NO304268B1 - FremgangsmÕte for fremstilling av et protein med aminosyresekvens som bestÕr av deler av aminosyre-sekvensen til hepatitt B-virus-stort (L) protein, vertscelle transformert med DNA som koder for proteinet, samt anvendelse av et protein eventuelt - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår fremgangsmåte for fremstilling av et

protein med aminosyresekvens som består av deler av aminosyresekvensen til hepatitt B-virus-stort (L) protein, vertscelle transformert med DNA som koder for proteinet, samt anvendelse av et protein eventuelt en proteinpartikkel. Hepatitt B-overflate-L-antigener som fremstilles er modifisert på forskjellige områder av kodingssekvensen under forandring og forøkning av deres biologiske aktivitet.

Hepatitt er en sterkt utbredt, alvorlig infeksjonssykdom som kan forårsakes av forskjellige agenser. Én viktig årsak er blitt identifisert som hepatitt B-virus (HBV) et lite virion med diameter ca. 43 nm inneholdende et egenartet genom, som består av en dobbelt-kjedet DNA-sirkel på 3200 basepar med en enkeltkjedet åpning på ca. 200 basepar. Infeksjon med dette virion resulterer i en akutt, noen ganger fatal sykdom. 85% av angrepne personer kommer seg etter ca. 3 måneders sykdom, ca. 1% lider av akutt nekrose av levervev, hvilket resulterer i død innen et kort tidsrom, og ca. 10% lider av gjentatte utbrudd av sykdommen. Ca. 4% av de infiserte personer utvikler en kronisk bærertilstand med øket risiko for primært hepatocellulært karsinom eller levercirrhose. Infeksjon oppstår oftest via perinatal eller parenteral transmisjon av infeksiøse virioner, f.eks. under blodoverføringer eller ved anvendelse av forurensete injeksjonssprøyter eller -spisser, eller ved seksuell kontakt. Det er derfor et påtrengende behov for pålitelige diagnostiske hjelpemidler for påvisning av HBV og for en vaksine som kan beskytte mennesker med høy utsettelses-risiko, såsom ektefeller til kroniske bærere, reisende til områder med høy HBV-endemisitet, nyfødte barn av kroniske bærere, homo-seksuelle, prostituerte og rusgiftmisbrukere som bør kunne anskaffes med små omkostninger. Videre er det i land i den tredje verden behov for en rimelig vaksine for masseimmuniseringsprogrammer.

I tillegg til viruspartikler som består av kjerne (HBcAg)- og kapsel- eller overflate (HBsAg)-antigenproteiner som omslutter det sirkulære, delvis dobbeltkjedete DNA-genom, kan blodet hos infiserte individer inneholde vesentlige mengder HBsAg-partikler som inneholder overflateantigenproteinet og vertslipider. Disse partikler er blitt renset fra humant serum og utformet som vaksiner som er blitt vist å gi beskyttelse overfor HBV-infeksjon (Szmuness et al., 1980).

I denne patentsøknad er det referert til visse publikasjoner ved at den første forfatter og årstallet for publikasjonen anføres i parentes. Full sitering av disse referanser oppregnet ifølge deres alfabetiske rekkefølge kan man finne i slutten av beskrivelsen.Beskrivelsene av disse publikasjoner i sin helhet er medtatt i denne patentsøknad som referanse for en mer fullstendig beskrivelse av teknikkens stand.

Fremstilling av vaksiner fra serumavledet HBsAg er blitt hemmet ved den begrensete tilførsel av infisert blod og ved behovet for gjennomgåelse av lang og streng utprøving for å sikre fjerning og/eller inaktivering av potensielle infektiøse stoffer.

Hepatitt B-virus (HBV)-infeksjoner i mennesker er forbundet med forekomsten i serum av forskjellige strukturer som bærer hepatitt B-overflateantigenet (HBsAg) [Tiollais et al, Nature,17:489 (1985)] . I tillegg til infektiøse virioner er trådaktige og sfæriske partikler med diameter 22 nm (som inneholder ca. 100 hylsterproteiner) tilstede, som er dannet ved sammenknytting av vertsavledete lipider med de tre hepatitt-overflateproteiner: hovedproteinet (S), mellomproteinet (M) og det store (L) protein.

Disse proteiner deler kodonene for den samme sekvens av226aminosyrer på HBV-genomet, kjent som S-protein-kodingssekvensen. Hele aminosyrekodingssekvensen som ligger umiddelbart foran S-proteinkodingssekvensen på HBV-genomet, omtales i det foreliggende som preS-kodingssekvensen. PreS-kodingssekvensen koder for en 55 aminosyre-sekvens som ligger umiddelbart foran S-proteinet, kalt preS2-området, og, avhengig av virus-undertypen, enten en 108 eller119 aminsyresekvens som ligger umiddelbart foran preS2-området, kalt preSl-området.

Hele preS-kodingssekvensen koder således for 163 (55 preS2 + 108 preSl) aminosyrer i ay-undertyper og for 174 (55 preS2 + 119

preSl) aminosyrer i de fleste ad-undertyper. Sekvenssammenlikninger mellom preS-kodingssekvensene i genomene hos ad- og ay-isolater har vist at de første 11 kodoner for preSl-området hos ad-isolater ikke er tilstede i ay-undertyper. I overensstemmelse med den generelt antatte nomenklatur, følges kodon- og aminosyrenummereringen for ad-undertyper gjennom hele denne patentsøknad, hvilket betyr at HBV-genomer hos ad-isolater koder for et preS-område på 174 aminosyrer nummerert fra 1 til 174, mens 163 aminosyre-preS-området hos ay-undertyper er nummerert fra 12 til 174.

Hovedproteinet (S) kodes for ved 226 aminosyre-kodon-S-genet og finnes i glykosylerte og ikke-glykosylerte former.

Mellomproteinet (M) innbefatter preS2-området og S-proteinet (M-protein: 55 pluss 226 aminosyrer). M-proteinet er et glykoprotein som finnes i to former ifølge omfanget av glykosylering [Stibbe et al, J. Virol., 46:626-628 (1983)]. De 55 aminosyrer som kodes for ved preS2-området, er hydrofile og inneholder en immunodominant epitop som befinner seg på overflaten av hylstergenet (restene 132-137). Denne epitop er disulfidbinding-uavhengig og angitt å være mer immunogen enn epitoper i S-proteinet [Neurath et al., Science, 224:392-394 (1984); Neurath et al., Nature, 315:154-156 (1985)]. PreS2-sekvensen inneholder også en reseptor for polymerisert humant serumalbumin (pHSA) [Machida et al, Gastroent., 86:910-918 (1984)]. Denne reseptor kan også binde monomert HSA og kan formidle tilhefting av HBV til hepatocytter, som også har en reseptor for pHSA. Det er blitt antydet at slik binding kunne føre til toleranse eller autoimmune reaksjoner hos mennesker.

Det store protein (L) innbefatter preSl-området, preS2-området og S-kodingssekvensen (L-protein: 108 (eller 119) pluss 55 pluss 226 aminosyrer). Det er tilstede i glykosylert og ikke-glykosylert form. L-proteinet har variabel lengde i henhold til undertypen, f.eks. 389 og 400 aminosyrer langt for henholdsvis ay- og ad-undertypene. PreSl-translasjonsproduktet inngår også ved tilhefting av HBV til hepatocytter.

På grunn av at promotoren for de S- og M-spesifikke transkripter er innesluttet i den åpne leseramme for L-proteinet, kan transformering av pattedyrsceller med DNA som koder for den komplette åpne leseramme for L-proteinet, resultere i syntese av alle de tre overflateproteiner. I pattedyrsceller utsondres HBsAg-partikler [Tiollais et al, omtalt ovenfor]. I pattedyrsystemer bevirker ekspresjon av L-protein inhibering av utsondring av HBsAg-partikler [se f.eks. Ou et al., J. Virol., 61:782 (1987)]. Dette fenomen er blitt antydet å ha forbindelse med tilstedeværelsen av en N-myristoylgruppe på L-proteinet, hvilket bevirker interferens med knoppskytings- eller utsondringsprosessen [Persing et al., Science, 234:1388-1391 (1986); Persing et al., J. Virol., 61:1672-1677

(1987)] .

Av bekvemmelighetshensyn med hensyn til henvisninger, viser følgende tabell A DNA-kodingssekvensene og aminosyresekvensene for preSl-, preS2- og S-områdene i HBV-proteinene omtalt i det foreliggende. Aminosyrenumrene er over kodonene i parentes og er nummerert fra det første ATG-kodon som finnes innenfor den åpne leseramme for hylsterproteinene funnet i HBV-adw-isolatsekvens som ble subklonet på plasmid pRIT10616. Siden de første 11 kodoner for denne ad-sekvens ikke er tilstede i noen av ekspresjonskassettene som er beskrevet ved den foreliggende patentsøknad, er disse sekvenser ikke oppgitt i tabell A. Plasmid pRIT10616, oppbevart i E. coli K12 stamme 600, er deponert ved American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA under adkomstnummer ATCC 39131.

Virustranskripsjonsinitieringssignaler i posisjon 5' i forhold til translasjonsinitieringskodonene regulerer ekspresjonen av hver av preSl-, preS2- og S-proteinene in vivo. Ved translasjon i pattedyrcellen kan proteinene være glykosylert, hvilket resulterer i et sett overflateantigener som vist i følgende tabell.

Siden DNA-sekvensen i det overflateantigen-kodende område ble kjent, er det blitt gjort flere forsøk på å danne S-protein ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi. Burrell et al., (1979) og Murray et al., (1980) såvel som flere andre forskere rapporterte ekspresjonen av HBsAg i E. coli. Valenzuela et al., (1982) rapporterte ekspresjonen av HBsAg i gjærceller. Etter sprenging av gjærceller transformert med en vektor inneholdende den S-proteinkodende sekvens under kontroll av gjæralkoholdehydrogenase I-promotoren, kunne sfæriske partikler som inneholdt HBsAg observeres som er lik dem som finnes i sera hos individer infisert med HBV. I europeisk patentsøknad 0 226 846 (Tschopp et al.) er fremstilling av HBV S-protein i gjærcellen Pichia beskrevet. Proteinsyntesen er under kontroll av et regulerende område som reagerer overfor metanol.

Skjønt vaksiner som inneholder utelukkende S-antigen-partikler vanligvis er meget beskyttende (Szmuness et al., 1980), reagerer imidlertid noen verter dårlig overfor slike preparater. For å over-vinne denne uforutsigbare svikt ved vaksinasjonen, er det blitt utviklet systemer for ekspresjon av preS2-protein og preSl-protein. PreS2 er kjent å være enda mer immunogent enn S-protein. Ved immunisering av mus med subviruspartikler som bærer preS2- og S-spesifikke epitoper, overgår f.eks. antistoffresponsen overfor preS2 anti-S-responsen (Milich et al., 1985). Videre er det blitt observert at immunisering med preS2-holdige partikler også kan gi en anti-S-respons. Det er nylig blitt gjort rede for preSl- og preS2-proteiners rolle ved immunisering og spesifisiteten når det gjelder T- og B-celleoppfattelse av HBV-overflateantigenproteiner (Milich, 1988, med referanser deri). Valenzuela et al. (1985) beskriver ekspresjonen av hele den preS2-proteinkodende sekvens i gjær transformert med et plasmid inneholdende de tilsvarende virussekvenser. Det skal bemerkes at ved gjærcelletranskripsjon må initieringen styres av gjærcellepromotorer som går forut for det respektive kodingsområde, siden virustranskripsjonsinitieringssignalene i HBV-ORF ikke oppfattes av gjærcelletranskripsjonssystemet.

Itoh et al. (1986) og andre beskriver også ekspresjon av preS2-proteinet i gjærceller og sammensetting til partikler. Dehoux et al. (1986) beskriver ekspresjon av et 39 kD preSl-protein i gjær og angir at dette settes sammen til partikkelform. En rapport av Imamura et al. (1987) beskriver ekspresjon i S. cerevisiae både av preS2-proteinet og preSl-proteinet. Disse forfattere angir at det store protein ble funnet som et relativt stabilt, ikke-glykosylert produkt med molekylvekt 42 kD som ikke lett kunne settes sammen til partikler.

Glykosylering av overflateproteinene dannet i gjær S. cerevisiae er forskjellig fra glykosylering observert i naturlig forekommende partikler isolert fra individer infisert med HBV. S-proteinet er ikke glykosylert, mens preS2-proteinet og preSl-proteinet er dannet i N-bundne glykosylerte og ikke-glykosylerte former. N-bundne kjeder av typen med høyt innhold av mannose ble identifisert, såvel som O-bundet (O-bundne) oligosakkaridkjede(r)

(Itoh et al., 1986; Langley et al., 1988).

Ekspresjon av HBV-overflateantigen i pattedyrsceller er også blitt utført. Michel et al. (1984) beskriver syntese av HBsAg i ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO)-celler transfektert med et plasmid som bærer preS2-proteinkodingssekvensen. Persing et al.

(1985) beskriver ekspresjon av tre HBsAg-beslektete polypeptider på 24 000, 27 000 og 35 000 dalton i muse-L-celler transformert med en preS2-protein-kodende sekvens. De tre oppnådde polypeptider kan organiseres til komplekse immunreaktive HBsAg-partikler med diameter ca. 22 nm.

McLachlan et al. (WO88/06185) rapporterte angående ekspresjonen av forskjellige HBV-beslektete proteiner i virveldyrceller. Imidlertid hemmes ekspresjonen av preS-antigen i pattedyrceller vanligvis ved det faktum at sekresjon av HBsAg-partikler inhiberes på grunn av relativ overproduksjon av preSl-protein i forhold til S-protein (Ou et al., 1987). Videre kan ikke forholdet mellom de forskjellige S-beslektete proteiner reguleres. Videre er dyrkning av animalske celler en kostbar fremgangsmåte som resulterer i høye omkostninger for det oppnådde produkt.

Skjønt vaksiner som for tiden er beskrevet og i anvendelse, har stor effektivitet, reagerer en viss prosentandel personer som får slike vaksiner, spesielt immunkompromitterte personer, f.eks. hemodialysepasienter, enten ikke eller langsomt overfor disse [se f.eks. Hadler et al., New Engl. J. Med., 315:209-215 (1986), og Bruguera et al., Post Grad. Med. J. , 63:155-158 (1987)].

Det er således behov på området for fremgangsmåter og blandinger som er egnet for fremstilling av ytterligere effektive vaksiner mot HBV.

Det beskrives en mikroorganisme som er relevant for foreliggende oppfinnelse valgt fra gruppen metylotrofe gjærslekter, som bærer A) mer enn én kopi av en ekspresjonskassett (ecl) som koder for et første polypeptid, og/eller én eller mer enn én kopi av en ekspresjonskassett (ec2) som koder for et andre polypeptid, og eventuelt dessuten én eller flere enn én ekspresjonskassett (ec3) som koder for et tredje polypeptid, eller B) én kopi av en ekspresjonskassett (ecl) som koder for et første polypeptid, og én eller mer enn én kopi av en ekspresjonskassett (ec2) som koder for et andre polypeptid, eventuelt dessuten én eller mer enn én ekspresjonskassett (ec3) som koder

for et tredje polypeptid,

hvor ekspresjonskassettene omfatter:

a) et regulon R som reagerer overfor metanol og/eller uttømmelse av katabolittundertrykkende karbonkilder; b) en åpen leseramme som koder for hele, eller en del (eller deler) av et protein med biologisk aktivitet som ett av hepatitt B-overflateantigenene; c) eventuelt en DNA-sekvens som tjener som transkripsjonsterminator T;

hvor R utøver kontroll når det gjelder transkripsjonen av den åpne leseramme og T styrer polyadenylering og/eller terminering av transkripsjon av en dannet mRNA.

Fordelen ved ovennevnte er at det er tilveiebragt en måte til oppnåelse av komposittpartikler som inneholder forskjellige andeler av preS- og S-protein, hvorved fremstilling av disse komposittpartikler i stor målestokk blir mulig med lave omkostninger. Ifølge et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringes det en fremgangsmåte for fremstilling av et protein med aminosyresekvens som består av deler av aminosyresekvensen til hepatitt B-virus-stort (L) protein (ad eller ay subtype) hvor aminosyresekvensen til proteinet består enten av: a) restene 12-52, etterfulgt av restene 133-145, etterfulgt av restene 175-400 av det nevnte L-proteinet, eller b) resten 12, etterfulgt av restene 14-52, etterfulgt av restene 133-145, etterfulgt av restene 175-400 av det nevnte L protein,

som erkarakterisert ved:

(i) fremstilling av en ekspresjonsvektor omfattende en DNA sekvens som koder for nevnte protein operativt forbundet med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser i stand til å dirigere ekspresjon av nevnte DNA sekvens samt inneholdende en seleksjonsmarkørkodende sekvens, (ii) transformering av en vertscelle med nevnte vektor, eventuelt med en rekombinant DNA vektor som er i stand til å uttrykke proteinet i form av en komposittpartikkel samtidig med S-proteinet av hepatitt B-oveflateantigen, (iii) dyrking av nevnte vert i et passende dyrkningsmedium og isolering av nevnte protein eventuelt av en proteinpartikkel med blandet subenhet-sammensetning fra cellelysatet eller ekstraktet av nevnte dyrkningsmedium.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en komposittpartikkel som inneholder minst to polypeptider svarende til hele, eller en del av et protein med biologisk aktivitet som et hepatitt B-overflateantigen, hvor partikkelen oppviser minst to antigene determinanter tilveiebragt av S-proteinet, preS2-proteinet eller preSl-proteinet som beskrevet i krav 1, og hvor partikkelen eventuelt videre omfatter vertsspesifikke lipider.

Følgende betegnelser som er anvendt gjennom hele beskrivelsen, er definert som følger: En "ekspresjonskassett" er definert som hvilket som helst atskilt område av DNA som funksjonerer i en vertscelle som en komplett genekspresjonsenhet.

En "komplett genekspresjonsenhet" er et strukturelt gen og promotoren og de regulerende områder som fordres for dets transkripsjon og translasjon.

Et "funksjonelt DNA-kodende område" vil si en DNA-kodende sekvens som, når den er sammensmeltet i fase til den S-proteinkodende sekvens, ikke innvirker på sammensetningen av en blandet HBsAg-partikkel.

Et "funksjonelt derivat" betyr en kodende sekvens med amino-syreforandringer som ikke innvirker på partikkeldannelsen og som bevarer immunogenitet eller annen funksjonalitet. Slike funksjonelle derivater kan fremstilles ved vanlig områdespesifikk mutagenese eller ved andre standardteknikker.

En "vektor" er definert som DNA som kan bære og opprettholde et DNA-fragment som koder for et protein som fremstilles ifølge oppfinnelsen, innbefattende f.eks. fager og plasmider. Disse betegnelser forstås av fagfolk på genteknologiområdet.

Oppfinnelsen, som omfatter ytterligere gjenstander, vil nå bli mer detaljert beskrevet ved følgende beskrivelse, eksempler og figurer.

Det henvises nå til figurene:

Fig. 1: Konstruksjon av plasmid pME4 ut fra pHARSl. HARS1-fragmentet er blitt overført til enkelt-PvuII-området på det tidligere pHARSl, sekvensen mellom den tidligere posisjon på HARS og beta-laktamase-genet såvel som 5'-enden av selve beta-laktamasegenet er blitt utelukket. Fig. 2: Skjematisk representasjon av lambda-fager som bærer genome Hansenula polymorpha DNA-fragmenter omfattende

a) MOX-genet

b) FMD-genet

Fig.3: Kart over plasmid pT-24. Dette plasmid inneholder et DNA-fragment som omfatter terminatoren for MOX-genet klonet i Smal-området i pUC19-multippelformåls-kloningsområdet. Fig.4:Kart over plasmid pRB-S-269 og pRB-S-271 som uttrykker S-genet under kontroll av henholdsvis MOX- eller FMD-promotoren. Fig. 5: Kart over plasmidene pBC, pMS-2, pFS-9. Sistnevnte to plasmider stammer fra pBC som inneholder Hansenula polymorpha URA3-genet ved innføring av ekspresjonskassetter inneholdende MOX-promotoren (pMS-2) eller FMD-promotoren (pFS-9) i den URA3-gen-kodende sekvens. Fig.6: Kart over plasmid pHK2. Dette plasmid inneholder et kanamycin-gen (avledet fra Tn5) under kontroll av ADH1-promotoren fra Saccharomyces cerevisiae. Dessuten omfatter plasmid pHK2 HARS1-sekvensen. Fig.7: Kart over plasmidene pRB-S-322 og pRB-S-326. Den funksjonelle enhet som består av kanamycinresistensgenet og ADH1-promotoren som tilstede på plasmid pHK, ble innsatt i HARS-områdene i plasmid pRB-S-269 og pRB-S-271. Fig. 8: Konstruksjon av pMPS-22 fra pMOX-P/Tl. PreS-genet fra hepatitt B-virus ble innsatt i EcoRI-området på plasmid pMOX-P/Tl. I det resulterende plasmid pMPS-22 reguleres preS-genet ved MOX-promotoren. Fig. 9: Kart over plasmid pMPS-9. For konstruksjon av dette plasmid ble preS-ekspresjonskassetten fra pMPS-22 innsatt mellom Xhol- og Stul-området i Hansenula-fragmentet i det opprinnelige plasmid pBC. Fig.10: Kart over Hansenula polymorpha URA3-genet og nabo-DNA- områder. Fig.11: En skjematisk tegning som illustrerer strukturen av plasmid pMPT121, hvor fremmede gensekvenser kan innsettes under regulering av MOX-promotoren. Fig.12: En skjematisk tegning som illustrerer strukturen av plasmid pKL<*>l inneholdende en ekspresjonskassett for L<*->protein under regulering av MOX-promotoren. Fig. 13: En skjematisk tegning som viser trinnene for konstruksjon av et E. coli-plasmid som innbefatter en Glyl3-deletert L-protein-ekspresjonskassett, pRIT12998. Fig. 14: En skjematisk tegning som illustrerer fremgangsmåten for oppnåelse av et gjærcelleplasmid pRIT12979 som kan uttrykke et Glyl3-deletert L-protein. Fig. 15: En skjematisk tegning som illustrerer konstruksjonen av plasmidet pRIT13191 inneholdende kodingssekvensen for et L-protein deletert for aminosyrer 53-132 og 146-174. Fig. 16: En skjematisk tegning som illustrerer konstruksjonen av gjærcelleekspresjonsplasmider pRIT13192 og pRIT13193 inneholdende ekspresjonskassettene for henholdsvis L<*->og AGly L<*->proteinene.

Vertscellen i henhold til et andre aspekt ved oppfinnelsen kan være hvilket som helst medlem av en metylotrof gjærcelleslekt som er transformert med DNA omfattende en sekvens som koder for et protein som definert i krav 1. Vertscellen kan ha blitt manipulert til å bære mer enn én kopi av en ekspresjonskassett ecl og eventuelt én eller flere enn én ekspresjonskassett ec2 og/eller eventuelt én eller flere enn én ekspresjonskassett ec3 eller minst én ekspresjonskassett av to eller flere forskjellige typer. Ekspresjonskassettene behøver bare være forskjellige i beskaffenheten når det gjelder det kodete protein som skal uttrykkes, og omfatter vanligvis følgende komponenter: a) Et regulon R som reagerer overfor metanol og/eller uttømming av katabolittundertrykkende karbonkilder. Betegnelsen

"regulon" som anvendt gjennom hele patentsøknaden, omfatter hvilken som helst cis-virkende DNA som inngår ved regulering av ekspresjon av et gitt strukturelt gen. Betegnelsen innbefatter således sekvenser som går forut for en gitt kodingssekvens, f.eks. en promotor og sekvenser som oppfattes av transkripsjonsfaktorer eller andre proteiner som inngår i transkripsjonsreguleringen. Betydningen av betegnelsen "regulon" er således ikke begrenset til sekvenser som svarer til kjente promotorer. DNA-sekvenser som oppviser samme responsivitet overfor metanol som kjente reguloner for metanolinduserbare gener, dvs. alle funksjonelt ekvivalente sekvenser.

Flere reguloner som oppviser de ovenfor angitte egenskaper, er nylig blitt kjent. F.eks. beskriver Ledeboer et al.(1985) den regulerende DNA-sekvens som går forut for metanol-oksydase (MOX)-strukturgenet hos Hansenula polymorpha. I EP 85 201 235.0 tilhørende Unilever NV, er det beskrevet et system for ekspresjon av proteiner, som innbefatter anvendelse av promotorene som regulerer ekspresjonen av metanol-oksydase og DHAS in vivo. I EP 87 110 417 tilhørende Rhein Biotech GmbH er det foreslått et system egnet for ekspresjon av fremmede proteiner under regulering av formiatdehydro-genasepromotoren (FMD). Ellis et al. (1985) beskriver isolering av metanolregulerbare gener fra Pichia pastoris. Disse og andre promotorer som fås eller kan fås fra gener hos metylotrofe gjærceller, som potensielt inngår ved metanolutnyttelse, har alle felles at de reagerer enten overfor tilsetting av metanol og/eller uttømming av en karbonkilde med forøket syntese av det respektive gen som reguleres av disse. Også innbefattet er alle DNA-sekvenser som oppviser samme responsivitet.

b) En åpen leseramme (ORF) som koder for en del (deler) eller hele proteinet med biologisk aktivitet som ett av hepatitt

B-overflateantigenene. Som allerede nevnt, omfatter hepatitt B-overflateantigener av gitt undertype et sett på ca. seks forskjellige proteiner, som er forskjellige når det gjelder lengde og glykosyleringsmønster. Disse proteiner oppviser

forskjellige antigene determinanter og ser også ut til å ha forskjellige funksjoner for det levedyktige virus. For frem-kallelse av en preS-immunrespons er det ikke nødvendigvis påkrevd å tilveiebringe den respektive komplette preS-sekvens, men det kan være tilstrekkelig å medta bare de kodoner som koder for den aktuelle epitop, i den åpne leseramme. Videre innbefatter et protein med biologisk aktivitet som ett av hepatitt B-overflateantigenene, også proteiner som har gjennomgått utbyttinger av aminosyrer som ikke innvirker på deres biologiske aktivitet.

c) Eventuelt en DNA-sekvens som tjener som terminator T. Som terminator kan anvendes hvilken som helst sekvens som effektivt avslutter transkripsjonen i den respektive vertsorganisme. Terminatorer kan f.eks. være sekvenser som har tendens til å gi dannelse av hårnålsstrukturer og/eller polyadenyleringsområder i transkribert RNA. Ved en foretrukket utførelsesform stammer terminatoren fra et metanolresponsivt gen i samme organisme og/eller fra samme gen som regulonet kom fra.

De tre komponenter anordnes i operabel binding for at regulonet skal bli istand til å regulere transkripsjonen og terminatoren til å avslutte transkripsjonen av den åpne leseramme mellom dem.

Mikroorganismen som beskrevet over har den uvurderbare fordel at, på grunn av tilstedeværelse av mer enn én kopi av en ekspresjonskassett som koder for et første polypeptid og/eller én eller mer enn én kopi av de forskjellige tilleggs-ekspresjonskassetter, kan transkripsjon og translasjon av det kodete protein (de kodete proteiner) skje i sterkt forøkte mengder. Mikroorganismen tilveiebringer muligheten til oppnåelse av hvilket som helst forhold mellom et første og et andre polypeptid i cellen. Således kan det ved sammensetting av protein under dannelse av partikler, oppnås komposittpartikler med hvilken som helst sammensetning. På grunn av dannelsen av store mengder av forskjellige proteiner i umiddelbar nærhet av hverandre, er det videre mer sannsynlig at disse proteiner danner partikler omfattende mer enn én polypeptidtype enn partikler kjent på området.

Mikroorganismen som beskrevet heri uttrykker fortrinnsvis hele, eller en del av, S-proteinet fra en første ekspresjonskassett (ecl) siden denne utgjør det strukturelle utgangspunkt for hvilken som helst partikkel som vil kunne dannes. Mikroorganismen kan videre inneholde en andre ekspresjonskassett (ec2) som uttrykker et polypeptid som representerer hele, eller en del av preSl-proteinet, f.eks. de preSl-spesifikke områder som er lokalisert i den N-terminale ende av dette protein, eller hele eller en del av preS2-proteinet. Mikroorganismen kan eventuelt inneholde tre forskjellige typer ekspresjonskassetter, slik at samtidig ekspresjon blir mulig når det gjelder tre polypeptider omfattende hele, eller en del av, S-proteinet, hele eller en del av preSl-proteinet og hele eller en del av preS2-proteinet.

Videre muliggjør anvendelse av reguloner som stammer fra metylotrof gjær, opphevelse av undertrykkelse eller induksjon av en cellekultur ved tilsetting eller uttømming av en karbonkilde eller ved tilsetting av metanol, som er billig å anskaffe.

Gruppen av metylotrofe gjærarter omfatter medlemmer av følgende slekter: Candida, Kloeckera, Saccharomyces, Rhodotorula, Torulopsis og Pichia, fortrinnsvis Hansenula. Ved den mest foretrukkete utførelsesform fås en mikroorganisme ifølge den foreliggende oppfinnelse blant Candida boidinii, Pichia pastoris eller Hansenula polymorpha. Gjær fra disse slekter er velkjente for fagfolk på området, og deres generelle dyrknings- og vekstbetingelser er etablerte.

En egnet stamme av den foretrukkete metylotrofe gjær Hansenula kan være hvilken som helst stamme av arten Hansenula polymorpha. Ved den mest foretrukkete utførelsesform har stammen som skal anvendes, de identifiserende karakteregenskaper tilhørende Hansenula polymorpha RB 10 (DSM 5215). RB 10 er en ura3-mutant av Hansenula polymorpha ATCC 3443 8.

Ved en foretrukket utførelsesform kan mikroorganismen ifølge den foreliggende oppfinnelse effektivt utnytte glycerol som karbonkilde. Glycerol er en ikke-katabolittundertrykkende karbonkilde som omdannes til energi med forskjellig effektivitet ved hjelp av kjente metylotrofe gjær. Gjærarter av slekten Hansenula kan metabolisere glycerol med høy effektivitet, mens S. cerevisiae vokser dårlig på denne karbonkilde. Dessuten resulterer vekst av Hansenula polymorpha på glycerol i meget liten etanol-biproduksjon, som ellers forårsaker problemer ved fermentering i stor målestokk.

Regulonene som anvendes for ekspresjonskassettene stammer fortrinnsvis fra gjær av de velkjente slekter nevnt ovenfor. Reguloner som er blittkarakterisertdetaljert, er foretrukket, såsom det regulerende område fra forskjellige metanolreagerende gener i Hansenula polymorpha, f.eks. metanoloksydasegenet, FMD-genet, DAS-genet eller katalasegenet. De regulerende områder hos mesteparten av disse gener er allerede sekvensbestemt og sekvensene publisert (f.eks. Janowicz et al., 1985; Ledeboer et al., 1985,

EP 87 110 417). Den tekniske fremgangsmåte for isolering av disse reguloner fra passende mikroorganismer lettes ved kjennskapet til de respektive DNA-sekvenser og tilsvarende restriksjonsmønstre.

Som terminator kan hvilken som helst sekvens inntas som effektivt tjener til å avslutte den begynnende mRNA uansett om den stammer fra et eukaryot eller prokaryot gen. Foretrukkete terminatorer stammer fra gjærcellegener. Anvendelse av termina-torsekvenser som fås fra de metanolreagerende gener angitt ovenfor, er mest foretrukket.

Det er en annen fordel ved vertscelle-mikroorganismen ifølge den foreliggende oppfinnelse at et overraskende høyt antall ekspresjonskassetter kan innføres i den respektive vertscelle og opprettholdes stabilt. Vanligvis er det to muligheter til oppnåelse av stabil opprettholdelse av spesifikk genetisk informasjon: Informasjonen er enten kodet kromosomalt, eller den er lokalisert på en autonomt repliserende vektor, som kan være et plasmid, et kosmid, et virus eller liknende. Normalt tilveiebringes høyere gendoseringer ved transformasjon av den ønskete vertsorganisme under anvendelse av høyt kopiantall av autonomt repliserende plasmider eller lysogene virus. Disse plasmider eller virus er velkjente på området og inneholder vanligvis et replikon og et selektivt markørgen som gjør mulig replisering og stabil opprettholdelse av vektoren. Imidlertid er virus ofte utsatt for omdannelse til lytiske sykluser, og plasmider har tendens til å tapes under visse betingelser og fordrer videre ofte kontinuerlig seleksjons-press. Videre kan det, selv med plasmider med høyt kopiantall, vanligvis ikke fås et kopiantall på mer enn ca. 50-75 i gjærceller. På den annen side fordrer innføring av ønsket genetisk informasjon, f.eks. en ekspresjonskassett, i vertsgenomet normalt en viss grad av homologi mellom minst en del av DNA-sekvensen som skal innsettes, fortrinnsvis endene av dette molekyl, og innsettingsstedet. Således er antallet potensielle integreringssteder for homolog rekombinering av et gitt molekyl begrenset, i de fleste tilfeller til bare ett. Dette antall er litt høyere for homolog rekombinering med gener som er tilstede i multiple kopier eller med transposon-liknende strukturer såsom Ty (Jacobs et al., 1988). For aktivering av det integrative rekombineringsfenomen er det foretrukket å anvende vektorer som mangler et replikon, men som bærer et selektivt markør-gen, som gir den transformerte celle en påvisbar fenotypisk egenskap og gjør mulig identifikasjon under selektive betingelser.

Tilfeldig rekombinering er normalt et sjeldent observert fenomen. Det er imidlertid mulig å innføre tallrike kopier av hvilken som helst gitt DNA-sekvens i én eller flere kromosomer i genomet, ved innsetting etter tilfeldig rekombinasjon. For oppnåelse av transformanter som bærer så mange som noen hundre kopier av den ønskete DNA-sekvens, er det foretrukket å anvende autonomt replikerende plasmider for transformasjon, som ved samtidig integrasjon av en del kopier og replikasjon av andre kan gi en stor samling av integrerbare kopier, som innsettes under etterfølgende cellesykluser. Det var overraskende nok mulig å oppnå metylotrofe gjærstammer som bærer mange ekspresjonskassetter.

Foretrukkete gjærstammer, såsom gjærstammer av slekten Hansenula, inneholder ca. 2-500, fortrinnsvis 15-200, særlig 20-150 kopier av en ønsket DNA-sekvens. Når det ønskete antall integrerte ekspresjonskassetter er oppnådd, kan ytterligere integrerings-prosesser forhindres ved vekstsykluser på ikke-selektivt medium under utskillelse av de gjenværende plasmidkopier.

Et spesielt trekk ved vertsceller ifølge den foreliggende oppfinnelse er fenomenet multimer integrering. Etter transformasjon med en vektor som er istand til autonom replikasjon, ble Hansenula polymorpha funnet å integrere flere repeterende enheter av plasmidet som ble anvendt for transformasjon. Repeteringer på opptil ca. 10 0 kopier av det innførte plasmid ble observert. Dette muliggjør tilstedeværelse og integrering av et høyt antall kopier av fremmede DNA-sekvenser uten at cellens levedyktighet kommer i fare ved innsetting i essensielle gener. Integrerte materialer som inneholdt multimer DNA ble overraskende vist å være stabile.

For det formål å utforme vaksiner som inneholder komposittpartikler, er et konstant forhold mellom de forskjellige polypeptider i partiklene ønskelig. For å møte dette behov, tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse vertsceller med en selektert andel av forskjellige ekspresjonskassetter. F. eks., kan en mikroorganisme ifølge den foreliggende oppfinnelse bære mellom 1 og100 kopier av en ekspresjonskassett (ecl) som koder for hele, eller en del av et protein med biologisk aktivitet som S-protein, og én kopi eller flere kopier av en ekspresjonskassett (ec2) som koder for et protein med biologisk aktivitet som preS2- eller preSl-protein.

Foretrukkete mikroorganismer som bærer en forholdsmessig andel på fra mellom 2 kopier av ecl til 1 kopi av ec2, til 30 kopier av ecl til 1 kopi av ec2, mer spesielt i forholdet 5-10 kopier av ecl til 1 kopi av ec2 eller 6-8 kopier av ecl til 1 kopi av ec2. En tredje ekspresjonskassett kan innføres i samme forhold som ec2 eller 6-8 kopier av ecl til 1 kopi av ec3.

I tillegg til muligheten for fremstilling av stammer inneholdende integrerte kopier av ekspresjonskassetten, er det også mulig å anvende mikroorganismer som inneholder autonomt replikerende vektorer omfattende autonomt replikerende sekvenser (ARS) og den ønskete ekspresjonskassett. Tilstedeværelse og opprettholdelse av vektorer som inneholder ARS, er velkjent på området.

Gjenstander som er relevante for den foreliggende oppfinnelsen er også DNA-molekyler som inneholder en ekspresjonskassett (ecl) som koder for et første polypeptid, og en ekspresjonskassett (ec2) som koder for et andre polypeptid og/eller en ekspresjonskassett (ec3) som koder for et tredje polypeptid, hvor ekspresjonskassettene omfatter

a) et regulon R som reagerer overfor metanol og/eller uttømming av katabolittundertrykkende karbonkilder; b) en åpen leseramme som koder for en del (eller deler) av et protein, eller hele proteinet, som har den biologiske aktivitet som ett av hepatitt B-overflateantigenene; c) eventuelt en DNA-sekvens som tjener som terminator T;

hvor R utøver kontroll av transkripsjonen av den åpne leseramme, og

T styrer polyadenylering og/eller terminering av transkripsjon av den dannete mRNA.

Når det gjelder egenskapene hos regulonet, den åpne leseramme

og terminatoren, refereres det til den ovenfor tilveiebragte informasjon. Når det gjelder disse molekyler, er det også foretrukket at både regulon og terminator stammer fra en metylotrof gjær valgt fra slektene Candida, Kloeckera, Saccharomyces, Rhodotorula, Torulopsis, Pichia og Hansenula. Ved den mest foretrukkete utførelsesform stammer regulonet og terminatoren fra et gen som inngår ved metanolutnyttelsen, f.eks. MOX-genet, FMD-genet, DAS-genet eller katalasegenet. Hansenula polymorpha er en foretrukket mikroorganisme som kilde for disse gener. Når det gjelder identiteten av polypeptidene kodet for ved ecl, ec2 og ec3, refereres det til forklaringen som er gitt ovenfor.

DNA-molekylet kan bestå av fragmenter fra de respektive naturlige kilder. DNA som koder for hver av hepatitt B-overflate antigenene, kan isoleres fra DNA fra intakte virus, også kalt Dane-partikler. Isolering, kloning og sekvensbestemmelse av HBV-virion-DNA er beskrevet i Charnay et al., (1979), Galibert et al., (1979), Sninsky et al. (1979), Valenzuela et al. (1979).

Valget av restriksjonsenzymer for kloning og DNA-raanipulering avhenger av hvilken undertype hepatitt-virus som anvendes. Undertypene er ikke bare forskjellige i lengde, men også når det gjelder deres individuelle restriksjonsmønstre som er underkastet normale mutasjoner. Det er mulig for enhver fagmann på området å identifi-sere restriks jonsfragmentet som bærer det ønskete kodingsområdet, f.eks. ved at man spalter den isolerte DNA under anvendelse av forskjellige sett restriksjonsendonukleaser, underkaster prøvene gel-elektroforese og "Southern blotting" eller ekvivalente metoder og identifiserer restriksjonsfragmentet under anvendelse av en probe som svarer til en kjent overflategensekvens. Hvis nødvendig, kan DNA sekvensbestemmes og manipuleres videre, f.eks. ved behandling med endonukleaser, in vitro-mutagenese, primer-reparering eller andre kjente teknikker for dannelse av et fragment med ønsket størrelse, som bærer den ønskete sekvens og har de hensiktsmessige termini. Som kjent for enhver fagmann på området, kan terminiene trimmes slik at de får hvilken som helst ønsket sekvens ved fordøying med ekso-nukleaser, innfylling med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I og tilsetting eller erstatting av DNA ved anvendelse av syntetiske oligodeoksyribonukleotider som koplinger og adaptere.

DNA-sekvensen som koder for det respektive hepatitt B-overflateantigen, kan så ytterligere kombineres med et hensiktsmessig regulon og/eller terminator, som fås ved kjente teknikker fra genomet i en metylotrof gjær. De respektive fragmenter tilpasses overens-stemmende, for at de skal være i egnet posisjon i forhold til translasjonsinitieringskodonet og translasjonstermineringskodonet i den kodende DNA-sekvens. Ligering utføres også i henhold til kjente fremgangsmåter. Siden disse metoder er velkjente på området, gis det ingen ytterligere forklaringer. For detaljert beskrivelse av teknikker anvendt ved molekylær kloning kan man slå opp i "Molecular Cloning" av Maniatis et al. (1982).

Istedet for å ligere DNA-sekvenser isolert utelukkende fra de respektive naturlige kilder, er det også mulig å syntetisere en del av, eller hele den ønskete ekspresjonskassett ved hjelp av kjemisk syntese. Kjemisk syntese kan utføres i henhold til kjente fremgangsmåter. Kjemisk syntese av lange oligodeoksyribonukleotider tilbys allerede på kommersiell basis. Videre kan hvilken som helst kombinasjon av fragmenter syntetisert kjemisk og fragmenter fra den respektive naturlige kilde være hensiktsmessig for den foreliggende oppfinnelses formål.

En ytterligere gjenstand relevant for foreliggende oppfinnelse er tilveiebringelse av URA3-genet som fås fra en metylotrof gjær. Genet er blitt identifisert ved komplementering av den tilsvarende pyr F-mutasjon av E. coli-stamme MB 1000 med plasmider konstruert ved tilfeldig innsetting av Hansenula polymorpha-restriksjons-fragmenter i en egnet vektor. Det ble identifisert et plasmid som utfylte mangelfullheten ved mottakerstammen. Det nylig identifiserte gen omfatter ca. 1400 bp ved måling på agarosegeler. Dets restriksjonsmønster er vist på fig. 10 nedenfor.

For å lette konstruksjonen, utvidelsen og innføringen av ekspresjonskassetten i vertsmikroorganismen, er det tilrådelig å innsette denne på en vektor som er egnet for transformasjon av en metylotrof gjær. Denne vektor kan enten være et lineært eller sirkulært plasmid eller et virus. Det er mulig å anvende såkalte integrative vektorer, dvs. vektorer som mangler enhver autonomt replikerende sekvens (ARS). Hvis disse vektorer ikke integreres, vil de tapes under etterfølgende cellesykluser.

Ved én foretrukket utførelsesform omfatter vektoren også slike ARS DNA-sekvenser som kan styre autonom replikasjon. Fortrinnsvis stammer disse sekvenser fra den respektive vertsmikroorganisme. Når det gjelder metylotrof gjær, er det beskrevet flere ARS, f.eks. HARS og PARS (Roggenkamp et al., 1986; Cregg et al., 1985). Disse sekvenser inneholder et område av DNA som funksjonerer slik at vektoren opprettholdes stabilt som en ekstra kromosomal helhet inne i vertscellen.

For å lette identifikasjonen av transformerte vertsorganismer, er det videre foretrukket å tilveiebringe selektive markørgener egnet for seleksjon av den ønskete mikroorganisme etter transformasjon. I gjærplasmider kjent på området svarer disse selektive markørgener ofte til DNA-sekvensene som koder for enzymer som inngår ved aminosyre- eller nukleinsyremetabolismen, som er defekte i mottaksvertsorganismen som skal transformeres.

Den samme strategi kan anvendes ved seleksjon av transformerte metylotrof gjær. Gener som vanligvis anvendes for seleksjon av auxotrofiske Saccharomyces cerevisiae- stammer, innbefatter LEU2-, HSI3-, TRP5-, ARG4- og URA3-genene. Gener fra Saccharomyces cerevisiae kan også anvendes som selektive markører ved transformering av metylotrof gjær; imidlertid kunne veksten av slike transformanter på minimalt medium svekkes i betydelig grad. Ved en foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse transformeres derfor metylotrofe gjærstammer som har mangelfullhet ved funksjonen av hvilket som helst gen som inngår ved normal metabolisme, med et DNA-molekyl som bærer et homologt villtype-markørgen. Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer for første gang et homologt markørgen for seleksjon når det gjelder transformanter i Hansenula polymorpha, nemlig URA3-genet. Dette gens karakteregenskaper, dvs. dets restriksjonsfragmentmønster, er omtalt ovenfor.

Som en alternativ måte til utvelgelse av transformanter kan det anvendes antibiotisk resistensgener. Dette er en velkjent fremgangsmåte for bakteriell transformasjon og er blitt vist å være anvendbar for S. cerevisiae (Jimenez og Davies, 1980).

Når det gjelder metylotrofe gjær er imidlertid hittil intet kjent angående deres oppførsel ved kontakt med antibiotika såsom kloramfenikol eller gentamycin G418. Dette antas å være den første rapport angående seleksjon av transformert metylotrof gjær ved at denne underkastes selektive konsentrasjoner av vekstinhiberende aminoglykosid-antibiotika etter transformasjonsprosessen. Aminoglykosidfosfotransferasen fra Tn5 (Grindley, 1980) kunne overraskende vises å være aktiv også når det gjaldt metylotrof gjær når det ble regulert ved en promotor fra bakegjær. Inaktivering av G418 er også effektivt for stammer hvor bare én eller to kopier av genet er tilstede i cellen, dvs. at genet ikke fordres i et høyt antall kopier. Ifølge den foreliggende oppfinnelse er dette et meget effektivt transformasjons/seleksjonssystem i metylotrof gjær.

Ved den mest foretrukkete utførelsesform er vektoren valgt blant vektorene pMS-2, pFS-9, pRB-S, pRB-S-269, pRB-S-271, pRB-S-322, pRB-S-326, pMPS22, pMPS21, pMPS9. Konstruksjonen og anvendelsen av disse vektorer vil bli mer detaljert beskrevet nedenfor.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for fremstilling av et protein som beskrevet ovenfor, hvor en metylotrof gjærcellevertsorganisme kan transformeres med en vektor som bærer ekspresjonskassettene ecl og/eller ec2 og/eller ec3, og hvor, ved replikasjon av vektoren, i det minste en del av ekspresjonskassettene integreres ved rekombinasjon med kromosomet i gjærcelle-vertsorganismen, fortrinnsvis som en multimer repeterende enhet. Som en følge av dette kan den transformerte metylotrofe organisme inneholde flere kopier av hvilken som helst innført ekspresjonskassett dispergert over hele genomet, men også med stor sannsynlighet for at multimere repeterende enheter av ekspresjonskassettene er lokalisert i ett område av genomet. Denne type rekombinasjon er funnet å oppstå særlig i Hansenula. Imidlertid kan den metylotrof gjærsoppverts-organisme også utvelges fra hvilke som helst andre typer metylotrofe gjærslekter, f.eks. Candida, Kloeckera, Saccharomyces, Rhodotorula, Torulopsis og Pichia.

Ved den mest foretrukkete utførelsesform er vertsorganismen valgt fra arten Hansenula polymorpha, eksemplifisert ved en stamme med de identifiserende karakteregenskaper hos Hansenula polymorpha RB 10. Hansenula polymorpha RB 10 ble deponert i "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen" 17. februar 1989 og fikk adkomstnummer DSM 5215.

Skjønt det er foretrukket å utføre transformasjonen ved anvendelse av hvilken som helst av de ovenfor beskrevne vektorer, vil man forstå at andre vektorer kan konstrueres og anvendes.

For oppnåelse av mikroorganismer inneholdende mer enn én kopi av en ekspresjonskassett (ecl) og eventuelt én eller flere enn én kopi av en andre ekspresjonskassett (ec2), er følgende fremgangsmåte som omfatter flere trinn, den mest hensiktsmessige måte. Ifølge fremgangsmåten blir den metylotrofe vertsorganisme a) transformert med en første vektor og i begynnelsen dyrket på seleksjonsmedium, fulgt av inkubering under ikke-selektive betingelser i flere generasjoner, b) mitotisk stabile transformanter inneholdende mer enn én ekspresjonskassett (ecl) som koder for et første polypeptid, velges, c) transformantene befris eventuelt for rester av autonomt replikerende plasmider, d) transformantene transformeres eventuelt med en andre vektor og dyrkes igjen initielt på selektivt medium, fulgt av inkubering under ikke-selektive betingelser i flere generasjoner, e) mitotisk stabile transformanter inneholdende mer enn én ekspresjonskassett (ecl) som koder for et første polypeptid, og eventuelt én eller mer enn én ekspresjonskassett (ec2) som koder for et andre polypeptid, velges, f) transformantene befris eventuelt for rester av autonomt replikerende plasmider, trinnene fra d) til

f) gjentas eventuelt under anvendelse av en tredje vektor.

Ifølge denne fremgangsmåte er det mulig å øke antallet ekspresjonskassetter av én type, f.eks. ecl, ved at cellene underkastes flere etter hverandre følgende sykluser med transformasjon, vekst under selektive/ikke-selektive betingelser, utvelgelse av transformanter og eventuelt befrielse for frie plasmider. Alternativt kan to eller flere typer ekspresjonskassetter innføres ved at det enten anvendes en enkelt vektortype som inneholder to eller flere forskjellige ekspresjonskassetter, eller ved at cellene underkastes de ovenfor beskrevne sykluser, hvor transformasjon utføres ved anvendelse av forskjellige vektorer, som bærer forskjellige ekspresjonskassetter. Fremgangsmåten tilveiebringer således mange forskjellige muligheter for oppnåelse av en ønsket mikroorganisme.

En gjenstand er også en komposittpartikkel omfattende minst to polypeptider som svarer til en del av et protein, eller et helt protein, som har biologisk aktivitet som hos ett av hepatitt B-overflateantigenene, hvor partiklene fremviser minst to antigene determinanter tilveiebragt av S-proteinet, preS2-proteinet eller preSl-proteinet, idet partikkelen eventuelt inneholder vertsspesifikke lipider. Vanligvis er partiklene dannet av hoveddelen av et protein med de antigene karakteregenskaper hos S-proteinet, som også utgjør fra ca. 80 til 90% av naturlig forekommende 20 nm-partikler. Komposittpartiklene kan videre omfatte enten hvilket som helst protein som har preSl-protein-spesifikke områders antigenisitet, dvs. peptider som svarer til i det minste en del av de N-terminale 108 (eller 119) aminosyrer i preSl-protein, eller/og hvilket som helst protein som har preS2-spesifikke områders antigenisitet, dvs. peptider som svarer til i det minste en del av det preS2-spesifikke området på 55 aminosyrer.

Tilstedeværelsen av to eller flere forskjellige proteiner med biologisk aktivitet som hepatitt B-overflateantigener i én partikkel, er en ny fremgangsmåte for utforming av gjæravledet anti-hepatitt B-vaksine. Gjæravledete partikler eller aggregater oppnådd hittil inneholder utelukkende enten S-proteinet, eller preS2-proteinet eller preSl-proteinet, dvs. bare ett av de tre mulige proteiner. Skjønt det er blitt vist av Valenzuela et al. (1985) og Itoh et al. (1986) at preS2-protein er sammensatt til partikler, er preSl-protein rapportert å danne enten en blanding av små partikler (med diameter 2 eller 3 nm) eller en polydispergert populasjon av store aggregater med diameter ca. 15-50 nm (Knuskern et al., 1988, Imamura et al., 1987).

Rutgers et al. (1988) rapporterer at på preS2-protein- og preSl-protein-partikler eller -aggregater, er de S-protein-kodete epitoper maskert siden disse partikler er mindre reaktive i AUSRIA-analysen. Dette kan ha skadelig effekt på immunresponsen med hensyn til S-proteinet når partikler som består av homogene preS-proteintyper anvendes som immunogener for vaksineformål.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således for første gang komposittpartikler som omfatter mer enn én type hepatitt B-overflateantigen. Analogt med partikler som omfatter bare ett protein dannet i S. cerevisiae, vil partiklene ifølge den foreliggende oppfinnelse normalt omfatte vertsspesifikke lipider.

Ved en foretrukket utførelsesform omfatter komposittpartiklene fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse mer enn 1% preSl-protein, idet resten av proteinet er S-protein og eventuelt en del preS2-protein. Foretrukkete partikler inneholder imidlertid 1-50%, særlig 1-25%, preSl-protein, idet resten er det samme som ovenfor. Ved særlig foretrukkete utførelsesformer er forholdet mellom preSl-protein og S-protein mellom 1:1 og 1:100, fortrinnsvis 1:2, 1:8 eller 1:15.

Partiklene fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse er i det minste delvis glykosylert. En andel av preSl-proteinene i metylotrofe gjær er glykosylert, som angitt ved påvisningen av bånd med molekylvekt på 4 5 kD, 3 8 kD og 3 9 kD. En fagmann på området vil være klar over at antallet og størrelsen av preSl-proteintypene observert ved "immunoblotting", kan representere en viss åpenbar variabilitet. Påvisning av båndene på 45, 38 og 39 kD vil blant annet avhenge av deres oppløsing under polyakrylamidgelelektroforese, interferens av andre gjærproteiner og variasjoner i effektiviteten av fremgangsmåtene anvendt ved immunoblotting. Videre vil fremgangsmåten som velges for fremstilling av ubearbeidete celleekstrakter og den spesifikke sammensetning av bufferen som anvendes for ekstraksjon, også kunne påvirke påvisningen av et spesielt bånd. De relative andeler av de tre typer kan også variere med vekstbetingelsene. Videre er beregninger av molekylvekt også underlagt forsøksvariasjoner og avhenger av standardene som anvendes for kalibrering. Glykosylering av S-protein er ikke blitt observert.

Komposittpartiklene som er beskrevet ovenfor, fremstilles hensiktsmessig ved dyrkning av en metylotrof gjærstamme ifølge den foreliggende oppfinnelse i et egnet dyrkningsmedium. Ved anvendelse av et regulert ekspresjonssystem kan syntesen av partikkel-komponenter reguleres for å hindre at ekspresjonen av dem påvirker celleveksten. Ved hvilken som helst ønsket celletetthet kan således undertrykkelse av metanol-regulonregulert proteinsyntese oppheves slik at ekspresjon av det heterologe protein blir mulig. Ved koordinert ekspresjon av forskjellige typer hepatitt B-overflateantigener som er i umiddelbar nærhet av hverandre, skjer det partikkeldannelse. Disse partikler kan isoleres fra kulturen ved hjelp av velkjente teknikker, f.eks. isopyknisk sentrifugering, kromatografi og andre fremgangsmåter kjent på området.

Den samme fremgangsmåte kan også anvendes for oppnåelse av partikler eller aggregater som bare omfatter én type overflateantigen, når hensiktsmessige stammer anvendes.

Ved en foretrukket utførelsesform starter proteinsyntese styrt ved ekspresjonskassetten ved uttømming av undertrykkende karbonkilder. Cellene, som tidligere er blitt underkastet katabolitt-undertrykkelse, starter ekspresjon ved fortynning av det undertrykkende middel. Virkningen av opphevelse av undertrykkelse kan ytterligere forsterkes ved tilsetting av metanol, hvilket resulterer i innføring av et metanolresponsivt regulon. Tilsetting av metanol resulterer i opp til 10 gangers forøkning av heterolog proteinsyntese .

Ved en foretrukket utførelsesform inneholder dyrkningsmediet glycerol som karbonkilde. Glycerol er en karbonkilde med minimal katabolittundertrykkende effekt. Glycerolkonsentrasjoner på opptil0,3% bevirker ikke undertrykkelse. Ved anvendelse av et dyrkningsmedium som inneholder glycerol, må derfor ikke denne karbonkilde fjernes fullstendig før eventuell tilsetting av metanol.

Fermentering av vertscellene ifølge den foreliggende oppfinnelse utføres ved mellom 3 0 og 40°C under anvendelse av et medium som holdes ved pH fra 3-7, fortrinnsvis ved pH fra 4-6. Eksempler på

medier er oppgitt nedenfor.

Ifølge foreliggende oppfinnelse kan komposittpartikkelen omfatte hvilket som helst av de modifiserte L-proteiner beskrevet nedenfor.

Ved en spesielt foretrukket utførelsesform svarer det fremstilte modifiserte L-protein til et polypeptid med 280 aminosyrer inneholdende restene 12-52 fulgt av restene 133-145, fulgt av restene 175-400 i forhold til ORF på et HB-virus av ad-serotype.

Ved enda en ytterligere foretrukket utførelsesform av denne oppfinnelse kan komposittpartikkelen som fremstilles inneholde hepatitt B-overflateantigenpolypeptider av forskjellige undertyper for utvidelse av beskyttelsesområdet. Det vil si at S-proteinet kan være av ad-undertypespesifisitet og preSl-proteinet og/eller det modifiserte L-protein og/eller preS2-proteinet av ay-undertype, eller omvendt.

Den nye komposittpartikkel eller hepatitt B-overflateantigen-protein fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse kan inngå i en materialsammensetning. Ytterligere komponenter i blandingen kan være stabilisatorer, buffersubstanser, fortynningsmidler, salter såsom NaCl, eller sukkerarter.

Som angitt ovenfor, er formålet å tilveiebringe en vaksine mot hepatitt B-virus. En komposittpartikkel som beskrevet ovenfor, eller hepatitt B-overflateantigen fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse er derfor en gjenstand for den foreliggende patentsøknad. Vaksinen kan omfatte ytterligere substanser, f.eks. salter, stabilisatorer, hjelpestoffer og/eller andre fysiologisk tilfreds-stillende additiver. Vaksinen omfattende komposittpartikler frembringer dannelse av antistoffer som er rettet mot minst to av de mulige antigene determinanter hos hepatitt B-overflateantigener. På grunn av tilstedeværelsen av preSl-spesifikke og preS2-spesifikke områder, kan til og med individer som ikke har reagert overfor vaksiner som for tiden er tilgjengelige, beskyttes mot hepatitt B-infeksjon. Vanligvis vil vaksinen fremkalle en bredere immunrespons enn nåværende vaksiner og kan videre fremstilles med lavere omkostninger på grunn av det store ekspresjonsomfang pr. celle og den høye celletetthet.

Den foreliggende oppfinnelse omhandler også en anvendelse av proteinet eller en partikkel med blandet subenhet-sammensetning fremstilt ifølge ethvert av kravene 1-2, for utvikling av et reagens eller et forsøkssett. Ved tilveiebringelse av en blanding omfattende komposittpartiklene fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse er det mulig å styre dannelsen av immunkomplekser dannet mellom antistoffer hos et infisert individ og slike partikler. Forsøkssettet fordrer videre tilveiebringelse av et påvisningsmiddel, f.eks. et geit/anti-humant IgG-antistoff merket ved hvilken som helst av de kjente teknikker. Antistoffet, som selvfølgelig også kan stamme fra hvilket som helst pattedyr, kan f.eks. koples til et enzym eller merkes radioaktivt for at påvisning skal kunne skje. Fordelen ved et forsøkssett som er reaktivt overfor antistoffer mot preSl- og preS2-spesifikke områder, er muligheten for tidlig påvisning av HBV-infeksjon, siden anti-preSl- og anti-preS2-antistoffer viser seg før anti-S-antistoffer under HBV-infeksjon hos mennesker (Petit et al., 1986). Således tilveiebringer forsøkssettet anvendt ifølge oppfinnelsen en hensiktsmessig måte for tidlig diagnostisering av denne sterkt infektiøse sykdom.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et modifisert stort overflateprotein (i det følgende kalt modifisert L-protein) i hepatitt B-virus (HBV). Ett slikt modifisert L-protein har en L-proteinsekvens som erkarakterisert vedfravær av seter som fortrinnsvis angripes av proteaser. Eliminering av disse seter gir et mindre proteasesensitivt molekyl, som ved ekspresjon gir et protein som lett kan renses i partikkelform.

Et annet aspekt ved den foreliggende oppfinnelse er fremstilling av et modifisert L-proteinkarakterisert vedfravær av en aminosyre som er nødvendig for myristylering av proteinet.

Ved enda et annet aspekt innbefattes et modifisert L-protein som erkarakterisert vedfravær av flere potensielle glykosyleringsseter. Eliminering av glykosyleringen av L-proteinet forbedrer presentasjonen av epitoper som er skjermet, fordreid eller modifisert ved glykosylering av proteinet som skjer under ekspresjon i gjærverter. Det modifiserte, deglykosylerte L-protein presenterer de beskyttende B-epitoper og betydelige TH-epitoper i preSl-, preS2-og S-området i deres riktige konformasjon, godt avdekket på overflaten av den resulterende partikkel.

Et ytterligere aspekt ved den foreliggende oppfinnelse innbefatter fremstilling et modifisert L-proteinkarakterisert veden utelukkelse av en del av preS2-området, som innbefatter bindings- setet for humant serumalbumin (pHSA). Denne modifikasjon av L-proteinet eliminerer derved den potensielle toleranse eller autoimmunproblemer knyttet til tilstedeværelsen av pHSA-reseptoren uten at hoved-B-epitopene i preS2-området tapes.

Det er tilveiebragt ifølge oppfinnelsen et modifisert L-protein som erkarakterisertsom ikke-glykosylert og som har forminsket proteasesensitivitet og forminsket pHSA-bindingskapasitet. Dette protein inneholder preSl-områdesekvensene som svarer til aminosyrerestene 12-52 sammensmeltet med preS2-områdesekvenser som svarer til aminosyrerestene 133-145, fulgt av hele kodingssekvensen for S-proteinet i en kontinuerlig leseramme.

De modifiserte L-proteiner fremstilt ifølge oppfinnelsen kan uttrykkes ikke bare i metylotrofe gjær som omtalt så langt, men også i andre gjærsoppekspresjonssystemer som danner proteinene som partikler som bibeholder de viktigste antigene seter som kodes for ved de tre områdene preSl, preS2 og S. De modifiserte L-proteiner kan også ko-uttrykkes med S-proteinet i gjær under dannelse av partikler av blandet underenhet-sammensetning. Andre ekspresjonssystemer, f.eks. bakterielle, insekt og pattedyr kan også danne de modifiserte L-proteiner i forskjellige former.

Som et annet aspekt anvendes i denne oppfinnelse også nye DNA-sekvenser som koder for de modifiserte L-proteiner som fremstilles ifølge den foreliggende oppfinnelse. Slike DNA-sekvenser kan innarbeides i vektorer under kontroll av hensiktsmessige regulerende sekvenser.

Det er tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av et modifisert L-protein i HBV som beskrevet ovenfor, som innbefatter dyrkning av en gjærcelle transformert med et gjærekspresjonsplasmid som uttrykker en utvalgt modifisert L-protein-gensekvens under kontroll av egnete regulerende sekvenser og hvor det anvendes egnete dyrkningsbetingelser. Det modifiserte L-protein kan også ko-uttrykkes i en gjærcellevert med S-protein. Det resulterende L-protein kan isoleres fra kulturen eller cellelysatet ved vanlige teknikker. Det modifiserte L-protein kan isoleres i form av partikler av enten blandet eller homogen underenhetssammensetning avhengig av dets ko-ekspresjon med S-protein.

Som enda et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av modifiserte L-proteiner i andre ekspresjonssystemer, innbefattende bakterielle ekspresjonssystemer; insektscelle-ekspresjonssystemer, f.eks. baculovirus-systemer, pattedyrscelleekspresjonssystemer; vacciniavirus-systemer og planteekspresj onssystemer.

Av ovenstående vil det forstås at de nye modifiserte store (L) hepatitt B-overflateproteinmolekyler kan anvendes alene eller med andre HBsAg- eller HBV-komponenter under tilveiebringelse av vaksinemidler for anvendelse til immunisering av personer mot HBV-infeksjon. Oppfinnelsen innbefatter ekspresjon av et modifisert L-protein i en egnet vertscelle under egnet regulerende kontroll.

Det modifiserte L-protein erkarakterisert veddelesjon, innsetting eller modifikasjon av mange forskjellige aminosyresekvenser i preS-området. Det må være klart at i L-molekylet som skal modifiseres og uttrykkes, er dets første 11 aminosyrer her allerede blitt utelukket, og molekylet inneholder 163 aminosyrer i preS-området (se US-patentsøknad nr. 009 325 medtatt i det foreliggende som referanse). Den resulterende reduksjon i størrelse av preS-området letter partikkeldannelse i vertscellen og forsterker forskjellige biofysiske egenskaper hos molekylet, som kan gjøre den modifiserte L-partikkel spesielt ønskelig for vaksinefremstilling og anvendelse. F.eks. kan de forkortete preS-områder muliggjøre bedre presentasjon av S- og preS-epitopene på partikkelen for veksel-virkning med immunsystemet, hvorved immunogeniteten forsterkes.

Ved én utførelsesform tilveiebringes ifølge fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse et modifisert L-protein hvor Gly 13-aminosyreresten i preSl-området er deletert. L-proteinet uttrykt i gjær bærer en myristylgruppe kovalent tilknyttet i en amidbinding, som beskrevet i US-patentsøknad 07/009 325. En N-terminal Gly-rest er et vesentlig krav for myristylering av et protein [Towler og Gordon, Ann. Rev. Biochem., 57:69-99 (1988)]. Ett egnet modifisert L-protein kodes derfor ved DNA med en delesjon av Glyl3-kodonet (GGG) fra nukleotidsekvensen som koder for L-proteinet. Denne delesjon resulterer i syntese av et ikke-myristylert L-protein.

Som anvendt i det foreliggende, angir symbolet Autelukkelse: Således betyr f.eks. AGlyl3-modifisert L modifisert L-protein som mangler aminosyrerest 13 (glycin).

Modifisert L-protein fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse er et modifisert L-protein hvor ett eller flere av dets potensielle glykosyleringsseter er utelukket. L-proteinet uttrykt i gjærsopp bærer en N-bundet oligosakkaridkjede ved Asnl23 og flere 0-bundne mannosekjeder bundet til Ser- og Thr-rester både i preSl- og preS2-områdene i molekylet, som beskrevet i US-patentsøknad 009 325, identifisert ovenfor [se også Rutgers et al., "Viral Hepatitis and Liver Disease" red. A.J. Zuckerman, A.R. Liss, New York, s. 304-308

(1988)]. For fjerning av N-glykosyleringssetet som erkarakterisertved sekvensen Asn-X-(Ser eller Thr), hvor X kan være hvilken som helst aminosyre, forandres sekvensen ved aminosyreposisjonene 123-125. Det N-bundne glykosyleringssetet kan elimineres ved utelukkelse eller erstatning av aminosyrene i stillinger 123 og 125, utelukkelse av aminosyre 124 eller utelukkelse av hele 123-125-sekvensen. For ødeleggelse av de O-bundne glykosyleringsseter, utelukkes alle, eller en del av, Ser- og Thr-restene i L-sekvensen fra, eller erstattes med, andre aminosyrer i proteinet. L-proteinet uttrykt fra illustrerende plasmid pRIT13192 erkarakterisertsom fullstendig eller delvis ikke-glykosylert.

Modifisert L-protein fremstilt ifølge oppfinnelsen inneholder en delesjon i preS2-sekvensen ved aminosyrerester 120-132 i preS2-området som er ansvarlig for binding av polymerisert humant serumalbumin (pHSA) [se Machida et al., angitt ovenfor]. pHSA-binding er nedsatt i stor grad på proteinene som mangler denne sekvens.

Modifisert L-protein fremstilt ifølge oppfinnelsen erkarakterisert veddelesjon eller forandring av de proteasefølsomme seter. Proteasefølsomme peptidbindinger finnes i preS-sekvensen bak Arg-restene rundt posisjon 100 i preSl-området [Heermann et al., Intervirology 28, 14-25 (1987)] og bak aminosyrerestene Argl37, Glyl49 og Argl67. Delesjoner eller andre modifikasjoner innført i kodingsområdet for L-proteinet for fjerning av en del av, eller alle, kodonene for disse rester, frembringer et L-protein som er mindre følsomt overfor proteasepåvirkning.

Delesjonene innført i kodingsområdet for L-proteinet under dannelse av modifiserte L-proteiner, lar fortrinnsvis kodonene for aminosyrer 21-47 og 133-145 være uberørt. Disse sekvenser antas å tilveiebringe det modifiserte protein med kapasitet til å frembringe preS-spesifikke antistoffer forbundet med immunbeskyttelse [se f.eks. Itoh et al., som ovenfor].

Konstruksjon av et eksempel-gjærekspresjonsplasmid pRIT12 979 som koder for Glyl3 L-proteinet er beskrevet i eksempel F.l nedenfor. Analyse av ekspresjonen av det modifiserte L-protein fra plasmid pRIT12979 med hensyn til ekspresjonsnivået, post-translasjonelle modifikasjoner og makromolekylær sammensetning er beskrevet i eksempel F.2.

Modifisert L-protein som mangler alle de tre ovennevnte egenskaper, dvs. for funksjon som et substrat for gjærglykosyle-ringsenzymer, pHSA-bindingskapasitet og proteasefølsomhet, og modifisert ved fjerning av kodonene for aminosyrerestene 53-132 og146-174i preS-området, er illustrert i plasmid pRIT13193, beskrevet i eksempel F.3 nedenfor. Plasmid pRIT13192 inneholder kodonene for restene 12-52 og 133-145 i preS-området. Analyse av L-proteinekspresjon fra plasmid pRIT13192 er også beskrevet i det foreliggende (eksempel F.4). L-proteinet uttrykt fra pRIT13192 viser således en sterkt redusert pHSA-bindingskapasitet, forbedret proteaseresistens og mindre glykosylering.

Enda et annet modifisert eksempel-L-protein fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse kombinerer utelukkelsene innført i L-protein-kodingssekvensene i pRIT12979 og pRIT13192. L-proteinet uttrykt ved denne sekvens koder for et ikke-myristylert, mindre glykosylert, mindre proteasefølsomt L-protein med redusert pHSA-bindingskapasitet. Konstruksjon av gjærekspresjonsplasmidet pRIT13193 som bærer dette modifiserte L-sekvensinnskudd, er også beskrevet detaljert i eksempel F.3 nedenfor.

Modifiserte L-proteinkodingssekvenser, innbefattende hele S-kodingssekvensen, for anvendelse ved den foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ut fra disse S- og preS-proteinkodingssekvensene ifølge tabell A ved vanlig setespesifikk mutagenese [se f.eks. Botstein et al., Science, 229:1193 (1985) eller rekombinante DNA-teknikker, [se f.eks. T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)] . Aminosyre-posisjonsnumrene som er henvist til nedenfor, vil svare til posisjonsnumrene i tabell A av klarhetshensyn. Imidlertid kan andre publiserte versjoner av S- og preS-sekvensene anvendes ved fremstilling av de modifiserte L-proteiner ifølge denne oppfinnelse av en fagmann på området.

F.eks. kan S-proteinet isoleres fra DNA ekstrahert fra Dane- partikler. F.eks. kan HBsAg-kodingssekvensen i HBV-DNA i visse Dane-partikler av adw-serotypen isoleres på et enkelt BamHI-fragment; HBsAg-kodingssekvensen i HBV-DNA i visse Dane-partikler av ayw-serotypen kan isoleres på et Hhal-fragment. HBV-DNA i Dane-partikler av samme serotype kan også oppvise forskjellige restriksjonssete-mønstre.

Konstruksjon av de modifiserte L-proteinsekvenser fremstilt ifølge denne oppfinnelse kan utføres ved anvendelse av mellom-vektorer. Teknikker for kloning av DNA-fragmenter i fager er f.eks. beskrevet av Charnay et al., Nature, 286:893-895 (1980) og Tiollais, britisk patentsøknad 2 034 323.

Det modifiserte L-protein fremstilt ifølge denne oppfinnelse kan konstrueres i et rekombinant DNA-molekyl eller vektor. En rekombinant vektor omfatter modifisert L-protein-kodingssekvensen operativt bundet til et regulatorområde. En slik vektor kan også i tillegg inneholde et replikon avhengig av preferanse og/eller verten som skal anvendes. Med betegnelsen "replikon" menes det minimale området av DNA som virker til stabilt og ekstrakromosomalt å opprettholde en rekombinant vektor i en eukaryot eller prokaryot vertsorganisme transformert med en slik vektor. Slike replikoner er velkjente 'på området. Med betegnelsen "regulatorområde" menes hvilken som helst DNA-sekvens som inneholder et promotorområde og andre sekvenser som er nødvendige for transkripsjon av en kodingssekvens som regulerer transkripsjon av et strukturelt gens kodingssekvens. Slike regulatorområder er velkjente på fagområdet.

En slik vektor kan fremstilles ved vanlige teknikker såsom ved innsetting av kodingssekvensen for det modifiserte protein fremstilt ifølge denne oppfinnelse, i en vektor som allerede inneholder et replikon og et regulatorområde på en slik måte at DNA-molekylet bindes operativt til et slikt regulatorområde. Dette DNA-molekyl, eller en ekspresjonskassett som inneholder kodingssekvensen for det modifiserte L-protein, kan konstrueres ved vanlige teknikker, såsom ved ligering av L-kodingssekvensen til regulatorsekvensen.

Restriksjon av DNA for fremstilling av DNA-fragmenter anvendt ved oppfinnelsen, ligering av slike fragmenter for fremstilling av rekombinante DNA-molekyler anvendt ved oppfinnelsen og innsetting i mikroorganismer utføres ved kjente teknikker, såsom teknikker beskrevet i de tidligere og etterfølgende angitte referanser. Betingelsene velges slik at man unngår denaturering av DNA og enzymene. Restriksjonsenzymer og ligaser anvendt ved utførelse av denne oppfinnelse, er kommersielt tilgjengelige og bør anvendes ifølge instruksjoner som følger med disse. T4-DNA-ligase er den foretrukkete ligase.

De forskjellige fragmenter og sluttkonstruksjoner anvendt for ekspresjon av de modifiserte L-proteiner, og komponentene i vektorene som bærer disse kodingssekvenser for ekspresjon i vertsceller ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse kan sammenføyes under anvendelse av vanlige fremgangsmåter som er kjent for fagfolk på området. I mange tilfeller er gener blitt isolert og restriksjonskartlagt såvel som sekvensbestemt. For dette formål kan man velge den aktuelle sekvens, såsom HBV-hylsterproteinkodings-sekvensen, ved restriksjon av genet, under anvendelse av ytterligere manipulasjon som nødvendig, såsom reseksjon med Bal31, in vitro-mutagenese, primer-reparering, eller liknende, under tilveiebringelse av et fragment med ønsket størrelse, innbefattende den ønskete sekvens, og med de hensiktsmessige termini. Koplinger og adaptere kan anvendes for sammenføyning av sekvenser såvel som erstatning av tapte sekvenser, hvor et anvendt restriksjonssete var inne i det aktuelle området. De forskjellige fragmenter som isoleres, kan renses ved elektroforese, elektroelueres, ligeres til andre sekvenser, klones, isoleres på nytt og manipuleres ytterligere.

Anvendelse av regulatorområder for regulering av transkripsjon av det aktuelle modifiserte L-gen kan gjøre mulig dyrking av vertscellene til høy tetthet med ingen, eller lave, ekspresjonsnivåer for det strukturelle gen, og deretter bevirke ekspresjon ved forandring av omgivelsesbetingelsene, såsom næringsstoffer, temperatur og liknende.

Vektoren som bærer L-protein-kodingssekvensen, transformeres til, og uttrykkes i, en utvalgt vertscelle ved vanlige teknikker. Cellen dyrkes så i hensiktsmessige dyrkningsmedier, dvs. medier som gjør det mulig for verten å overleve og uttrykke det modifiserte L-protein i gjenvinnbar mengde. Hvor f.eks. en gjær-vertscelle utvelges, er et eksempelmedium for slik anvendelse Yeast Nitrogen Base minimalt medium. De hensiktsmessige dyrkningsmedier kan velges av en fagmann på området avhengig av den spesielle vert som anvendes

ved fremgangsmåten.

Isoleringen av det modifiserte L-proteinmolekyl fremstilt ifølge oppfinnelsen kan skje fra et cellelysat eller ekstrakt av verts-celledyrkningsmediet avhengig av cellens evne til utsondring av det modifiserte protein. Gjenvinning av proteinet fremstilt ifølge denne oppfinnelse utføres ved vanlige proteinisoleringsteknikker.

For fremstilling av modifiserte L-proteiner ifølge denne oppfinnelse kan det utvelges en egnet vertscelle eller cellelinje. Egnete celler eller cellelinjer kan være gjærceller. Mange gjærcellestammer som er kjent for fagfolk på området, er tilgjengelige som vertsceller for ekspresjon av de modifiserte L-proteiner som fremstilles ifølge den foreliggende oppfinnelse. Ved utøvelse av denne oppfinnelse kan hvilke som helst gjærarter anvendes. Ved ett aspekt anvendes det ved eksemplene nedenfor Saccharomyces, spesifikt S. cerevisiae. Tallrike stammer av S. cerevisiae er tilgjengelige fra offentlige depoter og laboratorier, f.eks. American Type Culture Collection, Rockville, MD.

Ved et annet aspekt kan Hansenula polymorpha anvendes.

Andre gjærtyper kan også anvendes, innbefattende, uten begrensning, Hansenula, Pichia, Candida, Kluyveromyces og Schizosaccharomyces.

Dessuten kan andre typer eukaryote vertsceller, f.eks. pattedyrceller såsom ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO) eller 3T3-celler, anvendes som vertsceller for ekspresjon av L-proteinene som er beskrevet i det foreliggende. Utvelgelsen av egnete pattedyr-vertsceller og fremgangsmåter for transformasjon, dyrkning, amplifikasjon, undersøkelse og produktfremstilling og rensing er kjent på området. Se f.eks. Gething og Sambrook, Nature, 2 93:620-625

(1981), eller alternativt Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 5 (7) : 1750-1759 (1985) eller Howley et al., US-patent 4 419 446. Andre egnete pattedyrscellelinjer er ape-COS-l-cellelinjen, og CV-1 cellelinjen.

Det vil forstås at en del av delesjonene som innføres i L-protein-kodingssekvensen beskrevet ovenfor, har forandret de indre sekvenser som er engasjert ved transkripsjon og translasjon av M- og S-spesifikk mRNA i pattedyrsceller. En slik modifisert L-proteinkodingssekvens muliggjør derfor uavhengig ekspresjon av S- og modifisert L-protein i en pattedyrscelle som omslutter deres

individuelle ekspresjonskassetter.

På liknende måte er bakterieceller egnet som vertsceller egnet ved den foreliggende oppfinnelse. F.eks. er de forskjellige stammer av E. coli (f.eks. HB101, MC1061 og stammer anvendt i de følgende eksempler) velkjente som vertsceller på bioteknologiområdet. Forskjellige stammer av B. subtilis, Pseudomonas, andre stav-bakterier og liknende -kan også anvendes ved denne fremgangsmåte.

Dessuten kan, hvor ønskelig, insektsceller anvendes som vertsceller ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse. Se f.eks. Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298 (Plenum Press 1986) og referanser angitt deri.

En del virus kan også anvendes for ekspresjon av L-proteinene som fremstilltes ifølge denne oppfinnelse, såsom baculovirus eller vacciniavirus. Utvelgelse av hensiktsmessige vertsceller er innenfor kunnskapen hos en fagmann på området, og likeså utvelgelsen av hensiktsmessige dyrkningsbetingelser, medier og vektorkomponenter som er hensiktsmessige for ekspresjon i en valgt vertscelle.

I ekspresjonssystemene beskrevet ovenfor og nedenfor i eksemplene kan hvilken som helst promotor som kan regulere ekspresjonen av de proteinkodende sekvenser i den utvalgte vertscelle, velges. Når den valgte vertscelle er en gjærcelle, kan promotorene som er egnet for ekspresjon av de modifiserte L-proteinkassetter, innbefatte den sterke promotor TDH3 eller andre konstitutive eller regulerte promotorer som muliggjør modulasjon av nivået av L-proteinet avhengig av sammensetningen av vekstmediet. Dessuten er f.eks. PGK, ARG3 og APH1 illustrerende promotorer egnet i vektorene som benyttes ifølge den foreliggende oppfinnelse.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også ekspresjon av de modifiserte L-proteiner som en del av en HBsAg-partikkel med blandet polypeptidsammensetning, som beskrevet detaljert i US-patentsøknad 07/368 401, som er medtatt i det foreliggende som referanse. Fremgangsmåten innbefatter ko-ekspresjon i en gjærcelle av et første protein S og et andre protein X-S, hvor S i det vesentlige er hovedoverflateproteinet på HBV, og hvor X, for den foreliggende oppfinnelses formål, er en modifisert preS-sekvens kodet for ved et funksjonelt DNA-kodingsområde sammensmeltet i fase med S-kodingssekvensen.

Hvor det henvises til US-patentsøknad nr. 07/368 401, må det være klart at hovedsakelig den samme beskrivelse kan finnes i Jacobs et al., Gene 80: 279-291 (1989).

Ifølge denne fremgangsmåte ko-uttrykkes S-protein-kodingssekvensen med den modifiserte L-protein-aminosyresekvens. Kodings-områdene for L-proteinet såvel som sekvensen for S-proteinet kan konstrueres som beskrevet ovenfor under anvendelse av vanlig kjemisk synteseteknologi eller rekombinant DNA-teknologi. De modifiserte L-proteiner innarbeides sammen med S-proteiner i partikler med blandet underenhetssammensetning.

Ved konstruksjon av X-S-proteinene omfattende modifiserte L-proteiner fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse, er S fortrinnsvis hele det fullt utviklete overflateprotein (ca. 226 aminosyrer) på HBV (se tabell A) . Alternativt kan S-proteinet kodes for ved en S-proteinkodingssekvens i HBV-genomet, hvor S er hovedsakelig det samme som et autentisk HBsAg-S-protein. Avskårne deler av S kan også anvendes ved konstruksjon av de blandete partikler inneholdende modifisert L-protein sålenge partikkel-sammensetningen påvirkes ugunstig.

S-proteinkodingssekvensen anbringes i en første ekspresjonskassett under anvendelse av vanlige teknikker for at ekspresjon av S-proteinet i gjærcelleverten skal kunne skje. S-proteinkodingssekvensen eller en vesentlig del av denne anvendes ved en fusjon med deler av preS-kodingssekvensen og anbringes i en andre ekspresjonskassett for at fremstilling av et modifisert L-protein fremstilt ifølge denne oppfinnelse skal kunne skje.

En vektor, konstruert ved vanlige teknikker som beskrevet ovenfor, som bærer S-proteinekspresjonskassetten og én eller flere vektorer som bærer ekspresjonskassetten for det modifiserte L-protein, transformeres i en gjærvertscelle ved vanlige teknikker.

Alternativt anbringes S-proteinekspresjonskassetter og ekspresjonskassetter for ett eller flere modifiserte L-proteiner sammen på den samme vektor som transformeres i en gjærvertscelle.

Vektorer som kan anvendes, er Ty-integrative vektorer som beskrevet detaljert i US-patentsøknad 386 401. Ved en annen alternativt fremgangsmåte anvendes forenlige autonomt replikerende vektorer som bærer de ønskete ekspresjonskassetter og transformerer gjærvertscellen.

Eksempler på vektorsystemer er beskrevet detaljert i Mellor et al., Yeast, 2:145 (1986); Boeke et al., Cell, 40,491 (1985), Boeke et al., Cell, 42:507 (1985) og US-patentsøknader 101 463, 233 631, 368,401 og 009 325 (europeisk patentsøknad publikasjonsnr. 0 278 94 0) hvilke patentsøknader og referanser er medtatt i det foreliggende som referanse.

Ytterligere andre typer vertsceller kan anvendes for ekspresjon av de sammensatte HBsAg-partikler av blandet polypeptidsammensetning beskrevet i det foreliggende. Egnete eukaryote verter er de samme som dem som er oppregnet ovenfor når det gjelder ekspresjon av de modifiserte L-proteiner fremstilt ifølge oppfinnelsen, f.eks. pattedyrsceller, såsom CHO-celler. Insektsceller og virus såsom bakulovirus og vacciniavirus nevnt ovenfor, kan også anvendes.

Ved en foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse, anvendes Ty-integrative vektorer som bærer S-proteinekspresjonskassetten og autonomt replikerende plasmidvektorer som bærer ekspresjonskassetten for det modifiserte L-protein. Anvendelsen av Ty-vektorer som bærer S-protein-ekspres jonskassetten, muliggjør at disse sekvensen kan integreres stabilt i kromosomene i gjærvertscellen. Slike integreringer er stabile på grunn av deres lave avskjæringsfrekvens. Vektorene er således homogent fordelt i cellepopulasjonen, hvilket muliggjør en lik proteinsyntetiseringsgrad i hver celle.

Transformasjon inn i disse celler av autonomt replikerende plasmider som bærer ekspresjonskassetten for det modifiserte L-protein sikrer at nivået av syntese av modifisert L-protein for et bestemt omfang av S-proteinsyntese i hver celle varierer i henhold til kopiantallet av plasmidet som finnes i cellen.

Ved en ytterligere foretrukket utførelsesform kan både S-proteinekspresjonskassetten og ekspresjonskassetten for det modifiserte L-protein innsettes på Ty-integrative vektorer og integreres separat i gjærvertsceller av motsatte paringstype. Stammer som bærer de ønskete antall S-kassett- og modifisert L-kassett-integreringsenheter, kan så krysses under oppnåelse av diploidceller som uttrykker både S-polypeptidene og de modifiserte L-polypeptider. Hvis ønskelig kan haploid-segreganter som bærer begge typer ekspresjonskassetter fås ved sporedannelse av slike diploider.

Cellen kan dyrkes i hensiktsmessige dyrkningsmedier, dvs. medier som gjør det mulig at verten kan uttrykke S-proteinet og det modifiserte L-protein i partikler med blandet'underenhetssammensetning i gjenvinnbar mengde.

Resulterende modifiserte L-proteiner vil bli fremstilt samtidig

i gjærceller sammen med S-proteinet og sammensatt som blandete komposittpartikler. Slike partikler er i det foreliggende definert som en multimer sammensetning av to eller flere polypeptider til en partikkelformig struktur, som derfor erkarakterisert veden komposittbeskaffenhet av blandet polypeptidsammensetning. De forskjellige peptider er anbragt i en spatial forbindelse på overflaten av de blandete partikler. Tilstedeværelsen av de nye modifiserte L-protein på HBsAg-partikkelen vil•frembringe en immunrespons lik den som er forbundet med oppfattelse av den naturlige determinant. Den foreliggende oppfinnelse gjør derfor mulig fremstilling av HBsAg-partikler i gjær som etterlikner naturlige partikler for såvidt som de inneholder de essensielle antigene seter fra S-, M- og L-proteinene i HBV.

Isoleringen av den blandete partikkel fremstilt ifølge oppfinnelsen fra et cellelysat eller ekstrakt av dyrkningsmediet utføres ved vanlige proteinisolasjonsteknikker.

Ved utøvelsen av denne fremgangsmåte ifølge denne oppfinnelse kan hvilken som helst type gjærvert for hvilken transformasjons-, klonings- og ekspresjonssystemer er tilgjengelige, anvendes ved utvikling av "blandete partikler" av HBsAg.

I andre gjærsoppslekter finnes det ingen Ty-sekvenser, og derfor må vektorsystemer utformes for tilveiebringelse av ko-ekspresjon av kodingssekvensene for S-proteinet og det modifiserte L-protein i disse slekter for dannelse av de beskrevne blandete partikler. Ekspresjonskassetter kan derfor utformes for integrering i gjær-kromosomene under anvendelse av andre repetitive DNA-sekvenser eller plasmider såsom ARS-baserte plasmider i gjær såsom Pichia, som gjør mulig integrering i kromosomene. Et eksempel på slike anvendbare ARS-plasmider er beskrevet i Cregg et al., Mol. Cell. Biol., 5(12):3376 (1985).

I ekspresjonssystemene beskrevet ovenfor, f.eks. både Ty-ekspresjonssystemene og andre, omfatter regulatorelementet en promotor som bevirker RNA polymerasebinding og transkripsjon. Regulerbare promotorer, dvs. induserbare promotorer eller promotorer hvor undertrykking kan oppheves, kan også anvendes. Mange forskjellige egnete promotorer er tilgjengelige for ekspresjon av heterologe polypeptider i gjær. Disse innbefatter den kopper-induserbare metalltionein-gen (CUP1)-promotor og den konstitutive promotor for de glykolytiske gener, glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase (TDH3) og alkoholdehydrogenase (ADH). Områder for transkripsjonsavslutning i gjær stammer fra 3'-enden i hvilket som helst av flere gjærgener, f.eks. genet for iso-l-cytokrom C (CYC1). Ekspresjonssystemer for anvendelser i Kluyveromyces er beskrevet f.eks. i PCT WO83/0405, Hollenbert et al.; i Schizosaccharomyces, f.eks., i EP-A-107170, Yamomoto; i Pichia, f.eks., i Cregg et al., Bio/Technology, 5:479 (1987) og i Hansenula, f.eks. i EP-A-299108, Hollenbert et al.

Spesifikt tilveiebragt ved eksemplene ifølge denne oppfinnelse er S. cerevisiae- stammer som kan syntetisere S-protein som et resultat av genomintegrering av S-proteinekspresjonskassetter styrt av Ty-baserte vektorer.

Én slik vektor, pRIT13133-L, som inneholder TDH3-S-kodingssekvensen - ARG3-kassetten og URA3-markøren, er beskrevet i eksempel 1 i US-patentsøknad 368 401.

En annen Tyl-vektor, pRIT13034-L, inneholder samme ekspresjonskassett og URA3-markøren, men inneholder i tillegg CUPl-genet som kan anvendes som en tilleggsmarkør i CUP1<S->eller cupl A mottaksgjærstammer.

Foretrukkete gjærstammer mangler funksjonelle kromosomale CUP1-gener, som er følsomme overfor koppertoksisitet, for at transformanter hvor det er integrert flere kopier av vektorer lett skal kunne utvelges. To foretrukkete cupl A-gjærsoppstammer EJ cuplA3d ogEJcuplA7b er beskrevet i eksempel 9 i US-patentsøknad 368 401.

Gjærstammer som inneholder flere integrerte kopier av enten pRIT13133-L eller prRIT1034-L, er beskrevet i eksemplene nedenfor.

Transformasjon i disse gjærstammer i autonomt replikerende gjærekspresjonsplasmider som bærer en ekspresjonskassett for et modifisert L-protein, er også beskrevet i eksemplene nedenfor.

Diploid-gjærstammer som bærer flere integrerte kopier både av

S- og modifisert L-ekspresjonskassetter, er beskrevet i eksempel F.10 nedenfor.

Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse for frem stilling av slike modifiserte L-proteiner alene eller i partikler med blandet underenhetssammensetning har fordelaktig anvendelse ved fremstilling av vaksiner mot patogene mikroorganismer. F.eks. kan de modifiserte L-proteiner som er beskrevet i de forskjellige vaksine-utformninger omfattende hepatitt B-overflateantigen, gi fordeler som ikke fås med kjente HBV-vaksiner. HBsAg-partikkelen med blandet underenhetssammensetning som inneholder et modifisert L-protein, likner partikler eller filamenter eller virioner som finnes i blodet hos HBV-infiserte personer som inneholder preS2- og preSl-epitoper som ligger åpne på overflatene, i tillegg til epitoper fra hoved-proteinene, og kan også vise seg å være egnete i nye vaksine-utformninger. De modifiserte L-proteiner eller blandete partikler av blandet underenhetssammensetning som inneholder dem, kan ha immunogene egenskaper som ikke fås med individuelle blandinger av S-, M- og L-proteiner.

Ved en ytterligere utførelsesform av denne oppfinnelse kan partiklene som fremstilles med blandet underenhetssammensetning inneholde modifiserte L-proteiner og S-proteiner med forskjellige undertypedeterminanter for utvidelse av beskyttelsesområdet. Dvs. at det modifiserte L-protein kan være av ay-undertypespesifisitet og S-proteinet av ad-undertype, eller omvendt.

De modifiserte L-proteiner som fremstilles ifølge oppfinnelsen eller en partikkel som inneholder det modifiserte L-protein enten i blandet (S, modifisert L) eller homogen (modifisert L-protein) underenhetsform kan inngå i vaksine. En slik vaksine vil inneholde en immunbeskyttende mengde av partiklene eller modifiserte L-proteiner, dvs. at tilstrekkelig av proteinene eller partiklene administreres til at det fremkalles tilstrekkelig beskyttende antistoffrespons mot HBV uten alvorlige bivirkninger. Slike vaksiner kan fremstilles ved vanlige teknikker. F.eks. kan en vaksine for stimulering av beskyttelse mot HBV-infeksjon hos mennesker inneholde partikkel og/eller de modifiserte L-proteiner beskrevet ovenfor, og en egnet vanlig bærer. Partikkelen eller L-proteinet kan være i vandig oppløsning buffret ved fysiologisk pH for direkte anvendelse. Alternativt kan proteinet eller partikkelen blandes eller adsorberes med et vanlig hjelpestoff såsom aluminiumhydroksyd eller aluminium-fosfat. En slik partikkel eller modifisert L-protein kan også blandes med andre immunogener for fremstilling av kombinasjons- vaksiner. Se f.eks. New Trends and Development in Vaccines, red. Voller et al, University Part Press, Baltimore, MD (1978) .

Disse modifiserte L-proteiner, alene eller i partikler med blandet eller homogen underenhetssammensetning, som beskrevet, utvider således spekteret av antistoffer mot HBV, og kan tilveiebringe en tidligere respons overfor virusangrep hos en person som er vaksinert med vaksinene som inneholder disse proteiner. Dessuten kan vaksinene som inneholder disse modifiserte L-proteiner, sette personer som ikke reagerer på S-proteiner, istand til å frembringe en preS-respons, eller de kan forøke eller forsterke S-responsen.

En annen anvendelse av partiklene fremstilt ifølge denne oppfinnelse og/eller de modifiserte L-proteiner kan være som prober eller reagenser for påvisning av HBV eller HBV-avledete proteiner eller anti-HBV-antistoffer i biologiske prøver ved forskjellige vanlige immunforsøk og liknende.

Det vil være klart at alle vaksiner som er beskrevet i det foreliggende, kan administreres på hensiktsmessig måte, f.eks. subkutant, intravenøst eller intramuskulært. Mengden av immunogenet i hver vaksinedose velges av den behandlende lege under hensyn til pasientens alder, vekt, kjønn, generelle fysiske tilstand og liknende. Mengden som skal til for å gi en immunbeskyttende respons i pasienten uten betydelige skadelige bivirkninger kan variere avhengig av det anvendte immunogen og det eventuelle nærvær av hjelpestoff. Vanligvis ventes det at hver dose vil omfatte 1-1000 mikrogram protein, fortrinnsvis 1-200 mikrogram. Begynnelsesdoser kan eventuelt følges av gjentatte forsterkningsdoser, hvor ønskelig.

Særlig foretrukkete vaksiner er slike som omfatter komposittpartikler med strukturen (L<*>, S) , hvor L<*>er som definert nedenfor og S angir S-proteinet i hepatitt B-overflateantigen, mest foretrukket uttrykt i S. cerevisiae eller H. polymorpha som beskrevet i det foreliggende.

Som anvendt i det foreliggende, angir symbolet L<*>et modifisert L-protein omfattende restene 12-52, 133-145 og 175-400 i forhold til den store åpne leseramme på HB-virus av ad-serotype vist i tabell A nedenfor. Symbolet Agly L<*>angir likeledes et modifisert L-protein som omfatter rest 12, fulgt av restene 14-52, fulgt av restene 133-145 og 175-400.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Materialer

1. Plasmider

Plasmider nevnt i beskrivelsen er beskrevet i del A nedenfor.

2. Gjærsoppstammer

Hansenula polymorpha RB 10 (ura 3) er en mutant av Hansenula polymorpha ATCC 34438, oppnådd ved mutagenese under anvendelse av etylmetansulfonat (EMS) hovedsakelig som beskrevet av Roggenkamp et al. (1986).

3 . Enzymer

Restriksjonsendonukleaser, T4 DNA-ligase og andre anvendte enzymer ble anskaffet enten fra Boehringer, Mannheim, BRD eller Bethesda Research Laboratories, Eggenstein, BRD. Enzymene ble anvendt ifølge instruksjonene fra den respektive fabrikant.

4 . Immunologiske reagenser

a) Sl.l: Monoklonalt museantistoff spesifikt for Sl-området i preSl-proteinet (SmithKline Biologicals, Rixensart,

Belgia)

b) S2.1, S2.2 og S2.5; monoklonale museantistoffer spesifikke for S2-området i hepatitt B-overflateantigen

(SmithKline Biologicals, Rixensart, Belgia)

Antistoffer spesifikke for Sl-området og S2-området i hepatitt B-overflateantigen er omtalt som "preS-antistoffer".

c) RF6: Monoklonalt museantistoff spesifikt for S-området i hepatitt B-overflateantigen (H. Thomas, Royal Free

Hospital, London).

d) RF1: Monoklonalt museantistoff spesifikt for en konformasjonell underordnet epitop som befinner seg i

S-området (H. Thomas, Royal Free Hospital, London).

e) HBS1: Monoklonalt museantistoff rettet mot en denaturerings- og reduksjonsresistent epitop på plasma-avledet

HBsAg, i S-området (SmithKline Biologicals Rixensart, Belgia). Dette monoklonale antistoff konkurrerer i bin-dingsforsøk med Mab RF6.

Antistoffene a), b) og e) ble fremstilt av patentsøkeren ifølge standardfremgangsmåter ved fusjon av musemiltceller med myelomceller. Når det gjelder fremgangsmåten, vises det til Kohler og Milstein, 1975. Fremgangsmåter er beskrevet i Goding, Monoclonal Antibodies, Principles and Practice, Academic Press, London 1983. f) AUSRIA (Abbott Laboratories, Wiesbaden-Delkenheim, BRD og Louvain-La-Neuve, Belgia): kommersielt sett inneholdende polyklonale antistoffer rettet mot naturlige konformasjonelle epitoper. g) AUSZYME (Abbott Laboratories, Wiesbaden-Delkenheim, BRD og Louvain-La-Neuve, Belgia): kommersielt sett inneholdende monoklonale antistoffer rettet mot en naturlig konformasjonell epitop.

Antistoffene nevnt under f) og g) er kommersielt tilgjengelige. De reagerer ikke med monomert hepatitt B-overflateantigen. h) AUSAB (Abbott Laboratories, Louvain-La-Neuve, Belgia): kommersielt sett for påvisning av anti-HBsAg-antistoffer.

5. Medier

Pepton 190, gjærekstrakt, casaminosyrer og gjærnitrogenbase anvendt for fremstilling av medier ble anskaffet fra Gibco Ltd., Paisley, Storbritannia.

For fremstilling av agarplater ble 18 g agar (Gibco Ltd.) pr. liter tilsatt før autoklavering av det respektive medium.

SMR som inneholder metanol er også kalt Met-SMR.

b) YNB: Selektivt medium

c) YEPD: Ikke-selektivt rikt medium

Hvis nødvendig ble 1 mg gentamycin G418 tilsatt pr. 1

ml medium.

II Metoder

1. Behandling av DNA

Spaltning med restriksjonsendonukleaser, ligering under anvendelse av T4 DNA-ligase, fosforylering av DNA, isolering av DNA fra E. coli, separasjon av DNA ved gel-elektroforese og alle andre teknikker som hører til genteknologiområdet, ved disse anvendelser ble i det vesentlige utført som beskrevet av Maniatis et al., 1982.

2. Transformasjon av gjær

Metylotrof gjær transformeres ved fremgangsmåtene som er beskrevet tidligere (Roggenkamp et al., 1986).

Fremgangsmåten hvor det anvendes intakte frosne celler, er foretrukket (Klebe et al., 1983). a) Transformerte celler identifiseres ved komplementering av ura3-mangel eller ved resistens overfor gentamycin. Resistens overfor gentamycin G418 ble undersøkt ved utplating av cellene på YEPD-plater som inneholdt 25 ml stivnet medium. Etter 6 timers vekst på platene ble 1 ml vandig oppløsning som inneholdt 25 mg gentamycin 418, påført på hver plate og inkuberingen fortsatt i 2-3 dager. Gentamycin G418 (varemerke Geneticin) ble anskaffet fra Gibco Ltd.

b) Segregering av mitotisk stabile transformanter ble utført ved at transformanter ble selektert fra den

selektive transformasjonsplate, og disse fikk vokse i et flytende selektivt medium (YNB eller YEPD med G418 med 1 mg/ml) i ca. 20 generasjoner (to overføringer). Etter denne vekstperiode ble cellene inokulert i et ikke-selektivt medium (SMR eller YEPD) og fikk vokse i ytterligere 40-60 generasjoner (5-6 overføringer). Cellene ble så utplatet på en selektiv plate (YNB eller YEPD med G418 med 1 mg/ml), og kloner som fremdeles uttrykte den selektive markør, ble beholdt.

3. Isolering av gjær-DNA

Total-DNA fra gjær ble fremstilt som beskrevet i Struhl et al. (1979) .

4. Analyse av gjær-DNA

Strukturen av DNA i gjærtransformanter ble analysert ved fordøying med hensiktsmessige restriksjonsendonukleaser fulgt av agarosegelelektroforese. DNA-fragmenter ble så overført til nitrocellulose og hybridisert med den hensiktsmessige radioaktivt merkete DNA-probe (Southern 1975) .

5. Immunanalyser

"Western Blot"-analyse

a) Amersham-fremgangsmåte

Proteiner oppnådd fra ubearbeidete ekstrakter eller fra

gradientfraksjoner ble separert ved SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese (Laemmli, 1970) under anvendelse av 12,5% separasjonsgeler, 5% opphopingsgeler. Protein-båndene ble overført på nitrocellulose i det vesentlige som beskrevet av Towbin et al. (1979).

Det antigene materialet ble påvist ved reaksjon mellom flekken ("blot") og spesifikke antistoffer. Antigen-antistoff-komplekset ble visualisert ved reaksjon mellom filteret og biotinylert antistoff RPN 1001 (Amersham Buchler GmbH & Co. Ltd., Braunschweig, BRD) i en 1:300-fortynning fulgt av en inkubering med peroksydase-streptavidin-kompleks RPN 1051 (Amersham). Alle trinn i forsøket ble utført i henhold til instruksjonene fra fabrikanten. b) Alternativt ble filteret for-inkubert med 0,05 vekt/ volumprosent Tween i PBS. Etter inkubering med det aktuelle monoklonale antistoff, ble antistoffbinding påvist ved suksessiv inkubering med biotinylert saue-antimus-IgG (RPN 1021, Amersham) i en 1:250-fortynning inneholdende 0,05% Tween 20, streptavidin-biotinylert pepperrot-peroksydasekompleks (RPN 1051, Amersham, fortynning 1:400 i PBS inneholdende 1% gelatin) og til slutt 3 0/il H202og 10 ml HRP fargeutviklingsreagens ineholdende 4-klor-l-naftol (3 mg/ml metanol) i 50 ml PBS. Mellom inkuberingene ble filteret vasket med PBS som inneholdt 0,05% Tween 20.

Kvantifisering av dannete monomere antigener (S og preS) ble oppnådd ved sammenlikning av prøver av 0,01-0,3 fig gjær-avledet renset HBsAg (SmithKline Biologicals) med 3-5 forskjellige fortynninger av ubearbeidete proteinekstrakter av Hansenula inneholdende 2-20 fig totalt celleprotein.

Proteinkonsentrasjonen ble bestemt under anvendelse av et BioRad proteinanalysesett (BioRad Miinchen, BRD) .

EKSEMPLER: DEL A

Plasmider

Eksempel A. l

Konstruksjon av plasmider som muliggjør ekspresjon av protein i Hansenula volvmorvha a) Konstruksjon av et basisplasmid inneholdende en autonomt replikerende Hansenula polymorpha-sekvens (pME4).

Moderplasmidet som ble anvendt for konstruksjon av plasmider inneholdende S-genet under kontroll av Hansenula-promotorer er pME4, som allerede er beskrevet i doktorgradsavhandlingen av M. Eckart, 1988. pME4 er et derivat av YIp (Struhl et al.', 1979: Stinchcomb et al., 1980) oppnådd ved følgende modifikasjoner:

Den autonomt replikerende Hansenula polymorpha-sekvens HARS1 klones i Sall-setet i YIp5 som beskrevet i Roggenkamp et al. (1986), hvilket resulterer i pHARS. Plasmid pHARS ble så rekonstruert ved utelukkelse og gjeninnsetting av HARS1-Sali-fragmentet med 440 basepar i PvuII-setet i samme vektor. De heftende Sall-ender på fragmentet ble gjort stumpendet før ligering ved inkubering med eksonuklease VII fulgt av omsetting med Klenow-polymerase. Denne rekonstruksjon resulterte i et enkelt Sall-sete i tetracyklin-resistensgenet i pBR322-delen i plasmidet. Det således oppnådde mellomplasmid ble igjen rekonstruert for oppnåelse av et beta-laktamasegen som manglet den opprinnelige signalsekvens hvor signalsekvensen er erstattet at koplingen som er vist nedenfor; når det gjelder detaljer, se Eckart (1988):

Dette trinn ga plasmid pME4 som vist på fig. 1.

b) MOX- og FMD-promotorfragmenter

Isoleringen av MOX-promotoren fra H. polymorpha er beskrevet i

Eckart, 1988. For den foreliggende oppfinnelses formål ble et genom-EcoRI-Sali-fragment på 1525 bp inneholdende oppstrømskontrollområdet iMOX-genet og kodonene for de fem første aminosyrer i MOX-proteinet klonet i et pBR322-derivat. En skjematisk fremstilling av MOX-genet er vist på fig. 2. Dette mellomplasmid ble spaltet under anvendelse av EcoRI og behandlet med nuklease Bal31 og deretter ligert med EcoRI-kopiere. Således ble det oppnådd en serie promotorfragmenter med EcoRI 3'-ender og Sali 5'-ender ved etterfølgende spaltning med restriksjonsendonuklease Sali. Stillingene for de forskjellige utelukkelsessluttpunkter ble bestemt ved DNA-sekvensbestemmelse i henhold til fremgangsmåte ifølge Maxam og Gilbert, 1977. For såvidt angår ytterligere forsøk beskrevet i denne patentsøknad, ble det anvendt et plasmid betegnet pBR322-MP inneholdende en utelukkelse opptil stilling -3 (når det første base i MOX-translasjonsinitieringskodonet er base pluss 1). Plasmidet pBR322-MP er beskrevet i Eckart, 1988.

Isolering og karakterisering av FMD-promotoren er beskrevet i europeisk patentsøknad 87 110 417.0. For den foreliggende oppfinnelses formål ble et 1,4 kb BamHI- fragment omfattende ca. 1000 bp av oppstrøms-promotorområdet, klonet i BamHI-setet i pUC19. En klon ble valgt, hvor innskuddet var orientert på en slik måte at enkelt-EcoRI-setet i pUC19 var i 3'-enden av det innsatte fragment. En skjematisk representasjon av genomklonen som inneholdt FMD-genet innbefattende dets promotor, er vist på fig. 2B. En serie nuklease-Bal31-utelukkelser som startet fra EcoRI-setet i pUCl9-koplingen ble fremstilt for oppnåelse av plasmider som inneholdt promotoren uten sekvenser fra det strukturelle gen. Etter Bal31-behandling ble DNA ligert til EcoRI-koplinger, DNA ble spaltet med BamHI og BamHI-EcoRI-fragmentene ble klonet i pBR322. Mange forskjellige utelukkelser ble oppnådd. Utelukkelser til posisjoner minus 5 og minus 9 fra den første ATG var mest effektive ved senere forsøk. For de ytterligere forsøk beskrevet i denne patentsøknad, ble det anvendt et plasmid som bar et promotorfragment inneholdende utelukkelsen til stilling .-9 fra den første ATG (plasmid pBR322-FMD-P-9) . En skjematisk representasjon av MOX- og FMD-promotorfragmentene anvendt for konstruksjon av ytterligere plasmider, er vist nedenfor.

C) Terminator

Isoleringen av en transkripsjonsterminator fra MOX-genet er beskrevet i Eckart, 1988. En skjematisk representasjon av 3'-området i MOX-genet er vist nedenfor:

Sall-NruI-fragmentet vist i skjemaet ovenfor ble subklonet i pBR322 mellom Sali- og Nrul-setene, og dette plasmid ble så spaltet under anvendelse av restriksjonsendonuklease Asp718, hvilket resulterte i en lineærisering av plasmidet på grunn av et enkelt Asp718-sete i den åpne MOX-leseramme, og underkastet Bal31-utelukkelser.

Ved DNA-sekvensanalyse av de resulterende fragmenter ble et terminatorfragment på ca. 320 bp identifisert (Eckart, 1988) som fremdeles virker som terminator. Dette stumpendete terminatorfragment (GACATACC--315bp-EcoRV) ble ligert i Smal-setet i pUC19. Orientering av fragmentet ble påvist ved sekvensanalyse (Maxam og Gilbert, 1977). Den resulterende klon pT-24 er vist på fig. 3. Denne klon ble anvendt for konstruksjon av ekspresjonsvektorer som vist nedenfor.

d) Selektive markørgener

pME4 (beskrevet ovenfor, se fig. 1) ble spaltet med EcoRI, og de

heftende ender ble utfylt med Klenow-polymerase. Plasmid pT-24 ble fordøyd med EcoRI og HindiII og fragmentet omfattende pUC19-koplingen og MOX-terminatorfragmentet isolert. De heftende ender på dette fragment ble gjort stumpendet ved behandling med Klenow-polymerase, og det stumpendete fragment ble ligert med pME4. Det resulterende plasmid ble kalt pP/T-24. Kloningssetene som stammet fra pUC19, ble senere anvendt for ytterligere kloningstrinn.

Plasmid pP/T-24 inneholder S. cerevisiae URA3-genet som selektiv markør. Som en ytterligere selektiv markør ble det innført et gen som ga resistens overfor kloramfenikol. Dette gen ble isolert fra vektor pBR325 som et 1,7 kg AatII-ClaI-fragment, underkastet en kort Bal31-digerering for fjerning av ca. fire basepar på hver side, og gjort stumpendet ved anvendelse av Klenow-utfyllingsreaksjon. Deretter ble fragmentet ligert med pP/T-24, som var blitt spaltet med Nrul. Det resulterende plasmid som viste kloramfenikolresistens ble kalt pP/T-24-C.

Eksempel A. 2

Konstruksjon av et plasmid inneholdende hepatitt B-overflateantigen-genet i funksjonell kombinasjon med Hansenula polymorpha-terminatoren.

For oppnåelse av en funksjonell enhet som omfattet hepatitt B S-genet og en terminator som var effektiv i Hansenula polymorpha, ble S-genet innført somen Ncol-EcoRI-fragment på 683 bp i BamHI-setet i plasmidet pP/T-24C tilveiebragt ved pUC19-koplingsdelen i dette plasmid. Fragmentet på 683 bp ble oppnådd fra pRIT12331, som er en vanlig pUC9-basert E. coli-vektor inneholdende 683 bp NcoI-EcoRI DNA-fragment som koder fra S-proteinet fra Ncol ved ATG-kodonet (CCATGG) til EcoRI utover TAA stoppkodonet (TAACGAATTC). Overflate-antigenkodingssekvensen ble oppnådd ved vanlige rekombinante DNA-teknikker fra pRIT10616 beskrevet i EP-A-0278940 og i Harford et al., 1987. pRIT10616 inneholder genomet fra et HBV-virus av adw-serotype klonet på pACYC184 og ble deponert i American Type Culture Collection under betingelsene ifølge Budapest-traktaten 2. juni 1982 under adkomstnummer ATCC39131.

De heftende ender av S-genfragmentet og av det BamHI-spaltete pP/T-24C ble gjort stumpendet ved utfylling før ligering. Ligering av fragmentet i den riktige orientering regenererer nabo-BamHI- og Ncol-seter på konstruksjonen umiddelbart 5' til S-genkodingsområdet. Det resulterende plasmid er kalt pRB-S.

Eksempel A. 3

Konstruksjon av plasmider som inneholder en funksjonell ekspresjonskassett omfattende Hansenula polymorpha-avledete promotorer, hepatitt B-overflateantigen og Hansenula polymorpha-terminator.

pBR322-derivatene pBR322-MP og pBR322-FMD-P-9 inneholdende henholdsvis MOX- eller FMD-promotorene, ble fordøyd med EcoRI, og de heftende ender ble utfylt ved anvendelse av Klenow-polymerase. Plasmidene ble så spaltet med Sali. Det resulterende fragment som inneholder MOX-promotoren, omfatter utelukkende Hansenula polymorpha-genom-DNA, mens fragmentet som omfatter FMD-promotoren, i tillegg inneholder 275 bp av pBR322-sekvenser (posisjon bp 375 til bp 650 på pRB322-kartet).

Plasmid pRB-S ble kuttet ved det regenererte BamHI-setet, setet ble gjort stumpendet ved utfylling med Klenow-polymerase, og deretter ble plasmidet fordøyd med Sali. Promotorfragmentene med en heftende Sali-ende og en stump ende ble ligert med det store Sall-stumpendefragment av pRB-S inneholdende S-genkodingsområdet og Hansenula polymorpha-terminatoren. De resulterende plasmider er kalt pRB-S-269 (MOX-promotor) og pRB-S-271 (FMD-promotor, minus 9- utelukkelse) og inneholder S-genet under kontroll av Hansenula polymorpha-promotoren og -terminatoren som vist på fig. 4. Sekvensen som omgir fusjonsstedet mellom promotorer og S-gen, er vist skjematisk nedenfor.

Plasmider konstruert identisk med pRB-S-271 og pRB-S-269, men som mangler innskuddet av 440 bp-restriksjonsfragmentet som bærer HARS1-sekvensene, ble kalt pRB-S-269I og pRB-S-271I. Disse plasmider ble anvendt til oppnåelse av integranter inneholdende 1-3 kopier av ekspresj onskassetten.

Eksempel A. 4

Konstruksjon av integrative vektorer inneholdende S-genet.

a) Konstruksjon av plasmid pBC inneholdende autonomt replikerende Hansenula polymorpha-sekvenser og H. polymorpha-URA3-gen.

Plasmid pBC fås fra plasmid YRp7 (Tschumper og Carbon, 1980) inneholdende Saccharomyces cerevisiae-ARS1-sekvensen. Denne autonomt replikerende sekvens ble inaktivert ved innsetting av et 5400 bp Bglll-SphI-fragment omfattende Hansenula polymorpha-URA3-genet. Dessuten ble den autonomt replikerende Hansenula-sekvens 1 (HARS1) klonet i Sall-setet i tetracyklinresistens-genet (fig. 5).

b) Innsetting av ekspresjonskassetter i plasmid pBC.

Plasmid pRB-S-269 ble fordøyd med BspMII og Sali.

Det resulterende fragment, som hadde ekspresjonskassetten omfattende MOX-promotoren, det hepatitt B-overflateantigen-kodende område og terminator ble gjort stumpendet og ligert til plasmid pBC etter spaltning med Xhol og Stul og utfylling av de heftende Xhol-ender. Det resulterende plasmid pMS-2 inneholder S-genekspresjonskassetten omgitt av flankerende sekvenser av Hansenula polymorpha URA3-genfragmentet.

For integrering av S-genekspresjonskassetten i Hansenula polymorpha-genomet, ble plasmid pMS2 spaltet med Nhel, og det resulterende fragment på 6,1 kb ble anvendt til transformasjon av cellene.

Vektor pFS-9 ble konstruert på analog måte, bortsett fra at ekspresjonskassetten ble isolert fra pRB-S-271 som inneholdt FMD-promotoren.

En detaljert beskrivelse av de resulterende plasmider er vist på fig. 5.

Eksempel A. 5

Konstruksjon av plasmider omfattende S-genekspresjonskassetten og et ytterligere selektivt markørgen.

a) Konstruksjon av basisplasmid pHK2

For konstruksjon, av plasmid pHK2 (fig. 6; deponert under

betingelsene ifølge Budapest-traktaten i DSM (DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) under adkomstnummer 5328, 27. april 1989), ble kanamycinresistensgenet isolert fra transposon Tn5 (Gindley og Joyce, 1980) . Unødvendige sekvenser ble utelukket ved behandling av strukturgenet med nuklease Bal31. Det resulterende fragment som omfattet kanamycinstrukturgenet innbefattende kanamycinterminatoren, ble ligert med Saccharomyces cerevisiae ADH1-promotoren (Hitzeman et al 1981). Videre ble HARS1-sekvensen innført som et 440 bp Sall-fragment i plasmidet. b) Konstruksjon av kanamycinresistente stammer avledet fra pRB-S-269 og pRB-S-271.

Hindlll-fragmentet fra pHK som omfattet kanamycinresistens-kodingsområdet (3,5 kb) ble klonet i HindiII-setet som fantes i HARS1-sekvensen i plasmidene pRB-S-269 og pRB-S-271. De resulterende plasmider kalles henholdsvis pRB-S-322 og pRB-S-326 og er vist på fig. 7.

Eksempel A. 6

Konstruksjon av et moderplasmid for ekspresjon av preS-proteiner.

Plasmid pP/T-24 (eksempel A.2) ble rekonstruert for oppnåelse av et plasmid pMOX - P/Tl (fig. 8) som bærer en universal ekspresjonskassett omfattende MOX-promotoren, et multippel-kloningssete og MOX-terminatoren.

For innføring av en kopling inneholdende restriksjonsseter for restriksjonsendonukleasene Sali, EcoRI, Bglll og BamHI, ble pUC19-koplingen fra plasmid pP/T-24 delvis erstattet av syntetisk DNA inneholdende restriksjonsseter for de ovenfor nevnte enzymer.

Plasmid pP/T-24 ble spaltet med restriksjonsendonukleasene BamHI og Sali. Disse seter stammer fra pUCl9-koplingen (BamHI) og pME4 (Sali). Koplingsmolekylet inneholdende restriksjonssetene for Sali, EcoRI, Bglll og BamHI ble innført. Det resulterende plasmid pTl ble fordøyd med EcoRI og Sali, og MOX-promotoren ble innført som et 1,5 kb EcoRI-Sall-fragment som ga plasmid pT2. De aktuelle områder på plasmid pT2 er vist nedenfor:

Videre inneholder plasmid pT2 Hansenula polymorpha ARS- og Saccharomyces cervisiae URA3-genet som i plasmid pRB-269 (fig. 3).

Det neste konstruksjonstrinn var erstatningen av Saccharomyces cervisiae URA3-genet med URA3-genet fra en Hansenula polymorpha. En klon som inneholdt dette gen, ble isolert som beskrevet nedenfor i eksempel A.9. URA3-genet ble isolert som et 1,2 kb BamHI-Bglll-fragment. Mens Bglll-setet er et opprinnelig genom-sete, var BamHI-setet resultatet av ligering av et Sau3A-sete med et BamHI-sete anvendt for konstruksjon av genombiblioteket. De heftende ender på dette BamHI-Bglll-fragment ble utfylt ved Klenow-polymerase og innført i Aval-setet i pBR322, som også var blitt utfylt med Klenow-polymerase. Aval-setet ble regenerert ved ligeringen, og det resulterende plasmid ble betegnet pURA3-Pl.

Plasmid URA3-P1 ble fordøyd med Nrul og BspMII. Disse seter stammer fra pBR322, posisjonene bp 974 og bp 1664 på det vanlige pBR322-kart. Plasmid pT2 ble underkastet fullstendig fordøying med Nrul (bp 974 i pBR322) og delvis spaltet med BspMII.

Det er 2 BspMII-seter i pT2: Det første i pBR322 (bp 1664), det andre finnes i MOX-terminatoren. Nrul-BspMII-fragmentet av pT2 (1800 bp) inneholder URA3-genet fra Saccharomyces cerevisiae. Nrul-BspMII-fragmentet fra URA3-P1 som bærer Hansenula polymorpha URA3-genet, ble klonet i pT2, og erstattet S. cerevisiae URA3-genet på det tilsvarende Nrul-BspMII-fragment. Det resulterende plasmid pT3 inneholder MOX-terminatoren, en kopling, MOX-promotoren og Hansenula polymorpha URA3-genet etter hverandre. Plasmid pT3 mangler imidlertid et funksjonelt S-laktamasegen som i moderplasmid pME4. For erstatning av dette defekte £-laktamasegen med et funksjonelt gen, ble pBR322 fordøyd med EcoRI, de heftende ender utfylt med Klenow-polymerase og ligert til en 8 bp Asp718-kopling fulgt av fordøying med Pvul (posisjon 3738 på pBR322-kartet). Det således oppnådde Asp718-Pvu-fragment på 633 bp bærer den opprinnelige promotor og translasjoninitieringskodonet fra fi-laktamasegenet.

Plasmid pT3 ble underkastet spaltning med Asp718 (Asp718 finnes i enden av MOX-terminatoren) og delvis spaltning med Pvul. Asp718-Pvul-fragmentet oppnådd som beskrevet ovenfor, ble så innført i det for-behandlete pT3, hvilket ga plasmidet pMOX-P/Tl.

Plasmid pMOX-P/Tl er vist på fig. 8. Dette plasmid inneholder et funksjonelt beta-laktamasegen.

Eksempel A. 7

Konstruksjon av plasmider som uttrykker pre-S-proteiner.

Pre-S-genet som koder for preSl-S2-S-proteinet (det store protein) i hepatitt B-virus, ble oppnådd som et Ncol-Hindlll-fragment fra pRIT12816. pRIT12816 er en vanlig pBR322-basert E. coli-vektor inneholdende et 1185 bp NcoI-HindIII-fragment som koder for preSl-S2-S-proteinet fra Ncol ved ATG-kodonet (CCATGG) til Hindlll ved 15 bp utover TAA stoppkodonet (....AAGCTT). preSl-S2-S-kodingssekvensfragmentet ble oppnådd ved vanlige kloningsteknikker fra pRIT10616 beskrevet i EP-A-0278940 og i Harford et al., 1987. Et 861bp fragment som koder for preS2-S-sekvensen, kan også fås fra dette på vanlige måter. NcoI-HindIII-fragmentet ble gjort stumpendet ved utfylling med Klenow-polymerase og klonet i EcoRI-setet i pMOX-P/Tl, som også var gjort stumpendet. Som en følge av riktig ligering, regenereres EcoRI-setet foran preSl-strukturgenet ved NcoI/EcoRI-stumpendet ligering. Konstruksjonen som uttrykker preS-genet under regulering av MOX-promotoren, kalles pMPS-22. Dette er vist på fig. 8.

Den analoge konstruksjon inneholdende FMD-promotoren, kalles pMPS-21.

Eksempel A. 8

Konstruksjon av en vektor inneholdende en preS-ekspresjonskassett.

SalI-Asp718-ekspresjonskassetten fra plasmid pMPS22 ble gjort stumpendete ved utfylling, og innført mellom det utfylte Xhol-setet og Stul-seter på plasmid pBC beskrevet i eksempel A4a ovenfor. Det resulterende plasmid kalles pMPS-9 og er vist på fig. 9.

Eksempel A. 9

Kloning av Hansenula polymorpha URA3-genet.

URA3-genet fra Hansenula polymorpha ble klonet ved komplementering av den tilsvarende pyrF-mutasjon av E. coli stamme MB 1000.

Genom-DNA-fragmenter i størrelsesområdet fra 6-9 kbp ble isolert via partialfordøying med Sau3A, separasjon på en lavtsmeltende agarosegel og isolering av den hensiktsmessige DNA-fraksjon.

De rensete fragmenter ble ligert i det unike BamHI-setet i vektor YRp7, inneholdende en autonomt replikerende sekvens av Hansenula polymorpha innført i Sall-setet. Den resulterende ligeringsblanding ble anvendt til transformering av E. coli stamme MB 1000, og transformanter ble utvalgt på minimal-plater uten uracil. Oppnådde transformanter ble analysert, og plasmidene ble isolert. Et subfragment som vist på fig. 10, ble isolert, hvilket ga gjenopprettelse av URA<+->fenotypen i E. coli-, Saccharomyces cerevisiae- og Hansenula polymorpha-orotidin 5'-monofosfat-dekarboksylase-mutanter. Strukturen av den klonete DNA ble vist å være identisk med strukturen av genom-URA3-området ved "Southern blotting". Et restriksjonskart over Hansenula polymorpha URA3-genfragmentet er vist på fig. 10.

Del B

Ekspresjon av hepatitt B- overflateantigen / HBsAG) i Hansenula pol<y>morpha

Eksempel B. l

Konstruksjon av Hansenula polymorpha- st amme r inneholdende S- genet

Hansenula polymorpha RB 10 ble transformert med de ovenfor beskrevne plasmider pRB-S-269, pRB-S-269-I, pRB-S-271 og pRB-S-271-I. Flere kloner som bar autonomt replikerende plasmider (transformanter) eller integrert fremmed DNA (integranter) ble oppnådd.

Disse transformanter/integranter ble så undersøkt med hensyn til ekspresjon av S-gen under anvendelse av immunanalyser. To forsøkssystemer ble anvendt: "Western blotting" og AUSRIA- eller AUSZYME-forsøk (Abbott). Dannelsen av HBsAg-monomer ble analysert ved "Western blotting" under anvendelse av monoklonale RF6-antistoffer. Abbotts AUSRIA- eller AUSZYME-forsøkssett ble anvendt i henhold til instruksjonene fra fabrikanten for bestemmelse av mengden av HBsAg-partikler dannet i Hansenula. Transformanter som viste stabilt og høyt ekspresjonsnivå, ble utvalgt, og deres DNA analysert ved "Southern blotting" etter elektroforetisk separasjon.

a) Transformanter

Flere kolonier som bar det fritt replikerende plasmid ble

oppnådd fra Hansenula polymorpha transformert med plasmidene pRB-S-

269 og pRB-S-271. "Southern"-analyse av den totale mengde DNA oppnådd fra disse transformanter spaltet med forskjellige restriksjonsendonukleaser viste det ventete restriksjonsmønster.

b) Integranter

Hansenula polymorpha kan transformeres med de integrative

vektorer pRB-S-269-I og pRB-S-271-I ved høy frekvens. Integranter dyrket på komplett medium (YEPD) er mitotisk stabile. Alternativt kan mitotisk stabil opprettholdelse av en fremmed DNA i Hansenula også fås ved fremgangsmåten beskrevet ovenfor, hvor en autonomt replikerende vektor, fortrinnsvis et plasmid med høyt kopiantall såsom pRB-S-269 eller pRB-S-271, integreres spontant i genomet. De resulterende integranter viser også høy mitotisk stabilitet av det fremmede DNA.

Begge fremgangsmåtene som er nevnt ovenfor ble anvendt for oppnåelse av stammer som effektivt uttrykte S-genet i ikke-selektivt komplett medium. 3 stammer ble beholdt; stammen med identifikasjonsnummer 352, som var transformert med pRB-S-271, hvor S-genet reguleres ved FMD-promotoren, og stammer nr. 415 og 416, som var transformert med pRB-S-269 inneholdende et MOX-regulert S-gen, ble anvendt for videre forsøk.

Eksempel B. 2

Mitotisk stabilitet av fremmed DNA i integranter

Stabiliteten av de rekombinante stammer 352, 415 og 416 ble utprøvd ved følgende fremgangsmåte: Stammene ble dyrket i ikke-selektivt SMR-medium i 4 0 generasjoner. Tolv uavhengige kolonier ble isolert fra kulturene før og etter 40-generasjonsperioden. Strukturen av det fremmede DNA og kopiantallet av ekspresjonskassetten ble undersøkt i de isolerte kloner ved "Southern blot"-analyse i kombinasjon med agarosegelelektroforese av restriksjons-fragmenter og pulsfelt gradient-gelelektroforese av totalkromosomer. Sistnevnte teknikk gjør mulig separasjon og analysering av gjær-kromosomer (Schwartz og Cantor, 1984).

Pulsfelt- gelelektroforese( PFGE)

Celler fra stammene 415, 416 og 352 ble underkastet mild lyse i prøvebrønnene i en 0,7 vekt/volum-prosent agarosegel. Kromosomene som ble frigjort in situ, ble separert under anvendelse av et apparat av typen LKB-Pharmacia Pulsaphor Plus i henhold til instruksjonene fra LKB-Pharmacia. Etter PFGE ble DNA overført til nitrocellulose i henhold til fremgangsmåten ifølge Southern (1975). Flekken ("blot") ble underkastet hybridisering under anvendelse av<32>P-merkete prober som enten var spesifikke for MOX- og/eller FMD-genet eller URA3-genet fra Hansenula polymorpha, idet det er kjent at sistnevnte er tilstede som en enkelt kopi i genomet.

Sammenlikning av signalene fra eventuelle multimere integranter med signalene fra enkeltkopigener (indre markører) gjorde mulig beregning av kopiantallet av de aktuelle ekspresjonskassetter inne i cellen. Analyse av kromosomer ved PFGE viser at klon 415 har ca. 30-50 kopier av ekspresjonskassetten, mens klon 416 inneholder ca. 5-6 ekspresjonskassetter og klon 352 ca. 10 ekspresjonskassetter. Analysen viste at den fremmede DNA integreres i Hansenula- genomet.

Southern- analyse

Stammene 352, 415 og 416 ble dyrket i 40 generasjoner i SMR-medium. Tolv uavhengige kolonier ble isolert fra hver ladning før og etter ovennevnte vekstperiode. DNA-preparater fra disse subkloner ble så underkastet Southern-analyse etter spaltning med forskjellige restriksjonsenzymer og anvendelse av<32>P-merkete DNA-prober. Analyse av restriksjonsmønstrene viste at ekspresjonskassettene var intakte og at det innførte DNA var genetisk stabilt. Analysen viste videre at genomet fra stamme 415 inneholder lange repeterende enheter med flere kopier av plasmidet. Man trekker den slutning av plasmidet er anordnet i denne repeterende enhet på en "hode-til-hale"-måte.

Eksempel B. 3

Ekspresj onsundersøkelser

Rekombinante stammer ble analysert rutinemessig med hensyn til nærvær av HBsAG ved Western blotting og AUSRIA/AUSZYME-forsøk.

a) Dyrkning av kulturer og Western blotting.

Stammene 352, 415 og 416 ble dyrket ill kolber i 200 ml SMR-glycerolmedium ved 37°C med kraftig gjennomlufting. I begynnelsen av den stasjonære fase, som erkarakterisert veduttømming av glycerol, ble 50 ml/l av et fem ganger konsentrert SMR-medium som manglet glycerol, tilsatt sammen med metanol til en sluttkonsentrasjon på 10 g/l. Prøver med volum 10 ml ble uttatt fra kulturen før tilsetting av metanol og 24 timer etter tilsetting av metanol. For sammenlikningsformål ble de samme stammer også dyrket i SMR-medium som inneholdt 30 g/l glukose (oppheving av undertrykkelse av promotorer). Cellene ble høstet i slutten av log-fasen.

Fra de høstete celler ble råproteinekstrakter fremstilt ved suspensjon av en celleklump svarende til ca. 0,1 g tørrvekt i 5 ml PE-buffer (0,5 M NaCl, 0,1% Triton X-100, 10 mM fosfatbuffer pH 7,5, 2 mM PMSF). Omtrent et likt volum av glassperler med diameter 0,45 mm ble tilsatt til blandingen ble nesten fast. Blandingen ble underkastet kraftig risting i 4 minutter ved 4°C under anvendelse av en homogenisator av typen Braun MSK (B. Braun und Diessel Biotech GmbH, Melsungen, BRD). Deretter ble 4 ml PE-buffer tilsatt, og homogenatet ble blandet og sentrifugert i 5 minutter ved 4°C, 40 000 xg. Porsjoner på 5-25/xg av supernatanten ble underkastet SDS-polyakrylamidgelelektroforese under anvendelse av renset HBsAg (0,05-0,5/xg) som kontroll. Tilstedeværelsen av antigent materiale ble vist ved overføring av proteinet til nitrocellulose i henhold til fremgangsmåten ifølge Towbin (1979) og påvisning med det monoklonale antistoff RF6 som beskrevet i fremgangsmåte 5a ovenfor. Western blot gjør mulig en beregning av mengden av det dannete antigen i klonene 352, 415 og 416, ved henvisning til de kjente mengder rent gjæravledet HBsAg.

Resultatene er oppsummert i tabell 1. I metanol-induserte kolbekulturer (SMR-medium) med en celletetthet på ca. 5 g tørrvekt/1 utgjør S-proteinet ca. 2-5% av den totale mengde ekstrahert protein fra transformerte stammer.

Sammenlikning av ekspresjon i celler dyrket under betingelser med induksjon (metanol), opphevet undertrykkelse (glycerol) og undertrykkelse (glukose) viser en meget streng regulering av MOX- og FMD-promotorene. Ekspresjonen er fullstendig blokkert i glukose-dyrkete celler. I glycerol er syntesen av HBsAg ca. 3 0% av nivået oppnådd i induserte celler.

b) Antigenisitet av HBsAg uttrykt i Hansenula polymorpha. Antigenisiteten av materialet i råekstrakter ble målt ved

anvendelse av en Abbott AUSZYME-analyse basert på monoklonale antistoffer. Resultatene ble uttrykt som vilkårlige enheter (absorbans ved 4 92 nm pr. 0, 1 ug protein; fortynning av råekstrakter og reaksjonen ble utført i 150 mM NaCl, 25 mM fosfatbuffer pH 7,4, 0,01% BSA, 0,01% Tween 20). Reaktiviteten med AUSZYME angir tilstedeværelsen av konformasjonelle epitoper karakteristiske for subviruspartikler. c) Tetthetsgradientsentrifugering av råekstrakter av H. polymorpha.

Råekstraktene oppnådd i henhold til fremgangsmåten beskrevet ovenfor, ble underkastet tetthetsgradientsentrifugering under anvendelse av enten CsCl- eller sakkarosegradienter. Sakkarose-likevektssedimenteringsgradientsentrifugering ble utført ved påsetting av 100-200/xg (200 til) av råproteinekstraktet på toppen av en 20-50% sakkarosegradient i 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, 25 mM NaP04, pH 7,2. Rør med volum 5 ml ble sentrifugert i 18 timer ved 40 000 rpm i en rotor av typen Beckman SW 50.1.

Cesiumklorid-gradientsentrifugering ble utført ved fortynning av

1volumdel av råproteinekstraktet med 1 volumdel 3 M CsCl i 25 mM fosfatbuffer pH 7,4. Sentrifugeringen ble utført ved 4°C, 40 000 rpm i en rotor av typen Beckman 50 Ti i 40 timer.

Gradientene ble underkastet fraksjonering og de forskjellige fraksjoner undersøkt under anvendelse av RF6-antistoffer i Western blotting eller under anvendelse av AUSRIA- og/eller AUSZYME-analyser. Det kunne vises at en topp av HBsAg-materialet med en tetthet på ca. 1,16-1,19 g/ml dannes i en CsCl-tetthetsgradient. Materialet i denne topp reagerer meget godt ikke bare med RF6-antistoffer i Western blot, men også i AUSRIA- og AUSZYME-analysene. Denne tetthet, såvel som reaktivitet i AUSRIA/AUSZYME-analysene angir tilstedeværelse av konformasjonelle epitoper karakteristiske for partikler. I et ytterligere forsøk ble dessuten tettheten av dette materialet sammenliknet med subviruspartikler isolert fra humant serum. Det kunne vises at begge materialene finnes i sammen-liknbar tetthet ved isopyknisk sentrifugering i CsCl-oppløsninger.

Sakkarosegradientsentrifugering av råekstrakter ga toppfraksjoner som reagerte i AUSRIA og AUSZYME og som utgjorde minst 8 0% av HBsAg, vist ved analyse av gradientfraksjoner i parallell med AUSRIA/ AUSZYME og Western blotting. De resterende 20% av materialet finnes hovedsakelig i topp- og bunnfraksjonene av gradienten og reagerer bare i Western blott-analyse, hvilket viser at dette materialet utgjør den monomere form av proteinet. Analyse av toppfraksjoner oppnådd fra CsCl-gradienter viste også at minst 80% av materialet danner partikler.

De Hansenula-avledete partikler er resistente overfor proteolyse. Inkubering av råproteinekstrakter inneholdende partikler i flere timer ved forskjellige temperaturer viser bare en meget liten nedbrytning, vist ved undersøkelse av AUSZYME-verdiene og analysering av uskaddheten av polypeptidet ved denaturerende SDS-PAGE fulgt av Western blot. Materialet ble videre analysert ved elektronmikroskopering. Elektronmikroskopibildene viser tydelig partikler med en diameter på ca. 22 nm.

De ovenfor beskrevne resultater ble oppnådd for alle de tre stammene (352, 415 og 416).

Del C

Ekspresjon av preSl- S2- S- protein i Hansenula yolymorpha

Eksempel Cl

Konstruksjon av Hansenula polymorpha - stammer inneholdende preSl- S2-S- crenet

Hansenula polymorpha RB 10 ble transformert med Pvul-Asp718-fragmentet på 5570 bp fra pMPS-22, omfattende URA3-genet og preSl-genet under regulering av MOX-promotoren (se fig. 8). Videre ble det tilsvarende fragment som bar preSl-genet under regulering av FMD-promotoren (-9-delesjon) oppnådd fra plasmid pMPS-21. Integrantene fra disse transformasjoner ble vist å inneholde 1-2 ekspresjonskassetter ved Southern-analyse. Integranter som inneholdt preSl-genet under regulering av MOX-promotor, omtales som preS-AM; integranter som inneholdt preS-genet under regulering av FMD-promotor, er omtalt som preS-AF.

Integranter som inneholdt flere ekspresjonskassetter, ble oppnådd ved transformasjon av Hansenula polymorpha med autonomt replikerende plasmider pMPS22 og pMPS21 som bar HARS-sekvensen. Integranter ble dannet ved spontan integrering av disse plasmider som beskrevet under "Materialer og metoder", punkt 2b. Disse transformanttyper ble gitt den generelle betegnelse preS-BM (MOX-promotor) og preS-BF (FMD-promotor) .

Stammene preS-AM-405, preS-BM-402, preS-BM-403 og preS-BM-454, hvor ekspresjon av preSl-genet reguleres ved MOX-promotoren, ble beholdt for ytterligere analyse.

2 . Mitotisk stabilitet

Mitotisk stabilitet av det fremmede DNA i de fire stammer identifisert i eksempel Cl ovenfor ble undersøkt ved Southern-analyse av 12 uavhengige subkloner isolert før og etter en 4 0 generasjoners vekstperiode som beskrevet i del B. Analysen bekreftet den genetiske stabilitet av de integrerte vektorer (se også et eksempel i del D.3).

3 . Ekspresjon av preS- protein i Hansenula volymorpha

Stammene preS-BM-402, preS-BM-403, preS-AM-405 og preS-BM-454 ble dyrket på SMR-medium som inneholdt glycerol, fulgt av induksjon av cellene med metanol (10 g/l) nøyaktig som beskrevet i del B. Cellene ble høstet 25 timer etter tilsetting av metanol, og råekstrakter ble fremstilt som beskrevet i del B. a) Mengder på 12 fig av råekstrakter av stammene preS-BM-402, preS-AM-405 og preS-BM-454 ble analysert ved polyakrylamid-SDS-gelelektroforese fulgt av Western blotting under anvendelse av en blanding av monoklonale antistoffer (Sl.l, S2.2 og S2.5) som beskrevet i "Metoder 5 (a)". Begge typer stammer viste et antigent dobbeltbånd ved 38/39 kD og et ytterligere bånd ved 45 kD.

Stamme preS-AM-405 viste et lavere innhold av 45 kD-typen i forhold til 3 9 kD-materialene enn stamme preS-BM-402; stamme preS-BM-454 viste det høyeste relative innhold av 45 kD-typen.

Elektroforesemønsteret for preS-proteinet fra ovennevnte stammer ble sammenliknet med antigen som stammet fra humane serumpartikler. Både human- og gjærpreparater viste et bånd ved ca. 38/3 9 kD sammenliknet på Western blot.

b) En variasjon i ekspresjonsnivået for forskjellige stammer ble også sett. Disse forskjeller skyldtes sannsynligvis variasjoner

i kopiantall av ekspresjonskassetten mellom stammene. PreS-antigenet ble bestemt ved Western blotting til å utgjøre 0,1-1,5% av den totale mengde celleprotein i forskjellige preS-A- og preS-B-stammer, som oppført i tabell 2.

Råekstrakter ble også undersøkt med AUSZYME-analysen med hensyn til tilstedeværelse av partikler. Resultatene som vist i tabell 2 viser en meget lav reaktivitet uttrykt som A492-enheter pr. 0,1 fig protein.

c) Glykosylering: Stamme preS-BM-454,karakterisert vedhøy produksjon av preS-protein (ca. 1,5% av total mengde celleprotein)

og et uttalt 45 kD-bånd ble valgt for ytterligere undersøkelser med hensyn til glykosylering. PreS-protein fra preS-BM-454 ble analysert ved inkubering av råproteinekstraktene med EndoH-endoglykosidase. Følgende data viser klart av 45 kD-typen er en glykosylert form av preS-protein.

Ved inkubering av 45/xg råprotein i 0,5-1,0 og 24 timer med

0,5 mU EndoH-endoglykosidase i henhold til instruksjonene fra fabrikanten (Boehringer Mannheim, BRD), skiftet 45 kD-båndet til den tilsynelatende molekylvekt 42 kD. Denne skifting angir at 45 kD-typen er en N-glykosylert form av preS-protein, som bærer én "kjerne"-gruppe på ca. 3 0 00 D.

Tunicamycin, som er kjent for å være en potent inhibitor av N-glykosylering, ble også anvendt til undersøkelse av glykosyleringen av preS-protein i Hansenula polymorpha. Stamme preS-BM-4 54 ble dyrket til en tetthet på A600= 10,0 i YNB-medium som inneholdt glukose (10 g/l). 10 ml av denne kultur ble inokulert i 100 ml YNB som inneholdt 10 g/l metanol og 50 iig/ml tunicamycin. pH-verdien i mediet ble holdt konstant ved 7,2-7,5. Et kontrollforsøk ble utført uten anvendelse av tunicamycin. Cellene ble høstet 10, 15 og 30 timer etter inokulering av mediet som inneholdt tunicamycin.

Råproteinekstrakter ble analysert ved Western blotting. Under-søkelsene viste at i cellene dyrket i nærvær av tunicamycin er et enkelt bånd ved 42 kD og et dobbeltbånd ved 38/39 kD synlig.

I kontrollforsøket ble 42 kD-båndet erstattet med et 45 kD-bånd. Liknende resultater ble oppnådd med ekstrakter fra stammene preS-BM-402, preS-BM-403 og preS-AM-405, som imidlertid danner mye lavere mengder av 45 kD-proteintypen (ikke mer enn 5-10% av den totale mengde syntetisert preS-protein). Resultatene antyder at 42 kD-bånder representerer en O-glykosylert form av preS-protein.

d) Tetthetsgradientsentrifugering

Råekstrakter fra stamme preS-AM-405 og stammene preS-BM-402,

preS-BM-403 og preS-BM-454 ble underkastet analyse ved sakkarose- og CsCl-gradientsentrifugeringer. Betingelsene ble beskrevet i del B 3(c). Gradientfraksjonene ble undersøkt ved Western blotting og AUSZYME-forsøk.

Analysen viste at i motsetning til stammer som uttrykte S-antigen (del B) eller både preSl- og S-antigener (del D), danner ikke preS-stammene effektivt subviruspartikler. Hverken isopyknisk CsCl- eller sakkarosegradientsentrifugering viste dannelse av et bånd med den fordrete tetthet. Dette ble også bekreftet ved det faktum at det HBsAg-beslektete materialet fra gradientfraksjoner og råekstrakter reagerte dårlig i AUSRIA- eller AUSZYME-forsøkene.

Del D

Dannelse av komposittpartikler inneholdende både preS- og S-antiaener

Eksempel D. l

Konstruksjon av stammer

Det ble konstruert flere stammer som erkarakterisert vedforskjellige forhold mellom preSl- og S-ekspresjon og forskjellige totalekspresjonsnivåer.

Disse forskjeller ble oppnådd ved variasjon av kopiantallet av ekspresjonskassetter pr. genom. Ytterligere variabilitet ble oppnådd ved at genene ble satt under regulering av forskjellige Hansenula-promotorer.

Tre basistyper av rekombinante stammer ble oppnådd som følger:

a) Stammer som inneholdt én kopi av preSl-genet og én kopi av S-genet (A-stammer).

Nhel-DNA-fragmentet på 6,6 kb som inneholdt preSl-kassetten og URA3-genet ble isolert fra plasmid pMPS9 (fig. 9). Et Nhel-DNA-fragment som inneholdt S-genet ble isolert fra plasmid pMPS2 (fig. 5). Fragmentene ble ligert under anvendelse av T4 DNA-ligase, og sammenføyde fragmenter som besto av én kopi av hvert av genene, ble isolert fra agarosegeler. Disse fragmenter ble anvendt til transformering av Hansenula polymorpha stamme RB 10 til uracil-uavhengighet.

De resulterende transformanter ble analysert ved Southern blotting, og kloner som inneholdt én integrert kopi av hver kassett, ble utvalgt. Stamme preS/S-A-293 ble beholdt for ytterligere analyse. b) Stammer som inneholdt én preS-ekspresjonskassett og flere S-ekspresjonskassetter (B-stammer).

Hansenula polymorpha ble transformert med Asp718-PvuI-fragmentet på 5570 bp fra pMPS-22 som inneholdt preSl-ekspresjonskassetten. Transformanter som bar én integrert kopi av kassetten ble valgt. Stammen som ble beholdt var preS-AM-405, beskrevet i del Cl ovenfor.

Stamme preS-AM-405 ble så transformert med autonomt replikerende plasmider pRB-S-326 (FMD-promotor) eller pRB-S-322 (MOX-promotor)

(fig. 7) som inneholdt S-genet under regulering av de respektive promotorer. Begge plasmider bærer dessuten et gen som koder for resistens overfor gentamycin G418 som selektiv markør. Kan-genet er under kontroll av Saccharomyces cerevisiae ADH1-promotoren (fig. 7) som beskrevet ovenfor. Transformasjon ga flere stammer som alltid inneholdt én integrert kopi av preSl-kassetten og multiple integrerte kopier (30-100) av den S-gen-holdige kassett som vist ved Southern blot- og PFGE-analyser.

Stammene preS/S-B-431, preS/S-B-432 og preS/S-B-433 ble beholdt for ytterligere analyse. Stamme preS/S-B-431 bærer et MOX-promotor-regulert S-gen, mens preS/S-B-432 og preS/S-B-433 inneholder ekspresjonskassetter som omfatter FMD-promotoren. c) Stammer som inneholder flere ekspresjonskassetter både av S- og preS-genene (C-stammer).

Hansenula polymorpha ble transformert med det autonomt replikerende plasmid pMPS-22 som inneholdt preS-l-genet (fig. 8). Transformasjon ga flere stammer som inneholdt variable antall ekspresjonskassetter integrert i genomet. Isolater som inneholdt 2-20 preSl-ekspresjonskassetter, ble identifisert ved Southern blotting. Disse stammer er beskrevet i del C som preS-BM-402, preS-BM-403 og preS-BM-454 og uttrykker forskjellige mengder preS-antigen. Disse preS-stammer ble så igjen transformert med autonomt replikerende plasmider pRB-S-322 (MOX-promotor) og pRB-S-326 (FMD-promotor), som bærer S-genet (fig. 7). Resistens overfor G418 ble anvendt som transformasjonsmarkør. Utvelgelse med hensyn til stabile integranter ga flere kloner for.hver transformasjon, hvorav noen ble analysert ytterligere. Stammer som ble beholdt for ytterligere analyse var preS/S-C-452, preS/S-C-465 avledet fra stamme preS-BM-402, stamme preS/S-C-466 avledet fra stamme preS-BM-403, stamme preS/S-C-448-C4 avledet fra stamme preS-BM-454 hvor S-gen-ekspresjonskassettene omfatter FMD-promotoren. Tabell 3 gir detaljert informasjon angående de ovenfor beskrevne stammers opprinnelse og betegnelse.

Eksempel D. 2

Ekspresjon av preS- og S- proteiner i H . polymor<p>ha

Ekspresjon av preS- og S-proteiner i forskjellige transformant-stammer av H. polymorpha ble undersøkt ved immunblotting som beskrevet ovenfor under Materialer og metoder 5a og ved AUSZYME-analysen. En oppsummering av resultatene og egenskapene hos de forskjellige utprøvde stammer er oppført i tabell 3.

Stammer som både uttrykker preS- og S-proteinene, ble dyrket og indusert som beskrevet under del B, punkt 3, bortsett fra at det ble anvendt 3 0 ml dyrkningsvolumer. Råcelleekstrakter ble fremstilt som beskrevet ovenfor og underkastet SDS-polyakrylamidgelelektroforese fulgt av Western blotting under anvendelse av RF6 eller en blanding av monoklonale Sl.l- og S2.1-antistoffer for påvisning. Mengder på 12-15 fig av råekstrakter fra metanolinduserte celler av stammene preS/S-A-293, preS/S-B-431, preS/S-B-432, preS/S-B-433, preS/S-C-453, preS/S-C-465, preS/S-C-466 og preS/S-C-448-C4 ble immunblottet under anvendelse av monoklonalt RF6 for påvisning. Denne analyse viser at et spektrum av stammer kan oppnås som uttrykker forskjellige forhold mellom preS- og S-protein. Ut fra disse og andre immunblott ble forholdet mellom preS- og S-protein i stamme preS/S-B-431 beregnet å være ca. 1:15, i stamme preS/S-C-452 ca. 1:8 og i stamme preS/S-448-C4 ca. 5:3. Stammene ble funnet å være forskjellige også ved sitt produktivitetsnivå både ved immunblotting og ved AUSZYME-analyse som vist i tabell 3. Celleekstrakter fra disse stammer ble også immunblottet under anvendelse av monoklonalt Sl.l for påvisning. I de fleste stammer påvises preS-proteinet som dublettproteinbåndet ved 38-3 9 kD, med mindre mengder av 4 5 kD-båndet (som er beregnet å omfatte bare ca. 5% av den totale mengde påvist preS-protein) . I motsetning til dette uttrykker preS/S-C-448-C4 omtrent ekvivalente mengder av 38-39 kD- og 45 kD-typene.

Eksempel D. 3

Stabilitet av det fremmede DNA

Stabiliteten av det fremmede DNA i de ovenfor beskrevne preS/S-transformanter og -integranter ble analysert som beskrevet i del B. Undersøkelsene angir meget god mitotisk stabilitet av de rekombinante kloner. Southern-analyse av 12 uavhengige kolonier isolert før og etter en 4 0-generasjons-fermentering av stammene preS/S-453 og preS/S-431 viser at i alle tilfeller var det samme restriksjons-fragmentmønster synlig. PreS/S-stammene som er oppregnet i tabell 3, ble også analysert ved pulsfelt-gradientelektroforese. De separerte kromosomer ble blottet på nitrocellulosemembraner og deretter hybridisert med forskjellige radioaktive DNA-prober. Fremgangsmåten muliggjør beregning av antall kopier av S-ekspresjonskassetten og var et avgjørende bevis for at preS/S-stammene er integranter. Resultatene av disse forsøk er oppsummert i tabell 3 ovenfor.

Eksempel D. 4

Isolasjon og karakteriserin<g>av komposittpartikler

a) Delvis rensing av komposittpartikler fra Hansenula polymorpha.

En fermenteringskultur av Hansenula polymorpha-stamme preS/S-B-431 ble dyrket i S-medium beskrevet ovenfor under Materialer, 5d, og cellene ble gjenvunnet ved sentrifugering etter 78 timers induksjon med metanol. Celleklumpen ble suspendert på nytt ved en konsentrasjon på ca. 120 g tørr cellevekt pr. liter i buffer som inneholdt 0,5 vekt/volumprosent Tween 20, 2 mM EDTA, 4 mM PMSF, 5 volumprosent isopropanol og 50 mM natriumfosfatbuffer pH 9,0. Cellene ble knust i en kulemølle (Dynomill type KDL, Bachofen AG, Basel, Sveits) som inneholdt glasskuler med diameter 0,45-0,7 mm under anvendelse av fire passeringer ved en strømningshastighet på 6 liter pr. time og en oppholdstid på 7 minutter i kammeret.

Celleekstraktet ble klaret ved sentrifugering i 45 minutter ved 16 000 g ved 4°C, og supernatanten fjernet. 1 vekt/volumprosent kolloidalt silisiumdioksyd (Aerosil 380, Degussa, Frankfurt, BRD) ble så tilsatt til supernatanten under omrøring, og blandingen ble omrørt over natten ved 4°C for at adsorpsjon av HBsAg skulle skje. Silisiumdioksydet ble gjenvunnet ved sentrifugering i 30 minutter ved 4000 g ved 4°C og vasket to ganger med 0,9 vekt/volumprosent NaCl ved suspensjon av klumpen på nytt og sentrifugering på nytt. HBsAg adsorbert til silisiumdioksydet ble desorbert ved suspendering på nytt av den vaskete klump i 10 mM natriumpyrofosfat pH 9,5 og inkubering i 3 timer ved 37°C med konstant omrøring. Volumet av tilsatt natriumpyrofosfat-buf f er var ca. fra en åttedel til en tidel av det klarete begynnelsescelleekstraktvolum. Oppløsningen ble så sentrifugert ved 17 000 g i 60 minutter ved 4°C og supernatanten gjenvunnet.

Supernatanten ble gjort 1,5 M med CsCl og blandingen sentrifugert til isopyknisk likevekt i 70 timer ved 45 000 rpm i en 50.2 Ti-rotor (Spinco Division, Beckman Instruments, Palo Alto, USA). De resulterende CsCl-gradienter ble fraksjoner og fraksjoner undersøkt med hensyn til tilstedeværelse av HBsAg under anvendelse av et Elisa-analysesett (Enzygnost, Behring-Werke AG, Marburg, BRD) som beskrevet av fabrikanten. Toppfraksjoner ble blandet og dialysert mot 10 mM natrium/kaliumfosfat, 0,15 M NaCl pH 6,8. Analyser gjort på dette materialet og råcelleekstraktet viste at 48% av totalt AUSRIA-reaktivt materiale, under 3% av den totale mengde proteiner, under 0,2% av total mengde sukkerarter og under 2% av total mengde lipider ble gjenvunnet ved denne fremgangsmåte.

En celleklump av Hansenula polymorpha stamme preS/S-C-452 ble også ekstrahert ved nøyaktig samme fremgangsmåte med liknende resultater.

Prøver av de delvis rensete HBsAg-preparater fra preS/S-B-431-og preS/S-C-452-stammene ble undersøkt ved gelelektroforese og immunblotting under anvendelse av monoklonale antistoffer HBS1 og Sl.l for påvisning av HBsAg-beslektete proteiner som beskrevet i del D.4 nedenfor.

Immunblotting med monoklonalt HBS1 viste tilstedeværelse av et reaktivt bånd ved 24 kD og et ytterligere bånd ved ca. 38/39 kD i begge preparater. Immunblotting med monoklonalt Sl.l påviste bare det preSl-proteinbeslektete bånd ved 38/39 kD i begge preparater.

Dette viser at både preSl-protein- og S-proteintypene renses samtidig ved adsorpsjon med kolloidalt silisiumdioksyd og isopyknisk CsCl-tetthetsgradientsentrifugering. b) CsCl-tetthetsgradientsentrifugering av komposittpartikler.

En fermenteringskultur av H. polymorpha stamme preS/S-B-431 ble

dyrket i S-medium (Materialer, 5d) og høstet etter 73 timers induksj on med metanol. Celleklumpen ble gjenvunnet ved sentrifugering og suspendert på nytt, og et celleekstrakt ble fremstilt ved passering gjennom en French-presse som beskrevet nedenfor. Cellerester ble fjernet fra rålysatet ved sentrifugering i 30 minutter ved 17 000 g. Råcelleekstrakter ble så sentrifugert til likevekt ved 245 000 g i 1,5 M CsCl, fosfatbuffret saltoppløsning pH 7,5. Gradientene ble

fraksjoner og hver fraksjon analysert med hensyn til antigenisitet under anvendelse av ELISA-analyser spesifikke for HBsAg (Enzygnost: Behringwerke AG, Marbur, BRD) og med hensyn til preSl-protein. Enzygnost-forsøkene måler bare sammensatte HBsAg-partikler, ikke proteinmonomerer. Ved den preSl-protein-spesifikke Elisa-analyse anvendes monoklonalt museantistoff Sl.l for antigen oppfanging og

-påvisning, og denne er beskrevet nedenfor under del D.5.

En topp av HBsAg-aktivitet ble observert ved en tetthet på 1,18-1,19g/cm<3>i CsCl-gradienten. En hovedtopp- av preSl-protein-aktiviteten ble observert ved denne samme tetthet sammen med en mindre topp ved en tetthet på 1,26 g/cm<3>.

Gradientfraksjonene ble også analysert med hensyn til preSl-protein og S-protein ved immunblotting. Etter natriumdode-cylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese ifølge Laemmli (1970) og blotting på nitrocellulose ifølge Towbin et al. (1979), ble nitrocelluloseplaten inkubert med et polyklonalt kaninserum frembragt mot serumavledet HBsAg. Påvisning av antistoffbinding skjedde ved alkalisk fosfatase-metoden.

Et hovedproteinbånd ved 24 kD som svarte til S-proteinet, og et dobbeltbånd ved 38/39 kD ble observert. Den maksimale aktivitet i immunblottingen for alle de tre proteintyper var i CsCl-gradientfraksjoner med en tetthet på 1,18-1,19 g/cm3 som svarer til toppen av HBsAg-aktivitet målt i Enzygnost-forsøket. Dette viser at størstedelen av HBV-overflateantigenproteinene i råekstraktet er tilstede i en lipoproteinstruktur med en HBsAg-tetthetskarakteregenskap.

En ytterligere nitrocelluloseplate ble inkubert med monoklonalt museantistoff Sl.l. Dette antistoff påviste bare proteinbåndende ved 38/39 kD i fraksjoner som svarte til en CsCl-tetthet på 1,18-1,19 g/cm<3>.Råcelleektraktene ble også underkastet hastighet-sonal sentrifugering på sakkarosegradient. Råcelleektraktene ble påsatt på 5-20 vekt/volumprosent sakkarosegradienter tilberedt i 50 mM Tris-HCl-buffer pH 8,1 og sentrifugert ved 288 000 g i 200 minutter. Gradientene ble fraksjonert og fraksjonene analysert med hensyn til tilstedeværelse av HBsAg ved Enzygnost-Elisa-analysen og med hensyn til tilstedeværelse av preSl-protein-holdig HBsAg ved oppfanging av antigen med de HBsAg-spesifikke antistoffer fra Enzygnost-analysen og påvisning med preSl-protein-spesifikt Mab Sl.l. Enzygnost-analyse n viste en topp av HBsAg-aktivitet som ble bunnfelt gjennom gradienten.

Mab.1.1-Elisa viste den samme topp som Enzygnos-analysen, men

med en aktivitetsskulder som strakk seg til høyere sakkarose-tettheter. Denne skulder av materiale med en høyere bunnfelling-koeffisient elimineres når råekstrakter fra Hansenula polymorpha stamme preS/S-B-431 ble delvis renset ved adsorpsjon/desorpsjon på kolloidalt silisiumdioksyd og sentrifugering i en CsCl-gradient før analyse ved sakkarosetetthetsgradientsentrifugering. Disse resultater viser at både HBsAg og preSl-protein bunnfelles sammen i CsCl-tetthetsgradienter med en tetthetskarakteregenskap som hos lipoproteinpartikler.

c) Antigenisitet av kompositt- HBsAg- partikler uttrykt i H . polymorpha

HBV-overflateantigenpartikler ble delvis renset fra et

råekstrakt av H. polymorpha stamme preS/S-B-431 som beskrevet ovenfor under punkt 3a. Dette preparat ble undersøkt med hensyn til reaksjon med monoklonale museantistoffer (Mab) rettet mot epitoper på preSl-, preS2- og S-områdene på overflateantigenproteinet, og med hensyn til tilstedeværelse av reseptoren for polymerer av humant serumalbumin (pHSA-reseptor) på preS2-området.

Cl. Reaksjon med Mab Sl. l

Et monoklonalt museantistoff (Mab) Sl.l rettet mot en preSl-epitop på HBV-overflateantigenproteinet ble anvendt for påvisning av tilstedeværelse av dette sete på komposittpartikkelen ved en ELISA-analyse. Mab Sl.l ble belagt på brønnene i en mikrotiterplate (Immunobplate I; Nunc. Gibco Europe, Ghent, Belgia) og inkubert med det delvis rensete råekstrakt. Etter vasking for fjerning av ikke-bundet materiale, ble oppfanging av reaktive partikler påvist ved inkubering med Mab Sl.l koplet til pepperrotperoksydase ved fremgangsmåten ifølge Wilson og Nakame, 1978.

Fargeutvikling for påvisning av andre antistoffbinding skjedde med ortofenylendiamin som kromogen. Absorbans ble avlest ved 490 nm (med 620 nm for referansefilteret) i en Intermed Immunoreader, NJ 2000 (Analis, Ghent, Belgia). Det delvis rensete ekstrakt fra H. polymorpha stamme preS/S-B-431 ga en positiv reaksjon i forsøket, hvilket anga oppfanging ved, og binding til Mab Sl.l, hvilket er spesifikt for preSl-området. Overflateantigenpartikler som bare inneholdt S-protein renset fra S. cerevisiae er RIT4376 (Harford et al., 1978), ga ingen reaksjon i dette forsøk.

C2 . Reaksjon med Mab S2. 5

Monoklonalt museantistoff S2.5 er rettet mot preS2-området på HBV-overflateantigenet. Dette Mab ble anvendt i et ELISA-forsøk for bestemmelse av tilstedeværelse av preS2-epitopen på komposittpartiklene. Mab S2.5 ble belagt på brønnene i en mikrotiterplate og inkubert med det delvis rensete celleektrakt fra H. polymorpha preS/S-B-431. Antigenbinding ble påvist ved inkubering med Mab S2.5 koplet med pepperrotperoksydase, og fargeutvikling, som beskrevet ovenfor. Det delvis rensete celleektrakt fra H. polymorpha preS/S-B-431 ga positiv reaksjon i forsøket, hvilket anga tilstedeværelse av preS2-områdeepitopen på overflateantigenpartiklene. Overflateantigenpartikler som bare inneholdt S-protein renset fra S. cerevisiae RIT4376 ga ingen reaksjon i forsøket.

C3 . Reaksjon med Mab RF1 og Sl. l ( HRP)

Monoklonalt museantistoff RF1 (H. Thomas, Royal Free Hospital, London, UK) er rettet mot en konformasjonell avhengig epitop som befinner seg i S-området, og ble anvendt i et ELISA-forsøk. Dette Mab ble anvendt til belegging av brønner i mikrotiterplater og inkubert med det delvis rensete ekstrakt av H. polymorpha stamme preS/S-B-431. Partikkelbinding ble påvist ved inkubering med det pepperrotperoksydase-koplete Sl.l Mab beskrevet i del Cl ovenfor. Det delvis rensete ekstrakt fra H. polymorpha ga positivt resultat i forsøket, mens overflateantigenpartikler renset fra S. cerevisiae RIT4376 ikke ga noen reaksjon.

C4 . Analyse med hensyn til pHSA- reseptoren

En analyse for påvisning av pHSA-reseptoren på preS2-området ble utført i henhold til fremgangsmåten ifølge Pontisso et al. (1983).

Polymerisert humant serumalbumin ble belagt på brønnene i en mikrotiterplate og inkubert med det delvis rensete celleekstrakt av H. polymorpha stamme preS/S-B-431. Etter vasking for fjerning av ikke-bundet materiale, ble partikler som var oppfanget på platen påvist ved inkubering med polyklonale anti-HBsAg-kaninantistoffer merket med I<125>(AUSAB-analysesett). Det delvis rensete ekstrakt fra H. polymorpha ga positiv reaksjon i forsøket, mens HBsAg renset fra S. cerevisiae RIT4376 ikke ga noen reaksjon i forsøket.

Ovenstående resultater viser at det HBsAg-reaktive materialet som finnes i det delvis rensete ekstrakt fra H. polymorpha, inneholder antigene seter spesifikt bundet av Mab rettet mot epitoper i preSl-, preS2- og S-områdene på HBV-overflateantigen, og at dette materialet også inneholder et sete som reagerer med pHSA.

d) Immunutfelling av komposittpartikler

For bestemmelse av om hvorvidt det AUSRIA-reaktive materialet

som finnes i-et delvis renset ekstrakt av H. polymorpha stamme preS/S-B-431 inneholdt komposittpartikler, ble det utført en immunut feining med et monoklonalt antistoff spesifikt for preSl-proteinet.

Immunkomplekser ble oppfanget ved formalinfikserte Staphylococcus aureus (Staph A)-celler (Immunoprecipitin, BRL, Gaithesburg, MD, USA) under anvendelse av kanin-antimuseserum som laglagt antistoff mellom det monoklonale antistof og Staph A-cellene. Staph A-celler ble for-behandlet som anbefalt av leveran-døren og til slutt vasket og suspendert på nytt med 10 vekt/volumprosent i PBS. Staph A-cellene (120 fil av en 10 vekt/volumprosent suspensjon) ble så inkubert med 20 fil kanin-antimuseserum (RAM) i 2 timer ved romtemperatur. Staph A-RAM-komplekset ble oppsamlet ved sentrifugering, vasket to ganger med PBS som inneholdt 0,1 volumprosent Tween 2 0 og til slutt suspendert på nytt med ca. 10 vekt/ volumprosent i PBS som inneholdt 0,1 volumprosent Tween 20.

Til et delvis renset preparat av partikler av H. polymorpha stamme preS/S-B-431 oppnådd som beskrevet ovenfor, og til en prøve av gjæravledete S-protein-HBsAg-partikler (parti HB193, SmitKlineBiologicals, Rixensart, Belgia) som begge inneholdt 2 fig AUSRIA-reaktivt materiale i 500 fil, ble det tilsatt 1 fil Mab Sl.l (638 fig protein pr. ml) og blandingene ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur. 20 fil av Staph A-RAM-komplekset ble så tilsatt og inkubering fortsatt over natten ved 4°C. Dannete immunkomplekser ble oppsamlet ved sentrifugering, vasket fem ganger med PBS som inneholdt 0,1 volumprosent Tween 8 0 og 1 gang med PBS før suspendering av de endelige klumper på nytt i prøvebuffer for SDS-polyakrylamidgelelektroforese. Immunutfeiningene ble analysert ved immun blotting som beskrevet nedenfor under anvendelse av monoklonalt museantistoff RF6 (H. Thomas, Royal Free Hospital, London) for påvisning av HBsAg-proteintyper. Monoklonalt antistoff RF6 er rettet mot en denaturerings- og reduksjonsresistent epitop av plasma-avledet HBsAg og konkurrerer i bindingsforsøk med monoklonalt HBS1.

"Immunblot"-et viste at immunutfeiningen oppnådd fra H. polymorpha preS/S-B-431-partiklene ikke bare inneholdt preSl-protein et, men også S-proteinet, mens immunutfeiningen fra det Saccharomyces-avledete HBsAg ikke inneholdt noe S-protein.

Dette bekrefter at komposittpartiklene av blandet polypeptidsammensetning er tilstede i materialet som er delvis renset fra H. polymorpha stamme preS/S-B-431-celleektrakter.

e) Elektronmikroskopering

Delvis rensete HBsAg-partikler fra H. polymorpha stamme preS/S-B-431 ble undersøkt ved elektronmikroskopering. Materialet ble fortynnet i 20 mM Tris-HCl-buffer pH 8,2 med 0,1 vekt/volumprosent bovint serumalbumin og bunnfelt på kobber/rhodium-gittere dekket med en film av celloidin før farging med uranylacetat. Undersøkelse i elektromikroskop viste tilstedeværelse av sfæroidale til sfæriske partikler med en middeldiameter på 27 nm. Denne størrelse er innenfo r området for middelpartikkeldiametere målt ved den samme teknikk for en serie av HBsAg-preparater renset fra S. cerevisiae stamme RIT4376 (Petre, J. et al, Postgrad. Medical Suppl. 2/3-8 (1987)).

Eksempel D. 5

5. Sammenligning av komposittpartikler uttrykt i H. polymorpha og S. cerevisiae

Kulturer av stamme preS/S-C-453 av H. polymorpha og S. cerevisiae stamme Y1108 ble dyrket i S-mediet som beskrevet under Materialer, 5d. Stamme Y1108 er en diploid stamme av S. cerevisiae som uttrykker både preS-1- og S-proteinene fra ekspresjonskassetter integrert i genomet ved Ty-vektorer. Stammen inneholder 5-7 kopier av en preSl-ekspresjonskassett og 3-4 kopier av en S-ekspresjonskassett. Stammen fordrer tryptofan for vekst. Konstruksjon og kromosomal integrering av slike ekspresjonskassetter under anvendelse av Ty-vektorer er beskrevet i US-patentsøknad 07/292 202 inngitt 30. desember 1988, overdratt til SmithKline Beckman Corporation, som er medtatt i det foreliggende som referanse. Glycerol i en konsentrasjon på 1,5 vekt/volumprosent ble anvendt som karbonkilde for dyrkning av H. polymorpha. En serie av to liter erlenmeyerkolber som inneholdt 4 00 ml medium ble inokulert med H. polymorpha stamme preS/S-C-453 og inkubert på en orbitalryste-anordning i ca. 33 timer ved 30°C inntil glycerolet var oppbrukt. Cellene fra tre kolber ble høstet ved sentrifugering og celleklumpet lagret ved -70°C inntil ytterligere bearbeidelse. 100 ml dyrkningsmedium ble fjernet fra hver av 6 ytterligere kolber og erstattet med 100 ml friskt medium som inneholdt 4 vekt/volumprosent metanol. Inkuberingen ble så fortsatt.

Tre kulturer ble høstet ved sentrifugering etter ytterligere

14 timers inkubering, og ytterligere tre kulturer høstet etter 38 timers inkubering i nærvær av metanol. Cellene ble gjenvunnet ved sentrifugering og celleklumpen lagret ved -70°C inntil videre bearbeidelse.

Ved et andre forsøk ble kulturer av S. cerevisiae Y1108 dyrket som beskrevet ovenfor og høstet etter 19,5 timers inkubering. Kulturer av H. polymorpha preS/S-C-453 ble også dyrket som beskrevet ovenfor,, bortsett fra at cellene ble høstet etter 26 timers dyrkning i glycerolmedium og etter 45 timer i metanolholdig medium.

Celleklumper av Hansenula polymorpha ble suspendert på nytt i en konsentrasjon på ca. 25% våtcelleklumpvekt pr. volumdel i buffer som inneholdt 0,5 vekt/volumprosent Tween 20, 2 mM EDTA, 4 mM PMSF (fenylmetylsulfonylfluorid), 5 vekt/volumprosent isopropanol og 50 mM natriumfosfat pH 9,0. 10 ml av denne blanding ble gjennomledet 6 ganger i en French-presse ved 1406 kg/cm<2>for knusing av cellene. Råcelleekstraktet ble så klaret ved sentrifugering ved 17 000 g i 45 minutter ved 4°C og supernatanten gjenvunnet. Celleklumper av S. cerevisiae ble behandlet identisk, bortsett fra at cellene ble suspendert på nytt ved en konsentrasjon på ca. 50% våtcelleklumpvekt pr. volumdel av bufferen beskrevet ovenfor.

Proteininnholdet i hver supernatant ble bestemt ved fremgangsmåten ifølge Lowry et al. (1951). De klarete celleektrakter ble analysert med hensyn til HBsAg ved AUSRIA og med hensyn til tilstedeværelse av en preSl-proteinepitop ved en ELISA-analyse. Monoklonal-Sl.1-ELISA-analysen ble utført som følger. Brønner på plastbrett (Nunc Immunoplate 1, Gibco Europe, Ghent, Belgia) ble belagt med monoklonalt Sl.l museantistoff i 50 mM natriumbikarbonat-buffer pH 9,6 i 2 timer ved 37°C og antistoffoppløsningen fjernet. Brønnene ble så blokkert ved inkubering med en PBS-oppløsning som inneholdt 1 vekt/volumprosent bovint serumalbumin, i 1 time ved 37°C. To gangers seriefortynninger av celleektrakter i PBS, 0,2 vekt/volumprosent bovint serumalbumin ble så tilsatt i brønnene og inkubert i 1 time ved 3 7°C.

Brønnene ble så vasket 3 ganger med 0,9 vekt/volumprosent NaCl, 0,05 vekt/volumprosent Tween 20. Antigenoppfanging ble påvist ved inkubering med monoklonalt antistoff Sl.l koplet til pepperrotperoksydase ved fremgangsmåten ifølge Wilson og Nakane (1978).

Konjugert antistoff i PBS, 0,2 vekt/volumprosent bovint serumalbumin ble tilsatt i hver brønn og inkubert i 1 time ved 37°C. Andre antistoff binding ble påvist ved tilsetting av 100/xl av en oppløsning som inneholdt 4 mg o-fenylendiamin (Sigma) , 15 ixl hydrogenperoksyd oppløst i 10 ml, 0,1 M KH2P04pH 6,0 og inkubering i 15 minutter ved romtemperatur. Denne reaksjon ble blokkert ved tilsetting av 25 fil 1 N H2S04, og den optiske tetthet avlest ved 490 nm (med 62 0 nm for referansefilteret) i et Intermed Immunoreader, NJ200 (Analis, Ghent, Belgia). Resultatene ble beregnet ut fra den rettlinjete del av de oppnådde kurver for optisk tetthet, og uttrykt som optisk tetthets-enheter pr. mg protein.

Mengden AUSRIA-reaktivt HBsAg og preSl-protein bestemt i celleekstraktene av S. cerevisiae og H. polymorpha fra de to forsøk er vist i tabellene 4 og 5. Mengden AUSRIA-reaktive materialer funnet i råekstrakter av S. cerevisiae stamme Y1108 er ca. hundre ganger mindre enn i ekstrakter av H. polymorpha preS/S-C-453 indusert i 38-45 timer i metanol. Mengden preS-protein analysert ved ELISA er ca. 3-8 ganger mindre, hvilket viser at S. cerevisiae stamme Y1108 gir et større forhold mellom preSl-protein og S-protein enn H. polymorpha stamme preS/S-C-453.

Resultatene ble bekreftet ved immunblotting av ekstraktene fra det første forsøk sammen med ekstrakter av metanolinduserte kulturer av stamme 454 og 448-C4 som kontroller.

Prøver som inneholdt 15 /ig protein, ble kjørt i elektroforese gjennom 12,5% separasjons-, 5% opphopingsgeler i henhold til fremgan gsmåten ifølge Laemmli (1971) og underkastet immunblotting som beskrevet ovenfor under Materialer og metoder 5a under anvendelse av monoklonalt HBS1 for påvisning.

Ekstrakter fra stamme preS/S-C-453 viser et sterkt reaktivt bånd ved 24 kD i tilknytning til S-proteinet og et bånd ved 38-39 kD i tilknytning til preS-proteinet. Et bånd ved 45 kD er bare såvidt påviselig. I motsetning til dette viser ekstrakter fra S. cerevisiae stamme Y1108 svake bånd ved 24 kD og 45 kD. Dublettbåndet av preS-protein ved 38-39 kD var bare såvidt påviselig. Immunblottingresultatet bekrefter at S. cerevisiae uttrykker mindre S- og preS-proteiner enn metanolindusert H. polymorpha, og at preS-proteinet uttrykt ved S. cerevisiae hovedsakelig er den glykosylerte 4 5 kD-form.

Eksempel D. 6

Myristoylering av preS-protein i H. polymorpha.

Kulturer av stamme LR9, stamme 452 og 453 ble dyrket i ryste-kolber på minimalt medium med 2,5 volumprosent glycerol i 24 timer, og metanol (1 volumprosent) ble så tilsatt. 6 timer etter metanol-tilsetting ble tritium-merket myristinsyre tilsatt og kulturene inkubert i ytterligere 16 timer. Cellene ble oppsamlet, vasket og sprengt med glasskuler i nærvær av 1% SDS og S-merkaptoetanol. De ekstraherte proteiner ble separert ved SDS-PAGE-gelelektroforese og visualisert ved immunblotting med monoklonalt HBSl og ved fluorografi. Resultatene viste at et bånd som svarte til 38/39 kD preSl-proteinet, var merket i ekstraktene fra stammer 452 og 453, men ikke i ekstraktene fra LR9. Dette er i overensstemmelse med post-translasjonell fjerning av det N-terminale metionin og myristoylering av glycinresten i den annen posisjon i polypeptidet (Towler og Gordon, Ann. Rev. Biochem., 57:69-99, 1988).

Eksempel D. 7

Immunogenitet av preS-antigener fra H. polymorpha

Råproteinekstrakter ble fremstilt ut fra metanoldyrkete kulturer av stamme 4 52 og 4 54 og adsorbert på aluminiumhydroksyd med en endelig konsentrasjon på 1 mg/ml. PreSl-epitopinnholdet i hvert ekstrakt ble målt ved en ELISA-analyse under anvendelse av monoklonalt antistoff Sl.l og preSl-protein delvis renset fra S. cerevisiae som standard. Immunkomplekser for injeksjon ble også dannet ved inkubering av 600/il monoklonalt Sl.l antistoff med 1 ml Sepharose Protein G 4 Fast Flow (levert fra Pharmacia LKB, Brussel, Belgia) i 2 timer ved 4°C. Blandingen ble så sentrifugert, vasket med PBS og klumpen suspendert på nytt i 1 ml PBS. 250/xl av denne suspensjon ble tilsatt til 3,4 ml av hvert råcelleekstrakt og blandingen inkubert i 1 time ved 2 0°C.

Etter inkubering ble Sepharose Protein G/Sl.l/råprotein-blandingen sentrifugert og klumpen suspendert på nytt i 10 mM natriumfosfatbuffer. Halvparten av dette materialet ble adsorbert på aluminiumhydroksyd med en endelig konsentrasjon på 1 mg/ml.

Grupper på 5 Balb/c-mus ble injisert intraperitonealt med de fire preparater. Én måned senere fikk musene en intraperitoneal forsterkningsinjeksjon på 1/xg av adsorbert aluminiumhydroksyd, delvis rensete partikler fra en metanoldyrket kultur av stamme 4 53. Musene ble tappet for blod 15 dager senere. Titrene av anti-S-, anti-preS2- og anti-preSl-antistoffer i seraene ble bestemt på samme måte som beskrevet nedenfor.

Tabell 6 viser de respektive antistofftitre frembragt i Balb/c-mus uttrykt som geometrisk middeltiter.

Resultatene viser at anti-preS-antistoffene frembringes i mus når de injiseres med preSl-S2-S-holdig ekstrakt (stamme 454) eller med ekstrakt som inneholder komposittpartikler (stamme 452) og får forsterkningsdose med komposittpartikler (stamme 453).

Anmerkninger

(a) I forhold til preSl-S2-S-antigenet fra S. cerevisiae.

(b) Alle mus fikk en forsterkningsinjeksjon på dag 30 av

partikler delvis renset fra stamme 453.

(c) Titrene er uttrykt som den omvendte fortynning med en OD på

1,0 i analysen.

Del E

Eksempel E. 1

Ekspresjon av komposittpartikler inneholdende både modifiserte preSl-S2-S-(L<*>)- og S-antigener av enkelt eller blandet undertype

(1) Konstruksjon av en L<*>(ad)-kodingssekvens

En modifisert preSl-S2-S-(L<*>)-kodingssekvens egnet for direkte innsetting på Hansenula-ekspresjonsvektoren pMPT-121 (fig. 11) ble konstruert som følger. Plasmid-DNA fra pRIT13192 beskrevet nedenfor ble fordøyd med Hindlll-endonuklease under oppnåelse av lineære fragmenter. Ca. 1 ng av denne DNA ble blandet med oligonukleotidene BC74 og BC75 og underkastet polymerasekjedereaksjons (PCR)-utvidelse.

PCR-teknologi er velkjent og er beskrevet i "PCR Protocols, A guide to methods and applications"; Innes M.A. et al. (red.) Academi c Press Inc., San Diego CA. 1989.

Oligonukleotidene BC74 og BC75 har sekvensene som er vist nedenfor, og ble syntetisert ved vanlig fosforamiditt-kjemi.

BC74 5' CCC AGA TCT AAG CTT ATT AAA TGT ATA CCC A 3'

BC75 5' CCC GAA TTC AAA ATG GGG ACG AAT CTT TCT 3'

Oligonukleotid BC74 har homologi med 3'-enden i L<*->kodingssekvensen på pRIT13192 sammen med en Hindlll- og Bglll-restrik-sjonsseteforlengelse. Oligonukleotid BC75 har homologi med 5'-enden av L<*->kodingssekvensen på pRIT13192 sammen med et EcoRI-sete og en kort ledersekvens før ATG-kodonet som forlengelse. Ca. 1 ng av templat-pRIT13192-DNA ble blandet med 50 mM KC., 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 0,01 vekt/volumprosent gelatin, 200/xM av hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP, 1/xM av hver oligonukleotid-primer og 2,5 enheter Taq-polymerase i et sluttvolum på 100 ixl under anvendelse av kommersielt tilgjengelige DNA-utvidelsesreagenser (Gene Amp DNA-utvidelsesreagenssett fra Perkin Eimer Cetus; levert fra Vånder Heyden, Brussel). Blandingen ble underkastet 25 denaturerings-sykluser (2 min., 92°), kopling (2 min., 48°) og forlengelse (2 min., 72°) under anvendelse av en DNA Thermal Cycler (Perkin Eimer Cetus; levert fra Vånder Heyden, Brussel). Ett ng av det således oppnådde modifiserte, utvidete L<*->kodingssekvensfragment ble så utvidet på nytt i en andre runde med de samme oligonukleotider under samme betingelser, og renset fra reaksjonsblandingen ved etanol-utfelling.

En porsjon på ca. 250 ng av den tilpassete L<*->fragment-DNA på 870 bp ble fordøydt med EcoRI- og Bglll-endonukleaser og klonet mellom EcoRI- og Bglll-setene på et pBR327-derivatplasmid, pRIT12555, under dannelse av pRIT13488. pRIT12555 består av pBR327-replikonet med et Bglll-sete innført ved koplingsinnsetting mellom EcoRI- og Clal-setene i det opprinnelige plasmid.

En ytterligere porsjon av det tilpassete L<*->fragment ble spaltet t med EcoRI- og Bglll-endonukleaser og innført mellom EcoRI- og Bglll-setene i plasmidet pMPT121 (fig. 11). Dette plasserer L<*->kodingssekvensen mellom MOX-promotoren og MOX-terminatoren på et ekspresjonsplasmid egnet for innføring i H. polymorpha ved transformasjon. DNA-sekvensbestemmelse av det resulterende plasmid, pL<*->ll, viste at L<*->kodingsområdesekvensen var riktig.

(2) Konstruksjon av en S-(ay)-kodingssekvens

pRIT13490 er et pBR322-derivatplasmid som inneholder en komplett preS2-kodingssekvens oppnådd ved vanlige rekombinant-DNA-manipule-ringer fra pRIT10601 som inneholder det komplette genom fra et hepatitt B-virus av ay-undertype klonet på pBR322. pRIT10601 ble deponert i American Type Culture Collection, Rockville MD 2. juni 1982 under adkomstnummer ATCC 39132.

Det vil forstås av en fagmann på området at ved de følgende manipulasjoner beskrevet nedenfor, kunne pRIT13490 erstattes med pRIT10601 eller hvilket som helst annet klonet HBV-fragment inneholdende en komplett S-(ay)-kodingssekvens. DNA fra pRIT13490 ble fordøyd med Hindlll-endonuklease for linearisering av plasmidet, og blandet med oligonukleotidet BC74 beskrevet ovenfor og med oligonukleotid BC73 som har homologi med 5'-enden av S-kodingssekvensen på pRIT134 90 sammen med et EcoRI-sete og en kort ledersekvens før ATG-kodonet som forlengelse.

BC73 5' CCC GAA TTC AAA ATG GAG AAC ATC ACA TCA 3'

Blandingen av Hindlll-behandlet pRIT13490 og oligonukleotider ble utvidet ved 2 runder PCR som beskrevet ovenfor, under dannelse

av et S-(ay)-kodingssekvensfragment på 700 bp flankert av EcoRI- og Bglll-restriksjonsseter. Ca. 250 ng av dette materialet ble spaltet med EcoRI- og Bglll-endonukleaser og klonet mellom EcoRI- og Bglll-setene på pRIT12555 under dannelse av pRIT13438. Riktigheten av S-(ay)-kodingssekvensen på pRIT13438 ble bekreftet ved DNA-sekvensbestemmelse.

(3) Konstruksjon av en L<*>(ad/ay)-kodingssekvens

Ca. 1 ng av det PCR-utvidete fragment anvendt for konstruksjon av pRIT13488 ble ytterligere utvidet ved 2 runder PCR-utvidelse i nærvær av oligonukleotidene PC75 (beskrevet ovenfor) og BC3 0 med følgende sekvens.

BC3 0 5' ACG AGT CTA GAC TCT GCG GTA 3'

BC30 er homologt med området rund Xbal-setet i S-kodingssekvensen som stammer fra pRIT10616 HB-virusklonen av ad-undertype. Et fragment på 280 bp ble gjenvunnet ved utvidelsen, og ca. 250 ng av dette ble spaltet med EcoRI- og Xbal-endonukleaser.

Ca.1ng av det PCR-utvidete fragment anvendt for konstruksjon av Pritl3438 ble ytterligere utvidet ved 2 runder PCR-utvidelse i nærvær av oligonukleotidene BC74 (beskrevet ovenfor) og BC12 med følgende sekvens.

BC12 5' ATG GAG AAC ATC ACA TCA 3'

BC12 er homologt med de første 6 kodoner i S-kodingssekvensen i HB-virionene klonet på pRIT10601 og pRIT10616. Etter PCR-utvidelse ble 250 ng av fragmentet på 700 bp spaltet med Xbal- og Bglll-endonukleaser .

De to endonuklease-fordøyde, PCR-utvidete fragmenter ble så ligert med EcoRI-, Bglll-spaltet DNA fra pRIT12555.

Det ble gjenvunnet et plasmid pRIT13491, som besto av pRIT12555 sammen med EcoRI-Xbal-fragmentet fra PCR-utvidelsen av fragmentet anvendt til konstruksjon av pRIT13488 og XbaI-BglII-fragmentet fra PCR-utvidelsen av fragmentet anvendt for konstruksjon av pRIT13438. DNA-sekvensbestemmelse av L<*->kodingsinnskuddet på pRIT134 91 viste at det var blitt innført en feil ved den femte aminosyre i S-kodingsområdet. For korrigering av dette, ble det PCR-utvidete fragment som ble anvendt for konstruksjon av pRIT13488 ovenfor, spaltet med EcoRI- og Xbal-endonukleaser og anvendt til erstatning av det tilsvarende EcoRI-Xbal-fragment på pRIT13491 som inneholdt feilen. Det resulterende plasmid pRIT13489 spesifiserer en "hybrid"-L*kodingssekvens hvor delen fra ATG-initieringskodonet til Xbal-setet stammer fra en ad-undertype-virussekvens, og delen fra Xbal-setet til avslutningskodonet stammer fra ay-undertype-virussekvens. Det tilsvarende polypeptid vil ha ay-undertypen.

EcoRI-BglII-fragmentet fra pRIT13489 inneholdende hybrid-L<*>(ad-ay)-kodingssekvensen ble så innsatt mellom EcoRI- og Bglll-setene på plasmid pMPT-121 under dannelse av H. polymorpha-ekspresjonsvektoren pL<*>13.

(4) Ekspresjon i H. polymorpha av både modifiserte preSl-S2-S (L<*>)- og S-antigener under dannelse av komposittpartikler

Det ble konstruert flere stammer som varkarakterisert vedforskjellige forhold mellom L<*->og S-ekspresjon såvel som forskjellige totalekspresjonsnivåer. Disse forskjeller ble oppnådd ved variasjon av kopiantallet av ekspresjonskassetten pr. genom.

H. polymorpha stamme RB10 ble transformert som beskrevet ovenfor med plasmidet pL<*>11 som bærer L<*>(ad)-ekspresjonskassetten. Transfo rmasjonen ga flere stammer som inneholdt varierende antall ekspresjonskassetter integrert i genomet. To av disse stammer, betegnet L13/1 og L19/1, ble analysert mer detaljert. Southern blot-analyse viste at disse stammer inneholder flere kopier av L<*>(ad)-ekspresjonskassetten. L<*>(ad)-ekspresjonsnivået hos disse stammer ble analysert ved Western blot-analyse under anvendelse av monoklonalt antistoff HBS1. Et bånd på 33 kD tilsvarende L<*->antigen ble påvist. Ekspresjonsnivåene ble bestemt å være ca. 0,5-2% av total-celleprotein når cellene ble dyrket i glycerolmedium fulgt av tilsetting av metanol.

De L<*>(ad)-uttrykkende stammer ble transformert igjen med plasmid pRB-S-322 som bærer S(ad)-genet, under regulering av MOX-promotoren. pRB-S-322 er beskrevet ovenfor (se fig. 7). Resistens mot gentamycin ble anvendt som transformasjonsmarkør. Stabile integranter ble oppnådd under anvendelse av fremgangsmåtene beskrevet ovenfor. To av de oppnådde stammer ble undersøkt mer detaljert: Stamme LMS9/1 og stamme LMS26/2, begge avledete fra mottakerstamme L13/1. Southern blot-analyse viste at disse stammer bærer flere kopier av L<*>(ad)-ekspresjonskassetten såvel som flere kopier av S(ad)-ekspresjonskassetten.

Ekspresjonen av L<*->og S-antigener i H. polymorpha transformantene ble undersøkt med Western blotting under anvendelse av monoklonale antistoffer HBS1 og Sl.l som beskrevet ovenfor. Det ble oppnådd et spektrum av stammer som uttrykker forskjellige forhold mellom L<*->og S-antigen. HBSl-antistoffer påviser et protein på 24 kD som svarer til S-antigen, og bånd på 30 og 33 kD som svarer til L<*->antigen. Sl.1-antistoffer spesifikke for preSl-området viser et bånd ved 33 kD såvel som 30 kD-båndet. L<*>/S-forholdene ble bestemt å være ca. 1:1 for stamme LMS9/1 og ca. 1:10 for stamme LMS26/2. Ekspresjonsnivåene ble bestemt å være ca. 5-6% av totalcelle-proteinet når cellene ble dyrket under induserte betingelser med metanol.

Glykosyleringsundersøkelser viste at proteinet på 33 kD representerer en glykosylert form av L<*->antigenet. Når råproteinekstraktene fra stamme LMS9/1 og LMS26/2 ble inkubert med endoglykosidase H, skiftet båndet på 33 kD til den tilsynelatende molekylvekt på 3 0 kD. 3 0 kD er den ventete molekylvekt for L<*->antigen. Således er en del av L<*->antigenet dannet i H. polymorpha "kjerne"-glykosylert, mens resten utgjør den ikke-glykosylerte form av L* .

For undersøkelse av partikkeldannelse, ble råcelleektrakt fra stamme LMS9/1 underkastet CsCl-tetthetsgradientsentrifugering. Gradientfraksjonene ble analysert ved immunblotting under anvendelse av antistoff HBS1. En topp av HBsAg-reaktivt materiale innbefattende S-antigenet på 24 kD og L<*->antigenformene 30 og 33 kD ble observert ved en tetthet på 1,18 g/cm<3>. Dette resultat angir at komposittpartikler ble dannet i H. polymorpha-stammer som uttrykte L<*->og S-polypeptidene sammen.

Ved en ytterligere variasjon av oppfinnelsen ble det oppnådd en H. polymorpha-stamme som uttrykte L<*->og S-proteinene sammen, ved ytterligere transformering av stamme 415 beskrevet ovenfor. Stamme 415 bærer mellom 50 og 100 S(ad)-ekspresjonskassetter under regulering av MOX-promotoren, og erkarakterisert vedet høyt S-antigenekspresjonsnivå.

En L<*>(ad)-ekspresjonsvektor inneholdende et kanamycin-resistensgen ble konstruert. Et Nrul- fragment på 3,5 kb som kodet for kanamycin-resistensgenet under regulering av ADHI-promotoren og HARS-sekvensen ble isolert fra plasmid pHK2 (fig. 6). Plasmid pL<*>ll ble spaltet med Nrul- og Sali-endonukleaser og gjort stumpendet ved utfylling med Klenow-DNA-polymerase. Nrul/Sall-spaltingen utelukket HARS-sekvensen fra pL<*>ll-vektoren. Nrul-fragmentet fra pHK2 ble så ligert til det stumpendete store Nrul-Sali-fragment av pL<*>ll-vektoren, hvorved kanamycin-resistensgenet ble innført og HARS-sekvensen som var blitt deletert, igjen ble innført. Det resulterende plasmid er betegnet pKL<*>l eller pKL<*>10, avhengig av orienteringen av kanamycin-resistensgenkassetten. Strukturen av pKL<*>l er vist på fig. 12. Disse plasmider kan innføres i H. polymorpha ved transformasjon og seleksjon med hensyn til gentamycin-resistens som beskrevet ovenfor under Metoder.

Stamme 415 ble transformert med pKL<*>l og pKL<*>10 som bar L<*>(ad) - ekspresjonskassetten, og det ble oppnådd stabile transformanter etter seleksjon med hensyn til resistens overfor gentamycin. Flere stammer ble analysert ytterligere. Western blot-analyse under anvendelse av antistoff HBS1 viste et 24 kD protein som svarte til S-antigen såvel som båndene på 30 og 33 kD som svarte til henholdsvis den ikke-glykosylerte og glykosylerte form av L<*->antigen. I disse 415-avledete stammer varierte L<*>/S-forholdet fra ca. 1:1 i stamme LMS05-14-1 til ca. 1:20 i stamme LMS05-12-1. I stammer dyrket under fullstendig induserte betingelser med metanol, utgjorde L<*>/S-antigenekspresjonsnivåene en beregnet prosent på 5-6, basert på total-celleproteinet. Ingen forskjeller ble observert mellom stammer transformert med pKL<*>l og stammer transformert med pKL<*>10. (5) Ekspresjon av L<*->og S-antigener sammen som fører til komposittpartikler med blandet undertype.

For oppnåelse av H. polymorpha-stammer som gir L<*>/S-partikler med en blandet (ad/ay)-undertype, ble plasmid pL<*>13 som bærer en L<*>

(ad/ay)-ekspresjonskassett, transformert i H. polymorpha RB10.

Stabile kloner som uttrykker L<*->antigenet, kan fås og transformeres på nytt med plasmid pRB-S-322 som bærer S(ad)-ekspresjonskassetten med seleksjon med hensyn til gentamycinresistens. Stabile stammer fra den annen transformasjon analyseres ved Western blotting- og AUSRIA-analyser for bestemmelse av de respektive ekspresjonsnivåer av L<*>(ad/ay)- og S(ad)-antigenene og det totale nivå av overflateantigenekspresjon.

Stamme 415 som uttrykker S(ad)-protein, kan også transformeres på nytt med et derivat av pL<*>13 som bærer en funksjonell gentamycin-resistensmarkør under dannelse av stabile transformanter som både uttrykker L<*>(ad/ay)- og S(ad)-polypeptidene i form av komposittpartikler med både ad- og ay-undertype spesifisiteter.

Eksempel F. l

Konstruksjon av plasmidPRIT12979 som koder for et stort ikke-myristylert HBV- protein

En skisse over konstruksjonen av plasmid pRIT12979 er vist på fig. 13 og 14. Fig. 13 viser trinnene for konstruksjon av et E. coli-plasmid som innbefatter en AGlyl3-L protein-ekspresjonskassett, pRIT12998. Fig. 14 illustrerer fremgangsmåten for oppnåelse av et gjærplasmid pRIT12979 som kan uttrykke et AGlyl3 L-protein.

Det må være klart at Glyl3-resten kodes for ved det annet kodon i L-proteinkodingssekvensen som er oppført i tabell A.

Utgangsmaterialet for denne konstruksjon er plasmid pRIT12863, et derivat av pBR327 som inneholder TDH3-promotorinnholdet ogARG3-transkripsjonsavslutningsområdet [Cabezon et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81:6594-6598 (1984)] separert ved en BamHI, Smal, EcoRI-kopling. En kopling som inneholder et Bglll-sete anbringes oppstrøms for TDH3-promotorsekvensene. pBR327 er beskrevet i Soberon et al., Gene, 9:287-305 (1980) og ble anskaffet fra F. Bolivar (Department og Molecular Biology, National University og Mexico). Plasmidet kan gjenvinnes som beskrevet i US-patentsøknad 009 325.

Ekspresjonskassetten for det ikke-myristylerte L-protein er konstruert i koplingsområdet i pRIT12863.

Plasmidet pRIT12816, som er et E. coli-plasmid som stammer fra pASl [Rosenberg et al., Methods Enzymol., 101:123-164 (1983)], innbefatter kodingsområdet for det store HBV-(adw serotype)-protein flankert av et Ncol-sete (som overlapper ATG i kodonposisjon 12 i L-proteinkodingssekvensen) og av et EcoRI-sete utenfor stoppkodonet. • Dette plasmid er konstruert ved vanlige rekombinante DNA-teknikker [se T. Maniatis et al., angitt ovenfor].

Plasmid pRIT12816 spaltes med BstXI og EcoRI, og BstXI-EcoRI-fragmentet på 3 04 bp som koder for den N-terminale del av preSl-området, gjenvinnes og ligeres til følgende syntetiske BamHI-BstXI-adapter:

BamHI Xbal BstXI

GATCCCTCTAG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC C

GGAGATC TCC TTA TAA AGA CAA GGG TT.

Dette fragment innføres i pRIT12863, på forhånd spaltet med

BamHI- og EcoRI-enzymer, hvilket resulterer i plasmid pRIT12996. Den syntetiske BamHI-BstXI-adapter innbefatter det N-terminale preSl-området, men gir ikke den riktige leseramme med BamHI-setet plassert ved ATG-resten i TDH3-promotoren. Den riktige leseramme tilveiebringes ved fordøying av pRIT12 996 med BamHI og Xbal, fulgt av behandling med mungbønne-enzym for utelukkelse av de fremspringende forlengelser og ligering. Denne fremgangsmåte ga plasmid pRIT12997.

Til slutt ble EcoRI-fragmentet på 839 bp fra pRIT12816 innført i EcoRI-setet i pRIT12997 i riktig orientering under gjenvinning av den komplette kodingssekvens for AGly L-proteinet. Det resulterende plasmid pRIT12998 inneholder ekspresjonskassetten som koder for et L-protein hvor Glyl3 er utelatt, og kan ikke tjene som substrat for myristoyltransferasen.

For konstruksjon av et gjærplasmid som kan uttrykke AGly L-proteinet, ble plasmid pRIT12998 fordøyd med Bglll og Sali. Bglll-Sall-fragmentet på 5822 bp, som inneholder ekspresjonskassetten ble renset og innsatt i en vanlig gjærvektor pRIT12741 som er et pBR327-derivat som tilveiebringer et AmpR-gen, 2/x-sekvensene, E. coli-replikonet og LEU2-gjærsoppmarkøren for seleksjon.

Det resulterende plasmid pRIT12979 ble anvendt til transformering av LEU- S. cerevisiae stamme 10S44cir° (pep4-3, leu2-3, leu2-112) ellers kalt TCY1 eller Y482, som er deponert i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A. under adkomst-riummer ATCC 20818. Etter transformering kalles den resulterende LEU+-gjærstamme Y720.

Eksempel F. 2

Sammenligningskarakteriserinq av AGlv L- protein med L- protein

Gjærstamme Y720 ifølge eksempel F.l ble undersøkt med hensyn til AGly L-proteinekspresjon sammenliknet med gjærstamme Y587 (TCY1 transformert med pRIT12845) som uttrykker L-proteinet. pRIT12845 inneholder en 3370 bp ekspresjonskassett som består av en HBV-DNA-avledet kodingssekvens for de 389 aminosyrer i L-proteinet flankert 5 ' ved, og under regulering av, et 1050 bp TDH3-promotorfragment og 3 ' ved et 1150 bp fragment som bærer ARG3-transkripsjonsterminatoren. pRIT12845 er beskrevet detaljert i eksempel 16A i US-patentsøknad 009 325. Gjærstamme Y1017, som er TCYl-transformert med pRIT12741, tjente som negativ kontroll.

A. Myristvlering

Celler fra Y720, Y587 og Y1017 ble merket med<3>H-myristinsyre som beskrevet i US-patentsøknad 009 325. SDS-ekstrakter av disse celler ble analysert ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese (SDS_PAGE), fulgt av både immunblot og fluorografi [se f.eks. Towler og Glaser, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 83:2812-2816 (1986)].

Immunblott som beskrevet i US-patentsøknad 009 325 innbefattet påvisning med et S-spesifikt monoklonalt antistoff (Mab), enten Mab RF6 [H. Thomas, Royal Free Hospital, London] eller Mab HBsl [SmithKline Biologicals]. Disse antistoffer oppfatter overlappingsde naturerings- og reduksjonsresistente epitoper i S-proteinet. Immunbl ottet viste ekspresjon av to former av L-protein på 38 kD og 45 kD både i Y720 og Y587.

Fluorografiet viste tilstedeværelse av<3>H-merking av 38 kD L-proteinet fra Y587-celler som beskrevet i US-patentsøknad 009 325. Mindre mengder merking ble observert i 45 kD L-proteinet fra disse. I motsetning til dette hadde hverken AGly L-proteinet på 38 kD eller 4 5 kD fra Y72 0-celler innkorporert merkingen. Dette viser at elimine ring av glycinkodonet i pRIT12979 opphever myristyleringen av AGly L-proteinet i S. cerevisiae.

B . Ekspresi onsnivå

Celler fra Y720, Y587 og Y1017 ble dyrket under identiske betingelser i YNB uten aminosyrer [Difco Lab] 0,675% inneholdende 2% glukose i Erlenmeyer-kolber. Både total mengde sprengte celler og råekstrakter ble analysert ved kvantitativ immunblot som beskrevet i US-patentsøknad 009 325.

To gangers seriefortynninger av prøvene ble analysert, og immunpåvisningen var basert på de S-spesifikke Mab RF6 eller HBsl, eller et preSl-spesifikt monoklonalt antistoff, Sl.l [SmitKline Biologicals]. Immunblottene viste et 2-5 ganger høyere ekspresjonsnivå for AGly L-proteinet (Y720) enn det myristylerte L-protein i Y587. Ekstraksjonseffektiviteten viste seg å være omtrent lik for de ikke-myristylerte og myristylerte proteiner. Andelen av L-protein som ble funnet i den glykosylerte form av 4 5 kD, ble ikke forandret ved eliminering av myristyleringen.

C. Lipoprot einst rukturer

Råekstrakter fra Y720- og Y587-celler ble underkastet CsCl-likevektsentrifugering. Gradientfraksjonene ble analysert ved immunblot, AUSRIA-analyse [Abbott Lab] og ELISA-analyse spesifikk for en preSl-epitop under anvendelse av MAb Sl.l, hvor MAb Sl.l ble påstrøket på brønnene i en mikrotiterplate [Immunoplate I; Gibco Europa] og inkubert med prøvene. Etter vasking for fjerning av ubundet materiale, ble oppfanging av reaktive partikler vist ved inkubering med Mab Sl.l koplet til pepperrotperoksydase ved fremgangsmåten ifølge Wilson og Nakane (1978) i "Immunofluorescence and Related Techniques", W. Knapp et al., red., Elsevier, Amsterdam

(1978) . Fargeutvikling for påvisning av andre antistoffbinding skjedde med ortofenylendiamin som kromogen. Absorbansen ble avlest ved 490 nm med 620 nm for referansefilteret, i en Intermed Immunoreader, NJ2000 [Analis, Ghent, Belgia].

Antigen- og immunblot-profilene var identiske. Både AGly L- og villtype-L-proteinet dannet bånd ved en tetthet på ca. 1,25 g/cm<3>, hvilket viste at både de myristylerte og ikke-myristylerte proteiner er tilstede som lipoproteinstrukturer i råcelleektrakter. Sakkarose-gradienthastighetssentrifugering av CsCl-likevektsgradientrenset materiale viste identisk bunnfellingsoppførsel når det gjaldt de myristylerte og ikke-myristylerte L-proteinholdige lipoproteinstrukturer, hvilket viste at disse lipoproteinstrukturer har sammenliknbare fysiske parametere.

Eksempel F. 3

Konstruksjon av plasmider som koder for et modifisert HBV L- protein som mangler potensielle O- og N- glykosvleringsseter, potensielle pHSA bindingsseter og potensielle proteasefølsomme seter

En skisse av konstruksjonen av to gjærvektorer: pRIT13192, som koder for ekspresjonen av et myristylert modifisert L-protein (L<*>) og pRIT13193, som koder for ekspresjonen av et ikke-myristylert modifisert L-protein (AGly L<*>) er vist på fig. 15 og 16.

pRIT10616, deponert som ATCC 39131, fordøyes med Bglll, og det største fragment ligeres til pACYC177-replikonet [Chang og Cohen, J.

Bacteriol., 134:1141 (1978)], på forhånd dspaltet med BamHI. Det oppnådde mellomplasmid ble spaltet med EcoRI og ligert på nytt under oppnåelse av pRIT10633, som innbefatter et ufullstendig HBV-genom, hvorfra pACYC 184-vektoren er blitt fjernet.

Plasmid pRIT12331 er et pUC9-derivat [Amersham, U.K. og Pharmacia, Sverige] som inneholder 1500 bp Hindlll-Ncol ARG3-promoto rfragmentet fra pRIT10779 [Cabezon et al., Proe. NAtl. Acad. Sei. U.S.A., 81:6594-6598 (1984)] sammenkoplet i riktig orientering med et Ncol-EcoRI-fragment på 681 bp som inneholder S-kodingssekvensene, hvor Ncol-setet overlapper ATG-kodonet og EcoRI-setet forbi og i umiddelbar nærhet av stoppkodonet, innsatt mellom Hindlll- og EcoRI-restriksjonssetet på pUC9.

pRIT10633 fordøyes med BstEII- og Xbal-enzymer. BstEII-Xbal-fragmentet på 648 bp, hvor BstEII-forlengelsen ble utfyllt ved Klenow-polymerase, inneholdende hele preSl-preS2-området og de N-terminale sekvenser i S-området, ble renset og innført mellom Smål-og Xbal-setene i pUC12 [Amersham]. Det resulterende plasmid er pRIT13188.

Plasmid pRIT13188 ble behandlet med Ball og BamHI, som deletert preSl-området som koder for aminosyrene som strekker seg fra rest 52 til 133 [kodonene for aminosyre 53 og 132 var innbefattet i delesjonen]. Det store fragment ble behandlet med Klenow-polymerase og ligert, hvilket resulterte i plasmid pRIT13189, hvor BamHI-setet er gjendannet.

DNA som svarer til preS-aminosyreområdet som strekker seg fra rest 145 til 175 [kodonene for aminosyrer 146-174] ble utelukket ved digerering av pRIT13189 med BamHI og Xbal. Denne vektor ble ligert til følgende syntetiske adaptor: BamHI- forlengelse Ncol- forlengelse

GATCCCAGAGTCAGGGGTCTGTATTTTCCTGCTGGTGG

GGT CT CAGT C CC CAGACATAAAAGGACGAC CAC CGTAC

AspProArgValArgGlyLeuTyrPhe Pro AlaGlyGly

135 145

og til Ncol-Xbal-fragmentet fra pRIT12331 inneholdende den N-termina le del av S-genet. Det resulterende plasmid er pRIT13190.

Det C-terminale området av S-genet, avslutningen av transkripsjons-ARG3-området og LEU2-gjærgenet ble tilført ved innsetting av Xbal-Sall-fragmentet på 4145 bp fra pRIT12660 mellom Xbal- og Sall-setene på pRIT13190. [pRIT12660 inneholder en ekspresjonskassett på 3050 bp som består av en HBV-DNA-avledet kodingssekvensfor de 281 aminosyrer i M-proteinet flankert 5' ved, og under regulering av, et TDH-promotorfragment på 1050 bp, og 3 ' ved et fragment på 1150 bp som bærer ARG3-transkripsjonsterminatoren. pRIT1266 er beskrevet detaljert i US-patentsøknad 009 325]. Man fikk det resulterende plasmid pRIT13191.

For rekonstruering av ekspresjonskassettene for L<*->og AGly L<*->proteinet, ble TDH3-promotoren som enten var knyttet til det N-terminale kodingsområdet for et L-protein, eller til det N-terminale kodingsområde for et AGly L-protein, innført i pRIT13191.

EcoRI-Ball-fragmentet på 1234 basepar ble renset fra pRIT12845 som inneholdt L-proteinkodingssekvensen beskrevet ovenfor og i US-patentsøknad 009 325, og Bglll-Ball-fragmentet på 1227 bp ble renset fra pRIT12979 som inneholdt AGly L-proteinkodingssekvensen som beskrevet ovenfor.

Hvert fragment ble blandet med det store SacI-BamHI-fragment fra pRIT13191, fulgt av behandling med T4-polymerase og ligering. De resulterende plasmider ble betegnet pRIT13220 og pRIT13222. Kodingssekvensen som befinner seg i ekspresjonskassetten som er tilstede i pRIT13220, inneholder aminosyrerestene 12-52 fra preSl-sekvensen, 133-145 fra preS2-sekvensen og hele S-sekvensen som angitt i tabell A. pRIT13222 er identisk med pRIT13220, med unntak av utelukkelse av Glyl3-kodonet (GGG).

Siste trinn var fremstilling, ut fra pRIT13220 og pRIT13222, av Clal-Clal-fragmentet som inneholdt ekspresjonskassett for henholdsvis L<*->og AGly L<*->proteinene, og ligering av dem til Clal-Clal-fragmentet fra plasmid pRIT12845, hvilket ga opphav til henhold svis plasmid pRIT13192 og pRIT13193.

Disse sistnevnte plasmider ble anvendt til transformering av S. cerevisiae stamme TCY1, under dannelse av henholdsvis LEU<+->stammene Y1139 og Y1140 .

Eksempel F. 4

Ekspresjon av L<*>og AGly L<*>i gjær

Rå-gjærcelleekstrakter fra Y587 (L-protein), Y1139 og Y1140 (henholdsvis L<*>og AGly L<*>) ifølge eksempel F.3, og Y724 (kontroll-S. cerevisia-stamme, ingen ekspresjonskassett innsatt) ble underkastet SDS-PAGE- og immunblotpåvisning med enten det S-spesifikke Mab HBS1 eller Mab Sl.l. Y1139- og Y1140-ekstraktene viste to bånd med beregnet molekylvekt ca. 33 og 30 kD, som ble spesifikt oppfattet både av de preSl- og S-spesifikke antistoffer.

Behandling av ekstraktene med endoglykosidase H [New England Nuclear eller Boehringer] eller glykopepsidase F [Boehringer] resulterte i at 33 kD-båndet forsvant og 30 kD-båndet øket. Dette viser at 33 kD-båndet representerer en glykosylert form av L<*->og AGly L*-proteinet ifølge eksempel F.3 som bærer én N-bundet glykantype med høyt mannoseinnhold.

Merking av cellekulturene med<3>H-myristinsyre fulgt av analyse av celleekstraktene med SDS-PAGE, proteinblotting og enten fluorografi eller immunpåvisning, viste en sterk tilstedeværelse ay<3>H-merking i 3 0 kD-båndet og en svak inkorporering av<3>H-merking i 33 kD avledet fra Y1139-ekstraktet.<3>H som var tilstede i disse bånd, var resistent overfor hydroksylaminbehandling. Ingen inkorporering av<3>H-merking ble observert i de tilsvarende protein-bånd fra Y1140-ekstraktet. Dette viser at L<*->proteinet uttrykt i Y1139-celler tjener som substrat for gjærsopp-N-myristyltransferase og at utelukkelsen av Glyl3-resten i AGly L<*->proteinet i Y1140 forhindrer myristoylering av proteinet.

Analyse av ekstrakter fra Y1189 og Y1140 ved CsCl-likevekts- og sakkarose-hastighetsgradientsentrifugering viste tilstedeværelse av lipoproteinpartikler i ekstraktene.

Eksempel F. 5

Gjærstammer Y1088 og Y1295 inneholdende integrerte kopier av en S- proteinekspresjonskassett

Gjærstammer som innbefattet flere kopier av en S-ekspresjonskassett integrert i genomet ble konstruert.

A. Gjærstamme Y1088

Den Ty-baserte lineære vektor pRIT13133-L beskrevet i US-patents øknad 368 401 inneholdende en ekspresjonskassett for S-proteinet

(TDH3-promotor - S-proteinkodingssekvens - ARG3-termineringsområdet)

ble anvendt for transformering av begge partypene av S. cerevisiae stamme 10S69d ( ura3, leu2, trpl, gall, cir°) beskrevet i US-patentsøknad 368 401. Forskjellige haploidtransformanter som hadde flere vektorkopier integrert i sine genomer, ble krysset med de haploide stammer av motsatt partype. Southern blot-analyser av genom-DNA isolert fra segreganter under anvendelse av en S-DNA-fragmentprobe viser 2/2 segregeringer av vektorfragmenter i tetrade-analyser. Én haploid segregant oppnådd på denne måte, som inneholder 5-7 kopier av vektor pRIT13133-L, ble kalt Y957. Man fikk en TRP<+->revertant av Y957, og denne ble kalt Y1088.

B. Gjærstamme Y1295

Den Ty-baserte lineære vektor pRIT13034-L beskrevet i US-patents øknad 368 401 bærer en ekspresjonskassett for S-proteinet identisk med ekspresjonskassetten i pRIT13133-L. pRIT13034-L bærer CUP1-genet som en tilleggsmarkør som kan anvendes i CUP1<S->eller cuplA-mottaksstammer.

To haploide cuplA-S. cerevisiae-stammer (CUPl-gen sprengt i en stamme inneholdende en enkelt kopi av dette gen) er foretrukket som mottaks-gjærstammer for denne lineære Ty-vektor. Disse stammer har de respektive genomer: EJ cuplA3d (ura 3, leu 2, trp 1, gal lA, cup 1 A, a) og EJ cup lA7b (ura 3, trp 1, gal lA, cup lA, ot) og er beskrevet i US-patentsøknad 368 401.

Den Ty-baserte lineære vektor pRIT13034-L inneholdende en ekspresjonskassett for S-proteinet, ble anvendt for transformasjon av S. cerevisiae-stammer EJ cuplA3d og EJ cuplA7b. URA3-transformanter ble isolert og undersøkt med hensyn til resistens overfor kobbertoksisitet. De mer resistente transformanter viste seg å inneholde 2-5 kopier av integrerte vektorer. Klassiske genetiske krysninger mellom disse stammer og utvelgelse av en LEU""<T>RP""<h>aploid segregant resulterte i en haploid stamme som inneholdt 4-5 kopier av S-ekspresjonskassetten. En TRP<+->revertant av denne stamme ble kalt Y1295.

Eksempel F. 6

Konstruksjon av gjærstammer som uttrykker S- og L- antigenene sammen

Gjærplasmidene pRIT12845 (L-protein), pRIT12979 (AGly L-protein, eksempel F.l), pRIT13192 (L<*->protein, eksempel F.3), pRIT13193 (AGly L<*->protein, eksempel F.3) og pRIT12914 (intet hepatitt-gen innsatt) ble hvert anvendt til transformasjon av gjærstammen Y1088 til LEU<+>. De resulterende oppnådde gjærstammer ble betegnet henholdsvis Y13 01 (S, L), Y1302 (S, AGly L), Y1142 (S, L<*>), Y1261 (S, AGly L<*>) og Y1141 (kontroilstamme som bare uttrykker S-protein).

Likeledes ble pRIT12845, pRIT12979, pRIT13192, pRIT13193 og pRIT12377 (intet hepatittgen innsatt) innført i gjærstamme Y1295.

De resulterende oppnådde gjærstammer ble betegnet henholdsvis Y13 04 (S, L), Y1305 (S,AGly L), Y1306 (S, L<*>), Y1307 (S,AGly L*) ogY1308 (kontrollstamme som bare uttrykker S-protein).

Ko-ekspresjon av S- og L-proteinene ble vist ved immunblot-analyse av råcelleekstrakter. Blot-reaksjon med Mab HBS1 spesifikt for en S-epitop viste et bånd med beregnet molekylvekt på ca. 23 kD som vandret i den stilling som var ventet for S-proteinet i hvert av ekstraktene av de ovennevnte stammer.

Ekstrakter fra Y1301, Y1302, Y1304 og Y1305 viste i tillegg til 23 kD-båndet, bånd på 38 kD og 45 kD som vandret lik de ikke-glykosy lerte og glykosylerte former av L-proteinene beskrevet tidligere i US-patentsøknad 009 325, og i eksempel F.2 i det foreliggende. Behandling av ekstraktene med endoglykosidase H resulterte i omdanne Ise av 45 kD-båndet til et 41 kD-bånd, mens 23 kD- og 38 kD-båndene ikke ble påvirket.

Ekstrakter fra Y1142, Y1261, Y1305 og Y1307 viste i tillegg til 23 kD-båndet, bånd på 30 kD og 33 kD som vandret lik de ikke-glykosy lerte og glykosylerte former av L<*->og AGly L<*->proteinene beskrevet i eksempel F.4. Behandling av ekstraktene med endoglykosidase H resulterte i omdannelse av 33 kD-båndet til et 30 kD-bånd, hvilket er identisk med resultatene beskrevet i eksempel F.4.

Merking av celler med<3>H myristinsyre og analyse av ekstraktene med SDS-PAGE fulgt av immunblot og fluorografi viste tilstedeværelse av hydroksylaminbehandlings-resistent<3>H-merking i 38 kD-båndet

(ekstrakter fra Y1301 og Y1304) og 30 kD-båndet (ekstrakter fra Y1142 og Y1306) med bare mindre mengder<3>H-merking i 45 kD-proteinbåndet (ekstrakter fra Y1301 og Y1304) og 33 kD-proteinbåndet (ekstrakter fra Y1142 og Y1306). De tilsvarende bånd i ekstrakter fra Y1302, Y1305, Y1261 og Y1307 inneholdt ingen påviselig<3>H-merking. 38 kD- og 45 kD-formene av L- og Gly L-proteinene oppfattes i immunblot av de preSl-spesifikke Mab Sl.l og MA18/7 [W.H. Gerlich, University of Gottingen, BRD] de preS2-spesifikke Mab S2.4, S2.5, 52.7, S2.8, S2.9 og S2.10 [SmithKline Biologicals]. 30 kD- og 33 kD-formen av L<*->og AGly L<*->proteinene oppfattes av Mab S.l.l (som oppfatter en epitop i aminosyresekvens 12-32), MA 18/7 (som oppfatter en epitop i aminosyresekvensen 28-47) og S2.5 (som oppfatter en epitop i aminosyresekvens 133-145). Monoklonalt MA 18/7 er rapportert å inhibere binding av virioner til levercellemembraner [Pontisso P. et al., Virology, 173:522-530 (1989)]. 30 kD- og 33 kD-formene av L<*->og AGly L<*->proteinene oppfattes ikke av Mab S2.4, 52.8, S2.9, som ikke reagerer med peptid 12 0-145 i en ELISA-analyse, eller av Mab S2.7 og S2.10, som antakelig gjenkjenner en epitop lokalisert i aminosyrene 120-137. Monoklonalt F35-25 (fra M-A Petit, Inserm unité 131, Clamart, Frankrike) bindes til partikler renset fra stamme Y1307 som vist ved en ELISA-analyse, men bindes ikke til S-partikler. Dette monoklonale antistoff oppfatter en peptidsekvens (Petit M-A et al., Molec. Immunol., 26:531-537, 1989) som er vist å inngå i binding av virus til HepG2-hepatomceller (Neurath et al., Cell 46:429-436, 1986). Dessuten er det blitt funnet at (S, L<*>)-partikler bindes til HepG2 hepatomceller og at denne binding, og bindingen av HB-viruspartikler, kan forhindres ved monoklonalt antistoff F35.15 (Petit M-A et al., The 1990 intl. Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease, Aabstract 105, Houston, U.S.A., 4.-8. april 1990). Mab Q19/10 [W.H. Gerlich, University og Gottinge, BRD], som oppfatter en glykosyleringsavhengig preS2-epitop [Heermann et al. i "Viral Hepatitis and Liver Disease", Red. A. Zuckerman og Alan R. Liss, Inc. New York, s. 697-700, (1988)] og reagerer med 45 kD-formen av L- og Gly L-proteinene, reagerer ikke med 30- eller 33 kD-formene av L<*->eller AGly L<*->proteiner. Disse resultater er i overensstemmelse med aminosyreutelukkelsene innført i L<*->opg AGly L<*->proteinene.

Eksempel F. 7

Ko- ekspresion av S- og L- eller modifiserte L- proteiner fører til dannelse av partikler med blandet underenhetssammensetning

Ekstrakter fra hver av stammene som er beskrevet i eksempel F.6, inneholder HBsAg-beslektet antigenisitet, vist ved positive resultater i AUSRIA-analysen utført i henhold til fabrikantens instruksjoner [Abbott Lab.]. Ekstrakter fra Y1301, Y1302, Y1142, Y1261, Y1304, Y1305, Y1306 og Y1307, men ikke fra Y1141 og Y1308, gir positiv reaksjon i ELISA-S1.1-analysen. Ved CsCl-likevekts-sentrifugering dannet det AUSRIA- og ELISA-S1.1-positive materialet bånd sammen rundt en tetthet på 1,2 g/cm<3>. Immunblot bekreftet antigenisitetsprofilene, hvilket viste at proteintypene som ble funnet i råekstrakter, dannet bånd sammen i den AUSRIA- og ELISA-positive topp. Sakkarose-hastighetsgradientsentrifugering av dialyse rte toppfraksjoner fra CsCl-likevektsgradientene viste ko-bunn-felling av S- og L-proteinene eller de modifiserte L-proteiner, bestemt ved AUSRIA, ELISA-S1.1 og immunblot. Dette viser at S- og L- eller modifiserte L-proteiner er sammensatt til lipoproteinpartikler.

Immunutfelningsreaksjoner med Mab Sl.l ble anvendt for å vise at S- og L- eller de modifiserte L-proteiner var sammensatt i én fysisk helhet, dvs. partikler med blandet underenhetssammensetning. Ekstrak ter ble laget av gjærstammer som uttrykte S- og L- eller modifiserte L-proteiner enten alene eller sammen, f.eks. fra Y1139 (L<*->protein, eksempel F.3), Y1141 (S-protein, eksempel F.6) og Y1142 (S- og L<*->protein, eksempel F.6). Etter delvis rensing av partiklene ved CsCl-bånddannelse og dialyse av toppfraksjonene, ble partiklene underkastet immunutfelningsreaksjonen med Mab Sl.l. En blanding av partikler fra Y1139 og Y1141 ble anvendt som en ytterligere kontroll. L<*->proteinet ble immunutfelt i hvert tilfelle. Utfelling av S-proteinet sammen med L<*->proteinet ble observert bare fra reaksjonen med partikler som stammet fra Y1142.

Identiske resultater ble oppnådd med de andre gjærstammer som ko-uttrykker S- og L- eller de modifiserte L-proteiner (Y1301, Y1302, Y1261, Y1304, Y1305, Y1306, Y1307).

Eksempel F. 8

Stabilitet ocr pHSA- binding av partikler som inneholder det modifiserte L- protein

Følsomheten overfor proteolytisk nedbrytning ved gjærproteaser av L<*->og AGly L<*->proteinene ble analysert ved inkubering av råcelleekstrakter av Y1142 og Y1161 enten i 4 timer ved 37°C eller i 65 timer ved 4°C.

Ekstrakter av Y1301 og Y1302 tjente som sammenlikningskilde for L- og AGly L-protein. Analyse av ekstraktene ved immunblot før og etter inkubering viste en nesten fullstendig forsvinning av L- og AGly L-proteinene etter inkubering, mens L<*->og AGly L<*->proteinene fremdeles lett kunne påvises.

Rensete preparater av partikler fra stammer Y1306 og Y1307 ble inkubert i 7 dager ved 3 7°C og undersøkt ved SDS-PAGE og sølvfarging for påvisning av polypeptidene. Ingen påviselig nedbrytning av L<*->eller S-polypeptidene kunne observeres.

Partikler som stammet fra Y1142 ved CsCl-bånddannelse ble undersøkt ved en modifikasjon av pHSA-bindingsanalysen beskrevet av Pontisso et al., J. Virol. Methods 6, 151-159 (1983). Mikroplater (Immunoplate I; Nunc, Gibco Europa] ble belagt med glutaraldehyd-polymerisert humant serumalbumin (5 iig/ml pHSA i PBS, 2 timer 37°C) , og ikke-spesifikke proteinbindingsseter på platene ble mettet ved inkubering (1 time 37°C) med PBS som inneholdt 1% bovint serumalbumin (BSA). Seriefortynninger av prøvene i PBS som inneholdt 0,2% BSA fikk vekselvirke (1 time 37°C) med de pHSA-påstrøkete plater, og bundne partikler ble påvist (1 time 37°C) med en ikke-begrensende konsentrasjon av pepperrotperoksydase-koplet monoklonalt anti-S-antistoff (RF1, H.C. Thomas, Royal Free Hospital, London) i PBS som inneholdt 0,2% BSA, og påvist med H202og ortofenylendiamin som substrat. Mellom inkuberingene ble platene vasket med 0,15 M NaCl som inneholdt 0,05% Tween 20.

Partikler som stammet fra Y1141, tjente som negativ kontroll, og rensete partikler fra stamme 10S44C cir° inneholdende pRIT12660 som positiv kontroll. pHSA-binding var redusert i stor grad i de Y1142-avledete partikler (2% restaktivitet) sammenliknet med partiklene om stammet fra 10S44C cir° som innbefattet pRIT12660.

pHSA-binding kunne heller ikke påvises med rensete partikkelprep arater fra stamme Y1306 og Y1307.

Eksempel F. 9

Immuno<q>enitet hos partikler som inneholder L*- protein

Immunogeniteten hos (S, L<*>)-partikler fremstilt ifølge denne oppfinnelse ble undersøkt i Balb/c-mus. Partikler som stammet fra entenY1142 (S, L<*>) eller Y1142 (S) ble delvis renset ved CsCl-bånddannelse, og adsorbert på Al(OH)3. Grupper på åtte mus ble injisert med enten 50 eller 5 fig totalprotein (tilsvarende 1 eller 0,1 fig antigen ved AUSRIA-analyse) av hvert antigenpreparat på dag 0 og 30. Blodtapping av mus ble utført på dag 45 og de forskjellige analyser utført på individuelle sera. Anti-HBs-antistoffer ble målt med AusAb-analysesett (Abbott, USA) og uttrykt i mIU/ml under anvendelse av Hollinger-formelen [Hollinger et al., i "Viral Hepatitis", Szumness et al., Franklin Institute Press, Philadelphia, s. 451-466

(1982)] .

Anti-preS-antistoffer ble målt under anvendelse av en direkte-ELISA-analyse hvor utvalgte syntetiske peptider (peptid 12-32, peptid 32-47 og peptid 120-145) ble adsorbert til polystyrenbrønner i mikroplate (Immunoplate I; Nunc, Gibco Europa). Adsorpsjonen fant sted over natten ved 4°C fra en oppløsning av 0,5/xg/ml peptid i 0,05 M Na2C03/NaHC03-buffer pH 9,6, 100/il pr. brønn. Ikke-spesifikke seter på platene ble blokkert ved inkubering med 250 fil 5% føtalt bovint serum i PBS i 1 time ved 37°C.

To gangers seriefortynninger av museseraene i PBS som inneholdt 1% føtalt bovint serum, 0,05% Tween 20 fikk reagere med den peptidpåstrøkne plate i 2 timer ved 37°C (100 fil pr. brønn) . Etter vasking ble bundne antistoffer påvist ved et biotinylert antimus-IG fra sau (Amersham, 50 0 gangers fortynning i PBS som inneholdt 1% føtalt bovint serum, 0,05% Tween 20, 100 fil pr. brønn, inkubering i 1 time ved 37°C) og deretter med et streptavidin-biotinylert pepperr otperoksydase-kompleks (Amersham, 1000 gangers fortynning i PBS som inneholdt 1% føtalt bovint serum, 0,05% Tween 20) il time ved 37°C, 100 fil pr. brønn.

Mellom inkuberingene ble platene vasket med 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20. Endelig påvisning ble utført med H202og ortofenylendiamin som kromogen (15 fil H20 og 4 mg ort-fenylendiamin i 10 ml 0,1 M kaliumf osf atbuf f er, pH 6,0, 100 fil pr. brønn). Reaksjonen ble stoppet etter 20 minutter ved tilsetting av 25 /il 1 N H2S04°9absorbans ved 4 90 nm målt i en Intermed Immunoreader, NJ 2 000, Analis. Titeret for hvert serum ble beregnet som den resiproke verdi av den høyeste fortynning som ga en optisk tetthet på 1,00.

Tabell 7 viser de respektive antistoff-titre frembragt i Balb/c-mus uttrykt som geometrisk middeltiter.

Partikler renset fra stamme Y1307 (S, AGly L<*>) eller fra stamme RIT4376 [Petre J. et al., Postgrad. Med. J. 63, (Suppl. 2), 73-81

(1987)] ble adsorbert på Al(OH)3og injisert i grupper på 10 Balb/c-mus på dag 0 og 30. Musene ble tappet for blod på dag 45 og de blandede immunsera undersøkt med hensyn til tilstedeværelse av anti-S- og anti-preS-antistoffer som beskrevet ovenfor. Tabell 8 viser de respektive antistoff-titre frembragt i Balb/c-mus.

Eksempel F. IO

Integrering av en L*- ekspresionskassett i S . cerevisiae- genomet ved Tvi- formidlet homolog rekombinasjon

Det er ønskelig å integrere både L<*->og S-proteinekspresjons-kassettene som benytter denne oppfinnelse i vertsgenomet for tilveiebringelse av genetisk stabile stammer og for unngåelse av de 20-30% plasmidmanglende celler som vanligvis ses med 2 ixm-baserte S. cerevisiae- vektorer.

Plasmidene pRIT13459 og pRIT13460 ble konstruert som beskrevet for vektoren pRIT13009-p i US-patentsøknad 009 325 og i Jacobs et al. (Gene 80:279-291, 1989). LEU2-genet, isolert som et 2200 bp Xhol-Sali-fragment fra vektoren pCV9 (Petes et al., Cell 19:765,1980), ble innført mellom Sall-setene i Tyl-elementet på pRIT12927, idet det erstattet det opprinnelige fragment, under oppnåelse av pRIT13144. Et 3050 bp HindiI-Kpnl-fragment som bar L<*->ekspresjonskas setten fra pRIT1322 0 beskrevet i eksempel F.3 ble behandlet med T4-polymerase og ligert i det T4-polymerasebehandlete Sall-sete som var tilbake på pRIT13144 og under anvendelse av E. coli stamme XLl-blå som transformasjonsmottaker. ELI-blå er beskrevet av D. Hanahan i J. Mol. Biol., 166:557-580 (1983) og er kommersielt tilgjengelig fra Stratagene,11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, California. Begge orienteringer for innføring av Hindlll-Kpnl-kassettfragmentet ble oppnådd; pRIT13459 inneholder kassett-ARG3-terminatorområdet proksimalt til LEU2-genet, pRIT13460 inneholder kassett TDH3-promoto ren proksimalt til LEU2-genet.

De store Xhol-fragmenter på ca. 7700 bp fra både pRIT13459 og pRIT13460 ble renset fra 1% agarosegeler og anvendt for transformasjon av stamme EJ cuplA3d (se eksempel F.5 ovenfor til leucin-uavhengighet ved fremgangsmåten ifølge Hinnen et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75:1929, 1978).

LEU<+->transformanter ble oppnådd med begge fragmenter, og 12 kolonier fra hver serie ble analysert ved Western blotting med hensyn til L<*->proteinekspresjon og ved Southern blotting med hensyn til antallet integrerte kassetter. Fra transformasjonen av EJ cuplA3d med fragmentet fra pRIT13459 ble det beholdt en Y1528- stamme, som viste et nivå av L<*->ekspresjon ekvivalent med Y1306, og inneholdt 3-5 kopier av kassetten. Fra transformasjonen av EJ cuplA3d med fragmentet fra pRIT13460 ble det beholdt en Y1529-stamme som hadde liknende egenskaper som Y1528.

Både Y1528 og Y1529 ble paret med stamme Y1295 og dens trp""<m>oderstamme Y1215 (se eksempel F.5 ovenfor) og med stamme Y1367 under dannelse av diploider som følger:Y1528 x Y1295 = Y1586, Y1528 x Y1215 = Y1587, Y1527 x Y1367 = Y1588, Y1529 x Y1295 = Y1589, Y1529 x Y1215 = Y1590, Y1529 x Y1367 = Y1591.. Stamme Y1367 er a????, Ieu2, trpl, inneholder 6-8 kopier av den samme S-proteinkassett som stamme Y1295 og ble oppnådd under anvendelse av stammene og fremgangsmåtene beskrevet ved konstruksjonen av Y1295 i eksempel F.5.

Diploidstammene som er oppregnet ovenfor undersøkes med hensyn til sine overflateantigenekspresjonsnivåer og andelen av L<*->og S-polypeptider i partiklene ved Western blotting, AUSRIA-analyse og epitopspesifikke ELISA-analyser under anvendelse av reagensene og fremgangsmåtene beskrevet ovenfor, mer spesielt i eksempler F.2 og F.6. Antallet og stabiliteten av de integrerte ekspresjonskassetter bestemmes ved Southern blotting. Hvis ønskelig kan de diploide stammer sporedannes for oppnåelse av haploide segreganter som så kan undersøkes med hensyn til ekspresjon og genetisk stabilitet som beskrevet ovenfor.

Innføring av 3050 bp HindiII-Kpnl-fragmentet fra pRIT13222 på pRIT13l44 og utføring av de ovenfor beskrevne fremgangsmåter kan skje under dannelse av S. cerevisiae-stammer med integrerte kopier av AGly L<*->ekspresjonskassetten og stammer som uttrykker S,AGly L<*->partikler.

Ved en ytterligere utførelsesform innføres L<*->ekspresjonskassett en på en vektor lik pRIT13134-P [Jacobs et al., Gene 80; 279-291

(1989)] og som bærer URA3- og CUPl-genene som selektive markører innført i Tyl-elementet i pRIT12927. En slik vektor er identifisert som pRIT13501, hvorfra et Bglll-fragment på ca. 6500 bp med ovennevnte elementer kan utvinnes for transformasjon og integrering i en hensiktsmessig gjærvert ved seleksjon med hensyn til URA<+->transformanter. Etter transformasjonen kan antallet integrerte kassetter med fordel økes ved seleksjon med hensyn til økte nivåer av kobber-resistens som beskrevet i US-patentsøknad 07/368 401.

Eksempel F. 11

Ekspresjon av S, L*- blandete partikler med ad- og ay- undertvpe-determinanter

En integrativ vektor med en ekspresjonskassett for et L<*->protein av ay-undertype ble konstruert ved utbytting av Xbal-SacII-fragmentet som koder for den C-terminale del av et ad-undertype-S-protein og en del av ARG-transkripsjonsterminatoren, med et tilsvarende fragment fra et S-gen av ay-undertype. Plasmid pRIT13459 (eksempel F-10) ble spaltet med Xbal- og SacII-endonukleaser, og det største fragment ble renset fra en 1% agarosegel og ligert til et renset 1000 bp Xbal-SacII-fragment fra pRIT10780 under dannelse av pRIT13500. pRIT10780 er beskrevet i De Wilde et al., Develop. Biol. Standard, 59:99-107, (1985).

L<*->kodingssekvensen på pRIT13500 består av DNA med sekvenser identiske med sekvensene fra et virus av ad-spesifisitet fra ATG-kodonet til Xbal-setet, og av DNA som stammer fra et virus av ayw-spesifisitet fra Xbal-setet til avslutningskodonet. Det uttrykte L<*->polypeptid vil ha ay-undertypedeterminanter.

Xhol-fragmentet på ca. 7700 bp fra pRIT13500 kan integreres i gjærgenomet og de resulterende transformanter pares med stammer såsom Y1295 og Y1367 ved fremgangsmåtene beskrevet ovenfor for oppnåelse av stammer som uttrykker blandete partikler hvor L*-polypeptidet er av ay-undertype og S-polypeptidet av ad-undertype.

Ovenstående beskrivelse og eksempler er illustrerende. F.eks. kan det gjøres forskjellige tilleggsmodifikasjoner når det gjelder L-proteinet, f.eks. partial-deglykosylering eller en kombinasjon av forskjellige av modifikasjonene som er gjort i det foreliggende, i tillegg til slike som er nevnt i eksemplene for dannelse av modifiserte L-proteiner og partikler av blandet eller homogen underenhetssammensetning inneholdende disse modifiserte L-proteiner med hensiktsmessig sammensetning for vaksineanvendelse.

Ytterligere modifikasjoner som kan gjøres, innbefatter gjen-innføring av preS-sekvenser, innføring av kodingssekvenser som stammer fra andre HBV-proteinkodingssekvenser enn fra kapselgenet, f.eks. sekvenser fra HBV-kjernegenet, eller sekvenser som koder for immunologisk viktige aminosyreområder fra andre patogene kilder. Ytterligere kjente vektorkomponenter kan anvendes for erstatning av de spesifikke markørgener, promotorer og koplingssekvenser og liknende som er anvendt i eksemplene. Andre typer vertsceller kan anvendes.

REFERANSELISTE

Burrell et al., Nature 279, 43-47 (1979)

Charnay et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76, 2222-2226 (1979) Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985)

Dehoux et al., Gene 48, 155-163 (1986)

Eble et al., Mol. Cell. Biol. 6, 1454-63 (1986)

Eckart et al., Klonierung und Charakterisierung der Gene flir die Dihydroxyacetonsynthase und Methanoloxidase aus der methylotrophen Hefe Hansenula polymorpha, Ph.D. Thesis, University Diisseldorf

(1988)

Ellis et al., Mol. Cell. Biol. 5, 1111-1121 (1985)

Galibert et al., Nature 281, 646-650 (1979)

Grindley et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77, 7176-7180 (1980) Harford et al., Postgrad. Medical J. 63, Suppl. 2. 65-70 (1987) Heermann et al., J. Virol. 52, 396-402 (1984)

Hitzemann et al., Nature 293, 717-722 (1981)

Imamura et al., J. Virology 61, 3543-3549 (1987)

Itoh et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 138, 268 (1986)

Jacobs et al., Gene 67, 259-269 (1988)

Janowicz et al., Nucl. Acid Res. 13, 3043-3062 (1985)

Jimenez og Davies, Nature 287, 869-871 (1980)

Kingsman et al., Biotech Gen. Eng. Res. 3, 377 (1985)

Klebe et al., Gene 25, 333-341 (1983)

Kniskern et al., Hepatology 8, 82-87 (1988)

Kohler og Milstein, Nature 256, 495-497 (1975)

Laemmli, Nature 227, 680-785 (1970)

Langley et al., Gene 67, 229 (1988)

Ledeboer et al., Nucleic Acid Res. 13, 3063-3081 (1985)

Lowry et al., J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951)

Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor

(1982)

Maxam og Gilbert, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 560-564 (1977) McLachlan et al., WO88/06185 (1988)

Michel et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 7708-7712 (1984) Milich et al., Science 228, 1195-1199 (1985)

Milich et al., Immunology Today 9, 380-386 (1988)

Murray et al., EP-A-13828 (1980)

Ou et al., J. Virol. 61, 782 (1987)

Persing et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82, 3440-44 (1985) Pontisso et al., J. Virological Methods 6, 151-159 (1983) Roggenkamp et al., Mol. Gen. GEnetics, 3 02 (1986)

Rutgers et al., Viral Hepatitis and Liver Disease; Red. A.S. Zuckerm ann A.R. Liss, New York 304-308 (1988

Rutgers et al., Biotech 6, 1065-1070 (1988)

Schwartz og Cantor, Cell 37, 67 (1984)

Sninsky et al., Nature 279, 346-348 (1979)

Southern, J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975)

Stinchcomb et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77, 4559-4563

Struhl et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76, 1035-1039 (1979) Szmuness et al., New England J. Med. 303, 833-841 (1980)

Tschopp et al., EP-A-0 226 846

Tschumper og Carbon, Gene 10, 157-166 (1980)

Towbin et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA 76, 4350-4354 (1979) Valenzuela et al., Nature 280, 815-819 (1979)

Valenzuela et al., Nature 298, 347 (1982)

Valenzuela et al., Biotech. 3, 317 (1985)

Wilson og NAkami i "Immunofluorescence and Related Techniques"

(W. Knapp et al., red., Elsevier, Amsterdam).

Claims (7)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et protein med aminosyre-sekvens som består av deler av aminosyresekvensen til hepatitt B-virus-stort (L) protein (ad eller ay subtype) hvor aminosyresekvensen til proteinet består enten av: a) restene 12-52, etterfulgt av restene 133-145, etterfulgt av restene 175-400 av det nevnte L proteinet, eller b) resten 12, etterfulgt av restene 14-52, etterfulgt av restene 133-145, etterfulgt av restene 175-400 av det nevnte L protein, karakterisert ved: (i) fremstilling av en ekspresjonsvektor omfattende en DNA sekvens som koder for nevnte protein operativt forbundet med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser i stand til å dirigere ekspresjon av nevnte DNA-sekvens samt inneholdende en seleksjonsmarkørkodende sekvens, (ii) transformering av en vertscelle med nevnte vektor, eventuelt med en rekombinant DNA vektor som er i stand til å uttrykke proteinet i form av en komposittpartikkel samtidig med S-proteinet av hepatitt B-overflateantigen, (iii) dyrking av nevnte vert i et passende dyrkningsmedium og isolering av nevnte protein eventuelt av en proteinpartikkel med blandet subenhet-sammensetning fra cellelysatet eller ekstraktet av nevnte dyrkningsmedium.

2. Fremgangsmåte som krevet i krav 1, hvor S-proteinet i krav 1 (ii) er av ad sub-type og proteinet definert i krav 1 omfatter restene fra et L protein av ay subtype eller omvendt,karakterisert vedat tilsvarende ekspresjonssystem anvendes.

3. Vertscelle transformert med DNA omfattende en sekvens som koder for et protein som definert i krav 1,karakterisert vedat den omfatter: (i) en vektor omfattende DNA som koder for nevnte protein, i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser i stand til å dirigere ekspresjon av nevnte DNA-sekvens, samt seleksjonsmarkørkodende sekvens, eventuelt i tillegg en vektor omfattende en DNA sekvens som koder for S-antigen av hepatitt B-overflateantigen i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser i stand til å dirigere ekspresjon av nevnte DNA-sekvens, samt seleksjonsmarkørkodende sekvens.

4. Vertscelle ifølge krav 3,karakterisert vedat vektoren er en ekspresjonsvektor slik at under passende betingelser kan vertscellen dyrkes for å produsere et protein eventuelt partikkel med blandet subenhet-sammensetning som definert i krav 1.

5. Vertscelle ifølge ethvert av kravene 3 til 4,karakterisert vedat verten er valgt fra gruppen av gjær bestående av Saccharomyces, Hansenula, Pichia, Candida, Kluyveromyces og Schizosaccharomyces.

6. Vertscelle transformert med DNA omfattende en sekvens som koder for et protein som definert i krav 2, karakterisert vedat verten er valgt fra gruppen bestående av S. Cerevisiae eller H. polymorpha.

7. Anvendelse av et protein eller en partikkel med blandet subenhet-sammensetning fremstilt ifølge krav 1 eller 2 i fremstillingen av et reagens eller test kit for bestemmelse av HBV eller HBV-avledete proteiner eller anti-HBV antistoffer i en biologisk prøve in vi tro.