CN103087933B

CN103087933B - 一种重组多形汉逊酵母菌及其制备方法

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Publication number: CN103087933B
Application number: CN201110352508.4A
Authority: CN
Inventors: 李启明; 张靖; 张学峰; 梁宇; 靳玉琴; 马智静; 陈实; 于洁
Original assignee: BEIJING BIOLOGICAL PRODUCT INST
Current assignee: BEIJING BIOLOGICAL PRODUCT INST
Priority date: 2011-11-08
Filing date: 2011-11-08
Publication date: 2015-07-22
Anticipated expiration: 2031-11-08
Also published as: CN103087933A

Abstract

本发明提供了一种重组多形汉逊酵母菌及其制备方法。本发明的重组多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)包含乙肝病毒的L蛋白的编码基因和S蛋白的编码基因。本发明的多形汉逊酵母菌与现有技术相比具有以下优点和积极效果：本发明的酵母菌能够在体内自行装配成VLP，其与HBV天然病毒颗粒最为接近，理论上对HBV感染具有更好的免疫保护效果。本发明所提供的酵母菌具有较好的遗传稳定性，并能以甲醇或甘油作为唯一碳源，实现阻遏/解阻遏的诱导表达方式，使外源蛋白高效表达。

Description

一种重组多形汉逊酵母菌及其制备方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体而言，涉及一种重组多形汉逊酵母菌及其制备方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)的感染是一个非常严重的全球性的健康问题。全球约有3.5亿的HBV慢性感染者，约75％分布在亚太地区，其中许多人发展为慢性肝脏疾病如肝硬化、原发性肝癌等，全球每年约有100万人死于乙型肝炎病毒感染的相关疾病。目前并无特异性治疗乙肝的药物，控制乙肝传播的最主要手段就是接种有效的疫苗。商品化的乙肝疫苗投入临床使用，到目前为止已超过十五年，而接种乙肝疫苗已被列入WHO的扩展免疫计划(EPI)中。

上世纪80年代使用的第一代血源性疫苗和目前正在使用的第二代利用酵母、昆虫细胞等表达系统生产的基因工程乙肝疫苗，在临床上均表现出了良好的效果，对于控制乙肝的传播起了很大的作用。但现有疫苗仍有其不足之处：有5％-10％的人群即使加大剂量对这一类疫苗也存在不反应或低反应性；疫苗接种后可能产生逃逸突变；而疫苗本身较大的用量和较高的价格，更使得在贫穷的发展中国家普遍接种乙肝疫苗存在实际上的困难。因此，开发更为有效而廉价的疫苗对于在全球范围内控制乙肝病毒的传播仍然具有很大的实际意义。

乙型肝炎病毒颗粒(Dane颗粒)直径在42nm左右，呈球形，基因组为双链DNA分子，HBV的包膜由3种蛋白所组成，分别是主蛋白(S)、中蛋白(M)和大蛋白(L)。这3种蛋白分别有含各自起始密码子的氨基端，具有共同的羧基末端和终止密码子。主蛋白由S基因编码，仅含有S抗原成分，有226个氨基酸；中蛋白由S及preS2基因区编码，含有S和preS2抗原成分，有281个氨基酸；大蛋白则由preS1、preS2和S基因区编码，含有S、preS1和preS2抗原成分，由于preS1在不同病毒亚型中的大小不同，因此大蛋白的大小为389或400个氨基酸不等。

从病毒颗粒的构型看，HBV的L蛋白和M蛋白位于Dane颗粒的表面，是肝细胞表面受体和HBV作用部位，有实验证实preS区很有可能成为病毒吸附肝细胞膜的吸附蛋白，介导病毒附着和侵入细胞。此外，preS区同时具有多种生物学功能和较强的免疫活性，其抗体也具有中和作用，研究提示前S区与病毒的感染、复制和病毒颗粒的装配密切相关，尤其在参与病毒与宿主细胞的相互作用中发挥至关重要的作用。因此对preS1、preS2及其相关受体的研究也成为HBV与靶细胞作用研究的热点领域，HBV preS1的21-47位氨基酸可能是HBV与肝细胞结合的最重要部位，而且多种抗preS1(21-47)单抗能特异阻断大蛋白或HBV病毒颗粒肝细胞的结合。近年来大量的研究结果也从不同的层面和角度表明preS1在HBV感染的早期过程中可能起着关键的作用。因此，在疫苗中加入preS抗原成分有可能提供更好的保护性。

目前的HBV疫苗生产都是以S蛋白作为唯一的免疫原，抗原成分比较单一。因此研制包含有L蛋白和S蛋白的疫苗是很有必要的，它不但能起到预防作用，还有可能具有一定的治疗作用。

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种表达乙肝病毒L蛋白和S蛋白，或乙肝病毒L蛋白、S蛋白和M蛋白的酵母菌及其制备方法。

具体而言，本发明提供：

(1)一种重组多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)，所述多形汉逊酵母菌包含乙肝病毒的L蛋白的编码基因和S蛋白的编码基因。

(2)根据(1)所述的重组多形汉逊酵母菌，其中，所述多形汉逊酵母菌的染色体中整合有所述的L蛋白的编码基因和所述的S蛋白的编码基因。

(3)根据(2)所述的重组多形汉逊酵母菌，其中，所述的L蛋白的编码基因和所述的S蛋白的编码基因分别随机定点整合在所述多形汉逊酵母菌的所述染色体中。

(4)根据(1)所述的重组多形汉逊酵母菌，其中，所述多形汉逊酵母菌能够表达所述L蛋白和所述S蛋白。

(5)根据(4)所述的重组多形汉逊酵母菌，其中，在所述多形汉逊酵母菌中表达的所述L蛋白和所述S蛋白能够组装成乙肝病毒颗粒。

(6)根据(1)所述的重组多形汉逊酵母菌，其中，所述多形汉逊酵母菌中还包含乙肝病毒的M蛋白的编码基因。

(7)根据(6)所述的重组多形汉逊酵母菌，其中，所述多形汉逊酵母菌的染色体中整合有所述的L蛋白的编码基因、所述的S蛋白的编码基因和所述的M蛋白的编码基因。

(8)根据(7)所述的重组多形汉逊酵母菌，其中，所述的L蛋白的编码基因、所述的S蛋白的编码基因和所述的M蛋白的编码基因分别随机定点整合在多形汉逊酵母菌的所述染色体中。

(9)根据(6)所述的重组多形汉逊酵母菌，其中，所述多形汉逊酵母菌能够表达所述L蛋白、所述S蛋白和所述M蛋白。

(10)根据(9)所述的重组多形汉逊酵母菌，其中，在所述多形汉逊酵母菌中表达的乙肝病毒L蛋白、S蛋白和M蛋白能够组装成乙肝病毒颗粒。

(11)根据(1)-(10)中任意一项所述的重组多形汉逊酵母菌，其中，所述多形汉逊酵母菌是通过乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因和β-异丙基苹果酸脱氢酶基因都被阻断的双营养缺陷型多形汉逊酵母构建的。

(12)一种根据(1)-(5)中任意一项所述的重组多形汉逊酵母菌的制备方法，其包括：

将含有L蛋白的编码基因的第一重组载体和含有S蛋白的编码基因的第二重组载体转化入多形汉逊酵母菌中，以使所转入的所述第一重组载体和所述第二重组载体分别与多形汉逊酵母菌的相应同源序列进行同源重组，从而形成根据(1)-(5)中任意一项所述的重组多形汉逊酵母菌。

(13)根据(12)所述的制备方法，其中，所述多形汉逊酵母菌为乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因和β-异丙基苹果酸脱氢酶基因都被阻断的多形汉逊酵母。

(14)根据(13)所述的制备方法，其中，所述第一重组载体含有所述乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因和所述β-异丙基苹果酸脱氢酶基因中的一种；而所述第二重组载体含有所述乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因和所述β-异丙基苹果酸脱氢酶基因中的另一种。

(15)根据(12)所述的制备方法，其中，所述第一重组载体和所述第二重组载体是通过同一个转化步骤，同时转化入所述多形汉逊酵母菌中的。

(16)根据(15)所述的制备方法，其中，在进行所述的转化步骤后，筛选在营养缺陷型培养基上生长的单克隆菌落，从而得到所述的重组多形汉逊酵母菌。

(17)根据(12)-(16)中任意一项所述的制备方法，其中，所述第一重组载体具有如图2所示的PUC25-LL质粒的物理图谱、并且/或者所述第二重组载体具有如图1所示的PUC25-SU质粒的物理图谱。

(18)根据(16)所述的制备方法，其中，所述L蛋白的编码基因的核苷酸序列为如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列、并且/或者所述S蛋白的编码基因的核苷酸序列为如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。

(19)一种根据(6)-(10)中任意一项所述的重组多形汉逊酵母菌的制备方法，其包括：

将含有L蛋白的编码基因和所述M蛋白的编码基因的第三重组载体和含有S蛋白的编码基因的第四重组载体转化入多形汉逊酵母菌中，以使所转入的所述第三重组载体和所述第四重组载体分别与多形汉逊酵母菌的相应同源序列进行同源重组，从而形成根据(6)-(10)中任意一项所述的重组多形汉逊酵母菌。

(20)根据(19)所述的制备方法，其中，所述多形汉逊酵母菌为乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因和β-异丙基苹果酸脱氢酶基因都被阻断的多形汉逊酵母。

(21)根据(20)所述的制备方法，其中，所述第三重组载体含有所述乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因和所述β-异丙基苹果酸脱氢酶基因中的一种；而所述第四重组载体含有所述乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因和所述β-异丙基苹果酸脱氢酶基因中的另一种。

(22)根据(19)所述的制备方法，其中，所述第一重组载体和所述第二重组载体是通过同一个转化步骤，同时转化入所述多形汉逊酵母菌中的。

(23)根据(22)所述的制备方法，其中，在进行所述的转化步骤后，筛选在营养缺陷型培养基上生长的单克隆菌落，从而得到所述的重组多形汉逊酵母菌。

(24)根据(19)-(23)中任意一项所述的制备方法，其中，所述第三重组载体具有如图8所示的PUC25-LLM的物理图谱、并且/或者所述第四重组载体具有如图1所示的PUC25-SU质粒的物理图谱。

(25)根据(16)所述的制备方法，其中，所述L蛋白的编码基因的核苷酸序列为如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列、所述M蛋白的编码基因的核苷酸序列为如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列、并且/或者所述S蛋白的编码基因的核苷酸序列为如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。

本发明的多形汉逊酵母菌与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

1.本发明应用双缺陷型酵母表达系统在同一宿主菌内同时表达HBV的L和S两种蛋白，或者L、M、和S三种蛋白，其能够在体内自行装配成VLP(类病毒颗粒)，这种由L和S两种蛋白或L、M、和S三种蛋白包含有preS1、preS2和S三种抗原成分的VLP，与HBV天然病毒颗粒最为接近，理论上对HBV感染具有更好的免疫保护效果。

2.本发明应用第二代甲醇营养型酵母——汉逊酵母作为表达系统，该系统是一种优于大肠杆菌和其它酵母菌(如巴斯德毕赤酵母菌和酿酒酵母菌等)的外源基因表达系统，现已成为当前国际上公认的最为理想的外源基因表达系统之一。本发明应用双营养缺陷型汉逊酵母工程菌和表达两种或三种蛋白的重组载体，通过一步转化实现两种或三种蛋白在同一个宿主菌中共表达，并在该菌内包装成类病毒颗粒。简化了筛选步骤，提高了筛选效率，同时降低了转化过程中易出现污染的概率。

3.本发明的重组多形汉逊酵母菌来源于双缺陷型多形汉逊酵母菌，为应用基因工程方法使乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(URA3)和β-异丙基苹果酸脱氢酶基因(LEU2)处发生了突变，突变位点明确，突变机制清楚，保证了疫苗的安全性。同时，遗传稳定性高，回复突变率低，生物量高，使HBV工程菌具有较好的遗传稳定性。

4.本发明中HBV的三种表面抗原蛋白S、M、L分别以MOX、FMD、DAS作为启动子，这三种启动子均为汉逊酵母的强诱导型启动子，能以甲醇或甘油作为唯一碳源，实现阻遏/解阻遏的诱导表达方式，使外源蛋白高效表达。

附图说明

图1为HBV的S蛋白酵母表达载体——PUC25-SU质粒的示意图；

图2为HBV的L蛋白酵母表达载体——PUC25-LL质粒示意图；

图3为HBV-LMS菌株中L、M、S基因PCR鉴定结果电泳图；

Lane1：DL-2000DNA marker；

Lane2：以HBV-MF和HBV-MB为引物，扩增的M基因；

Lane3：以HBV-LF和HBV-LB为引物，扩增的L基因；

Lane4：以HBV-SF和HBV-SB为引物，扩增的S基因；

图4为HBV-LMS阳性酵母菌株S蛋白免疫印迹结果图；

Lane1：诱导后的HBV-LMS酵母菌株破碎后上清；

Lane2：rainbow marker；

图5为HBV-LMS阳性酵母菌株M蛋白免疫印迹结果图；

Lane1：rainbow marker；

Lane2：诱导后的HBV-LMS酵母菌株破碎后上清；

图6为HBV-LMS阳性酵母菌株L蛋白免疫印迹结果图；

Lane1：rainbow marker；

Lane2：诱导后的HBV-LMS酵母菌株破碎后上清；

图7为由HBV S、M、L三种蛋白包装成的类病毒颗粒电镜观察图；

图8为HBV的L和M蛋白酵母表达载体——PUC25-LLM质粒示意图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述并结合附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

本发明提供一种能够共表达乙肝表面抗原L蛋白和S蛋白的汉逊酵母菌，以及能够共表达乙肝表面抗原L蛋白、S蛋白和M蛋白的汉逊酵母菌。本发明还提供一种能够共表达乙肝表面抗原L蛋白和S蛋白的汉逊酵母菌的构建方法，以及能够共表达乙肝表面抗原L蛋白、S蛋白和M蛋白的汉逊酵母菌的构建方法。

为了实现本发明的目的，本发明提供了一种构建方法，但是本发明不限于此，本领域技术人员所熟知的其它能够实现相同目的的质粒(所述质粒包含与以下技术方案中的质粒相同的基因，区别仅在于所用的具体质粒不同)也可用于构建所述酵母菌，并包含在本发明的保护范围之内。

本发明的一种优选的技术方案可以是：

首先提供一种酵母表达载体，所述载体是以25S1和25S2作为其整合臂，用于与酵母染色体上的25S基因发生同源重组，将目的基因整合到宿主菌染色体上；所述载体利用不同的酵母启动子和终止子，如：MOX、DAS、FMD等，同时所述载体以URA3或LEU2作为标记基因。

其次提供一种双缺陷型多形汉逊酵母菌，所述双缺陷型多形汉逊酵母菌仅在URA3和LEU2基因处发生了突变，突变位点明确，突变机制清楚，染色体其它部位未发生改变，因此并未改变汉逊酵母菌的其它代谢通路，保证了基因工程疫苗研发过程中的安全性；所述双营养缺陷型汉逊酵母菌的遗传稳定性高，回复突变率低，生物量高，用于表达外源蛋白的基因遗传稳定，不易丢失；在所述双营养缺陷型汉逊酵母菌株内可以进行两种或两种以上的蛋白共表达，尤其适用于研发多组分的VLP疫苗。

最后提供了一种能够表达一种外源蛋白或同时表达两种或两种以上外源蛋白的表达框，表达框包含元件为：

1)整合臂序列，所述整合臂序列可以为25S或18S，位于表达框的两端；

2)外源蛋白表达序列，所述外源蛋白表达序列包括：汉逊酵母菌启动子序列、外源蛋白编码基因序列、汉逊酵母终止子序列；其中所述启动子及终止子序列可以为汉逊酵母菌的MOX、DAS、FMD；外源蛋白表达序列可以为一种或更多种，例如在一个表达框中含有单一的S蛋白表达序列，或单一的L蛋白表达序列，或在一个表达框中同时含有两种或两种以上外源蛋白表达序列(如L蛋白表达序列和M蛋白表达序列)，两个或多个外源蛋白表达序列间以标记基因序列相隔；外源蛋白编码基因可以是外源蛋白编码基因的原始序列，也可以是根据多形汉逊酵母菌密码子使用偏好进行优化后的序列；

3)标记基因序列，所述标记基因序列为编码汉逊酵母菌的LEU2或URA3序列。

在一个优选的具体实施方式中，表达框在5′至3′方向上可操作地连接有：整合臂序列1、标记基因序列、外源蛋白表达序列、整合臂序列2。更优选的是，表达框在5′至3′方向上可操作地连接有：整合臂序列25S1、标记基因序列URA3、外源蛋白表达序列MOX-S、整合臂序列25S2。

在另一个优选的具体实施方式中，表达框在5′至3′方向上可操作地连接有：整合臂序列1、外源蛋白表达序列、标记基因序列、整合臂序列2。更优选的是，表达框在5′至3′方向上可操作地连接有：整合臂序列25S1、外源蛋白表达序列DAS-L、标记基因序列LEU2、整合臂序列25S2。

在另一个优选的具体实施方式中，表达框在5′至3′方向上可操作地连接有：整合臂序列1、外源蛋白表达序列1、标记基因序列、外源蛋白表达序列2、整合臂序列2。更优选的是，表达框在5′至3′方向上可操作地连接有：整合臂序列25S1、外源蛋白表达序列DAS-L、标记基因序列LEU2、外源蛋白表达序列FMD-M、整合臂序列25S2。

所述用于筛选重组汉逊酵母菌的营养缺陷型培养基优选无氨基酸基础培养基。

本发明提供的表达L和S或L、M和S蛋白的汉逊酵母工程菌中，外源蛋白基因序列通过整合臂以随机定点的方式整合到双缺陷型酵母菌的染色体中。

以下通过实施例的方式进一步解释或说明本发明内容，但这些实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。

下述实施方案中的百分比均为质量体积百分比。下述实施方案中所用的PCR反应试剂、限制性内切酶、DNA连接酶、pMD18T载体购自TAKARA公司。下述实施方案中所用的5-氟乳清酸、制霉菌素购自SIGMA公司。下述实施方案中所用的培养基的配置如下：

完全培养基(YPD液体培养基)：酵母提取物(1％)、胰化蛋白胨(2％)、D-葡萄糖(2％)，用水配制；

无氨基酸基础培养基(MD液体培养基)：无氨基酸酵母氮源(YNB(1.34％))、生物素(410-5％)、D-葡萄糖(2％)，用水配制；

补充尿嘧啶的基础培养基(SM-Ura液体培养基)：MD培养基、尿嘧啶(105mg/l)；

补充亮氨酸的基础培养基(SM-Leu培养基)：MD培养基、亮氨酸(110mg/l)；

补充尿嘧啶和亮氨酸的基础培养基(SM-Ura-leu培养基)：SM-Ura培养基、亮氨酸(110mg/l)；

补充5-氟乳清酸的含尿嘧啶的基础培养基(SM-Ura-5FOA培养基)：SM-Ura培养基、5-FOA(1g/l)；

补充尿嘧啶和亮氨酸的限制性基础培养基(LM-Ura-Leu培养基)：SM-Ura培养基、亮氨酸(55mg/ml)；

固体培养基为以上相应的液体培养基内加入1.5％琼脂，其中LM-Ura-Leu固体培养基中加入1.2％琼脂。

以上培养基经高温高压消毒灭菌(0.12MPa，115℃，20分钟)后，4℃保存备用。

下述实施方案中所用的试剂配方如下：

50mM的磷酸钾缓冲液(pH7.5)：K₂HPO₄·3H₂O(42mM)、KH₂PO₄(8mM)。

STM水溶液：蔗糖(270mM)、pH 7.5的Tris·HCl(100ml)、CaCl₂(1mM)。

以上溶液经0.22μm滤器过滤除菌，4℃保存备用。

以下实施例中所用的酶切及连接均为常规操作，具体操作步骤可参见《分子克隆实验指南》(科学出版社出版，第3版，2002年8月1日)。

以下实施例中，下划线上的基因序列表示的是在该序列中的酶切位点，所述酶为该序列后的括弧内的酶。

实施例1HBV中S、M、L蛋白的基因序列的合成

从GenBank上查找到HBV的adr亚型的S基因、M基因和L基因序列，对其根据多形汉逊酵母菌密码子使用偏好进行优化后进行序列合成，分别得到如下序列：SEQ ID No.7(S蛋白)、SEQ ID No.8(M蛋白)、SEQ ID No.9(L蛋白)，具体序列可参见所附的序列表。对上述序列SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9进行全基因合成。

实施例2启动子、终止子的扩增

以汉逊酵母(ATCC26012)基因组为模板，使用HSDNA聚合酶(TakaRa，Code No.DR010S)PCR扩增甲醇氧化酶基因(MOX)、二羟丙酮合成酶基因(DAS)、甲醇脱氢酶基因(FMD)的启动子和终止子。

根据GenBank MOX启动子(MOX-P，见SEQ ID No.1)和终止子(MOX-T，见SEQ ID No.2)核苷酸序列设计引物为：

MOX(P)-F：CGAGCTCAATTGTTGCCGCATGCATCCTTGC(SacI)

MOX(P)-B：TTTGTTTTTGTACTTTAGATTGATGT

MOX(T)-F：GGAGACGTGGAAGGACATACCGC

MOX(T)-B：CGGGTCGACACAAAAGCTGGAGCTCAATCTCCGG(Sal I)；

根据GenBank DAS启动子(DAS-P，见SEQ ID No.3)和终止子(DAS-T，见SEQ ID No.4)核苷酸序列引物为：

DAS(P)-F：CGAGCTCAAGCTTGAATCGTGAAACGTCG(SacI)

DAS(P)-B：GGGAAGAAAAGACAGAGATG

DAS(T)-F：CCACGATAAAGTAAATAAGC

DAS(T)-B：CGAGCTCGGATCCGATGCATTCTATTTGG(SacI)；

根据GenBank FMD启动子(FMD-P，见SEQ ID No.5)和终止子(FMD-T，见SEQ ID No.6)核苷酸序列引物为：

FMD(P)-F：CGGGTCGACGGAGACAGAGATAAGAG(SalI)

FMD(P)-B：CGGCATATTTCTATTGC

FMD(T)-F：TTGAATCAAGTGACGTCG

FMD(T)-B：CGGGTCGACTGGAAAGTCGCAGACCG(SalI)

PCR反应体系如下所示：

表1用于扩增启动子、终止子的PCR反应体系

Template(约10ng/μl)	1μl
		Primer^*1(20pmol/μl)	0.5μl
Primer^*2(20pmol/μl)	0.5μl
		dNTP Mixture(各2.5mM)	4μl
5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺plus)	10μl
		PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)	0.5μl
dH₂O	加至50μl

Primer^*1为MOX(P)-F；Primer^*2为MOX(P)-B；

或者Primer^*1为MOX(T)-F；Primer^*2为MOX(T)-B；

或者Primer^*1为DAS(P)-F；Primer^*2为DAS(P)-B；

或者Primer^*1为DAS(T)-F；Primer^*2为DAS(T)-B；

或者Primer^*1为FMD(P)-F；Primer^*2为FMD(P)-B；

或者Primer^*1为FMD(T)-F；Primer^*2为FMD(T)-B。

反应条件如下：

使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(CodeNo.DV805A)分别切胶回收扩增片段。

实施例3外源基因片段表达盒的获得

1.整合臂连接

利用引物25S-F1、25S-S1和25S-F2、25S-B2分别扩增汉逊酵母基因组中25S基因的上、下游基因序列25S1(SEQ ID No.10)、25S2(SEQ ID No.11)，作为酵母表达载体与酵母染色体发生同源重组的整合臂，连接入pUC-57中，形成pUC-25S具体过程如下所述：

25S-F1：CCGGAATTCTCGCTTCTTCACATTC(EcroI)

25S-B1：CGAGCTCGGGATATGGATTTAG(SacI)

25S-F2：ACGCGTCGACAATCTAAATTATTG(SalI)

25S-B2：CCCAAGCTTCGAGCTCTTCAGATAATTGG(HindIII)

扩增25S1目的基因序列的PCR反应体系如下表2所示：

表2用于扩增25S1目的基因序列的PCR反应体系

模板：酵母基因组DNA	2μL
		25S-F1	1μL
25S-B1	1μL
		dNTP	5μL
10*PCR ExTaq buffer	5μL
		ExTaq酶	1μL
去离子水	35μL
		总体积	50μL

在PCR仪上进行PCR反应，反应条件如下：

94℃5分钟1次循环；

94℃40秒；

52℃40秒；

72℃1分钟30次循环；

72℃10分钟1次循环。

将以上PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收25S1目的片段。

扩增25S2目的基因序列的PCR反应体系如下所示：

在PCR仪上进行PCR反应，反应条件如下：

94℃5分钟1次循环；

94℃40秒；

56℃40秒；

72℃1分钟30次循环；

72℃10分钟1次循环。

将以上PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收25S2目的片段。

将25S1通过EcroI和SacI双酶切连接入PUC57(cloning vector，GenScript)中，形成PUC25S1质粒。将25S2通过SalI和HindIII双酶切连接入PUC25S1质粒中，形成PUC25质粒。

实施例4HBV S蛋白的酵母表达载体的构建

4.1插入目的蛋白表达框

将实施例2得到的PCR扩增启动子序列MOX、实施例1得到的S蛋白的编码序列、实施例2得到的PCR扩增MOX终止子序列依次串接在一起(DNA Blunting Kit试剂盒TAKARA Code：D6025)(即：PCR扩增产物MOX(P)、编码S蛋白的SEQ ID No.7序列和MOX(T)的串接产物)，并通过Sac I和SalI插入实施例3所获得的载体PUC25质粒中，得到PUC25-S质粒。

4.2插入标记基因

将标记基因序列元件(序列为SEQ ID No.12，URA3)经SacI单酶切连接入PUC-25S质粒中，形成PUC-25SU质粒，见图1。

实施例5HBV L蛋白的酵母表达载体的构建

5.1.插入标记基因

将标记基因LEU2序列元件(序列为SEQ ID No.13)经SacI/SalI双酶切连接入PUC-25质粒中，形成pUC-25L质粒。

以汉逊酵母基因组为模板，以引物

LEU-F3	CGAGCTCAGATCTGAGTCCCTGAGTAC，SacI
		LEU-B3	ACGCGTCGACAGATCTGGGTTTACCACCCG，SalI

扩增LEU2目的基因序列(SEQ ID No.13)，两端导入SacI/SalI酶切位点，扩增LEU2目的基因序列，PCR反应体系及反应条件如下：

在PCR仪上进行PCR反应，反应条件如下：

94℃5分钟1次循环；

94℃40秒；

52℃40秒；

72℃1分钟30次循环；

72℃10分钟1次循环。

将扩增得到的LEU2通过SacI和Sal I插入到PUC25质粒中，形成PUC25L质粒。

5.2插入目的蛋白表达框

将实施例2得到的PCR扩增启动子序列DAS、实施例1得到的L蛋白的编码序列、实施例2得到的PCR扩增DAS终止子序列依次串接在一起(DNA Blunting Kit试剂盒TAKARA Code：D6025)(即：PCR扩增产物DAS(P)、编码L蛋白的SEQ ID No.9序列和DAS(T)串接产物)，并通过SalI单酶切插入实施例5.1所获得的载体PUC-25L质粒中，得到PUC25-LL质粒。

实施例6HBV M和L蛋白的酵母表达载体的构建

6.1插入目的蛋白表达框

将实施例2得到的PCR扩增启动子序列FMD、实施例1得到的M蛋白的编码序列、实施例2得到的PCR扩增FMD终止子序列依次串接在一起(DNA Blunting Kit试剂盒TAKARA Code：D6025)(即：PCR扩增产物FMD(P)、编码M蛋白的SEQ ID No.8序列和FMD(T)串接产物)，并通过SacI单酶切插入实施例5所获得的载体PUC-25LL质粒中，得到PUC25-LLM质粒。

实施例7菌株的获得和鉴定

以下以HBV S+M+L蛋白阳性菌株为例，描述菌株的获得和鉴定，但是本发明不限于此，HBV S+L蛋白阳性菌株的获得和鉴定方法与下述方法大致相同，所不同之处仅在于：在进行L与S蛋白共表达时，所需要转化的质粒是PUC-25SU质粒和PUC25-LL质粒。在进行L、M和S三个蛋白共表达时，所需要转化的质粒是PUC-25SU质粒和PUC25-LLM质粒。筛选和鉴定的方法相同。

1.HBV的L、M、S蛋白酵母表达框的获得

将实施例四、五、六中获得的酵母穿梭表达质粒PUC-25SU质粒，PUC25-LL质粒和PUC25-LLM质粒分别进行EcroI/Hind III进行双酶切，获得HBV的S蛋白、L蛋白以及L+M蛋白的酵母表达框。PUC-25SU质粒是用于S蛋白的表达，它是以MOX(P)作为启动子，以MOX(T)作为终止子，以URA3作为标记基因。PUC25-LL质粒是用于L蛋白的表达，它是以DAS(P)作为启动子，以DAS(T)作为终止子，以LEU作为标记基因。PUC25-LLM质粒是用于L蛋白和M蛋白的表达，以LEU作为标记基因，其中L蛋白得表达是以DAS(P)作为启动子，以DAS(T)作为终止子，而M蛋白的表达是以FMD(P)作为启动子，以FMD(T)作为终止子。

2.酵母感受态的制备

以URA3和LEU2双缺陷型汉逊酵母菌株(其详细制备方法如试验例1所示，但是不限于此，也可使用其它方法制备得到的URA3和LEU2双缺陷型汉逊酵母菌株)作为出发菌中，进行感受态的制备。将2ml菌液接种于50ml的YPD液体培养基中，在37℃下在250rpm摇床内振荡培养至对数生长期(OD₆₀₀值在1.2-1.5之间)，在3000rpm下离心10分钟并收集菌体；用pH7.5的磷酸钾缓冲液重悬，然后加入250μL的1M DTT，置于37℃水浴箱内静止15分钟，在3000rpm下离心10分钟并收集菌体。将收集的菌体重悬于50ml的STM溶液中进行清洗，在3000rpm下离心10分钟收集菌体；再将菌体重悬于30ml的STM溶液中再次进行清洗，在3000rpm下离心10分钟收集菌体；将菌体重悬于250μL的STM溶液中，每管分装60μL，置于冰浴中备用。

3.电转化

1)将酶切后的酵母表达载体PUC-25SU质粒和PUC25-LLM质粒各5μg加入到60μl双营养缺陷型汉逊酵母感受态中：

2)将以上的质粒和感受态细胞混匀后加入到已预冷的电转杯内，并在电转化仪的作用下进行电转化。

3)加入1ml YPD液体培养基内，于250rpm 37℃摇床内，震荡培养1小时。

4)3000rpm下离心5分钟收集菌体，用MD液体培养基将收集的菌体清洗2次后，用200μL的MD液体培养基重悬菌体，最后将菌液均匀的涂布于MD固体培养基上，37℃培养箱内培养3-5天。

4.HBV S+M+L蛋白阳性菌株的鉴定——ELISA

挑取20株MD固体培养基上生长的单克隆酵母菌株，进行目的蛋白的甲醇诱导表达，观察其蛋白表达量情况，具体步骤如下：

(1)挑取MD固体培养基上生长的单克隆酵母菌落于2ml MD液体培养基中，在37℃摇床内震荡培养24小时。

(2)将菌液按1∶20的比例连续转接3次，进行传代培养，以验证其遗传稳定性。第4次将菌液转接于4ml的MD液体培养基中，进行扩大培养。

(3)诱导。将4ml菌液在3000rpm下离心5分钟收集菌体，并将酵母菌用等体积的MM液体培养基洗涤2次，最后重悬于4ml的MM培养基中，37℃250rpm摇床内诱导，并每隔6小时补加0.8％无水甲醇，共诱导24小时。

(4)收菌，破碎酵母并提取蛋白。将4ml诱导好的酵母菌液于3000rpm条件下离心5分钟收集菌体，并用无菌水1ml洗涤菌体一次，最终将菌体重悬于300μL的酵母破碎缓冲液(20m M PB，100m MNaCL，0.01％Tween-80，PH 8.0)中，再加入200mg的玻璃珠和2μL100mM的PMSF。于旋涡震荡器上进行剧烈震荡，以破碎酵母，共震荡20分钟，每隔2分钟，要于冰中静置2分钟，以使其冷却，防止目的蛋白的降解。震荡结束后在12000rpm条件下离心10分钟，吸取上清液于新离心管中，并再次加入2μL 100mM的PMSF。

(5)直接ELISA方法对表达的HBV L、M和S蛋白进行检测。取步骤(4)中最后吸取的上清液，用封闭液按1∶2000的比例稀释，并取100μL加入已包被有HBV S蛋白单克隆抗体(1∶1500)，前S1单克隆抗体(1∶6000)和前S2单克隆抗体(1∶8000)的酶标板上，同时以阳性血清作为阳性对照，以未诱导的菌提取的蛋白作为阴性对照，37℃内孵育1小时后，PBST洗涤3次，加入用封闭液稀释1000倍的抗HBV结构蛋白的多克隆抗体(HRP)作为二抗，于37℃内孵育1小时后，PBST洗涤3次。最终加入50μL显色液A，50μL显色液B，在37℃条件下显色5分钟，最终加入50μL终止液，于酶标仪上进行双波长读数，OD值最高的则被视为HBVL，M和S蛋白表达量最高的菌株，实现了HBV L M S三种蛋白于一株酵母菌中的高效共表达，最终筛选获得一株高效表达HBV L M S三种蛋白的汉逊酵母菌，将其命名为——HP-LMS菌株。

5.HP-LMS菌株的鉴定——PCR

对筛选到的HBV L、M和S蛋白高表达量阳性酵母菌株阳性酵——“HP-LMS”，进行基因组的提取，并利用PCR的方法鉴定L、M、S目的基因的整合位置是否正确。

以HBV-LF(TGATCGGGGCCCTTAGCT)和HBV-LB(GTAGTCGTCGTCAGCTAGC)为引物，鉴定L目的基因的整合位置；以HBV-MF(GTCGATATATAGCTGCAGCTATG)和HBV-MB(GTGCTAGCTGAGTCGATCG)为引物，鉴定M目的基因的整合位置；以HBV-SF(TAGCTTAGCTAGCTGCTGC)和HBV-SB(TGCTAGCCGTGCTGCTAGCAAACTC)为引物，鉴定S目的基因的整合位置。以上引物中，上游引物都位于启动子上，下游引物都位于目的基因上，保证了完整的目的基因是在启动子下游并且都准确的整合到酵母染色体上。经TAKARA公司测序得知，均未发生突变，测得目的基因序列与SEQ ID No.7，SEQ ID No.8，SEQ ID No.9一致。

具体PCR反应过程如下所述：

在PCR仪上进行PCR反应，反应条件如下：

94℃5分钟1次循环；

94℃40秒；

54℃40秒；

72℃1分钟30次循环；

72℃10分钟1次循环。

将以上PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR结果见图3，HBV-LMS菌株L、M、S基因均以预期目的整合到酵母染色体上。

6.HP-LMS阳性菌株的鉴定——Western-Blotting

(1)将诱导后HP-LMS酵母菌进行高压破碎，取上清，制备Western-Blotting样品，进行SDS-PAGE电泳，蛋白Marker为RainbowMarker。

(2)转膜：恒流150mA，转移2h。

(3)封闭：转移结束后，用镊子将膜拿出，剪去一角做记号，将与胶相接触的一面朝上放入封闭液中，摇床轻微振荡，4℃过夜。

(4)封闭后，将膜置于TBST中清洗3次，每次5分钟。

(5)加入一抗：将膜放入一塑料袋中，抗体用TBS稀释(HBV S单克隆抗体(检测M蛋白)按1∶300稀释，HBV前S1单克隆抗体(检测L蛋白)按1∶1000稀释，HBV前S2单克隆抗体(检测M蛋白)按1∶1000稀释)，除袋内的气泡，封口，37℃，170rpm振荡1h。

(6)倒掉抗体溶液，膜用TBST清洗3次，每次5min。

(7)加入二抗：将山羊抗小鼠IgG(HRP，可得自中山金桥公司)1∶1000稀释于TBS中，再以相应比例加入到装有膜的塑料袋中，去气泡，封口，37℃，170rpm，振荡1h。

(8)TBST清洗3次，每次5分钟。

(9)显色：称取0.005g-0.006gDAB于10ml的TBS缓冲液中，再加入3.5μl的H₂O₂配制成显色液。将膜放于显色液中显色，当目的条带出现后，立即将其放入水中终止反应。

(10)图4、图5、图6分别是S蛋白、M蛋白和L蛋白的免疫印迹结果图，目的蛋白的大小分别是25KD、31KD和44KD，均与预期结果一致。

实施例8HP-LMS阳性菌株高密度发酵，目的蛋白的分离纯化及类病毒颗粒的电镜观察

HP-LMS阳性菌株可进行高密度发酵，利用甲醇对阳性酵母菌进行诱导表达，每隔24h加入甲醇至终浓度1％，诱导56h后取菌离心。将诱导后的工程菌用高压破碎处理，离心后，通过密度梯度离心进行分离纯化，250g/L氯化铯，160000g，4℃，16h，去除氯化铯，再进行蔗糖密度梯度离心，120000rpm，4℃，16h。将上述分离纯化的产物滴加到300目的Fomvar膜上，用2％磷酸钨(pH7.0)复染40秒，电镜下可见多种形态的类病毒颗粒，包括直径为22nm的小球形颗粒，管形颗粒等。结果见图7。

试验例1URA3和LEU2双缺陷型汉逊酵母菌株的制备

1.灭活URA3基因的重组质粒p18T-KURA3的构建

重组质粒p18T-KURA3的构建过程如下。根据已报道(GenBank)的多形汉逊酵母菌的URA3的核苷酸序列设计引物如下。

引物名称序列(5’-3’)

URA3-F：CACAGACTTAGATTGGTATA

URA3-B：TCTTCCCAATTTTTTTTTTTC

URA3-MF：ATATCGGTATATATACCAATC

URA3-MB：GGAATTCTTAAGGATTCCCGGGTAATAACTG

提取多形汉逊酵母菌ATCC 26012的总DNA作为模板，以URA3-F和URA3-B为引物，按照如下PCR反应体系来扩增URA3基因序列：

其中，在PCR仪上进行PCR反应的反应条件如下：

94℃，5分钟；然后进行94℃，40秒、54℃，40秒、72℃，1分钟循环30次；72℃，10分钟。

将以上PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测并凝胶回收1.0kb的PCR产物，然后用T4DNA连接酶(购自TAKARA公司)将回收的PCR产物与pMD 18T载体连接，从而形成p 18T-URA3质粒。按照下列过程将重组质粒p18T-URA3的第35位碱基进行定点突变，使得A突变为G，并最终构建成p18T-KURA3重组载体：

以p 18T-URA3质粒为模板，以URA3-MF(导入变异位点)和URA3-MB为引物，进行如下PCR反应：

其中，在PCR仪上进行PCR反应的反应条件如下：

94℃，5分钟；然后进行94℃，30秒、55℃，30秒、72℃，5分钟循环30次；72℃，10分钟。

将以上PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，并凝胶回收3.8kb的PCR产物，将PCR反应产物进行Blunting kination反应，具体反应体系和条件如下：

Blunting kination反应条件：在37℃反应10分钟，然后在70℃反应10分钟。取5μl的Blunting kination反应液，加入5μ1的LigationSolution I，混合于16℃条件下连接1小时后转化至大肠杆菌DH 5α中，挑取阳性克隆并送至TaKaRa公司进行序列的测定，重组质粒p18T-URA3的第35位碱基进行发生突变的质粒为p18T-KURA3质粒。

2.含灭活LEU2基因的重组质粒p18T-KLEU2的构建

重组质粒P18T-KLEU2的构建过程如下。

根据已报道(GenBank)的多形汉逊酵母菌的LEU2的核苷酸序列设计引物：

引物名称序列(5’-3’)扩增片段(bp)

LEU2-F 1ACATGCATGCCAAAATAGTTCCATC(Sph I)

LEU2-B 1ACGCGTCGACGAATAGCTCTCAGTGTCGC(Sal I)

525

LEU2-F2CCAGAGCTCGTCGTCGTCTTC(Sac I)

LEU2-B2CCGGAATTCGATCTGGGTTTACCACCC(EcoR I)570

提取多形汉逊酵母菌ATCC 26012的总DNA作为模板，以LEU2-F1和LEU2-B1为引物扩增LEU2基因的一段上游DNA序列，即L1片段，长度为525bp。以LEU2-F2和LEU2-B2为引物扩增LEU2基因的一段下游DNA序列，即L2片段，长度为570bp。

按照如下PCR反应体系进行，其中引物3为LEU2-F1、引物4为LEU2-B 1或者引物3为LEU2-F2、引物4为LEU2-B2：

在PCR仪上进行PCR反应，反应条件如下：

94℃，5分钟；然后进行94℃，40秒、57℃，40秒、72℃，1分钟循环30次；72℃，10分钟。

将以上PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测并凝胶回收L1片段，然后用T4DNA连接酶将回收的L1片段与pMD 18T载体连接为pMD18T-L1质粒。将pMD18T-L1质粒与L2片段分别进行Sac I和Eco RI双酶切，纯化后连接，最终构建成p18T-KLEU2重组质粒。

3.尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌的构建及鉴定

将1中构建的p18T-KURA3通过电转化的方式转化入多形汉逊酵母菌ATCC 26012中，经筛选得到尿嘧啶单营养缺陷型汉逊酵母菌株，并进行鉴定，具体步骤如下：

a、多形汉逊酵母菌ATCC 26012感受态的制备

将多形汉逊酵母菌ATCC 26012划线接种于斜面培养基(其为含有7.5％的琼脂的YPD培养基)上进行活化，用接种环挑取单克隆菌落接种于2ml的YPD液体培养基中，在37℃下在250rpm摇床内振荡培养24小时，再将2ml菌液接种于50ml的YPD液体培养基中，在37℃下在250rpm摇床内振荡培养至对数生长期(OD600在1.2-1.5之间)，在3000rpm下离心10分钟并收集菌体；用pH7.5的磷酸钾缓冲液重悬，然后加入250μl的1M的二硫苏糖醇(DTT)，置于37℃水浴箱内静止15分钟，在3000rpm下离心10分钟并收集菌体。将收集的菌体重悬于50ml的STM水溶液中进行清洗，在3000rpm下离心10分钟收集菌体；再将菌体重悬于30ml的STM溶液中再次进行清洗，在3000rpm下离心10分钟收集菌体；将菌体重悬于250μl的STM溶液中，每管分装60μl，置于冰浴中备用。

b、电转化重组质粒p18T-KURA3

以重组质粒p18T-KURA3为模板，以表2的URA3-F和URA3-B为引物进行PCR反应，PCR反应体系及反应条件如1中所示，将PCR产物进行酚-氯仿抽提并进行乙醇沉淀，将沉淀溶于去离子水中，测定其浓度。测序鉴定该DNA，其具有如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列。向上述制得的60μl的多形汉逊酵母菌ATCC 26012感受态细胞中电转化10μg的上述DNA，然后将转化产物加入1ml的YPD液体培养基中，在37℃下在250rpm摇床内振荡培养1小时，在3000rpm下离心10分钟收集菌体，用MD液体培养基将收集的菌体清洗2次后，用200μl的SM-Ura液体培养基重悬菌体，最后将菌液均匀的涂布于SM-Ura-5FOA固体培养基上，37℃培养箱内培养3-5天。

c、筛选转化子中的尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌

挑取步骤b中在SM-Ura-5FOA固体培养基上生长的菌落，分别点种于MD和SM-Ura固体培养基上，在37℃下培养48小时，在SM-Ura固体培养基上生长而在MD固体培养基上不生长的菌落则为尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌，其它表型均与多形汉逊酵母菌ATCC 26012相同。利用该方法获得了9个尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌克隆，挑取一个单克隆，命名为NVSI-H.p-24，用于后续试验。

d、鉴定：

I)互补试验

以多形汉逊酵母菌ATCC 26012的总DNA为模板，以URA3-F1和URA3-B2为引物进行PCR反应扩增URA3基因全长，并将该PCR产物转化入上述3之c中所获得的NVSI-H.p-24尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌，获得能够将URA3基因互补的菌株，其在MD培养基上可以生长，从生物学功能上证明上述利用该方法构建的尿嘧啶营养缺陷型菌株即为URA3基因功能缺失的多形汉逊酵母菌突变株。

II)PCR鉴定

提取尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌的总DNA作为模板，以URA3-F和URA3-B为引物进行PCR反应，反应产物由TAKARA公司负责测序，通过同源性比较和序列分析，得知该菌株在SEQ IDNO：14所示的核苷酸序列的第35位碱基发生了点突变，由A突变为G，其所对应的氨基酸也发生了改变。

e、对尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌进行遗传稳定性分析

将上述构建的尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌分别进行液体培养基和固体培养基的传代培养，以验证其是否发生回复突变。

取200μl的NVSI-H.p-24菌液接种于2ml的YPD液体培养基内，在37℃下在250rpm摇床内振荡培养24h，连续转接3次，传代100代以上后，在3000rpm下离心10分钟收集菌体，用MD液体培养基清洗2次，最终用200μl的MD液体培养基重悬菌体，将重悬菌液分别涂布于MD和SM-Ura固体培养基上，在37℃下培养48小时，该菌株在MD和SM-Leu固体培养基上未生长而在YPD、SM-Ura和SM-Ura-Leu固体培养基上都生长，证明尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌未发生回复突变现象，且遗传性比较稳定。

取尿嘧啶单营养缺陷型菌株点种于MD和SM-Ura固体培养基上，在37℃下培养72小时，并连续转接3次，传代100代以上，结果在MD固体培养基上都未生长，在SM-Ura固体培养基都生长，也证明了尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌未发生回复突变现象，且遗传性都很稳定。

f、对尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌进行生物量的检测

将多形汉逊酵母菌ATCC 26012和尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌接种于YPD固体培养基上，用接种环分别挑取大小一致的单克隆菌落于3ml的YPD液体培养基内，在37℃下在250rpm摇床内振荡培养24小时；取2ml菌液接种于20ml的YPD液体培养基内，在37℃下在250rpm摇床内振荡培养24小时，在4500rpm下离心10分钟收集菌体，并重悬于10ml无菌水中清洗，再次以4500rpm离心10分钟收集菌体，并测定菌体的湿重，计算其生物量，结果平均生物量为21.45g/l，而多形汉逊酵母菌ATCC 26012的生物量为22.67g/l，可见尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌与多形汉逊酵母菌ATCC26012在生物量上无明显差异。

4.尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌的构建、鉴定

将2中构建的重组质粒p18T-KLEU2通过电转化的方式转化入3中制得的尿嘧啶单营养缺陷型汉逊酵母菌中，经筛选得到尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌，并进行鉴定，具体步骤如下：

a、尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌感受态的制备

以3中制得的尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌作为出发菌，并且按照3中的步骤1中所述制备尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌感受态细胞。

b、电转化重组质粒p18T-kLEU2

以2中的重组质粒p18T-kLEU2为模板，以表3所述的LEU2-F1和LEU2-B2为引物进行PCR反应，PCR反应体系及反应条件如2中所示，将PCR产物进行酚-氯仿抽提并进行乙醇沉淀，将沉淀溶于去离子水中，测定其浓度。将10μg的DNA经电转化方法转化入尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌感受态细胞内，然后将转化产物加入1ml的YPD液体培养基中，在37℃下在250rpm摇床内振荡培养1小时。

c、突变株的富集

将步骤b中的1ml的菌液接种于20ml的YPD液体培养基内，在37℃下在250rpm摇床内振荡培养12小时，在3000rpm下离心5分钟收集菌体，用MD液体培养基清洗菌体2次，再于20ml MD液体培养基中饥饿培养3小时；加入100μl的50mg/l的制霉菌素进行突变菌株的富集，在37℃下在200rpm摇床内振荡培养15分钟，在3000rpm下离心5分钟收集菌体，用MD液体培养基清洗菌体3次。最后将菌液均匀的涂布于LM-Ura-Leu固体培养基上，37℃培养3-5天。

d、筛选转化子中的尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌株

挑取步骤c中在LM-Ura-Leu培养基上生长的较小的单克隆菌落，分别点种于SM-Ura培养基和SM-Ura-Leu培养基上，在37℃下培养48小时，在SM-Ura培养基不生长而在SM-Ura-Leu固体培养基上生长的菌株则为尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌株。

e、鉴定

I)尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌的鉴定

将步骤d中获得的尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌株接种于2ml的YPD液体培养基内，在37℃下在250rpm摇床内振荡培养12小时，在3000rpm下离心5分钟，用1ml的MD液体培养基清洗2次，然后重悬于500μl的MD液体培养基中，各取100μl分别涂布于YPD、MD、SM-Ura、SM-Leu、SM-Ura-Leu培养基上，在37℃下培养48小时，结果仅在YPD和SM-Ura-Leu培养基上生长，而在MD、SM-Ura、SM-Leu培养基上均不生长，则认为是尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌株。

II)互补试验

以多形汉逊酵母菌ATCC 26012的总DNA为模板，以URA3-F1和URA3-B2为引物进行PCR反应扩增URA3基因全长，以LEU2-F1和LEU2-B2为引物进行PCR反应扩增LEU2基因全长，将URA3和LEU2PCR产物通过电转化方式转入尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型酵母菌株内，转化菌液最终涂布于MD固体培养基上，在37℃下培养3-5天，获得了能够将URA3基因和LEU2基因互补的菌株。从生物学功能上证明了上述利用该方法构建的尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型酵母菌株即为URA3基因和LEU2基因功能缺失的多形汉逊酵母菌突变株。

II)PCR鉴定

提取尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型酵母菌株的总DNA，以其为模板，以LEU2-F1和LEU2-B2为引物进行高保真的PCR反应，扩增出与以PMD19T-KLEU为模板扩增产物大小一致的PCR反应产物，并与以多形汉逊酵母菌ATCC 26012总DNA为模板进行相同方式扩增所得的反应产物进行对比，反应产物由TAKARA公司测序，通过同源性比较和序列分析以及结合电泳结果图，得知该尿嘧啶单缺陷型汉逊酵母菌株的染色体LEU2基因大小由约2400bp变为约1000bp，经测序得知第603位到第1912位共1310个碱基发生了大片段的核苷酸缺失，酵母染色体LEU2部位发生了基因敲除，达到使LEU2基因功能缺失的目的。

f、对尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型汉逊酵母菌株进行遗传稳定性分析

将步骤e中确定的尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌株，接种于2ml的YPD液体培养基内，在37℃下在250rpm摇床内振荡培养24小时，连续转接3次，传代100代以上，最后在3000rpm下离心5分钟，用1ml的MD液体培养基清洗2次，重悬于500μl的MD液体培养基中，各取100μl分别涂布于YPD、MD、SM-Ura、SM-Leu、SM-Ura-Leu培养基上，在37℃下培养48小时，该菌株仅在YPD和SM-Ura-Leu培养基上生长，而在MD、SM-Ura、SM-Leu培养基上均不生长，得知该尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌株遗传稳定性较好。

g、对尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌株进行生物量的检测

将多形汉逊酵母菌ATCC 26012、尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌、和步骤e中确定的尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌分别接种于YPD固体培养基上，用接种环分别挑取大小一致的单克隆菌落于3ml的YPD液体培养基内，在37℃下在250rpm摇床内振荡培养24小时；取2ml的菌液接种于20ml的YPD液体培养基内，在37℃下在250rpm摇床内振荡培养24小时，在3000rpm下离心10分钟收集菌体，并重悬于10ml无菌水中清洗，然后再次在3000rpm下离心10分钟收集菌体，测量菌体的湿重，计算其生物量，结果多形汉逊酵母菌ATCC 26012的生物量为22.67g/l，尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌的生物量为22.33g/l，尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌的生物量为22.45g/l。可见尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌与多形汉逊酵母菌ATCC 26012以及尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌在生物量上无明显差异。

h、对该尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌株进行生长曲线的绘制

如步骤f所述，分别取40μl的菌液接种于4ml的YPD液体培养基内，在37℃下在250rpm摇床内振荡培养，每隔1小时测其OD600吸光度值，以OD600吸光度值作为纵坐标，以时间为横坐标，绘制生长曲线图，结果表明尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌与多形汉逊酵母菌ATCC 26012和尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌在生长曲线上无明显差异。

Claims

1.一种重组多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)，所述多形汉逊酵母菌包含乙肝病毒的L蛋白的编码基因、S蛋白的编码基因和M蛋白的编码基因；

其中，所述多形汉逊酵母菌的染色体上的25SrDNA基因中分别独立地整合有所述的L蛋白的编码基因、所述的S蛋白的编码基因和所述的M蛋白的编码基因，并且所述多形汉逊酵母菌能够表达所述L蛋白、所述S蛋白和所述M蛋白；

其中，所述L蛋白的编码基因的核苷酸序列为如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，并且所述S蛋白的编码基因的核苷酸序列为如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，并且所述M蛋白的编码基因的核苷酸序列为如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；以及

其中，所述多形汉逊酵母菌是通过乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因和β-异丙基苹果酸脱氢酶基因都被阻断的双营养缺陷型多形汉逊酵母构建的。

2.根据权利要求1所述的重组多形汉逊酵母菌，其中，在所述多形汉逊酵母菌中表达的乙肝病毒L蛋白、S蛋白和M蛋白能够组装成乙肝病毒颗粒。

3.一种根据权利要求1-2中任意一项所述的重组多形汉逊酵母菌的制备方法，其包括：

将分别独立地含有L蛋白的编码基因和所述M蛋白的编码基因的第三重组载体和含有S蛋白的编码基因的第四重组载体转化入多形汉逊酵母菌中，以使所转入的所述第三重组载体和所述第四重组载体分别与多形汉逊酵母菌的相应同源序列进行同源重组，从而形成根据权利要求1-2中任意一项所述的重组多形汉逊酵母菌。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述多形汉逊酵母菌为乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因和β-异丙基苹果酸脱氢酶基因都被阻断的多形汉逊酵母。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述第三重组载体含有所述乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因和所述β-异丙基苹果酸脱氢酶基因中的一种；而所述第四重组载体含有所述乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因和所述β-异丙基苹果酸脱氢酶基因中的另一种。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述第三重组载体和所述第四重组载体是通过同一个转化步骤，同时转化入所述多形汉逊酵母菌中的。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其中，在进行所述的转化步骤后，筛选在营养缺陷型培养基上生长的单克隆菌落，从而得到所述的重组多形汉逊酵母菌。

8.根据权利要求3-7中任意一项所述的制备方法，其中，所述第三重组载体具有如图8所示的PUC25-LLM的物理图谱、并且/或者所述第四重组载体具有如图1所示的PUC25-SU质粒的物理图谱。