DE69130071T3 - Zusammensetzung verwendbar als therapeutisches mittel gegen chronische virale leberkrankheiten - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, welche eine Polypeptidsequenz und einen Träger umfasst, zur Bereitstellung eines Heilmittels gegen von Hepatitis-B-Virus verursachte chronische Lebererkrankungen.
  • Mindestens fünf verschiedene Viren, nämlich Hepatitis-Virus A, B, C, D und E, sind in der Lage, den klinischen Aspekt einer akuten Hepatitis hervorzurufen. Anders als bei Hepatitis A und E, welche enteral übertragen werden und zum Tod des Patienten führen können, können Hepatitis B, C (früher bezeichnet als parenterale Non-A-Non-B-Hepatitis) und D in ein chronisches Entzündungsstadium fortschreiten, das seinerseits zu Leberzirrhose und primärem hepatozellulären Karzinom führen kann.
  • Es stehen relativ wenig Daten über Hepatitis C und D, über Verfahren für die Diagnose und ihre Behandlung und über die jeweiligen Viren zur Verfügung. Das Hepatitis-D-Virus ist ein RNA-Virus, welches bekanntermaßen unvollständig ist. Deshalb benötigt es einen Helfervirus, um sich in Patienten zu entwickeln, und wird lediglich in Personen angetroffen, welche mit HBV infiziert sind. Erst vor sehr kurzer Zeit ist das Hepatitis-C-Virus nachgewiesen worden, und ein Antikörpertest (Anti-HCV), der die Diagnose chronischer Hepatitis-C-Infektionen erleichtert, wurde entwickelt. Jedoch besteht ein zunehmend dringlicher Bedarf nach einer Behandlung, um diese Krankheit zu heilen.
  • Dasselbe gilt für chronische Hepatitis B, einer viel besser untersuchten Krankheit hinsichtlich ihrer Erkennung mittels immunologischer Methoden, ihres verursachenden Virus und hinsichtlich des viralen Lebenszyklus und der DNA-Sequenz. Man sagt, dass Patienten chronische Träger des Hepatitis-B-Virus sind, wenn die virale DNA länger als zehn Wochen fortbesteht, das HBe-Antigen (HBeAg) für mehr als zwölf Wochen fortbesteht oder wenn das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg) länger als sechs Monate beständig ist.
  • Ungefähr dreihundert Millionen Menschen sind dazu verdammt, unter chronischer Hepatitis-B zu leiden, wobei die meisten davon im fernen Osten leben.
  • Für diese Menschen scheint das Hauptrisiko, infiziert zu werden, während oder unmittelbar nach der Geburt vorzuliegen, da eine chronisch infizierte Mutter das Virus an ihr Neugeborenes überträgt. 90 Prozent der auf diesem Wege infizierten Kinder werden während ihres späteren Lebens ebenfalls chronisch infiziert werden. In der westlichen Welt tritt die Infektion gewöhnlicher später im Leben, während der Kindheit oder sogar der Erwachsenenzeit, auf, und zwar hauptsächlich durch eine parenterale oder sexuelle Übertragung. In diesen Fällen von Hepatitis-B-Infektion nach der Geburt werden lediglich fünf bis zehn Prozent der Infizierten zu chronischen Trägern. Das übertragene Virus ist allerdings nicht für die von infizierten Menschen aufgezeigten unterschiedlichen Reaktionen verantwortlich, das Virus entweder zu eliminieren oder es lebenslang im Körper zu behalten. Folglich scheint es eine Angelegenheit des immunologischen Zustands zu sein, welcher das zukünftige Körperbefinden bestimmt.
  • Das HB-Virion (Dane-Partikel) ist aus verschiedenen Strukturproteinen aufgebaut, den Kernproteinen und den Oberflächen-(S)-Proteinen. Die letzteren sind Translationsprodukte eines offenen Leserasters, das sich über die codierende Sequenz von drei S-Typ-Domänen erstreckt, von denen jede mit einem ATG-Triplett beginnt, das fähig zur Initiierung der Translation in vivo ist. Die Domänen werden als prä-S1, prä-S2 und S in der Reihenfolge vom 5'- zum 3'-Ende des Moleküls bezeichnet. Es gibt sechs Proteinprodukte, die aus diesem ORF abgeleitet werden: Eine glykosylierte und eine nicht-glykosylierte Form des Hauptproteins (gp27 und p24), welches nur von der S-Domäne translatiert wird (226 Aminosäuren) (hier nachstehend bezeichnet als HBV-S-Peptide), ein mittleres Protein (281 Aminosäuren) mit einer oder zwei Polysaccharidseitenketten (gp33 bzw. gp36), das von der prä-S2- und S-Region codiert wird (hier nachstehend bezeichnet als HBV-S2-Peptide), und schließlich sowohl eine glykosylierte (gp42) und eine nicht-glykosylierte (p39) Form des großen Proteins (389-400 Aminosäuren, abhängig von dem viralen Serotyp), welches durch Translation von prä-S1, prä-S2 und S gebildet wird (hier nachstehend bezeichnet als HBV-S1-Peptide). Die Kernproteine sind HBcAg und HBeAg, wobei das letztgenannte denkbarerweise ein Prozessierungsprodukt von HBcAg ist. Das Kernprotein kann ein prä-Kernpeptid tragen.
  • Das Dane-Partikel, welches das infektiöse Virion ist, umfasst sowohl Kern- als auch Oberflächenproteine, wohingegen die Filamente aus einer Mischung der sechs Oberflächenantigene bestehen. Die HBV-S-, -S2- und -S1-Peptide (wie hierin definiert) assemblieren sich alleine derartig, dass die sogenannten 20-nm-Partikel gebildet werden, welche vollständig uninfektiös sind. Mit dem HB-Virus infizierte Patienten durchlaufen mehrere Stadien der Hepatitis, bevor sie als chronisch HBV-infiziert angesehen werden. Unmittelbar nach der Infektion wird ein infektiöses Stadium folgen, das durch die Gegenwart von HBeAg im Serum gekennzeichnet ist. Fortgesetzte HBs-Antigenämie trotz inhibierter HBV-Replikation deutet auf die Gegenwart viraler DNA-Sequenzen hin, welche in das zelluläre Genom des Patienten integriert sind. Die integrierten viralen Sequenzen befähigen die Wirtszelle nicht, das komplette Virus zu synthetisieren. Allerdings sind Leberzellen mit integrierten HBV-Sequenzen dazu fähig, nur HBeAg herzustellen, welches seinerseits im Serum des Patienten nachweisbar ist und ein Indikator für chronische Hepatitis-B ist. Sehr wahrscheinlich werden die transformierten Hepatocyten nicht von cytotoxischen T-Zellen lysiert, sondern proliferieren und induzieren entweder eine chronisch persistente Hepatitis (CPH) oder eine chronisch aktive Hepatitis (CAH), welche dann zu einer Zirrhose der Leber oder zu einem primären hepatozellulären Karzinom fortschreiten können, was zum vorzeitigen Tod des Patienten führt.
  • Kürzlich wurde festgestellt, dass Patienten, die chronisch HBV-infiziert sind, einen Mangel der endogenen Interferon-Herstellung aufzeigen (Abb et al., 1985: J. Med. Virol. 16. 171-176). Dies war die Begründung, Patienten, die unter chronischer Hepatitis-B leiden, wie angezeigt durch das Vorhandensein von HBeAg und HBV-DNA im Serum, mit Interferon-α (IFNα) zu behandeln. Kontrollierte Versuche mit großen Zahlen von Patienten zeigten, dass die Verabreichung von Interferon-α zu einer signifikant erhöhten Eliminierung des Hepatitis-B-Virus im Vergleich mit Kontrollen führte. Allerdings scheinen Personren, die bei oder um die Zeit der Geburt infiziert wurden, keine Serokonversion in Antwort auf diese Therapie aufzuweisen. Dieses Phänomen schließt unglücklicherweise etwa 75% der Träger von der IFNα-Therapie aus.
  • Gegenwärtig bleibt die exakte Wirkungsweise von Interferon-α auf chronische Hepatitis-B unklar. Seine antivirale Aktivität könnte nicht-infizierte Zellen vor HBV-Infektion schützen oder die virale Transkription, Translation und Replikation in HBV-infizierten Zellen verringern. Interferon besitzt ferner immunomodulatorische Wirkungen durch Aktivierung von T-Zellen, Makrophagen und NK-Zellen und durch Induzieren der Expression von MHC-Klasse I-Proteinen.
  • Eine andere Vorgehensweise zur Behandlung chronischer Hepatitis B basiert auf der Idee, die Replikation des Virus zu inhibieren, womit dessen Verteidigung hinreichend beeinträchtigt würde, um das Wirtsimmunsystem in die Lage zu versetzen, das Virus zu eliminieren. Dies führte zu antiviralen Test-Arzneimitteln, wie Adeninarabinosid und Adeninarabinosidmonophosphat, zur Behandlung von chronisch HBV-infizierten Personen. Allerdings sprachen weniger als die Hälfte der Patienten auf diese Therapie an, und zwar entweder durch eine anhaltende oder vorübergehende Serokonversion (HBeAg+ zu Anti-HBe+). Ein weiterer negativer Aspekt dieser antiviralen Arzneimittel sind ihre immunsuppressiven Eigenschaften.
  • Andere Arzneimittel, die für die Behandlung von chronischen Trägern getestet worden sind, schließen Interferon-β und Acycloguanosin (Acyclovir), Interleukin-2, Steroide, wie Prednisolon, und Kombinationen davon ein. Aber keines von ihnen konnte bessere Ergebnisse als bei der Behandlung mit Interferon-α zur Verfügung stellen. Nur eine Kombinationstherapie, welche die anfängliche Verabreichung von Steroiden, gefolgt von derjenigen von IFNα einschließt, kann die Antwortrate bei ausgewählten Patienten erhöhen.
  • Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass chronisch HBV-infizierte Schimpansen weder durch Behandlung mit HBsAg (gebunden an ein Tetanustoxoid) noch mit Anti-HBs-Antikörpern geheilt werden können. Darüber hinaus wurde versucht, chronisch HBV-infizierte Patienten durch Verabreichung von HBV-S-, -S2- und -S1-Peptiden (wie hierin definiert) zu immunisieren. Diese Behandlung führte noch nicht einmal zur Bildung von Anti-HBs-Antikörper in diesen Personen.
  • Die WO88/10300 beschreibt die Verwendung von Epitopen von HBV, nämlich Peptiden aus dem HBV-Kern, prä-S1- und prä-S2-Regionen, getragen auf einem immunogenen Teilchen, gebildet aus einem sezernierten Peptid, welches die Erzeugung von Antikörpern in einem Tiermodell verursacht. Die EP-A-243913 beschreibt die Anwendung von Peptiden aus den prä-S1-und/oder prä-S2-codierenden Regionen des HBV-Genoms auf einem Träger, um eine Antikörperherstellung hervorzurufen. Jedoch wurde in keiner der obenstehend erwähnten Anmeldungen offenbart, dass die Erzeugung dieser Antikörper irgendeine Auswirkung zur Eliminerung von ruhenden oder latenten Viruspartikeln in Hepatocyten von mit Hepatitis infizierten Tieren besitzt. Im Lichte des obenstehend, zuvor erwähnten Stands der Technik, in welchem Anti-HBs- Antikörper infizierte Schimpansen nicht heilten, erschien ein heilender Effekt als unwahrscheinlich.
  • Zusätzlich sind, gemäß der Definition, chronische Träger des Hepatitis-B-Virus dadurch gekennzeichnet, dass HBsAg in ihrem Serum nachweisbar ist. Deshalb ist es absolut unvorhersehbar gewesen, dass eine Kombination, umfassend ein T-Zell-aktivierendes Epitop, das von der prä-S1-prä-S2-S-Region des HBV-Genoms codiert wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, fähig ist, eine Immunisierung in und eine letztliche Heilung von chronischen Trägern des Hepatitisvirus-B herbeizuführen.
  • Angesichts des oben erörterten Stands der Technik ist es das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein wirksames therapeutisches Mittel für die Behandlung von chronischer Hepatitis-B-Erkrankung zur Verfügung zu stellen, das zu einer vollständigen Antwort führt (d. h. zu einer anhaltenden Inhibition der HBV-Replikation, dem Verlust von HBV-DNA und -DNA-Polymerase und zu einem Absinken und schließlich dem Verschwinden von HBeAg und HBsAg im Serum von Patienten).
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird dieses Ziel erreicht durch eine Kombination von
    • a) mindestens einer Polypeptidsequenz mit einem oder mehreren antigenen T-Zell-aktivierenden Epitopen von dem Hepatitis-B-Virus und
    • b) einem Träger, der zur Präsentation der Epitopsequenz(en) a) in der Lage ist, wobei die Polypeptidsequenz(en) a) am Träger b) durch kovalente oder hyrophobe Bindung gebunden ist/sind.
  • Diese Erfindung richtet sich auf die Verwendung dieser Kombination zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von chronischer viraler Hepatitis.
  • Es ist wichtig, dass die Polypeptidsequenz a), bei welcher es sich um ein oder mehrere verschiedene Polypeptide handeln kann, die Antigenizität eines T-Zell-aktivierenden Epitops auf eine direkte oder indirekte Weise vermittelt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können die Polypeptidsequenz(en) a) ein Polypeptid oder eine Kombination von zwei oder mehreren Polypeptiden des Hepatitis-B-Virus eines jeglichen Subtyps, insbesondere adw, ayw, adr und ady, sein. Die Polypeptidsequenz(en) a) kann/können deshalb die Aminosäuresequenz von einem oder mehreren Vertretern, die aus HB-viralen prä-S1-, prä-S2- oder S-Peptiden (wie hierin definiert) und den HB-Kern-Antigenen gewählt sind, sein.
  • Als Polypeptidsequenz(en) a) sind weiterhin jegliche der oben angegebenen Polypeptide oder eine Kombination von zwei oder mehreren Polypeptiden verwendbar, welche modifiziert sind entweder durch Aminosäuredeletionen, wobei ein mindestens sechs aufeinanderfolgende Aminosäurereste umfassendes Epitop konserviert sein muss, oder durch Hinzufügen weiterer Aminosäuren entweder an dem N-Terminus, dem C-Terminus oder als Insertionen in der/den Polypeptidsequenz(en) a). In jedem dieser Fälle ist es allerdings wesentlich, dass die biologische Aktivität beibehalten wird. Somit kann/können die Polypeptidsequenz(en) a) ein Polypeptid vom Hepatitis-B-Virus sein, modifiziert:
    • i) durch das Vorhandensein von willkürlichen Deletionen, wobei ein mindestens sechs aufeinanderfolgende Aminosäurereste umfassendes Epitop konserviert ist,
    • ii) durch das Vorhandensein von Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren, oder
    • iii) durch das Tragen einer zusätzlichen Aminosäuresequenz an ihrem N-Terminus, an ihrem C-Terminus oder als eine Insertion.
  • Genauer gesagt, kann es sich bei der/den Polypeptidsequenz(en) a) um die Aminosäuresequenz von einem oder mehreren Vertretern, die aus HB-viralen prä-S1-, prä-S2- und S-Peptiden und HB-Kern-Antigenen gewählt sind, modifiziert wie obenstehend, handeln.
  • Um die hydrophobe Bindung oder Verankerung zu unterstützen, wird/werden die Polypeptidsequenz(en) a) vorteilhafterweise myristyliert.
  • Um die passende pharmakologische Aktivität aufzuzeigen, ist es notwendig, dass in der Kombination der vorliegendem Erfindung die Polypeptidsequenz(en) a) auf einem Träger b) präsentiert wird/werden. Dieser Träger besteht aus einer besonderen Substanz, welche zum Beispiel aus Teilchen eines hydrophoben Polymers, aus anorganischen Teilchen oder aus Teilchen eines Polysaccharids bestehen kann. Vorzugsweise ist der Träger b) eine zweite Polypeptidsequenz, welche bei der Sekretion Teilchen bildet, wobei die Teilchen vorzugsweise einen Durchmesser von mindestens 10 nm aufweisen.
  • Es wird bevorzugt, dass die teilchenbildende Polypeptidsequenz b) ein wesentlicher Teil von oder die komplette Aminosäuresequenz eines Polypeptids ist, welches gewählt werden kann aus HBV-S-Peptid (wie hierin definiert), HBV-Kernantigen, HAV-Kernantigen, HAV-Oberflächenantigen, HIV-Oberflächenantigen und HIV-Kernartigen, als auch dem Oberflächenanigen des Poliovirus. Als der teilchenbildende Träger b) wird HBV-S-Peptid und/oder -Kernpeptid bevorzugt.
  • Bei Verwendung als Trägersequenz b) können die obenstehend angegebenen Polypeptide durch willkürliche Deletionen von Aminosäuren, durch Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren oder durch Hinzufügen einer oder mehrerer Aminosäuren entweder an dem N-Terminus, dem C-Terminus oder durch Insertion einer oder mehrer Aminosäuren in die Polypeptidsequenz b) modifiziert werden, vorausgesetzt dass das Teilchenbildungsvermögen erhalten bleibt. Somit kann die Polypeptidsequenz b) ein wesentlicher Teil von oder die komplette Aminosäuresequenz eines Polypeptids sein, das aus HBV-S-Peptid; HBV-Kern-, HAV-Kern- und HIV-Kernantigenen; und Oberflächenantigenen von Poliovirus, HAV und HIV gewählt ist, modifiziert
    • i) durch das Vorhandensein von willkürlichen Deletionen, wobei das Teilchenbildungsvermögen erhalten bleibt,
    • ii) durch das Vorhandensein von Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren oder
    • iii) durch das Tragen einer zusätzlichen Aminosäuresequenz an ihrem N-Terminus, an ihrem C-Terminus oder als eine Insertion.
  • Um die hydrophobe Bindung zu unterstützen, wird die Polypeptidsequenz b) vorteilhafterweise myristyliert.
  • Wenn der Träger b) eine Polypeptidsequenz ist, können die beiden Sequenzen a) und b) über eine oder mehrere der folgenden Wechselwirkungen verknüpft sein: hydrophobe Verankerung (vermittelt durch Myristinsäure), Disulfidbrückenbildung, oder beide Sequenzen können durch eine Peptidbindung verknüpft sein, wodurch ein Fusionspeptid gebildet wird. Im letztgenannten Fall kann wahlweise eine Spacersequenz zwischen den Polypeptidsequenz(en) a) und Polypeptidsequenz b) inseriert werden, wobei die Spacersequenz an beide Polypeptide über Peptidbindungen geknüpft ist.
  • Die Polypeptidsequenz(en) a) bzw. b) können durch Expression eines rekombinanten DNA-Moleküls hergestellt werden. Das rekombinante DNA-Molekül kann für die Kombination von den Polypeptidsequenz(en) a) und b) codieren. Das rekombinante DNA-Molekül kann deshalb mindestens eine erste DNA-Sequenz und gegebenenfalls eine zweite, eine dritte und/oder eine vierte DNA-Sequenz umfassen, wobei
    • i) die mindestens eine erste DNA-Sequenz für mindestens eine Polypeptidsequenz a), wie obenstehend definiert, codiert,
    • ii) die zweite DNA-Sequenz für eine Polypeptidsequenz b) gemäß der obenstehenden Definition des teilchenbildenden Peptids codiert,
    • iii) die dritte DNA-Sequenz für eine Spacersequenz codiert, und
    • iv) die vierte DNA-Sequenz für einen Selektionsmarker codiert, und wobei die DNA-Sequenzen durch für die Expression wesentliche DNA-Elemente gesteuert werden, und gegebenenfalls ein gemeinsames Leseraster aufweisen.
  • Die Polypeptidsequenz(en) a) und die Polypeptidsequenz(en) b) können deshalb auf dem gleichen rekombinanten DNA-Molekül in Tandemanordnung codiert sein. Die Polypeptidsequenz(en) a) und die Polypeptidsequenz(en) b) können daher von einem einzelnen offenen Leseraster auf dem DNA-Molekül exprimiert werden und sind wahlweise durch eine Spacer-Polypeptidsequenz getrennt, die ebenfalls in dem einzelnen offenen Leseraster codiert ist.
  • Bedingt durch die Tatsache, dass viele Aminosäuren durch mehr als ein Triplett bestimmt werden, gibt es mehrere DNA-Sequenzen, die für die obenstehend definierten Peptidsequenzen a) und b) codieren.
  • Daneben können rekombinante DNA-Moleküle, welche sich von den obenstehend definierten rekombinanten DNA-Molekülen durch die Tatsache unterscheiden, dass bis zu 30% der Nukleotide substituiert sein können, verwendet werden.
  • Eine Wirtszelle wird mit einem für die obenstehende Kombination, welche nützlich zur Behandlung von chronisch HBV-infizierten Patienten ist, codierenden rekombinanten DNA-Molekül transfiziert. Diese Wirtszelle kann eine Säuger-, eine Hefe- oder eine Bakterienzelle sein. Für den Zweck dieser Erfindung wird es bevorzugt, dass diese Zelle keinerlei humane Serumproteine oder jedewede Primaten-Serumproteine herstellt, außer die Polypeptid(e), welche innerhalb der obenstehenden Kombination eingeschlossen sind.
  • Der Begriff "HBV-S-Peptid", wie hierin verwendet, bezeichnet das Peptid, welches von der gesamten S-Region des HBV-Genoms codiert wird, d.h. unter Ausschluß der prä-S1- und prä-S2-Regionen. Der Begriff "HBV-prä-S2-Peptid", wie hierin verwendet, bezeichnet das von den gesamten prä-S2- und S-Regionen des HBV-Genoms codierte Peptid. Der Begriff "HBV-prä-S1-Peptid", wie hierin verwendet, bezeichnet das Polypeptid, welches von den gesamten prä-S1-, prä-S2- und S-Regionen des HBV-Genoms codiert wird. Der Begriff "Epitop", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Sequenz von mindestens sechs aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die von der angegebenen Genomregion codiert werden (z.B. bezeichnet ein "HBV-prä-S2-Epitop" eine Sequenz von mindestens sechs Aminosäuren, die von der prä-S2-Region des HBV-Genoms codiert werden). Der Begriff "T-Zell-Epitop", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Epitop, das mit Rezeptoren auf der Oberfläche von T-Zellen interagiert, um eine Immunantwort zu steigern oder anderweitig zu bewirken.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet "Antigenizität" das Vermögen, eine Immunantwort hervorzurufen (z. B. durch Wirken als ein Antigen), das Vermögen, die Herstellung von Antikörpern zu verursachen (z. B. durch Wirken als Antigen) und/oder das Vermögen, mit einem Zelloberflä chenrezeptor wechselzuwirken, um eine Immunantwort oder die Herstellung von Antikörpern zu erhöhen.
  • Der Begriff "HBV" bedeutet jedweden Subtyp des Virus, insbesondere adw, ayw, adr und ayr, beschrieben in der Literatur (P. Valenzuela, Nature, Band 280, S. 815 (1979), Gerlich, EP-A-85 111 361 , Neurath, EP-A-85 102 250 ). Beispiele für Peptidsequenzen davon, welche die Po1ypeptidsequenz(en) a) bilden, die die Antigenizität eines oder mehrerer Epitope vermitteln, sind in der Sequenzauflistung (SEQ ID-Nr. 17-20, 22) gezeigt.
  • Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die folgenden Kombinationen:
    • – HBV-S-Antigenteilchen mit spezifischen Epitopen (Determinanten) der prä-S1-, prä-S2- und/oder Kernpeptide;
    • – HBV-Kern-Antigenteilchen mit spezifischen Epitopen (Determinanten) der prä-S1-, prä-S2-, S-Peptide und/oder der Kernantigene;
    • – Hepatitis-A-Antigenteilchen mit spezifischen Epitopen (Determinanten) von den Hepatitis-B-S-, -prä-S1-, -prä-S2- und/oder -Kernpeptiden.
  • Für die vorliegende Erfindung bevorzugte rekombinante DNA-Moleküle sind gekennzeichnet durch das Vorhandensein von Sequenzen, welche für Polypeptidsequenz(en) a), die die Antigenizität eines oder mehrerer T-Zell-Epitope vermitteln, und für das Polypeptid b), das bei der Sekretion Teilchen mit einem Durchmesser von 10 nm oder mehr bildet, codieren, wobei beide davon unter der Steuerung eines geeigneten Promotors stehen. Als Beispiele von für a) codierenden Sequenzen kann jegliche der Sequenzen erwähnt werden, welche unter den ID-Nummern 1 bis 24 in der Sequenzauflistung aufgeführt sind. Beispiele der DNA-Sequenz, die für die Polypeptidsequenz b) codiert, sind durch jedewede der ID-Sequenzen 25 bis 27 oder 35 in der Sequenzauflistung repräsentiert.
  • Jede der 24 Sequenzen (ID-Nummern 1 bis 24) kann mit jeder Sequenz kombiniert werden, die unter ID-Nummer 25 bis 27 in der Sequenzauflistung beschrieben ist, wobei sowohl die Reihenfolgen a-b als auch b-a eingeschlossen sind.
  • Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine Kombination der Epitop-Sequenz ID-Nr. 28 (entsprechend der Sequenz, welche die Aminosäuren 9 bis 28 der S1-Sequenz von HBV beinhaltet) in Kombination mit Sequenz ID-Nr. 26 und/oder 27 als einem Teilchenbildner.
  • Hepatitis-Virussequenzen, die in dem rekombinanten DNA-Konstrukt verwendet werden, können auf jeglichem Wege gebildet oder isoliert werden, einschließlich der Isolierung und Ligation von Restriktionsfragmenten, chemischer Synthese von Oligonukleotiden unter Verwendung eines Synthesizers (Cyclon, BioSearch) und Synthese durch das PCR-Verfahren (T.J. White, N. Arnleim, H.E. Erlich, 1989; The Polymerase Chain Reaction, Technical Focus 5 (6)).
  • Bevorzugte rekombinante DNA-Moleküle wurden durch die Ligation von synthetischen Oligonukleotiden an ein 5'-XbaI-BglII-3'-Fragment (ID-Nummer 27) aus der S-Region des HBV-Genoms, welches abgeleitet ist aus einem BglII-BglII-HBV-Fragment, das die gesamte prä-S1-prä-S2-S-Region einschließt, oder Ligation an die gesamte S-Region gebildet. Bei der Herstellung derartiger Konstrukte verwendete Oligonukleotide sind in der nachstehenden Tabelle I zusammengefasst. Tabelle I
    Funktion Definition SEQ ID-Nr.
    Kern (adw) aa* 59-87 6
    Kern (adw) aa 2-28 7
    Kern (adw) aa -10-28 8
    Kern (adw) aa 29-58 9
    Kern (adw) aa 1-87 10
    Kern (adw) aa -10-87 11
    Kern (adw) aa 70-110 12
    Kern (adw) aa 80-125 13
    Kern (adw) aa 88-120 15
    S1 (ayw) aa 9-28 17
    S1 (ayw) aa 83-103 18
    S1 (ayw) aa 20-40 19
    S1 (ayw) aa 59-94 20
    S1 (adw) aa 94-114 21
    S1 (adw) aa 70-105 22
    S2 (ayw) aa 2-21 23
    S2 (ayw) aa 14-33 24
    • *aa = Aminosäure
  • Andere bevorzugte DNA-Moleküle wurden durch Ligation von Kern-Sequenzen, welche durch das PCR-Verfahren hergestellt werden und welche für T-Zell-Epitope codieren, an die Kern-Sequenz von HBV (SEQ ID-Nr.: 25), die als Polypeptidsequenz b) fungiert, gebildet. Die bei der Herstellung dieser Konstrukte verwendeten Oligonukleotide sind in der Tabelle II-1 angegeben. Tabelle II-1
    Funktion Definition SEQ ID-Nr.
    Kern komplett, bp 1901-2500 1
    Kern C-terminale Deletion, bp 1901-2405 2
    Kern C-terminale Deletion und inseriertes Stop-Codon, bp 1901-2405 3
    Kern/prä-Kern 10 aa prä-Kern, C-terminale Deletion, bp 1871-2405 4
    Kern/prä-Kern 10 aa prä-Kern, C-terminale Deletion und inseriertes Stop-Codon, bp 1871-2405 5
    Kern aa (-10-120) 16
    Kern/prä-Kern 10 aa prä-Kern, kompletter Kern, bp 1871-2500 35
  • Die Tabelle II-2 zeigt mehrere Beispiele, worin die T-Zell-Epitop-codierenden DNA-Sequenzen durch Restriktionsfragmentierung des HBV-Genoms isoliert worden sind und an die DNA-Sequenz ligiert wurden, welche für die Polypeptidsequenz b), wie oben definiert, codiert. Tabelle II-2
    Funktion Definition SEQ ID-Nr.
    Kern/prä-Kern komplett, bp 1403-31 **
    S2 ay/ad **
    S2 (K) ay/ad S2-S, 7 Codons deletiert, Startcodon ATG verändert zu ATA 14
    • ** Sequenz wurde veröffentlicht von Galibert, F., et al., (1979: Nature 281, 646-650) und von Ono, Y., et al., (1983: Nucl. Acid Res. 11 (6), 1747-1757)
  • In der Tabelle II-3 sind spezifische rekombinante DNA-Moleküle aufgelistet. Das Verfahren für ihre Konstruktion wird in den Beispielen ausführlicher beschrieben werden. Tabelle II-3
    End-Konstrukt T-Zell-Epitop Teilchenbildner Selektionsgen
    MT-Kern (-10-120) + SAg + neo Kern (aa -10-120) S adw/ayw oder S/XbaI/BglII neo
    MT-S1(aa 9-28)-S + egpt S1 (aa 9-28) ay S adw/ayw oder S/XbaI/BglII egpt#
    MT-Kern-neo Kern/prä-Kern bp 1403-31 Kern adw neo
    MT-Kern (1-87) + HBsAg – neo Kern (aa 1-87) S adw/ayw oder S/XbaI/BglII neo
    • # egpt = E. coli-Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase
  • Bevorzugte rekombinante DNA-Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, neben den für die Polypeptide a) und b) codierenden Regionen, eine zusätzliche DNA-Sequenz, welche für einen Selektionsmarker codiert. Darüber hinaus umfassen sie alle üblichen für die Expression wesentlichen Elemente, wie Promotorsequenz, Start-Codon und ein Polyadenylierungssignal.
  • Beispiele von geeigneten Promotoren sind der Methallothionein (MT)-, der U2- und der H2K-Promotor im Falle der Verwendung von Säugerzellen als Wirtszelle. Wenn Hefe- oder Bakterienzellen angewandt werden sollen, können jeweils geeignete Hefe- bzw. Bakterienpromotoren, wie der GCN4- und der GAL 1/10-Promotor oder die prokaryotischen trp- und tac-Promotoren verwendet werden.
  • Um die Kombination von Polypeptid(en) a) und Polypeptid b) gemäß dieser Anmeldung herzustellen, wird das rekombinante DNA-Molekül in Wirtszellen durch Transfektion (im Falle von Säugerzellen), durch Transformation (im Falle von Hefe- und Bakterienzellen) oder auf anderem Wege eingeführt. Als Wirt können Zellen eines jeglichen Organismus verwendet werden, welche fähig zur Transkription und Translation rekombinanter DNA-Moleküle sind, wie Säuger-, Bakterien- und Hefe-Zellen.
  • Geeignete Säugerzellen gemäß dieser Erfindung sind zum Beispiel VERO-Zellen (eine Affennierenzelllinie), 3T3-, C127- und L-Zellen (Mäuse-Fibroblastenzelllinien) und CHO (chinesische Hamsterovar-)Zellen, welche bezüglich Dehydrofolatreduktase entweder positiv oder negativ sind.
  • Gemäß einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es weiterhin möglich, dass die obenstehend definierte erste DNA-Sequenz und die obenstehend definierte zweite DNA-Sequenz, welche für die Polypeptidsequenz(en) a) bzw. für eine Polypeptidsequenz b) codieren, in verschiedenen rekombinanten DNA-Molekülen vorhanden sind, in welchem Falle die Wirtszellen mit beiden dieser rekombinanten DNA-Moleküle cotransfiziert werden. Tabelle III Mögliche Alternativen von Zusammensetzungen für Teilchen mit T-Zell- Epitopen, die auf chronische Hepatitis-Träger abzielen.
    End-Konstrukt Promoter T-Zel SYN 1-Epitop PCR GEN Teilchen- Bildner Selektionsgen Reinigung
    12 MT/H2/U2 Kern(AA-10-+87) gesamtes Sadw/ayw S/XbaI/BglII neo/egpt
    13 MT/H2/U2 Kern(AA70-110) gesamtes Sadw/ayw S/XbaI/BglII neo/egpt
    14 MT/H2/U2 Kern(AA80-125) gesamtes Sadw/ayw S/XbaI/BglII neo/egpt
    15 MT/H2/U2 Kern(AA88-120) gesamtes Sadw/ayw S/XbaI/BglII neo/egpt
    16 MT/H2/U2 Kern(AA-10+SATG+ AA2-87) gesamtes Sadw/ayw S/XbaI/BglII neo/egpt
    17 MT-Kern(10-+120)+SAg+neo MT/H2/U2 Kern(AA -10-+120) gesamtes Sadw/ayw S/XbaI/BglII neo/egpt
    18 MT-S1(AA9-28)-S+egpt MT/H2/U2 S1-(AA9-28)(ay) gesamtes Sadw/ayw S/XbaI/BglII neo/egpt
    19 MT/H2/U2 S1-(AA83-103)(ay) gesamtes Sadw/ayw S/XbaI/BglII neo/egpt
    20 MT/H2/U2 S1-(AA20-40)(ay) gesamtes Sadw/ayw S/XbaI/BglII neo/egpt Material und Methoden
    21 MT/H2/U2 S1-(AA59-9) gesamtes Sadw/ayw S/XbaI/BglII neo/egpt
    22 MT/H2/U2 S1-(AA94-114)(ad) gesamtes Sadw/ayw S/XbaI/BglII neo/egpt
    23 MT/H2/U2 S1-(AA70-105)(ay) gesamtes Sadw/ayw S/XbaI/BglII neo/egpt
    24 MT/H2/U2 S1-(AA9-28)(ay) Kernadw neo/egpt
    25 MT/H2/U2 S2-(AA2-21)(ay) gesamtes Sadw/ayw S/XbaI/BglII neo/egpt
    26 MT/H2/U2 S2-(AA14-33)(ay) gesamtes Sadw/ayw S/XbaI/BglII neo/egpt
    27 MT/H2/U2 S2ayw Sayw/adw neo/egpt
    28 MT/H2/U2 Adapter S2(K)-ayw Sayw/adw neo/egpt
    Tabelle III Mögliche Alternativen von Zusammensetzungen für Teilchen mit T-Zell-Epitopen, die auf chronische Hepatitis-Träger abzielen.
    End-Konstrukt11 1 Promoter22 SYN T-Zell-Epitop PCR GEN Teilchen-Bildner Selektionsgen Reinigung3
    1 MT/H2/U2 Kern ohne prä-Kern Kern(adw) neo/egpt
    z.B. bp 1901-2500
    2 MT/H2/U2 Kern ohne prä-Kern; mit Deletion des C-Terminus+ Kern(adw) neo/egpt
    z.B. bp 1901-2405
    3 MT/H2/U2 Kern ohne prä-Kern; mit Deletion des C-Terminus+ Stopsignal Kern(adw) neo/egpt
    z.B. bp 1901-2405
    4 MT-Kern-neo MT/H2/U2 Kern und prä-Kern 10AA Kern mit prä-Kern Kern(adw) neo/egpt Material und Methoden
    d.h. bp 1403-31
    5 MT/H2/U2 Kern und prä-Kern 10AA mit Deletion am C-Terminus Kern(adw) neo/egpt
    z.B. 1871-2405
    6 MT/H2/U2 Kern und prä-Kern; mit Deletion des C-Terminus+ Stopsignal Kern(adw) neo/egpt
    z.B. bp 1871-2405
    7 MT/H2/U2 Kern(AA59-87) gesamtes Sadw/ayw S/XbaI/BglII neo/egpt
    8 MT/H2/U2 Kern(AA2-28) gesamtes Sadw/ayw S/XbaI/BglII neo/egpt
    9 MT/H2/U2 Kern(AA-10-+28) gesamtes Sadw/ayw S/XbaI/BglII neo/egpt
    10 MT/H2/U2 Kern(AA29-58) gesamtes Sadw/ayw S/XbaI/BglII neo/egpt
    11 MT-Kern(1-87) +HBsAg-neo MT/H2/U2 Kern(AA 1-87) gesamtes Sadw/ayw S/XbaI/BglII neo/egpt
    • Anmerkungen: 1: siehe Beispiel 3 2: jeder der angegebenen Promotoren ist geeignet 3: siehe Beispiele
  • Die Tabelle III gibt einen Überblick darüber, wie man geeignete DNA-Sequenzen kombiniert, um DNA-Konstrukte gemäß der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Es sollte angemerkt werden, dass jegliche in dieser Tabelle beschriebene Bestandteile kombiniert werden können, um eine DNA-Sequenz bereitzustellen, welche, wenn in eine Wirtszelle eintransfiziert, herangezogen werden kann, um eine Kombination (umfassend die Polypeptid(e) a) und b)) als Medikament für die Behandlung von chronischer Hepatitis B herzustellen. Die für die T-Zell-Epitopsequenzen codierenden DNA-Sequenzen wurden synthetisch (SYN) mit einem Biosearch Cyclon-Synthesizer, durch eine PCR-Vorgehensweise (PCR) oder durch Restriktionsenzym-Fragmentierung des viralen Genoms (GEN) hergestellt.
  • Für die Behandlung von Patienten, die unter chronischer viraler Hepatitis leiden, kann die Kombination von Polypeptidsequenz(en) a) und einem Träger b) in irgendeinem Typ einer pharmazeutischen Zusammensetzung zubereitet werden, welche darüber hinaus ein geeignetes Verdünnungsmittel oder pharmazeutisches Trägermaterial, wie eine Pufferlösung, umfasst.
  • Die Verabreichung kann durch jedwedes Verfahren bewirkt werden, d.h. durch parenterale (z.B. intravenöse oder intramuskuläre) oder orale (z.B. unter Verwendung typhoider Bakterienzellen zur Einkapselung der aktiven Substanz) Verabreichung.
  • Die pharmazeutische Zubereitung umfasst die obenstehend beschriebene Kombination in ausreichender Konzentration, um eine Antwort nach der Verabreichung hervorzurufen.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • I zeigt ein DNA-Konstrukt, codierend für einen Promotor, eine Teilchenbildnersequenz und ein Selektionsgen (beschrieben in Beispiel 3/4).
  • II zeigt ein DNA-Gen-Konstrukt, enthaltend einen Promotor, ein Epitop mit dem gesamten HB-S-Ag und ein Selektionsgen (beschrieben in Beispiel 3/18).
  • III zeigt ein DNA-Konstrukt, das einen Promotor, ein T-Zell-Epitop mit einem Teilchenbildner-Rest und ein Selektionsgen aufzeigt (beschrieben in Beispiel 3/21).
  • IV zeigt die AST-Werte von Schimpanse 1 während der Hepa-Care-Behandlung (beschrieben in Beispiel 10/1).
  • V zeigt die Antigenwerte von Schimpanse 1 während der Hepa-Care-Behandlung (beschrieben in Beispiel 10/1).
  • VI zeigt Werte von Leberenzymen ALT und GGT von Schimpanse 1, der dreimal mit Hepa-Care booster-behandelt worden ist (beschrieben in Beispiel 10/2).
  • VII zeigt Werte von Leberenzymen ALT, AST und GGT und von Antigen von Schimpanse 2 während der Hepa-Care-Behandlung (beschrieben in Beispiel 10/3).
  • VIII zeigt die Leberenzyme, wie bei einem unbehandelten Kontroll-Schimpansen bestimmt (beschrieben in Beispiel 10/3).
  • IX & X zeigen die Antigen- bzw. Antikörpertiter von Patient 1 während der Hepa-Care-Behandlung (beschrieben in Beispiel 11).
  • XI & XII zeigen die Antigen- bzw. Antikörpertiter von Patient 2 während der Hepa-Care-Behandlung (beschrieben in Beispiel 11).
  • XIII & XIV zeigen die Antigen- bzw. Antikörpertiter von Patient 2 während der Hepa-Care-Behandlung (beschrieben in Beispiel 11).
  • Die Erfindung wird spezifischer durch die folgenden Beispiele beschrieben.
  • Beispiel 1
  • 1. Fraktionierte Präzipitation mit Polyethylenglykol (PEG)
  • Der Überstand von HBV-Protein-herstellenden Kulturen wurde gesammelt und in Portionen von 2400 ml aufgeteilt. Zu jeder Portion wurden 144 g PEG-6000 (Serva) zugegeben und durch 20 Minuten langes Rühren bei Raumtemperatur aufgelöst, und es wurde weitere 6 Stunden lang bei 4°C gerührt. Der Niederschlag wurde durch 30 Minuten lange Zentrifugation in 500 ml großen Flaschen in einem GS3-Rotor bei 9000 U/min (15000 × g) bei 10°C abgetrennt. Der Überstand wurde gesammelt und 144 g PEG-6000 wurden zugegeben und wie obenstehend beschrieben aufgelöst. Die Lösung wurde 3 Stunden lang bei 4°C gerührt. Der Niederschlag aus dieser Lösung wurde wie obenstehend beschrieben gewonnen, außer dass die Zentrifugation 60 Minuten lang fortgesetzt wurde.
  • 2. Gelchromatographie
  • Das nach PEG-Fällung erhaltene Material wurde in 20 ml PBS erneut gelöst und einer Gelchromatographie auf A-5m (BioRad) unterzogen. Die Säulenabmessungen waren 25 × 1000 mm und 480 ml Bettvolumen. In einem typischen Fraktionierungsdurchlauf wurden 1000 μg PEG-präzipitiertes HBV-Protein in 10 bis 15 ml geladen und mit PBS bei einer Geschwindigkeit von 6 Tropfen/Minute (18 ml/h) eluiert. Es wurden 3 ml große Fraktionen aufgefangen. Das HBV-Protein eluierte mit dem ersten Peak. Die gesammelten Fraktionen wurden einem CsCl-Gradienten unterzogen.
  • 3. Sedimentation im CsCl-Gradienten
  • Etwa 30 Fraktionen, welche den ersten Peak in der Säulenchromatographie auf A-5m überspannen und vorgereinigtes HBV-Protein enthalten, wurden auf etwa 100 ml gesammelt bzw. zusammengefasst. Diese Lösung wurde mit CsCl auf eine Dichte von 1,30 g/cm3 eingestellt und anschließend in ein Polyallomerröhrchen-Verbindungsstück in einen SW 27/28-Rotor (Beckman) überführt. Ein Gradient wurde gesetzt, indem 4 ml einer CsCl-Lösung von 1,35 g/cm3 unterschichtet und 4 ml von 1,25 g/cm3, gefolgt von 4 ml von 1,20 g/cm3 Dichte überschichtet wurden. Dieser Gradient wurde 50 Stunden lang bei 28 000 U/min bei 10°C laufen gelassen. Danach wurde der Gradient fraktioniert und gereinigtes HBV-Protein, das in der Schicht von 1,20 g/cm3 Dichte schwebte, wurde abgesammelt. Die Lösung wurde durch drei Dialysezyklen in Beuteln gegen Wasser entsalzt.
  • Beispiel 2
  • Quantitative Bestimmung von HBV-Protein
  • 1. mittels Radioimmunoassay
  • Im AUSRIA II-125-"Sandwich"-Radioimmunoassay (im Handel erhältlich von Abbot) wurden Perlen, die mit Meerschweinchen-Antikörper gegen Hepatitis-B-Oberflächenantigen (Anti-HBs) beschichtet waren, mit Serum oder Plasma oder gereinigtem Protein und geeigneten Kontrollen inkubiert. Jedwedes vorhandene HBsAg wurde an den Festphasen-Antikörper gebunden. Nach Absaugen des ungebundenen Materials und Waschen der Perlen wurde humanes 1251-Anti-HBs mit dem Antikörper-Antigen-Komplex auf den Perlen reagieren gelassen. Die Perlen wurden dann gewaschen, um ungebundenes 125I-Anti-HBs zu entfernen.
    • )-Anti-HBs HBsAg
    • )-Anti-HBs.HBsAg 125I-Anti-HBs
    • )-Anti-HBs.HBsAg.125I-Anti-HBs
  • Die auf den Perlen verbleibende Radioaktivität wurde in einem Gamma-Szintillationszähler gezählt.
  • 2. mittels ELISA
  • Im Enzygnost-HBsAg-Mikro-"Sandwich"-Assay (im Handel erhältlich von Behring) wurden Vertiefungen mit Anti-HBs beschichtet. Serum, Plasma oder gereinigtes Protein und geeignete Kontrollen wurden den Vertiefungen zugegeben und inkubiert. Nach dem Waschen wurden Peroxidase-markierte Antikörper gegen HBsAg mit den verbleibenden antigenen Determinanten zur Reaktion gebracht. Die ungebundenen Enzym-verknüpften Antikörper wurden durch Waschen entfernt und die Enzymaktivität auf der Festphase wurde ermittelt. Die enzymatisch katalysierte Reaktion von Wasserstoffperoxid und Chromogen wurde durch Zugeben von verdünnter Schwefelsäure angehalten. Die Farbintensität war proportional zur HBsAg-Konzentration der Probe und wurde durch photometrisches Vergleichen der Farbintensität der unbekannten Proben mit den Farbintensitäten der begleitenden Negativ- und Positivkontollseren erhalten.
  • Beispiel 3
  • Herstellung von Genkonstrukten der vorliegenden Erfindung, welche Promotor, gewünschte Antigensequenzen und Selektionsgen enthalten.
  • 1. Isolierung des MT-Promotors.
  • Das Plasmid pBPV-342-12 (ATCC 37224) wurde mit den Endonukleasen BglII und BamHI verdaut. Es wurden drei DNA-Moleküle erzeugt. Das Fragment von Interesse enthält den Metallothionein-Promotor und eine pBR322-Sequenz, umfassend 4,5 kb, und ist leicht aus den anderen Fragmenten (2,0 kb und 7,6 kb Größe) nachzuweisen.
  • Die Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 200 μl Reaktionspuffer bei einer Endkonzentration von 0,5 μg/μl DNA einschließlich 100 Units eines jeden Restriktionsenzyms durchgeführt. Die Vervollständigung des Verdaus wurde nach dreistündiger Inkubation bei 37°C durch Agarosegelelektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel überprüft. Die Reaktion wurde durch Zugeben von 4 μl 0,5 M EDTA gestoppt.
  • Das 4,5 kb große Fragment wurde von den anderen Fragmenten durch präparative 1,2%ige Agarosegelelektrophorese getrennt. Die DNA wurde aus dem Agarosegel auf DE-81-Whatman-Filterpapier eluiert, aus welchem die DNA in einem Hochsalzpuffer entfernt wurde. Die DNA wurde durch eine Phenol/Chloroform-Extraktion und zwei Ethanolfällungen gereinigt.
  • 2. Ligation eines für das HBV-Kern-Antigen codierenden 1,8 kb großen Fragmentes.
  • Ein 1,8 kb großes BamHI-BamHI-Fragment, enthaltend die HBV-Kern-codierenden Regionen, wurde aus HBV-enthaltender DNA isoliert. Dieses Fragment wurde mit dem 4,5 kb großen Fragment mit dem MT-Promotor und dem pBR-Rest (beschrieben in 1) zusammenligiert.
  • Zwei μl des 1,8 kb großen Fragmentes wurden mit 3 μl des 4,5 kb großen Fragmentes gemischt und in einem Gesamtvolumen von 10 μl Ligationspuffer, der 2 Units T4-DNA-Ligase und 2 mM ATP enthielt, bei 14°C über Nacht zusammenligiert.
  • Die Ligationsmischung wurde für die DNA-Aufnahme zu 150 μl einer Suspension von kompetenten Bakterienzellen hinzugesetzt. Nach der DNA-Aufnahme wurden die Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, welche 50 μl/ml Ampicillin enthielten, bei Volumina von 50 bis 300 μl Zellsuspension pro Platte aufgebracht. Die Agarplatten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Einzelne isolierte Bakterienkolonien wurden hinsichtlich des Vorhandenseins eines Plasmids mit den gewünschten Fragmenten gescreent.
  • 3. Screenen nach den das gewünschte Plasmid enthaltenden Bakterienkolonien
  • Einzelne Kolonien wurden mit einem Zahnstocher aufgenommen und in ein Röhrchen (5 ml) mit LB-Ampicillin-Medium überführt. Die Röhrchen wurden über Nacht bei 37°C in einer Umge bung unter schnellem Schütteln inkubiert. Eine Mini-Plasmidpräparation jeder herangewachsenen Bakteriensuspension wurde durchgeführt. Die verschiedenen resultierenden DNAs wurden durch Verdau mit der Restriktionsendonuklease BglII überprüft. Es wurden zwei Moleküle erwartet, ein 400 bp großes Fragment und ein 5,9 kb großes Fragment. Der Verdau wurde durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Plasmid-DNA wurde aus den Bakterienzellen isoliert.
  • 4. Insertion eines Neomycin-Selektionsmarkers
  • Das aus obenstehendem (3) resultierende Plasmid wurde durch Verdau mit dem Restriktionsenzym EcoRI linearisiert. Die Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 50 μl und bei einer Endkonzentration von 1 μg/μl Plasmid-DNA durchgeführt. Es wurden 50 Units EcoRI zugesetzt und der Verdau wurde nach 3 Stunden langer Inkubation bei 37°C durch Agarosegelelektrophorese überprüft. Die Reaktion wurde durch Zusetzen von 1 μl 0,5 M EDTA gestoppt und die DNA wurde mit einer Endkonzentration von 0,3 M Natriumacetat und 3-4 Volumen Ethanol 30 Minuten lang bei –80°C gefällt. Die gefällte DNA wurde in 50 μl destilliertem Wasser gelöst.
  • 2 μl des linearisierten Plasmids wurden mit 3 μl des DNA-Fragments mit dem Metallothionein-Promotor und dem Neomycin-Selektionsgen (isoliert aus dem Plasmid pMT-neo-E (erhältlich von ATCC/Exogene) durch Verdau mit der Endonuklease EcoRI als ein 3,9 kb großes Fragment) gemischt und zusammenligiert. Einzelne Bakterienkolonien wurden hinsichtlich des Vorhandenseins des gewünschten Plasmids gescreent.
  • 5. Isolierung eines Fragments, das die U2-Promotorsequenz enthält.
  • Das Plasmid pUC-8-42 (erhältlich von Exogene) wurde mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und ApaI verdaut. Es wurden zwei DNA-Moleküle erzeugt. Das Fragment von Interesse enthält den U2-Promotor, der 340 bp umfasst, und ist leicht von dem anderen Fragment (3160 bp) nachzuweisen. Der Verdau wurde in einem Gesamtvolumen von 200 μl Reaktionspuffer bei einer Endkonzentration von 0,5 μg/μl DNA einschließlich 100 Units eines jeden Restriktionsenzyms durchgeführt. Die Vervollständigung des Verdaus wurde nach dreistündiger Inkubation bei 37°C durch Agarosegelelektrophorese in einem 0,7%igen Agarosegel überprüft. Die Reaktion wurde durch Zugeben von 4 μl 0,5 M EDTA gestoppt. Das 340 bp große Fragment wurde von der Plasmid-DNA durch präparative 1,2%ige Agarosegelelektrophorese getrennt. Die DNA wurde aus dem Agarosegel auf DE-81-Whatman-Filterpapier eluiert, aus welchem die DNA in einem Hochsalzpuffer entfernt wurde. Die DNA wurde durch eine Phenol/Chloroform-Extraktion und zwei Ethanolfällungen gereinigt.
  • 6. Insertion des Fragments mit der Promotorsequenz in ein Polylinker-Plasmid
  • Das Plasmid pSP 165 (im Handel erhältlich von Promega Biotec), enthaltend eine Polylinkersequenz (mit den folgenden Restriktionsstellen: EcoRI, SacI, SmaI, AvaI, BamHI, BglII, SalI, PstI, HindIII), wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI linearisiert. Die Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 50 μl und bei einer Endkonzentration von 1 μg/μl Plasmid-DNA durchgeführt. 50 Units EcoRI wurden zugesetzt und der Verdau wurde nach dreistündiger Inkubation bei 37°C durch Agarosegelelektrophorese überprüft. Die Reaktion wurde durch Zusetzen von 1 μl 0,5 M EDTA gestoppt und die DNA wurde mit einer Endkonzentration von 0,3 M Natriumacetat und 3-4 Volumen Ethanol 30 Minuten lang bei –80°C gefällt. Die gefällte DNA wurde in 50 μl destilliertem Wasser gelöst.
  • 2 μl der Plasmid-DNA wurden mit 10 μl der Fragment-DNA mit der U2-Promotorsequenz vermischt und in einem Gesamtvolumen von 25 μl Ligationspuffer, enthaltend 2 Units T4-DNA-Ligase und 2 mM ATP, bei 14°C über Nacht zusammenligiert. Danach wurde die DNA durch Phenol/Chloroform-Extraktionen, gefolgt von zwei Ethanolfällungen, gereinigt und in 10 μl destilliertem Wasser gelöst. Die resultierenden überhängenden Enden von EcoRI und ApaI mußten in glatte Enden umgewandelt und ligiert werden. Die überhängenden Enden wurden wie folgend durch Reaktion mit der Mung-Bean-Nuclease in glatte Enden umgewandelt: zu 25 μl DNA (Konzentration 1 μg/μl) in Reaktionspuffer wurden 20 Units Enzym zugesetzt, um eine Endkonzentration von 1% Glycerin und ein Endreaktionsvolumen von 35 μl zu ergeben. Nach einer 30 Minuten langen Inkubation bei 30°C wurde die DNA durch Phenol/Chloroform-Extraktionen, gefolgt von zwei Ethanolfällungen, gereinigt. Die DNA wurde erneut in 5 μl destilliertem Wasser gelöst. Die resultierenden glatten Enden wurden in 15 μl Reaktionsvolumen mit 10 × mehr T4-Ligase, als obenstehend verwendet, und 2 mM ATP bei 14°C über Nacht zusammenligiert.
  • Die Ligationsmischung wurde für die DNA-Aufnahme zu 150 μl Suspension von kompetenten Bakterienzellen hinzugesetzt. Nach der DNA-Aufnahme wurden die Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, welche 50 μg/ml Ampicillin enthielten, bei Volumina von 50 bis 300 μl Zellsuspension pro Platte ausgebreitet. Die Agarplatten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Einzelne isolierte Bakterienkolonien wurden hinsichtlich des Vorhandenseins eines Plasmids mit dem gewünschten U2-Promotorfragment gescreent. Das resultierende Plasmid wurde aus den Bakterienzellen isoliert und durch Restriktionsenzymanalyse charakterisiert.
  • 7. Ligation des synthetischen Oligo-DNA-Nukleotides 89 (SEQ ID-Nr.: 30) an das MT-Promotorfragment (4,5 kb).
  • Das 4,5 kb große Fragment (beschrieben in 1) mit dem MT-Promotor und einem pBR-Rest wurde mit dem synthetischen Oligonukleotid 89 (SEQ ID-Nr.: 30) zusammenligiert. Die Ligationsmischung wurde für die DNA-Aufnahme zu 150 μl Suspension von kompetenten Bakterienzellen hinzugesetzt. Einzelne isolierte Bakterienkolonien wurden hinsichtlich des Vorhandenseins des gewünschten Plasmids gescreent. Das neue Plasmid wurde durch einen Verdau mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und XbaI überprüft. Es wurden zwei Moleküle erwartet, ein 2,0 kb großes und ein 2,6 kb großes.
  • 8. Zusammenligieren des synthetischen Oligonukleotides 101 (SEQ ID-Nr.: 32) mit dem Plasmid (beschrieben in 7).
  • Das Plasmid (beschrieben in 7) wurde mit BglII und BamHI verdaut und ein Fragment von 13 Nukleotiden wurde entfernt (beschrieben in 1). Das resultierende Fragment, welches das erste Oligonukleotid 89 (SEQ ID-Nr.: 30) enthielt, wurde mit dem Oligonukleotid 101 (SEQ ID-Nr.: 32), einem BglII-BamHI-Fragment, zusammenligiert. Nach der DNA-Aufnahme wurden einzelne Zellen hinsichtlich des Vorhandenseins des gewünschten Plasmids gescreent. Das neue Plasmid wurde durch einen Verdau mit den Endonukleasen EcoRI und XbaI oder EcoRI und BglII überprüft.
  • 9. Ligation des synthetischen DNA-Oligonukleotides 99 (SEQ ID-Nr.: 31) an das 4,5 kb große Fragment (beschrieben in 1).
  • Das 4,5 kb große Fragment (BglII-BamHI) wurde mit dem DNA-Oligonukleotid 99 (SEQ ID-Nr.: 31) zusammenligiert. Nach Screenen einzelner Bakterienkolonien, welche unterschiedliche DNAs enthielten, wurde das gewünschte Plasmid durch Verdau mit EcoRI, welcher zu zwei Fragmenten, 1,9 kb und 2,7 kb groß, führte, und durch positive Linearisierung mit BglII oder BamHI charakterisiert.
  • Das neue Plasmid wurde dann mit PstI und BamHI verdaut. Es wurden zwei Moleküle erwartet, ein 2,6 kb großes Fragment mit einem pBR-Rest, dem MT-Promotor und dem Oligonukleotid und ein 2,0 kb großer pBR-Rest. Das 2,6 kb große Fragment wurde isoliert.
  • 10. Ligation des 2,6 kb großen Fragmentes des in 9 beschriebenen Plasmids mit einem Fragment, das aus dem (in 8 beschriebenen) Plasmid isoliert wurde.
  • Das Plasmid (beschrieben in 8) mit den DNA-Oligonukleotiden 89 und 101 (SEQ ID-Nr.: 30 bzw. 32) wurde mit PstI und BglII verdaut. Es wurden zwei Fragmente erwartet. Ein 2,5 kb großes Fragment mit einem pBR-Rest und dem MT-Promotor und ein 2,2 kb großes Fragment mit einem pBR-Rest und beiden Oligos.
  • Dieses 2,2 kb große Fragment wurde mit dem in 8 beschriebenen 2,6 kb großen Fragment, das den pBR-Rest, den MT-Promotor und das Oligo 99 (SEQ ID-Nr.: 31) enthielt, zusammenligiert.
  • Nach dem Screenen hinsichtlich des gewünschten Plasmids wurde es durch Restriktionsendonuklease-Verdau mit BglII-XbaI charakterisiert. Es wurden zwei Fragmente erwartet, ein 270 bp großes Fragment der Oligo-DNA-Nukleotide und ein 4,5 kb großes Fragment des MT-Promotors und des pBR.
  • 11. Ligation des 2,3 kb großen HBV-BglII-BglII-Fragmentes
  • Ein 2,3 kb großes BglII-BglII-Fragment mit den codierenden HBV-prä-S1-, -prä-S2- und -S-Regionen wurde aus HBV-enthaltender DNA isoliert. Das 2,3 kb große Fragment wurde mit dem 4,5 kb großen Fragment (erhalten wie in 1 beschrieben) mit dem Metallothionein-Promotor zusammenligiert.
  • 2 μl des 2,3 kb großen Fragmentes wurden mit 3 μl des 4,5 kb großen Fragmentes vermischt und in einem Gesamtvolumen von 10 μl Ligationspuffer, enthaltend 2 Units T4-DNA-Ligase und 2 mM ATP, bei 14°C über Nacht zusammenligiert.
  • Die Ligationsmischung wurde für die DNA-Aufnahme zu 150 μl Suspension von kompetenten Bakterienzellen hinzugesetzt. Nach der DNA-Aufnahme wurden die Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, welche 50 μg/ml Ampicillin enthielten, bei Volumina von 50 bis 300 μl Zellsuspension pro Platte verteilt. Die Agarplatten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Einzelne isolierte Bakterienkolonien wurden hinsichtlich des Vorhandenseins eines Plasmids mit dem gewünschten Fragment gescreent.
  • 12. Konversion eines Teils der HBV-Gensequenz mit HBV-Kern-Epitopen.
  • Das aus obenstehendem 11 resultierende Plasmid wurde mit den Endonukleasen BglII und XbaI verdaut. Es wurden zwei Moleküle erwartet, ein 550 bp großes Fragment und ein 6,25 kb großes Fragment, das nach Agarosegelelektrophorese isoliert wurde.
  • Das 6,25 kb-Fragment wurde mit dem 270 bp großen Fragment (nach Verdau mit BglII und XbaI und Fragmentisolierung, wie obenstehend beschrieben) des in 10 beschriebenen, für einen Epitopteil des HBV-Kern-Gens codierenden, Plasmids zusammenligiert.
  • Die Ligationsmischung wurde für die DNA-Aufnahme zu 150 μl Suspension von kompetenten Bakterienzellen zugesetzt. Einzelne isolierte Bakterienkolonien wurden hinsichtlich des Vorhandenseins des gewünschten Plasmids gescreent. Das neue Plasmid wurde durch einen Verdau mit BamHI überprüft. Es wurden drei Moleküle erwartet, ein 950 bp großes, ein 450 bp großes und ein 5150 bp großes Fragment.
  • 13. Herstellung eines "Vehikel"-Plasmides
  • Das (in 11 beschriebene) Plasmid wurde mit EcoRI und XbaI verdaut. Es wurden zwei Moleküle erwartet, ein 2450 bp großes Fragment und ein 4350 bp großes Fragment, das nach Gelelektrophorese isoliert wurde.
  • Dieses 4350 bp große Fragment wurde mit dem Oligo-DNA-Nukleotid 39 (SEQ ID-Nr.: 29), welches für die gesamte DNA-Sequenz des HBV-S-Gens vom ATG bis zur XbaI-Stelle codierte, worin das ATG zu ATA verändert worden war, zusammenligiert.
  • 14. Kern-Epitop stromaufwärts des gesamten HBV-S-Gens
  • Dieses "Vehikel"-Plasmid wurde dann mit PstI und XbaI verdaut. Es wurden zwei Moleküle erwartet, ein 600 bp großer Plasmidrest und ein 3850 bp großes Fragment, welches isoliert und mit einem PstI-XbaI-Fragment von 2800 bp (2700 bp), das nach Verdau des in 10 beschriebenen Plasmides isoliert worden war, zusammenligiert wurde.
  • Nach dem Screenen hinsichtlich des gewünschten Plasmids wurde es durch Restriktionsendonuklease-Verdau mit EcoRI und XbaI, EcoRI und BglII und BamHI charakterisiert.
  • 15. Insertion eines Selektionsmarkers
  • Das (in 14 beschriebene) Plasmid wurde mit EcoRI linearisiert. Die Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 50 μl und bei einer Endkonzentration von 1 μg/μl Plasmid-DNA durchgeführt. Es wurden 50 Units EcoRI zugesetzt und der Verdau wurde nach drei Stunden langer Inkubation bei 37°C durch Agarosegelelektrophorese überprüft.
  • Die Reaktion wurde durch Zusetzen von 1 μl 0,5 M EDTA gestoppt und die DNA wurde mit einer Endkonzentration von 0,3 M Natriumacetat und 3-4 Volumen Ethanol 30 Minuten lang bei –80°C gefällt. Die gefällte DNA wurde in 50 μl destilliertem Wasser gelöst.
  • 2 μl des linearisierten Plasmids wurden mit 3 μl des DNA-Fragments, das den Metallothionein-Promotor und das Neomycin-Selektionsgen enthielt (beschrieben in 4), gemischt und zusammenligiert. Einzelne Bakterienkolonien wurden hinsichtlich des gewünschten Plasmids gescreent, welches isoliert, gereinigt und charakterisiert wurde.
  • Jedes obenstehend beschriebene Genkonstrukt kann ebenfalls mit dem U2-Promotor konstruiert werden, wobei das MT-Promotor-enthaltende DNA-Fragment, nach Verdau mit EcoRI und BglII, durch ein den U2-Promotor enthaltendes DNA-Fragment ersetzt wird, welches nach einem Verdau mit EcoRI und BglII isoliert wurde.
  • 16. Isolierung des E. coli-Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (egpt)-Selektionsgens
  • Das Fragment mit dem egpt-Selektionsgen wurde nach Verdau des Plasmid pMSG mit BamHI und BglII isoliert (1,8 kb) und mit einem 4,5 kb großen Fragment (BglII-BamHI, beschrieben in 1), enthaltend den MT-Promotor, zusammenligiert.
  • Nach Screenen hinsichtlich des gewünschten Plasmids wurde es isoliert, gereinigt und durch eine Umwandlung der BamHI-Stelle zu einer EcoRI-Stelle finalisiert.
  • 17. Isolierung der gewünschten DNA-Sequenzen durch das PCR-Verfahren
  • Ein DNA-Fragment (400 bp) wurde nach Gelelektrophorese isoliert. Es wurde durch das PCR-Verfahren (beschrieben in Beispiel 5) unter Verwendung der spezifischen Oligonukleotide 131 und 132 (SEQ ID-Nr.: 33 und 34) als Primer erzeugt.
  • Das DNA-Fragment wurde mit den Endonukleasen BamHI und XbaI verdaut und dann durch Gelelektrophorese gereinigt. Das isolierte PCR-Fragment wurde mit einem 6,25 kb großen Fragment zusammenligiert, welches aus dem (in 13 beschriebenen) Plasmid nach Verdau mit BglII und XbaI isoliert worden war. Nach DNA-Aufnahme und Bakterientransformation wurden die einzelnen Bakterienkolonien hinsichtlich des gewünschten Plasmides gescreent.
  • 18. Insertion eines Selektionsmarkers.
  • Das (in 17 beschriebene) Plasmid wurde durch Hinzufügen eines Selektionsgens in das Plasmid (beschrieben in 15) fertiggestellt.
  • 19. Isolierung des H2K-Promotors.
  • Der H2K-Promotor wurde als ein EcoRI- und BglII-Fragment (2 kb) aus pSP65H2 (erhältlich von Exogene) isoliert. In allen beschriebenen Konstrukten sind alle Promotoren als EcoRI/BglII-Fragmente austauschbar.
  • 20. Konversion eines Teils der HBV-Gensequenz.
  • Das aus obenstehendem 11) resultierende Plasmid wurde mit den Endonukleasen BglII und XbaI verdaut. Es wurden zwei Moleküle erwartet, von denen eines ein 6,250 kb großes Fragment ist, das nach Agarosegelelektrophorese isoliert wurde.
  • Das 6,250 kb große Fragment wurde mit dem Oligo-DNA-Nukleotid 23 (SEQ ID-Nr.: 28) zusammenligiert. Die Ligationsmischung wurde für die DNA-Aufnahme zu einer 150 μl Suspension von kompetenten Bakterienzellen zugesetzt. Einzelne isolierte Bakterienkolonien wurden hinsichtlich des Vorhandenseins des gewünschten Plasmids gescreent. Das neue Plasmid wurde durch einen Verdau mit den Endonukleasen EcoRI und BglII überprüft. Es wurden zwei Moleküle erwartet, ein 1,9 kb großes und ein 4,450 kb großes.
  • 21. Insertion eines egpt-Selektionsmarkers.
  • Das (in 20 beschriebene) Plasmid wurde mit EcoRI linearisiert. Die Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 100 μl und bei einer Endkonzentration von 0,6 μg/μl Plasmid-DNA durchgeführt. Es wurden 60 Units EcoRI zugesetzt und der Verdau wurde nach drei Stunden langer Inkubation bei 37°C durch Agarosegelelektrophorese überprüft. Die Reaktion wurde durch Zusetzen von 2 μl 0,5 M EDTA gestoppt und die DNA wurde mit einer Endkonzentration von 0,3 M Natriumacetat und 4 Volumen Ethanol 1 Stunde lang bei –80°C gefallt. Die gefällte DNA wurde in 50 μl destilliertem Wasser gelöst.
  • 2 μl des linearisierten Plasmids wurden mit 3 μl des DNA-Fragments (3,7 kb) mit dem Metallothionein-Promotor und dem egpt-Selektionsgen (beschrieben in 16), erhalten durch Verdau mit EcoRI, gemischt und zusammenligiert. Einzelne Kolonien wurden hinsichtlich des Vorhandenseins des gewünschten Plasmids gescreent. Jedes der beschriebenen Genkonstrukte in Tabelle III ist auf dem gleichen Weg, wie obenstehend beschrieben, herstellbar.
  • Beispiel 4
  • Transfektion von Säugerzellen mit Konstrukten der vorliegenden Erfindung.
  • Um die Sekretion wesentlicher Mengen der von Konstrukten der vorliegenden Erfindung codierten HBV-Peptide zu erreichen, müssen Säugerzellen mit einem DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung transfiziert werden. Die Cotransfektion wurde in zwei Schritten (d.h. einer separaten Transfektion für jedes Konstrukt) oder in einem einzigen Schritt (d.h. eine Transfektion unter Verwendung einer Präparation beider Konstrukte) durchgeführt. Die Cotransfektion wurde entweder durch Verwendung verschiedener Selektionsmarker auf den zwei Konstrukten oder durch Nachweis der Sekretion von Expressionsprodukten beider Konstrukte durch Immunoassay bestätigt.
  • Alternativ dazu können eine Sequenz, die für die HBV-Peptidsequenz der vorliegenden Erfindung codiert, und eine getrennte Sequenz, welche für das gesamte S- oder Kern- oder HAV-Protein codiert, in einem einzigen Konstrukt kombiniert werden.
  • Beispiel 5
  • Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
  • Die Polymerase-Kettenreaktion ermöglicht, spezifische DNA-Nukleotidsequenzen einer gewählten Region einer bekannten genomischen Sequenz in vitro um mehr als das millionenfache zu vervielfältigen (Thomas J. White, Norman Arnleim, Henry A. Erlich, 1989: The polymerase chain reaction. Technical Focus, Band 5, Nr. 6; S. Kwok und R. Higuchi, 1989: Avoiding false positives with PCR. Nature, Band 339, S. 237-238).
  • Aus Zellen isolierte DNA oder Plasmid-DNA wird behandelt, um ihre komplementären Stränge zu trennen. Diese Stränge werden dann mit einem Überschuß von zwei DNA-Oligonukleotiden (jedes 20-25 Basenpaare lang) annealt bzw. aneinandergelagert, welche chemisch so synthetisiert worden sind, dass sie an Sequenzen passen, die durch X Nukleotide getrennt sind (wobei X im allgemeinen zwischen 50 bis 2000 Basenpaare beträgt).
  • Die zwei Oligonukleotide dienen als spezifische Primer für die in vitro-DNA-Synthese, die durch DNA-Polymerase katalysiert wird, welche die DNA zwischen den zu den zwei Oligo nukleotiden entsprechenden Sequenzen kopiert. Wenn die zwei Primer-Oligonukleotide die korrekte Sequenz enthalten, ist es möglich, neue Verdaustellen am 5'- und 3'-Ende zu erzeugen.
  • Nach mehreren Reaktionszyklen wurde eine große Menge eines DNA-Fragmentes der gewünschten Länge erhalten, durch Gelelektrophorese gereinigt und durch Restriktionsenzymverdau und Agarosegelelektrophorese charakterisiert. Das vervielfältigte, gereinigte DNA-Fragment wurde dann verwendet, um es mit anderen Fragmenten, d.h. Plasmid, zusammen zu ligieren.
  • Die PCR-DNA-Fragmente wurden mit glatten Enden amplifiziert. Um (für das Ligationsvorgehen) überhängende Enden zu erhalten, muss das Fragment mit den gewünschten Endonukleasen verdaut und erneut gereinigt werden.
  • Die PCR-Reaktion wird 20 bis 30 Zyklen lang andauern. Ein Zyklus ist in drei Schritte mit unterschiedlichen Reaktionszeiten und unterschiedlichen Reaktionstemperaturen unterteilt, was von einem PCR-Thermocycler gesteuert wird. Der erste Schritt ist die "Denaturierung" der Matrizen-DNA (1 min/95°C), der zweite Schritt ist die "Hybridisierung" der Matrizen-DNA und der Primer (1 min/55°C), gefolgt von der "Polymerisierung" (2 min/72°C).
  • Das Endvolumen für einen Assay beträgt zum Beispiel 30 μl, wobei die nachstehenden Endkonzentrationen enthalten sind: PCR-Puffer (1 x), Nukleotid-Mix mit 200 μM jedes der vier Nukleotide, 200 ng für 30 μl von jedem der zwei Primer, 0,5 Units Taq-Polymerase pro 30 μl Aqua bidest.
  • Beispiel 6
  • Kultivierung von transfizierten Zellen zur Sekretion von Protein
  • Die Empfängerzellen (C127- oder CHO-Zellen, erhältlich von ATCC) wurden am Tag 1 in normales Wachstumsmedium (DMEM + 10% fötales Kälberserum, Glucose und Glutamin) in Petrischalen (1-2 × 106 Zellen pro Schale, ɸ 10 cm) eingebracht. Am nächsten Tag wurde das Medium entfernt (4 Stunden, bevor das DNA-Präzipitat auf die Zellen gegeben wurde), und die Zellen wurden zweimal mit 1 × PBS gewaschen. Danach wurden 8 ml DMEM ohne FCS zugesetzt, 4 Stunden später wurde das DNA-Präzipitat (hergestellt wie nachstehend beschrieben) den Zel len zugegeben. Wiederum nach 4 Stunden wurde das Medium entfernt, 3 ml Glycerin-Mix (50 ml 2 × TBS-Puffer, 30 ml Glycerin, 120 ml destilliertes Wasser) wurden zugegeben. Der Glycerin-Mix wurde unmittelbar nach einer drei Minuten langen Inkubation bei 37°C entfernt und die Zellen wurden mit 1 × PBS gewaschen. Die Zellen wurden über Nacht mit 8 ml DMEM mit 10 % FCS kultiviert.
  • Nach 48 Stunden wurden die Zellen durch Behandlung mit Trypsin-EDTA-Lösung (0,025 Trypsin + 1mM EDTA) aus der Schale gewonnen. Zur Entfernung des Trypsin-EDTA wurden danach die Zellen mit 1 × PBS gewaschen, in DMEM mit 10% FCS suspendiert und in Costar-24-Vertiefungs-Platten verteilt (Zellen aus einer Schale in vier 24-Vertiefungs-Platten).
  • Als die Zellen gut herangewachsen waren, wurde Selektionsmedium zugesetzt (Konzentration 0,5-1 mg/ml Neomycin oder: Xanthin (250 μg/ml), Hypoxanthin (15 μg/ml) oder Adenin (25 μg/ml), Thymidin (10 μg/ml), Aminopterin (2 μg/ml), Mycophenolsäure (25 μg/ml) für eco-gpt, zum Beispiel). Das Medium wurde jede Woche ausgewechselt. Die ersten wachsenden Zellkolonien wurden nach zwei Wochen beobachtet.
  • Zu 10 μg Plasmid-DNA und 20 μg Träger-DNA (Lachssperma-DNA, Kalbsthymus-DNA) wurde TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,05) zu einem Endvolumen von 440 μl zugegeben und zusammen mit 60 μl M CaCl12 vermischt. Danach wurde die gleiche Menge von 2 × TBS (Hepes 50 mM, NaCl 280 mM, Na2HPO4 1,5 mM, pH 7,05) zugegeben und gut vermischt. Die Präzipitationslösung wurde 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert und direkt den Zellen zugegeben, welche transfiziert werden sollten.
  • Beispiel 7
  • Herstellen des Adjuvanz von gereinigten Teilchen.
  • Zu der in steriler Kochsalzlösung suspendierten gewünschten Konzentration an Antigen wurden 1:10000 Volumen Thimerosol, 1/10 Volumen Filter-sterilisiertes 0,2 M KA1(SO4)2·12 H2O zugesetzt. Der pH-Wert wurde mit sterilem 1 N NaOH auf 5,0 eingestellt und die Suspension wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Alum-präzipitierte Antigen wurde durch 10minütige Zentrifugation bei 2000 U/min gewonnen, in steriler normaler Kochsalzlösung mit 1:10000 Thimerosol resuspendiert und unter sterilen Bedingungen aliquotiert.
  • Beispiel 8
  • Reinigung von Hepatitis-B-Kernantigen.
  • Der Zellüberstand von HB-Kernantigen-sezernierenden Zellen wurde gesammelt und durch Ultrafiltration konzentriert. Das Konzentrat wurde durch 15 Minuten lange Zentrifugation bei 20000 U/min bei 4°C in einem Beckmann-SW28-Rotor geklärt.
  • Die Teilchenbildung wurde durch Sucrose-Dichte-Zentrifugation (0-45% Sucrose) in einem Beckmann-SW28-Rotor 24 Stunden lang bei 28000 U/min und 4°C getestet. Der Gradient wurde fraktioniert und die einzelnen Fraktionen wurden mittels ELISA analysiert.
  • Beispiel 9
  • Die folgenden Tabellen geben einige Resultate der ELISA-Analyse von immunogenen Teilchen der vorliegenden Erfindung wie nachstehend beschrieben wieder:
    Die Tabelle IV zeigt die ELISA-Daten des gereinigten HBs-Antigenteilchens, hergestellt aus jedwedem HBV-Sequenzkonstrukt der vorliegenden Erfindung, einschließend die prä-S1-Epitope und die S-Region, mit dem monoklonalen Anti-prä-S1-Antikörper MA 18/7 und dem monoklonalen Anti-HBs-Antikörper GO22.
  • Die Tabelle IV zeigt die Fraktionen (21), welche nach dem CsCl-Dichtegradienten aufgefangen wurden. Tabelle IV-1
    CsCl-Gradienten-Fraktion Nr. ELISA-Messung (E = 492) Monoklonaler Antikörper 18/7
    13 0,092
    14 0,210
    15 0,388
    16 1,662
    17 2,604
    18 0,648
    19 0,031
    Tabelle IV-2
    CsCl-Gradienten-Fraktion Nr. ELISA-Messung (E = 492) Monoklonaler Antikörper G022
    13 0,136
    14 0,426
    15 0,822
    16 1,970
    17 2,954
    18 0,967
    19 0,076
  • Die Tabelle V zeigt die ELISA-Daten der gereinigten HB-Kernantigen-Teilchen, hergestellt aus jeglichem HB-Kernsequenz-Konstrukt der vorliegenden Erfindung, mit polyklonalen Antikörpern gegen HB-Kern und mit monoklonalem Antikörper G022 gegen HB-S-Ag. Tabelle V-1
    Sucrose-Gradienten-Fraktion Nr. ELISA-Messung (E = 492); Polyklonale Antikörper
    6 0,25
    7 0,922
    8 1,423
    9 1,5
    10 1,5
    11 1,28
    12 0,466
    Tabelle V-2
    Sucrose-Gradienten-Fraktion Nr. ELISA-Messung (E = 492) Monoklonaler Antikörper G022
    6 0,020
    7 0,024
    8 0,018
    9 0,011
    10 0,015
    11 0,020
    12 0,022
  • Beispiel 10
  • Untersuchungen der Hepa-Care-Verabreichung bei Schimpansen:
  • "Hepa-Care" sind Teilchen, die Hepatitis-B-Oberflächenantigene (S1 und S) in einer spezifischen Zubereitung (Verhältnis 50:50) präsentieren, welche für die Behandlung von chronischen Trägern des Hepatitis-Virus verwendet werden.
  • Experiment 1
  • Ein Hepatitis-B-Träger, der Schimpanse 1, wurde (intramuskulär) mit Hepa-Care bei den Zeiten von 0, 4 und 8 Wochen bei einer Dosierung von 18 μg pro Injektion behandelt.
  • Die Leberenzyme wurden überwacht (IV), ebenso wie der Hepatitis-B-Antigen-Spiegel (V).
  • Experiment 2
  • Dem Schimpansen 1 wurde nach der oben stehend beschriebenen Behandlung eine Booster-Behandlung bei Woche 30, 34 und 38 gegeben. Die Ergebnisse sind in der VI gezeigt.
  • Experiment 3
  • Schimpanse 2 wurde mit Hepa-Care behandelt, jedoch im Gegensatz zu Schimpanse 1 wurde dies intravenös gegeben. Die Dosierung betrug 2 mg. Die Ergebnisse sind in der VII gezeigt.
  • Bei einem Kontroll-Schimpansen 3 wurden ebenfalls die Leberenzyme überwacht und sind in der VIII gezeigt.
  • Beispiel 11
  • Behandlung mit Hepa-Care: (zur Definition, siehe Beispiel 10) Patient 1 (männlich, Alter = 65 Jahre, Erkrankung seit 2 Jahren):
    Hepatitis-B-Parameter: HBsAg pos.
    Anti-HBs neg.
    HBeAg neg.
    Anti-HBe pos.
    Anti-HBc neg.
    wurde (i.m.) mit Hepa-Care in Monat 0, 1, 6 und 7 behandelt. Die Ergebnisse der Antigen- und Antikörpermessungen sind in den IX und X angegeben. Patient 2 (weiblich, Alter = 48 Jahre, Erkrankung seit 12 Jahren):
    Hepatitis-B-Parameter: HBsAg pos.
    HBeAg neg.
    Anti-HBs neg.
    Anti-HBe pos.
    Anti-HBc pos.
    wurde (i.m.) behandelt mit Hepa-Care in Monat 0, 1 und 6. Die Ergebnisse der Antigen- und Antikörpermessungen sind in den XI und XII gezeigt. Patient 3 (weiblich, Alter = 41 Jahre, Erkrankung seit 5 Jahren):
    Hepatitis-B-Parameter: HBsAg pos.
    HBeAg neg.
    Anti-HBs neg.
    Anti-HBe pos.
    wurde (i.m.) mit Hepa-Care in Monat 0, 1, 2 und 5 behandelt. Die gemessenen Werte von HBs-Antigen und Anti-HBs-Antikörpern sind in den XIII und XIV gezeigt. SEQUENZ-AUFLISTUNG
    Figure 00380001
    Figure 00390001
    Figure 00400001
    Figure 00410001
    Figure 00420001
    Figure 00430001
    Figure 00440001
    Figure 00450001
    Figure 00460001
    Figure 00470001
    Figure 00480001
    Figure 00490001
    Figure 00500001
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    Figure 00520001
    Figure 00530001
    Figure 00540001
    Figure 00550001
    Figure 00560001
    Figure 00570001
    Figure 00580001
    Figure 00590001

Claims (19)

  1. Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von chronischer Hepatitis, die vom Hepatitis B-Virus verursacht wird, wobei die Zusammensetzung eine Kombination von a) mindestens einer Polypeptidsequenz mit einem oder mehreren antigenen T-Zell-aktivierenden Epitopen von dem Hepatitis B-Virus und b) einem Träger, der zur Präsentation der Epitopsequenz(en) a) in der Lage ist, wobei die Polypeptidsequenz(en) a) am Träger b) durch kovalente oder hydrophobe Bindung gebunden ist/sind, umfasst.
  2. Verwendung gemäß Anspruch 1, worin die Polypeptidsequenz(en) a) die Aminosäuresequenz von einem oder mehreren Vertretern, die aus HB-viralen prä-S1-, prä-S2- und S-Peptiden und HB-Kern-Antigenen gewählt sind, ist/sind.
  3. Verwendung gemäß Anspruch 1, worin die Polypeptidsequenz(en) a) ein Polypeptid vom Hepatitis-B-Virus ist/sind, modifiziert: i) durch das Vorhandensein von willkürlichen Deletionen, wobei ein mindestes sechs aufeinander folgende Aminosäurereste umfassendes Epitop konserviert ist, ii) durch das Vorhandensein von Substitutionen aus einer oder mehreren Aminosäuren oder iii) durch das Tragen einer zusätzlichen Aminosäuresequenz an ihrem N-Terminus, an ihrem C-Terminus oder als eine Insertion.
  4. Verwendung gemäß Anspruch 3, worin die Polypeptidsequenz a) die Aminosäuresequenz von einem oder mehreren Vertretern, die aus HB-viralen prä-S1-, prä-S2- und S-Peptiden und HB-Kern-Antigenen gewählt sind, ist/sind, modifiziert wie in Anspruch 3 definiert.
  5. Verwendung gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Polypeptidsequenz(en) a) myristyliert ist/sind.
  6. Verwendung gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Polypeptidsequenz(en) a) durch die Expression eines rekombinanten DNA-Moleküls hergestellt wird/werden.
  7. Verwendung gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger b) ein Polysaccharid, ein hydrophobes Polymer oder ein anorganisches Molekül mit Teilchenform ist.
  8. Verwendung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der Träger b) eine zweite Polypeptidsequenz ist.
  9. Verwendung gemäß Anspruch 8, worin die Polypeptidsequenz b) bei der Sekretion Teilchen mit einem Durchmesser von mindestens 10 nm bildet.
  10. Verwendung gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei die Polypeptidsequenz b) ein wesentlicher Teil von oder die komplette Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das von HBV-S-Peptid; HBV-Kern-, HAV-Kern- und HIV-Kernantigenen; und Oberflächenantigenen von Poliovirus, HAV und HIV gewählt ist, ist.
  11. Verwendung gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei die Polypeptidsequenz b) ein wesentlicher Teil von oder die komplette Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das von HBV-S-Peptid; HBV-Kern-, HAV-Kern- und HIV-Kernantigenen; und Oberflächenantigenen von Poliovirus, HAV und HIV gewählt ist, ist, modifiziert i) durch das Vorhandensein von willkürlichen Deletionen, wobei Teilchenbildungsvermögen erhalten bleibt, ii) durch das Vorhandensein von Substitutionen aus einer oder mehreren Aminosäuren oder iii) durch das Tragen einer zusätzlichen Aminosäuresequenz an ihrem N-Terminus, an ihrem C-Terminus oder als eine Insertion.
  12. Verwendung gemäß mindestens einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die Polypeptidsequenz b) myristyliert ist.
  13. Verwendung gemäß mindestens einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei die Polypeptidsequenz b) durch die Expression eines rekombinanten DNA-Moleküls hergestellt wird.
  14. Verwendung gemäß mindestens einem der Ansprüche 8 bis 13, wobei die Polypeptidsequenzen a) und b) über Disulfidbrücken verknüpft sind.
  15. Verwendung gemäß mindestens einem der Ansprüche 8 bis 13, wobei die Polypeptidsequenzen a) und b) über "hydrophobe Verankerung" (vermittelt durch Myristinsäure) verknüpft sind.
  16. Verwendung gemäß mindestens einem der Ansprüche 8 bis 13, wobei die Polypeptidsequenz a) und b) durch eine Peptidbindung verknüpft sind, worin wahlweise eine Spacersequenz zwischen Polypeptidsequenz(en) a) und Polypeptidsequenz b) inseriert ist, wobei die Spacersequenz über Peptidbindungen an Polypeptidsequenzen a) und b) geknüpft ist.
  17. Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei die Polypeptidsequenz(en) a) und die Polypeptidsequenz b) hergestellt worden sind durch Expression von dem gleichen rekombinanten DNA-Molekül, auf dem die Sequenzen in Tandemanordnung codiert sind.
  18. Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei die Polypeptidsequenz(en) a) und die Polypeptidsequenz b) von einem einzelnen offenen Leseraster auf dem DNA-Molekül exprimiert werden und wahlweise durch eine Spacer-Polypeptidsequenz getrennt sind, die ebenfalls in dem einzelnen offenen Leseraster codiert ist.
  19. Verwendung gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zusammensetzung zur Verabreichung mittels intravenöser oder intramuskulärer Injektion ist.
DE69130071T 1990-12-19 1991-12-19 Zusammensetzung verwendbar als therapeutisches mittel gegen chronische virale leberkrankheiten Expired - Lifetime DE69130071T3 (de)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
EP90124775 1990-12-19
EP90124775A EP0491077A1 (de) 1990-12-19 1990-12-19 Zusammensetzung verwendbar als therapeutisches Mittel gegen chronische virale Leberkrankheiten
PCT/EP1991/002460 WO1992011368A1 (en) 1990-12-19 1991-12-19 A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases

Publications (3)

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