyet agaróz gélelektroforézis után izolálunk.
A 6,25 kb méretű fragmenst a 10. pontban ismertetett 270 bp méretű fragmenssel Egáljuk (BglII és Xbal emésztés, és az előzőkben ismertetett fragmens izolálás után), amely a HBV-mag gén egy epitóp részét kódolja.
A ligáló elegyet 150 μΐ kompetens baktériumsejtszuszpenzíóhoz adjuk, a DNS baktériumsejtekbe való juttatása céljából. A különálló, izolált baktériumtelepeket átvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e a keresett fragmenst hordozó plazmidot. Az új plazmid jelenlétét BamHI restrikciós enzimmel emésztve igazoljuk. Három molekulát várunk, egy 950 bp, egy 450 bp és egy 5150 bp méretű fragmenst.
13. Egy „hordozó” plazmid készítése
All. pontban ismertetett plazmidot EcoRI és Xbal restrikciós enzimmel emésztjük. Két molekulát várunk, az egyik egy 2450 bp méretű fragmens, a másik egy 4350 bp méretű fragmens, amelyet gélelektroforézis után izolálunk.
Ezt a 4350 bp méretű fragmenst Egáljuk a 39. számú DNS oligonukleotiddal (29. szekvencia), amely a HBV-S gén teljes szekvenciáját tartalmazza az ATG-től az Xbal helyig, amelyben az ATG-t ATA-ra változtattuk.
14. Mag-epitóp a teljes HBV-S gén előtt
Ezt a „hordozó” plazmidot PstI és Xbal restrikciós enzimmel emésztjük, két molekulát várunk, az egyik egy 600 bp méretű plazmidmaradék, a másik egy 3850 bp méretű fragmens, amelyet izolálunk, és a 10. pontban ismertetett plazmid PstI-Xbal restrikciós enzimekkel való emésztése után kapott 2800 (2700) bp méretű fragmenssel Egálunk.
A keresett plazmid megkeresése után EcoRI és Xbal, EcoRI és BglII és BamHI restrikciós enzimekkel végzett emésztéssel igazoljuk a szerkezetét.
15. Egy szelekciós marker beépítése
A 14. pontban ismertetett plazmidot EcoRI restrikciós enzimes emésztéssel linearizáljuk. A reakciót 50 μΐ össztérfogatban és 1 pg/μΐ plazmid DNS koncentráció mellett hajtjuk végre. 50 egység EcoRI restrikciós enzimet adunk az elegyhez, és az emésztés lejátszódását (3 óra, 37 °C-on végzett inkubálás után) agaróz gélelektroforézissel igazoljuk.
A reakciót 1 μΐ 0,5 mol/1 EDTA hozzáadásával állítjuk le, majd a DNS-t 0,3 mol/1 végkoncentrációjú nátrium-acetáttal és 3-4-szeres térfogatú etanollal kicsapjuk (-80 °C, 30 perc). A kicsapott DNS-t 50 μΐ desztillált vízben oldjuk.
A linearizált plazmidból 2 μΐ-t 3 μΐ DNS-fragmenssel elegyítünk, amely fragmens tartalmazza a metallotionein promotert és a 4. pontban ismertetett neomicin szelekciós gént, majd Egáljuk őket. Egyedi baktériumtelepeket vizsgálunk át, hogy tartalmazzák-e a keresett plazmidot, amelyet azután izolálunk, tisztítunk és jellemzünk.
A fentiekben ismertetett mindegyik génkonstrukciót előállíthatjuk az U2 promoterrel is, mikor is az MT-promotert tartalmazó DNS-fragmenst, EcoRI és BglII restrikciós enzimekkel végzett emésztés után egy olyan DNS-fragmenssel helyettesítjük, amely az U2 promotert tartalmazza, EcoRI és BglII restrikciós enzimekkel végzett emésztés után.
16. Az Escherichia coli xantin-guanin-foszforiboziltranszferáz (egpt) szelekciós gén izolálása
Az egpt szelekciós gént tartalmazó 1,8 kb méretű fragmenst a pMSG plazmid BamHI és BglII restrikciós enzimekkel végzett emésztése után izoláljuk, és egy
4,5 kb méretű, az 1. pontban ismertetett 4,5 kb méretű BglII-BamHI fragmenssel Egáljuk, amely az MTpromotert tartalmazza.
A keresett plazmidot megkeresése után izoláljuk, tisztítjuk, és véglegesítjük oly módon, hogy a BamHI hasítási helyet EcoRI hellyé alakítjuk.
17. A keresett DNS-szekvenciák izolálása PCR módszerrel
Egy DNS-fragmenst (400 bp) izolálunk gélelektroforézis után. Ezt PCR módszerrel állítjuk elő (leírását lásd az 5. példában), a 131. és 132. számú specifikus nukleotidok mint indítómolekulák felhasználásával (33. és 34. szekvencia).
A DNS-fragmenst BamHI és Xbal restrikciós enzimmel emésztjük, majd gélelektroforézissel tisztítjuk. Az izolált PCR fragmenst egy 6,25 kb méretű fragmenssel Egáljuk, amelyet a 13. pontban ismertetett plazmidból izoláltunk, BglII és Xbal restrikciós enzimekkel végzett emésztés után. Transzformálás után az egyedi baktériumtelepeket átvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e a keresett plazmidot.
18. Egy szelekciós marker beépítése
A 17. pontban ismertetett plazmid végső szerkezetét egy szelekciós génnek a plazmidba való építésével hozzuk létre (leírás a 15. pontban).
19. A H2K promoter izolálása
A H2K promotert egy 2 kb méretű EcoRI és egy BglII fragmens formájában izoláljuk a pSP65H2 plazmidból (kapható az Exopgene-tól).
HU 216 301 Β
20. A HBV génszekvencia egy részének konverziója
All. pontban keletkező plazmidot BglII és Xbal restrikciós enzimmel emésztjük. Két molekulát várunk, ezek közül az egyik egy 6,250 kb méretű fragmens, amelyet agaróz gélelektroforézis után izolálunk.
A 6,250 kb méretű fragmenst a 23. számú DNS oligonukleotiddal (28. számú szekvencia) Egáljuk. A ligáló elegyet 150 μΐ kompetens baktériumsejt-szuszpenzióhoz adjuk a DNS bejuttatása céljából. Az egyedi baktériumtelepeket átvizsgáljuk, hogy megtalálható-e bennük a keresett plazmid. Az új plazmid szerkezetét EcoRI és BglII restrikciós enzimmel végzett emésztéssel igazoljuk. Két molekulát várunk, az egyik 1,9 kb, a másik 4,450 kb méretű.
21. Egy egpt szelekciós marker beépítése
A 20. pontban ismertetett plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel linearizáljuk. A reakciót 100 μΐ össztérfogatban hajtjuk végre, 0,6 pg/μΐ plazmid DNS koncentráció mellett. 60 egység EcoRI-et adunk hozzá, és az emésztést agaróz gélelektroforézissel igazoljuk (3 óra, 37 °C). A reakciót 1 μΐ 0,5 mol/l EDTA hozzáadásával állítjuk le, majd a DNS-t 0,3 mol/l végkoncentrációjú nátrium-acetáttal és 3-4-szeres térfogatú etanollal kicsapjuk (-80 °C, 30 perc). A kicsapott DNS-t 50 μΐ desztillált vízben oldjuk.
A linearizált plazmidból 2 μΐ-t 3 μΐ DNS-fragmenssel elegyítünk, amely fragmens tartalmazza az egpt szelekciós gént, majd Egáljuk őket. Egyedi baktériumtelepeket vizsgálunk át, hogy tartalmazzák-e a keresett plazmidot. A III. táblázatban ismertetett génkonstrukciók ugyanazon az úton állíthatók elő, amint azt az előzőekben ismertettük.
4. példa
Emlőssejtek transzfekciója
Abból a célból, hogy a HBV peptidek jelentős mennyiségének szekrécióját elérjük, az emlőssejteket a találmány szerinti DNS-konstrukcióval kell transzfektálni. A kotranszfekciót vagy két lépésben hajtjuk végre (azaz az egyes konstrukciókat külön-külön transzfektáljuk) vagy egy lépésben (azaz egy transzfekciót végzünk a két konstrukciót tartalmazó készítmény felhasználásával). A kotranszfekció megtörténtét vagy úgy igazoljuk, hogy különböző szelekciós markereket használunk a két konstrukción, vagy úgy, hogy mindkét konstrukció expressziós termékének a szekrécióját igazoljuk immunesszével.
Egy másik módszer szerint egy, a találmány szerinti HBV peptid szekvenciát kódoló szekvenciát és egy másik szekvenciát, amely a teljes S vagy mag vagy HAV fehérjét kódolja, egyetlen konstrukcióban kombinálhatjuk.
5. példa
Polimeráz láncreakció (PCR)
A polimeráz láncreakció lehetővé teszi, hogy egy kiválasztott specifikus DNS nukleotid-szekvencia kiválasztott régióját in vitro körülmények között, több mint egy milliószorosan megsokszorozzuk [Thomas J. White, Norman Amleim, Henry A. Erlich: The polymerase chain reaction. Technical focus, Vol. 5, No 6 (1989); Kwok and R. Higuchi: Avoiding false positives with PCR. Natúré, 339, 237-238 (1989)].
A sejtekből izolált vagy plazmid DNS-t úgy kezeljük, hogy a komplementer szálakat elválasztjuk egymástól. Ezeket a szálakat azután két, feleslegben levő DNS oligonukleotiddal illesztjük (mindegyik 20-25 bázispár hosszú), amelyeket kémiailag szintetizáltunk, és szerkezetük olyan, hogy egymástól X számú nukleotiddal elválasztott szekvenciákhoz illeszkedjenek (X értéke általában 50 és 2000 bázispár között van).
A két oligonukleotid szolgál specifikus indító molekulaként a DNS-polimeráz által katalizált in vitro DNS-szintézishez, amelynek során a DNS-polimeráz a két oligonukleotid közötti szekvenciának megfelelő DNS-szekvenciát lemásolja. Ha a két indítómolekula tartalmazza a megfelelő szekvenciákat, akkor lehetséges, hogy új restrikciós endonukleáz emésztési helyeket hozzunk létre az 5’ és a 3’ végeken.
A reakció többszörös ciklusban való lejátszatása után nagy mennyiségű, keresett hosszúságú DNS-ffagmenst kapunk, ezt gélelektroforézissel tisztítjuk, majd restrikciós enzimes emésztéssel és agaróz gélelektroforézissel jellemezzük. A sokszorozott, tisztított DNS-ffagmenst használjuk azután más fragmensekkel, azaz plazmidokkal való ligáláshoz.
A PCR-DNS-fragmensek tompa végű fragmensekként sokszorozódnak. Ahhoz, hogy fapados végeket kapjunk (a ligálási eljáráshoz), a fragmenst a kívánt restrikciós endonukleázokkal kell emészteni, majd ismét tisztítani kell.
A PCR-reakció 20-30 ciklusban játszódik le. Egy ciklus három lépésből áll, különböző reakcióidőkkel és különböző reakció-hőmérsékletekkel, amit a PCR-thermo-cycler szabályoz. Az első lépés a mátrix DNS denaturálása (1 perc 95 °C-on), a második lépés a mátrix DNS és az indítómolekulák „hibridizálása” (1 perc 55 °C), végül ezt követi a „polimerizálás” (2 perc 72 °C).
Egy vizsgálat végtérfogata 30 μΐ, amely az alábbi végkoncentrációkat tartalmazza: PCRpuffer (lx), nukleotidkeverék, az egyes nukleotidokból 200 pmol/l, a két indítómolekulából 200-200 ng, 0,5 egység Taq polimeráz kétszer desztillált vízben.
6. példa
A transzfektált sejtek tenyésztése a fehérjék szekretédása céljából
A befogadó sejteket (Cl27 vagy CHO sejtek, hozzáférhetők az ATCC-nél) normál növesztő táptalajba oltjuk (DMEM + 10% boíjúmagzat-szérum, glükóz és glutamin) Petri-csészékben (l-2xl05 6 sejt per Petricsésze, átmérője 10 cm) az 1. napon. A következő napon a táptalajt eltávolítjuk (4 órával azelőtt, hogy a DNS-csapadékot hozzáadtuk a sejtekhez), majd a sejteket kétszer mossuk PBS-sel. Ezután 8 ml, FCS nélküli DMEM táptalajt adunk hozzá, 4 órával azután hogy a DNS csapadékot (az alábbiakban leírtak szerint készítve) hozzáadtuk a sejtekhez. Ezután ismét 4 órával később a táptalajt eltávolítjuk, és 3 ml glicerinelegyet (50 ml 2 χ TBS puffer, 30 ml glicerin, 120 ml desztillált
HU 216 301 Β víz) adunk hozzá. A glicerinelegyet rögtön azután eltávolítjuk, hogy 3 percig 37 °C-on inkubáltuk, majd a sejteket 1 xPBS-sel mostuk. A sejteket egy éjszakán át tenyésztjük 8 ml, 10% FCS-t tartalmazó DMEM-mel.
óra elteltével a sejteket kinyerjük a Petri-csészékből, tripszin-EDTA oldattal való kezeléssel (0,025% tripszin + 1 mmol/1 EDTA). Ezután, a tripszin-EDTA eltávolítása céljából a sejteket lxPBS oldattal mossuk, majd 10% FCS-t tartalmazó DMEM-ben szuszpendáljuk, és 24 mélyedéses lemezekre osztjuk szét (egy Petri-csészéből származó sejteket négy 24 mélyedéses lemezre osztunk szét).
Amikor a sejtek már jól növekszenek, akkor szelekciós táptalajt adunk hozzá (koncentrációk: 0,5-1 mg/ml neomicin, vagy 250 pg/ml xantin, 15 pg/ml hipoxantin vagy 25 pg/ml adenin, 10 pg/ml timidin, 2 pg/ml aminopterin, 25 pg/ml mikofenolsav az eco-gpt-hez például). A táptalajt minden héten cseréljük. Az első növekvő sejttelepeket 2 hét elteltével figyelhetjük meg.
pg plazmid DNS-hez és 20 pg hordozó DNS-hez (lazacsperma DNS, borjútimusz DNS) TE puffért (10 mmol/1 TRIS-HC1, 1 mmol/1 EDTA, pH=7,05) adunk 440 pl végtérfogatban, majd 60 pl 2 mol/1 koncentrációjú CaCl2-vel keverjük össze. Ezután ugyanilyen mennyiségű 2 χ TBS-t adunk hozzá (összetétele: 50 mmol/1 HEPES, 280 mmol/1 NaCl, 1,5 mmol/1 Na2HPO4 pH=7,05), és jól összekeverjük. A csapadékos oldatot 30 percig 37 °C-on inkubáljuk, majd közvetlenül azokhoz a sejtekhez adjuk, amelyeket transzfektálni akarunk.
7. példa
A tisztított részecskék adjuvánsának készítése
A steril sóoldatban szuszpendált, kívánt koncentrációjú antigénhez 1:10000 térfogat Thimerosolt, 1/10 térIVCsCl gradiens Frakció sorszám fogat szűréssel sterilezett 0,2 mol/1 KA1(SO4)2x 10H2O-t adunk. A pH értékét 5,0-ra állítjuk steril 1 mol/1 NaOHval, majd a szuszpenziót szobahőmérsékleten kevertetjük 3 óra hosszat. Az alumínium által kicsapott antigént ki5 nyerjük (centrifugálás 10 percig 2000/perc fordulatszámmal), steril normál sóoldatban szuszpendáljuk, amely 1:10 000 Thimerosolt tartalmaz, majd steril körülmények között alikvot részekre osztjuk.
8. példa
Hepatitis B mag-antigén tisztítása A HB-mag-antigént szekretáló sejtek felülúszóját kinyerjük, majd ultraszűréssel töményítjük. A koncentrátumot centrifúgálással tisztítjuk (20 000/perc, 15 perc,
4 °C, Beckman SW28 rotor).
A részecskeképződést szacharóz sűrűséggradiensen végzett centrifúgálással vizsgáljuk (0-45% szacharóz) Beckman SW28 rotorban 24 óra hosszat 28 000/perc fordulatszámmal, 4 °C-on. A gradienst frakcionáljuk, majd az egyes frakciókat ELISA-val elemezzük.
9. példa
Az alábbi táblázatok a találmány szerinti immunogén részecskék ELISA vizsgálatának néhány eredmé25 nyét mutatják be, az alábbiak szerint:
AIV. táblázatban a találmány szerinti bármely HBV részecskekonstrukcióból készített tisztított HBs-antigén ELISA adatait látjuk, beleértve a pre-Sl epitópokat és az S régiót, az MA 18/7 anti-pre-Sl monokloná30 lis antitesttel és a G022 anti-HBs monoklonális antitesttel.
A IV. táblázat a CsCl sűrűségi gradiens utáni 21-es frakciókat mutatja.
. táblázat
ELISA mérés (E=492)
18/7 Monoklonális antitest
19
0,092
0,210
0,388
1,970
2,954
0,967
0,031
HU 216 301 Β
CsCl gradiens Frakció sorszám
IV-2. táblázat
ELISA mérés (E=492)
G022 Monoklonális antitest
19
0,136
0,426
0,822
1,970
2,954
0,967
0,076
Az V. táblázatban a találmány szerinti bármely HBmag-szekvencia konstrukcióból készített tisztított HBmag-antigén részecskék adatait láthatjuk a HB-mag elleni poliklonális antitestekkel és a HB-S-Ag elleni monoklonális antitesttel.
V-l. táblázat
Szacharóz gradiens Frakció sorszám
ELISA mérés (E=492) Poliklonális antitestek
9
0,25
0,922
1,423
1,5
1,5
1,28
0,466
V-2. táblázat
Szacharóz gradiens
ELISA mérés (E=492)
Frakció sorszám G022 Monoklonális antitest
6 0,020
7 0,024
8 0,018
9 0,011
10 0,015
11 0,020
12 0,022
10. példa
A Hepa-Care beadására végzett vizsgálatok csimpánzokban
A Hepa-Care olyan részecskéket jelent, amelyek a Hepatitis B felszíni antigéneket (SÍ és S) specifikus formulában hordozzák (az arány 50:50), amelyet a Hepati55 tis B vírus krónikus hordozóinak kezelésére használunk.
1. kísérlet
Egy Hepatitis B-t hordozó, 1-es csimpánzt intramuszkulárisan kezelünk Hepa-Care-rel a 0., 4. és 8.
héten 18 pg per injekciós dózissal.
HU 216 301 Β
A májenzimeket követjük (IV. ábra), és a Hepatitis B szintet is követjük (V. ábra).
2. kísérlet
Az 1-es csimpánznak az előzőekben leírt kezelése után egy emlékeztető kezelést adunk a 30., 34. és 38. héten. Az eredmények a VI. ábrán láthatók.
3. kísérlet
A 2-es csimpánzt is Hepa-Care-rel kezeljük, de az 1-es csimpánzzal ellentétben ennek intravénásán adjuk be a hatóanyagot. A dózis 2 mg. Az eredmények a VII. ábrán láthatók.
Egy 3-as, kontroll csimpánzban is ellenőrizzük a májenzimeket, és az eredmények a VIIL ábrán láthatók.
Kezelés: Hepa-Care-relintramuszkulárisana0., 1., 6. és 7. hónapban. Az antigén és antitest mérések eredményeit a IX. és X. ábrán mutatjuk be.
2- es beteg (nő, 48 éves, 12 éve beteg):
Hepatitis B paraméterek: HBsAg pozitív anti-HBs negatív
HBeAg negatív anti-HBe pozitív anti-HBc negatív
Kezelés: Hepa-Care-rel intramuszkulárisan a 0., 1. és 6. hónapban. Az antigén és antitest mérések eredményeit a XI. és XII. ábrán mutatjuk be.
3- as beteg (nő, 41 éves, 12 éve beteg):
Hepatitis B paraméterek: HBsAg pozitív
11. példa 15 anti-HBs negatív
Kezelés Hepa-Care-rel HBeAg negatív
(A meghatározást lásd a 10. példában) anti-HBe pozitív
1-es beteg (férfi, 65 éves, 2 éve beteg): Kezelés: Hepa-Care-rel intramuszkulárisan a 0.,
Hepatitis B paraméterek : HBsAg pozitív 1., 2. és 5. hónapban. A HBs antigén és az anti-HBs
anti-HBs negatív 20 antitestek mért értékeit a XIII. és XIV. ábrákon mutat-
HBeAg negatív juk be.
anti-HBe pozitív Az alábbiakban a szekvencialistákat mutatjuk be.
anti-HBc negatív
SZEKVENCIALISTA 25 Topológia: lineáris
Szekvencia száma (SEQID NO.): 1 Molekula típusa: genomi DNS
Szekvencia típusa: nukleotid Eredeti forrás: HBV mag
Szekvencia hossza: 558 bp Közvetlen kísérleti forrás: PCR-amplifikálás
Szálszám: egyszeres 30
ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT
ACT GTG GAG TTA. CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC
TTC TTT CCT TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACC
GCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCT
CCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC
AGG CAA GCC ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATG
ACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAA
GAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TAT
GTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA
CTA TTG · TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTT
GGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC TCT
TTC GGA GTG TGG ATT CGC ACT CCT CCA GCC TAT
AGA CCA CCA AAT GCC CCT ATG TTA TCA ACA CTT
CCG GAA ACT ACT GTT GTT AGA CGA CGG GAC CGA
GGC AGG TCC CCT AGA AGA AGA ACT CCC TCG CCT
CGC AGA CGT AGA TCT CAA TCG CCG CGT CGC AGA
AGA TCT CAA TCT CGG GAA TCT CAA TGT TAG
HU 216 301 Β
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 2
Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 504 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag PCR-amplifikálás
ATG GAC ATT GAC . CCT TAT ' AAA GAA TTT GGA GCT
ACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC
TTC TTT CCT TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACC
GCC TCA GCT CTG TAT: CGA GAA GCC TTA GAG TCT
CCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC
AGG CAA GCC ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATG
ACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAA
GAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TAT
GTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA
CTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTT
GGA AGA GAG ACT GTA CTT-. GAA TAT TTG GTC TCT
TTC GGA GTG TGG ATT CGC ACT CCT CCA GCC TAT
AGA CCA- CCA AAT GCC CCT ATG TTA TCA ACA CTT
CCG GAA ACT ACT GTT GTT AGA CGA CGG GAC CGA
GGC AGG TCC CCT AGA AGA AGA ACT CCC TCG CCT
CGC AGA CGT
Szekvencia száma (SEQ ID NO.) Szekvencia típusa:
Szekvencia hossza:
Szálszám:
nukleotid 504 bp egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag PCR-amplifikálás
ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT
ACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC
TTC TTT CCT TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACC
GCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCT
CCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC
AGG CAA GCC ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATG
ACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAA
GAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TAT
GTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA
CTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ÁCT TTT
GGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC TCT
TTC GGA GTG TGG ATT CGC ACT CCT CCA GCC TAT
AGA CCA CCA AAT GCC CCT ATG TTA TCA ACA CTT
CCG GAA ACT ACT GTT GTT AGA CGA CGG GAC CGA
GGC AGG TCC CCT AGA AGA AGA ACT CCC TCG CCT
CGC AGA CGT
HU 216 301 Β
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 4 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 534 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag PCR-amplifikálás
TCC AAC CTG TGC CTT GGG TGG CTT TGG GGC
ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT
ACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC
TTC TTT CCT TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACC
GCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCT
CCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC
AGG CAA GCC ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATG
ACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAA
GAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TAT
GTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA
CTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTT
GGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC TCT
TTC GGA GTG TGG ATT CGC ACT CCT CCA GCC TAT
AGA CCA CCA AAT GCC CCT ATG TTA TCA ACA CTT
CCG GAÁ ACT ACT GTT GTT AGA CGA CGG GAC CGA
GGC AGG TCC CCT AGA AGA AGA ACT CCC TCG CCT
CGC AGA CGT
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 5 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 534 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag PCR-amplifikálás
TCC AAC CTG TGC CTT GGG TGG CTT TGG GGC
ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT
ACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC
TTC TTT CCT TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACC
GCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCT
CCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC
AGG CAA GCC ATT CTC TGC . TGG GGG GAA TTG ATG
ACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAA
GAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TAT
GTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA
CTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTT
GGA AGA GAG ACT GTA CTT.,. GAA TAT TTG GTC TCT
TTC GGA GTG TGG ATT CGC ACT CCT CCA GCC TAT
AGA CCA CCA AAT GCC CCT ATG TTA TCA ACA CTT
CCG GAA ACT ACT GTT GTT AGA CGA CGG GAC CGA
GGC AGG TCC CCT AGA AGA AGA ACT CCC TCG CCT
CGC AGA CGT
HU 216 301 Β
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 6 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 87 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag kémiai szintézis
ATC CTC TGC TGG GGG GAA TGG ATG ACT CTA GCT ACC TGG
GTG GGC
AAT AAT TTG GAA GAT CCA GCA TCT AGG GAC CTT GTA GTA AAT
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 7 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 81 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag kémiai szintézis
GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT ACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC TTC TTT CCT TCC GCT AGG
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 8 Topológia: lineáris
Szekvencia típusa: nukleotid 20 Molekula típusa: genomi DNS
Szekvencia hossza: 114bp Eredeti forrás: HBV mag
Szálszám: egyszeres Közvetlen kísérleti forrás: kémiai szintézis
TCC AAC CTG TGC CTT GGG TGG CTT TGG GGC ATG GAC ATT GAC CCT
TAT AAA GAA TTT GGA GCT ACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT
TCT GAC TTC TTT CCT TCC GTC AGG
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 9 30 Topológia: lineáris
Szekvencia típusa: nukleotid Molekula típusa: genomi DNS
Szekvencia hossza: 90 bp Eredeti forrás: HBV mag
Szálszám: egyszeres Közvetlen kísérleti forrás: kémiai szintézis
GAT CTC CTA GAC ACC GCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG
TCT CCT GAG CTA TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC AGG
CAA GGT
Szekvencia száma (SEQ ID NO.) Szekvencia típusa:
Szekvencia hossza:
Szálszám:
nukleotid
261 egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag kémiai szintézis
ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT
ACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC
TTC TTT CCT TCC GTC AGG GAT CTC CTA GAC ACC
GCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCT
CCT GAG CTA TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC
AGG CAA GGT ATC CTC TGC TGG GGG GAA TGG ATG
ACT CTA GCT ACC TGG GTG GGC AAT. AAT TTG GAA
GAT CCA GCA TCT AGG GAC CTT GTA GTA AAT
HU 216 301 Β
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 11 Topológia: lineáris
Szekvencia típusa: nukleotid Molekula típusa: genomi DNS
Szekvencia hossza: 291 Eredeti fonás: HBV mag
Szálszám: egyszeres Közvetlen kísérleti fonás: kémiai szintézis
TCC AAC CTG TGC CTT GGG TGG CTT TGG GGC
ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT
ACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC
TTC TTT CCT TCC GTC AGG GAT CTC CTA GAC ACC
GCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCT
CCT GAG CTA TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA GTC
AGG CAA GGT ATC CTC TGC TGG GGG GAA TGG ATG
ACT CTA GCT ACC TGG GTG GGC AAT AAT TTG GAA
GAT CCA GCA TCT AGG GAC CTT GTA GTA AAT
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 12 25 Topológia: lineáris
Szekvencia típusa: nukleotid Molekula típusa: genomi DNS
Szekvencia hossza: 123 Eredeti fonás: HBV mag
Szálszám: egyszeres Közvetlen kísérleti fonás: kémiai szintézis
ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAA GAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA
GTA GTC AAT TAT GTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA
CTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTT
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 13 Topológia: lineáris
Szekvencia típusa: nukleotid Molekula típusa: genomi DNS
Szekvencia hossza: 13 8 bp Eredeti fonás: HBV mag
Szálszám: egyszeres Közvetlen kísérleti fonás: kémiai szintézis
GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TAT GTT AAT ACT AAC ATG GGT
TTA AAG ATC AGG CAA CTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT
TTT GGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC TCT TTC GGA GTG
TGG
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 14 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 294 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás lineáris genomi DNS HBV S2 ayw/adw HBVDNS
ATS CAG TGG AAT
CAA GAT CCC AGA
GGT GGC TCC AGT
ACT ACT GCC TCT
ATA GAG AAC ATC
TCC AGA ACC TTC
GTG AGA GGC CTG
TCA GGA ACA GTA
CCC TTA TCG TCA
ACA TCA GGA TTC
CAC CAA ACT CTG
TAT TTC CCT GCT
AAC CCT GTT CTG
ATC TTC TCG AGG
CTA GGA CCC CTT
HU 216 301 Β
CTC GTG TTA CAG GCG GGG TTT TTC TTG TTG ACA AGA
ATC CTC ACA ATA CCG CAG AGT CTA GAC TCG TGG TGG
ACT TCT CTC AAT TTT CTA GGG GGA ACT ACC GTG TGT
CTT GGC CAA AAT TCG CAG TCC TCA ACC TCC AAT CAC
TCA CCA ACC TCT TGT CCT CCA ACT TGT CCT GGT TAT
CGC TGG ATG TGT CTG CGG CGT TTT ATC ATC TTC CTC
TTC ATC CTG CTG CTA TGC CTC ATC TTC TTG TTG GTT
CTT CTG GAC TAT CAA GGT ATG TTG CCC GTT TGT CCT
CTA ATT CCA GGA TCC TCA ACA ACC AGC ACG GGA CCA
TGC CGG ACC TGC ATG ACT ACT GCT CAA GGA ACC TCT
ATG TAT CCC TCC TGT TGC TGT ACC AAA CCT TCG GAC
GGA AAT TGC ACC TGT ATT CCC ATC CCA TCA TCC TGG
GCT TTC GGA AAA TTC CTA TGG GAG TGG GCC TCA GCC
CGT TTC TCC TGG CTC AGT TTA CTA GTG CCA TTT GTT
CAG TGG TTC GTA GGG CTT TCC CCC ACT GTT TGG CTT
TCA GTT ATA TGG ATG ATG TGG TAT TGG GGG CCA AGT
CTG TAC AGC ATC TTG AGT CCC TTT TTA CCG CTG TTA
CCA ATT TTC TTT TGT CTT TGG GTA TAC ATT
Szekvencia száma (SEQID NO.): 15
Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 99 bp
Szálszám: egyszeres
30 Topológia: lineáris
Molekula típusa: genomi DNS
Eredeti forrás: HBV mag
Közvetlen kísérleti forrás: kémiai szintézis
TAT GTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA CTA TTG TGG
TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTT GGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA
TAT TTG GTC
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 16
Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 390 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás lineáris genomi DNS HBV mag PCR-amplifikálás
TCC AAC CTG TGC CTT GGG TGG CTT TGG GGC
ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT
ACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC
TTC TTT CCT TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACC
GCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCT
CCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC
AGG CAA GCC ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATG
ACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAA
GAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TAT
GTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA
CTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTT
GGA AGA' GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC
HU 216 301 Β
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 17
Szekvencia típusa: nukleotid a megfelelő proteinnel
Szekvencia hossza: 60 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV SÍ ay kémiai szintézis
AAT CCT CTG GGA TTC TTT CCC GAT CAC CAG TTG GAT CCA GCC TTC AGA GCA AAC ACC GCA
Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro Alá Phe Arg Alá Asn Thr Alá
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 18
Szekvencia típusa: nukleotid a megfelelő proteinnel
Szekvencia hossza: 63 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV SÍ ay kémiai szintézis
CCT GCC TCC ACC AAT CGC CAG TCA GGA AGG CAG CCT ACC CCG CTG TCT CCA CCT TTG AGA AAC
Pro Alá Ser Thr Asn Arg Gin Ser Gly Arg Gin Pro Thr Pro He Ser Pro Pro Leu Arg Asn
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 19
Szekvencia típusa: nukleotid a megfelelő proteinnel
Szekvencia hossza: 63 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV SÍ ay kémiai szintézis
GAT CCA GCC TTC AGA GCA AAC ACC GCA AAT CCA GAT TGG GAC TTC
AAT CCC AAC AAG GAC ACC
Asp Pro Alá Phe Arg Alá Asn Thr Alá Asn Pro Asp Trp Asp Phe
Asn Pro Asn Lys Asp Thr
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 20
Szekvencia típusa:
Szekvencia hossza: Szálszám:
nukleotid a megfelelő proteinnel 108 bp egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV SÍ ay kémiai szintézis
CCG CAC GGA GGC CTT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT
CAG GGC ATA CTA CAA ACT TTG CCA GCA AAT CCG CCT
CCT GCC TCC ACC AAT CGC CAG TCA GGA AGG CAG CCT
Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gin Alá
Gin Gly He Leu Glu Thr Leu Pro Alá Asn Pro Pro
Pro Alá Ser Thr Asn Arg Gin Ser Gly Arg Gin Pro
HU 216 301 Β
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 21 Topológia: Molekula típusa: Eredeti forrás: Közvetlen kísérleti forrás: lineáris genomi DNS HBV SÍ ad kémiai szintézis
Szekvencia típusa: Szekvencia hossza: Szálszám: nukleotid 63 bp egyszeres
CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA AGG CAG CCT ACT CCC ATC
TCT CCA CCT CTA AGA GAC - X
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 22 Topológia: lineáris
Szekvencia típusa: nukleotid a meg- Molekula típusa: genomi DNS
felelő proteinnel Eredeti forrás: HBV SÍ ad
Szekvencia hossza: 108 bp Szálszám: egyszeres Közvetlen kísérleti forrás: 15 kémiai szintézis
CCA CAC GGC GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT
CAG GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT CCT
CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA AGG CAG CCT
Pro His Gly Gly He Leu Gly Trp Ser Pro Gin Alá
Gin Gly He Leu Thr Thr Val Ser Thr He Pro Pro
Pro Alá Ser Thr Asn Arg Gin Ser Gly Arg Gin · Pro
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 23 Topológia: lineáris
Szekvencia típusa: nukleotid Molekula típusa: genomi DNS
Szekvencia hossza: 60 bp Eredeti forrás: HBV S2 ay
Szálszám: egyszeres Közvetlen kísérleti forrás: kémiai szintézis
CAG TGG AAT TCC AGA ACC TTC CAC CAA ACT CTG CAA GAT CCC AGA
GTG AGA GGC CTG TAT - X
Szekvencia száma (SEQID NO.): 24 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 60 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia :
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás lineáris genomi DNS HBV S2 ay kémiai szintézis
GAT CCC AGA GTG AGA GGC
CTG TAT
TTC CCT GCT GGT GGC
TCC AGT
TCA GGA ACA GTA AAC -X
Szekvencia száma (SEQ ID NO.) Szekvencia típusa: Szekvencia hossza: Szálszám: : 25 nukleotid 558 bp egyszeres 50 Topológia: Molekula típusa: Eredeti forrás: Közvetlen kísérleti forrás: lineáris genomi DNS HBV mag PCR-amplifikálás
ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT
ACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC
TTC TTT CCT. TCC GTA CGA GAT. CTC CTA GAC ACC
GCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCT
HU 216 301 Β
CCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC
AGG CAA GCC ;ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATG
ACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAA
GAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TAT
GTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA
CTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTT
GGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC TCT
TTC GGA GTG TGG ATT CGC ACT CCT CCA GCC TAT
AGA CCA CCA AAT GCC CCT ATG TTA TCA ACA CTT
CCG GAA ACT ACT GTT GTT AGA CGA CGG GAC CGA
GGC AGG TCC CCT AGA AGA AGA ACT CCC TCG CCT
CGC AGA CGT AGA TCT CAA TCG CCG CGT CGC AGA
AGA TCT CAA TCT CGG GAA TCT CAA TGT TAG
Szekvencia száma (SEQID NO.): 26 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 678 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás lineáris genomi DNS HBV S adw/ayw HBV DNS
ATA GAG AAC ATC ACA TCA GGA TTC CTA GGA CCC CTT CTC
GTG tta CAG GCG GGG JTTT ' TTC TTG TTG ACA AGA ATC CTC
ACA ATA CCG CAG AGT CTA GAC TCG TGG TGG ACT TCT CTC
AAT TTT CTA GGG GGA ACT ACC GTG TGT CTT GGC CAA AAT
TCG CAG TCC TCA ACC TCC AAT CAC TCA CCA ACC TCT TGT
CCT CCA ACT TGT CCT GGT TAT CGC TGG ATG TGT CTG CGG
CGT TTT ATC ATC TTC CTC TTC ATC CTG CTG CTA TGC CTC
ATC TTC TTG TTG GTT CTT CTG GAC TAT CAA GGT ATG TTG
CCC GTT TGT CCT CTA ATT CCA GGA TCC TCA ACA ACC AGC
ACG GGA CCA TGC CGG ACC TGC ATG ACT ACT GCT CAA GGA
ACC TCT ATG TAT CCC TCC TGT TGC TGT ACC AAA CCT TCG
GAC GGA AAT TGC ACC TGT ATT CCC ATC CCA TCA TCC TGG
GCT TTC· GGA AAA TTC CTA TGG GAG TGG GCC TCA GCC CGT
TTC TCC TGG CTC AGT TTA CTA GTG CCA TTT GTT CAG TGG
TTC GTA GGG CTT TCC CCC ACT GTT TGG CTT TCA GTT ATA
TGG ATG ATG TGG TAT TGG GGG CCA AGT CTG TAC AGC ATC
TTG AGT CCC TTT TTA CCG CTG TTA CCA ATT TTC TTT TGT
CTT TGG GTA TAC ATT
HU 216 301 Β
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 27 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 585 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás lineáris genomi DNS HBV S adw/ayw HBV DNS
CTA GAC TCG TGG TGG ACT TCT CTC AAT TTT CTA GGG
GGA TCT CCC GTG TGT CTT GGC CAA AAT TCG CAG TCC
CCA ACC TCC AAT CAC TCA- -CCA ACC TCC TGT CCT CCA
ATT TGT CCT GGT TAT CGC TGG ATG TGT- CTG CGG CGT
TTT ATC ATA TTC CTC TTC ATC CTG CTG CTA TGC CTC
ATC TTC TTA TTG GTT CTT CTG GAT TAT CAA GGT ATG
TTG CCC GTT TGT CCT CTA ATT CCA GGA TCA ACA ACA
ACC AGT ACG GGA CCA TGC AAA ACC TGC ACG ACT CCT
GCT CAA GGC AAC TCT ATG TTT CCC TCA TGT TGC TGT
ACA AAA CCT ACG GAT GGA AAT TGC ACC TGT ATT CCC
ATC CCA TCG TCC TGG . GCT TTC GCA AAA TAC CTA TGG
GAG TGG GCC TCA GTC CGT TTC TCT TGG CTC AGT TTA
CTA GTG CCA TTT GTT CAG TGG TTC GTA GGG CTT TCC
CCC ACT GTT TGG CTT TCA GCT ATA TGG ATG ATG TGG
TAT TGG GGG CCA AGT CTG TAC AGC ATC GTG AGT CCC
TTT ATA CCG CTG TTA CCA ATT TTC TTT TGT CTC TGG
GTA TAC ATT
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 28 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 106 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV SÍ kémiai szintézis
5'—GAT—CTT—TAA—CAT—GGA—GAA—CAA—TCC—TCT—G GG—ATT-CTT—TCC—CGA—TCA—CCA—GTT—GGA—TCC—A GC—CTT—CAG—AGC—AAA—CAC—CGC—AAA—TCC—AGA—T
TG—GGA—CTT-CAA—TCC—CAG—(T)-“'
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 29 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 115 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBVS kémiai szintézis
5'—AAT—TCT—AGA—CTC—GAG-TCT-GAA—CAT—AGA—G
AA—CAT—CAC—ATC-AGG—ATT—CCT—AGG—ACC—CCT—T
CT—CGT—GTT—ACA—GGC—GGG-GTT—TTT-CTT—GTT—G
AC-AAG-AAT-CCT-CAC-AAT-ACC-GCA-GAG-CC)-3
HU 216 301 Β
Szekvencia száma (SEQID NO.): 30 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 108 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag kémiai szintézis ' -GAT-CTT-TTA—AAG—GGA—TCC-TCT—GCT-GGG—G
GG-AAT-GGA-TGA-CTC-TAG- CTA-CCT-GGG-TGG-G
CA—ATA—ATT—TGG—AAB—ATC—CAG—CAT—CTA-GGG—A
CC-TTG-TAG-TAA-ATC-TAG-AC- (A) -3'
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 31 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 106 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag kémiai szintézis
5' —GAT—CTC-CGG—GAA—7TC-CTG-GGG—CAT-G3A—C
AT-TGA-CCC-TTA—TAA—AGA-ATT-TGG—AGC-TAC-T
57—GGA—G7T—ACT—CTC—5TT—T77—SCC—77C— i GA—C
TT-CTT-TCC-7TC-CGT-CA5- (.G) -3 '
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 32 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 89 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag kémiai szintézis
5'—GAT—CTC-CTA—GAC—ACC-GCC-TCA—GCT—CTG—T
AT-CGA—GAA—GCC-TTA-GAG—TCT-CCT-GAG-CAT-T
GC—TCA—CCT—CAC—CAT—ACT—GCA—CTC—AGG—CAA—3
- (G)- 3'
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 33 Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 25 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag kémiai szintézis
5'-TTG-GAT-CCT-CCA-ACC-TGT-GCC-TTG-(G)-3
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 34
Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 25 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag kémiai szintézis
5'-CCT-CTA-GAA-CCA-AAT-ATT-CAA-GTA-(C)-3
HU 216 301 Β
Szekvencia száma (SEQ ID NO.): 35
Szekvencia típusa: nukleotid
Szekvencia hossza: 588 bp
Szálszám: egyszeres
Topológia:
Molekula típusa:
Eredeti forrás:
Közvetlen kísérleti forrás:
lineáris genomi DNS HBV mag PCR-amplifikálás
TCC AAC CTG TGC CTT GGG TGG CTT TGG GGC
ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT
ACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC
TTC TTT CCT TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACC
GCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCT
CCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC
AGG CAA GCC ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATG
ACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAA
GAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TAT
GTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA
CTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTT
GGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC TCT
TTC GGA ' GTG TGG ATT CGC ACT CCT CCA GCC TAT
AGA CCA CCA AAT GCC CCT ATG TTA TCA ACA CTT
CCG GAA ACT ACT GTT GTT AGA CGA CGG GAC CGA
GGC AGG TCC CCT AGA AGA AGA ACT CCC TCG CCT
CGC AGA CGT AGA TCT CAA TCG CCG CGT CGC AGA
AGA TCT CAA TCT CGG GAA TCT CAA TGT TAG
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (16)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek hatóanyagként a következő komponensek 40 kombinációját tartalmazzák:
    (a) legalább egy, valamely Hepatitis vírus egy vagy több antigén T-sejt-aktiváló epitópját tartalmazó polipeptid-szekvencia, valamint (b) egy olyan hordozó, amely képes az (a) epitópszekvenciá(ka)t bemutatni, és az (a) polipeptid-szekvencia(ák) kovalens vagy hidrofób kötéssel kapcsolódiának) a (b) hordozóhoz, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagot farmakológiailag elfogadható hígító-, hordozó- és/vagy egyéb segédanyaggal összekeverve kró- 50 nikus vírusos hepatitis kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményekké alakítjuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polipeptid-szekvenciaként Hepatitis B vírus (HBV) eredetű szekvenciá(ka)t alkalmazunk.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polipeptid-szekvenciaként HBV preSl, pre-S2 és/vagy S és/vagy HBV mag-antigén aminosav-szekvenciájának megfelelő szekvenciá(ka)t alkalmazunk.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (i) tetszőleges deléciókkal, (ii) egy vagy több aminosav helyettesítésével, (iii) egy aminosav-szekvenciának az N-terminálison, a C-terminálison vagy inszercióként történő hozzáadásával módosított polipeptid-szekvenciá(ka)t alkalmazunk, és a módosítás során egy, legalább hat
    45 egymás utáni aminosavat tartalmazó epitópot megtartunk.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mirisztilezett (a) polipeptidszekvenciá(ka)t alkalmazunk.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (b) hordozóként poliszacharidot, hidrofób polimert vagy részecske formájú szervetlen molekulát alkalmazunk.
  7. 7. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, 55 azzal jellemezve, hogy (b) hordozóként egy második polipeptid-szekvenciát alkalmazunk.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szekréció során legalább 10 nm átmérőjű részecskéket képező (b) polipeptid-szekvenciát alkalma60 zunk.
    HU 216 301 Β
  9. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a következő polipeptidek teljes aminosavszekvenciájával, vagy annak jelentős részével rendelkező (b) polipeptid-szekvenciát alkalmazunk: HBV Speptid; HBV mag-, HAV mag- vagy HÍV magantigén; poliovírus, HAV vagy HÍV felületi antigén.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (i) tetszőleges deléciókkal, (ii) egy vagy több aminosav helyettesítésével, (iii) egy aminosav-szekvenciának az N-terminálison, a C-terminálison vagy inszercióként történő hozzáadásával módosított (b) polipeptid-szekvenciát alkalmazunk, azzal a feltétellel, hogy a módosítás során a részecskeképző képességet megtartjuk.
  11. 11. A 7-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mirisztilezett (b) polipeptidszekvenciát alkalmazunk.
  12. 12. A 7-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy diszulfid-hidakkal kapcsolt (a) és (b) polipeptid-szekvenciákat alkalmazunk.
  13. 13. A 7-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy „hidrofób horgonyzás”-sal (mirisztilsavon keresztül) kapcsolt (a) és (b) polipeptidszekvenciákat alkalmazunk.
    5
  14. 14. A 7-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy peptidkötéssel kapcsolt (a) és (b) polipeptid-szekvenciákat alkalmazunk, ahol az (a) polipeptid-szekvencia és a (b) polipeptid-szekvencia közé adott esetben egy térköz-szekvenciát inszertálunk,
    10 amelyet peptidkötésekkel kapcsolunk az (a) és (b) polipeptid-szekvenciákhoz.
  15. 15. A 7-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (a) és (b) polipeptid-szekvenciaként az említett kombinációt kódoló rekombi15 náns DNS-molekula által expresszált polipeptid-szekvenciát alkalmazunk.
  16. 16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy intravénás vagy intramuszkuláris injektálással történő adagolásra alkalmas gyógyszerkészítményeket állítunk elő.
HU9301794A 1990-12-19 1991-12-19 Eljárás krónikus vírusos hepatitisz kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására HU216301B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP90124775A EP0491077A1 (en) 1990-12-19 1990-12-19 A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9301794D0 HU9301794D0 (en) 1993-10-28
HUT66437A HUT66437A (en) 1994-11-28
HU216301B true HU216301B (hu) 1999-06-28

Family

ID=8204863

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9301794A HU216301B (hu) 1990-12-19 1991-12-19 Eljárás krónikus vírusos hepatitisz kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására

Country Status (15)

Country Link
US (2) US6020167A (hu)
EP (2) EP0491077A1 (hu)
JP (2) JP3857305B2 (hu)
KR (1) KR0156587B1 (hu)
AT (1) ATE170220T1 (hu)
AU (1) AU657935B2 (hu)
CA (1) CA2098021C (hu)
CZ (1) CZ290233B6 (hu)
DE (1) DE69130071T3 (hu)
DK (1) DK0563093T4 (hu)
ES (1) ES2121000T5 (hu)
HK (1) HK1002901A1 (hu)
HU (1) HU216301B (hu)
SK (1) SK280551B6 (hu)
WO (1) WO1992011368A1 (hu)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10299017I2 (de) * 1987-06-22 2005-05-25 Medeva Holdings Bv Hepatitis-B-Oberfl{chenantigen enthaltendes Peptid.
EP0491077A1 (en) * 1990-12-19 1992-06-24 Medeva Holdings B.V. A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases
DE4107612A1 (de) 1991-03-09 1992-09-10 Behringwerke Ag Rekombinante proteine mit der immunreaktivitaet des hepatitis b virus e antigens (hbeag), verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in immunoassays und impfstoffen
US7611713B2 (en) 1993-03-05 2009-11-03 Pharmexa Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide compositions
US6689363B1 (en) 1992-01-29 2004-02-10 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide and nucleic acid compositions
US6509149B2 (en) 1995-06-06 2003-01-21 Hybridon, Inc. HPV-specific oligonucleotides
CA2260761C (en) * 1996-06-25 2011-05-03 Nico Johannes Christiaan Maria Beekman Vaccine comprising antigens bound to carriers through labile bonds
US7091324B2 (en) 1998-11-05 2006-08-15 Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Prevention and treatment of HCV infection employing antibodies directed against conformational epitopes
JP2003528138A (ja) * 2000-03-29 2003-09-24 ジョージタウン・ユニバーシティ デルタ肝炎ウイルス感染症の治療法
IL142802A (en) * 2000-04-27 2015-01-29 Enzo Therapeutics Inc Use of one or more HBV antigens for the preparation of oral pharmaceutical preparations for the treatment of a person with active HBV infection or hepatocellular carcinoma
US6787526B1 (en) 2000-05-26 2004-09-07 Idenix Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating hepatitis delta virus infection with β-L-2′-deoxy-nucleosides
US7022830B2 (en) * 2000-08-17 2006-04-04 Tripep Ab Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene
RU2295536C2 (ru) * 2001-02-05 2007-03-20 Стрессджен Байотекнолоджиз Корп. Композиции на основе белка вируса гепатита в и стрессового белка и их применение
US7351413B2 (en) * 2002-02-21 2008-04-01 Lorantis, Limited Stabilized HBc chimer particles as immunogens for chronic hepatitis
WO2003080672A1 (en) * 2002-03-22 2003-10-02 Aprogen, Inc. Humanized antibody and process for preparing same
DE10339927A1 (de) * 2003-08-29 2005-03-24 Rhein Biotech Gesellschaft für neue Biotechnologische Prozesse und Produkte mbH Zusammensetzung zur Prophylaxe/Therapie von HBV-Infektionen und HBV-vermittelten Erkrankungen
GB0326416D0 (en) 2003-11-12 2003-12-17 Karolinska Innovations Ab Methods and means relating to hepatitis B infection
CA2549865A1 (en) * 2003-11-12 2005-06-02 Hbv Theranostica Ab Methods and means relating to hepatitis b infection
US9603921B2 (en) * 2004-10-27 2017-03-28 Janssen Vaccines Ag Virosome particles comprising antigens from influenza virus and hepatitis b virus
WO2009022236A2 (en) 2007-08-16 2009-02-19 Tripep Ab Immunogen platform
WO2009092396A1 (en) 2008-01-25 2009-07-30 Universitätsklinikum Heidelberg Hydrophobic modified pres-derived peptides of hepatitis b virus (hbv) and their use as hbv and hdv entry inhibitors
CN101485672B (zh) * 2008-12-05 2010-08-25 广东粤龙药业有限公司 异丙景糖酐在制备治疗人HBeAg阳性慢性乙型肝炎药物中的应用
US10076570B2 (en) 2009-08-07 2018-09-18 Transgene S.A. Composition for treating HBV infection
KR20120052352A (ko) 2009-08-07 2012-05-23 트랜스진 에스.에이. Ｈｂｖ 감염을 치료하는 조성물

Family Cites Families (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US34705A (en) * 1862-03-18 Improvement in tompions for fire-arms
US3636191A (en) * 1969-10-08 1972-01-18 Cancer Res Inst Vaccine against viral hepatitis and process
FR2480779B2 (fr) * 1979-08-30 1986-07-18 Anvar Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur
EP0182442B2 (en) * 1978-12-22 1996-04-03 Biogen, Inc. Recombinant DNA molecules and their method of production
ES8105035A1 (es) * 1978-12-22 1981-05-16 Biogen Nv Un metodo para producir al menos un polipeptido que muestra antigenicidad de hbv
IE52036B1 (en) * 1979-05-24 1987-05-27 Univ California Non-passageable viruses
US4935235A (en) * 1979-05-24 1990-06-19 The Regents Of The University Of California Non-passageable viruses
US5196194A (en) * 1979-05-24 1993-03-23 The Regents Of The University Of California Vaccines containing Hepatitis B S-protein
USRE34705E (en) 1979-08-30 1994-08-23 Institut Pasteur Nucleotidic sequence coding the surface antigen of the hepatitis B virus, vector containing said nucleotidic sequence, process allowing the obtention thereof and antigen obtained thereby
US4415491A (en) * 1980-01-14 1983-11-15 The Regents Of The University Of California Synthetic vaccine peptide epitomes of hepatitis B surface antigen
EP0038765B1 (fr) * 1980-04-22 1987-09-02 Institut Pasteur Vaccin contre l'hépatite virale B, procédé et cellules eucaryotes transformées pour la production de ce vaccin
IL63224A (en) * 1980-07-17 1985-05-31 Scripps Clinic Res Synthetic peptide specific antigenic determinant and method of manufacturing antigenic materials therefrom
GR76274B (hu) * 1981-08-04 1984-08-04 Univ California
AU8746582A (en) * 1981-09-02 1983-03-10 Biogen N.V. Hepatitis b virus e type antigen
US4741901A (en) * 1981-12-03 1988-05-03 Genentech, Inc. Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture
JPS58194897A (ja) * 1982-05-07 1983-11-12 Takeda Chem Ind Ltd 新規ｄｎａ，その製造方法およびそれで形質転換させた宿主
JPS5936698A (ja) * 1982-08-20 1984-02-28 Science & Tech Agency Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａおよび形質転換動物細胞
US4977092A (en) * 1985-06-26 1990-12-11 Amgen Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells
US5198348A (en) * 1982-08-30 1993-03-30 Amgen Inc. Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells
JPS5974985A (ja) * 1982-10-19 1984-04-27 Takeda Chem Ind Ltd 新規ｄｎａ
CA1341302C (en) * 1983-02-22 2001-10-09 Rae Lyn Burke Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis of foreign protein
US4696898A (en) * 1984-01-16 1987-09-29 Integrated Genetics, Inc. Vector encoding hepatitis B surface antigen
FR2559159B1 (fr) * 1984-02-02 1986-09-12 Inst Nat Sante Rech Med Vecteurs viraux de clonage et d'expression d'une proteine dans une cellule eucaryote, comportant au moins une partie du genome d'un retro-virus; cellules eucaryotes transfectees; procede utilisant de telles cellules et proteines obtenues
FR2560890B1 (fr) * 1984-03-07 1987-10-16 Grp Genie Genetique Composition utile pour la fabrication de vaccins contenant des particules portant l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et le recepteur de l'albumine serique humaine polymerisee, cellules animales capables de produire de telles particules et procede pour leur obtention
US4861588A (en) * 1985-02-05 1989-08-29 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers
US5324513A (en) * 1984-03-07 1994-06-28 Institut Pasteur Composition useful for the fabrication of vaccines
US4847080A (en) * 1984-03-07 1989-07-11 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipide vesicle carriers
US5204096A (en) * 1984-03-07 1993-04-20 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers
US5158769A (en) * 1984-03-07 1992-10-27 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers
US4777240A (en) * 1984-03-08 1988-10-11 Scripps Clinic And Research Foundation SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker
US4942125A (en) * 1984-09-07 1990-07-17 Scripps Clinic And Research Foundation SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker
US4599230A (en) * 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4599231A (en) * 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
WO1985004103A1 (en) * 1984-03-09 1985-09-26 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis b virus vaccine including both t cell anc b cell determinants
US5098704A (en) * 1984-06-18 1992-03-24 Chiron Corporation Hepatitis surface antigen particle vaccine
EP0171908A3 (en) * 1984-07-11 1987-07-15 Takeda Chemical Industries, Ltd. Hepatitis b virus surface antigen and production thereof
GB8421282D0 (en) * 1984-08-22 1984-09-26 Connaught Lab Multispecific antigenic proteins
US4722940A (en) * 1984-08-23 1988-02-02 Georgia Tech Research Corporation Aminoalkyl phenyl selenides for the treatment of hypertension and nervous system dysfunctions
EP0175261B1 (en) * 1984-09-12 1991-12-11 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
US4722840A (en) * 1984-09-12 1988-02-02 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
US4639371A (en) * 1984-10-02 1987-01-27 New York Blood Center, Inc. Hepatitis B antigenic compositions and vaccines against hepatitis B derived therefrom
EP0180012A1 (de) * 1984-10-27 1986-05-07 Wolfram H. Prof. Dr. Gerlich Immunogene Polypeptidsequenz des Hepatitis B-Virus
US4683136A (en) * 1985-03-06 1987-07-28 Scripps Clinic And Research Foundation Proteinaceous antigens with conformation-independent and conformation-dependent determinants
CA1324094C (en) * 1985-04-03 1993-11-09 Dino Dina Hepatitis a virus vaccines
FI861417A0 (fi) * 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
US5837249A (en) * 1985-04-19 1998-11-17 The Wistar Institute Method for generating an immunogenic T cell response protective against a virus
US4639271A (en) * 1985-04-24 1987-01-27 Moore Business Forms, Inc. Chromogenic mixtures
FR2581394B1 (fr) * 1985-05-02 1988-08-05 Grp Genie Genetique Particules ayant les proprietes immunogenes de l'antigene hbs et portant un site antigenique etranger aux epitopes portes par l'antigene hbs, vecteurs et cellules animales pour la production de telles particules et compositions contenant de telles particules pour la production de vaccins mixtes
US4649192A (en) * 1985-05-30 1987-03-10 Smith Kline-Rit Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate
JPH084507B2 (ja) * 1985-10-03 1996-01-24 武田薬品工業株式会社 新規ｄｎａおよびポリペプチド
US4959323A (en) * 1985-11-04 1990-09-25 Mt. Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Production and use of pre S polypeptides of hepatitis B virus
US4895800A (en) * 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen
US4816564A (en) * 1986-01-31 1989-03-28 Merck & Co., Inc. Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast
US4742158A (en) * 1986-04-25 1988-05-03 Merck & Co., Inc. Purification of hepatitis pre-S antigens by polymerized serum albumin affinity binding
IE59389B1 (en) * 1986-05-23 1994-12-23 Merck & Co Inc Method for producing hepatitis b virus core antigen (HBcAg) in yeast
CA1310602C (en) * 1986-06-03 1992-11-24 Hajime Horii Yeast promoter and process for preparing heterologous protein
AU617292B2 (en) * 1986-06-20 1991-11-28 Scripps Clinic And Research Foundation T and b cell epitopes of the pre-s region of hepatitis b virus surface antigen
US5068185A (en) * 1986-07-10 1991-11-26 Merck & Co., Inc. Trains of yeast for the expression of heterologous genes
IL79740A0 (en) * 1986-08-17 1986-11-30 Yeda Res & Dev Hepatitis vaccine
US4882145A (en) * 1986-12-09 1989-11-21 Scripps Clinic And Research Foundation T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein
US5143726A (en) * 1986-12-09 1992-09-01 The Scripps Research Institute T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein
US4818527A (en) * 1986-12-09 1989-04-04 Scripps Clinic And Research Foundation T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein
EP0278940A3 (en) * 1987-01-30 1988-12-07 Smithkline Biologicals S.A. Hepatitis b virus surface antigens and hybrid antigens containing them
DE10299017I2 (de) * 1987-06-22 2005-05-25 Medeva Holdings Bv Hepatitis-B-Oberfl{chenantigen enthaltendes Peptid.
EP1088830A3 (en) * 1987-06-22 2004-04-07 Medeva Holdings B.V. Hepatitis b surface antigen particles
US4883865A (en) * 1987-09-30 1989-11-28 Merck & Co. Inc. Recovery of pres2+s antigen
US4963483A (en) * 1987-10-13 1990-10-16 Merck & Co., Inc. Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast
US5011915A (en) * 1987-10-26 1991-04-30 Merck & Co., Inc. Process for purifying recombinant hepatitis antigens
US5039522A (en) * 1988-01-29 1991-08-13 New York Blood Center, Inc. Immunogens containing peptides with an attached hydrophobic tail for adsorption to hepatitis B virus surface antigen
NZ229260A (en) * 1988-06-03 1994-02-25 Merck & Co Inc Hepatitis b virus, expression cassette for pre-s domain, host cells and
US5242812A (en) * 1989-02-07 1993-09-07 Bio-Technology General Corp. Method for production and purification of hepatitis B vaccine
US5462863A (en) * 1989-02-09 1995-10-31 Development Center For Biotechnology Isolation of Hepatitis B surface antigen from transformed yeast cells
GB8903313D0 (en) * 1989-02-14 1989-04-05 Wellcome Found Conjugates
ATE159031T1 (de) * 1989-07-25 1997-10-15 Smithkline Biolog Antigene sowie verfahren zu deren herstellung
EP0421626A1 (en) * 1989-09-19 1991-04-10 Merck & Co. Inc. Vaccine for aids and hepatitis B
EP0491077A1 (en) * 1990-12-19 1992-06-24 Medeva Holdings B.V. A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases
US5102989A (en) * 1991-03-15 1992-04-07 Merck & Co., Inc. Method of stabilizing recombinant hepatitis B virus surface proteins from recombinant host cells
IL101653A0 (en) * 1991-04-29 1992-12-30 Merck & Co Inc Multiple hepatitis b virus surface proteins which form particles
CA2067003A1 (en) * 1991-04-29 1992-10-30 Peter J. Kniskern Hbsag escape mutant vaccine
US5840303A (en) * 1991-08-26 1998-11-24 The Scripps Research Foundation Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitis B virus
JP2501186Y2 (ja) * 1992-03-31 1996-06-12 株式会社栗本鐵工所 ハンマ―ミル
CN1094311A (zh) * 1993-04-27 1994-11-02 中国科学院上海生物化学研究所 氨端带前表面抗原决定簇的乙型肝炎表面抗原蛋白
CN1063343C (zh) * 1993-04-27 2001-03-21 中国科学院上海生物化学研究所 氨端带前表面抗原决定簇的乙型肝炎表面抗原蛋白
CN1059927C (zh) * 1994-03-10 2000-12-27 中国科学院上海生物化学研究所 羧端带有前表面抗原1抗原决定簇的乙肝表面抗原融合基因及其编码蛋白
US5792163A (en) * 1996-01-03 1998-08-11 Hitzig; Gary Linear punch

Also Published As

Publication number Publication date
EP0563093B1 (en) 1998-08-26
HUT66437A (en) 1994-11-28
HU9301794D0 (en) 1993-10-28
DK0563093T3 (da) 1999-02-08
US6020167A (en) 2000-02-01
CZ118693A3 (en) 1994-02-16
CA2098021A1 (en) 1992-06-20
WO1992011368A1 (en) 1992-07-09
EP0563093A1 (en) 1993-10-06
US20030235591A1 (en) 2003-12-25
SK280551B6 (sk) 2000-03-13
DE69130071T2 (de) 1999-01-07
EP0563093B2 (en) 2007-10-03
HK1002901A1 (en) 1998-09-25
ES2121000T5 (es) 2008-04-16
KR0156587B1 (en) 1998-10-15
SK63693A3 (en) 1993-10-06
DE69130071T3 (de) 2008-02-21
CZ290233B6 (cs) 2002-06-12
JP3857305B2 (ja) 2006-12-13
ATE170220T1 (de) 1998-09-15
AU657935B2 (en) 1995-03-30
DE69130071D1 (de) 1998-10-01
DK0563093T4 (da) 2008-01-21
ES2121000T3 (es) 1998-11-16
JPH06507303A (ja) 1994-08-25
AU9081791A (en) 1992-07-22
JP2001019643A (ja) 2001-01-23
EP0491077A1 (en) 1992-06-24
CA2098021C (en) 2000-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU657935B2 (en) A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases
US6100065A (en) Hepatitis B surface antigen vaccine
EP0304578B1 (en) Peptide comprising hepatitis B surface antigen
KR100208129B1 (ko) B형 간염 백신
KR100808313B1 (ko) 비형 간염 코어 항원 융합 단백질
KR100815408B1 (ko) 만성 간염용 치료 백신으로서의 안정화된 ＨＢｃ 키메라입자
US20090239265A1 (en) Virus like particles
US20020165172A1 (en) Compositions and methods for treating intracellular diseases
IE69265B1 (en) Chimaeric hepadnavirus core antigen proteins
Murray et al. Protective immunisation against hepatitis B with an internal antigen of the virus
US6297048B1 (en) Hepatitis therapeutics
Pride et al. Evaluation of B and T-cell responses in chimpanzees immunized with Hepagene®, a hepatitis B vaccine containing pre-S1, pre-S2 and S gene products
US5324513A (en) Composition useful for the fabrication of vaccines
AU3610293A (en) Hepatitis therapeutics
WO1998028004A1 (en) Hepatitis delta particle containing a fusion protein immunogen
CN101309931A (zh) 包含截短的hbc核心蛋白和基于皂苷的佐剂的疫苗
Wu et al. A novel hepatitis B virus variant S 129 (Gln→ Leu): Lack of correlation between antigenicity and immunogenicity
WO1988010301A1 (en) Hepatitis b surface antigen vaccine
Murray et al. S.) zyxwvutsrqpo