CN1429908A - 基因重组乙肝病毒表面抗原的基因修饰序列及其产物 - Google Patents

Abstract

本发明对天然乙肝病毒表面抗原全序列(PreS1+PreS2+S)基因中的部分不适合在酵母细胞中翻译氨基酸的DNA编码进行修饰，建立了以切除乙肝病毒天然序列N’末端的多个氨基酸为主要特征的PreS1+PreS2+S DNA序列。以此新的序列构建的基因工程酵母表达株，每升菌液可表达1克以上的新型乙肝表面抗原。该抗原作为疫苗可诱导实验小鼠产生特异性抗Hbs、PreS1、PreS2的抗体。该抗原具有理想的聚合性与稳定性。

Description

基因重组乙肝病毒表面抗原的基因修饰序列及其产物

技术领域

本发明涉及新型基因重组乙型肝炎病毒表面抗原(PreS1+PreS2+S)DNA的序列修饰与重组目的蛋白质的高效表达，及其目的蛋白质的高度特异性和稳定性。

背景技术1、流行病学概况

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染所致的乙型肝炎，是世界范围内严重危害人类健康的传染性疾病。据统计，全球61亿人口中有2.16亿人为乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)携带者，其中78％分布在亚太地区，我国是HBV感染的高发区，约8％-12％的人群(1.2亿左右)为HBsAg携带者，约占全世界HBsAg携带人口的50％。HBV的感染不仅可以引起急、慢性病毒性肝炎，而且还与肝硬化和肝癌的发生、发展有密切的关系。我国慢性肝炎人数超过1000万，其中80％以上为乙肝患者。在肝硬化病人中，60-80％为HBV感染者。约有1/4的HBV携带者将最终发展成为肝硬化和肝癌，每年全世界至少有一百万人因此而死亡。因此，HBV感染在全世界尤其在我国是一个极其严重的公共卫生问题。2、HBV基因结构和功能

乙型肝炎病毒基因组为一部分双链的环状DNA分子，约3200个碱基组成。HBV基因基因组分为S区、C区、P区及X区。S区又分为S、PreS1与PreS2三个基因区。S区(678个核苷酸)、PreS2区(前S2，165个核苷酸)基因数是固定的，分别编码226个和55个氨基酸残基组成的多肽链；而PreS1(前S1)区碱基数在不同亚型有所差别，长度在324-357个核苷酸之间，编码约108-119个氨基酸。C区基因编码HBcAg。P区最长，编码一种依赖RNA的RNA多聚酶。X区基因编码的蛋白功能尚未确定。

S基因区为HBV DNA一个重要的开放读码框架(ORF)，该区依次分为PreS1、PreS2、S三个区段，分别编码HBV的外衣壳蛋白(PreS1、PreS2、HBsAg抗原)。由226个氨基酸组成的S蛋白称为小蛋白(S)，是HBV表面抗原的主要组成部分；由PreS2和S区的281个氨基酸共同组成的蛋白称为中蛋白(M)；由PreS1、PreS2、S区的389-400个氨基酸组成S区大蛋白(L)。S基因区编码蛋白，是装配病毒颗粒的主要成分，也是刺激机体产生中和抗体(或称为保护性抗体)的主要抗原。特别是由PreS2区编码的由55个氨基酸残基组成的多肽，含有丰富的不依赖二硫键的连续抗原决定簇，因而具有比S更强的免疫原性。PreS2还含有人血清白蛋白受体(PHSA-R)，HBV可籍此由多聚血清白蛋白介导吸附于肝细胞表面，这也是HBV嗜肝性感染的重要分子基础。新近大量研究证实，人肝细胞具有PreS1多肽受体，经PreS2-多聚血清白蛋白介导，PreS1区直接与肝细胞膜结合而导致HBV感染的发生。PreS1和PreS2均有阻止HBV入侵肝细胞的作用。

在自然状态下，HBV呈现出具有感染力的约42nm的病毒颗粒称为Dane颗粒，其外膜蛋白作为疫苗的主要成分，因为(1)全部序列是已知的；(2)不具有感染力；(3)可诱导人体产生抗体。3、乙型肝炎的治疗与预防现状：

有关乙型肝炎的抗病毒治疗一直是相关领域研究与开发的热点，并且已经出现了许多化学合成药、天然植物药和生物抗病毒因子如干扰素等药物，但迄今为止，世界范围内抗乙肝病毒的药物和治疗方法都达不到理想效果。因此目前控制乙肝感染与流行的唯一有效措施是接种乙肝疫苗。

目前，所使用的乙肝疫苗分为三代。第一代乙肝疫苗为血液来源的HBsAg主蛋白颗粒，虽然曾经在预防和控制乙型肝炎方面发挥了巨大的作用，但存在着突出的潜在安全性和原料(HBsAg阳性血液)来源限制的问题。1986年美国Merck公司的酵母表达系统基因工程乙肝疫苗的研发成功标志着第二代乙肝疫苗(单S组分基因工程乙肝疫苗)的诞生，随后其他国家(公司)的酵母表达系统或CHO表达系统基因工程单S组分乙肝疫苗也纷纷上市。目前，第一代血源性乙肝疫苗已经在世界上部分国家被禁止使用。第二代乙肝疫苗主要有两类：重组酵母疫苗和重组CHO疫苗。基因重组乙肝疫苗具有与血源性乙肝疫苗相同的效率，免疫原性好，安全性好，90％左右的接种者都能产生保护性抗体，抵抗HBV感染。重组疫苗在世界上广泛应用，在预防和控制乙型肝炎中发挥着重要作用。但在人群预防接种后的统计学证实，约有10％的人群对基因重组乙肝疫苗无免疫应答产生。另外还发现了S主蛋白的免疫逃逸突变株(中国专利，专利号00123612)。

研究表明，HBV表面抗原的PreS区(包括PreS1和PreS2)可能在HBV感染和抗感染的过程中起着重要作用。虽然HBV表面抗原基因S区编码蛋白(HBsAg主蛋白)是装配病毒颗粒外壳的主要成分，也是刺激机体产生保护性抗体的主要抗原，但PreS2肽段含有人多聚血清白蛋白受体(PHSA-R)，HBV可籍此由多聚血清白蛋白介导吸附于肝细胞表面，而人肝细胞上有PreS1多肽受体，经PreS2-多聚血清白蛋白介导，PreS1区直接与肝细胞膜结合而导致HBV感染的发生，这可能是HBV嗜肝性感染的重要分子基础。PreS1和PreS2区肽段上都含有B淋巴细胞和T淋巴细胞激活表位，不但能刺激机体产生针对性的抗体，而且还能激活T淋巴细胞，以细胞免疫反应的方式增强机体抵抗乙肝病毒感染的能力。由PreS2区编码的由55个氨基酸残基组成的多肽，含有丰富的不依赖二硫键的连续抗原决定簇，具有比S更强的免疫原性。有报道证实，在病毒感染过程中，抗PreS的抗体出现早于S抗体，且PreS肽段的存在能增强机体对S蛋白的免疫应答反应。Merck公司1987年申请的一个中国专利(专利号：87100465，1996年7月17日授权)中描述，针对PreS1或PreS2的抗体在体外实验中都具有阻断乙肝病毒与肝细胞之间结合的作用，而单独的抗表面抗原S蛋白(不含PreS区)的抗体则不具有这种功能。

由于以上原因，早在第二代乙肝疫苗上市之前和/或上市之初，各国即已开始研究与开发免疫效力更高的新一代基因重组乙肝疫苗，即第三代疫苗：在重组单S疫苗基础上，增加PreS2和PreS1区段。第三代疫苗将增加疫苗的免疫效率，并有可能实现95％以上的接种者获得免疫力。

目前，美国、日本、英国、以色列、法国、比利时、意大利、新加坡等国家已先后完成了第三代真核系统基因工程乙肝疫苗(PreS1+PreS2+HBs，3S乙肝疫苗)的基础与临床研究，研究结果证实，这种“3S”疫苗在黑猩猩、BALb/c和SWR/J小鼠等实验动物和人群研究中均能产生高于重组单HBs疫苗的抗体水平和T细胞免疫应答；并且可使约75％的对单HBs疫苗不反应的人群产生特异性免疫应答。英国和以色列今年已经正式上市该产品。这种新型的乙肝病毒表面抗原“3S”疫苗的免疫效率已被国际公认。4、基因工程新型乙肝疫苗(HBs+preS1+preS2)序列和表达技术的专利概况

近十余年来，关于新一代基因工程乙肝疫苗的研究与专利非常之多，新一代基因重组乙肝疫苗(HBs+PreS)研究的专利技术主要集中在：

1)HBsAg带有PreS1或PreS2，或同时带有PreS1+PreS2区的乙肝病毒表面抗原(即HBsAg中蛋白或大蛋白)基因序列及其新型疫苗的应用研究；

2)乙肝病毒表面抗原和核心抗原(HbcAg)的融合抗原疫苗；

3)新型重组乙肝疫苗高产量表达系统及工艺；

4)糖基化和表达颗粒的组成及空间构型对免疫效力的影响；

5)各种抗原载体(如脂质体和多肽载体等)和新型免疫佐剂等。

在上述专利中，现有的基因工程单S苗(HBsAg小蛋白)中添加PreS成分是新一代乙肝疫苗研究的核心。已查阅到的国内外公示的涉及到带有PreS的乙肝表面抗原的专利就有300多条，其中涉及PreS区参与乙肝疫苗构建专利达100多条，这些专利主要来自于美国、法国、英国、日本、以色列、中国等。

现仅就国内外对乙肝病毒表面抗原带有PreS区抗原的大或中蛋白疫苗的DNA序列结构的主要代表性专利归纳如下：(1).PreS1+PreS2+S自然全序列。

日本武田公司1988年4月申请的中国专利，专利申请号88102178；

Merck公司1987年1月28日申请的中国专利，申请号87100465；

江西医学院饶伟华1998年8月14日申请的中国专利，申请号98117171；(2).PreS1(糖基化位点之一，PreS1的N端第四个氨基酸突变)+PreS2+S序列；

(Merck公司1993年6月30日申请的PCT专利，专利号WO9401132A1)(3).PreS1(去掉N端第2到第15个氨基酸)+PreS2+S序列；

(Merck公司1987年1月28日申请的欧洲专利，专利号EP0244924B1)(4).PreS1(去掉N端第1到第15个氨基酸)+PreS2+S序列；

(Merck公司1987年1月28日申请的中国专利，申请号87100465)(5).PreS1(缺失N端第1到第20个氨基酸)+PreS2+S序列；

(汪垣等1994年4月25日申请的中国专利，申请号94112133)(6).PreS(第12个氨基酸)+PreS(第14-52个氨基酸)+PreS(第133-145个氨基酸)+S(第

175-400个氨基酸)氨基酸组成序列；

(SmithKline公司1990年7月25日在中国申请的专利，申请号90107172)(7).PreS(第12-52个氨基酸)+PreS(第133-145个氨基酸)+S(第175-400个氨基酸)的重组

序列；

(SmithKline公司1990年7月25日在中国申请的专利，申请号90107172)(8).PreS2+S顺置序列；

(Merck公司1993年6月30日申请的PCT专利，专利号WO9401132A1；

中国预防医学科学院病毒学研究所田淑芳等，专利号93102498)(9).PreS2(糖基化位点之一，PreS2的N端第四个氨基酸突变)+S序列；

(Merck公司1993年6月30日申请的PCT专利，专利号WO9401132A1)(10).PreS1(几到几十个氨基酸的)小肽片段+S序列；

(参见Medeva公司1991年12月19日和1994年6月10日申请的美国专利，专利号

分别为6020167和6022543)(11).PreS2(第120到第146个氨基酸)+S+PreS1(preS1的第21到第47个氨基酸)的倒置重

组序列；

(汪垣等1996年7月4日申请中国专利，申请号96116417)(12).S+PreS1(第21到第47个氨基酸)的倒置重组序列；

(汪垣等1994年3月10日申请的中国专利，申请号94112069；中国预防医学科学院病

毒所田淑芳等2000年8月31日申请的的中国专利，申请号00123612)

在以上抗原序列中，(1)到(10)采用的是(完整或部分缺失的)PreS1+(完整或部分缺失的)PreS2+(完整或部分缺失的)S区的模式；(11)到(12)采取的是将(完整或部分缺失的)PreS1区连接到S区的3’端(即PreS1与S顺序倒置)的模式。

在宿主表达系统上，各专利采取了多种不同的技术路线。归纳主要有酵母细胞系统和CHO系统两种。CHO系统能够使表达抗原的糖基化和空间构型尽量地接近自然状况，从而使之保持比较好的免疫原性，然而其表达量太低一直是工业化过程中的瓶颈。美国Merck公司和一些欧洲公司的诸多研究专利(如中国专利87100465和美国专利4816564)认为酵母细胞也是一个非常好的表达宿主系统，一方面其表达较高，另一方面表达产物的免疫原性也已经被第二代乙肝疫苗所证明(目前世界上使用的第二代基因工程乙肝疫苗大多采用酵母表达系统)。另外，Merck公司在另一些专利中(如中国专利92104291和PCT专利WO9401132A1)正在尝试使用糖基化缺陷型的酵母细胞和使含PreS区的乙肝表面抗原基因的一些糖基化位点突变的方法来改进免疫原性。

上述含PreS区的新型乙肝疫苗构建技术中，无论是酵母或CHO系统，大多采用了质粒或痘苗病毒载体的重组疫苗表达系统，如日本武田公司采用了pGLD LP39-RcT、PGLDLIIP39-RcT等系列载体表达系统；美国Merck公司采用PKHBS等系列质粒重组表达系统，中国科学院生化所构建的重组痘苗表达系统，还有其他各国公司与研究单位采用了经改造的不同质粒。

此外，Scripps Clinic and Research Foundation(美国)(1987年6月20日申请的中国专利，申请号87105411)和纽约血库公司(1987年4月27日申请的中国专利，申请号87102945)采取的是(合成的或重组表达的)PreS区小肽(对应一个或几个B或T淋巴细胞表位的抗原决定族，6个氨基酸以上，50个氨基酸以下)+脂质体载体构建疫苗的方法，其中纽约血库公司认为PreS(第120到174个氨基酸)小肽的免疫效果最好。纽约血库公司还以此为基础建立了一整套PreS1和PreS2抗原抗体测定方法，并制作了相应的试剂盒。

由于采用自然全序列乙肝病毒表面抗原基因来构建第三代基因工程乙肝疫苗的方法存在着表达量太低(日本武田化学工业公司在酵母培养中可得到50毫克/升的目的蛋白表达量只是其中的特例，大部分研究只能达到几毫克/升的表达水平，CHO系统的表达量就更低)，或含PreS区成分太少，或免疫效力太低的问题。有一些研究结果提示，天然PreS区可能会影响整个表面抗原基因在宿主中的表达，或者由于翻译过程和PreS区蛋白酶敏感位点的影响，大部分表达产物中仍然只有很少的PreS区存在。如上所述，一些研究者采用基因修饰及改造技术，经过对前S区部分片段的缺失或部分位点突变的PreS区加上完整或部分缺失的S区、或者将完整或部分缺失的PreS区连接到S区的3‘端(即PreS与S顺序倒置)、或者仅用PreS1或PreS2的部分小肽片段(表达或化学合成)，再以脂质体或其他载体连接作抗原递呈、或者双质粒或多质粒表达，此时甚至可以加上乙肝病毒核心抗原片段或丙丁戊肝病毒的一些抗原等各种方法来解决这一问题。

Merck公司还采用双质粒表达系统来实现实行不同抗原位点组合，并控制不同抗原成分在最终表达颗粒中的比例(如核心抗原和表面抗原的比例，或S抗原和PreS抗原的比例，分别可以从1∶1到20∶1)。辽宁天成生物制药研究所在中国专利01103990中也有类似的做法。

Medeva公司(美国专利6020167和6022543)则以完整的S主蛋白作为颗粒形成和抗原递呈的载体，以融合蛋白的方式将PreS(主要是PreS1)小片段或乙肝病毒核心抗原小片段整合到表达颗粒上而实现其免疫原性，并且通过使表达颗粒空间构型模拟自然乙肝病毒Dane颗粒的方法提高免疫效力。而江西医学院的饶伟华(中国专利98117171)则构建了包含PreS1+PreS2+S全序列的核酸疫苗，据称只须一次接种，免疫保护效果较好；国外有几家公司如Merck也在进行核酸疫苗的研究工作，但核酸疫苗本身的技术还不成熟，还有不少技术问题需要解决。

以上专利中除中国专利93102498表明表达量为2.5毫克/升外，都没有明确披露表达量，并且大多至今未产业化，提示其中尚存在一些没有解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一是提供用于在宿主细胞，特别是真核酵母细胞中高效表达异源重组蛋白质的方法。

本发明的另一目的是提供用于适宜于在宿主细胞，特别是真核酵母细胞中高效表达特异性高、稳定性好、具有更佳免疫效率的新型重组乙型肝炎病毒表面抗原(PreS1+PreS2+S)的DNA基因序列。发明详述一、乙肝表面抗原基因cDNA的扩增及克隆

乙肝病毒分有数种亚型，即adw，adr，ayw和ayr，各型之间的DNA序列稍有差异。本发明的目的是高效表达包含有PreS1，PreS2多肽和S蛋白的乙肝抗原重组蛋白，使其成为新型乙肝疫苗、诊断试剂、治疗药物，故重点是如何表达出具有天然乙肝抗原免疫活性的乙肝表面抗原蛋白分子。

本发明所用的乙肝病毒DNA来自中国乙肝病人血清，经常规PCR方法获得乙肝表面抗原基因cDNA片断，将cDNA片断首先克隆于puc-18载体质粒中，经序列测定确定乙肝表面抗原基因序列。如图1所示。

在此步骤中，图2表示用于放大扩增乙肝表面抗原基因cDNA各片断的多聚核苷酸引物，其中N代表的是用于克隆puc-18载体质粒克隆位点的DNA序列，使用不同组合经PCR反应获得乙肝表面抗原基因各cDNA片断，如图3所示。PCR反应条件为：

94℃ 2’

94℃30”→42℃ 30”→72℃ 60”35

72℃10’→4℃

PCR产物经1.5％琼脂糖胶分离纯化后，克隆于puc-18载体质粒中，转入JM109钙化大肠杆菌敏感细胞，再经PCR测定获得含各cDNA片断的阳性克隆株。

纯化阳性克隆株中的载体质粒DNA，经DNA序列测定后，确认含乙肝表面抗原基因片断的阳性克隆株。图4、图5所示为乙肝表面抗原PreS1+PreS2+S基因序列测序图和序列表。二、构建乙肝表面抗原表达重组体(cassette)

在HBsAg表达及修饰中，糖基化是维持HBsAg免疫原性的重要部分。由于原核细胞，如大肠杆菌，缺乏糖基化功能，不能有效地使表达物糖基化，故HBsAg的表达必须在真核或哺乳动物细胞中表达。本发明选择酵母细胞为表达系统。

构建酵母表达系统重组体(cassette)，选用启动子为甲醇氧化酶的启动子(AOX1)序列，经限制性未端延伸技术，将AOX1基因5端cDNA片断、HBsAg cDNA和AOX13端cDNA片断组装在一起，形成用于转入酵母细胞表达新型带有PreS1+PreS2+ScDNA基因序列的乙肝疫苗的表达复合体，见图6。三、转化筛选乙肝表面抗原表达株

采用改良后的HO在1983年提出的氯化锂方法，将表达复合体融合于酵母菌染色体中。具体方法为：1、制备转化用细胞

取25ml30℃培养至OD600为1.0的细胞液，经无菌蒸馏水洗涤1次，室温1500g离心10分钟，细胞沉淀用TE溶液洗涤1次，室温1500g离心10分钟，再将细胞沉淀悬浮于10ml氯化锂溶液中，30℃培养，2小时取50μl分装于无菌试管中备用。2、转化

取10μg待转化DNA加入到含50μl转化细胞试管中，30℃培养30分钟加入0.3ml含40％聚乙二醇(PEG-3350)的氯化锂溶液，30℃培养30分钟，将转化管放入40℃水溶液中热休克5分钟，离心后加入0.6ml灭菌蒸馏水悬浮细胞，分别取0.1ml，0.2ml和0.3ml接种于YPD琼脂培养基上，30℃培养48小时，可见表面光滑、湿润、圆形的单个白色酵母菌落。3、筛选转化阳性细胞

挑取光滑单个菌落，分别接种琼脂平板上，30℃培养48小时，选择典型菌株，经PCR确定是否含有转化的HBsAg基因，如图7所示。表达HBsAg所使用的启动子是AOX1，在甲醇的诱导下，AOX1基因启动，并开始表达融合在其下方的“3S序列”的HBsAg基因。四、表达具有天然结构活性乙肝表面抗原蛋白

多数表达乙肝表面抗原菌株，不能形成具有天然乙肝表面抗原聚合体结构的产物，又由于PreS多肽对于存在于细胞中的蛋白酶异常敏感，故表达出含有PreS多肽的乙肝表面抗原较为困难。为了达到获得类似天然结构的乙肝表面抗原，修饰PreS区段的蛋白酶敏感区或在纯化过程中加入蛋白酶抑制剂等方法已有众多报道。

本发明选择通过切除编码PreS多肽cDNA5’末端不同区段的DNA片断，保留原始起始编码“met”的编码ATG，连接于后续不同位置的氨基酸编码DNA序列5’未端，形成不同大小的重组乙肝表面抗原cDNA基因序列，通过前述的转化表达及测定，筛选出最佳表达菌株。图8所示的是不同大小cDNA重组表达株所表达的重组乙肝表面抗原和抗S，抗PreS，抗PreS1，抗PreS2抗体反应的ELLSA结果。

经过大量试验，本发明最终确定，切除PreS1第2-14位氨基酸序列、第2-15位氨基酸序列、第2-19位氨基酸序列后形成的重组乙肝表面抗原表达物((^-2？14、^-2？15、^-2？19)PreS1+PreS2+S HBsAg蛋白)具有较好的自然乙肝表面抗原的特性，其中以切除PreS1第2-19位氨基酸序列后形成的重组乙肝表面抗原表达物((^-2？19)PreS1+PreS2+S HBsAg蛋白)具有最接近自然乙肝表面抗原的特性，其DNA序列如图9测序图、图10序列表，其表达物的SDS-PAGE胶图片如图11，其表达物的电镜图片(图12)显示，该重组蛋白可形成类似天然20nm颗粒的多聚体结构。图13为(^-2？19)PreS1+PreS2+S HBsAg蛋白聚合体的免疫电镜照片。

附图说明

图1：经PCR方法获得乙肝表面抗原基因cDNA片断，将cDNA片断首先克隆于puc-18载体质粒中，经序列测定确定乙肝表面抗原基因序列。

图2：用于放大扩增乙肝表面抗原基因cDNA各片断的多聚核苷酸引物，其中N代表的是用于克隆puc-18载体质粒克隆位点的DNA序列。

图3：使用不同组合，经PCR反应获得的乙肝表面抗原基因各cDNA片断。1道为DNA标记；2道为带有衔接子序列的HBsAg cDNA片断；3道为HBsAg S1-S2 cDNA片断，约1250bp；4道为HBsAg S2-S cDNA片断，约850bp；5道为HBsAg S cDNA片断，约670bp。

图4：PreS1+PreS2+S HBsAg DNA序列测序图。

图5：PreS1+PreS2+S HBsAg DNA、蛋白质序列。

图6：用于酵母表达系统多位点融合重组HBsAg表达盒。所述表达盒可以被整合到任何甲基营养型酵母的HIS、LEU2、ARG4、TRP1和URA3基因中。

图7：不同大小cDNA重组表达株的PCR分析。1道为DNA标记；2道为HBsAg S；3道为HBsAg S2+S；4道为S1^-2～19+S2+S；道5为S2+S；道6为S1+S2+S。

图8：不同大小cDNA重组表达株所表达的重组HBsAg和抗S，抗PreS，抗PreS1，抗PreS2抗体反应的ELLSA结果。

图9：^-2至19)PreS1+PreS2+S HBsAg DNA序列测序图

图10：^-2至19)PreS1+PreS2+S HBsAg DNA、蛋白质序列表

图11：^-2至19)PreS1+PreS2+S HBsAg表达物的SDS-PAGE胶照片。第1道：蛋白分子标准；第2道：初培养诱导裂解物；第3、4、5道：三批培养诱导裂解物；第6道：为诱导培养裂解物。

图12：电镜观察纯化重组聚合HBs-preS1-preS2蛋白形态特征的照片，磷钨酸负染色。放大倍数：80000×3。基因工程新型乙肝疫苗纯化聚合蛋白((^-2至19)PreS1+PreS2+SHBsAg)，蛋白颗粒直径大约在30-50nm之间。聚合蛋白呈均匀散在分布，表面不光滑，有绒毛样突起，呈不规则线形分枝状排列，其尖端稍膨大呈小球形。也有散在小颗粒聚合蛋白呈现

图13：免疫电镜观察纯化重组聚合HBs-preS1-preS2蛋白形态特征，磷钨酸负染色。放大倍数：40000×3。基因工程新型乙肝疫苗纯化聚合蛋白((^-2至19)PreS1+PreS2+SHBsAg)，与抗HBs单克隆抗体反应后的电镜形态。图中可见，表面不光滑、有绒毛样突起、呈不规则线形分枝状排列的“3S”重组蛋白，与特异性抗HBs单克隆抗体结合后所形成的免疫复合物，因抗原抗体结合而聚集成密集网状或团块。

图14：重组(^-2至19)PreS1+PreS2+S蛋白(本发明重组蛋白)稳定性试验结果。样品10倍稀释，37℃加速反应。检测间隔时间：2填，37℃观测28天结果。

本发明通过以下实施例进一步加以说明。实施例1：乙肝表面抗原基因cDNA的扩增及克隆

本发明所用的乙肝病毒DNA来自中国乙肝病人血清，经常规PCR方法扩增获得乙肝表面抗原基因cDNA片断，将各cDNA片断首先克隆于puc-18载体质粒中，经序列测定确定乙肝表面抗原基因序列，如图1所示。

在此步骤中，图2所列的是用于放大扩增乙肝表面抗原基因cDNA各片断的多聚核苷酸引物，其中N代表的是用于克隆于puc-18载体质粒克隆位点的DNA序列，使用不同组合经PCR反应扩增获得乙肝表面抗原基因各cDNA片断，如图3所示。PCR反应条件为：94℃ 2分钟；94℃ 30秒→42℃ 30秒→72℃ 60秒，共35个循环周期后，再72℃ 10分钟→4℃。经1.5％琼脂糖胶分离纯化后，克隆于puc-18载体质粒中，转入JM109钙化的敏感大肠杆菌细胞，再经PCR测定获得含各cDNA片断的阳性克隆株。

纯化阳性克隆株中的载体质粒DNA，经DNA序列测定后，确认含乙肝表面基因片断的阳性克隆株，图4、图5所示为乙肝表面抗原PreS1+PreS2+S基因序列测序图和序列表。实施例2：构建乙肝表面抗原PreS1 N端不同位点的氨基酸酶切修饰的乙肝表面抗原表

     达序列与重组体

为筛选并最终获得高效表达具有接近天然乙肝表面抗原蛋白结构与理想的免疫效果，本发明选择毕赤酵母细胞系统为表达系统，分别构建系列修饰酶切的HBV的(^-2、^-2至3、^-2至4、^-2至5、^-2至6、^-2至7、^-2至8、^-2至9、^-2至14、^-2至15、^-2至19)PreS1+PreS2+S的cDNA表达序列，并分别构建酵母-HBV-的(^-2、^-2至3、^-2至4、^-2至5、^-2至6、^-2至7、^-2至8、^-2至9、^-2至14、^-2至15、^-2至19)PreS1+PreS2+S表面抗原表达系统盒(cassette)，选用启动子是甲醇氧化启动子(AOX1)序列，经限制性末端延伸技术，将AOX1基因5’端cDNA片断、乙肝表面抗原cDNA和AOX1 3’端cDNA片断共同组装在一起，形成用于转入酵母细胞的表达复合体，见图6。实施例3：转化与筛选乙肝表面抗原表达株1、采用HO等在1983提出的氯化锂方法，经改良后，将表达复合体融合于酵母细胞染色体中，具体方法为发明详述“三”所述。2、如图7所示，表达乙肝表面抗原所使用的启动子是AOX1启动子。在培养液中存在甲醇的状态下，AOX1启动进而表达融合在其下方的乙肝表面抗原基因。3、ELISA方法鉴定筛选不同酶切修饰构建的系列HBV-的(^-2、^-2至3、^-2至4、^-2至5、^-2至6、^-2至7、^-2至8、^-2至9、^-2至14、^-2至15、^-2至19)PreS1+PreS2+S的酵母系统乙肝表面抗原表达物的特异性和表达量等。不同重组表达株所表达的重组乙肝表面抗原和抗S、抗PreS1、抗Pres2抗体反应的ELLSA结果如图8所示。实施例4：基因修饰表达具有天然结构活性乙肝表面抗原蛋白(^-2至19PreS1+PreS2+S)酵

     母表达系统鉴定

本发明通过去除编码PreS多肽cDNA5’末端不同位置的DNA片断，保留原始起始编码“met”的编码ATG连接于后续不同位置的氨基酸编码DNA，形成不同大小的重组乙肝表面基因，通过前述的转化表达及测定，筛选最佳表达菌株。图8所示的是不同大小重组表达株所表达的重组乙肝表面抗原和抗S、抗PreS1、抗Pres2抗体反应的ELLSA结果。

研究结果证实：

1)本发明所建立的以酶切去除PreS1第2-19位氨基酸((^-2至19)PreS1+PreS2+S(表示切除了PreS1 N端的从2-19序列的氨基酸)乙肝表面抗原酵母表达系统，能够高效表达包含从PreS1 N端第20为氨基酸及后续所有表面抗原成分的蛋白(大于1000毫克/升培养物)；

2)如图11所示，经SDS-PAGE胶证实，(^-2至19)PreS1+PreS2+S抗原蛋白的分子量约为42KD，与天然乙肝PreS1+PreS2+S抗原分子量(42KD)基本一致；

3)具有自然乙肝表面抗原的特性，纯化后的(^-2至19)PreS1+PreS2+S蛋白体外能分别与HBsAg、PreS1、PreS2的单克隆抗体及乙肝病人或健康HBsAg携带者血清发生特异性结合反应，用该抗原免疫实验小鼠，可以诱导小鼠产生高滴度的特异性抗HBsAg、PreS1、PreS2抗体；

4)该表达蛋白具有理想的空间聚合结构，不能通过300万孔径的滤膜；以非变性的大孔径凝胶电泳发现，聚合蛋白分子量大约为360万左右。

5)如图12，电子显微镜下，纯化的聚合蛋白((^-2至19)PreS1+PreS2+S)，蛋白颗粒直径大约在30-50nm之间。聚合蛋白呈均匀散在分布，表面不光滑，有绒毛样突起，呈不规则线形分枝状排列，其尖端稍膨大呈小球形。也有散在小颗粒聚合蛋白呈现。该重组蛋白可形成类似天然颗粒的多聚体结构。图13是(^-2？19)PreS1+PreS2+S蛋白聚合体的免疫电镜照片。该蛋白与特异性抗HBs单克隆抗体结合后所形成的免疫复合物，因抗原抗体结合而聚集成密集网状或团块。

6)该表达产物具有非常理想的稳定性，纯化后的(^-2至19)PreS1+PreS2+S蛋白在37℃温箱中保存28天、其抗原反应性仍没有显著性下降，如图14所示。

主要参考资料1.Sulowska Z.Dworniak D.Tchorzewski H.：The use of flow cytometry for thedetermination of the hepatitis B virus pre-S1 envelop protein binding by humanperipheral blood lymphocytes in vitro in the course of recovery.PolskiMerkuriusz Lekarski.11(61)：32-5，2001.2.Zuckerman JN.Zuckerman AJ.Symington I.，et al：Evaluation of a newhepatitis B triple-antigen vaccine in inadequate responders to currentvaccines.Hepatology.34(4 Pt 1)：798-802，2001.3.Young MD.Schneider DL.Zuckerman AJ.，et al：Adult hepatitis B vaccinationusing a novel triple antigen recombinant vaccine.Hepatology.34(2)：372-6，2001.4.Raz R.Koren R.Bass D.，et al：Safety and immunogenicity of a new mammaliancell-derived recombinant hepatitis B vaccine containing Pre-S1 and Pre-S2antigens in adults.Israel Medical Association Journal：Imaj.3(5)：328-32，2001.5.Yamada T.Iwabuki H.Kanno T.，et al：Physicochemical and immunologicalcharacterization of hepatitis B virus envelope particles exclusivelyconsisting of the entire L(pre-S1+pre-S2+S)protein.Vaccine.19(23-24)：3154-63，2001.6.Tadanori Yamada，Hidehiko Iwabuki，Takashi Kanno.Et al：Physicochemical andimmunological characterization of hepatitis B virus envelope particlesexclusively consisting of the entire L(preS1+preS2+S)protein.Vaccine19(2001)3145-31637.Jones CD.Page M.Bacon A.，et al：T-cell and antibody responsecharacterisation of a new recombinant pre-S1，pre-S2 and SHBs antigen-containing hepatitis B vaccine；demonstration of superior anti-SHBs antibodyinduction in responder mice.Vaccine.17(20-21)：2528-37，1999.8.Le Seyec J.Chouteau P.Cannie I.，et al：Infection process of the hepatitisB virus depends on the presence of a defined sequence in the pre-S1 domain.Journal of Virology.73(3)：2052-7，1999.9.McDermott AB.Cohen SB.Zuckerman JN.，et al：Hepatitis B third-generationvaccines：improved response and conventional vaccine non-response--evidencefor genetic basis in humans.Journal of Viral Hepatitis.5 Suppl 2：9-11，1998.10.Jones CD.Page M.Bacon A.Cahill E.，：Characterization of the T-andB-cell immune response to a new recombinant pre-S1，pre-S2 and SHBs antigencontaining hepatitis B vaccine(Hepagene)；evidence for superior anti-SHBsantibody induction in responder mice.Journal of Viral Hepatitis.5 Suppl2：5-8，1998.11.Pride MW.Bailey CR.Muchmore E.，et al： Evaluation of B and T-cell responsesin chimpanzees immunized with Hepagene，a hepatitis B vaccine containing pre-S1，pre-S2 gene products.Vaccine.16(6)：543-50，1998.12.Dhawan PS.Gill HH.Shah S.，et al：Immunogenicity of hepatitis B vaccinewith pre-S1，pre-S2 and S antigens.National Medical Journal of India.9(4)：201，1996.13.Zoulim F.Capel F.Berthillon P.et al：Clinical and virological evaluationof the detection of pre-S1 and pre-S2 antigens in serum from patients withchronic hepatitis B.Gastroenterologie Clinique et Biologique.19(12)：970-5，1995 Dec.14.Minami M.Okanoue T.Nakajima E.，et al：Significance of pre-S region-defective hepatitis B virus that emerged during exacerbation of chronic typeB hepatitis.Hepatology.17(4)：558-63，1993.15.Wang WL.：Expression and significance of Pre-S1 and Pre-S2 in human primaryhepatic carcinoma(PHC).Chung-Hua Chung Liu Tsa Chih[Chinese Journal ofOncology].14(2)：83-6，1992.16.梁争论：新型乙肝疫苗效率评价  卫生部药品生物制品鉴定所资料汇编2001年17.徐冰：新型乙肝疫苗。《国外医学》预防、诊断、治疗生物制品分册，22(4)：156-158，1999。18.李雪翔译：5ug和10ug重组乙肝疫苗在健康婴儿中的免疫原性和安全性比较研究。《国外医学》预防、诊断、治疗生物制品分册，20(3)：129-130，1997。19.程鲁白译：标准或大剂量s亚单位重组乙肝疫苗与含S亚单位、前S1、前S2颗粒疫苗再接种无应答健康人的比较研究。《国外医学》预防、诊断、治疗生物制品分册，21(1)：30-31，1998。20.潘小虹译：两种重组乙肝疫苗在8-10岁儿童中的免疫原性比较。《国外医学》预防、诊断、治疗生物制品分册，23(6)：270-271，2000。主要参考专利：1.酵母中生产乙型肝炎病毒蛋白质的方法。中国专利号：87100465.8。申请日：1987年1月28日。公告日：1996年7月17日Merck公司2.能形成粒子的复合乙型肝炎病毒表面蛋白。中国专利申请号：92104291.4。申请日：1992年4月28日。公开日：1993年4月7日Merck公司3.Production of vaccines against Hepatitis B virus.欧洲专利公开号：EP0244924B1。申请日：1987年1月28日。公开日：1994年3月23日。Merck公司4.Method for producing nonhyperglycosylated hepatitis B virus protein.欧洲专利公开号：EP0344864A2。申请日：1989年5月31日。公开日：1989年6月12日。Merck公司5.Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast.美国专利号：US4816564。申请日：1986年1月31日。授权日：1989年3月28日。Merck公司6.Vccines comprising yeast-derived hepatitis B virus polypeptides.美国专利号：US5133961。申请日：1987年6月29日。授权日：1992年7月28日。Merck公司7.Multiple hepatitis B virus surface proteins which form particles.PCT专利公开号：WO9219740A1。申请日：1992年4月27日。公开日：1992年11月12日。Merck公司8.Vaccine comprising mixed preS1+preS2+S and core particle.PCT专利公开号：WO9401132A1。申请日：1993年6月30日。公开日：1994年1月20日。Merck公司9.Composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases.美国专利号：US6020167。申请日：1991年12月19日。授权日：2000年2月1日。Medeva公司10.Hepatitis B surface antigen vaccine.美国专利号：6022543。申请日：1994年6月10日。授权日：2000年2月8日。Medeva公司11.Peptide comprising hepatitis B surface antigen.欧洲专利公开号：EP0303578B1。申请日：1988年6月22日。公开日：2001年10月24日。Medeva公司12.前S基因编码的乙型肝炎肽免疫原、疫苗、诊断试剂及合成的脂质囊泡载体。中国专   利申请号：87102945A。申请日：1987年4月27日。公开日：1988年4月20日。纽约血库公司13.Pre-S gene-coded hepatitis B peptides and immunogens and vaccines comprising them.欧洲专利公开号：EP0154902B2。申请日：1985年2月28日。公开日：1999年7月7日。纽约血库公司14.Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunog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                            序列表<110>武汉柏傲生物工程有限公司<120>基因重组乙肝病毒表面抗原的基因修饰序列及其产物<140><141>2002-12-<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1134(核苷酸)<212>cDNA<213>人工序列<223>合成<400>1ATGTTTCCCG ACCACCAGTT GGATCCAGCC TTCAGAGCAA ACACCGCAAA TCCAGATTGGGACTTCAATC CCAACAAGGA CACCTGGCCA GACGCCAACA AGGTAGGAGC TGGAGCATTCGGGCTGGGTT TCACCCCACC GCACGGAGGC CTTTTGGGGT GGAGCCCTCA GGCTCAGGGCATACTACAAA CTTTGCCAGC AAATCCGCCT CCTGCCTCCA CCAATCGCCA GACAGGAAGGCAGCCTACCC CGCTGTCTCC ACCTTTGAGA AACACTCATC CTCAGGCCAT GCAGTGGAATTCCACAACCT TTCACCAAAC TCTGCAAGAT CCCAGAGTGA GAGGCCTGTA TTTCCCTGCTGGTGGCTCCA GTTCAGGAGC AGTAAACCCT GTTCCGACTA CTGCCTCTCC CATATCGTCAATCTTCTCGA GGATTGGGGA CCCTGCGCTG AACATGGAGA ACATCACATC AGGACTCCTAGGACCCCTTC TCGTGTTACA GGCGGGGTTT TTCTTGTTGA CAAGAATCCT CACAATACCGCAGAGTCTAG ACTCGTGGTG GACTTCTCTC AATTTTCTAG GGGGAACTAC CGTGTGTCTTGGCCAAAATT CGCAGTCCCC AACCTCCAAT CACTCACCAA CCTCCTGTCC TCCAACTTGTCCTGGTTATC GCTGGATGTG TCTGCGGCGT TTTATCATCT TCCTCTTCAT CCTGCTGCTATGCCTCATCT TCTTGTTGGT TCTTCTGGAC TATCAAGGTA TGTTGCCCGT TTGTCCTCTAATTCCAGGAT CCTCAACCAC CAGCACGGGA CCATGCCGAA CCTGCATGAC TACTGCTCAAGGAACCTCTA TGTATCCCTC CTGTTGCTGT ACCAAACCTT CGGACGGAAA TTGCACCTGTATTCCCATCC CATCATCCTG GGCTTTCGGA AAATTCCTAT GGGAGTGGGC CTCAGCCCGTTTCTCCTGGC TCAGTTTACT AGTGCCATTT GTTCAGTGGT TCGTAGGGCT TTCCCCCACTGTTTGGCTTT CAGTTATATG GATGATGTGG TATTGGGGGC CAAGTCTGTA CAACATCTTGAGTCCCTTTT TACCGCTGTT ACCAATTTTC TTTTGTCTTT GGGTATACAT TTAA

Claims (15)

1、用基因工程技术构建的编码乙肝病毒表面抗原PreS1+PreS2+S的DNA序列，其中所述DNA序列选自下列序列之一：

(1)缺失了编码PreS1的2-14氨基酸之核苷酸的DNA序列；

(2)缺失了编码PreS1的2-15氨基酸之核苷酸的DNA序列；

(3)缺失了编码PreS1的2-19氨基酸之核苷酸的DNA序列。

2、含有权利要求1的DNA序列的宿主细胞。

3、含有权利要求1的DNA序列的酵母宿主细胞。

4、含有权利要求1的DNA序列的甲基营养型酵母细胞。

5、含有权利要求1的DNA序列的汉逊酵母细胞和毕赤酵母细胞。

6、生产乙肝病毒表面抗原的方法，所述方法包括：

(1)将编码乙肝病毒表面抗原的DNA序列与可以重组至酵母染色体上的酵母质粒组成重组复合体，经多位点融合，融合于酵母细胞染色体上1个或1个以上的特定基因中；

(2)在适宜酵母细胞生长的条件下培养转化的酵母细胞；

(3)从培养的酵母细胞中分离、纯化乙肝病毒表面抗原。

7、生产乙肝病毒表面抗原的方法，所述方法包括：

(1)将权利要求1的DNA序列与可以重组至酵母染色体上的酵母质粒组成重组复合体，经多位点融合，融合于酵母细胞染色体上1个或1个以上的特定基因中；

(2)在适宜酵母细胞生长的条件下培养转化的酵母细胞；

(3)从培养的酵母细胞中分离、纯化乙肝病毒表面抗原。

8、生产乙肝病毒表面抗原的方法，所述方法包括：

(1)将编码乙肝病毒表面抗原的DNA序列与含甲醇氧化酶(AOX1)启动子的DNA片段组成重组复合体，经多位点融合，融合于酵母细胞染色体上1个或1个以上的特定基因中；

(2)在适宜酵母细胞生长的条件下培养转化的酵母细胞；

(3)从培养的酵母细胞中分离、纯化乙肝病毒表面抗原。

9、生产乙肝病毒表面抗原的方法，所述方法包括：

(1)将权利要求1的DNA序列与甲醇氧化酶启动子(AOX1)组成重组复合体，经多位点融合，融合于酵母细胞染色体上1个或1个以上的特定基因中；

(2)在适宜酵母细胞生长的条件下培养转化的酵母细胞；

(3)从培养的酵母细胞中分离、纯化乙肝病毒表面抗原。

10、权利要求6-9的任一方法，其中所述酵母细胞为甲基营养型酵母。

11、权利要求6-9的任一方法，其中所述酵母细胞为汉逊酵母细胞和毕赤酵母细胞。

12、权利要求6-11的任一方法，其中所述酵母细胞染色体上的特定基因是已被确定可用于融合外源性DNA的基因，如：AOX1，HIS4，TRP1等。

13、权利要求6-12任一方法生产的乙肝病毒表面抗原在制备乙肝疫苗中的应用。

14、权利要求6-12任一方法生产的乙肝病毒表面抗原在乙肝治疗中的应用。

15、权利要求6-12任一方法生产的乙肝病毒表面抗原在诊断试剂盒中的应用。

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