PT94791B - Metodo para producao de novos antigenios - Google Patents

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Martin Comberbach
Teresa Cabezon
Pierre Voet
Eric Jacobs
Cornelis P Hollenberg
Zbigniew A Janowicz
Armin J Merckelbach
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Smithkline Biolog
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Description

O presente invente diz respeito a uma partícula composta compreendendo peio menos dois polipeptídeos correspondendo à total idade ou parte de uma proteína tendo a activida.de biológica de um dos antigénios de superfície da. hepatite Bs em que a. partícula apresenta pelo menos dois determinantes antigénicos proporcionados pela proteína S? proteína preS2 ou proteína preSl5 a referida partícula compreendendo ainda 5 f acul tativamente=, lípidos específicos do hospedeiro^ □ invento também proporciona uma proteína L modificada do antigénio de superfície da hepatite B que pode ser usada sozinha ou incorporada em tais partículas compostas»
Uma realização particular da proteína L modificada CL'T') compreende os resíduos 12-52 seguidos dos resíduos 133-145 seguidos dos resíduos 175-400 da proteína í_ e uma realização particular de uma partícula composta tem a forma <Lr5 S) onde S é a proteína S de HBsAq,
Ko-deot ser preparadas vacinas melhoradas da hepatite iPOS são dos imunogénios atrás referidos.. especialmentE .eveduras, tais como 3« cerevisiae e Hansenula oolvmoroha.
Novos antigénios.....e.......B8éto_dgs^^a_^sua_jgr^Bara^go invento está relacionado com usn microorganismo seleccionado do grupo dos géneros de leveduras metilotróficass uma molécula de DMA contendo uma. cassete de expressão^ um vector adequado para transformação de uma levedura metilotrófica5 um processo para a preparação de um microorganismog uma partícula composta contendo pelo menos dois polipeptídeos correspondendo a toda ou parte de uma proteína tendo a actividade biológica do antigénio de superfície da hepatite B5 um método para a preparação ds partículas compostas e composições,, vacinas e kits de testes contenda as mesmas,
O invento também está relacionado com a construção de estirpes de microorganismos que sintetizem proteínas grandes modificadas de superfície do vírus da hepatite Bs especial mente antigénios L de superfície da hepatite B os quais estão modificados em várias regiões da sequência codificadora para alterar e aumentar a sua actividade biológica»
A hepatite é uma doença infsecioss grave bastante disseminada que pode ser causada por vários agentes. Uma causa importante foi identificada como o vírus da hepatite B CHBV)5 u® virião pequeno cora cerca de 43 nra de diâmetro contendo ura genoma peculiar» o qual consiste num círculo de DNA de cadeia dupla de 3 2Θ0 ph tendo um segmento de cadeia simples com cerca de 200 pb» A infecção com este virião resulta numa doença aguda5 por vezes fatal» Oitenta e cinco por cento das pessoas afectadas recuperam após cerca de três meses de doença? cerca de 1% sofre de necroseaguda do tecido hepático», resultando na morte num período curto e cerca de Í0% sofre de surtos repetidos» Aproximadamente 4X das pessoas infectadas desenvolve um estado portador crónico com um
risco aumentado de carcinoma hepafcocelular primário ou cirrose do •fígado»
A infecção geralmente ocorre via tranmiss-ão perinatal ou parenteral de viriSes infecciosos, por exemplo no decurso de transfusões sanguíneas ou quando da utilização de seringas ou agulhas de injecção contaminadas ou por contacto sexual» Portanto verifica—se a necessidade urgente de meios, de diagnóstico fiáveis para a detecção de HBV e de uma vacina protectora de pessoas de alto risco de exposição, como sejam as esposas de portadores crónicos., viajantes para áreas onde a endemicidade de HBV é elevada, rec em-nascidos- de portadora crónicos» homossexuais, prostitutas e drogados» a qual deve ser obtida a baixo custo» Aintí-a» em países do terceiro mundo existe a necessidade de uma vacina baratapara programas de imunização massiva»
Alé-m das partículas virais consistindo nas proteínas do nucleóide CHBcAg) e dos antigénios da cápside ou de superfície (HBsAg) encerrando o genoma de DNA circular parcialmente de cadeia dupla, o sangue dos indivíduos infectados pode conter quantidades substanciais de partículas de HBsAg contendo a proteína do antigénio de superfície e lípidos do hospedeiro» Estas partículas foram purificadas a partir de soro humano e formuladas como vacinas que conferem protecção contra a infecção por HBV CSzmuness et al», 198®)»
Neste pedido certas mencinando o primeiro autor e parêntesis» A citação completa publicações são referenciadas o ano da publicação dentro de destas referências apresentadas por ordem alfabética pode ser encontrada no fim da descrição» As divulgações destas publicações na suã totalidade são incluídas por referência neste pedido com a finalidade de descrever mais detalhadamente o estado actual dos conhecimentos»
A preparação ds vacinas -a partir ds HBsAg derivado do sorotem sidodificultada pela fonte limitada de sangue infectado e pela necessidade de se proceder a testes rigorosos e demorados para assegurar a remoção s/ou inactivação de potenciais agentes i n fsc c iosqs=
A infecção pelo vírus da hepatite B em humanos estã associada com a ocorrência no soro de várias estructuras portadoras do antigénio de superfície da hepatite B (HBsAg) ETiollais et al., Mature, 17 s 439 (1935)1= Além dos viriSes infecciosos5 estão presentes partículas filamentosas e esféricas de 22 nm de diâmetro (contendo cerca de l®0 proteínas do invólucro) as quais são formadas pela associação de lípidos derivados do hospedeiro com três proteínas de superfície da hepatites as proteínas major (S)? mêd i a (M) e g rande CD»
Estas proteínas partilham a mesma sequência ds 226 codSes de aminoácidos no genoma do HBV? conhecida como a sequência codificadora da proteína S« Toda, a sequência codificadora ds aminoácidos que precede imsdiatamente a sequência codificadora da proteína 3 no genoma ds HBv é aqui refsrido como a sequência codificadora prsS„ A sequência codificadora preS codifica uma sequência de 55 aminoácidos que precede imsdiatamente a proteína S? designada região preS2? e? dependendo do subtipo do vírus5 uma sequência 1®8 ou 119 aminoácidos que precede imediatamente a região preS'2,, designada região preSl»
Toda a sequência codificadora preS codifica assim 163 (55 preS2 t- 105 preSÍ) aminoácidos nos subtipos ay s 174 (55 pres2 ·*· 119 preSÍ> aminoácidos na maior parte dos subtipos ad= As comparações ds sequências entre as sequências codificadoras de preS nos genomas dos isolados ad e ay mostraram que os primeiros onze codoes da região preSÍ dos isolados ad não estão presentes nos subtipos ay» De acordo com a nomenclatura geralmente adoptada? ao lonqo desta pedido a numeração dos ccdões e aminoácidos dos subtipos ad é seguida? significando que os gsnomas de HBV dos isolados ad codificam uma. região preS de 174 aroinoácidos numerados de 1 a 174 enquanto que os 163 aminoácidos da. região preS dos subtipos ay são numerados de 12 a 174=
A proteína major (S5 é codificada peles gene S de 226 cadSes de aminoácidos e existe nas formas glicosilada e nso glicosiladã»
A proteína média CM) inclui a região preS2 s a proteína S (proteína Ms 55 roais 226 aminoácidos)» A proteína M é uma glicoproteína presente em duas formas de acordo com o grau de glicosilação CStibbe et ai.» J» Vi ro1» H 46 s 626-628 ( 1983)3» Os 55 aminoácidos codificados pela região preS2 são hidrofílicos e contêm um epitopo imunodoroinante situado na superfície do gene do invólucro (resíduos 132-137)» Este epitopo é independente de ligações dissulfureto e descrito coroo sendo roais imunogénico do que os spitopos da proteína S» ENeurath et al»s Science^ 224 s 392-394 (19845s Neurath et al»3 Nature, 315s154-156 (198553» A sequência preS2 também contem um receptor para a albumina sérica bovina humana poliroeriza.de. ípHSA) CMachida et ai ? Sastroent» „ 86^910-918 C1984)3» Este receptor pode também ligar-se a HSA monomérica e pode mediar a ligação de HBv a hepatócitos, os quais podem ter um receptor de pHSfi» Foi sugerido que tal ligação poderá levar à. tolerância ou reacçSes auto-imunes em humanos»
A proteína grande (L) inclui a região preS!? a região preS2 e a sequência codificadora de S (proteína Ls 108 (ou 1Í9) mais 55 mais 226 aminoácidos)» Ela está presente na formas glicosolada e não glicosilada» A proteína L é de coropreiroento variável ds acordo com o subtipo» e»g»5 389 e 4©@ aminoácidos de
comprimento para os subtipos ay e ad5 respectivamente= 0 produto da tradução de preSl está também envolvido na. ligação tíe HBV a hepa tó-c i tos-»
Devido ao promotor dos produtos de transcrição específicos S e M estar dentro da grelha de leitura aberta da proteína L? a transformação de células de mamífero com DMA codificador da grelha de leitura aberta completa para a proteína L pode resultar na síntese das três proteínas de superfície= Em células de mamífero., as partículas HBsAg são secretadas CTiollais st al = 5 referido atrás3= Nos sistemas de mamíferos a expressão da proteína L provoca uma inibição da secreção das partículas de HBsAg, LVer? e»g»5 Ou et al»5 3. Vi rol.. 61 s782 <1987)3» Foi sugerido que este fenómeno esteja relacionado com a presença na proteína L de um grupo N-miristoílo3 provocando interferência com o processo de gemulação ou -secreção tPersing st al», Scier.cs, 534; 1388—Í39Í <1986)? Persing et sl»? J-Virol»6i_s 1672-1677 <1987)3»
Para facilidade de referê'ncia5 a Tabela A que se segue descreve as sequências de DMA codificadoras e as sequências de aminoácidos das regiões preSÍ5 preS2 e S das proteínas do HBV aqui disutidas» Ds números dos aminoácidos estão por cima dos codões entre parênntesis e estão numerados do primeiro codão ATS presente na grelha de leitura aberta ρ-ara as proteínas do invólucro encontradas na sequência do isolado adw do HBV que foi subclonada no plasmídeo pRITíôóló» Como os onze primeiros codões desta sequência ad não estão presentes em qualquer uma das cassetes de expressão descritas no.presente pedido estas sequências não estão apresentadas na Tabela A»
D plasmídeo pRIT106ió„ transportado por E» coli ΚΊ2 estirpe 600 3 está depositado na American Type Culture
Co11sc tion? Roc ATCC 3913Í„
Maryland, LLS.A» com o número de acesso
Tabela
REGIí® PR*r.~~5-l
Ncol
(12) ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG GGA TTC TTT
Met Gly Thr Asn Leu Ser Vai Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe
(26)
CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC
Pro Asp His Gin Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn
(40)
AAT CCA GAT TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG CCA
Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp Pro
(54)
GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA TTC GGG CCA GGG CTC
Ala Ala Asn Gin Vai Gly Vai Gly Ala Phe Gly Pro Gly Leu
(68)
ACC CCT CCA CAC GGC GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT
Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gin Ala
(82)
CAG GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT CCT CCT GCC
Gin Gly Ile Leu Thr Thr Vai Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala
(96)
TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT
Ser Thr Asn Arg Gin Ser Gly Arg Gin Pro Thr Pro Ile Ser (110) (119)
CCA CCT CTA AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC
Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gin Ala ·»
(120) ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAA GCT CTG CAG GAT
Met Gin Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gin Ala Leu Gin Asp
(134)
CCC AGA GTC AGG GGT CTG TAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT
Pro Arg Vai Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser
(148)
TCA GGA ACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCT CAC ATA
Ser Gly Thr Vai Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile
(162) (174)
TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGG GAC CCT GTG ACG AAC
Ser Ser Ser Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Vai Thr Asn
PROT EíNfi O
(175)
ATG GAG AAC ATC ACA TCA GGA TTC CTA GGA CCC CTG CTC GTG
Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Vai
TTA CAG GCG GGG TTT TTC TTG TTG ACA AGA ATC CTC ACA ATA
Leu Gin Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile
CCG CAG AGT CTA GAC TCG TGG TGG ACT TCT CTC AAT TTT CTA
Pro Gin Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu
GGG GGA TCA CCC GTG TGT CTT GGC CAA AAT TCG CAG TCC CCA
Gly Gly Ser Pro Vai Cys Leu Gly Gin Asn Ser Gin Ser Pro
ACC TCC AAT CAC TCA CCA ACC TCC TGT CCT CCA ATT TGT CCT
Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro
GGT TAT CGC TGG ATG TGT CTG CGG CGT TTT ATC ATA TTC CTC
Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu
TTC ATC CTG CTG CTA TGC CTC ATC TTC TTA TTG GTT CTT CTG
Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Vai Leu Leu
GAT TAT CAA GGT ATG TTG CCC GTT TGT CCT CTA ATT CCA GGA
Asp Tyr Gin Gly Met Leu Pro Vai Cys Pro Leu Ile Pro Gly
TCA ACA ACA ACC AAT ACG GGA CCA TGC AAA ACC TGC ACG ACT
Ser Thr Thr Thr Asn Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr
CCT GCT CAA GGC AAC TCT ATG TTT CCC TCA TGT TGC TGT ACA
Pro Ala Gin Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr
AAA CCT ACG GAT GGA AAT TGC ACC TGT ATT CCC ATC CCA TCG
Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser
TCC TGG GCT TTC GCA AAA TAC CTA TGG GAG TGG GCC TCA GTC
Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Vai
CGT TTC TCT TGG CTC AGT TTA CTA GTG CCA TTT GTT CAG TGG
Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Vai Pro Phe Vai Gin Trp
TTC GTA GGG CTT TCC CCC ACT GTT TGG CTT TCA GCT ATA TGG Phe vai Gly Leu Ser Pro Thr vai Trp Leu ser Ala Ue Trp ATG ATG TGG TAT TGG GGG CCA AGT CTG TAC AGC ATC GTG AGT «et Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile vai Ser
CCC TTT ATA CCG CTG TTA CCA ATT TTC TTT TGT CTC TGG GTA pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp vai (400)
TAC ATT TAA Tyr Ile Stop
Os sinais de iniciação da rsnscrição viralsituados reist.í.varoes> s.e 5ú= cuooes de inicisçso da trautu-isQ cgutruísm a e expressão de cada uma das proteínas preSi, preS2 e S in
LVQ pudem ser
Quando da tradução na célula tis mamífero? as proteína·: çjlicosiladaSj, resultando numa série de antigénios de superfície como demonstrado na tabela que se segue»
Proteína Çomgrimento Camino- ácidos) Designação Glicosilação de sequências da proteína S Glicosilação. de domínios específicos preS2
P24 226 Proteína S -
BP27 226 Proteína S + -
GP33 281 Proteína preS'2 -
BP36 281 Proteína preS2 ·+· •i-
P39* 389 Proteína preSÍ - -
BP42 389 Proteína preSÍ +
Ss Subtipo ayw§ as proteínas pre-Sl derivadas do subtipo adw têm cerca de a i?5 KDa de tamanho? o que está de acordo coo aminoâcidos adicionais no extremo N-terminal CHeermann et ah, (1984)»
Uma vez conhecida a. sequência de DNft da. região codificadora do antigénio de superfície?várias tentativas foram feitas para produzir a proteína S através de tecnologia de D1MA recombinante» Burrell st sl, (1979) e Murray et al»? (1980) assim como váreios outros investigadores descreveram a expressão de HBsAg em E» t‘o 1 i Va 1 en zue 1 a et al» (1982) descreveram a expressão de HBsAg SiTí levedura» Após rebentamento das células de levedura transformadas com um vector contendo a sequência codificadora da proteína sob o controle do promotor da alcol-desidrogenase 1 de levedura? observaram-se partículas esféricas contendo HBsAg semelhantes às encontradas no soro de indivíduos infectados com HBV» No pedido de patente europeia 0 226 846 CTschopp et al»?) está descrita a produção da proteína. S de HBV na levedura Pichia» A síntese proteica está sob o controle de uma região reguladora que responde ao metanol»
Mo snlánta, se hera que 35 vacinas contendo exclusivamente partículas de antigénio S sejam geralmente altamente proteetoras (Szmuness et aL= 19805 alguns hospedeiros respondem fracamente a tais preparações» Para ultrapassar esta falha imprevísivelda vacinação, foram desenvolvidos para a expressão da proteína preS2 e da proteína preSi» Sabe-se que que preS2 é mesmo mais imunogénica do que a proteína S. Por exemplo quando da imunização de ratinhos com partículas suhvirsis portadoras de epítopos específicos de preS2 e de 3, a resposta de anticorpos a preS2 excede a resposta anti-S CMillich et ais 19855» Ainda foi observada que a imunização com partículas contenda preS2 pode também induzir uma resposta anti-S» 0 papel das proteínas preSi e preS2 na imunização e a especificidade do reconhecimento de células T e B das proteínas do antigénio de superfície de HBV foi recentemente revisto CMilich, 1988, com referências incluídas)= valenzuela et al. s CÍ985) descrevem a expressão de toda a sequência codificadora da proteína preS2 em levedura transformada com um plasmídeo contendo as correspondentes sequências virais» Dsvs-se notar que na transcrição de levedura, a iniciação tem de ser dirigida por promotores de levedura precedendo a respectiva região codificadora, uma vez que os sinais de iniciação da transcrição viraldentro da HBV-ORF não são reconhecidos pelo sistema de transcrição de levedura»
Itoh et al» (1986) & outros também descreveram a expressão da proteína preS2 em levedura e montagem em partículas» Dehoux et al„ (1986) descrevem a expressão de uma proteína de preSi de 39 KDa em levedura e estabelecem que esta esta na forma de partícula» Uma publicação de xmamura et al», (19875 descreve a expressão em S» cerevisiae da proteína preS2 e da proteína preSi» Estes autores estabelecem que a proteína grande foi encontrada como um produto não qlicosilado relativamente estável de 42 KD de peso molecular que não foi fácilmente montada em partículas»
A glicosilação das proteínas de superfície produzidas na levedura S» cerevisiae difere da glicosilação observada nas partículas naturais isoladas a partir de indivíduos infectados cofii HBV» A· proteína 3 não é glicosilada? enquanto que a proteína preS2 e prsSl são produzidas nas formas glicosilada ligada em N e não glicosilads» Foram identificadas cadeias ligadas em M do tipo manose elevado? assim como cadeia(s) de oligossacàrido ligadas em □ CItoh et ah, S986? Lanqley et al =, 1933)»
A expressão do antigénio de superfície de células de mamífero também foi efectuada» Michel et al. descreveu a síntese de HBsAq em células de ovário de
HtíV em (1984)
Hamster
Chinês ÍCHO) transfectadas com um plasmídeo portador da sequência codificadora da proteína preS2» Persing et sL5 (1985) descreveu a expressão de três polipeptídeos z-i~ií4
0Θ0 e 35 dal tons em células L de ratinho transformadas com uma sequência codificadora da proteína pre82» tís três polipeptídeos obtidos podem ser organizados em partículas complexas ifflu.no—rsactivas de HasAo com cerca rfs fíèjí de CiSusetro».
McLachlan et al«5 (WÔSS/ÔóíSo) descreveu a expressão ds várias proteínas relacionadas com HBV em células de vertebrados... Aindas a expressão do antiqénio preS em células de mamífero é geralmente dificultado pelo facto ds devido à relativa, superprodução ds proteína preSí relativamente à proteína S a secreção das partículas de HBsAg á inibida. (Ou st ai»,. 1987),, Aindas a proporção das diferentes proteínas relacionadas com S nSo pode ser controlada» Finalmente a cultura de células animais é uma. abordaqem dispendiosa ctue resulta em custos elevados oara o produto obtido» tís oeei quk as vacinas presentemente descritas e em uso tenham grande eficácia», uma certa percentagem das pessoasuma que y
recebem as V3C ΧΠ515 g par 11 cularmente as pe 5505-· x ra u ri o c o íjs ρ r o sta t x—
£3 âS S w Q κ g Do.C i ©Π tS5 ÇZi fi semod i a 1 i se, nSo respon dsiTí ou fazem-no
lentaraente CVer, e. y - ?. e Br Hadier eh - Ί CÃ 1 s P Eoo 1 a J= Med„,
—r j T*r _ z~s «~a Γí < rr· ·.; ia s Ύ—ώ i o e ( x 1 ?! Ή ΓΗ £ Ç&F-pJ ÇS T Η I « q Post brad. Msd« u . =
1 cro (1987)3.
uteis iS
Permanece pois a necessidade de métodos preparação de outras vacinas ef.tezes contr
L. ΟίΏ pQS 5. Ç
HBV.
rtss-iiíf num prisieifu asoetr do oresente invento é proporcionado um microorganismo seleccionado do grupo dos géneros ri?
ieveouras metxxctroficas, oorcsoor o-as
A 5 mais do que uma cá<
de uma uasstf codificadora de um primeiro polipeptídeo e/ou uma ou mais do que uma cópia de uma cassete de expressão (ec2) codificadora de um segundo polipeptídeo? facultstivamente, em adição uma ou mais do que uma cassete de expressão Cec3) codificadora de um terceiro ρο1i peρt í dso·.,· ou
S) uma cópia de uma cassete de expressão (ecl) codificadora de um primeiro polipeptídeo e/ou uma ou mais do que uma cópia de uma cassete de expressão Cec2) codificadora de um segundo polipeptídeo, facultativamente em adição uma ou ovais do que uma cassete de expressão Cec3) codificadora de um terceiro polipeptídeo.
em que as cassetes de expressão compreendem?
a5 um reyulão R que responde ao metanol e/ou depleção de fontes de carbono repressora de catabolitoss
b) uma qrslha de leitura aberta, codificadora da totalidade Cou. parte) de uma proteína tendo a activids.de biológica de um dos sntiqênios de superfície da hepatite 8 =
c) fscultatívamente uma sequência de DMA que serve como terminador da transcrição T?; em que R exerce controle sobre a transcrição da grelha de leitura aberta ε T dirige a poliadenilação de um produto mRiMA» ϊ/ou terminação da transcrição
A vantagem do aspecto atrás referido do invento é proporcionar um meio para a obtenção de partículas compostas contendo várias proporções de proteína preS e S permitindo assim a produção em larga escala destas partículas composta a baixe £ Í“- to a
U presente invento também proporciona um .ila composta contendo pi totalidade ou parte de um ari ti génio de apresenta pelo meno dos pela proteína. S lo menos dois polipeptídeos correspondendo à de uma proteína tendo a actividade biológica uperíície da hepatite 8, em que a partícula ; dois determinantes antigénicos proporcionaproteína preS2 ou proteína preSí s a rsfrida partícula, compreendendo ainda.? facultativsment ficos do hospedeirob .pidos espe
Os termos que se seguem usados ção são definidos como se seques dma ífudsBBí-í- de expre-s-sMo® e região discreta de DMA que funcione numuma unidade de expressão de um o ene como xe to-.
Jefinida como qualquer célula hospedeira como
Uma «unidade de expressão de um gene completo» é iene estructural e o promotor e regiões reguladoras necessáriê sua transcrição e tradução» um uma «reoxâo cooitxcaoora oe uma sequência de DMA codificadora que? a sequência codificadora da proteína
DMA funeiona 1» significa quando fundida em fase com 5, não interfere com a montagem de uma partícula mista de HBsAg» um «derivado funcional^ significa uma sequência codificadora tendo alterações de aminoácidos que não interferem com a formação de partículas e que retenham a imunogenicida.de ou outra função» Tais derivados funcionais podem ser preparados por mutagénese dirigida convencional ou por outras técnicas convencionais.
Um «vector» é definido como DNA que pode transportar e manter ί-Απη·-. Ç fragmento de dNA do inventa5 plasoiídeos. Estes termos- são
Lncluxndos poi n-templa, compreenaiaos como pelos familiarizados com a área da engenharia genética» invento, que compreende outros- temas, é agora descrita de modo mais detalhado pela descrição, exemplos e figuras qus se seguem»
Breve descrição das fiqurass
1- iqura í s
Construção do pI-asmídeo pME4 do pHAKSÍ» 0 fragmento
HAftSl foi transferido para o único sitio Pvull do pHARSl, as
X τ>
SSOtVénC 1-3.3 3Π tirS
íimeiras posições de HARS e o gene da beta· —lactaraase assim como o extremo o? do próprio gene da beta—lactamase foram eliminadas»
Figura 2:·;
Representação esquemática dos fagos lambda portadores de fragmentos de DNA genómico de Hansenula po 1ymorpha compreendendo
a) o gene MOX
b) o gene FMD»
Figura 35 &:= í-B ρ χ a.i=-íH.i!_'sí<_í Lonteui uai fragmento de DMA englobando o terminador do gene MOX clonado no
-•e riLonagem múltipla de pUt;'i9„
Figura 4s
Mapas dos plasmídeos pRB-S269 e pRB-S-271 expressandi qens S sob o controle do promotor MOX ou FMD, resoectivamente»
Figura 5=
Mapas dos plasmídeos pBCs pMS-2? pFS—9= us dois últimos ! gene URA3 de Hanssnula plasmídeos derivam de pBC contendo polymorpha por inserção das setes qs CGntsnoo o promotor MOX ípms-2) ou o promotor FMD (ptb-9) no gene URAS codificador da sequência.
iqura a;
Mapa do plasmá-dso pHÈC2« Este plasmídeo contem um gene da canamicina (derivado de Tn5) sob o controle do promotor ADHÍ Saccharomyçss cerevisiaeEm s.diçao o plasmídeo pHRz compreen— •JF: de a sequência HARtíi, r iqura
A un i d ad e
Mapas dos plasmídeos pRfc<—S—322 e pRB-S-32 Tuncional consists no yens de resiscencxa a. canamicina promotor ADHÍ tal como presente no plasmídeo ρΗΚ foi inseridc regiões HARS dos plasmídeos pRB-S-269 e pRB-5-271»
Fiqura 8;
Construção de pMrS-22 a partir de pMO prea do vírus da Hepatite H foi inserido no sítio EcoKl tío plasmídeo pMOX-PZiin No plasmídeo resuitaní pelo promotor MOX„ prír £ oene preb reouÃtóOo
Figura 9s
Mapa d ο p1as mídeo pMPS-F, w a r a
plasmí ,dec ' a. cassete de expres são ds praS do
ontr® o sítio Xhol eo siti o Stul do fra
plasmídeo original pBc rnrtRÍTnrán rtísct te
Hansenu1a do i-iqura icgg
Mapa do gene UR.A3 de Hansenu la pol y mo rp ha DMA ad j acentes » regiões de
F ioura 1 ί s
Um diagrama ilustrando a estrutura do plasmídeo pRPT121 sís que sequências de um gene estranho podem ser inseridas sob o controle do promotor MO)G f-iqura 12 í estructura do plasmídeo oKL’’ para a proteína sob
Um diagrama ilustrando contendo uma cassete de sxprsssSo controle do promotor MOX.
i-iqura 15 s construção de um plasmídeo de E» coli portador de uma cassete de expressão da proteína L com Sli3 eliminada, pRITI12998»
Um diagrama esquemático ilustrando o processo para a obtenção de um plasmídeo de levedura pRIT12979 capas de expressar uma proteína Lsem Gli3 =
Figura 15g (Jm diagrama esquemático ilustrando a construção do plasmídeo pRiITÍ3191 contendo a sequência codi'ficadora de uma proteína L sem os aminoácidos 53-132 e 146-174»
Figura 16 s
Um diagrama esquemático ilustrando a construção dos plasmídeos ds exoressão em levedura qR1T13192 e ORIT13193 ΐ $ contenda as cassetes de expressão das proteínas L e £Gli L' 5 respect i vamente» microorganismo de acordo com o primeiro aspecto do invente pode ser qualquer membro de um género de leverdura metilotrófico5 que tenha sido manipulado para ser portador de mais do que uma cópia de uma cassete de expressão ecl s facultativamente uma ou mais do que uma cassete de expressão ec2 e/ou facultativamente uma ou mais do que uma cassete de expressão ec-3 ou pelo menos um-a casssete de expressão de dois ou mais tipos diferentes» As cassetes de expressão necessitam apenas de diferir na natureza da proteína codificada a ser expressa e em geral compreendem os seguintes componentess
a) Um regulão R que responde ao metanol e/ou depleção de fontes de carbono repressoras de catabolitos» 0 termo «regulão» como é usada ao longo do pedido compreende qualquer DNA que actua em cis envolvido na regulação da expressãotíe um determinado gene estrutural, 0 termo englobai assim sequências precedendo uma determinada sequência' codificadoras por exemplo? um promotor e sequências que sejam reconhecidas por factores de transcrição ou outras proteínas envolvidas na regulação da transcrição» 0 significado do termo «regulão»não está pois limitado a sequências correspondentes a promotores conhecidos» Estão também incluídas sequências de DNA apresentando a mesma resposta ao etanol como regulSes conhecidos de genes induzidos pelo metanol» i»e» todas sequências funcionalmente equivalentes»
Recentemente tornaram-se conhecidos vários regulSes apresentando as mesmas propriedades descritas atrás» Por exemplo Ledebosr et al» CÍ985) descreve a sequência de DMA reguladora que precede o gene estrutural da metanol-oxidase
<i‘10X) de Hansenula polymorpha. Em EP 85 2®í 235 = 0 de Unilever Í4V, ê descrito um sistema para a expressão de proteínas, o qual envolve a utilização dos promotores que regulam a expressão da metanol-oxidase e DHAS in vivo» Em EP 87 HO 4Í7 de Rhein Biotech GmbH é proposto um sistema adequado para, -a expressão de proteínas estranhas sob o controle do promotor da. forraato-desidrogenase CFMD1» Ellis et al (1985) descreve o isolamento de qenes reguláveis pelo metanol de P ic h ia pastor is, Estes e outros promotores obtidos ou obteníveis a partir de genes de levedura, metilotrófica, que estejam potencialmente envolvidos na utilização de metanol, todos tendo em comum o facto de responderem ã adição de metanol e/ou deploção de uma fonte de carbono com síntese melhorada do respectivo gene por eles regulado» Também estão incluídas todas as sequências d e L-ivK que ãpressRCSfli a mesma resgosoa.«
Uma grelha de leitura aberta ÍORF) codificadora de parte(s) ou da totalidade da proteína tendo a actívidade biológica de um dos antigénios de superfície da hepatite Eh Conforme já mencionado, os antigénios de superfície da hepatite B de um determinado subtipo compreende uma série de aproximadamante seis proteínas diferentes, diferindo no comprimento e no padrão de glicosilação» Estas proteínas apresentam diferentes determinantes antigênicos e também parecem ter diferentes “unções para o vírus viável= Para induzir uma resposta imune preS não ê imprescindível proprcionar a respectiva sequência preS completai, roas pode ser suficiente incluir apenas os codSes codificadores do epitopo relevante na grelha de leitura aberta» .Ainda, uma proteína tendo a actívidade bilógica de um dos antigénios de superfície da hepatite B também inclui proteínas que sofreram alterações de aminoácidos que não interferem com a sua actívidade
biológica«
Facul tativamente uma sequência de DNA servindo como um terminador T, Como terminador pode ser usada qualquer sequência que termine eficazmente -a transcrição no respectivo organismo hospedeiro» Os terminadores podem ser por exemplo sequências com tendência para formar as estruturas em gancho e/ou sítios de poliadenilação em RNA transcrito» Numa realização preferida o terminador deriva dí um gene que responde ao metanol derivado do mesmo organismo e/ou do mesmo gene de onde foi obtido o rsgulão» cional termin entre
Os três componentes estão a para permitir que o regulão .dor termine a transcrição da 1 es» ranjados em ligação operaregule a transcrição e o grelha da leitura, aberta microorqanismo de acordo com o presente invento tem a importante vantagem de a transcrição e tradução daCs) proteina(s) codificada(s) poderem ocorrer em quantidades substancial mente aumentadas devido à presença de mais de uma cópia de uma cassete de expressão codificadora de um primeiro polipeptídeo e/ou uma ou mais de uma cópia de cada uma das diferentes cassetes de expressão adicionais» 0 microorganismo de acordo com o presente invento proporciona a possibilidade de obter qualquer proporção desejada de um primeiro polipeptídeo relstivamente a um sequndodentro da célula» Assim», quando da montagem da proteína ρ-ara formar partículas compostas podem ser obtidas partículas de qualquer composição» Ainda devido à produção de elevadas quantidades de diferentes proteínas em estreita proximidade estas proteínas formam com si)·™.ioi ps uuâui 1 idade pai compreendendo mais oo que uma. espécie de polipeptídeo do que as partículas, conhecidas-» *
microorganismo de acordo
expressa de preferencia toda ou parte da prot tj-κΐ pFX tOSX £ 5.
cassete de J»X£)foe;ctSr} ( í=4f-1 R U&S VSZ CjUç? tBSt-5 c on 5t i tu i a base
estrutural de qualquer part ícula que possa ser formada» Numa
rea1ização 0 microoruanisrao contem ainda uma segunda cassete de
S X p F Βο-ΐ··*^ O \ ec2) qus expressa um polipeptídso reprssen tando Wu£
ou. parte da proteína preSl 5 por exemplo os domínios específicos localizados no extremo N-terminaldesta proteína ou toda ou parte da proteína preS2» Numa outra realização o microocanismo pode conter tr?s tipos diferentes de cassete ds expressão para permitir a exoressão simultânea de trfs do1ipeptídeos compreendendo na
Bí :oda ou parte da proteína da proteína preS2= funda 5 tróficas cerraits □ uso de requloes derivados de leveduras metils
L f teípf” SoSo-O sj Γ**^>5τΗ·ίΞ··5 cultura celular pela adição ou depleçã.o de uma. fonte de carbono ou pela adição ds metanol que é pouco dispendioso» ou mducSio oe uma u oruoo leveduras mstilotróficas compreende membros dos segu.xnces géneross Candida,
Kloecfcera, _____ baccnaroiiivces s eTerSncia Hansenu 1 a» Na realização mais preferida um microorgsnismo ds acordo com o
Rhodotor u 1 a, 1 orulopsis e Pichia, de presente invento ou Hansenu 1 a po 1 ymorpha, As leveduras destes géneros cuEn^czuas e escão escaoeleczoas as- condições qeraus de CFGSC iíBSH TO a sã.o bem cultura e
Uma eslirpe
Hansenu1a pode ser qualquer estirpe polymorpha. Na realização mais preferida preferida da. espécie Hansenula a estirpe a. ser usada tens as caractsrísticas de identificação de Hansenu1a po1ymorpha rctí iu (DSh 5215)» RB l€f s um mutante urat> ds Hansenula polymorpha y
ATCC 3443?
Numa realização preferida, o microorganismo de acorde com o presente invente é capaz da utilização eficaz de glicerol carbono» 0 alicerol é uma fonte de carbono não como Tonte oe repressora de ciandiferente por leveduras catabolitos que é convertida em energia com cies ds levedura do género metilotróficas conhecidas Hsnsenuls são caoazes tís erícaespéaetabolizar f-b-, glicerol com uma eficácia elevada, enquanto 5» cervisiae cresce pouco nesta fonte de carbono» Em adição, o Hansenu1a po1ymorph-a em glicerol resulta numa produçãc ria muito fraca de stanolque de outro modoi provocaria problemas ourante a fermentação em larga escala» secunoa, I_ 1
Os regulões usados para as cassetes de expressão do presente invento são ds preferência derivadas de levedura dos géneros conhecidos referidos atrás» São preferidos os regulões que foram caractsrizados detalhadamente, como sejam a região reguladora de vários genes que respondem ao metanol de Hansenula polymorpha, por exemplo o gene da metanol-oxidase, o gene FMD, o gene DAS ou o gene da catalase» As regiões reguladoras da maior parte destes genes já foram sequenciados e publicadas as s-equên— cias íe.g» Janowicz et ai», iVBo» Ledeboer et al», l'9So, EP 8/ 11© 417)» 0 processo técnico do isolamento destes- requiões a partir do microorganismo adequado é facilitado pelo conhecimento das respectivas sequências de DNA e correspondentes padrões de restrição»
Como termin-ador pode ser incluída qualquer sequência que sirva eficazmente para terminar o mRNA nascente independentemente de ser derivado de um gene eucariótico ou procariótico» Ds termínadores preferidos são obtidos a partir de asnss de
levedura» é preferida a utilização de sequências de terminação obtidas a partir de genes que respondem ao metanol referidos atrás »
Uma outra vantagem dos microorganismos de acordo com o presente invento è o número surpreendentemente elevado de cassetes de expressão que podem ser introduzidas na respectiva célula hospedeira e podem ser mantidas estávelmente» Ds um modo geral existem duas possibilidades para conseguir a manutenção estável de informação genética específicas
A informação pode ser codificada pelo cromossoma ou poda =.=-st pode sei um piasmxoeo, um cosmxoeo: v í rus ou si mi1ares
Normalmsnte são proporcionados níveis elevados de genes por oeos cs replxcaçáo aucónoma de alto numero de cópias ou vírus 1isogénicos» Estes plasmídeos ou vírus são bem conhecidos e geralmente contêm um replicão e um gene de uma marca selectiva que permite a replicação e a manutenção estável do vector» No entanto, os vírus são por vezes sujeitos a conversão para ciclos líticos e os plasmídeos têm tendência a perderem—se em certas condições e ainda muitas vezes necessitam ds pressão selectiva contínua» Ainda mesmo com plasmídeos de elevado número de cópias um número de cópias não excedendo cerca ds 50 a 75 pode ser geralmente obtido em levedura» Por outro lado, a introdução da informação genética pretendida , e»g» uma cassete ds expressão, no genoma do hospedeiro normalmsnte requere um certo grau de homologia entre pelo menos uma parte da sequência de DMA a ser inserida, de preferência os extremos da referida molécula, e o sítio da inserção» Assim o número de potenciais sítios de integração para a rscombinsção homóloga de uma dada molécula ê limitado, em muitos casos a apenas um» Este número é
mais elevado para a recombinação homóloga com os genes presentes est múltiplas cópias ou com estructuras do tipo transposão tais coiiio Ty luacoos et al», x98ó i » P'ara promover a t· ecombin-uçuo integrativa» é preferível usar vectores sem ua replicão masportadores de um gene para uma marca selectiva» o qual confere uma característiea fenotípica detectãvel á célula transformada e permite a identificação em condições sslsctivas.
-A recombinação ao acaso normalmente é um acontecimento raro» No entanto de acordo com o presente invento é passível introduzir numerosas cópias de qualquer sequência de DNA num ou mais cromossomas do genoma, por inserção devida a recombinação ao acaso» Para se obter transformantes portadores de algumas centenas ds cópias da sequência de DNA pretendida, prefere-se usar plasmídeos de replicação autónoma na transformação, os quais por casos simultâneos de integração de algumas. cópias e replicação ds outras podem proporcionar um número elevado de cópias integrável, que podem ser inseridas durante ciclos subsequentes» Surpresndentemente foi possível obter estirpes de levedura metilotróficas portadoras de muxtas uass-ete-” ds
As estirpes- de levedura preferidas, tais como estirpes de levedura do qêners Bansenula, contêm cerca de 2 - 500 preferência Í5 · Haa.i :s>cs·» suao ? u.w< { ve>» u.cã OS -5. 5 wfê
2005 eepecia1mente 20 a 150 copias de u&a sequência de DNA pretendida» Uma vez obtido o número de pretendido de cassetes de expressão integradas podem ser evitados posteriores processos de integração por ciclos de crescimento em meio não selectivo para, segregar as restantes cópias do plasmídeo»
Uma característiea espe-cxal dos mxcroorqarxsmos de acordo com o presente invento é o fenómeno da integração multimê— ricâí Quando da transformação com uffi vector capas de replicação autónoma Hansanu 1 a ρο 1 y morpha integrou 'várias repetições dos
Λ>
plasmídeos usados na transformação» Observaram—se repetições de até cerca de 10© cópias do plasmídec introduzido» J.st presença e integração de um elevado número de cóoias de ísr {«4. E~s= cias de DNA estranho sem pôr em risco a viabilidade das por inserção em genes não essenciais» Surpresndentemente zélulas observou—se serem estáveis os inteqrantes contendo DNA multimérico»
Com a finalidade ds obtenção de vacinas antendo partículas compostas é desejável uma proporção constante dos diferentes polipeptídeos das referidas partículas» Para concreti— zar esta necessidade o presente invento proporciona microorganismos tendouma proporção seleccione.da de diferentes cassetes ds expressão» Por exemplos um microorganismo de acordo com o presente invento pode ser portador de 1 a 160 cóoias de uma cassete ds expressão Cecl) codificadora da totalidade ou parte de proteína tendo a actividade biológica da proteína S e í cópia várias cópias de uma cassete de expressão Cec2’ uma proteína tendo a actividade biológica da proteína preS2
I!
ΙΛίΏ-3.
de ds
OU
Js microorganismos pretensos oortaoores de uma proporçao entre 2 cópias d í~'C 1 pâV-íâ UiBet E__õpX& d-S ícL? $3 cápXH'—· d© de ec2 mais especialmente na proporção IO cópias de ecl para uma cópia ds ec2 ou ó-£ uma cópia ds ec2» Lima terceira cassete de introduzida na mesma proporção de sc2 ou 6-£ uma cópia de ec3.
CaOlSS d í 5contsndo cópxss int©gra.da.s d« p-Sr“S .rpes é fc«?.íísfc*éni autónoma compreendendo sequências de replicação autónoma CARS) s <2 © ·© x p Γβ5 5«lQ ? :ontsndo VBCturBs d© • -l·.-
-a cassete de expressão pretendida» A presença e manutenção dos vectores contendo ARS são bem conhecidos»
SSa também objectivos tio presente invento moléculas de DMA contendo uma cassete de expressão Cecl) codificadora de um primeiro polipeptidea e um a cassete de expressão (ec2) codificadora de um segundo polipeptidea e/ou uma cassete de expressão (ec3) codificadora de ura terceiro polipeptídeo* em que a cassete de expressão compreendes
a) um regulão R que responde ao metanol e/ou depleção de fontes -bono repressoras de catabolitos?
uma qrelha de leitura aberta codificadora de parte (ou b>
partes) ou da totalidade de uma proteína tendo a actividade biológica de um dos antiqénios de superfície da. hepatite B?
racultativamente uma sequência de servindo como
U!3 i-sf f suj-i ;-a dor Ts em que R exerce controle sobre a transcrição da. grelha, de leitura aberta ε T dirige a poliatí-enilação e/ou terminação da transcriçãodo mRiMA produzido»
Para· as propriedades do regulão, da grelha de leitura acerta s oo terminador é feita referência á. informação proporcionada strás» Também para estas moléculas é preferível derivar o regulão ε o terminador de uma levedura mstiloi ;lec<
dos géneros Cand i da, KloeckeraSac c ha romyc es, Rhodo toru 1 a ·., Toruloosis, Pichia e Hansenula. Na realização raais preferida o regulão e o terminador derivam de um gene envolvido na utilização do metanol, por exempla a gene MOX« a gene FMD, o gene DAS ou o gene da catalase» Como fonte destes qenes o microorqanismo *
preferido é Hansenu 1 -a po 1 ymorpha, Para a identidade dos dos polipeptídeos codificados por eci» ec2 s ec3? é feita referência è. explicação dada atrás» iKU X lécula de DNA de acordo com o presente uar Uf invento pode respectivss antiqénios ser composta por fragmentos obcxaos fontes naturais» '0 DMA codificador de qualquer um dos ds superfície da hepatite B pode ser isolado a partir der DMA de vírus intactOjs também designado partículas de Dane» 0 isolamento, clonaqem e ssquenciação dó DNA do virião HBV estão descritos em Charnay e al», (1979)» Saiibert et al», (1979), Sninsky et al», (1979) Valenzuela et al» (1979)» oaí »-Z
A escolha* das enzimas de restrição para a clonagsm e a manipulação do DMA depende da espécie de subtipo do vírus dai hepatite usado» Os subtipos diferem não só no comprimento como também nos padrSes de restrição individuais que estão sujeitos aos casos normais ds mutações» έ possível para qualquer pessoa familiarizada com a matéria identificar o fragmento de restrição portador da região codificadora pretendida, por exemplo por clivagem do DMA isolado usando diferentes séries de endonucleases ds restrição, submetendo as amostras a electroforsse em gel e transferência Southern ou métodos equivalentes e identificação do fragmento de restrição usando uma sonda correspondendo a uma sequência conhecida do qene de superfície» Se necessário, o DNA pode ser sequenciado eainda manipulado» por exemplo por tratamento com endonucleases, por mutagénese in. vitro» preparação de um iniciador ou outras técnicas conhecidas para criar um fragmento tendo o tamanho pretendido, portador da sequência pretendida. e tendo os extremos adequsdí
Tal como é conhecido» os extrsmos podem ser arranjados para terem qualquer sequência pretendida por digestão com sxonucleases, preenchimento com o fragmento Klenow I e adição ou substituição de DNA usando da DNA-polimerase
oliqodesoxirribonucleotídeos sintéticos como liqantes e adaptado—
A sequência de DNA codificadora do respectivo antigénio de superfície da hepatite pode então ser ainda combinado com um regulão e/ou terminador adequados, os quais podem ser obtidos por técnicas conhecidas a partir do genoma de uma levedura metilotrófica» Os fragmentos respectivos são assim adaptados de modo a ficarem numa posição adequada reíativamente ao codâo de iniciação da tradução e ao codão de terminação da traduçãoda sequência de DNA codificadora» A ligação é também efectuada de acordo com procesos conhecidos» Uma vez que estes métodos são bem conhecidos não serão serão fornecidas mais explicações» Para uma descrição mais detalhada das técnicas usadas em clonaqem molecular pode ser consultado «Molecular Cloninq» de Maniatis et al«, C19S2).
Em lugar da ligação de sequências de DNA isoladas exclusivamente a partir das respectivas fontes naturais, é também possível sintetizar parte ou a totalidade da cassete de expressão pretendida por meio de síntese química» A síntese química pode ser conduzida de acordo comtécnicas conhecidas» A síntese química de longos oliqodesoxirribonuclsotídeos já existe numa base comercial» Ainda, qualquer combinação de fragmentos sintetizados quimicamente e de fragmentos obtidos a partir da respectiva fonte natural ρ-ode ser adequada para os fins do presente invento»
Um outro ubjectivo do pr« o qene URA3 obtido a partir de uma 1 foi identificado por complamentação F de E= coli estirpe MB 1 000 com inserção ao acaso de fragmentos polymorpha num vector -adequado» Foi complementou a deficiência da esti sente invento ã proporcionar evedura metilotrófica» 0 qene da correspondente mutação pyr plasmídeos construídos por de restrição de Hansenula identiTicado uír plasmídeo que rpe recipiente» 0 novo gene
identificado compreende aproximadamente í 400 pb medindo em géis de agarose» 0 seu padrão de restrição está apresentado na Figura 1.0 abaixo»
Para facilitar a construção, a amplificação e introdução da cassete de expressão no microoganismo hospedeiro ê aconselhável inserir aquela num vector adequado à. transformação de uma levedura metxlotrõfica« Este vector pode ser um plasmídeo linear ou circular ou um vírus» É possível usar os chamados- vectores de integração, i=e» vectores sem qualquer sequência de replicação autónoma (ARS)» Se estes vectores não estiverem integrados serão perdidos durante os cicios celulares subsequentes»
Numa realização preferida o vector também comoreende tais sequências de DMA ARScapazes de dirigir a replicação autónoma» De preferência estas- sequências microorganismo hospedeiro» No caso das leveduras sistilotróTica existem descritas- várias sequências APS, por exemolo HARS e PARS são derivadas do respectivo
4CRoggekamp s:
ai
Í98é.!! Creqo et al
CL co L.-â*z> ro-trQ Life l í i- X «S bxcontêm uma região de DMA que funciona na manutenção estável do ica dentro da célula vector como i. íâ c
Facilitar a identificação do organismo hospedeirc transformado è ainda preferido proporcionar genes de marcas selectivas adequadas à selecção do microorganismo pretendido após pieismídeos de levedura conhecidos estes qene· transformação» Nos H de marcas selectivas por vezes correspondem a sequências de DM codificadoras de .enzimas envolvidas no metabolismo de -aminoácido ou ácidos nucleicos, as quais são defectívas no organismo hospe deiro recipiente a ser tr-ansform-arin.
A mesma estratégia pode ssr aplicada na selecção de te usados na selecção de estirpes auKotróficas de Saccharomyces nengei j_Fl 52.
TRP e URA3 o U;
cerevisiae incluem
genes obtidos a partir >
ssr usados como marcas
me ti1otró f icas, no eritan
SsTs me i ο stím sio poderá ss
realização preí erida do '
metilotróficas □ st i d isn u
envolvidos no metaboli
molécula de DiMA portador.
gem» 0 presente invento
gai-ut sar mwyt.es »-er ev xsxa.e puuein ectivas na transformação de leveduras o crescimento de tais transformantes ioderâ ser considsrávelmente inibido» .Assim. numa isente invento as estirpes de levedura na função de qualquer um dos genes j normal sSo transformados com uma io gene homólogo da marca tipo selvaOporciona pela primeira vez uai gene marcador homólogo para a selecção de transformantes em Hansenula. polymorpha» designadamente o gene URA3. As características deste genes i«e» o seu padrão de fragmentos de restrição está discutido abaixo»
b.
LrOtíiL? Vii pode—se fazer uso de genes de res uma abordagem bem conhecidas para a transformação de bactérias mostrou—se aplicável a S» cerevisias íJimenez e DavieSn X9S0)» selecção de i rstibfuraisníss tlncia a -antibióticos» Esta é imo entanto, para, as leveduras metilotróficas até agora nada era conhecido no que respeita ao seu comportamento quando do contacto com antibióticos tais como cloranfenicol ou gentamieina G418» Pensa—se que seja a primeira descrição da selecção de leveduras metilotróficas transfarmadas submetendo-as às mesmas concentrações selectivas de crescimento de antibióticos aminoqlucósidos inibidores do crescimento após o processo de transformação o Surpreenden temente 3 a antinoq lucósidc—fosfotransf©rase derivada de Tn5 CBrxndley» 198®) mostrou-se activa também em leveduras metilotróficas quando regulada por um promotor obtido a «X
partir da levedura de padeiro» .A inactivação de G418 é eficaz também em estirpes onde apenas uma ou duas cópias do gene estão presentes na célula, i»s« o gene não é necessário num número de cópias elevado. De acordo com o presente invento isto ê um sistema de transformação/selecção muito eficaz nas leveduras metilotróficas»
Na realização2 mais preferida o vector de acordo com presente invento é seleccionado dos vectores pMS
Ol“ 23’ pRB-S-269 ? pRB-5-27í5 pRB-5-322, pRB~S-32ó s pMRS22 , pMPS9« A construção e utilização destes vectores será, abaixo mais detalhadamente»
X η pMPS21»
Um outro objectivo do presente invento é um processo para a preparação de um microorganismo como descrito atrás, em que um organismo hospedeiro levedura meti1atrófica é transformado com um vector portador das cassetes de expressão sei e/ou ec2 b/ou ec3 e em que quando da replicação do vector pelo menos algumas das cassetes de expressão são integradas por recombinação no cromossoma do organismo hospedeiro levedura, de orefer'ê'ncia uOn^»fcf€|L<*ônC 3.-3 a u’ Oi’*Q3.n como uma repetição multimérica» Como metilotrófice- transformado pode conter várias cópias de qualquer cassete de expressão introduzida dispersa por todo o genoma» mas também com uma probabilidade elevada de as repetições multimericas das cassetes de expressão estarem localizadas num sítio do genoma» Este tipo de recombinação observou-se ocorrer especialmente em Hansenula» No entanto5 o organismo hospedeiro levedura metilotrófica pode também ser seleccionado de qualquer outra espécie dos géneros de leveduras metilotróficas, por exemplo, Candida, Kloeckera, Saccharomycss, Rhodotorula» Torulopsis e chia,
J»
Na realização mais preferida o organismo hospedeiro é seleccionado da espécie Hansenula polyffiorpba. exemplificada por unta estirpe tendo as características de identificaçãade Hansenu 1 a polymorpha RB í®„ Hansenula poIymQrpha RB 1Θ foi depositada no «Deutsche Sammlung von Mikrooqanismsn und zelIkulturen» soí 17 de
Fevereiro, 178? o recebeu o NS de acesso DSM 5215 outro asoecto deste invento» lonstxtux uni que ouoros vectores
Be bem que seja preferido efectuar usando qualquer um dos vectores a.trás descritos de acordo com presente invento, será também possiv construídos e usados.
Para se obter microorganismos contendo mais do que uma cópia de uma cassete de expressão (ecl) e facultatívamente uma ou mais do que uma segunda cassete de expressão Cec2>5 a via mais conveniente é o processo que se segue envolvendo vários passos» De acordo com o processo» o organismo hospedeiro metilotrófico a) é transformado coni um primeiro vector e inicialmente cultivado em meio selectivo, seguido de durante várias gerações, estáveis contendo mais do oaçao •j nr!íhar&
lunoiciies a 1 Sí— t x v o?
que uma cassete de expressão íecl) codificadora de um orimeiro polpeotideosão seleccion-ados,
USj referido transformantes são facultativamente livres de plasmídeos de replicação autónoma residuais, d) os referidos transformantes são facultativamente transformados com um vector e novamente inicialmente cultivados em meio selectivo, seguido de incubacão s—m COndlt-uS^ iyO£-=- nao seieccivsiB emente varias gerações?
x u. x. L/ nam-se os transformantes mitóticamente estáveis contendo mais do que um-a cassete de expressão (ecl) codificadoras de um primeiro polipeptidao e facultatívamente uma ou mais do que uma cassete de expressão Cec2> codif icadoras de um segundo pol ipept.£deo;« f> os referidos transformantes são faeultatívamente livres t ran s f onsan f es dos plasmídeos de replicação
autónoma residuaisf os passos d) a são facultativamente repetidos u :C or
De acordo com este processo, é possível aumentar o número de cassetes de expressão de um tipo5 por exemplo^ ecl., sujeitando as células a vários ciclos subsequentes de transforma— ção5 crescimento em condiçSes selectivas/não selectivass selecção dos transformantes e facultativamente eliminação ds olasmídeos» Como alternativa^ dois ou mais tipos de cassetes de expressão podem ser introduzidos usando um vector de um único tipo contendo duas ou mais cassetes de expressão ou submetendo as células aos ciclos atrás descritos? em que a transformação ê efectuada usando diferentes vectorssg portadores de diferentes cassetes de expressão» 0 processo ds acordo com o presente invento proporciona assim uma variedade de possibilidades para obtenção de um microorganismo pretendido«
Um objectivo -do presente invento é também uma partícula compostas compreendendo pelo menos dois polipeptídeos correspondendo -a parte ou á total idade de uma proteína tendo a activi— dada biológica de um dos antigénios de superfície da. hepatite B, :??« ‘Jb.B dois determinantes proteína preS2 ou s pariicuias apresentam selo menos antiqénicos propocionados oala proteína S, proteína prsSl5 a referida partícula contendo facultativamente os 1ipidos específicos do hospedeiro» Em geral., as partículas são feitas de uma proteína maioritária tendo as características antigénicas da proteína. S? o que também constituicerca de 8® a . — X.
i r i *5 r í i r
9®/c ua.s psrtiLiilãs de .z® um naturais,
As partículas compostas podem -ainda compreender qualquer uma das proteínas tendo a antigenicidads dos domxnios especíTicos da proteína preSl ? ϊ.β« peptídeos correspondendo a pelo menos parte dos aminoácidos N—terminais í®8 (ou 119) da proteína prsSl du/s qualquer proteína tendo a anteqinicidade de domínios específicos oreS2- i»e»
peptídeos correspondendoa pelo menos parte dos odomínio específico de preS2» aminoácidos dO
A presença de duas ou mais proteínas diferentes, tendo a actividade biológica dos antigénios de superfície da hepatite B numa partícula é uma nova abordagem para o projecta da vacina anti-hepatite B derivada de levedura» As partículas ou agregados derivados de levedura até agora obtidos contêm exclusivamente a proteína S ou a proteína preS2 ou a proteína preSis i»e» apenas Ufna das três proteínas possíveis» Se bem que tenha sido mostrado por Valenzuela et a
Λ :: jj (1980/ e ILhu sl al». Clvtíó) proteína preS2 é montada em partículas, para a proteína pr está descrita a formação de um mistura de partículas pequenas <2
O» i nm de diâmetro) ou uma. população polidispersa de grani agregados com 15 a O0 nm de diâmetro (Kniskern Imamura et al», 1987)= et a(
Rutgers et al»3 (1988) descrevem que nos agregadas ou partículas de proteína preS2 e de proteína preSi, os epítopos codificados pela proteína 8 estão mascarados uma vez que estas partículas são menos reactivas no ensaio AUSRIA» Isto pode ter um efeito prejudicial na resposta imune relativamente â proteína S quando as partículas compostas de espécies homogéneas da proteína preS são usadas como imunogénios nas vacinas»
Assim, o presente invento proporcionai pela primeira vez pssrs-iculas composras compreendendo meus de uma especie de antigé— nios de superfície da hepatite B» Por analogia cora partículas compreendendo apenas uma. proteína produzida em Sacchsroisyces cerevisiae, as partículas de acordo com o presente invento compreenderão normalmente lípidos específicos do hospedeiro»
Numa realização preferida as partículas compostas de acordo com o presente invento compreendem mais do que IX- da proteína preSÍ?
»sto da proteína sendo proteína S s facultativamente alguma proteína prs52= No entanto? as partículas preferidas contêm Í-50X? especialmente 1-25X de proteína preSÍ? oresto sendo o mesmo de atrás» Em realizações especíalmente preferidas? a proporção de proteína preSÍ para proteína S é entre Isl e
100 ? d e p re fe rên cia fts partículas de acordo com o presente invento são peio menos parcialmente qiicosiladas» Uma proporção das proteínas preSÍ em leveduras metilotróficas são glicosiladas? conforme indicado pela detecçSo de bandas com pesos moleculares de 45 KD, 38 KD e 39 KD. Será apreciado pelos familiarizados com a matéria que o número s tamanho das espécies de proteína. preSÍ observados por irauFiotransferência pooe apresentar alguma varxahx xioaoe
-aparente» A detecção d alia» da sua resolução acrilamida variações i mter bandas de 45? 58 e 39 ku dependerá _ durante a slectroforese em gel de polide Isvedura e processo usados na imunotransferência» i-a eucacia dos
Ainda? o método escolhido para a preparação dos extractos celulares brutos e a composição específica do tampão usado na extracção podem também influenciar a detecção de uma banda particular» As proporções relativas d-as três espécies podem também variar com as condições de crescimento» Ainda? os cálculos- dos pesos moleculares estão também sujeitos a variação experimental s dependem dos padrões usados na calíbraçSo» A glicosilação da proteína 8 não 3 o i obse rv ao a.»
As partículas compostas descritas atrás são convenientemente preparadas por cultura de uma estirpe de levedura metilotróf ica de acordo com o presente invento num meio de culturí adequado» Usando um sistema regulado de expressão? a síntese do-·
componentes das partículas pode ser contralàcT&”'para evitar que a sua expressão afecte o crescimento celular» Assim em qualquer densidade celular pretendida3 a síntese proteica controlada pelo regulão do metanol pode ser desreprimida para permitir a expressão da proteína heteróloga«Quando da expressão coordenada dos diferentes tipos de antxgénios de superfície da hepatite B em estreita proximidade, dá-se a formação ds partículas» Estas partículas podem ser isoladas a partir da cultura por meio de técnicas bem conhecidas^ por exemplo por centrifugação isopicnica, cromatoqrafia e outros métodos conhecidos,
U mesmo método pode ser também aplicado de modo a obrer-se parcxcuias ou agregaoos compreenoenoo apeou de antxgénxo de superfícx ;1 quando são usadas estxrpí uma es pec xe adeouadas»
Numa res1 i zação« síntese proteica dirigida · cassete de expressão começa quando da deplecção das fontes carbono repressoras» As células3 que foram préviamente sujeite repressão por catabolitos», começam a expressão quando da dilu;
essor. u efeito daí u X.
n.Kw 5 ^ue resulta na indução de etanol resulta desrepressão do agente aumentado pela adição ds metanol regulão que responde ao metanol» A adição de metan aumento ate lu vezes da sxntess oa proteína heteróloga
Numa realização preferida^ o meio de cultura contem glicerol como fonte de carbono» 0 glicerol é uma fonte de carbono tendo um efeito mínimo de repressão dos catabolitos» Concentrações de glicerol até 0?3X não afectam a repressão» Portanto3 quando se usa um meio de cultura contendo glicerol, esta fonte de carbono não tem ds ser removida completamente antes da adição facu1 ta t iva de metano1» y
A fermentação -das estirpes d-s levedura metilotróficas de acordo com o presente invento é efectuada entre 30 s 40°C usando um meio mantido a pH 4 a 6= SSo dados abaixo exemplos de meios»
Numa outra realização preferida deste invento a partícula composta pode compreender qualquer uma das proteínas L modificadas descritas .genéricamente e específícamente abaixo» oroce.ina =
Numa realização particularmente preferida modificada corresponde a um polipeptídeo de 280 aminoaczaos contendo os resíduos 12-52, 133-145 ε 175~4®-0 relativamente è. ORF no vírus HBdo serotip-o ad»
Ainda numa outra realização preferida deste invento partícula composta pode conter polipeptídeos do antigénio superfície da hepatite B de diferentes subtipos para alarqar gama cs proiscçac r-, v~r-. 4- ks 4 ή ·&·: t tm seja s. proWxns b poeíe ssr da espsciTicias· de do subtipo ad e a proteína preSl e/ou a proteína L e/ou a proteína preS2 do subtipo ay ou vice versa» objectivo do presente invento é ainda, uma compreendendo a nova partícula composta ou proteína do íilQQ 1T .1C ad £·.
c o® pos x ς: ao antigénio ie superfície da hepatite B produzida de acordo com o presente invento, Outros componentes estabi1izadores, substãncias como wat da composição do invento podem ser ’tamponantes, diluentes, sais tais conforme foi descrito atrás, a finalidade inicial do presente invento é proporcionar uma vacina contra a o vírus ds hepatite B» Assim» uma vacina compreendendo uma partícula composta como descrito atrás ou o antigénio ds superfície da hepatite B produzido da «acordo com o presente invento ê ainda um objectivo
do presente pedido» A vacina pode corapreenaer ainoa substâncias, por exemplo sais, estabilizadores, adjuvantes e/ou outros aditivos fisiologicamente aceité.veis» A v-acina compreendendo partículas compostas induz a formação de anticorpos dirigidos contra pelo menos dois dos possíveis determinantes antiqénicos dos antigénios de superfície da Hepatite B» Devido ã presença de domínios específicos de oreSí © específicos de prsS2, mesmo os
indivíduos que não respondem ãs vacin veis, podem ser protegidos contra a infecção pela hepatite B» Em geral a vacina de acordo com o presente invento evocará uma resposta imune mais larqa do que as presentes vacinas e ainda pode ser produzida -a custos mais baixos devido à elevada quantidade de expressão por células è. elevada densidade celular» u presente invento também provou ser útil para o desenvolvimento ds um kit de testes» Ao proporcionar—se uma composição compreendendo as partículas compostas de acordo com o presente invento, é possível controlar a formação da complexos imunes formados entre anticorpos de um índividuo infectado com tais partículas» 0 kit de testes requere ainda o fornecimento de um agente ds detecção, por exemplo, um anticorpo de cabra anti—IgG humana, marcado por qualquer uma das técnicas conhecidas» 0 anticorpo, que pode certamente ser também derivado de qualquer outro mamífero, pode por exemplo ser acoplado a uma enzima ou pode ser marcado radioactivamente para se efectuar -a detecção» A vantagem ds um kit de testes que responde a anticorpos contra.
dominio'· ©speuificos de preSÍ e preS2 é a possibilidade detectar precocemente a infecção por HBV, uma vez que os anticorpos anti—preSÍ s anti—preB2 aparecem antes dos anticorpos anti—S durante a infecção com HBV no homem (Pstit et al., 1986)= Assim o kit de testes de acordo com o invento proporciona um meio conveniente para o diagnóstico precoce desta doença altamente infec*
Mura outro -aspecto o presente invento proporciona uma proteína grande de superfície modificada (daqui em diante proteína L modificada) do vírus da hepatite B CHBV)» Tal proteína L modificada tem uma sequência de proteína L caracterizada pela ausência de sítios preferencialmente atacados por proteases» A eliminação destes sítios proporciona uma molécula menos sensível às proteasess que quando da expressão produz uma proteína fácilmente purificada na forma de partícula»
Um outro aspecto do presente invento é uma proteína L modificada caracterizada pela ausência de· um aminoácido necessário à miristoilação da proteína»
ΗΙΠΟί. ftUSi OUΤΙΓΟ S5DSCIO Ο ΡΓ656Πΐ£ ΧΠνΊΞΠΈΟ inclui uma proteína L modificada que se caracteriza pela ausência de vários potenciais sítios de glícosllação» A eliminação da glico— si1ação da proteína L melhora a apresentação dos epítopos que estejam protegidos^ distorcidos ou alterados pela qlicosilação da proteína que ocorre durante a expressão em hospedeiros de levedura» A proteína L modificada desglicosilada apresenta os epítopos protectores B e signifícantes epítopos TH da região preSÍ? preS2 e S na sua conformação correcta, bem expostos na superfície da Π-3. r t í c u I-ΞΙ γ’θέξλλ 1 t-3.n t®B
Um outro aspecto do presente Invento inclui uma proteína L modificada caracterizada por uma delecção de uma parte da região preSSj a qual inclui o sítio de ligação à albumina do soro CpHSA)» Esta modificação da proteína L. elimina assim a potencial tolerância ou problemas auto-imunes ligados à. presença do recep— tor de pHSA sem perder os principais epítopos B da região preS2»
Ainda num outro aspecto deste invento^ é proporcionada uma proteína L que se caracteriza como não qlicosilada e tendo
4«
menor sensibilidade âs proteases e menor capacidade de ligação a pHSft. Esta proteína contem as sequências da região preSi correspondendo -aos resíduos de aminoácidos 12 a 52 fundidos ãs sequências da região preS2 correspondendo aos resíduos de aminoácidos 133-145, seguido de toda a sequência codificadora da proteína S numa grelha de leitura contínua.
As proteínas L modificadas deste invento podem ser expressas nSo só em leveduras metilotróficas como já discutido mas também noutros sistemas de expressão de levedura que produzam as proteínas como partículas retendo os principais sítios antigénicos codificados pelos três domínios preSi, oreS2 e S« As proteínas L modificadas podi samoem ser proteína S em levedura para formar partícula de composição em subunidadss mista. Outros sie-temas de expressão, e„g»? de bactérias, insectos, mamíferos, podem também produzir as proteínas L modificadas em várias formas.
Um outro aspecto deste invento também procorciona novas 'sequências de codificadoras das proteínas L modificadas do presente invento. Num outro aspecto deste invento, tais sequências de D!'-ís4 podem ser xncorporatías em vectores sob o controle de sequências reguladoras adequadas»
Ainda como um outro aspecto é proporcionado um método para a produção de uma proteína L modificada de HBV como descrito atrás envolvendo a cultura de uma célula de levedura transformada com um plasnsídeo de expressão em levedura expressando uma sequência seleccionada do gene da proteína L modificada sob o controle de sequências reguladoras adequadas .e empreqando condições de cuitura adequadas, rt proteína L modificada pode também ser cq-expressa num hospedeiro levedura com a proteína 3. A proteína
L resultante pode ser
Lsoiaoa da culru?
ou lisado celular por s>
técnicas convencionais., A proteína L modificada pode ser isolada na forma de partículas de composição de subunidades mista, ou homoqénea dependendo da sua co-expressão com a proteína S,
Ainda, como outro as-pscto5 o invento proporciona, um método para a produção de proteínas L modificadas noutros sisted e e x ρ r essão bac te r i an os ? insecto, e,q = , sistemas de mas de expressão? incluindo sistemas sistemas- de expressão em células de baculovírus-5 sistemas de expressão em células de mamíferosξ
Ainda, um outro aspecto deste invento são compreendendo uma ou mais proteínas L modificadas deste sõzmnas ou em combinação c<
vacinas mven to 3 outros agentes vacinais e veículos e adju.vantes de vacinas farmaçãoticamente aceitáveis. As vacinas descritas podem também incluir a proteína L modificada na forma de uma partícula de composição em subunidades mista com outros peptídeoí ,e, protema
Do que foi dito será apreciado que as moléculas da nova proteína grande <L) modificada de superfície da hepatite B podem ser usadas sózinhas ou com outros comoonentes de HBsAq ou HBV para proporciona? oessoas contra, a aqerou auinais para usai· na imunização de
Lnfecção por HBV» □ invento também envolve a expressão de uma proteína L modificada numa, célula hospedeira adequada sob controle regulador adequado.
A proteína l_ modificada do presente invento é caractsrizada por delecçã.o;, inserção ou modificação de uma variedade de sequências da aminoácidos na região preS, Deve—se compreende? que que a molécula, a ser modificada e expressa aqui já foi desprovida dos seus primeiros li aminoácidos e contem 163 aminoácidos na
desejável para as regiões pre região preSi (ver pedido de patente copendente U=S= SN aqui incluída como referência)» A redução de tamanho resultante da região preS facilita a formação de partículas na célula hospedeira e modifica várias propriedades biofísicas da molécula, as quais podem tornar a partícula L modificada particularmente a produção e utilização de vacinas» por exemplo, ;S encurtadas do presente invento podem permitir melhor apresentação dos epítopos S e preS na partícula para interacçlo com o sistema imune, aumentando assim a irounogenicidade »
Numa rsfiXizsçao, o presente ιπνειιΐυ proteína L modificada a que se retirou Gli 13 na regiSo preSi» A proteína 1 expressa jf uyuruiurid unis.
o resíduo as aminoácido portadora de um grupo miristilo covalentemente ligado numa ligação amida, como descrito no pedido de patente copendente U»S» SN 07/009,325» Um resíduo Gli N—terminal é um requesito essencial ã mirxstoilacãc uma proteína Esowler
Borooni
Rev
Biochem»» 57?69-99 (1988)1= Portanto,uma proteína L modificada dequada deste invento è codificada por DMA tendo uma deleçSo do codão Glii3 ÍG88) da sequência de nucleotídeos codificadora da proteína sta dsleçSo resulta mtese de uma protexna u nSo-mi ris ti1atía,
Uun i o? iae aqui e usado o sifobuixo deits deleçSo» Assim, por exemplo, L modificada deltaSlil3 significa proteína L modificada sem o resíduo de aminoácido 13 íqlicina)»
Uma outra realização do presente invento é uma proteína i_ HindiTicaua em que toj exxmxnado um ou maxs sítios oe qlxeosxla— çSo potenciais, A proteína L expressa em levedura é portadora de uma cadeia de oligossacárido ligado em N na Asnl23 e várias cadeias de m-anose ligadas eis 0 a resíduos Ser e Tre em ambas as \
regiões preSÍ e pre82 da molécula como descrito no pedido de patente U»S = SN 009,325, identificado atrás Ever também Rutgers et al«, «Virai Hepatítis and Liver Disease» ed „ fi» -J,, Zuckerman, A«R» Liss, New York, pp 304-308 (1988)3« Para remover o sítio de N—glicosiiação que é caracterizada pela sequência Asn—X-ÍSer ou Tre), onde X pode ser qualquer aminoácído, a sequência, nas posições de aminoácidos 123-Í25 é alterada» 0 sítio de glicosilação ligada em N pode ser eliminado por delecção ou substituição dos aminoácidos nas posições 123 e 125, eliminando o aminoácido Í24 ou eliminando toda a sequência 123-125» Para destruir os sítios de glicosilação ligada em Q, todos ou alguns dos resíduos Ser e Tre na sequência L foram eliminados dela ou substituídos com outros aminoácidos na proteína» A proteína L expressa a partir do plasmídeo pRIT13192 é caracterizada por ser total ou parcialmente não glicosilada»
Uma outra proteína L modificada do invento contem uma dsleçSo na sequência preS2 nos resíduos de aminoácidos Í2Ô-132 da região preS2 responsável pela ligação da albumina sérica humana polimerizada CpHSA) Cver Machida et al, referido atrásj. A ligação a pHSA é grandemente diminuída nas proteínas sem esta sequência»
Uma outra proteína L modificada de acordo com o invento é caracterizada por delecção ou alteração dos sítios sensíveis a proteases» As ligações peptídicas sensíveis a proteases existem na sequência preS antes dos resíduos Arg á volta da posição 1©@ na região preSÍ EHeermann st al»„ Interv iro1oqy 28» 14—25 (1987)3 e antes dos resíduos de aminoácidos Arg137, G1Í149 e Arg167» As deleções ou outras modificações introduzidas na região codificadora da proteína L para remover alguns ou todos os codões destes resíduos produzem uma proteína L menos sensíveis è -seção de proteases»
As delecções introduzidas na região codificadora da proteína L para formar proteínas L modificadas de prsfeência deixando intacíos os codSes dos aminoàcidos 21-47 e 133-145= Pensa-se que estas sequências proprocionam à proteína modificada a capacidade tíe induzir anticorpos específicos de preS correlacionados com proteção imune Ever e»g», Itoh et ai», supra!»
A construção de um plasmídeo de expressão de levedura exemplificativo pRIT12979 codificador da proteína Slil3 L está descrita no exemplo F»1 abaixo» A análise da expressão da proteína L modificada a partir do plasmídeo pRITÍ2979 quanto ao nível de expressão, modificações pós—trdução e montagem macromolecular está descrito no Exemplo F»2»
Uma outra proteína L modificada, sem as três propriedades atrás referidas, i»e» para funcionar como substrato para as enzimas de glicosilação de levedura, capacidade de ligação a pHSA s sensibilidade a proteases, e modificada por remoção dos codSes dos resíduos de aminoàcidos 53—132 e 146-174 da região preS está ilustrado no plasmídeo pRIT13192, descrito no Exemplo F»3 abaixo» 0 plasmídeo pRIT13192 contem os codSes dos resíduos de aminoácidos 12-52 e 133-145 da região preS» A análise da expressão da proteína L a partir do plasmídeo pRIT13192 está também aqui descrito (Exemplo F»4>» A proteína L expressa a partir de pRITl.3192 mostra assim que uma capacidade de ligação a pHSA grandemente reduzida, uma maior resistência a proteases e menor g licosil-ação»
Ainda uai outro exemplo de proteína l_ modificada do presente invento combina as deleçSes introduzidas nas sequências codificadcras da proteína L do pRIT12979 s pRIT13192» A proteína L expressa por esta sequência codifica uma proteína L não miristilada, menos glicosilada, menos sensível às proteases com menor capacidade de ligação a pHSA» ή construção do plasmídeo de expressão pRIT13193 portador desta inserção da sequência L modificada está também descrito detalhadamente no Exemplo F»3 abai xo»
As sequências dá proteína L modificada, incluindo toda a sequência codificadora de S, para usar no presente inventa podem ser preparadas a partir destas sequências codificadoras da proteína preS e S da Tabela A por mutagénese dirigida convencional Cver, B»g«5 Botstein et al», Science, 259sí193 (1985)3 ou técnicas de DMA recombinante, Evers e»g», T. Maniatis et al». Molecular Cloníng, A Lahoratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory í1982)3» Os números das posições de aminoácidos referidos abaixo correspondem aos números das posições na Tabela A por questões de clareza» No ent-anto, outras versões publicadas das sequências S e preS podem ser usadas na preparação de proteínas L modificadas deste invento por alguém familiarizada com a matéria»
Por exemplo, a proteína S pode ser isolada a partir do DMA extraída de partículas de Dane em soro humano infectado par preenchimento da região de cadeia simples com uma DMA-polimerase, de preferência a. polimera.se endógena, seguido de digestão com uma endorsuclease de restrição» A escolha da endonuclease dependerá, em parte das partículas de Dane particulares» Por exemplo, a sequência codificadora de HBsAg do DMA de HBV de certas partículas de Dane do serotipo adw pode ser isolada num único fragmenta BamHXj a sequência codificadora de HBsAg do DMA de HBV de certas partículas de Dane do serotipo ayw pode ser isolada num fragmento Hhal» 0 DNA de HBV das partículas de Dane do mesmo serotipo apresentam diferentes padrões de sítios de restrição»
A construção das sequências de proteína t modificada deste invento podem ser conseguidas usando vectores intermediários, As técnicas para clonagsm de fragmentos ds DNA em fagos estão descritas, por exemplo, por Charnay et al», Nature266i S93-895 (1980) e Tiollais, United Kingdom Patent Application 2,034,323»
A proteínas L modificadas deste invento pode- ser construiria numa molécula ou vector de DNA recombinante» Um vector recombinante deste invento compreende a sequência da proteína L modificada deste invento operacionalmente ligada, a uma região reguladora» Tal vector pode também conter adicionalmente um replicão dependendo da. preferência e/ou do hospedeiro a ser empregue, 0 termo «replicão» pretende significar a região mínima de DNA que funciona para manter estável mente e fora, do cromossoma um vector recombinante num organismo hospedeiro eucariótico ou procariótico transformado com tal vector» Tais replicSes são bem conhecidos na área., 0 termo «região reguladora» pretende significar qualquer sequência de DNA que contenha u.ma região de promotor e outras sequências necessárias à transcrição de uma sequência codificadora que regulem a. transcrição de uma sequência codificadora de um gene estrutural, Tais regiSes reguladoras são bem conhecidas„
Tal vector pode ser preparado por técnicas convencionais como sejam por inserção da sequência codificadora da proteína modificada deste invento num vector já contendo um replicão e região reguladora de tal modo que a molécula de DNA é operacionalmente ligada a tal região reguladora» Esta molécula de DNA ou uma cassete de expressão contendo a sequência codificadora da proteína L modificada, pode ser construída por técnicas convencionais, como sejam por ligação da sequência, codificadora de L à sequência regu1adora»
A restrição do DNA para preparar fragmentos de DNA usados no invento, ligação ds tais fragmentos para preparar moléculas de DNA recombinants usadas no invento e inserção em microorganismos são efectuadas por técnicas conhecidas, tais como as técnicas descritas- nas referências prévia e subsequentemente citadas» As condições- são seleccionadas ρ-ara evitar desnaturação do DNA e das enzimas» As enzimas de restrição e 1 ig.as.es usadas na realização deste invento podem ser adquiridas comercialmente e deverão ser usadas de acordo com as instruções que as acompanham» A DMA-ligase de T4 é a ligase preferida» □s vários fragmentos e construções finais usados na expressão das proteínas L modificadas e os componentes dos vectores portadores destas sequências codificadoras para a expressão em células hospedeiras no método do presente invento podem ser ligados uns aos outros usando métodos convencionais conhecidos- dos familiarizados com a área» Em muitos casos, os genes foram isolados e feitos os mapas ds restrição -assim como a sequenciação» Para tal pode-se seleccionar a sequência de interesse» como seja a sequência codificadora da proteína do invólucro de HBV, por restrição do gene, empregando outra manipulação conforme for necesário como seja novo corte com Ba151, mutagênese in vitro, reparação com iniciadores ou similares, para proporcionar um fragmento de um tamanho pretendido, incluindo a sequência pretendida e tendo os extremos adequados» Ligantes e adaptadores podem ser usados para a ligação ds sequências, assim como substituição de sequências perdidas, sempre que um sítio de restrição empregue seja interno relativamente â região com interesse» Os vários fragmentos que são isolados podem ser purificados por electroforese, electroeluidos, ligados a outras sequências, clonados, novamente isolados e pósteriormente manipulados»
Í3-3
A utilização das regiões reguladoras no controle transcrição do gene L modificado ds interesse pode permitir o crescimento das células hospedeiras para densidades elevadas sem expressão ou com níveis de expressão muito baixos do gene es-truru.al e depois indução da expressão por alteração das condições ambientais, como sejam nutrientes, temperatura e similares»
Q vector portador da sequência codificadora da proteína L é transformado e expresso numa célula hospedeira seleccionada por técnicas convencionais» A célula então cultivada num meio de cultura adequado, i»e», os meios que permitem ao hospedeiro sobreviver e exoressar proteína modificada em quantidade recuperãvel, Por exemplo, sempre que um-a célula hospedeira de levedura é seleccionada, um meio exemplificativo ρ-ara tal utilização é o meio mínimo Yeast Mitrogen Base» Os meios de cultura -adequados podem ser seleccionados por alguém familiarizado com a matéria dependendo do hospedeiro particular empregue no método» isolamento da molécula da proteína L modificada do invento pode ser a partir de um lisado celular ou extracto do meio de cultura da célula, hospedeira dependendo da capacidade da célula para secretar a proteína modifiçada» A- recuperação da proteína deste invente? é efectuada por técnicas convencionais de isolamento de proteínas»
Para a produção de proteínas L modificadas deste invento pode ser selecionada uma célula ou linha celular hospedeira» As células- ou linhas celulares adequadas podem ser células de levedura» Muitas estirpes de células de levedura conhecidas dos familiarizados com a matéria estão disponíveis como células nospsoeras para a expressão de proteínas L modificadas- do presente invento» Na prática deste invento, pode ser empregue qualquer espécie de levedura» Num aspecto, os exemplos abaixo
emρregam Saco harofiycss, disponíveis numerosas es pibiXCOí i a oo r a to r 3. os;
Sbpeui i ícaaieiiLe S, cerevisias» Existem irpes ds 5. çerevis1se nos decositários e = g,? American Type CuI fure Collection,
Num outro aspecto pode ser usada Hansenu 1 a po 1 yntor pha,
Podem também ser empregues outras espécies de levedura.
incluindo., sem limitação, Hansenula,
KluyvBrgiByces e Schizosaccharomvces =
Picnia,
Candidí eu c a r oó t x c aí . outras espécies de células de mamífero, tais como células d células hospedeiras ovário de hamster chinês íuHu) ou células 3T3«S podem tc‘“ gues como células hospedeiras para a expressão das proteínas L aqui descritas, A selecção ds células hospedeiras ds mamífero adequadas e métodos para transformação, cultura., amplificação» despiste s produção e purificação do produto são conhecidos.. Ver» por exemplo Sething e Sambrookj Nature, 293g620-625 (1931)., ou alternativamente5 Kaufman et al» tlol» Cel 1» Biol,5 (7) s 1750-1759 (1985) ou Howley et al» Patente U,S» 4,419,446» Outras linhas ds células ds mamífero adequadas são & linha celular COS-1 e a linha celular CV—Í»
Sera entendido que algumas das deleçoes introduzidas na. sequência codificadora da proteína L descritas atrás alteraram as sequências internas envolvidas na transcrição e tradução de mRNA específico ds ri e S em células de mamífero, Tal sequência codificadora da proteína L modificada permite pois» a expressão independente da proteína S e L. modificada numa célula de mamífero portadora das suas cassetes de expressão individuais» >
De modo semelhante as células de bactérias são célulashospedeiras úteis adequadas para o presente invento,. Por exemplo as várias estirpes de rio r col i (e»q=--i HBÍôl, MC1061 estirpes usadas nos- exemplos que se sequem) são bem conhecidas como células hospedeiras no campo da biotecnologia» Várias estirpes de B» subtil is, Pseudomonas,outros bacilos e similares podem também ser empregues neste método»
Em adição, sempre que necessário, as células de insecto podem ser utilizadas presente invento» Ver, como células hospedeiras no método do e»q» Miller et al.» Benetic Enqineerinq,
8s277-298 (Plenum Press 1986) e referências ali citadas»
Alguns vírus podem também ser empregues para expressar as proteínas L deste invento» como sejam baculovírus ou vírus da vacina» A selecção de células hospedeiras adequadas está dentro da capacidade dos familiarizados com a área, tal como a selecção das condições de cultura adequadas, meios e componentes vectores adequados à expressão numa célula hospedeira seleccionada»
Mos sis-ternas de expressão descritos atrás s abaixo nos Exemplos, pode ser selecclanado qualquer promotor capaz de controlar a expressão das- sequências- codificadoras de proteínas na célula hospedeira seleccionada» Sempre que a célula hospedeira escolhida é unta célula de levedura, os promotores- úteis na expressão das cassetes ds proteína L. modificada podem ser incluir o promotor forte TDH3 ou outros promotores constitutivos ou regulados que permitam a modulação do nível da proteína L dependendo da composição do meio de crescimento» Em adição, oor exeiHplu, P6K, ARS3e APH1 São exemplos de oromotorss úi prsssn r© xnven xc«
Ο presente invento t-arobém oroDorcions s expressão de proseinss L de HBsA.q ds modificadas deste invento como parte ds u
Hbsft p-r* * *
T JL r* M · ·~ς omposiçSo polipeptidica mista, como descrito tíetaIhadamente no Pedido ds Patente U«b» eopendsnte SN 0/7368,401, c qual á aqui incluído como referência» 0 método envolve a co-expre=sao numa célula ds segunda proteína X-S, proteína de superfície ^vedura as uma prxnfeira pruu£;á.r;3 o e unta onde ê substancialmente a de HBv e onde X, par fins do presente invento, é uma sequência preS modificada codificada por uma
OCIjli Xl~£&íjO? «a uiS
DÍMA funcional fundida em fase com sequência codificadora de S = ssempre que copendents N2 07/368,401 deverá notar—se que se oode encontrar su bstanciaimente a 80 s 279-291 í1989) = d i vu1qaçSo em jsuuds ai
6ene
De acordo com este método a sequência codificadora da proteína S é co-sxpressa com a sequência de aminoácidos da proteína L modificada» As regiões codificadoras da proteína L, assim como a sequência da proteína S podem ser construídas como descrito atrás usando tecnologia de síntese química convencional ou de DMA recombinante» As proteínas L modificadas são incorporadas juntamente com proteínas 5 em partículas de subunidades de composição mista»
Na construção das proteínas X—b compreendendo proteínas L modificadas do presente invento, S é de preferência a proteína de supertxcis madura completa, (cerca tíe 22& amxnoac j.oos) do HBV (ver Tabela A)» Como alternativa, a proteína S pode ser codificada por uma sequência codificadora da proteína S do genoma de HBV, em que S é substancialmente o mesmo que uma proteína S autêntica de HBsAg» As formas truncadas de S também podem ser empreoues na
Λ construção ds partículas mistas contendes proteína L modificada, desde que -a montagem das partículas não seja adversamente afectada.
A sequência codificadora da proteína L è colocada, nuraa primeira cassete de expressão empregando técnicas convencionais para permitir a. expressão da. proteína. 8 no hospedeiro levedura, A sequência, codificadora da proteína S ou uma fraeção substancial dela é empregue numa fusão com fracçSes da sequência codificadora da preS nuraa segunda cassete de expressão parai permitir a produção de uma proteína L modificada deste invento,
Um vector construído por técnicas convencionais como descrito atrás, portador de uma cassete de expressão da proteína S e um ou mais vectorss portadores da cassete ds expressão da proteína L modificada são usados para transformar células hospedeiras da levedura por técnicas convencionais»
Cosíq alternativa, as cassetes de expressão da proteína S e as cassetes de expressão ds uma ou raais proteínas L modificadas são colocadas conjuntaments no mesmo vector que é usado, para transformar uma célula hospedeira de levedura.
Os vectores que podem ser usados são vectores integra— tivos Ty como descrito detalhadamente no pedido de patente U„S« copendente SN 386,401= Um outro método alternativo emprega vectores de replícação autónoma compatíveis que são portadores das cassetes de expressão pretendidas e transforma células hospedeiras de levedura»
Exemplos de sistemas vectores estão descritos detalha— demente em Mallor et al«, Ysast, 2sí45 (19861? Boeke et al», Cell, 40, 491 CÍ985) e pedidos de patentes U,S, copendentes SN .9
101,4635 233,631= 368,401 e 009,325 (Publicação de Pedido de Patente Europeia N2 0 278 940) cujas patentes e referências são aqui incluídas como referência»
Adicional mente outras espécies, de células hospedeiras podem ser utilizadas para a expressão de partículas de composito HBsAg de uma comosição se polipeptideo misturada aqui descrita. Hospedeiros eucarioticos apropriados são os mesmos que se encontram listados anteriormente para a expressão de proteínas 1 modificada do inventa por exemplo células de mamíferos, tais como células ds CHO» Células de inse-ctos e- virus tal como baculovírus e virus de vaccinia anteriormente mencionados podem também ser utilizados.
Uma realização preferida do método de acordo com o presente invento emprega vectores integrativos Ty portadores da cassete de expressão da proteína S e vectores plasmídeos de replicação autónoma portadores ds uma cassete de expressão da proteína L modificada» A utilização de vectores Ry portadores ds uma cassete de expressão da proteína S permite que estas sequências sejam estávelmente integradas nos cromossomas da célula hospedeira de levedura» Tais integrações são estáveis devido à sua baixa frequência de excisão» Os vectores são assim homogeneamente distribuídos na população ds células, permitindo uma taxa semelhante de síntese proteica em cada célula»
A transformação destas células por plasmídeos de replicação autónoma portadores da cassete de expressão da proteína L modificada assegura que para, uma quantidade definida de síntese de proteína S em cada célula, o nível de síntese de proteína L modificada varie ds acordo com o número de cópias do plasmídeo presente na célula»
Numa outra realização preferida tanta a cassete de expressão da proteína 3 com a cassete de expressão da proteína L modificada podem ser inseridas nos vectores integratiyos Ty e separadamente integrados em células hospedeiras de levedura de tipos de conjugação opostos» As estirpes portadoras, do número pretendido de casos de integração da cassete S e da cassete L modificada· podem então ser cruzadas parai se obter células diplóidesexpressando ambos os polipeptídeos S e L modificado» Caso se pretenda segregantes haplóides portadores de ambos as tipos de cassete de expressão podem ser obtidos por esporulação de tais diplóides»
A célula pode ser cultivada» em meio de cultura adequado? i»e» meio que permita ao hospedeiro expressar a proteína 3 e a proteína L modificada em partículas de composição mista de subunidades numa quantidade recuperável»
As proteínas L modificadas resultantes serão produzidas simultânsamente em células de levedura juntamente com a proteína S e montadas como partículas compostas mistas» Tais partículas são aqui definidas como uma montagem muitimérica de dais ou mais polipeptídeos numa' estrutura de partícula? a qual è portanto caracterizada por uma natureza composta sendo de composição polipeptídica mista» Os diferentes psptídeos estão dispostos numa, associação espacial na superfície das partículas mistas» A presença da nova proteína L modificada na partícula de HSsAg induzirá uma resposta imune semelhante á associada cara o reconhecimento do determinante nativo» 0 presente invento permite assim a produção de partículas de HBsAg em levedura que simulem as partículas naturais desde que contenham os sítios antigénicos essenciais das proteínas S, M e L do HBV»
isolamento da partícula mista do invento a partir do lisado celular ou extracto do meio de cultura è efectuado por técnicas convencionais de isolamento de proteínas.
Na realização deste método do invento, qualquer espécie de hospedeiro levedura para o qual exista sistemas de transformação, clonagem e expressão pode ser empregue no desenvolvimento de «partículas mistas» de HBsAg.
Noutros géneros de levedura em que- não existam sequências Ty devem ser projectados sistemas vectores para proporcionar co-sxprsssão das referidas sequências codificadoras da proteína S e L modificada nestes géneros para, criar as partículas mistas descritas. Portanto, as cassetes de expressão podem ser projectadas para integração nos cromossomas de levedura empregando outras sequências -de DNA repetitivas ou plasmídsos tais como plasmídsos baseados em ARS síh leveduras tais como Pichia, permitindo a integração nos cromossomas. Um exemplo ds tais plasmídeos ARS aplicáveis está descrito em Creqg et al., Mo 1,, Ce 11. B1 o 1., 5 <121x3376 (19Θ5>«
Nos sistemas de expressão descritos atrás, e.g. os sistemas de expressão Ty e outros, o elemento regulador compreende um promotor que efectue a ligação da RNA-polimerase e a transcrição. Podem ser também usados promotores reguláveis, i.s., induziveis ou desreprimíveis. Existe disponível uma variedade de vectores úteis para a expressão de polipeptídeos heterólogos sw levedura. Estes incluem o promotor do gene da metalotioneína induzivel pelo cobre (CUP1) e o promotor constitutivo dos genes glicolíticos, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (TDH31 e álcool—desidrogenase <ADH). As regiões para a terminação da transcrição em levedura são derivadas do extremo 3’ de qualquer um dos vários genes- de levedura, por exemplo, o gene do iso-l-citocrómio C (CYC1U Os
e.£S’CS<n3.S uS ©Xpr&SíxUÍÍO ρ5.Γ3. ΙΛ:
Bffí
K.1 uyvsr omy css estão descritos g.g. 5 era PCT N083/®4®5®5 Hollenberg et al§ em Sc h i zpsaccharoisyces, Pichia» e.·. q» = e = g s> 5 sís EP—A— i ® z 1 z® » em Cregg eta 1 - 5 Bio/Tec hno 1 oqy» os 47* ¥amamoto5 em s em •lansenulaB e.g» em fc.P—A-2991®8? Hollenberg et al
SSo especificamente proporcionadas pelos exemplos do presente invento estirpes de S» cerevisiae capazes de sintetizar a protsínaS como resultado da integração genómica das cassetes de expressão da proteína S dirigida pelos vectores baseados em Ty=
Uííi desses vectores;. pRI I13133—contendo a cassete da sequência codificadora TDH3-S - AR63 e a marca URA3 esta descrito no Exemplo 1 do pedido de patente U»S„ copenrfente SN 368»4®1„
Um outro vector Tyls pRIT13®34-L5 contem a mesma cassete de expressãoe a marca ÚRA3 mas contem em adição o gene CUP1 que pode ser usado como marca a. dicional em em estirpes de levedura recipientes CUP~ ou cupídelta»
As estirpes de levedura preferidas não têm genes CUPÍ cromossómicos funcionaiss os quais são sensíveis à toxicidade pelo cobre, de modo a seleccionar-se fâcilmente os transformantes tendo xntgrado várias cópias dos vectores» Duas estirpes preferidas de levedura cupídelta Ed cup.tdelta3d e EJ cupídelta7b estão descritas no Exemplo do pedido de patente copendente <J = S» SN 3ó8n4&í,
As estirpes de levedura contendo várias cópias integradas de pRITi3133—L ou prRITl®34—L estão descritas nos Exemplos
3051X0, *
A transformação destas estirpes de levedura com plasaií— deos de replicação autónoma para expressão em levedura portadores de uma cassete de expressão para uma proteína L modificada também íemplos abaixo, tá descrito no;
Fita
As estirpes de levedura diplóides portadoras de vária; cópias integradas das cassetes ds expressão de S e de L modificado estão descritas no Exemplo F»l@ abaixo,
O método do presente invento para a produção de tais proteínas L modificadas sózinhas ou em partículas de composição mista de subunidades tem utilidade na produção de vacinas contra microorganismos patogénicos, Por exemplo, as proteínas L modificadas descritas nas várias formulações de vacinas compreendendo o antigénio de superfície do vírus da hepatite B podem proporcionar benefícios não obtidos com vacinas conhecidas contra HBV, A partícula de HBsftg de composição mista de subunidades contendo uma proteína L modificada assemelha-se a partículas ou filamentos ou viriSes presentes no sangue de pessoas infectadas com HBV que contêm spitopos prea2 e além dos epítopos das epítopos preól expostos na sua superfície orincioais proteínas e podem também mostrar—se úteis em novas formulações de vacinas. As proteínas L modificadas ou partículas mistas ds composição mista de subunidapropriedades imunogénicas que não são □es luí;tendo *as uodem ter obtidas com misturas intíivid·.
de protinas 3, Me L
Numa, outra realização deste invento as partículas de composição mista de subunidades podem conte?- proteínas L modificadas e proteínas 3 com determinantes de diferentes subtipos ds modo a alargar a gama de protecção» Ou seja a proteína L modifiueidd pude ter a especiTicidade do subtxpo ay s a prote&ns S a do subtipo ad ou vice versa» ♦
ç *· ç
Assim este invento inclui vacinas contendo as proteínas L modificadas do invento ou uma partícula contendo a proteína L modificada na fornia de subunidades mistas CS, L modificada) ou homogéneas (proteína L modificada). Tais vacinas conterão uma quantdade imunoprotectora das partículas ou proteínas L. modificadas, i»e„, quantidade suficiente das proteínas ou partículas são administradas para induzir uma resposta de anticorpos suficientelente prorectora contra HBv sem efeitos adversos,
Tais vacinas podem ser preparadas por técnicas convencionais= Por exemplo, uma vacina para estimular protecção contra infecção por HBV em humanos pode conter a partícula e/ou as proteínas L modificadas descritas atrás e um veiculo convencional adequado» A partícula ou a proteína L podem estar numa solução aquosa tamponada a pH fisiológico para uso directo» Como alternativa, a proteína ou partícula pode ser misturada ou adsorvida com um adjuvante convencional, como seja hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio. Tal partícula ou proteína L modificada pode ser também combinada com atros imunogénios para praparsr vacinas de combinação. Ver, e.g», New Trends and DeveXopments in Vaccines, eds= Voller et ai „, Univsrsity Park Press, Baltístore, MD <1978).
Estas proteínas L modificadas, sósinhas ou em partículas de composição mista ou homogénea de subunidades, como descrito alarga -assim o espectro de anticorpos contra HBV e podem proporcionar uma resposta mais rápida a exposição ao vírus numa pessoa vacinada, com a vacina contendo estas proteínas» Em adição as vacinas contendo esteas proteínas L modificadas podem permitir as pessoas qus nao respondem às proteínas 8 montar uma resposta preS ou podem aumentar ou. diminuir a resposta S«
Uma outra utilização das partículas deste invento e/ou das proteínas L modifxcadas pode ser como sondas de ou reagentes
ns detecção ds proteínas derivadas de HBV ou de anticorpos anti-HBV em amostras biológicas por vários imunoensaios convenc i ona is e sim i 1 ar es»
Será apreciado que todas as vacinas aqui descritas podem ser administradas por uma via adequada, e»g», pela via subcutânea, intravenosa ou intramuscular« A quantidade do imu.nogénio em cada dose de vacina é seleccionada pelo médico assistente tendo em consideração a idade do paciente, peso, sexo, estado físico geral e similares» A quantidade para induzir uma resposta imunoprotectora no doente sem efeitos secundários adversos significativos pode variar dependendo do iraunogénio empregue e ,da presença facultativa de um adjuvante» Ds um modo geral, espera-se que cada dosecompreenda 1-1000 microgramas de proteína, de preferência í-260 microgramas» As doses iniciais podem, facultativamente, ser seguidas de injecções de memória sempre gue se Queira»
Assim, o presente invento proporciona um método para o tratamento ou prevenção da infecção com hepatite B em humanos o qual se caracteriza pela administração a um paciente necessitado de uma quantidade protectora de uma vacina de acordo com o invento,
São especialmente preferidas vacinas de acordo com o invento que compreendam partículas compostas de estrutura <L#,S> udue é como οετιηΐείο ana.ixo e S significa a proteína S do antigénio de superfície da. hepatite B, preferencialmente expressa sm S» cerevisiae ou H» polymorpha como aqui descrito»
Conforme aqui é usado o símbolo L$ significa uma proteína L modificada, compreendendo os resíduos 12-52, 133-145 e 175-400 relativamente à grande grelha de leitura aberta no vírus no
HB serotipo -ad mostrada na Tabela A atrás descrita» O símbolo deltagli Lx de modo semelhante significa uma proteína L modificada compreendendo o resídua 12 seguido dos resíduos 14-52, s dos resíduos 133-Í45 e 175-400=
Os txemolos oue se sequem Ilustram o invento.
Plasmídeos
Os plasmídeos referidos Parte A abaixo»
Estirpes de iev.sdu.ra
Hansenuia po1ymorpha RB 10 Cura 3? é um mutente de Hansenula po1ymorpha ATCC 34438, obtido por «ufagénese usando etilmetanossulfonato CEMS) essencialmente como descrito por Hoggenkamp et al= (1986)=
Enzimas
Enrionucleases de restrição, DNA—lígass de T4 e outras enzimas usadas, foram adquiridas à Boehringer, Mannhsim, FRS ou Bethesda Research Laboratories, Eggenstein, FRS» As enzimas foram usadas de acordo com as instruções do respecxxvo faorxcante»
Reagentes imunoloqicos
a) SI» is anLxcorpo Suíudunal de ratinho especifico do domínio SI da proteína preSl CSmithkline Bioloqicals, tf
R i xen sart, Se1qium)
O/ =zi « 1 π OjzÍ b u «.J Ij c-.D I.XC lí F” jJvJS· íiRjnLf*- Λ ΰίΠί5.Λ=2 £5ρδ=- .Í.T ICuS para o domínio 52 do antigénio de superfície da hepatite B (Smíthkline Bioloqicals, Rixensart, Belqiumí»
Us anticorpos específicos do domínio Sí e do domínio 52 do antigénio de superfície da hepatite Bestão referidos como «anticorpos orsS»« til & » h? i i.ii_ormo mo-; =oo í una 1 de ratiniiu espeuxixcu du domínio 5 do antxqénio de mornas» Koyax t-ree «ospxcaj sHoerticip London)« d a heoati te {H, d' KFls Anticorpo monoclonal de ratinho específico de um epitopo dependente da conformaçãosituado na região S íH» Thoraas, Roval Free Hospital, London)» rfbls ftnxxcorpo monocxonai v «λ t x n ho .rj.uj.uu lmiu um epitopo resistente à desnaturação e â redução do HBsAg derivado do plasma, situado na região S CSmithkline Bioloqicals, Rixensart, Belqium)=
Us s anticor pos a), b5 e/ foram preusi· sdu~- u*— lí segundo processos convencionais por fusão de células do baço utr t aLjnho cuíís células de roxeioroa» Rara o mecodo é veios referência a Kohler e Milstein, 1975» Os métodos estão descritos em Sodxng, Honoclonal Antibodxes, Principies and Practice, Academic Press, London 1983=
f) AUSRIA (Abbott Laboratories, IMiesbaden-Delkenheim, FRS e Louvain-La-Neuve, Beloium)° kit comercial contendo
anticorpos policlonais diriqidos contra epítopos conformaci— onais nativos»
g) AUti L V Mc. e Louvain-La corpos rnonoc
CAbbot Neuve 3 C5C ? S 3. '&
t Laboratories, Wieshaden—Delkenheim, l-Kfcj Belgiunús kit comercial contendo arsfciãirxqxQos conera epxcopos concorfnacionai' nativos» comsrcialmente= Eles não reagem com antigénio de superfície
Ds anticorpos mencionados em f), q) podem ser adquiridos reagem com ani monomérico da heoatite B.
h) AUSAB (Abbott Laboratorii
Wiesbaden-Delkenheim,
Louvain—La—ÍMeuve, Belgium) s kit comercial para -a deteção de anticorpos anti-HBsAg»
Me i os tepton 190, extracto de levedura, Casamino acids e base azotada de leveduras usados· na preparação de meios foram adquiridos à tíibco Ltd»= Paisley, U»K=
Para se preparar placas de agar, ÍS g de agar (Gibco Ltd») por litro foram adicionados antes da autoclavaaem do resoectivo meio <>
l) b'MRs Meio não selectivo semi-rico
Pepton :lv0
Casamino acids (Pepton 5)
Base azotada para leveduras W/0 ÍNH,τ ).-,30, ÍNH.>_S0Zj, Zj.
Fontes de carbonos glucose ou glicsrol ou metanol q /1 g/1 í,4 g/1 5
2%? g/í 20 g/1 10 g/1
SMH contendo metanol é também designado Pfet-SMR» ? iMjd » ί”:Ο Í O se 1 i—— 13. VO base azotada de levedura sem CMH„ ).-,30 ; r« ; L ~ - f1. 2 X ___ \ \ o x í_?=._ Q y 1 j ?_í}
C NH „ ) ^30
Fontes ds carbono; glucose ou g1icero1 ou metanol
15 4 g Z 1 g/1 20 q z 1 i© a/1
YEPDs Meio rico não selsctivo
Extracto ds levedura Pepton 1P0 Blucose í 0 y f 1 2© g/I
Se necessário, foi adicionado 1 mg de gentamicina G4ítí por 1 ml de meio» e
d) Meio S
COMPONENTE
QUANTIDADE POR LITRO (NH„>„SO.
} ‘.t i -d ϊ“» »1
MgS0fl_ = 7H,0
NaCl .-v _ r-‘ 7 /-Mj r* i.~: o xnnU
L-Histidina monD-hidrocloreto LD-hle t i on ir» a LD-Tri ρtofano
CuS0„=5H_0
Kl
FeCl-y = 6H^,0
MnSOA»H^O
Ns-noOZi »2H^0 j£ '1* X
ZnbU^j =
Biotina
Ca-pan totenato
Ácido fólico
Inositol
Niacina
Acido p-Aminobenzóico P í r i d o xina-hitír RibofIsvina Ti a mina—hidroclorsto
Q & mg 9 oiq mg 0,1Ó ÍOQ %? it mg feí 5 tí mg í , 6 mg 0,8 mg í, 6 mg 0,16 mg mg 0siá mg
160 mg *5 r. 4 HiÇ 0,2 mg *”Ç?
0,2 mg 32 mg
II
1b Manipu1acão de DMA
Clivagem com endonucleases de restrição, ligação usando DMA-ligase de T4, fosforilação de DMA, isolamento de DMA a partir de E» coli, separação de DMA por electroforese em gel e todas as outras técnicas pertencentes ao campo da. tecnologia de genes usadas nestes pedidos foram essencialmente executadas como descrito por Maniatis st al», 1982»
2» Transformação de levedura.
Levedura metilotrófica é transformada pelos métodos descritos anteriormente CRoggenkamp et al», 1986)=
É preferido o método que utiliza células intactas congeladas (Klebe et al» » 1983) =
a) As células transformadas são identifiçadas por complementação da deficiência urs3 ou por resistência ã gentamicina = ’esístê'ncia à oentamic ina B4í8foi tes-tadi sfeRíiSSl SVíO sãS oe meio solidificado células em placas YEPD contendo 25 ml Após 6 horas de crescimento em placas, 1 ml de solução aquosa contendo 25 mg de gentamicina 418 foi aplicado em cada placa e a incubação continuou durante 2 a 3 dias» Gentamicina G418 (Marca Registada. Geneticin) foi adquirida
OXULU L. L-:J u *
b) A segregação de transformantes mitóticamente estáveis foi efectuada per selecção dos transformantes a partir da placa de transformação selectiva e deixando-os crescer num meio líquido selectívo YNB ou YEPD com B418 a Img/ml) durante cerca de 2® gerações (duas passagens)» Após este período de crescimento as células foram inoculadas em meio não selectivo CSMR ou YEPD) e deixadas crescer
C5-6 passágens). As célul·· durante maxs : as ΐoram então z om U4 j. 8 a i .“.</£—•£50 neracões semeadas numa piss-s selectiva mq/ml) e os clones expressando ainda a marca selectiva foram retidos.
isolamento do DNA de levedura
-e parou -se
DNA total de levedura como descrito em Struhl et (1979)
Análise do DMA de ?dura
A estrutura do dNA. em transforaiantes de levedura foi analisado por digestão com as endonucleases de restrição adequadas seguido ds electroforese em gel de agarose» Os fragmentos ds DNA foram então transferidos para nitrocslulose e hibridados com a sonda adequada de DNA marcado radioactivamente (Southern 1975).
5- 1munoensai os
Análise de transferências Western
a) Processo da Amersham proteínas obtidas a partir dos ísfX ur «tu utJc brutos ou —
partir de fracções de gradiente fora electrof ore-se em gel de SDS-poliacri usando géis de 12,5% para a separaçã concentração» As bandas de proteína nitro-celulose essencialmente como de { í 979 ? « m separadas por 1amida C Laemm1i, o e 5% para a foram transferida· scrito por Towbin
P‘ et
a.
a.
O material antigénico foi etectado por reacção da transferência com anticorpos específicos» 0 complexo antigénio- anticorpo foi visualizado por reacção do filtro com anticorpo biotinilado RPN 1001 CAmersham Buchler GmbH e Co= Ltd,, Braunschweig, FRG) numa diluição de lí3@® seguido de uma incubação com o complexo peroxidase-estreptavidina nPN lUol (Affiersnam?» iooos os passos da. expensncia foram efectuados de acordo com as instruções do fabricante»
b) Como alternativa, o filtro foi pré-incubado com 0,05% Tween
Cp/v) em PBS» Após incubação com um dado anticorpo monoclonal, a ligação do anticorpo foi detectada por incubação sucessiva com imunoglobulinas de carneiro anti-Ig de ratinho biotiniladas ÍRPN 1021, Amershamí numa diluição de 1=250 contendo 0,05% Tween 20, o complexo estreptavidina-peroxidase de rábano silvestre biotinilada CRPN 1Θ51, Amersham, diluição Í.400 em PBS contendo l?i ds gelatina) e Tmalmente 3%íp.l de e 1%? ml de reagente
Coiour Development contendo 4—cloro-l-naftolC3 mgz/ml de metanol.) em 50 ml de PBS, Entre as incubações o filtro foi lavado com PBS contendo 0,05% de Tween 20»
A quantificação dos antigénios roonoméricos produzidos CS e preS) foi conseguida por comparação das amostras de 0,01---0,3 p.g de HBsfig purificado derivado de levedura. CSmithkline Biologicals) com 3-5 diluições diferentes ds extractos de proteína, brutos de de proteína celular total»
Hansenula.
on tend pç
A concentração de proteína ensaio de proteína BioRad foi determinada usando um kit BioRad Munich, FRB) =
EXEMPLOS g PARTE
P1 asmídeus
Exemplo AȒ
Construção ds plasaiídgos que permitem a expressão da proteína em
Hansenula polymorpha •a) Construção ds um plasmídeo básico contendo uma sequência de replicação autónoma em Hansenu1a polymorpha (pME4í, plasmídeo parental usado contendo o qens S sob o controle ds pME4, o qual já foi d l_Oi 12»· ‘.F~U.X F D’» px cíS-HIxGSuíSj promotores ds Hansenu13 é de Ph,D de M« Eckart, 1988, pME4 è um derivado de VIpõ CStruhl et al., 19795 Stinchomb et al., 1980) obtido através das sequintss modificaçõess
A sequência de replicação autónoma HARSÍ de Hansenula polymorpha foi clonada no sítio Sall de YIp5 como descrito por
Koggenkamp et al, ílVtíó) pHARS ’
entãe í reconstruído por deleção i
•Sal I de 440 pares de bases no
. X. ε?χ t : remos coesivos j Sa11 do τ
para resultar em pHARó» Li plasmídeo sítio PvuII do mesmo vector, Us extremos coesivos Sall do fragmento foram tornados cersss antes da ligação por incubação com exonuclease VII seguido de reacção com polimerase Klenow, Esta reconstrução resultou num único sítio Sall no gene de resistência à tetraciclina da parte de pBR322 deste plasmídeo» □ plasmídeo intermediário assim obtido foi novamente reconstruído de modo a obter~se um gene da beta— —lactamase sem a sequência sinal original em que a sequência sinal foi substituída pelo adaptador mostrado abaixo5 para detalhes ver Eckart <19SS)s
bau to Ah TTC A (B TCC BOT (-.♦ALj
CT6 CTT Λ Λ Γ“lisiO “Ι~~Γ··τ- ι s 1 TAC AGG CCA GTE
Met Ser Bli
B-lact
• L© deu o plasmídeo pMfc.4· «no se mostra na figura 1»
Fragmentos dos promotores MOX e Fliu isolamento do promotor MOX a parti
SJF v poiymorpna foi descrito por Eckart, 1988.
uo prssen
-i-.-s,
P.í um fragmento genómico EcoRl-SalI de Í525 pb contendo a região de controle a montante do gene MOX e os codSss para os cinco primeiros aminoãcidos da proteína MOX foi clonado num derivado do pBR322nNa Fig» 2 esta apresentada uma representação esquemática do gene MOX» Este plasmídeo intermediário foi cortado usando EcoRI e tratado com nuclease Bal3í s subsequentemente ligado a adaptadores EcoRI» Assim obteve-se uma série de fragmentos de promotor tendo extremos 35 EcoRI e extremos 55 Sal! por subsequente clivagem com a endonuclease ds restrição Sall» As posições dos limites das deleções foram estabelecidas por sequenciacão de DMAde acordo com o método ds Mexam e Siibert,1977« Tendo em vista a outras experiências descritas neste pedido usou-se um plasmídeo designado pBR322-MP contendo uma deleção até à posição menos 3 (quando a primeira base do codão de iniciação da trsduçãode MOX é
-a base siais plasmídeo pBR322-MP está descrito em Eckart,
1888»
Li xsolamencu e •í_arâs_‘cer x2-=it_
-QÍBOtDr descrito no Fedido de Patente Europeia 87 11® 417»®» Para fins do presente invento um fragmento BamHI de 1,4 Kfa englobando cerca e !©®®pb da região do promotor a montante foi clonado no sitio
BamHI ds pUC19= Seleccionou—se um clone em que orientada xnserçã sn TO1 ada de modo a ter o único sítio EcoRI do pUC19 no extremo 35 do fragmento inserido» Na Figura 2B está uma representação esquemática, do clone genómico contendo o gene FMD incluindo o seu promotor» Preparou-se uma série de delações Bal3i começando no sítio EcorI dentro do adaptador de pUCí'·? de modo a obter-se plasmídeos contendo o promotor sem sequências do gene estrutural» Após tratamento com Bal31 o DNA foi ligado a adaptadores EcoRI» o DMA foi clivado com BamHI e os fragmentos BamHI-EcoRI foram clonados em ηΕ·Ρ322» Qbtevs—^s uma variedade de ripierfíet;. A·-; deleções nas posições menos 5 e menos V a partir do primeiro ATS foorans as mais eficazes em experiências posteriores» Para posteriores experiências descritas neste pedido usou—se um plasmídeo portador de um fragmento de promotor contendo a deleção na posição -9 a partir do primeiro ATS (plasmídeo pBR322-FMD-P-9í= Está apresentada abaixo uma representação esquemática dos fragmenws de prusiotorss huX — FrtD usadui» na plasmídeos» :Df!b uruçaij de outs· os raqmento promotor MOX <-3>
EcoRI (ISO© ob)
I o —.\
-hAhu l Au-AAAAhL.SSAATTCC .Ad a o t ad o r ç
Fragmento promotor FMD í~9)
BamHI ( 1000 OO )
TCATC
CCOb.i
GBAATT CC
Adaptador
o) ierminador
O isolamento de um terminador da transcrição a partir de umqene MOX está, descrito em Eckart? 1988» Está apresentada abaixa uma representação esouemática da reqião 35 do qene MOXs
Arg Fen Stop
ASA TTC TAA
Sall—147/ p b
-EcoRV— ? pb >
—-NruI
284 pb
36tí ob fragmento SalI-NruI apresentado no esquema atrás foi subclonado em pBR322 entre os sítios Sall e NruI e este plasmídeo foi então clivado usando a endonuclease de restrição Asp71S resultando numa linearização do plasmídeo devido a um sitio único Asp71S dentro da grelha de leitura aberta MOX e sujeito a d e1eç Ses Ba131 =
For análise da sequência de DMA dos fragmentos resul tantes foi identificada um fragmento terminador de de aproximada mente 320 pb (Eckart? 1988) que ainda funciona, como terminador Este fragmento terminador de extremos cerses
—.3 f Ολ 1 _Ll4í=»-dO GíO —·£ l_j.O bs pUClV í GACATACC—315pborientação de i-i fragmenta foi estabelecida por Bilbert, 1977). 0 clone pT-24
Figura 3= Este clone foi usado expressão como se mostra abaixo.
análise da sequência resultante está apresentado para construir os vectores
Cite?
d) Senes de marcas selectivas
3~S 5 f’—.
e HindiII e isolado o de pUC19 s o fragmento pME4 (descrito atrás, ver Fig. 1) foi clivado com EcoRI tremas coesivos foram preenchidos com polimerase Klenow. 0 plasmídeo pT—24 foi diqerido com EcoRI fragmento compreendendo o adaptador de terminador MQX. Os extremos coesivos deste fragmento foram tornados cerses por tratamento com polimerase Klenowe o fragmento de extremos cerses. ligada as pME4« O plasmidso resultante foi designado pP/T-24» Os sítios de clonagem derivados de pUC19 foram usados qosteriormente noutros passos de clonaqem.
plasmídeo pP/T-24 contem o qene URA3 de como marca selectiva» Como outra sares selectiva foi um gene conferindo resistência ao cloranfenicol= Este gene toi isolado a partir do vector pBR325 como um fragmento AatU—Clal ds 1,7 Kb, sujeico a uma curta digestão cora Ba.Ιοί ρ-ara remoção de cerca de quatro pares de bases de cada lado e dotado de extremos cerses por preenchimento com Klenow. Subsequentemente o fragmento foi ligado a pP/T—24, que tinha sido cortado com Nruí. 0 plasmí— deo resultante apresentando resistência ao cloranfenicol foi d es i gn atío pP/T-24-C.
mtroouz ido
Exemplo A, 2
A construção ds um plasmideo contendo o gene do antigénio de superfície da Hepatite B em combinação funcional com o terminador de Hansenula polymorpha,
Para se obter uma unidade funcional compreendendo o gene S da Hepatite 8 e um terminador eficaz em Hansenu la ρο 1 y IRO r ρ ha» o gene S foi introduzido como um fragmento NcoI-EcoRI de 683 pb no sítio BamHI do plasmideo pP/T~24C proporcionado pela fracção de adaotador de oUC-19 do referido plasmídeo»0 fragmento de 683 pb foi obtido a partir ds p-RIT12331 que é um vector convencional de E» coli baseado em pUC19 contendo o fragmento de DMA McoI-EcoRI de 683 pb codificador da proteína S desde Mcol no codão ATS (SCATSB> até EcoRI para lá do codao de paragem TAA ÍTAACSAATTC)» A sequência codificadora do antigénio de superfície foi derivada por técnicas de DMA recombinants convencionais a partir de pRITÍOóíó descrita em EP-A-0278940 e em Harfard et al»5 1987» pRIT10616 contem o genoma de um vírus H8V do serotipo adw clonado em pACYC184 e foi depositado na American Type Culture Collection ds acordocom os termos do tratado de Budapeste em 2 de Junho de 19S2 com o numero de aces-so A1CC-591-SÍ =
Os- extremos coesivos do fragmento de gene S e do pF7T~24C cortado com BamHI foram tornados cersss por preenchimento antes da li imed íatamsnte .qação» At ligação do fragmento na orientação correcsítios BamHI e Ncol ad;
un 1 r uc a
plasmideo resultante foi designado pRu-a» *' tf fc. xempio A„3
Construção dos plasmídeos contendo uma cssssr f un c i on a 1 c om p r een d en d o de expressão d e Hanssnu1a í!_ ρ r rasotores aerιvaaos polymorpha^ o gene do antigénio de superfície S da Hepatite B e o terminador de Hansenu1a po1ymorpha»
Os derivados de contendo os promotores MOX e hMD, respectivamente, dos com EcoRI e os extremos coesivos foram preenchidos pBR322~FMD-P~9 foram digeri— usandc polimerase Klenow» us plasmídeos foram então clivados com Sall mente DNA genómico de Hansenu1a po1ymorpha, enquanto o fragmento 3 ~h rÍA= SFjQUêncofiipreendsndo o promotor FMD contem em adição de pBR-522 (posição 37’o pb a 650 ph do mapa do pBf?322)
Cl·
0
do, o sítio foi.
pol imerase K , I sn o
isso ti ιοί Lurcaoo no siuiu canTu reges iera— :ado de extremos cerses por preenchimento com polimerase Klenow e subsequentemente o plasmídec foi digerido com Sall» Os fragmentos de promotor tendo um extremo coesivo Sall e um extremo cerse foram ligados com o fragmento grande Sa mo cerse do phB;ontendo a região codificadora do gene Se o terminador de Hansenula polymorpha, foram designados pR8~S~269 (promotor FMD, deleção menos 9) e contem o gene S sob o controle do promotor e terminador de Hansenu1a ρο1ymorpha como se mostra na Figura
4» resultantes MOX) e pRB—S—271 (promotor
S está apresentada na representação esquemática abaixo»
Fusão do promotor MQX (pRtí~S-2ó9)
---AAAAAC SSAATTSATCC ATS
Promotor MOX qene o
h) Fusão do promotor FMD (-9í
-9 -H <-------TTCCATC SSAATTSATCC ATS
Promotor FMt)
Os plasmídeos construídos ds modo idêntico a pR8~3~27í e pRB-S-269, mas sem inserção do fragmento de- restriçãode 440 pfa portador de sequências HARSÍ foram designados pRB-tí~2õ91 e pRB-S-2711« listes plasmídeos- foram usados para obter integrantes contendo 1 a 3 cópias da cassete de expressão»
Exemplo A«4
Construção dos vectores integrativos contendo o gene S..
a) Construção do plasmídeo pBC contendo sequências de replicaçáo autónoma de Hansenu i a po 1 ymorpha e o gene URA3 de H polymorpha„ plasmídeo? pBC deriva dc? plasmídeo YRp-7 (Tschumper e Carbon., 1980) contendo a sequência ARS1 ds Saccharomyces cerevisiae, Esta sequência de replicação autónoma foi Inactivsds *
*
oor inserção de um fragmento BqlXI—Sphl de 5400 pb incluindo o gene URA3 de Hans-enula polymorpha» Ainda a sequência 1 de replicação -autónoma de Hansenu 1 a ÍHARS1) foi clonada no sítio Sall do qsne de resistência à tetraciclina (Fig«5)«
b)
Inserção das cassetes de expressão no olasmídeo dBC.
U plasmídeo pRB-S-269 foi digeric
ÍU i_ UHi
BspNII e Sall fragmento resultante portador da cassete de expressão compreendendo o promotor MOX, a região codificadora do antigénio de superfície da Heoatite B e o terminador foi dotado de extremos cerses e ligado ao plasmídeo pBC após clivagem com Xhol s StuI e preenchimento dos extremos coesivos Xhol» □ plasmídeo resultante pMS~2. contem a cassete de expressão do gene S rodeada por sequências delimitantes do fragmento do gene URAS ds Hsnssnula polymorpha» integração da cassete do gene s
Hansenula golymorpha o plasmídeo p:
:raqmento resultante grtoz TOí coroado
Tox usdo g-ara com Nhel e o transformar as vector pFS-9 foi construído de modo análogo exceptuando a cassete de expressão h pRB-S-271 contendo o promotor FMD» ildO d adi parcxr ds
Na Figura 5 é proporcionada uma descrição detalhada dos plssnuoeos resuitdnrss:
Exemplo A,5
Construção de plasmídeos compreendendo a ;xpressão do gene S e ura gene de uma marca selectiva adicional»
-3.)
Coí íss LruciSD do plasisíídeu bas»iuo pHK2
Para a construção d-o plasraídeo pHK2 CFig. éj depositado nos termos do Tratado de Budapeste na DSM CDSM DEUTSCH SAMMLIJNS VON ΜIKRQORGANISífEMN UND ZEL.LKULTUREN GmbH) cora o número de acesso 5328 era 27 de Abril de 1989) o gene de resistência ã canaraicina foi isolado a partir do transposão Tn.5 ígrindley e Joyce, » hs seguancxas desnecessárias foram eixminaoas por tratamento do gene estrutural com nuclease Bal3í» 0 fragmento resultante compreendendo o gene estrutural da canaraicina incluindo o terrainador da canaraicina foi ligado ao promotor ADH1 de
3a c c bar omy ces cerevisiae (Hitzeman st al hoi ainda introduzida a sequência HARSÍ como ura fragmento Gall de 44® pb no 01 a sra 5. d eo«
b) Construção de estirpes resistentes- á canaraicina derivadas de pRB-S-269 e pRB-S-271» fragmento Hindili do pHK englobando a região codific-adora da resistência à canaraicina {.5,5 Kb cluuado ho sitio
HindiII presente na sequência HARSÍ dos pias pRB-S-271. Os plasmídeos resultantes forara des pRB-B~326- respectivamente e estão apresentados mideos pR.tí~B~2é>V ignados pRB-S-32 na Figura 7»
Exemplo A, 6 uonstrução de rsrs~S«
UHS íBIBideu pa?
rnfeína?
expressão de proteir plasmídeo pP/l-24 (Exemplo A = 2> foi reconstruído ds modo a obter—ss ura plasmídeo pMOX—P/Tl (Fiq, 8) portador de uma.
:as5ste de expressão universal compreendendo o promc jítio de clonagem múltipla, e o terminador MOX, >r MOX,
Para inserir ura .adaptador contendo s; para as endonucleases ds restrição Sall, EcoRI, BglH e BamHI, □adaptador pUCIF do plasmídeo pP/T-24 foi parcialmente substituído por DNA sintético contendo sítios de restrição para as enzimas atrás referidas,
U plasmídeo pP/í-24 Lção BamHI e Sall. Este foi cortado com as endonucleases de Ξ- sítios derivam do adaptador de pUCl5? (BamHI) e de pME4 (Sall), A molécula do adaptador contendo os sítios de restrição Sall, EcoRI, BglII s BamHI foi inserida, 0 plasmídeo resultante pTl foi digerido com EcoRI e Sall e o promotor MOX inserido como um fragmento EcoRI—Sall de 1,5 Kb dando o plasmídeo pT2. vantes do plasmídeo pT
Estão apresen tadas aba· as areas re ~s=M=riu.
-AAAAAC GGAATTC AGATCT
Mí-tf . f i---------Pramator MuX
Terminadar u plasmídeo p!2 contem ainda AK8 de HansenuIa paiymorpha e o gene URA3 de Saccharamyces cerevisiae como no plasmídeo qRB—269 CFiq» 3)» passo de construção seguinte foi a substituição do gene URA3 de 5'accharomyces· cerevisiae pelo gene URA3 derivado de Hansenula po 1 ymorp ha» isolou—se um clone contendo este gene conto descrito abaixo no exemplo A = 9» 0 gene URA3 foi isolado como um fragmento BamHI~Bgl I i de 1,2 Kb» Enquanto o sítio Bglll um sítio genómico original, o sítio BamHI foi resultado da ligação de um sítio Sau3A com um sítio BamHI usado para construir a biblioteca genómica» Os extremos coesivos deste fragmento BamHI-BglIIforam preenchidos pela polimerase Klenow e e inseridos no sitio Aval do pBR322, o qual também foi preenchido com polimerase Klenow» 0 sítio Aval foi regenerado por ligação e o plasmídeo resultante foi designado pURA3-F’l» plasmídeo URA3-P1 foi digerido com IMrul
BspMII
Estes sítios derivados do pBR322, posições pb 9/4 e pb 1664 do mapa convencional do pBE32:z„ 0 plasmídeo pi2 foi sujeite digestão completa com NruI (pb 974 do pBR322) e digestão * *ΐ λ 1 uuhí BspMII
Existem '2 sítios BspMilem pT2s 0 primeiro em ptíR322 Cpb 16645, o segundo está situado no terminador MOX„ D fragmento NruI-BspMH do pT2 CISOGph) contem o gene URA3 de Saccharomyces cerevisiae. 0 fragmento Nrul-BspMU de URA3 portador do gene URA3 de Hansenu1a ρο1ymorpha foi clonado em pT2 substituindo o gene URA3 de Sacoharomyces cerevisiae situado no correspondente fragmento NruI-BspMII» 0 plasmídeo pT3 resultante contem o terminador rIDX, um -adaptador, o promotor MOX e o gene URA3 de Hansenu 1 a ρο 1 ymor pha uns a seguir aos outros„0 plasmídeo pT3 no entanto não possui um gene β-lactamase funcional como no plasmídeo parental pME4» Para substituir este gene da β-laotamase defeituoso por um gene funcional, pBR322 foi digerido com EcoRI, os extremos coesivos preenchidos com polimerase Klenow e ligado a um adaptador Aspl78 de 3 pb seguido de digestão com Pvul (posição 3738 do mapa do pBR3225» 0 fragmento de Asp71S-PvuI de 633 pb assim obtido é portador do promotor original e do codão de iniciação do gene da β-lactaroase» u plasmídeo pT3 foi sujeito a clivagem por Asp7í8 (o sitio Asp718 está situado no extremo do termin-ador MOX) e a uma digestão parcial com Pvul« 0 fragmento Asp718-Pvul obtido como descrito atrás foi então inserido no pT3 pré-tratado dando o plasmídeo pMOX-PZTÍ» plasmídeo pMGX-P/Tl está apresentado na Figura 8» Este plasmídeo contem um gene da β-lactamase funcional»
ExeaiaÃQ-AiZ
Construção de plasmídeos expressando proteínas pre-S» gene pre-S codificador da proteína preSÍ-S2-S (proteína grande) do vírus da hepatite B foi obtido como um fragmento
Ncol—HindIIΪ do pRIT1281ó» pRITÍ2Sl& ê uíb vector de E» coli convencional baseado em pBR322 contendo um fragmento ΝεοΙ-HindIII de 1185 pb codificador da proteína preSl-82-S desde Mcol no codão ATS CCCATSSl até HindiII no pb 15 para lá do codão de paragem TAA <»»»»AASCTT). □ fragmento da sequência codificadora de preSí-S2~S foi derivado por por técnicas ds clonagem convencionais do pRITlêóió descrito em EP—A—o278940 e em Harford et al = , 1987, Um fragmentod eS61 pb codificador da sequência preS2~S pode também ser recuperado a partir deste por meios convencionais» 0 fragmento Ncol-HindlII foi dotado de extremos cerses por preenchimento com polimerase Klenow e clonado em no sítio EcoRI de extremos cerses do ρΜΟΧ-Ρ/TÍ» Como consequência da ligação correcta o
sítio EcoRI antees <
X X Q -3. Ç 30 d OS extremos
o gene preS sob o coi
Esta está ap írssentaO'
A construç!
naoa pMPS-zí e
foi rsoeneraoo or
A construção -análoga contendo o oromotor FMD foi desiqtxemplo A,
Construção de um vector contendo uma cassete de expressão preS»
A cassete de expressão Sali—Asp/18 do plasmídeo pMPS22 foi dotada de extremos cerses por preenchimento e inserida entre o sitio Xhol preenchido e e os sítios- StuI do plasmídeo pBC descrito no Exemplo A4a atrás» 0 plasmídeo resultante foi designado pMPS—9 e está apresentado na Fiaura 9»
faxemolo A,v
Clonagem do gene URA3 de Hansenula polymorpha» gene URA3 de Hansenu1a po1ymorpha foi clonado por compigmentação da correspondente mutação pyrF de E» coli estirpe ME5 1 00V a isolaram-se fragmentos genòmícos variando de tamanho entre 6 e 9 Kpb por digestão parcial com Sau3A, separação num gel de agarose de baixo ponto fe fusão e isolamento da fraeção de DNA adouada.
-agmentos purificados foram ligados no único sitio BamHI do vector YRp7s contendo uma sequência de replícação aulónuiísa de Hansen u1a poiymorρha inserica no sitio til.
mistura de ligação resultante foi usada para transformar E. coli itirpe MB Í®0® e os transformantes foram seleccionados em ciscas de meio mínimo sem uracilo. Os transformantes obtidos foram analisados e isolados os plasmídeos» Isolou-se suhtr aqm«n to como se mostra na. Figura 1@5 o qual medeia a restauração do fenótipo URA* em mutantes orotidina-S^-monofosfato de E» coli.
‘òaccharoatyces csrevísiae e Hansenula nolymorpha. A estrutura do DNA clonado observou—se por transferência Southern ser idêntica à da. região genómica de URA3» Na Figura í® está apresentado um mapa de restrição do fragmento do gene URA3 de Hansenula polymorpha.
Harto ϋ
Exρrsssao du ηγíui□ £n.1 u de eupei iicis da Hepatiue nBsAq i -sTi
Hansenu1a ao1ymorpha
Construção de estirpes de Hansenul polymorpha contendo o o ene S
Hansenula polymorpha RB 1® foi transformada com os plasmídeos atrás descritos pRB-S-2óR» pRB-S-2óR-I, pRB-S-271» pRB-8-271—I, Foram obtidos vários clones portadores de plasmídeos de replicação autónoma Ctransformantes) ou com DMA integrado incegran tes)»
Estes transformantes /integrantes foram então testados quanto á expressão do gene S usando imunoensaios. Usaram-se dois sistemas de testess Transferência Western e os testes AUSRIA ou AUSYME (Abbot). A produção do monómero HBsAg foi -analisada par transferência Western usando anticorpos monoclonais RF6. Os kits AUSRIA e AUSZYME da Abbot foram usados de acordo com as instruções do fabricante para calcular a quantidade de partículas de HBsAg produzidos em Hansenu1a. Os transformantes apresentando um nível de expressão elevado e estável foram seleccionados e o seu
DMA analisado por transferência Southern após separaçã·:
forerxca» ranstarmantes
Várias- colónias portadoras do plasmídeo de replicsção autónoma foram obtidas a partir de Hansenula polymorpha transformada com os plasmídeos pRB-S-269 e pRB-S-271» A anális-í do DMA total obtido pare oestes cransformantes dxqerxdo com *»
οι i ©γ>=?πtss «ndonuc iSSSSÍ çãc esperadQu
1e restrição mostrou o padrão de restrj b5 Iπtsq rantes vectares integra ti vos okbHansenU1a ρο1y-morpha pode ser transformada com os 269-1 e pRB-S-27í~I numa frequência elevada» Os inteqrantes cultivados em meio completo (YEF’D) são mitóticamente estáveis» Como alternativa, a manutenção mitóticamsnte estável de um DMA estranho em H an sen u1a pode também ser obtida pelo processa descrito atrás, em que um vector de replicação autónoma, de preferência um plasmídeo de elevado número de cópias tal como pRB-S-269 ou pRB-S~271 que se integra espontâneamente no qenom-a, Os integrantes resultantes também apresentam elevada estabilidade mitótica do DNA estranho»
Ambos os métodos referidos atrás foram usados para obtenção de estirpes expressando eficazmente o gene S em meio completo não selectivo» 3 estirpes foram mantidas? a estirpe tendo o número de identificação 352» que foi transformada com pRB-S-271» em que o gene S é regulado pelo promotor FMD e as contendo um gene S regulado por MOX, foram usadas ss experiências, pos te r i o rss» i~ x em p 1 o B»2
Estabilidade mitótica. de DMA estranho em integrantes
A estabilidade das estirpes- recombinantes 302, 415 e 416 foram testadas pelo seguinte processos As estirpes foram cultivadas em meio SMR não selectivo durante 4® qerar.Ses» Doze
colónias independentes foram isoladas a partir das culturas autfcíS e após o período de 40 gerações,
A estrutura do DMA estranho e o número de cópias da cassete de expressão foram examinados nos clones isolados por análise de transferências Southern em combinação com electrofore— se em gel de agarose dos fragmentos de restrição e Pulsed Field Gradient Gel Electrophoresis ds cromossomas totais» Esta, última técnica permite a separação e análise de cromossomas de levedura (Schwartz e Cantor, 1984}» «Pu1sed Field Bsl Electrophoresis»
Células das estirpes 415, 4iô e 352 foram sujeitas a. lisa suave nas cavidades de amostras de um gel de O,7% p/v de agarose» Os cromossomas libertados in situ foram separados usando um aparelho LKB—Pharmacia Puisaphor Plus de acordo com as instruções da LKB—Pharmacia» Após PFGE o DfMA foi transferido para mtrocelulose de acordo com o processo de Southern (19/5)» A transferência, foi submetida a hibridação usando sondas marcadas com '‘p específicas dos genes MOX e/ou FMD ou o gene URA3 de Hanssnula polymorpha, sabendo—se que este último está presente como uma. cópia única, no genoma»
A comparação dos sinais derivados ds possíveis integrantes- muitiméricos com os de genes de cóoias simples (marcas intrínsecas) permitiu ura cálculo do número de cópias das cassetes de expressão importantes presentes dentro da. célula» A análise dos cromossorass por PFGE demonstra que o clone 4Í5 tem cerca, de 30 a 50 cópias das cassetes de expressão, enquanto que o clone 416 contem cerca de 5-ó cassetes ds expressão ε o clone 352 ceca de 1 0 cassetes de expressão» A análise mostrou que o DMA estranho é integrado no genoma de Hansenula»
Air se Southern
A-=. estirpes 352, 415 e 416 foram cultivadas durante 4® gerações em meio SKR» Dose colónias independentes foram isoladas a. partir de cada lote -antes e após o período de crescimento referido» As preparações de DNA destes subclones foram então sujeitas a análise Southern após clivagem com várias enzimas de restrição e usando sondas d-e DNA marcadas com ,J-P, A análise dos padrões de restrição mostrou que a.s cassetes de expressão estavam intactas e que o DNA introduzido estava qenéticaments estável» A análise revelou ainda que o genosta dai estirpe 415 contem repetições longas com várias cópias do plasnsídeo» Deduziu-se que os o plasfíixrfeo está arranjado nesta repetição ds modo cabeça-cauda»
Exemplo .8 = 3
Estudos de expressão
As estirpes recoesbinantes foram de rotina analisadas quanto à presença de HBsAg por transferência Western e AUSRA/AUSZVME« tesceí
Crescimento das culturas e transferência Nestes
416 foram cu 1 ti'
o
licerol a í •_J / s__-
s. c i on ár i a s □ Qg
com arejamento ? caractsrizada de 11 em 200 ml de meio SMR~glicerol vigoroso» No começo da jase £ pela deplsção de glicerol, adicionou-se 50 ml/1 de um meio SMH cinco vezes concentrado sem glicerol juntamente com metanol para uma concentração final de 10 g/1. Retiraram-se amostras de 10 ml da cultura, antes da adição de metanol s 24 horas após a adição de metanol» Para fins comparativos as mesmas estirpes foram cultivadas em meio SMR contendo 30 g/1 de glucose Cdesrepressão dos promotores). As células foram colhidas na fase logarítmica tardia.
A partir das células colhidas prepararam-se extractos proteicos brutoscorrespondendo a cerca de 0,1 g de peso seco em 5 ml de tampão PE <0,5 M IMaCl, ©,17 de Triton X-100, tampão fosfato 1® mM pH 7,5, 2 mM PMSF). Aproximadamente uro volume- igual de esferas de vidro ds 0,45 mm de diâmetro foi adicionado até a mistura ficar quase sólida. A mistura foi sujeita a agitação forte durante 4 min a 4“C usando um homogenizador Braun MSK (B. Braun e Diessel Blotech BmbH, Melsungen, FRS)» Subsequentemente, adicionou—se 4 ml de tampão PE e o homogenato foi misturado e centrifugado 5 minutos a 4~’C, 4Θ 00®xg« Amostras ds 5 a 25 p.g do sobrenadante foram sujeitos a elsctroforese em gel de SDS-poIiacrilamida, usando HBsAg purificado (0,05 a 0,5 pg ) como testemunha. A presença de material antigénico foi demonstrada por transferência da proteína para nitrocelulose de acordo com o método de Towfoin (1979) e dstecção com o anticorpo monoclonal RFó como descrito no Método 5a acima. As transferências Western permitem um cálculo da quantidade de antigénio produzida nos clones 352, 415 e 416, por referência, a quantidades conhecidas de HBsAg puro derivado de levedura.
Os resultados estão resumidos na Tabelai» Nas culturas em frasco induzidas com metanol ímeio SMR) com uma densidade celular de 5 g de peso seco /1, a proteína S constitui cerca de 2 a 57 d-a proteína total extraída das estirpes transformadas»
A comparação da expressão em células cultivada em condições de indução (metanol), desrepressão (glieerol) e repressão (glucose) demonstra um controle muito apertado dos promotores MQX e FliD. A expressão está completamente bloqueada em células cultivadas em glucose»
30% do nível obtido em
iiKsftf
ç.m gliuerol, -a aintcss células induzidas, cerca de
b) Antigenicidade de HBsAg expresso em Hansenula polymorpha ft anteginicidade do mater foi medida usando um teste AUSZYME monoclonais» Os resultados estão ex nas (absorvSrscxa a 492 nra por U5Í extractos brutos e a reacção fora tampão fosfata 25 mM pH 7,4, 0,01% ff este AUSZYME acterísticos d ndica a presença de epítopos partículas sufi-virais» ial contido em extratos brutos da Abbot baseado em anticorpos presssos em uniodades arbitrá— μα de proteínas diluição dos ,m efectuadas em 15© mM MaCl, Tween 201= A reactividade com conformac _;n -3. i S
TABELA 1 Produção de Ο X p ΓΌ S £ -3 i ndo o gene S
c-sloulado por fcranferência HBsAg calculado por- snSc?.io
Fonte Western AUSZYnE
Estirpe promotor de mg/10009 arbitrário
Carbono de proteína Unidades A 0?i pg proteína
352 FMD Glucose Sem sinal
G1icerol A ~ t; 3—5 j. «Ϊ— 10,0
Metanol X· r; --J’*’”-»? Jf y 25,0
Sem sinal tj 1
- -i »
=3 1 X O tó Γ U x 1 3 í#~ 1 5 □ i z ? 0
Metanol 4 n @'~5 == 0 4^3 _ A
416 MOX Glucose Sem sinal Sem sinal
Slicerol 0=,5-0,,8 ge0
Metanol ai κ Q %í 22 ς 0
c) Centrifugação em grad brutos de Hansenula oolymorp XOFltSrS· do dOFtISXdctd' 5-- e dos extractos
Os extractos bruto *ξ- obtidos do acordo
descrito atrás Toram sujeit os a centrifugação Si» gradiente de
densidade usando gradientes de CsCl ou sucrose. Μ O Sl í C V i TUQ -3.Ç1 -5.0
em y rauienbes de equilíbrio sacarose
ΤΟX SYO=—. CLtO-5.
por
aplicação ds 100 a 200pg <200 μΐ) do extrato bruto de proteína no topo dede um gradiente de sacarose de 20 a 50% em 5« mM NaCl, 2 mM EDTA, 25 mM NaPOz,, pH 7,2» Tubos tendo um volume de 5 ml foram centrifugados durante 18 horas a 40 8©@ rpm num rotor Beckman SW
A centrifugação em gradiente de cloreto ds césio foi efectuada por diluição de 1 volume do extracto bruto de proteína com í volume de CsCl 3M em tampão fosfato 25 mM pH 7,4» A centrifugação foi realizada a 4°C, 4© ©00 rpm num rotor Beckman 50 Ti durante 40 horas» f-S radientss foram sujeitos & fraccionamento e as várias fr-acçSes testadas usando anticorpos RF6 em transferências Western ou usando ensaios AUSRIA ss/oíí AUSZYME» Mostrou-se que no gradiente de densidade de CsCl se forma um piccí de materialcom uroa oensidsoe de aproximadamence x,xô a x,x Y q/mx« o macerxax presente neste pico reage muito bem não só com anticorpos RF6 em transferências Western mas também nos ensaios AUSRIA e AUSZYME.·.
como reactxvidade nos testes epítopos conformacxonais HUfôâ OU t*“3. BX pS?r*Í β’Π€Ζ&<& -c5.
Esta densidade assim AUSRIA/AUSZYME indica a presença de característicos da.s partículas» Ainda» densidade deste material foi comparada com partículas subvirais isoladas a partir da soro humano» Conseguiu-se demonstrar que ambos os materiais se encontram numa densidade comparável por centrif Ligação .'i.sopicnica em soluções e CsCl»
A centrif ugação em gradientes ds sacarose dos extractosbrutos deu fracções de pico» que reagiram com AUSRIA. e AUSZYME e que constituiu pelo menos B©% do HBsAg conforme demonstrado por análises das fracções dos gradientes em paralelo com AUSRIA e/AUSZYME e transferências Western» Os 2©2 de material
c.i dua encontra—se principalmente nas fracções do topo e fundo e reagem
•apenas sst análises da transferências Western, indicando que material constitui a forma monomérica da proteína» A análise •fracções do pico obtido em gradientes de CsCl também revelou pelo menos 80% do material forma partículas» das que
As partículas derivadas de HansenuIa ρο1ymorpha resistentes à proteólise.. A incubação dos extractos proteína contendo partículas durante várias horas temperaturas revela apenas uma ligeira degradação como oelos valores dos testes de AUSZYME e analisando se o »510 .-Ir»».
uSO OU náO tactopor SDS-PASfc. desnaturante brutos a várias se mostra polipeptísequido de transferências Western» 0 microscopia electrónica» As ma cer xa»
TO3 an a 1 i sad o oo r
Fotografias de microscopia electrónica mostram claramente partículas com uni disêmetro de aoroximada*
Os resultados descritos atrá foram ootioos ara
L.r'a'i3 eatirueu
PARTE C ão da proteína preSí?m Hansenula polymorpha
Exemplo C»1 construção de estirpes ds Hansenula polymorpha contendo o gene preSÍ—S2—S
Hansenu1a polymorpha RB 1© foi transformada com o fragmento Pvuí —Asp718 da 557© pb derivado de pMPS—22, englobando o gene UHA3 e o gene preõl sob o controle do promotor MOX Cver
Figura 8)„ Ainda, o preSl sob o controle fraqmento corresponden te do promotor FMD (deleção oortatíor do gene —9) fox obtido a
— Q*7 — partir do plasmídeo pMPs-21» Os integrantes rssultantss destas transformacSss apresentar® 1 a 2 cassetes de expressão por análise Southern» Os integrantes contendo p gene preSÍ sob o controle do promotor MOX são referidos como preS—AM; os integrantes contenda a gene preSÍ sob o com referidos como preS-AF» do promotor MOX são
Os integrantes contendo várias lassetBs de expressão foram obtidos por transformação de Hansenu1a po1ymorpha com plasmídeos de replicação autónoma pMPS22 e pMPS2i portadores da sequência HARS» Os integrantes foram formados por integração espontânea destes plasmídeos como descrito em «Materiais e Métodos», item 2b» Estes tipos de transformantes foram designados pela designação geral preS-BM (promotor MOX) e preS-BF (promotor FMD)»
As ss rir pes preS-AM-405, preS-BM-402, preS-Bl-t-403 e preS—BM—454 em que a expressão do gene preSÍ é regulada pelo promotor MOX foram guardadas para posterior análise»
Estabilidade «sitática h escabxizdade mitutxca ; ranho presente nas quatro estirpes identificadas no Exemplo C»í acima foi testada por análise Southern ds 12 subclones independentes isolados antes e após um período de crescimento de 40 gerações como descrito na PARTE B» a análise confirmou a estabilidade genética dos vectores integrados (ver também um exempla na PARTE D»3)»
3» Expressão da proteína preS em Hansenula polymorpha
As estirpes preS—BM—402, preS—BM—403, preS—AM—405 e preS-BM-454 foram cultivadas em meio SMR contendo glicerol
seguido de indução das células cora .mefano 1 íí© g/D exactamente como descrito na PARTE £= As células foram colhidas 25 horas apos adição de etanol e os extractos brutos foram preparados como descrito na Parte B»
a) quantidades de 12 pg de extractos brutos das estirpes preS-BM-402, pre-3-AM~4@5 e preS-BM-454 foram analisados por electroforese em gel de SDS-ραΙiacrilamida seguido de transferência Western usando uma mistura de anticorpos monoclonais CSÍ.l, S2«2 e S2«5) como descrito em «Métodos 5 (a)»» Ambos os tipos de estirpes apresentara uma dupla banda antigènica a 38/3? KD e uma outra banda a 45 KD»
A estirpe preS—AM-4©5 mostrou um teor mais baixo da espécie 45 KD relativamente aos materiais 39 KD do que a estirpe preS-B.M-4®2;; a estirpe preS-BM-454 apresentou o teor relativo mais altoda espécie 45 KD» □ padrão electroforético da proteína preS das estirpes atrás foi comparado com o antigénio derivado das partículas de soro humano» Ambas as preparações humana e de levedura apresentam uma banda a cerca de 38/39 KD quando comparado com transferências Western»
b) Foi também observada uma variação no nível de expressão das diferentes estirpes» Estas diferenças foram presumivelmente devidas a variações no número de cópias da cassete de expressão entre as estirpes» 0 antigénio preS foi calculado por transferências Western como constituindo ©,1 a. 1,5 a da proteína celulartotal ens estirpes diferentes preS-A e preS-B como apresentado na Tabela 2«
Os extractos brutos foram também testados com o nsaio AUSZYME quanto ã presença de partículas» Os resultados como se mostra na Tabela 2 demonstram uma reactividade muito baixa expressa como unidades de por ®,í pg de proteína»
TABELA 2 - Expressão de preS em H» polymorpha
C1 one Proteína PreS calculada por transferência Western mg preS1/1®Smq AUSZYME unidades A.,.-..-, por ®,1 p.g de proteína
preS~AM~405 0,1-0,2 0,01
preS-BM-402 0,3~®,5 0,02
preS-BM-403 0,4-0,6 0,02
preS-BM-454 1,2-1,5 ©,1-0,2
c) Slicosilaçãos A estirpe preS-BM-454 caracterizada por elevada produção da proteína preS (cerca de i,5X da proteína celulr total) e uma banda pronunciada de 45 KD foi escolhida para posteriores estudos de glicosilação» A proteína preS de preS-BM-454 foi analisada por incubação dos extractos brutos de proteína com endoglicosida.se EndoH» Os resultados que se seguem mostram claramente que -a espécie de 45 KDé uma forma glicosílada da proteína preS»
Quando da incubação de 45 pg de proteína bruta durante ®,5, 1,0, e 24 horas com ®5 mli de endoglicosida.se EndoH de acordo com as instruções do fabricante íBoehringer Mannheím, FRS), a banda ds 45 KD passou para, um peso molecular aparente de 42 KD»
Esta mudança indica que a espécie de 45 KD é uma forma N—qlicosi— lada da proteína preS, portadora de um grupo central de aproximadsmente 300« D»
A tunicamicina que se sabe ser um potente inibidor ds N~~glicos.il ação, foi também usado para estudar a glicosilação da proteína preS em Hansenula polymorpha» A estirpe preS-BM-454 foi cultivada até uma densidade de em meio YNB contendo glucose (1© g/l) = 1© ml desta cultura foram inoculados em 100 ml de YNB contendo ÍOg/l de metanol e 5© pg/ml de tunicamicina» 0 valor do pH foi mantido constante entre 7,2 e 7,5» Fez-se uma experiência testemunha sem utilizar tunicamicina» As células e 3© horas após a inoculação do meio foram colhidas contendo tunic
10, 15 licina»
Os sxtractos de proteína bruta foram analisados por transferência Western» Os estudos demonstraram que nas células cultivadas na presença de tunicamicina são vísiveis uma única banda de 42 KD e uma dupla banda a 38/39 KD» Na experiência testemunha a banda de 42 KD foi substituída por uma banda de 45 KD» Resultados semelhantes foram obtidos com extractos das estirpes preS—BM—4©2, preS-BM—403 e preS-AM-405, que no entanto produzem quantidades muito mais baixas da proteína 45 KD (não mais do que 5 a 10% da proteína pre-S total sintetizada!» Os resultados sugerem que a banda de 42 KD representa uma forma O-glicosilada da proteína preS»
d) Centrifugação em gradientes de densidade
Extractos brutos da estirpe preB-AM-405 e estirpes preS-BM~402, preS-BM-403, preS-BM-454 foram sujeitas a análise por gradientes de sacarose e CsCl» As condições foram descritas
na Parte B 5íc). As fracçSes dos gradientes foram testadas por transferências Western e por testes de AUSZYME,
A análise revelou queao contrário das estirpes expressando o antigénio S (PARTE B> ou os antigènios preSl e S (PARTE D), as estirpes preS não formam eficasmente partículas subvirais» Nem a centrifugação isopicnica em CsCl nem em gradientes de sacarose revelou a formação de uma banda da densidade requerida» Isto foi também confirmado pelo facto de o material relacionado com HBsAg das fracçSes do gradiente e os extractos brutos reagirem fracamente com os testes AUSRIfi ou AUSZYME»
PARTE D coroação de partículas compostas contendo os antigènios prshi e tí
ExanalaJU
Construção de estirpes
Construiram-se várias estirpes que são caracterizadas por diferentes taxas de expressão de preSÍ relativamente a S e diferentes níveis de expressão total»
Estas diferenças foram conseguidas por variação do número de cópias das cassetes de expressão por genoma» Obteve-se variabilidade adicional colocando os genes sob o controle de diferentes promotores de Hansenula»
Obtiveram-se três tipos básicas de estirpes recombinantes como se seques
-a) As estirpes contendo uma cópia do gene preSí e uma cópia do gene S (estirpes A>
fragmento de DNA Nhel de 6,6 Kb contendo a cassete prsSÍ eo gene URA3 foi isolado a paritr do plasmídeo pMPS9 (Figura ’?)« Um fragmento de DNA Nhel contendo o gene S foi isolado para formar o plasmídeo pMPS2 (Figura 5)= Os fragmentos foram ligados usando DNA-ligase de T4 e os fragmentos unidos consistindo numa cópias de cada um dos genes foram isolados a partirde géis de agarose» Estes fragmentos foram usados para transformar Hansenula polymorpha estirpe RB1@ para independência ao uracilo»
Os transformantes resultantes foram analisados por transferência Southern e os clones contendo uma cópia integrada de cada cassete foram seleccionados» A estirpe preS/S-A-293 foi guardada para posterior análise»
b) Estirpes contendo uma cassete de expressão preS- e várias cassetes de expressão S (estirpes B)
Hansenula polymorpha foi transformada com o fragmento Asp71S-Pvul de 557® pb de pMF‘S-22 contendo a cassete de expressão preSí» Os transformantes portadores de uma cópia integrada da cassete foram seleccionados» A estirpe retida foi preS—AM-405 descri ta na parte C»1 atrás ·.
A estirpe preS-AM-4®5 foi então transformada com plasmídeos de rsplicação autónoma pRB-S-326 (promotor Ff®) ou pRB-S-322 (promotor MOX) (Figura 7) contendo o gene S sob o controle dos respectivos promotores» Em adição ambos os plasmídeos são portadores de um gene codificadores- de resistência â gentamicina 8418 como marca selectiva,, 0 gene Kan está sob o
Controls do promotor ADHi de Saccharomyces cerevisiae (Figura 75 como descrito atrás» A transformação deu várias estirpes contendo -sempre uma cópia integrada da cassete preSl e múltiplas cópias integradas (30 a 100) da cassete contendo o gene S como se mostra palas análises de transferências Southern s PF6E»
As estirpes preS/S—B—43Í, preS/S~B—432 e preS/S—B—433 foram retidas para posterior análise» A estirpe preS/S-B-431 é portadora de um gene S controlado por um promotor MOX, enquanto que preS/S-B-432 s preS/S-B-433 contem as cassetes ds expressão compreendendo o promotor FliD,
c) Estirpes contendo várias cassetes de expressão dos genes S e preS (estirpes C5
Hansenula polymorpha foi transformada com o plasmídeo de replicação autónoma pMPS-22 contendes o gene preSl (Figura 8)» A transformação deu várias estirpes contendo números variáveis de cassetes ds expressão integradas no genoma» Os isolados contendo 2 a 20 ca.ss.etes ds expressão preSl integradas no gsnoma foram identificados por Transferência Southern» Aquelas estirpes foram descritas na Parte Ccorao preS-BM-402« preS-BM-403 s preS-BM-454 e expressam diferentes quantidades de antigénio preS» Estas estirpes prsSforam então novamente transformadas com os plasmídeos de replicação autónoma pRB-S-322 (promotor MOX) e pRB-S-32ó (promotor FMD55 os quais são portadores do gene S (Figura 75« A resistência a G41S foi usada comes uma marca de transformação, A sel-ecção dos integrantes estáveis deu vários clones para cada transformação alguns dos quais foram posteriormente analisados» As estirpes retidas para posterior análise foram preG/S—C-452, preS/S-C~465 derivados da estirpe preS-BM-402? estirpe preS/S-C-466 derivada da estirpe preS-BM-403, estirpe prsB/-C“448-C4 derivada da estirpe preS-BM-454? em que as cassetes de expressão f
do gene S compreendem o promotor FMD« fi tabela detalhada acerca da origem e designação das dá informaçã estirpes atrá descr i tas *
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Tabela Ȓ ral
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Proporção esti- mada de PreS para S a partir de Imunotransfe- rência _ m mo o HririNonincnra r-trlrlrlHHrlrdLÍ) raratorararararara uuuuuuuuo
Reactividade com AUSZYME Unidades Α^θ2 arbri* tárias - inoinoininino ΟΗΝΗΠ(ΊΠΠ(Ί • 1 1 1 1 1 1 1 1 inooooincnrao HrlHNrlNNH
ra Ό ^r rd C cd p; •p ra O -P j -p ra; ra ° & 0, íca p “o ra w £ ra p w 7 a ra X P g ω a'c »rooraoratnrain ΟΜΠΜ'Τ'ί'Τ'ί 1 1 1 1 1 1 1 1 1 raintnooinmino tn u
Número estimado de casetes S in rd rd 1 o O O O O ooorarainmcd rd rd rd 1 1 1 1 1 • · · O O O O O (0 ra ra cn m n m rd U U U λ''λ\λ'·λ''λ''
Número estimado de casetes PreS ra ra ra ra o o o o ° (d rd rl Η 1Γ| ,Η lr| O c, p p p 1 'ra 'ca 'cd 'cd o > > > > XS
Estirpe preS/S-A-293 preS/S-B-431 preS/S-B-432 preS/S-B-433 preS/S-C-452 preS/S-C-453 preS/S-C-465 preS/S-C-466 preS/S-C-448-C4
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Expressão das proteínas preS e S em H„ polymorpha.
A expressão das proteínas preS e S em diferentesestirpes de H. polymorpha foi testada por imunotransfrência como descrito em Materiais e Métodos 5a e por ensaio AUSZYME. Na Tabela 3 está apresentado um resumo dos resultados e das propriedades das várias estirpes testadas.
As estirpes expressando -as proteínas preS e S foram cultivadas e induzidas como descrito na Parte B item 3 exceptuando terem sido usados volumes de cultura de 30 ml. Os extractos celulares brutos foram preparados como descrito atrás e sujeitos a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida seguido de transferência Western usando RFó ou uma mistura dos anticorpos monoclanais SI»1 e S2.Í para detecção. Quantidades de 12 -a 15 pg de extractos brutos de células induzidas com metanol das estirpes preS/S-A-293, preS/S-B-431, preS-B-432, preS/S-B-4-33, preS/S-C-453, preS/S-C-465, preS/S-C-46à e preS/S-C-44S~C4 foram i-munotransferidas usando o anticorpo monoclonal RFB na detecção» Esta análise demonstra que se pode obter um espectro de estirpes que expressam diferentes proporções de proteína preS relativamente à proteína S» Destas e outras imunotransferências a proporção de preS relativamente a Sna estirpe preS/S-B-431 foi calculado como sendo cerca de 1 = 15, na estirpe preS/S-C-452 cerca de IsQ e na estirpe preS/S-448-C4 cerca de 5s3» Encontrou-se que as estirpes diferem também na seu nível de produtividade tanto por imunotransferência como por ensaio AUSZYME como se mostra na Tabela 3, Os extractos celulares destas estirpes foram também imunotrsnsferidos usando na detecção o anticorpo monoclonal Sí . 1» Na maior parte das estirpes a proteína preS é detectada como uma banda dupla de 343—39 KD com menor quantidade da banda 45 KD Ca qual foi estimado como compreendendo -apenas 5X da proteína preS total detectada)» Ao contrário a estirpe preS/S—C-448-C4 expressa quantidades aproximadamente equivalentes das espécies 38-39 KD e 45 K.D»
ExemQloJ)^3
E.ãtabilidade_do.^MA......estranho
A estabilidade do DNA estranho nos transformantes preS/S e integrantes atrás descritos foi analisada como descrito na Parte B = Os estudos indicam uma estabilidade mitática muito fraca dos clones recombinantes» A análise Southern de 12 colónias independentes isoladas antes e após uma fermentação ds 4® gerações das estirpes preS/S-453 e preS/S-431 demonstrou que em todos os casosera vísivel o mesmo padrão de fragmentos de restrição. As estirpes preS/S apresentadas na Tabela 3 foram também analisadas por Pulsed Field Gradient Electropborssis» Os cromossomas separados foram transferidos para membranas ds nitrocslulose e depois hibridados com diferentes sondas de DNA radioactivas» 0 processo permite o cálculo do número ds cópias da cassete de expressão S e provou conclusivamente que estas estirpes preS/S são integrantes» Os resultados destas experiências estão resumidos na Tabela 3 acrâs»
Fxsmplo D,4
Isolamento e caracterização de partículas compostas
a) Purificação parcial de partículas compostas derivadas de
Hansenula polymorpha
Uma. cultura, de fsnssntador de Hansenula polymorpha estirpe preS/S-B-43í foi cultivada em meio S descrito atrás em Materiais, 5d e as células recuperadas por centrifugação após 78 horas de indução com metanol» 0 sedimento celular foi ressuspenso numa concentração ds aproximadamente 120 g de peso seco de células por litro em tampão contendo 0,5a (p/v) de Tween 20, 2 mH EDTA, 4mM PM8F, 5X <v/v) de isopropanol e tampão fosfato de sódio 50 mH pH 9,0« As células foram rebentadas num moinho de esferas CDynomill Type KDL, Bachofen AS, Basei Switzerlsnd? contenda esferas de vidro de 0,45-0,7 mm de diâmetro fazendo 4 passagens a um fluxo e 6 litros por hora e um tempo de residência de 7 minutos na câmara,
O extracto celular foi clarificado por centrifugação durante 45 minutos a 16 &&& g a 4~C e o sobrenadante recuperado»
Silica coloidal (fterosil 38®, Degussa, Frankfurt, FRG) a 17» (p/v> foi então adicionado ao sobrenadante com agitação e a mistura agitada durante a noite a 4UC para permitir a adsorção de HBsAg» A silica foi recuperada por Centrifugação durante 30 minutos a 4 0®Og a 4u'Ce lavada duas vezes com 0,9% íp/V) de NaCl por ressuspensão do sedimento e reoentrifugação»D HBsAg absorvido á silica foi desadsorvido por ressuspensão do sedimenta lavada em pirofosfato de sódio 1® mM pH 9,5 e incubação durante 3 horas a 37JC com agitação constante» 0 volume de tampão pirofosfato de sódio adicionado foi cerca de um oitavo a um décimo do volume de extracto celular clarificado inicial» A solução foi então centri— fugada a 17 ®®0 g durante 60 minutos a 4UC e o sobrenadante recuperado = sobrenadante foi ajustado a 1,5 M CsCl e a mistura centrifugada até equilíbrio isopicnico durante 70 horas a 45 000 rpmnum rotor Ti 50.2 CSpinco Division, Beckman Instruments, Ralo
Alto, USA)» Os gradientes de CsCl resultantes foram fraccionados s as fracções testadas quanto ã presença de HBsAg usando um kit de ELISA CEnzygnost, Behring—Werke AG, Marburg, FRG) como descrita pelo fabricante» As fracçSes do pico foram reunidas e dialisadas contra fosfato sódio/potássio 10 mM, NaCl pH 6,8» Os ensaios feitos neste material ε □ extracto celular bruto mostraram que 48% do material total reactivo com AUSTRIA, menos de 3% das proteínas totais, menos de 0,2% dos açúcares totais e menos de 2% dos lípides totais foram recuperados neste processo»
Um sedimento de células de Hansenula poiyisorpha estirpe preS/S-C-452 foi também extraído exactamente pelo mesmo processo com resultados semelhantes»
Amostras de preparações de HBsAg parcialmente purificado derivadas das estirpes preS/S-B-431 e preS/S-C-452 foram examinadas por electroforese em gel e iaiunotransferência usando os monoclonais HBSi b Sí.í para a detecção de proteínas relacionadas com HBsAg como descrito na Parte D»4 abaixo»
A imunotransferência com o mnoclonal HBSi mostrou, a presença de uma banda reactiva em 24 KD e ainda, uma banda com cerca de 38/39 KD em ambas as preparações»
Isto mostra que a proteína preSi e a proteína S copurificam através da adsorção a silica coloidal e centrifugação isopicnica em gradientes de densidade de CsCl» b> Centrifugação em gradiente de densidade de cloreto de césiodas partículas compostas»
Uma cultura de fermentador de Η» ρο1y morρha estirpe preS/S-B-431 foi cultivada em meio 8 (Materiais, 5d> escolhidas após 73 horas ds indução com metanol» 0 sedimento ds células foi recuperado por centrifugação e ressuspenso e um extracto celular preparado por passagem através de uma French Press como descrito abaixo» Os detritos celulares foram removidos do lisado bruto por centrifugação durante 30 minutos a 17 000 g» Os extractos celulares brutos foram centrifugados até equilíbrio a 250 00®g em CsCl 1,5 M, tampão ds fosfatos salina pH 7.5. Os gradientes foram fraccionados e cada uma das fracçSes analisada quanto à antigenicidade usando testes ds ELISA específicos para HBsAg (Enzygnosts Behringwerke AS, Marburg, FRS) e para preSi« Os testes Enzygnost medem apenas partículas de HBsAg montadas e não monómeros de proteína. 0 teste de ELISA específico da proteína preSl emprega o anticorpo roonoclonal murino Sl.l para captura s detecção de antigénios e está descrito abaixo na parte D. 5«
Observou-se um pico de actividade HBsAg numa densidade de 1,18-1,19 g/cro no gradiente de cloreto «de césio» Um pico principal de actividade da proteína preSl foi observado nesta mesma densidade juntamente com um pico menor numa densidade de Í,2Ó g/cm3»
As fracçSes ds gradiente foram também analisadas quanto à presença de proteína preSl & proteína S por irounotransferência. Após slectroforese em gel de dodecilsulfato ds sódio e s poliacrilamidade acordo com Laemmli <1970) e transferência para nitrocelulose de acordo com To&sfoin et al» CÍ979), a folha; ds nitrocelulose foi incubada com um soro policlonal de coelho induzido contra soro derivado de HBsAg» A detecção da ligação de antícorpo foi pelo método de fosfatase alcalina»
Foram observadas uma banda proteica, principal a 24 KD correspondendo á proteína S e uma dupla banda de 38/39 KD» A actividade máxima na imunotransferência para as três espécies de
111 proteína foi nas fracçSes do gradiente de CsCl com uma densidade de 1,18-1,19 g/cm' que corresponde ao pico de actividade de HBsAg medido no teste Enzygnost. Isto indica que a maioria das proteínas do antigénio de superfície de HBV no extracto bruto estão presentes numa estrutura lipoproteica com uma densidade característica de HBsAg.
Uma. outra folha de nitrocelulose foi incubada com o -anticorpo monoclonal murino Sl«l. Este anticorpo detectou apenas as bandas de proteína de 38/39 KD nas fracçSes correspondendo a uma densidade de CsCl de 1,18-1,19 g/cm'. Os extractos celulares brutos foram também sujeitos foram aplicados em gradientes de 5-20% Cp/v) de sacarose feitos em tampão Tris-HCl 5® mH pH 8,1 e centrifugados a 288 ®-®@ g durante 2®® minutos» Os gradientes foram fraccionados e as fracçSes analisadas quanto à presença de de HBsAg pelo teste de ELISA Enzygnost e detecção com o Mafa Sí.í especifico da proteína preSi. 0 ensaio Enzynost mostrou um pico de actividade HBsAg sedimentando através do gradiente.
A ELISA com o Mafa 1»i mostrou o mesmo pico que o ensaio Enzygnost mas com um patamar de actividade prolongando-se para densidades de sacarose mais elevadas» Este patamar de material com um coeficiente de sedimentação mais elevado é eliminado quando extractos brutos de Hansenula polymorpha estirpe preS/S-B—431 foram parcialmente purificados por adsorção/desadsorção em silica coloidal e centrifugação num gradiente de de CsCl antes da análise por centrifugação em gradientes de densidade de sacarose» Estes resultados mostram que o HBsAg e a proteína pre-Sl co—sedimentam nos gradientes de densidade de CsCl cora uma densidade característica de partículas lipoproteicas»
c) fintÃgeniçidaág......ds.......par.U.gula.ã..AJjB,ãAa,.£QfflBSst^5--g>mLêêSéS-gfll
Η» po1ymorpha
As partículas de antigénio de superfície doHBV foram parcialmente purificadas a partir de um extracto bruto de H. polymorpha estirpe prsS/S-B-43í como descrito atrás no item 3a. Esta preparação foi testada quanto à reacção com anticorpos monoclonsis murinos CMabs) dirigidos contra epítopos situados nas regiões preSi, preS2 e S da proteína do antigénio ds superfície e quanto à presença do receptor tie polímeros da albumina do soro humana Creceptor ds pHSA) na região preS2.
Cí» Reacção......çogt..nab§l..°í
Ufií anticorpo monoclonal murino CMab) Si»í dirigido contra um epítopo preSi da prteína do antigénio de superfície do HBV foi usado para dstsctar a presença deste sítio na partícula composta por um ensaia de ELISA» Os poços de uma placa de microtitulação Clmmunoplate I5 Nunc, Sibco Europe, Bhent, Belgium) foram revestidos com MabSl.1 e incubados com o extracto bruto parcialmente purificado» Após lavagem para remover o material não ligado, a captura de partículas reactivas foi revelada por incubação com MabSl.1 acoplado a peroxidase de rábano silvestre pelo método de Wilson e Makame, 1978=
D desenvolvimento de cor para revelar a ligação do segundo anticorpo foi com ortofenilenodiamina como cromogénio. A absorvSncia foi lida a 490 nm Ccom £>2® nm para o filtro de referência) num Immunoreader Intermed, MJ 2ΘΟ0 C.Analis, Ghent, Belgium)»
O extracto parcialmente purificado ds Hansenula polymorpha estirpe preS/S-B-431 deu uma reacção positiva no teste
4?
* •C
indicando a captura e ligação do MabSÍ.Í que ê específico para a região preSl» As- partículas de antigénio de superfície contendo apenas proteína S purificada a partir de S» cerevisiae RIT4376 Charford et al»? 1987) não deu reacção neste teste»
C)
R«auí»2o uufli Mabs2 anticorpo monocionaí murxno 32.
usado num teste de ELISA oar è dirigido contra a
HBV. Este Mab foi a presença do epítopo preS2 nas partículas compostas» Os poços de uma placa de microtitulação foram revestidos com o MabS2=5 e incubados com o extracto celular parcialmente purificada de Η. ρο1ymorpha preS/S-B-431. A ligação do antigénio foi revelada por incubação com o MabS2«5 acoplada a peroxidase de rábano silvestre e o desenvolvimento de cor foi efectuado como atrás» D extracto celular parcialmente purificado de H» polymoroh-a preS/S-B-431 deu uma reacção positiva no teste indicando a presença do epítopo da região preS2 nas partículas do antigénio de superfície» As partículas do antigénio de supefície contendo apenas a proteína S purificada a partir de S, cersvisias RIT4376 não deu reacção no teste»
C3» Reaccão com os Mabs RF1 e Sí»í CHRP) b antxcorpo monocionaí murxno μ*1-*» Ϊ ϊ íri ϊ « Λ Π «
Free Hosoita innrinn, U»K») é dirigido contra um epítopo confor macional situado na região S e foi usado num teste de ELISA» Este anticorpo monocionaí foi usado para revestir poços de olacas de microtitulação e incubado com o extracto parcialmente purificado de Η» ρο1ymorpha preS/S-B-431= A ligação de partículas foi revelada por incubação com a peroxidase da rábano silvestre acoplada ao Mab Sl.í descrito na secção C=1 atrás» 0 extracto parcialmente purificado de H» polymorpha deu um resultado positivo no teste enquanto as partículas de antigénio de superfície purificadas a partir de 5. cerevisiae RIT4376 não deram reacção»
M = Ensaio Para,.....p, receptor,.....»H5fi
Um ensaio para a dstecção do receptor pHSA presente na região pre82 foi feito de acordo com o processo de Pontisso et al» <1933)o
A albumina sêrica humana polimerizada foi usada para revestir os poços de uma placa ds microtitulação e incubou-se com o extracto celular parcialmente purificado de H= polymorpha estirpe preS/S-B~43í„ Após lavagem para remover o material não ligado, as partículas capturadas na placa foram detectadas por incubação com os anticorpos policlonais de coelho anti-HBsftg marcados com (kit AUSAB)» 0 extracto parcialmente purificado a partir de H, ρο 1 yaiorpha deu uma reacção positiva no teste enquanto que HBsAg purificado a partir de S» cervisiae RIT4376 não deu reacção noteste.
Os resultados acima mostram que o material rsactivo HBsAg presente no extracto parcialmente purificado de H. polymorpha contem sítios antigénicos sspecificamente ligados por Mahs dirigidos contra epítopos nas regiões preSi, preS2 e S do antigénio de superfície do HBV e que este material não contem um sitio rsactivo com pHSA» d> Imunoprecipitação ds partículas compostas
Para determinar se o material rsactivo com AUSRIA num extracto parcialmente purificado de Η» ρο1ymorpha estirpe uma
PreS/S-B-431 continha partículas compostas realizou-se imunoprecipitação com um anticorpo monoclonal específico para a proteína preSl,
Os complexos imunes foram capturados por células de Staphylococcus aureus CStaph A) fixadas com formalin-a <Immunopre~ cipitin, BRL, Saithesburg, MD, USA) usando o soro de coelho anti-ratinho coroo anticorpo da sanduicheentre o anticorpo roonoclonal e as células de Staph A» As células de Staph A foram pré-tratadas conforme recomendado pelo fabricante e finalmente lavadas e ressuspensas a 10% Cp/v> em PBS» As células de Staph A <120 μΐ da suspensão a 10% p/v) foram então incubadas coro 20 μΐ de soro de coelho anti ratinho (RAM) durante 2 horas á temperatura ambiente» Cf complexo Staph A-RAM foi colhido por centrifugação, lavado duas vezes com PBS contendo 0,1% <y/v) de Tween 20 e finalrosnts ressuspensas a cerca de 10% <p/v) em PBS contendo 0,1% (v/v) de Tween 20»
A uma preparação parcialmente purificada de partículas de H. polymoroha estirpe preS/S-B-43i obtida coroo descrito atrás e a uma amostra de partículas de proteína S do HBsAg derivadas ds levedura (lote HB193, Sroith Kline Biologicals, Rixensart, Belgium) ambas contendo 2 pg de material reactivo com AUSRIftem 500 μΐ foi adicionado 1 μΐ de MabSl.1 <633 pg de proteína por rol) e as misturas foram incubadas durante duas horas à temperatura ambiente» 2© μΐ do complexo Staph A-RAM foi então adicionado e a incubação continuou durante a noite a 4~C» Os complexos imunes formados foram colhidos por centrifugação, lavados 5 vezes com PBS contendo 0,i% <v/v) de Tween 20 e uma vez com PBS antes da ressuspensão dos sedimentos finais em tampão de amostra para electroforese ero gel ds SDS-poIiacrilamida» Os imunoprecipitados foram analisados por imunotransferência como descrito abaixo usando o anticorpo monoclonal RF6 <H» Thoroas, Royal Frss *
<c
Hospital, London) para detecção de espécies proteicas de HBsAg» 0 anticorpo monoclonal RF6 é dirigido contra um epítopo resistente à desnaturação s à redução do plasma derivado ds HBsAg e compete Effi experiências de ligação com o monoclonal HBSí»
A imunotransferência mostrou que o imunoprecipitado obtido a partir das partículas de H» polymorpha preS/S-B-431 continham não só -a proteína preSÍ como também a proteína S enquanto o imunoprecipitado do HBsAg derivado de Saccha romyces não continha poteína S»
Isto confirma que as partículas compostas de composição mista em polipeptídeos estão presentes no material parcialmente purifiçado a partir de H» polymorpha estirpe preS/S-B-431» e> Microscopia eleçtrónica
As partículas de HBsAg parcialmente purificadas a partir de H» po1ymorpha estirpe preS/S-B-431 foram examinadas por microscopia electrónica.. 0 material foi diluido em tampão 20 mH Tris-HCl pH 8,2 com 0,1% Cp/v) de albumina do soro bovina e sedimentado em grelhas de cobre/ródio cobertas com um filme de celoidina antes da coloração com acetato de uranilo» Q exame no microscópio electrónico mostrou a presença de partículas esferoitíais a esféricas com um diâmetro médio de 27 nm» Este tamanho está dentro da gama dos diâmetros médios das partículas medidas pela mesma técnica para uma série de preparações de HBsAg purificadas a partir ds 5» cerevisiae estirpe RIT4376 (Petre, J» st al postgrad» Medicai Suppl»2 73-81 1987)»
Exemplo D»5
5» Comparação ds partículas compostasexpressas em H» polvmorgha e sm S» cerevisias expressão S»
A construção
Culturas da sstirps prsS/S-C-453 de H. polymorpha e de 3» cerevisíae sstirps Y11Ô8 foram cultivadas em meio S como descrito em Materiais ? 5d» A estirpe Y11108 · ê uma estirpe diplóide de S» cerevisias expressando ambas as proteínas preSÍ e S a partir de cassetes de expressão integradas no genoma através de vectores Ty» A sstirps contem 5—7 cópias de uma cassete ds expressão preSÍ e 3-4 cópias de uma cassete de estirpe requere triptofano para o crescimento» integração cromossómica de tais cassetes de expressão usando vectores Ty está descrito em USSN copendente 07/292 202 entregue em 3ft do Dezembro, Í933 atribuída Smithkline Beckman Corporation que aqui é incluído como referência, Usou-se glicerol a 1 ?55Í t'p/v) como fonte de carbono para o crescimento de H» polymorpha» Uma série de frascos erlenmeyers de 2 litros contendo 400 ml de meio de cultura foram inoculados com H» polymorpha estirpe preS/S-C—453 e incubados num agitador orbital durante cerca de 33 horas a 30UC até exaustão do glicerol» Ais células dos três frascos foram colhidas por centrifugação a o sedimento celular guardado a -70°C para posterior processamento» Removeu-se 100 ml ds meio ds cultura de cada um ds seis outros frascos e substituiu-se por 100 ml de meio fresco contendo metanol a 4Z Cp/v), Continuou~se a incubação»
Colheram-se três culturas por centrifugação após mais 14 horas ds incubação e mais três culturas foram colhidas após 38 horas ds incubação na presença de metanol» As células foram
recuperadas por centrifugação e o sedimento celular guardada a ~-70cC até posterior processamento»
Numa segunda experiência culturas de S» cerevisiae Yíí©8 foram cultivadas como descrito atrás e colhidas após '19,5 horas de incubação. As culturas de H» polvmorpha preS/S-C-453 foram também cultivadas como descrito -atrás excepto as células serem colhidas após 26 horas da crescimento em glicerol e após 45 horas em meio contendo metanol»
Os sedimentos celulares de Hansenula polymorpha foram ressuspensos numa concentração de aproximadamente 25% de peso do sedimento de células molhadas por volume em tampão contendo ô,5X (p/v) de Twsen 2®, 2 mH EDTA, 4 mM PHSF Cfenilmetilsulfonilfluo— reto), 5%(p/v) de isopropanol e fosfato de potássio 5® mM pH 9,®» 1® ml desta mistura foi passado 6 vezes numa French Press a 2® ©0® psi para rebentar as células» 0 extracto celular bruto foi então clarificado por centrifugaçãoa 17 0©© g durante 45 minutos a 4UC e o sobrenadan-te recuperado» Os sedimentos celulares de S» cerevisiae foram tratados de modo semelhante excepto as células serem ressuspensas numa concentração de aproximadamente 5®% de peso de sedimento de células molhadaspor volume do tampão descrito atrás» teor em proteína de cada sobrenadante foi determinado pelo método de Lowry et al» (1951)» Os extractos celulares clarificados foram testados quanto à presença de HBsAg por AU-SRIA e quanto à presença de um epítopo da proteína preSí por um ensaio de ELISA» 0 ensaio de ELISA com o anticorpo monoclonal Si»1 foi efectuada como se segue» Os poços das placas de plástico (Nunc Immunoplate í, Bibco Europe, Bhent, Belgium) foram revestidas com o anticorpo monoclonal de ratinho SI»1 em tampão bicarbonato de sódio 5© mM pH 9,ó durante 2 horas a 37’“’C» Adicionou-se então aos poços diluições seriadas de duas vezes dos extractos celulares feitas em PBS, 0,2% (p/v) de albumina do soro bovina e incubou-se durante í hora a 37fC =
Os poços foram então lavados 3 vezes com 0,9% íp/v) NaCl, 0,05% (p/v) de Tween. A captura de antigénio foi revelada por incubação com o anticorpo monoclonal Sl«í acoplado a peroxidase de rábano silvestre pelo método de Wilson e Nakane (1978)= anticorpo conjugado em PBS, ©,2% íp/v) de albumina do soro bovina foi adicionado a cada poço e incubado durante 1 hora a 37°C= A ligação do segundo anticorpo foi revelada pela adição de ΙΟ® μΐ de uma solução contendo 4 mg de o-fenilenodiamina (Sigma), 15 μΐ de peróxido de hidrogénio dissolvido em 10 ml de ΚΗ,-,ΡΟ» pH 6,0 e incubação durante 15 min ã temperatura ambiente»
A reacção foi bloqueada pela adição de 25μ1 de 1 N Η.-,50Λ e a densidade óptíca lida a 490 nsi (com 620 nm como filtro de referência) num Intermed Immunoreader, N3200 (Analis, Bhent, Belgium), Os resultados foram calculados a partir da porção linear das curvas de densidade éptica obtidas e expressos em Unidades de Densidade óptica por mg de proteína»
A quantidade de HBsAg reactivo em AUSRIA e a proteína preSl determinada nos extractos celulares de S,. cerevisiae e de H. polymorpha das duas experiências estão apresentadas nas Tabelas 4 e 5» A quantidade de materiais reactivos com AUSRIft encontrados em extractos brutos de S, cerevisiae estirpe YÍÍ08 ê cerca de cem vezes menos do que nos extractos brutos ds H» polymorpha preS/S-C-453 induzidas durante 38 a 45 horas em metanol, A quantidade de proteína preS testada por ELISA é cerca de 3 a 8 vezes menos indicando que 5'» cere visiae estirpe YÍÍOB produz uma maior proporção de proteína preSl relativamente à proteína S do que H ·., pol ymor pha estirpe preS/S-C-453 = »
*
TABELA
Ensaio AUSRIA dos extractos celulares brutos
Ex tracto celular hrasco Número Proteína HBsAq CAUSRIA)X proteína total Proteí preSl txU. 1 ic-lH t$ Unidad OD por mg oroteí nõí de na
S tt C £? Γ Er V í s i â 1 A rs ® .01 1 Z. tj *7
λ/ ·? ·1 í i ã t7uf o 18 q & 0,008 5 „ 0
cz í ~«- & @ _ 0 1 0 A
H» polymorpha 6,8 0, ®77 „ a
preS/S—C—453 b 7,4 0.103
cultura em c 9,2 0.. i 15 7
o 1icerol
Indução com .·>% Fí_5 4 -5 CC A tj 1. ’-J 9_2
metanol b 7,0 í ,4® 11,3
UUí r 7,4 í .·. 46 8,8
fabel
Ensaio AUSRIA dos xtrac tus cs iuí are?
brutos
Ex tracto celular F rssc o Νώ Cmg/ml) HBshq <AuSRIA)% proteína total Prctsína. PreSl ELISA§ Uiliuaues OD por mg de prO£&Xt ífiá.
Sc cerevxsiae •rã 13-3 0=008 8r·^
Yí 1@8 O 15,0 0 5 0 í 5 9,7
c •i “ ·? 0,f013 O _ o
H« polymorρha a S - 4 0 .. 0 7 0 Ί *'·«
prsS/S—C-453 b s~t «·“% t£ V--1 tj â.-à 0 ~ -*'i
cu11u ra em c ~7 o 0 - 7¾
g1xcsrol
Indução com £> 3 1 = í 06 « 4 *t 3 í
metanol b 6 5 5 1,314 ώ .3 i3
38 horas c 7,7 1»688 5,1
Os resultados foram confirmados por imunotransferência dos extractos da primeira experiência juntamente com sxtractos de culturas induzidas com metanol das testemunhas·,
Bstxrp®s 43-4 448~“L4 looio
Amostras contendo 15 ug de proteína foram sujeitas a elsctroforese através de géis da separação e de concentração da 12,5% e 5% respec tivamente, de acordo com o mé-todo de Laemmli <19715 e sujeitos a imunotransferência como descrito atrás em Materiais e Métodos· 5a usando o monoclonal HBS1 para detecção.
Extractos da estirpe preS/S-C-453 apresentam uma banda fortemente reactiva a '24 KD relacionada com a proteína S e uma banda a 38-39 KD relacionada com proteína preS» Uma banda de 45 KD quase não é detsctável. Pelo contrário, extractos de 5» cerevisiae estirpe yíl.08 apresentam bandas fracas a 24 KD e 45 KD = A banda dupla de 38-39 KD da proteína preS estava quase indetectável» 0 resultado da imunotransferência confirma que S. cerevisiae expressa menos proteínas S e preS do que em H. po3.ymorpha induzida com metanol e que a proteína preS expressa por 5, cerevisiae é predominantemente a forma glicosilada de 45 KD,
Exsmplo_D^6
Miristoilação da proteína preS em Η, po1ymor pha.
Culturas da estirpe LR9, estirpe 452 e 453 foram cultivadas em frascos de agitação em meio mínimo com 2,52 v/v de glicerol dirante 24 horas s metanol <1%, v/v) foi então adicionado» 6 horas após a adição de metanol, adicionou—se ácido miristico marcado com trítio e as- culturas foram incubadas durante mais lã horas, Colheram-se -as células, lava.ra.m~se e romperam-se com esferas de vidro na presença de 12 de BDS e R-mercaptoetanoI. Asproteínas extraídas foram separadas for electroforese em gel de SDS-PAGE e visualizadas por imunotransferência com o anticorpo monoclonal HBSí e por fluorografia» Os resultados mostraram que uma banda correspondendo ã. proteína preSÍ de 36/39 KD foi marcada nos extractos das estirpes 452 e 453 mas não no extracto de L.R9 = Isto é- consistente com a remoção pós—traduçãod-a metionina N-tsrminal e miristoilação do resíduo de glícina na segunda posição do polipeptídeo {Towler e Sordon? Ann» Rev« Biochem»? 1988)»
57=69-99?
Imunogenicidade dos antigénios preS derivados de H» polymorpha
Prepararam-se extractos brutos de proteína a partir de culturas cultivadas em metanol das estirpes 452 e 454 e adsorvidas a hidróxido de alumínio a 1 mg/ml concentração final» 0 teor em epítopo preSÍ de cada um dos extractos foi medido num ensaio de ELISA usando o anticorpo monoclonal Sl.1 com 1 ml de Sepharose Protein B 4 Fast Flow C adquirido à Pharmacia LKB? Brussels? Belgium) durante 2 horas a 4aC = A mistura foi então centrifugada? lavada com PBS e o sedimento ressuspsnso em 1 ml de PBS» 25ΘμΙ desta, suspensão foi adicionado a 3,4 ml de cada extracto celular bruto e a mistura incubada durante 1 hora a 20°C»
Após incubação a mistura, de Sepharose Protein G/Sl,1/proteína bruta foi centrifugada ε o sedimento ressuspsnso em tampão fosfato de sódio 10 mM= Metade deste material foi a.dsorvido a. hidróxido de alumínio a uma concentração final de 1 mg/rol»
Grupos de 5 ratinhos Balb/c foram injectados intraperi— tonealmente com as quatro preparações» Um mês mais tarde os ratinhos receberam uma injecção de memória intraperitoneal de 1 pg de partículas parcialmente purificadas adsorvidas a hidróxido de alumíníode uma cultura cultivada em metanol da estirpe 453» Ds ratinhos foram sangrados 15 dias mais tarde» Os títulos de anticorpos- anti-S? anti-preS2 e anti-preSl nos soros foram determinados coroo aqui descrito abaixo»
A fabela 6 mostra os induzidos em ivos títulos de anticorpos
Os resultados· mostram que os anticorpos anti-preS são induzidos em ratinhos quando injectados com sxtracto contende compostas (estirpe 4525 e administradí memór i a de oart íc u1as compostas C es t i ros com uma xnjeccão iaosis o hreparação qg de «-HBS antigénio SMT eis injectado mlU/ml
Ca) Cb) «-120-14(
SMT C c) «12-32 «-52—47
GMT C c) SMT C c )
Estirpe 454 r~-, 4____a.
c,XIr tííC tC bruto ?Ztft
612
i. íTí Ll Ft O p p t íSC-1 Q ias
ΕΓ-i O 2. X—’
Estirpe 452 Extracto bruto
Imunopptado
1Í9903
784 »
G
i.3.} Relativo ao antiqénio preSÍ-B2~S ds S» cerevisiae <b) Todos os ratinhos receberam uma injecção de memória no dia 30 ds partículas parcialmente purficadas da estirpe 453» (c) Os títulos estão expressos como o inverso da diluição que dá uma DO de ino ensaio»
-V-.V
Eé£ts_E
Exemplo E»1
Express-So de partículas compostas contendo os antigênios preSi-32-3 CL#) e S modificados de um subtipo simples ou misto.
<í> Construção de uma sequência codificadora de L# Cad>
Uma sequência codificadora de preSí-S2-S CL#) modificada adequada para a inserção directa no vector de expressão de Hansenula pF-IPT-12'ί (Figura 11.) foi construído como se segue» 0 DMA de plasmideo de pRlT13192 aqui descrito abaixo foi digerido com a endonuclease Hindlíl para se obter fragmentos lineares» Cerca de 1 ng deste DMA foi misturado com oligonucleotídeos BC74 e BC75 e sujeito a amplificação por reacção de cadeias com polimerass CPCR) =
A tecnologia PCR ê bem conhecida e está descrita em «PCR Protocole, A guids to roethods and applications»;; Innes Μ. A» st al. CEds») Academic Press Inc», San Diego CA» Í9S9.
Os oligonucleotídeos BC74 e BC75 têm as apresentadas abaixoe toam sintetizados por química de detos convencional»
BC74· 5:: CCC ASA TCT AAS CTT ATT AAA TGT ATA
BC75 5 3 CCC GAA TTC AAA ATS SGS ACG AAT CTT sequências fosforamiCCC A 33 TCT 35 oligonucleotídeo BC74 tem homologia com o extremo 35 da sequência codificadora L# em pRIT13192 juntamenis com uma. extensão dos sítios de restrição Hindlíl e Bgllí» 0
2S
C oligonucleotídeo BC75 tem homologia com o extremo 53 da sequência codificadora de L# em pR17i3192 juntamente com um sítio EcoRI e uma sequência líder pequena antes do codSo ATG como extensão» Cerca de 1 ng de DMA molde pRI713192 foi misturado com 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl^, 0,01% Cp/v5 de gelatina, dfiTP, dCTP, dSTP e dTTP 20 μΜ cada, iniciadores oligonucleotídeos í μΜ cada e 2,5 unidades de polimerase Taq num volume finalde 100 μΐ usando reagentes de amplificação de DNA comerciais CGne Amp DMA Amplification Reagent Kit da Perkin Elmer Cetuss adquirido ã Vandsr Heyden, Brussels)» A mistura foi sujeita a 25 ciclos de desnaturação Í2 min, 92’’) ? emparelhamento (2 min, 48~) e extensão (2 min, 72RoF) usando um DMA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus? adquirido à Vander Heyden, Brussels). Um ng do fragmento da sequência codificadora LS modificada e amplificada assim obtido foi então reamplifiçado numa segunda volta com os mesmos oligonucleotídeos nas mesmas condições e purificado da mistura de reacção por precipitação com etanol»
Uma amostra de aproximadamente 250 ng e DMA do fragmento L$ adaptado de 870 pb foi digerido com as endonucleases EcoRI e BqlII e clonado entre os sítios EcoRI e BglII de um plasmídeo derivado do pBR327, pRIT12555, para dar pRIT13488» pRIT12555 consiste no replicão do pBR327 com um sítio BglII introduzido por uma inserção de adaptadores entre os sítios EcoRI e Ciai do plasmídeo original»
Uma outra amostra do fragmento L® adaptado foi digerido com as endonucleases EcoRI e BglII e inserido entre os sítios EcoRI e BglII do plasmíe-o pMPT12i (Figura íl) Isto coloca & sequência codificadora L? entre o promotor MOX e o terminador MOX num plasmídeo de expressão adequado para a introdução em H» polymorpha por transiarmação» A sequenciaçãc do plasmídeo
resultante, pLS-li, mostrou a sequência da região codificadora de Lí estava correcta» (2) Construção de uma sequência codificadora ds S-Cay) pRIT3490 é UB derivado do plasmídeo pBR322 contendo uma sequência codificadora de preS2-S completa obtida por manipulações convencionais de DNA recombinante a partir do pRIT1060í que contem o genoma completo de um vírus da hepatite B do subtipo ay clonado em pBR322« pRITWóGÍ foi depositao na American Type Culture Collection, Rockville F’1D em 2 de Junho, 1982 como Número de Acesso ATCC 39132«
Será apreciado pelos familiarizados com a matéria que nas manipulações que se seguem descritas abaixa pRIT1349® poderá ser substituído por pRITÍ0601 ou qualquer outro fragmento de HBV clonado contendo urna sequência codificadora completa de S-(ay)» 0 DNA de pRIT1349® foi digerido com a endonuclea.se HindIIIpara linearizar o plasmídeo e misturado com o oligonucleotídeo BC74 descrito atrás e com o oligonucleotídeo BC73 que tem homologia com o extremo 5’ da sequência codificadora S no pRIT13490 juntamente com um sitio EcoRI e uma sequência líder antes do codão ATS como extensão»
BC73 5’ CCC GAA TTC AAA ATE BAC AAC ATC AC A TCA 3' ,
A mistura de pRIT13490 tratado com HindiΣΙ e oligonucleotídeos foi amplificada por 2 ciclos de PCR como descrito atrás para gerar um fragmento um framento de 700 pb da sequência codificadora de S-Cay) delimitada por sítios de restrição EcoRI e BglII» Cerca de 250 nq deste material foi digerido com as endonu— cleases EcoRI e Bglll e clonado entre os sítios EcoRI e BglII do
pRITi255o para dar pRIT13438» Verificou—se, por sequenciação, que a sequência codificadora de S-Cay) em pRIT13438 estava correcta» (3) Construção de uma sequência codificadora L# Cad/ay)
Cerca de í ng do fragmento amplificado por PCR usado para construir pRITí3488 foi ainda amplificado por mais 2 ciclos de amplificação por PCR na presença dos oligonucleotídeos BC75 (descrito atrás) e BC3© tendo a seguinte sequência,
BC3© 5 ACG AST CTA GAC TCT GCG GTA 35
BC3© é homóloqo da região à volta do sitio Sbal da
ÍB d£ c i eases
, cod i f icsdors de S derivada do c I ons pRITlOè
Kf i O:~5 ad „ Um fragmento de 28© pij foi Γ&
.çSo e cerca de 25© ng deste f o i diger ido com
EcoRI e Xbal»
•ado da endonu.Cerca de 1 ng do fragmento amplificado por PCR usado para construir pRlTÍ343S foi ainda amplificado por 2 ciclos de amplificação por PCR na presença dos oligonucleotídeos BC74 (descrito atrás) e BC1.2 tendo a seguinte sequências
BC1.2 55 ATG GAG AAC ATC ACA TCA 35
BC12 é homólogo dos 6 promeiros codões das sequências codificadoras S dos viriSes HB clonados em pRITÍÔó©! e pRITÍ®61ó» Após amplificação por PCR cerca de 25© ng do fragmento de 7©© ph foi digerido com as endonucleases Xbal e BqlII»
Os dois, fragmentos- amplificados- por PCR e digeridos com endonucleases foram então ligados a DMA de pRITí2555 digerido com EcoRI e Bqlll»
Um plasmídeo, pRíTí-3491, foi recuperado consistindo em pRIT12555 juntamente com um fragmento EcoRI-Xbal da amplificação porPCR do fragmento usado para construir pRlT13488 e o fragmento Xbal-BglII da amplificação por PCR do fragmento usado para construir pRIT13438. A sequenciação do DMA da inserção codificadora de L$ em pRlTÍ3491 mostrou a existência d-s um erro introduzido no 52 aminoácido da região codificadora de S= Para corrigir isto, ο fragmento amplificado por PCR usado para construir pRIT13488 atrás foi digerido com -as endonucleases EcoRi e Xbal e usado para substituir o correspondente fragmento EcoRI-Xbal em pRITl3491 que continha, o erro» 0 plasmídeo resultante pRITl-3489 especifica um sequência codificadora Lí «híbrida» em que a parte desde o codão de iniciação ATS até ao sítio Xbal deriva ds sequências do vírus subtipo ad e desde o sitio Xbal até ao codão de terminação deriva de da sequência do vírus subtipo ay. 0 correspondente polipeptideo terá o subtipo ay» fragmenta EcoRl-BglII do pRITÍ3489 contendo a sequência codificadora do híbrido Lí- <ad-sy> foi então inserido entre os sítios EcoRi e Bglll no plasmídeo pMPT-12í para dar o vector de expressão de H«......gQlvmqrgha pL$ 13»
C4> Expressão em H» polymorpha dos antigénios preSl~S2-S íL$) e S modificados para formar partículas compostas
Várias estirpes foram construídas que foram caracterizadas por -diferentes proporções de expressão de L* e S asssim como diferentes níveis de expressão total» Estas diferenças foram conseguidas por variação do numero de cópias da cassete de expressão por genoma»
H r. ρσ 1 y mo r p ha estirpe RBlu foi transformada como descrito atrás com. o plasmídeo pLSli portador da cassete de expressão Li <ad)= A transformação deu várias estirpes contendo números variáveis de cassetes de expressão integradas no genoma» Duas destas estirpes, designadas LÍ3/1 e LÍ9/1, foram analisadas mais dstalhadamente » A análise de transferência Southern revelou que estas estirpes contem várias cópias da cassete de expressão L* <ad>« 0 nível de expressão de Li Cad) destas estirpes foi testado por análise de transferências Western usando o anticorpo monoclonal HBS1« Foi detectada uma banda de 33KD correspondendo ao antigénio Li» Os níveis de xpressão foram calculados como sendo de 0,5-2% da proteína celular total quando as células foram cultivadas em meio com glicerol seguido da adição de metanol»
As estirpes expressando Li (ad) foram transformadas novamente com o plasmídeo pRB-S-322 portador do qene Síad) sob o controle do promotor MOX» pRB-S-322 está descrito atrás (ver Figura 7) = .A resistência à gentamicina foi usada como marca da transformação» Os integrantes estáveis foram obtidos empregando os métodos descritos atrás» Duas das estirpes obtidas foram estudadas mais detalhadamentes estirpe LMS9/1 e estirpe LMS26/2, ambas derivadas da estirpe recipiente LÍ3/1» A análise de transferência Southern revelou que estas estirpes são portadoras de várias cópias da cassete de expressão LiCad) assim como de várias cópias da cassete de expressão SCad)»
A expressão dos antigénios Li e S em transformantes de H» po1y morpha foi testada por transferência Western usando os anticorpos monoclonais KB31 e 31»! como descrito atrás-, Obteve-se um espectro de estirpes que e-xpre-ssam diferentes proporções do antigénio Li e 3, Os anticorpos HBS1 detestam uma proteína de 24 KD correspondendo ao antigénio S e bandas ds 30 e 33 KD correspondendo ao antigénio Li» Os -anticorpos Sí = 1 específicos dai região preSl revelam uma bsnde de 33KD assim como uma banda de 30 KD» As razões L$/S foram calculadas como sendo ds cerca de Ísi
para a estirpe LMS9/1 e cerca de ísl© para a estirpe LMS26/2» Os níveis de expressão foram calculados como sendo de aproximadamente 5-67 da proteína celular total quando as células foram cultivadas em condições de indução com metanol»
Os estudos de glicosilação mostraram que a proteína de 33 KD represena uma forma glicosilada do antigénio L-ϊ» Quando so extractos celulares brutos das estirpes LMS9/1 e LMS26/2 foram incubadas com a endoglicosidase H» a banda de 33 KD mudou para o peso molecular aparente de 30 KD» 30 KD é o peso molecular esperado do antigénio L't« Assim parte do antigénio LS produzido eat Hpo.1 ymorpha é glicosilado no «núcleo» enquanto o restante constitui a forma não glicosilada de Lí„
Para testar a formação de partículas o extracto celular bruto da estirpe L.MS9/1 foi sujeito a centrifugação em gradientes ds densidade de cloreto de césio» As fracções do gradiente foram analisadas por imunotransferência usando o anticorpo HBS1» Um pico ds material rsactivo HBsAg incluindo o antigénio S de 24 KD e as formas de antigénio L# de 30 e 33 KD foram observadas numa n densidade de 1,1# g/cm~» Este- resultado indica que as partículas compostas foram formadas em estirpes de Η» ρο1y morpha coexpressando os polipeptídeos L? e S»
Numa outra variação do invento uma estirpe ds H. polymorpha coexpressando as proteínas L? e S foi obtida por transformação da estirpe 415 descrita atrás» A estirpe 4Í5 é portadora de entre 5© e 10© cassetes de expressão SCadisob o controle do promotor MOX e é caracterizada por um nível de expressão elevado do antigénio S»
Construiu-se um vector de expressão L>K (ad? contendo um gene de resistência à canamicina» Um fragmento Nruí de 3,5 Kb codificador do gene de resistência á canamicina sob o controle do promotor AE>H1 e a sequência HARS foi isolado a partir do plassmideo pHK2 (Figura 65 = 0 plasmídeo pL#il foi digerido corn as endcnucleásss NruI e Sall e dotado de extremos csrsss por preenchimento com DMA—polimerass Klenow. A digestão com Nru/Sall eliminou a sequência HARS do vector pL$íí« 0 fragmento Nrul de pH‘<2 foi então ligado ao fragmento grande Mrui-Sall do vector pLÍIl introduzindo assim o gene de resisteência á canamicina e reintroduzindo a sequência HARS que tinha sido eliminada. 0 plasmídeo resultante foi designado pKLÍl ou pKL?10 dependendo da orientação da cassete do gene de resistência à canamicina. A estrutura de pKLSl está apresentada na Figura 12. Estes plasmídeos podem ser introduzidos em H» polymorpha ρο-r transformação e selecção por resistência à gentamicinacomo descrito atrás em Métodos.
A estirpe 415 foi transformada com pKLSÍ e pKL?10 portadores da cassete de expressão L#Csd5 e os transformantes estáveis foram obtidos após selecção para resistência, à gentami— cina. Várias estirpes foram ainda analisadas. A análise ds transferências Western usando anticorpo HBS1 mostrou que uma proteína de 24 !<D correspondendo ao antigénio S assim como bandas de 3® e 33 KD correspondendo às formas não çlicosilsda e glicosilada do antigénio LS respectivamente» Nestas estirpes derivadas de 415 a razão LS/S variou entre cerca de Isí na estirpe LMS05-14-1 e creca de ls20 na estirpe LMS05-12-1» Nas estirpes cultivadas em condições de indução total com metanol, os níveis de expressão de antigénio LS/S constituiu 5-6% da proteína celular total» Não foram observadas diferenças entre as estirpes transformadas com pKL^l e as estirpes transforsadas com pKLÃl©» (5) Co-expressão dos antigénios Lt s S conduzindo a partículas compostas com subtipo misto»
Rara se obter estirpes ds H, polymorpha que produzem partículas LS/S com um subtipo misto Cad5ayls H» polymorpha foi transformada com o plasmideo pLSló portador de um-a cassete de expressão L# Catí/ay)»
Os clones estáveis expressando o antigénio L$ podem ser obtidos e retransformados com o plasmideo pRB-S-322 portador da cassete de expressão Síad) com selecção para resisitência à qentamicina , As estirp-ss estáveis da segunda transformação foram analisadas por transferências Western e ensaio a AUSRIA para determinar os respectivos níveis de expressão dos antigènios Lt Cad/ay) e SCad) s o nível total da expressão de antigénio de superfície,
A sstirps 415 expressando a proteína Síad) podem s-er tarabêm retransf ormados com um derivado ds pL&13 portador de uma marca de resistência è gentamicina funcional para gerar transforsian tes estáveis expressando expressando os polipsptídeos L$ Cad/ay) e SCad) na forma de partículas compostas com as especificidades dos subtipos -atí s ay»
Exemplo......F,.í ítenstepSlP-do_tossídep.......Bglllgg/g............P.gdil.l^d.Qr^g_^ma__,„,proteína
Mas Figs» 13 e 14 está apresentado esquema da construção do plasmideo pRXT12979= A Figura 13 mostra os passos da construção de um plasmideo de E» colí portador de uma cassete de expressão de proteína L deltaSliíS, pRIT1299S, A Figura 14 ilustra o processo para a obtenção de um plasmideo de levedura pR!T12979 capaz de expressar uma proteína L deltaGliíS»
Deve-se entender que o resíduo Sli 13 é codificado pelo segundo codão da sequência codificadora da proteína L representada na Tabela A» material de partida para esta construção é o plasmídeo pRIT128635 um derivado do pBR327 que contem a região do promotor TDH3 e a região de terminação da transcrição ARG3 ECafaezon st al», Proc» Natl» Acad» Sei» USA, 81s6594-6598 <1984/3 separados por um adaptador BamHI, Smal, EcoRI» Um adaptador contendo um sitio BglIII está situado a montante das sequências do promotor TDH3» pBR327 está descrito em Soberon et al»» Bene, 9s287-305 <1980) e foi cedido por F« Bolívar (Department of Molecular Biology, National University of México)» Este plasmídeo pode ser recuperado como descrita no Pedido de Patente U»S = copendents SN 0®9,325»
A cassete de expressão parai a proteína L não miristoilada foi construída dentro da região do adaptador de pRITÍ2863=
Q plasmídeo pRITÍ28í-6, que é um plasmídeo ds E. coli derivado de pASl ERosenberg et al», Metbods Ensymol», 101 s125-164 (1983)3, é portador da região codidificarfora da proteína grande do HBV (serotipo adw) delimitado por um sítio Ncol <sobraponível com o codão ATS na posição 12 na sequência codificadora da proteína L) e por um sitio EcoRI para lá do codão de paragem» Este plasmídeo foi construído por técnicas de DMA recombinante convencionais Cver, T» Maniatis et al», referido atrás3» plasmídeo pRIT12SÍ6 foi digerido com BstXI e EcoRI e o fragmenta BstXI-EcoRI da 304 pb codificador da fraeção N-terminal da região preSÍ foi recuperado e ligado ao seguinte adaptador sintética BamHI-Bs tXIs
BamHI Xbal BstXI
SATCCCTCTAS ACS AAT CTT TCT STT CCC AAC C
GGAGATC TGG TTA TAA- AGA CAA GGG TT.
Este fragmento foi inserido em pRIT12863, préviamente digerido com as enzimas BamHI e EcoRI, resultando no plasmídeo pR!TÍ2996» 0 arfptador sintético BamHI-BstXI é portador da região preSí N-ierminal, mas não proporciona a grelha de leitura correcta com o sitio BamHI colocado no resíduo ATS do promotor TDH3» A grelha de leitura correcta é proporcionada por digestão de pRIT1299& com BamHI a Xbal? seguido de tratamento com enzima de «mung beanspara eliminar as extensões protuberantes e ligação» Este processo produz o plasmídeo pRIT12997»
Finalmente, o fragmento EcoRI ds 839 pb do pRITÍ2816 foi inserido no sitio EcoRI do pRITÍ2997 na orientação correcta para recuperar a sequência codificadora completa da proteína L deltaSli» 0 plasmídeoresultante pRIT12998 contem a cassete de expressão codificadora da proteína L que não possui 8IÍÍ3 s não pode servir de substrato à miristoil-transferase»
Para construir um plasmídeo de levedura capaz de expressar a proteína L deltaSLi, o plasmídeo pRIT12998 foi digerido com BglII e SalX» 0 fragmento Bglíl-Salí de 5822 pb que contem a cassete de expressão foi purificado e inserido num vector de levedura convencional pRIT12741 que é um derivada de pBR327 que fornece um gene AmpR, as sequências 2μ, o replicão de E. coli e a marca selectiva LEU2 de levedura» plasmídeo resultante pRIT12979 foi usado para transformar a estirpe de 5« cervisiae LEU- ÍÔS.^cir0 <oep4-3, ~ ώ|ήτ.
Ieu2™3» leu2—112), igualmente designada TCYí ou Y482, a qual está depositada na American Type Culture Collection» Rockville,
Maryland, U«S»A= com o número de acesso ATCu 20818« Após transformação, a estirpe LEU·*· resultante foi designada Y720»
Exemplo F = 2
Caracterização comparativa da proteína L deltaSli com a ....proteína
L
A estirpe de levedura Y720 do Exemplo F»í foi examinada quanto à expressão da proteína L deltaSli comparstivamente com a estirpe de levedura Y587 ÍTCY1 transformada por pRIT12845> que expressa a proteína L = pRIT12345 contem uma cassete de expressão de 3370 pb consistindo num DNA de HBV derivado da sequência codificadora dos 389 aminoácidos da proteína L delimitada em 5? pelo fragmento promotor TDH3 de 1050 pbe sob o seu controle e em 35 por um fragmento de 1150 pb portador do terminador da transcrição ARS3« pRIT12345 está descrito detalhadamente no Exemplo 16A do Pedido de Patente U«S. copendente SN €‘09,325= A estirpe de levedura Y1017, que é TCYl transformada com pRIT1274í, serviu c orno tes temun ha neg at. i va«
A= MiLiStgiiêção
Células de Y720, Y587 e YÍ017 foram marcadas com ácido '”'H~-mirístico como descrito no Pedido de Patente- U«S= copendente SN 0-09,325= Os extractos de SDS destas células foram analisados por electroforese em de SDS-poliacrilamida CSBS-PABE), seguido imunotransferência e fluorografia CVer, e»g«, Towler e Glassr, Proc = Natl» Acad. Sei., U.S.A., 83£2812-2816 (198611=
A imunotransferência como descrito no Pedido de Patente U=S, copendente SM ©09,325 envolveu a detecção com um anticorpo monoclonal (Mab) específico de S, o Mab RF6 CH= Thomas, Royal
L,J
Frea Hospital, Londonl ou o Mab HB81 CSmithKliiie Bxologicalss Estes anticorpos reconhecem epítopos sohreponíveis resistentes à desnaturação a â redução na proteína S« A irounotransferência mostrou a expressão de duas formas da proteína L de 38 KD e d© 45KD em Y72© s Y587.
fluorograma mostrou a presença da marca ’ H na proteína L. de 38 KD derivada de células Y587 como descrito no Pedido de Patente U»S = copendente SN 009,325» Quantidades pequenas da marca foram observadas na proteína L de 45 KD derivada deles» Pelo contrário, nem a proteína L deltaSli 38 Kd nem a 45 Kd derivadas de células Y720 incorporaram a marca, Isto demonstra que a eliminação do codão glicina em pRIT12979 elimina a miristoilação da oroteína L deltaGli em S. cerevisiae.
B» Nível de expressão
As células de Y720, Y587 e Y10Í.7 foram cultivadas em condições idênticas em YNB sem aminoácidos LDifco Lahs-3 -a 0,675% contendo glucose a 25 em frascos Erlenmsyer» As células totais rebentadas e os extractos brutos foram analisados por imunotransfsrência quantitativa como descrito no Pedido de Patente U = S» copendente SN 009,325=
Diluições seriadas de duas vezes das amostras foram analisadas e a imunodetecção baseou-se nos Nabs específicos RP6 ou HBSI ou num anticorpo monoclonal específico ds preSl , Sí.l Smithkline Biologicals!» As imunotransferências apresentam um nível de expressão2 a 5 vezes superior para proteína L deltaSli CY720) do que para a proteína L mírisfcoilada era Y5S7» A eficácia da extracção parece ser sensivelmente a mesma para as proteínas não miristoiladas e miristoiladas» A proporção de proteína L encontrada na forma glicosílada de 45 KD não foi alterada pela eliminação da miristoilação»
EL·........Estruturas......da......Lipo proteínas
Os extractos brutos de células Y720 e Y5S7 foram sujeitos- a centrifugação de equilíbrio em CsCl» As fracções do gradiente foram -analisadas por imunotransferência, ensaio AUSRÍA EAbbott Labs-3, um ensaio de ELISA específico de para um epítopo preSl usando o mab Sl»í, em que se usou o Mab Sí = í para revestir poços de placas de mirotitulação Elmmunoplate Is Sibco Europel e incubou-se com as amostras a testar» Após lavagem para remover material não ligado, a captura de partículas reactívas foi revelada por incubação com o Mab SI«í acoplado a peroxidase de rábano silvestre pelo método de Wilson e NaK-ane C1978) em «Immunofluorescence and Related Techniques», W» Knapp et al=, eds»
Elsevier, Amsterdam ÍÍ97S). 0 desenvolvimento de cor para revelar a ligação do segundo anticorpo foi com ortofen.ilenodíamina como cromogênio, A absorvância foi lida a 49© nm com 620 nm para o filtro de referência, num Intermed Immunoreadsr, NJ2000 CAnslis, Shen t, Be1g ium1 = perfil antigènica e a imunatransferência foram idênticos, A proteína L tísliaSli e -a proteína L tipo selvagem .5 posicionaram-se numa densidade de aproxi.madamente 1,25 g/cm , demonstrando que estão presentes proteínas miristoiladas e não miristoiladas como estruturas 1ipoproteicas em extractos celulares brutos» A centrifugação de velocidade em gradientes de sacarose do material purificado por gradientes ds equilíbrio em CsCl mostrou comportamento de sedimentação idêntico para a proteína L miristoilada e não miristoilada contendo estruturas 1ipoproteicas, indicando que estas estruturas 1ipoproteicas possuem parâmetros físicos comparáveis»
Construção de plasmídeos codificadores de uma proteína L do_HBV g^dificada......sem,,,.....os_potenciais_sítios......de..........Q-......__e_____W-ql,icosi la^ão^ potenciais......sítios,.,de.......lj^g,,go_.a_.)3HSA_e......potenciais_sítios, .sensíveis a prgtgases
Nas Figs» 15 e 16 está apresentado um esquema da construção de dois vectores de levedura; pRXT13192, codificador da expressão de uma proteína L modificada miristoilada CL*) e pRXTÍ3193, codificador da expressão de uma proteína L modificada não miristoilada ÍdeltaGli L&>« pRIT10616, depositado como ATCC39Í3Í, foi digerido com BglII e o fragmento maior ligado ao replicão pACYC 177 CChang e
141
Cohen, 3» Bacteriol», 154s1141 (1978)3, préviamente digerido por BamHI . 0 plasmídeo intermediário obtido foi digerido com EcoRI e religado para se obter príITi0633, o qual ê portador do genomma HBV a partir do qual o vector pACYG 184 foi excitado» plasmídeo pRIT1233í é um derivado de pl)C9 EAmersham, LLK» e Pharmacia, SwedenJ contendo o fragmento promotor ARG3 HindiΣϊ-Ncol de Í500pb do pRITl®779 CCabeson et al ficad» Sei. iJ.S-.A.» 81x6594-6598 (1984)3 fundido na orientação v_y
abe ízon e t al , ΗΓ
) 3 TΙΑΠ- X _í uu i
ús 681 pfa que
io Ncol so br eoon
correcta com um fragmento Ncol—EcoRI de 68 sequências codificadoras de 8 com o sít cotíão ATG e o sítio EcoRI para lá do codão ds paragem e adjacente a ele, inserido entre us sítius pUC9« estrição HindIII pRIT10633 foi diger com as enzimas ;fc 11 e X ba 1 fragmento Bstfc.II-XbaI de 648 pb, em que a extensão BstEII preenchida por polimerase Klenow, contendo toda a sequêncií foi
UOl região PreSl—PreS2 e as sequências N—terminais da região S foi purificada e inserida entre os sítios Smal e Xbal do pUCÍ2 CAmershaml» 0 plasmídeo resultante é pRITÍ3í88= plasmídeo pRIT13188 foi tratado com Bali e BamHI, que eliminou a região preSl codificadora dos aminoácidos que se estendem entre os resíduos 52 e 133 Eos codSes dos aminoácidos 53 e 132 foram incluídos na deleçãol» 0 fragmento grande foi tratado com polimerase Klenow e ligado, resultando no plasmídeo pRITÍ3189 em que o sítio BamHI foi restaurado.
os resíduos 145 s í/o Cos codSes dos aminoácidos 146—1743 foram eliminados por digestão do pR.ITÍ3189 com BamHI s Xbal» Este vector foi liqado ao sequinte adaptador sintéticos
Extensão Ham Hl extensão Ncol
GATCCCAGAGTCABGGGTCTSTATTTTCCTGCTGGTGG
GGTCTCAGTCCCCAGACATÃAAAGQACGACCACCGTAC
A s pP r o A r g V a 1A r g G1 i L euT i r F en P r o A1 aG 1 i 61 i 135 145 e aa fragmento Ncol-Xbal de pRIT12331 contendo a fracção N-terminal do qene 3= 0 plasmídeo resultante é pRIT13190»
A região C-terminal do gene S5 a região ds terminação da transcrição ARG3 e o gene LEU2 de levedura foram adicionados por inserção do fragmento Xbal-Sall de 4145 pbdo pRITÍ2óó® entre os sítios Xbal e Sall do pRITl-319®» CpRíT12660 contem uma cassete de expressão ds 3@5® pb consistindo numa sequência de DMA codificadora derivada de HBV para os 281 aminoâcidos da proteína M delimitada em 55 por um fragmento promotor TDH de Í€i5© pb e sob o seu controle e em 33 por um fragmento de de 115® pb portador do terminador da transcrição ARS3 = pRIT12óó® está descrito detalha— damente no Pedido de Patente U=S» copendente SN 0©9?3253, Obteve—se o plasmídeo resultante pRIT13191=
Para reconstituir as cassetes de expressão para as proteínas L.® e deltaGlí LS? o promotor TDH^. associado à região codificadora N-terminal de uma proteína L ou à região N-terminal tíe uma proteína deltaGlí L foi inserido effs pRITÍ319í= fragmento de EcoRI-BalI de 1234 pares de bases foi purificado a partir de pRIT12845s contendo a sequência codificadora da proteína L descrita atrás e em Li, 3 = SN ©09,325 e o fragmento BglII—B-alI de 1227 pb foi purificado a partir de
pRJ.Tl'2V79 contendo -a sequência codificadora da proteína L deltaSli como descrito atrás»
Cada um dos fragmentos foi misturado com o fragmento grande SacI-BamHI do pRIT13191 seguido de tratamento com polimerase de T4 e ligação» Os plasmídeos resultantes foram designados pRXT13220 e pRXT13222» A sequência codificadora contida na cassete de expressão presente em pRIT13220 contem os resíduos de aminoácidos 12 a 52 da sequência preSÍ, 133 & 145 da sequência preS2 e toda a sequência S conforme indicado na Tabela A» pRIT13222 é idêntico a pRIT1322® com excepção da deleção do codSo 81x13 (888)» □ último passo foi a preparação de pR.tT1322® e pR!T13222 do fragmento Clal-Clal contendo cada uma das cassetes ds expressão para as proteínas L# e deltaSli LÃ respectivamente e ligação delas ao fragmento Clal-Clal do plasmídeo pRXT12S45, dando origem aos plasmídeos pRITÍ3Í92 e pRITÍ3193, respectivamente»
Estes últimos plasmídeos foram usados para transformar S„ cerevisiae estirpe TCYÍ, para dar as estirpes LEU+ Y1139 e Y114Ô, respectivamente»
Exgmglp F.4
Expressão de L* e deltaSli LÃ.....sis levedura
Os extractos brutos de levedura derivados de Y587 CproteínaL), Y1139 e Y1140 CLà e deltaSli Là respectivamente) do Exemplo F=3 e Y724 (estirpe testemunha ds 3» cerevisiae, sem cassete de expressão inserida) foram sujeitos a SDS-PAGE e detscção por imunotransferência com o Mab HBsl ou o Mab Sí»1 específicos de S» Os extractos Y1Í39 e YÍÍ4® mostraram duas bandas de peso molecular calculada de aproximadamente 33 e 3® KD que foram especificamente reconhecidas por ambos os anticorpos específicos'de preSl a S» tratamento dos extractos com endoglicosidase H CNew England Nuclear ou Boehríngerl resultou no desaparecimento da banda de 33 KD. isto indica que a banda de 33Kd representa uma forma gíícosilada das proteínas u? e deltaGli L# do Exemplo F.3 portadora de uma manose elevada ligada em N do tipo glicano.
A marcação flas culturas celulares com ácido H miristico seguido de analise dos extractos celulares por BDS—FASE, transferência de proteínas e fluorografia ou imunodetecçã, mostrou uma presença forts da marca ~Ή na banda de? 3@ KD e uma incorporação fraca da marca H em 33 KD derivada do extracto de 3
Y1Í39» U H presente nestas bandas era resistente ao tratamento com hidroxilamina» Não foi observada incorporação da marca. ~H nas bandas de proteína correspondentes derivadas do extracto de Y1Í40» Isto mostra que a proteína L# tal como ê expressa nas células de Y1139 serve como substrato à N-miristoil-tranferase de levedura e que s. deleção do resíduo Glií3 na proteína deltaGli L# de Y1Í40 evita a miristoilaçso da proteína.
A análise dos extractos de YÍ189 e de Y1140 por centrifugação de equilíbrio em gradientes de cloreto de césio e de velocidade em gradientes de sacaroseindicou a presença de partículas lipoproteicas nos extractos.
Exemplo F.5
Estirpes de Levedura Y1088 e.....Yí2g5._ContendçL.,lnt^radas_Çág.Ías__de uma Cassete de Expressão da Proteína S
Construiram-se estirpes de leveduraportadoras de varias cópias de uma cassete de expressão S integradas no genoma»
A» í MÍX^^^„Jsyadura _X1088 □ vector linear pRIT13133-L baseado em Ty descrito no Pedido de Patente U = S» copendente SN 368,401 contenda unia cassete de expressão para a proteína SC promotor TDH3 - sequência codificadora da proteína S - refião de terminação de ARS3) foi usado para transformar ambos os tipos conjugantes de S« cerevisiae estirpe lOSóPd (ura3, 1eu2» trpl, qal15 cirG> descrita no Pedido de Patente LLS» copendente SN 368,401= Diferentes transformantes haplóides portadores ds várias cópias do vector integradas nos seus genomas foram cruzados com as estirpes haplóides do tipo conjugante oposto» Análises de transferências Southern de DNA genómico isolado a partir dos segregantes usando uma sonda fragmento do DNA de S5 mostra segregações de 2/2de fragmentos, do vector em análise de tétradas» Um segregante haplóide assim obtido, que continha 5-7 cópias do vector pRITÍ3133-L= foi designado Y‘?57= Um rever tente TRP+ ds Y957 foi obtido e designado YÍ088»
8» Estirpe de levedura Y129o vector linear pR!TÍ3034—L baseado em Ty descrito no Pedido de Patente U,S. copendente SN 368,401 é portador de uma cassete de expressão da proteína 5 idêntica ã do pRIT13133-L_. pRIT13034-L é portadora do gene CUP1 como marca adicional que pode ser usada em estirpes recipientes CUP1ou cupldelta,
Duas estirpes haplóides de S. cerevisiae cupldelta (gene CUPí destruído numa estirpe contenda uma única cópia daquele gene) são preferidas- como estirpes de levedura, recipientes para este vector linear Ty, Estas estirpes têm os respectivos genomass E-3 cupldelta3d Cura 3, leu 2, trp 1, gal Idelta, cup Idelta, a) e Eu cup ldelta7b Cura 3, trp 1, gal Idelta, cup Idelta, «) e estão descritos no Pedido de Patente U»S» copendente SN 368,401. '
O vector linear pRIT13®34~L baseado sa Ty contendo uma cassete ds expressão para a proteína Sfoi usadopara transformar S, cerevisiae estirpes Ed cupldelta 3d assim como Ε-J cupldelta 7b« Os transformsant.es URA3 foram isolados s despistados quanto á resistência è. toxicidade pelo cobre» Os transformantes- mais resistentes pareceram conterem 2 a 5 cópias de vectores integrados» Cruzamentos de genética clássica entre estas estirpes e selecção de um segregante haplóide TRP resultou numa estirpe haplóide contendo 4 a 5 cópias da cassete de expressão. Um rever tente TRP+· desta estirpe foi designado Y1295»
Construção de estirpes de levedura que co-expressam os antigénios
§......e......L
Os plasmídeos da levedura pRIT12845 (proteína L) pRIT12979 (proteína deltaGli L, Exemplo F=i>, pRIT13192 (proteína L$, Exemplo F,3), pRITÍ3193 (proteína deltaGli L#, Exemplo F»3> e pRIT12914 (sem gene da hepatite inserido) foram usados para transformar a estirpe de levedura YÍ088 para LELH-» As estirpes de levedura resultantes obtidas foram designadas Y1301 (S»L), YÍ3©2
CS,deltaSli L), YÍ142 CS, L«), ¥1261 CS, deltaGli L«) e YÍ141 (estirpe testemunha expressando apenas a proteína B) respectivamen te»
De modo semelhante, pRU 12845, pRIT12979, pRIT13192, pRiTí3í93 e pRITÍ2377 (sem genes da hepatite inseridos) foram introduzidos na estirpe- de levedura ¥1295= As estirpes de levedura resultantes obtidas foram designadas Y1304 <S?L), Y1305 CS,deltaBli L), Y13D6 (8, L«>, Y1307 (8, deltaGli L«> e Y13®8 (estirpe testemunha expressando apenas a proteína S) respeotivamente,
A co-sxpressSo das proteínas S e L foi demonstrada por análise de ímunotransíerências de extractos celulares brutos» A reacção dai transferência com o Mab HBS1 especifico para um epítopo S revelou uma banda de peso molecular aproximado 23 KD migrando na posição esperada para a proteína S em cada um dos extractos das estirpes atrás referidas»
Os extractos de Y1301, Υ13Θ2, ¥1304 e Y1305 mostraram ainda para além da banda 23 Kd, bandas de 38 Kd e 45 Kd migrando como as formas não glicosiladas e glicosiladas das proteínas L anteriormente descritas em Pedido de Patente U=S, SM009,325 e aqui no Exemplo F»2» 0 tratamento dos extractos com endoglicosidase H resultou na conversão da banda de 45 Kd numa banda de 41 Kd enquanto que as bandas ds 23 Kd e 38Kd não foram afectadas»
□s extractos de ¥1142, YÍ26Í, Y1360 e Y13Ô7 mostraram além da banda ds ds 23 Kd, bandas de 3€? Kd e de 33Kd migrando como as formas- não glicosilada e glicosilada das proteínas L$ e deltaSli LS descritas no Exemplo F»4» O tratamento dos extractos com endoglicosidass H resultou na conversão da banda de 33 Kd numa banda ds 30 Kd o que ê idêntico aos resultados descritos no Exemplo F»4 =
A marcação das células com ácido H mirístico e análise dos extractos por SDS-PABE seguido de imunotransferência e fluorografia demonstrou a presença de marca JH resistente ao tratamento com hidroxilamina nas bandas ds 38 Kd (extractos derivados de Y13@l e Y1304) e de 30 Kd (extractos de Y1142 e
- __ Yí-506) com apenas quantidades pequenas da marca H nas bandas ds proteína 45 Kd Cextractosde Y1301 e YÍ304) e 33 Kd (extractos ds Y1142 e Y130Ó), As bandas correspondentes em sxtractos de ¥1302 e, Y1305,YÍ26Í e Y1307 não continham marca “Ή detectãvel»
As formas de 38 Kd s 45 Kd das proteínas L s Bli L são reconhecidas em imunotransferencias pelos Mafos 81=í s MAi8/7 específicos ds prsSÍ lW»H» Berlich, Univsrsity of Sottingen, FRG1, pelos Mabs 82=4, 82,5, S2.7, 82=8, 82,9 e 82,10 específicos de preS2 ESmithkline Biologicalsl.. As formas ds 30 Kd s 33 Kd das proteínas L# e deltaSli L‘í são reconhecidas pelo Mafa Si,l (reconhecendo um epítopo presente na sequência de aminoácidos 12-32), MAÍ8/7 (reconhecendo um epítopo presente na sequência de aminoâcidos 133-Í451» Monoclonal ΙΊΑ Í8/7 está descrito como inibindo a ligação dos viriões às membranas das células do fígado EPontisso P„ st al», VirologY, 173¾522-530 (1989)3, As formas ds 30 Kd s 33 Kd das proteínas L_$ e deltaSli L* não são reconhecidas pelos Mabs 82,4, 82,8, 82,9 que não reagem com o peptídso 120-145 num ensaio de ELISA nem pelos .Mabs 82,7 e 82,10 que presumivelmente reconhecem um epítopo localizado nos aminoácidos 120-137» 0 monoclonal
F35-25 (obtido do l-tofi Fetit, INSERM unidade l3l., Claroart, Fran-ee) partir da estirpe Y1307 coso liga—se a parriculas punticscas a H se mostrou por um ensaio de ELISA aiss não se liga Este monoclonal reconhece uma equência peptxdica al., Molec. Immunol., 26s531 -5571989) que se envolvida na liqação do vírus a células de
-a partículas a. C Pe t i t Μ—A e t mostrou estar hepatoma HepB2 (Neurath et ai., Cell 46s429-436, 1986)., Ainda encontrou-se que
as oa r t ícu1as (S,L i/ se ligam a células de hepa toma
ligação e a ligação de partícula ts do vírus HB pode
pe 1 o Rionc 1 ona 1 F35»1 5 (Petit Μ—A S L o. 1 l T Π ζζ Í. Π tl 1
on Virai Hepatitis and Liver Η Q Ή *C í ~ 5. C t
» yymposiUMi lt)O«Houston 5
U=S»A=, April 4-8, 1990)» 0 Mab Q19/10 EW»H= Berlich» University of Gottingen, FRS3 que □nhece um epítopo preS2 dependente de qlicosilação CHeerman et al» em «Virai Hepatitis and Liver Dissass^, bds. A. iuckerman e Alan R. Lxss, Inc. NeW vork ρμ.ανζ— ”700, (1988)3 e reage com a forma de 45 Kd das proteínas L e *31 i L, não reage coo as formas de 30 ou 33 Kd das proteínas Li ou DELTABli Li» Estes resultados estão de acordo cosi as deleçSes de aminoácidos introduzidas nas proteínas Li e DELTAGli Li.
Ehemplo F»7 ;o-expressão ae protexnas S ou L modificada conduz à formação de parciculas de composição íiíxsca em aminoácioos
Os extractos feitos a partir da Exemplo F.ó contem antigenicidade relac demonstrado por resultados positivos no de acordo com as instruções do fahric sxtrac uB YÍ3^1 ·?
$$ ionada com HBsAq como ensaio AUSRIA efectuado ante CAbbott Lab.3» Os
1..W4.
yt&Zi r
Y130/ mas não os derivados de VI positiva no ensaio de ELISA com Sí » gação de equilíbrio em CsCl o mater
14-1
j.
VI308 dão uma reacção
Quando sujeito a cen 1 positivo em AUSRIA e rifuELISft comSl.í o material positivo co-sedimente a volta de uma densidaos — de 1,2 g/cm'» As imunotransferências confirmaram os perfis de antigenicidade mostrando que as espécies proteicas encontradas nos extractos brutos co-sedimentam no pico positivo em AUSRIA e ELISA com SÍ.Í» A centrifugação de velocidade em gradientes de sacarose das fracçSes do pico dialisadss derivadas dos gradientes de equilíbrio em CsCL mostraram co—sedimentação das proteínas S eL ou das proteínas L modificadas conforme determinado por AUSRIA, ELISA-Sí»! e imunotransferência» Isto demonstra que as proteínas S e L e L modificada são montadas em partículas lipoproteicas »
As reacçoes de imunoprecipitação com o Mab Si.l foram usadas para demonstrar que as proteínas S e L ou L modificada estavam associadas numa entidade física i.e. partículas de composição mista em subunidades» Fizeram-se extractos a partir de estirpes de levedura expressando as proteínas S e L ou 1 modificada, sózínhas ou em conjunto, por exemplo, de ¥1139 (proteína L$, Exemplo F„3), YÍ141 (proteína S, Exemplo í»6) e yli42 (proteína S e Líç Exemplo F=ó). Após semi-purificação das partículas por sedimentação em CsCl e diálise das fracçSes do pico, as partículas foram sujeitas à reacção de imunoprecipitação com o Mab SÍ.Í. Uma mistura de partículas derivadas de Y1139 e Y114Í foi usado como uma testemunha adicional» A proteína La foi imunoprecipitada para todos os casos» A coprecipitação da proteína S com a proteína Lft foi observada apenas na reacção com partículas derivadas de Y1142»
Resultados idênticos foram obtidos com as outras estirpes de levedura que co-expressam as proteínas S e L ou L modificada (¥1301, YÍ302, Y1261, Y13Ô4, ¥1305, ¥1306, Y1307).
Exemplo .F» 8
Estabilidade e ligação a.pHSA de ...partículas contendo.....a...aroteína_L modifiçada
A sensibilidade a degradação proteolítica por proteases de levedura das proteínas L® e deltaGli LS foi analisada por incubação dos extractos celulares brutos de Y1142 e Y116Í durante 4 horas a 37aC ou 65 horas a 4°C»
Os extractos de Υ13Θ1 e Y1302 serviram como fonte comparativa de proteína L e deltaGli L« A análise dos extractos por imunotransferência antes a depois da incubação apresentaram um desaparecimento quase completo das proteínas L e deltaGli L após incubação enquanto as proteínas L$ e deltaGli L.® eram ainda f ác i1men te de tec táveis„
As preparações purificadas de partículas das estirpes Υ13Θ6 e YÍ307 foram incubadas durante 7 dias a 37°C e examinadas por SDS-PAGE e coloração com prata para revelar os polipeptídeos» Não se pode observar degradação detectável dos polipeptídeos L® ou S«
As partículas derivadas de YÍ142 por sedimentação em CsCl foram testadas por uma modificação do ensaio de ligação a pHSA descrito por Pontisso et al» J» virol» Methods ós 151-3.59 (1983). Microplacas (Immunoplate Nunc, Gibco Europe) foram revestidas com albumina do soro humano polimerizada com glutaraldeído <5 pg/ml de pHSA em PBS. 2 horas a 37°C) e os sítios de ligação inespecífica a proteína nas placas foram saturados por incubação (1 hr a 37°C) com PBS contendo 13 de albumina do soro bovina (BSA). Diluições seriadas das amostras a testarem PBS contendo ©,2% ds BSA intersctuaraiB com as placas revestidas com pHSA s as partículas ligadas foram detectadas <1 hr a 37°C) com uma concentração não limitante do anticorpo monoclonal antí-S acoplada a peroxidase de rábano silvestre (RF1, H = C» Thomas, Royal Free hospital, London) em PBS contendo ©»2% de BSA e reveladas com e ortofenilenodiamina como substrato» Entre as incubações as placas foram lavadas com @,15 M NaCl contendo ©,©5% de Ttrseen '2©»
As partículas derivadas de YÍ14Í serviram como testemunha negativas as partículas purificadas da estirpe 10S44C cirJ contendo pRITi266© como testmunha positiva» A ligação a pHSA foi grandemente diminuída nas partículas derivadas de ¥1142 (2% de actividade residual) comparado com as partículas derivadas de 10S44C cir!-í portadoras de pRITi266®»
A ligação a pHSA também não foi detectável com preparações de partículas purificadas das estirpes YÍ3©6 e Y13©7»
Exemplo F.9
IayílSSeD.i.E;.igade.....d.e_.5ãr t ícu 1 as_ç on tendo.....a.......proteína......L%
A imunogenicidade das partículas <3, L®) deste inventa foi estudada em ratinhos Balb/c» As partículas derivadas de Y1142 í3, L$) ou YÍ141 CS) foram pareiaIsente purificadas por sedimentação em CsCl e adsorvidas a Al(OH)·^» Brupos de oito ratinhos foram injectados com 5© ou 5 pg de proteína total (correspondendo a 1 ou ©,í p.g de antigénio por ensaio AUSRIA) de cada preparação de antigénio nos dias © e 3®» Colheu-se sangue dos ratinhos no dia 45 e os diferentes ensaios efectuados em soros individuais» foram medidos com o kit AusAb (Abbott, íiiUI/ffil usando a fórmula de Hollinger
Ds anticorpos anti-HBs USA) a expressos em *
*
CHollinger et al», em «Virai Hepatitis» Szumnsss et al. Franklin Institute Press» Philadelphia pp» 451-466 <1982)3.
Os anticorpos anti—preb Furam medidas usando um snssio de ELISA directo em que peptídeos sintéticos seleccionados (peptídeo 12-32, peptídeo 32-47 e peptídeo 120-145) foram adsorvidos ãs paredes de polistireno da microplaca (Immunoplate I, Mune, Gibco turope). A adsorção deu-se durante a noite a 4”C com pg/ml- de peptídeo em tampão 0,05 M Lficos nas
U.íllat 5u 1 LiÇ tíO
Ns^CO-,/NsHCCU pH9,6, 100 p.l por poço. Os sítios inespec placas foram bloqueados por incubação bovino a 5% em PSS durante 1 hora a 37“C, om
250u 1 soro fetal
Diluições seriadas de duas vezes dos soros de ratinhos em PBS contendo '1% de soro fetal bovino, 0,05% de Tween 2€5 reagiram complacas revestidas com com peptídeo durante 2 horas z
-,...,0.-, , , , , , . . .
oz i.r 100 μχ pot ptjçu.- . Apos lavagem, □& an Lii-urpub xx^aPus ;Dr -—.r etectados por um soro biotinilado de carneiro anti—lo de ratinho (Amersham, diluido 500 vezes em PBS contendo 1% >, 100 μΐ por poço, incubação durante 1 depois- com um complexo de estrsptavidina—peroxida— biotinilada (Amersham, 10@0 vezes diluida soro fetal bovino e 0,05% de Tween 20) bovino, 0,00% de Iween hora a 37“C> s-e de râo-ano sxlvescre em PBS contendo 1% de durante i hora a 3/uC, 100μ1 por poço»
Entre as incubações, as placa;
NaCl, 0,05% de Tween 2Θ» A revelação final foi com e ortofe—
Z ui nilenodiamina como cromoqénio <15 μΐ de H-Q e 4 mq de ortofenil— enodiamina em 10 ml de tampão de fosfato de potássio , pH6,0,
00pi por poço?» r reacção Toi μ<Αϊ -=íca apos :00Ul 25 μ 1 iiiiu peide ÍN f-UiSO^e lida a absorvãncia a 490 nm num idição de
Infcermed
Immunoreader, MJ 2000, Analis» D título para cada soro
induzidos
A Tabela 7 mostra os respectivos títulos em ratinhos Balb/c expressos em Título d
3e anticorpos Média Seoméϊ;ΓΧ<Σ·Η «
-r . J · b,
Particu1as Ite -J *X7 «-HBS «120-145 «12-32 -z “7 . zí
derivadas SiíT em T—-5-.-ÍT· -Λ- Oi’£ 5 -t- GMT® GMTS
mUI/rnl
Y11 2 50 0 -4- 0 0 0 5222 A. ‘
ÍS, uo =· 2-3 4 0 0 0 212 í 49®
λ/ ·;·?*? 2 i i ‘Ύ 1 128000 202 21Í <200
CS) 29βββ <* 200 2β·5 <200
Cl) Ds títulos foram expressos como o inverso da diluição que dá uma DO de 1,0»
Partículas purificadas da estirpe YÍ-5©/ Cs? deltaSIi da estirpe RIT4376 CPetre J» et al»s Postgrad» Med« J» 63·, 1 1 i ~í i »í i »-.m v.·. í-i i v ..i. i-ι ™* çft :.-.= -- f / «y =— n
L_f i ou
CSupl»2), 73-81 (19875 3 foram adsorvidas a AICOH)em grupos de ίβ ratinhos Balb/c nos dias O e 3® foram sangrados nc= dia 45 imune reunião tox ratinhas xaminado quanto à presença de anticorpos anti-S e anti-preS como descrito atrás» A Tabela 8 mostra os respectivos títulos de anticorpos induzidos em ratinhos Balb/c»
i rir
Psrhí cu 1-3.S Dos© €í“HB3 purificadas a partir ds pg
V1307 (S,delta61i L«)
RIT4376
100 ão;
(?) Qs títulos são expressos como o inverso ds diluição que dá uma DO de 1,0 no ensaio» ixemplo F»Í0 nteqração ds uma cassete
Ufc?
cienoíOct csrevisiae oor recombinaçao homóloga mediada por iyí é desejável integrar as cassetes de expressão da proteína Lf e S deste invento no genoma do hospedeiro para proporcinar estirpes genéticamente estáveis e para evitar os 20~3®% de células sem plasmídeo geralmente encontrado com vectores de S» cerevisiae baseados em 2 micron»
Os plasmídeos ρΚΪ 11-3459 e ρκΐΤΙ-3460 foram construídos como descrito para o vector pRIT13009-p no Pedido de patente LkS» copendente SN009,32b e soí Jacobs et al», (bens 80- = 279-291,1989) » O gene LEU2, isolado como uis fragmento Xho—Sall de 2200pb a partir do vector pCV9 Cpetes et al», Cell 198765, 1980), foi inserido entre os sítios Bali do elemento Tyí em pRIT12927, substituindo o fragmento original, para dar pR!T13144» Um fragmento HindiII-Kpnl de 3050 pb portador da cassete de expressão do pRIT13220 descrita no Exemplo F«3 foi tratado coo polimerase de T4 e ligado ao sitio Bali restante tratado com polimerase de T4 em pRITl.3144 e usando E. coli estirpe XLl-Blue como recipiente da transformação» XLl-Blue está descrita por Hanahan D» em 3« Mol. Biol», 166g557-580 (1983) e está comercialmente disponível na Btratagene, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, Califórnia» Foram obtidas ambas as orientações da inserção do fragmento cassete Hindi I I-Kpnl f pRIT13459 contem a cassete da região determinador AR83 proximal relativamente ao gene LEU2, pRITÍ.346€?~ contem a cassete do promotor TDH3 proximal relativamente ao gene LEU2»
Os- fragmentos grandes Xhol de- aproximadamsnte 7700 pb de pRITí3459 e ds pRíT1346€? foram purificados de géis de 12 de agarose e usados para trans-formar a estirpe Eu cupídelta3d (ver o Exempla F»5 atrás) quanto á independência de leucina pelo método de Hinnen st al = , CProc» Natl= ftcad» Sei» USA, 75sí929» 1978)»
Os transformantes LEU* foram obtidos com ambos os fragmento e 12 colónias de cada série foram analisadas por transferência Western quanto a expressão da proteína L# e por transferência Southern quanto ao número de cassetes integradas» A partir da transformação de EJ cupldelta3d com o fragmento derivado de pRIT13459 reteve—se uma estirpe Y1528 mostrou um nível de expressão equivalente a Y1306 e continha 3-5 cópias da cassete» Da transformação de E-3 cupídelta-3d com o fragmento derivado de pRITÍ3460 reteve-se uma estirpe com propriedades semelhantes a Y1528, ¥1528 e Y1529 foram conjugadas com estirpes Y1295 e a sua estirpe parental trp YÍ215 íver Exemplo F»5 atrás) e com a estirpe Y1367 para formar diplóides como se segues ¥1528 x Y1295 = ¥1586, VÍ528 x 1215 = ¥1587, ¥1528 x Y 1.367 =¥1588, ¥1529 x ¥1295 = Y1599, ¥1529 x Y12Í5 =¥1590, Y1529 x ¥1367 = ¥1591« A estirpe Y1367 é u, le-u2, trpi, contem 6-8 cópias- da mesma cassete de proteína S como a estirpe Y1295 e foi obtida usando as estirpes e métodos descritos na construção de ¥1295 no Exemplo F=5«
As estirpes diplóides referidas atrás foram despistadas quanto ao seu nível de expressão do antigénio de superfície e â proporção de polipsptídeos L# e 3 nas partículas por transferência Western, ensaio AUSRIA e testes de ELISA específicos de epítopos usando os reagentes e métodos descritos atrás, mais particularmente nos Exemplos F=2 e F=6 = 0 número e estabilidade tías cassetes de exprssão integradas foi determinado por transferência Southern, Caso se pretenda as estirpes diplóides podem ser esporuladas para se obter segregsntes haplóides que possam então ser despistados quanto à expressão e estabilidade genética como descrito atrás,
A inserção do fragmento HindiII-Kpnl do pRITÍ3222 em pRI713144 seguindo ο-s processos atrás descritos pode ser efectuado para dar estirpes ds 5» cerevisíae com cópias integradas da cassete de expressão deltaSli L® e estirpes expressando partículas 8, deltaSli L$.
Numa outra realização a cassete de expressão Lt è inserida num vector semelhante ao pRIT13134-P CJacohs et al», Eene 80 g 279-291 <1989)3 e que é portador dos genes URA3 e CIJP1 como marcas sslectivas inseridas- dentro do elemento TY1 do pRíT12927» Tal vector foi identificado como pRITÍ35®l a partir do qual um fragmento BglII de aproximadamente 650® pb com os elementos- acima pode ser recuperado para transformação e integração num hospedeiro levedura adequado par-a selecção de transformantes URA*. Após transformação o número de cassetes integradas pode ser com vantagem aumentado por selecçãode níveis- aumentadas de resistência ao cobre como descrito no Pedido de Patente U.S» copendente SN 07/368,4®i»
Exemplo F-11
Expressão de partículas mistas S»LÃ com determinantes do subtipos gd.....e.....ay
Construiu-se um vector integrativo com uma cassete de expressão para uma proteína LÃ do subtipo ay por troca do fragmento XbaJ-SacII codificador da parte C-terminal de uma proteína S subtipo ad e parte de um terminador da transcrição ARG comum fragmento correspondente derivado ds um gene S do subtipo ay.· G plasmídeo pRIT13459 (Exemplo F»10) foi digerido com as entíonuclsases XbaJ. e SacII so fragmento maior foi purificado a partir de um gel de 1% de ag-arose e ligado ao fragmento Xbal-SacII de 1©0© pb do pRITÍ078© para dar pRIT135©0» pRITÍ078® está descrito em De Wilde et al», Develop» Biol» Standard, 59.5 99-107, (1985)»
A sequência codificadora de LÃ em pRITí3500 consiste em sequências de DNA idênticas às de um vírus de especificidade ad desde o codão ATS até ao sítio Xbal e de DNA derivado de um vírus de especificdade ayw desde o sítio Xfoaí até ao codão de terminação» 0 polipeptídeo LÃ expresso terá determinantes do subtipo ay»
G fragsíien Lo XhuI de de //0(5 pb der X V *3.0 U
oRIT135€*0 pode ser integrado no ζΤ Ç? C3 i!: =3 de levedura e os transf·
mant.es resultantes conjugados < zomcome stií rpes tais como Y1295
Y1367 pelos métodos- descritos atrás de ÍBOQQ a ODtSr estir
expressando partículas mistas em que o ρα11peρ t id eo Líi é
ρ·~ = dí subtipo ay e o polipeptídeo S do subtipo -adi
A descrição e exemplos atrás são ilustrativos e não limitantss do invento. Por exemplo, podem ser feitas uma. variedade ds modificações adicionais à proteína L, -s = g», desglicosilação parcial ou unis combinação de várias das modificações aqui feitas, em adição às referidas nos exemplos para gerar proteínas L homogénea contendo estas proteínas L modificadas de composição adequada para usar em vacinas»
Modificações adicionais que podem ser feitas incluem reintrodução de sequências- preS, introdução de sequências- codificadoras derivadas ds sequências codificadoras de HBV diferentes das do qene do invólucro, e»g. sequências codificadoras de regiões de aminoácidos importantes xmunolágicamsnte de outros pafogénios. Componentes- adicionais de vectores conhecidos podem ser empregues para substituir os genes de marcas- específicas, sequências de promotores e adaptadores e similares empregues nos exemplos» Outros tipos de células hospedeiras -podem ser empregues. As células- hospedeiras, vectores e componentes ds vectores empregues nestes exemplos são ilustrativos e podem ser substituídos com outras estirpes ou modificações- por alguém familiarizado com a matéria» Este invento engloba todos os melhoramentos e modificações que caiam dentro do âmbito das reivindicações que se
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Claims (7)

  1. REIVINDICAÇÕES;
    lâ - Método par-a a produção de uma proteína grande de superfície da hepatite B, modificada? compreendendo uma sequência de aminoâcidos codificadora d-a proteína L? em que uma modificação em pelo menos uma das seguintes sequências? uma sequência sensível à digestão por proteases? uma sequência necessária â miristoil-ação? uma sequência necessária à glicosilação ligada em N? uma sequência necessária à glicosilação ligada em 0 e uma sequência necessária à ligação de albumina do soro bovina? caracterizado pela cultura de uma célula ds levedura contendo uma sequência de DMA codificadora? para expressão da proteína L modificada no meio de cultura adequado e isolamento da referida proteína a partir do lisado celular ou. extracto da referida cultura»
    03Método de acordo com a reivindicação 1 caracteri· saco por a proteína L aminoâcidos traduzida segunda posição» modificada compreender uma sequência;
    )Γϊ!«3Γ13 SBíii Ui» esíduo qlicin
  2. 3ã - Método de acordo com a reivindicação 1 carscterizado por a proteína L modificada ter qualquer sequência de Asn-X-Tre ou Asn-X-Ser? sendo X qualquer aminoácido? alterado por delecção ou substituição de Asn? ou Ser ou deleção de X» . Λ s deleção ou. substituição de Tre — netodo Qe -acordo com aí reivindicação dicação 2 caracterizada por u.ma sequência de aminoâcidos tendo os resíduos- 12—52 ou o resíduo 12 seguido dos resíduos 14-52? seguido seguido dos resíduos 175-40® da oroteína t proteína L modificada compreender
    UUb rssíduos 133-145 oã - Método ds acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 cargcierizsdo por a célula de levedura ser selsccionsda do grupo constituído por SaccS^aroreyçes, Hansnula, Pichia, Candida, KluyveromyçjBs e Sçhi,zosãccharomyçese óâ - Método ds acordo com a reivindicação 5 caracterizado por a célula de levedura compreender S„ cerevisiae ou Hansenula polymorpha,
  3. 7ã - Método de acordo com qualquer uma das reivindieações 1 a 6 em que a proteína L modificada é expressa na forma ds uma partícula simultâneamente com a proteína S do antigénio de superfície da hepatite B, caracterizado pela cultura de uma célula de levedura que foi adicionalmente transformada com um vector de DNA recombinante capaz de expressar a referida proteína S e isolamento a partir do lisarfo celular ou do extracto ds proteína ds partículas ds composição mista ds subunidades»
    Sã _ Método de acordo com a reivindicação 7 caracterizatío por a partícula ds composição mista em subunidades ter a s ’s fórmula CL'!',S) em que L7 define uma proteína L modificada do vírus da hepatite B tendo uma sequência de aminoácidos compreendendo os resíduos 12-52 seguido dos resíduos 133-145 seguido dos resíduos 175-400 da proteína L e S define a proteína S do antigénio de superfície da hepatite B.
  4. 9â - Método de acordo com a reivindicação 7 ou reivindicação? 8 caracterizado por a proteína S ser do subtipo ad e a proteína L modificada é do subtipo ay ou vice versa, l©ã - Processo para a preparação de um microorganiosmo transiormado seleccionado do grupo dos géneros de leveduras metilotróficas, caracterizado pela transformação do referido cooLendo unis cãsseiK qk sxprBs&SD teci) codx i icsuors de Ufli primeiro polipeptídeo e/ou uma cassete de expressão £ec2) codificadora de um segundo polipeptídeo e/ou uma cassete de expressão Cec3) codificadora de um terceiro polipeptídeo, em que as cassetes de expressão compreendem;
    a) ura requlão R que responde ao metanol e/ou depleção da fontes de carbono repressoras de catabolitos,
    b) uma grelha de leitura aberta codificadora de toda ou parte oe uma proteína tendo a actividade bxoiogxca de um Que suxxqsuiuÍs de superfície da hepatite B?
    c) Tacuxtsxxvamente uma sequência oe úíMh sarvxiíuíO lOíru um terrainador T era que R exerce controle sobre a transcrição da grelha de leitura aberta a T dirige a poliadenilaçSo e/ou terminação da transcrição de ura raRNA produzido.
    1 ia
    ProcessG de acordo cora a reivindicação i®= caractsrizado por o primeiro polipeptídeo representar toda ou parte da proteína da proteína o segundo polipeotídeo repre— senta toda ou parte da proteína prebí e o terceiro polxpeptíds facultativo representa toda ou parte da proteína preS2 ou segundo polipeptídeo representa toda ou parte da proteína preS2,
  5. 12ã — Processo de acordo cora a reivindicação i® ou reivindicação li caracterizado por a levedura metilotrófíca ser seleccionada de uma espécie dos qéneros Candida? K. 1 oeckera; Saccharorayçss, Rhodotorula, Torulopsis, Pichia ou Hansenula»
    165
    Í3ê - Processo ds acordo com qualquer uma das reivindicações Í0 a 12 ca.racfcerizado por o regulão derivar de um gene envolvido n-a utilização de metanol, de preferência um gene MOX, usa gene FMD, um gene DAS ou um gene da catai ase, em que os referidos genes são de preferência derivados de Hansenula polymorpha»
  6. 14® - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13 caracterizado por a levedura metilotrófica sre ssleccionada de Hansenula^ de preferência Hansenula polymorpha,. ainda mais preferencialmente de uma estirpe tendo as características de Hansenula polymorpha RB 10 ÍDSfi 5215)„
  7. 15â - Método para a preparação de usa partícula composta, caracterizado por uma uma estirpe de levedura metilotrópica transformada, preparada de acordo com o processo de acordo com qualquer uma das reivindicações í© a 14, ser cultivada num meio de cultura adequado em condições que permitam a síntese proteica e as proteínas serem isoladas a partir da cultura» lóã - Processo para preparação de uma vacina contra a infecção pela hepatite B, caracterizado pela mistura da proteína ou partícula preparada de acordo com o método de qualquer uma das reivindicações í a 9 ou 15 com um veículo ou adjuvante -adequado»
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