JPS6274295A - ハイブリツド粒状免疫原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 り従来の技術および発明が解決しようとする問題点〕 免疫系は細胞、分泌された因子の非常に複雑な有機体で
あり、そして病原体または毒素により生ずる病気に対し
て脊椎動物を保護するために応答する。噛乳動物は病気
にかかるが、ほとんどの場合生存するという事実は、こ
の系の誤りやすさおよびその特別な可能性の両者を示す
ものである。

免疫系は生体内および生体外の目的の両者について広い
用途を見い出し、ここでワクチン注射、受動免疫、およ
び生体外の診断、組織学、細胞学などのための抗体の生
産に用いられる。モノクローナル抗体の出現により、免
疫系は、ポリクローナル抗体が不適切であった広範な種
類の目的のためのモノクローナル抗体の生産において、
その利用が非常に拡張した。

免疫系は？！ｉ雑であり、そして完全には理解されてい
ない。免疫系が宿主のべブチドおよびサツカリドから異
質免疫原を認識する方法は、なお明らかにされておらず
、広範な研究の＋題である。鉗乳動物の宿主が異質タン
パク質にさらされ、弱いかあるいは検出できない免疫応
答が得られろ場合が多数存在する。多くのワクチンは、
免疫感作のとき感染を生じうる発病力のある有機体の可
能性をもつ、減衰された有機体の使用に基づく。多くの
場合において、表面タンパク質またはその免疫原部分で
免疫感作することが望ましいが、これは関連するエピト
ープ部位に対する抗体を生産することができないかある
いは弱い応答のため、不満足であることがしばしば発見
されている。多くのタンパク質またはエピトープ部位は
弱い免疫原的であることがわかり、それゆえ異種間の宿
主に注入されたとき、問題の部位に対する中和性抗体は
得られるとしてもほんのわずかである。

したがって、問題のエピトープ部位に対して高い免疫原
性を示す組成物を調製できることは非常に重要である。

このようにして、接種のときに向上した免疫応答を得る
ことができ、受動免疫感作において活性である抗体を提
供することができ、そして抗体の生産に用いらね、る片
通の宿ｆ中でそうでなければ弱い免疫原性のエピトープ
部位であるものに対する（バ体を生産することができる
。さらに、１穐より多い感染剤からのエピト−プ部位を
含有する組成物を製造することは好ましいであろう。次
いで、これらの組成物は多価ワクチンとして利用するこ
とができ、高価でなく、より効彰のよい、より安全な免
疫感作養生を可能とすることができるであろう。

Ｂ型肝炎（Ｉｌｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ）ウィルスのゲノ
ム全体ハ且１部中でクローニングされ、そしてそのヌク
レオチド配列が決定されたシ＼レンズエラ（Ｖａｌｅｎ
ｚｕｅｌａ）等、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　（１
９７９）２β、Ｑ、：８１５−８１９；ハレンズエラ（
Ｖａｉｅｎｚｕｅｌａ）等、」穎イルスの＄４Ｆ；’＄
　（Ａｎｉｍａｌ　Ｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　）
　（１９８０）５７−７０ページ〕。Ｂ型肝炎表面抗原
粒子は酵母菌−≦−，ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で合成さ
れかつ組立てられた〔バレンズエラ（Ｖａｌｅｎｚｕｅ
ｌａ）等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（１９Ｂ２）２
９８：３４７−３５０）　、前表面（ｐｒｅ−ｓｕｒｆ
ａｃｅ）抗原区域を含有するＢ型肝炎表面抗原粒子の酵
母菌の合成および組み立ては、「肝炎表面抗原粒子のワ
クチン（ｔｌｅｐａｔｉｔｉｓ　５ｕｒｆａｃｅ　Ａｎ
ｔｉｇｅｎＰａｒｔｉｃｌｅ　Ｖａｃｃｉｎｅ）　Ｊと
題する１９８４年６月１８日提出の米国特許出願第６２
１．７５６号に８己載された。

旦、他生の単純庖ｈ　（Ｈｅｒｐｅｓ　Ｓｉｍｐｌｅｘ
）ウィルスの糖タンノぐり質Ｄｊ丘伝子お、よび遺伝子
ヌクレオチド配列のクローニングは報告された〔ワトソ
ン（Ｗａ　Ｌｓｏｎ）等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
）　（１９８２）２１８：３８１−３８．１　）。クロ
ーニングされたｉＪ、岬タンパク質り遺伝子は、「ｊｊ
’＞純庖疹ウィルスの塘タンパク質りの改良された発見
＜Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　１Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　
Ｇｌｙ−ｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄ　ｏｆ　ｔｌｅｒｐｅ
ｓ　Ｓｉｍｐｌｃｘ　Ｖｉｒ＋Ｊｓ）と題する１９８４
年７月１７日に提出された米田特許出願第６３１．６６
９号において報告されているように、酵母菌中で発現さ
れた。

ヒトのマラリア寄生虫ブラスモＺ久ム・ファルシパルム
（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に
ついてのサーカムスホロヅイテ（ｃｉｒｃＵｍｓｐｏｒ
ｏｚｏｉｔｅ）　（ａｓ）タンパク質の配列がクローニ
ングされた〔ディム（Ｄａｍｅ）等、ｙイエンス（胚ル
抵９旦）　（１９８４）２２５　：５９３およびエネア
（Ｅｎｅａ）等、１ｂｉｄ　６２８ページ〕。フおよび
プラスモジウム・ノウレジ（Ｐ　、　Ｋｎｏｗｌｅｓｉ
）からのＣＳタンパク質はエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）中で〔ヤング（Ｙｏｕ
ｎｇ）　等、サイエンス（シ１μ脛虹）　（１９８５梓
評−：　９５８　：ｌおよび酵母菌中で〔シャルマ（Ｓ
ｈａｒｍａ）およびゴドソン（Ｇｏｄｓｏｎ）　、サイ
エンス（ｓｃｉｅｎｃｅ　）　（１９８５）２２８　：
８７９〕クローニングされた。また、プラスモジウム・
ファルシパルム（旦、ハ兵頂狂１ザ）のＣＳタンパク質
からの合成ペプチドはマウスおよびう。

トについて免疫原性であることがゎがっ、ｔ〔ハロウ（
Ｂａ　ｌ　１ｏｕ）等、＋　４エンス（ｓｃｉｅ吟シ）
　（１９８５）２２８　：９９６）。上の関連する開示
のすべてを、本明細書の記載の参考とされたい。

〔問題点を解決するための手段〕

天然に産出するウィルス粒子形成性タンパク質の少なく
とも一部分と、問題の１種または２種以上のエピトープ
部位を有する１種土たば２挿以ヒのオリゴペプチドとの
ハイブリッドウィルス粒子形成性タンパク質を含むウィ
ルス粒子からなる新規な免疫原組成物が提供される。オ
リゴペプチドはハタテリア寄生体、異るウィルスまたは
他の召集因子からの抗原区域を含むことができる。粒子
はハイブリッドタンパク質の遺伝情報を指定する。

（ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ）核酸配列を調製することによ
って形成される。この核酸配列は、唯一の粒子形成性タ
ンパク質としであるいは１種または２種以上の異る粒子
形成性タンパク質を暗号化する（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）核
酸配列と組み合わせて、発現のため宿主細胞中に導入さ
れる。核酸配列は宿主内で発現されてポリペプチドを生
産し、粒子に組み立てられる。これらの粒子は、粒子形
成性ポリペプチドおよび問題のエピトープ部位の両者に
対する抗体を生産するための免疫原として使用すること
ができる。これらの粒子はワクチンとして使用すること
ができ、あるいは分離可能なポリクローナルまたはモノ
クローナル抗体の生産に使用できる。前記抗体は受動免
疫感作、生体外診断、細胞学、組織学または他の用途に
使用することができる。

粒子形成性ポリペプチドの少なくとも一部分の遺伝↑ｎ
化を指定する核酸配列に対して、イントロンの存在下ま
たは不存在下に、適切なリーディングフレームにおいて
連結されたエビ１〜−ブ部位を有する１種または２種以
−Ｆのポリペプチドまたはオリゴペプチドの遺伝４１　
ｆｌｕを指定するポリヌクレオチドフラグメントを用い
ることＧごより、１種またはそれ以上の前もって決定し
たエピトープ部位の免疫原性が増大した、新規な免疫原
組成物が提供される。ここで得られるハイブリットタン
パク質は、粒子形成能力を保持する。とく乙二核酸配列
は、問題の１種または２種以上のエピトープ部位の遺伝
情報を指定するポリヌクレオチド配列の同一方向におい
て、３′末端への有意なりＮＡ一本領（ｓｅｎｓｅ　５
ｔｒａｎｄ）の転写方向に５′末端区域に接合したウィ
ルス粒子形成性ポリペプチドの少なくとも一部分の遺伝
情報を指定するために用いられる。問題のエピトープ部
位の暗号情報を指定するポリヌクレオチド配列は、天然
に産出せず、粒子形成性ポリペプチドの遺伝情報を指定
する配列に接合される。ハイブリッドタンパク質の遺伝
情報を指定する生ずるハイブリッド遺伝子は、転写調節
および翻訳の開始および停止の信号へ接合され、そして
発現（ｅｘｐｒｅｓｓ　１ｏｎ）および粒子のアセンブ
リー（ｐａｒｔｉｃｌｅ　ａｓｓｅｍｂｌｙ）の条件下
で宿主中に導入される。このアセンブリーは、ハイブリ
、・トタンバク質のみあるいはハイブリ、トタンバク質
と他の粒子形成性タンパク質との組み合わせの粒子の形
成の結果であることができる。

パッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）のプロセスの一
部分として、カプシドまたはキャブンドタンパク質を暗
号化するウィルス遺伝子は宿主内で発現され、そして組
み立てられてカプシドを形成する。次いで、カプシドは
従来法に従い分離され、そして抗体の形成を刺激する免
疫原として使用されうる。

ハイブリッド粒子形成性タンパク質の調製ζこおいて使
用すべき粒子形成性ポリペプチドのための要件は、ポリ
ペプチドが宿主内で十分に安定であってカプシドを形成
すること：ポリペプチドが自動的に集成して細胞質内で
カプシドになること；粒子形成性タンパク質の末端また
はその断片が１種または２種以上の異るポリペプチド（
例、オリゴペプチド）によって変更されうろことであり
、これにより異質ポリペプチドは所望の抗原コンホメー
ションで粒子の表面において提供（ｐｒｅｓｅｎ　ｔ）
されかつ粒子形成性タンパク質は発現宿主内で細胞毒性
ではない。

単細胞微生物宿主内で調製されうる粒子形成性タンパク
質の例は、Ｂ型肝炎表面抗原（ｔｌＢｓＡｇ）、とくに
Ｂ型肝炎表面抗原に対する前駆物質、ｐｒｅＳ−Ｂ型肝
炎（ｐｒｅＳ−１１ｅｐａｔｉ　ｔｉｓ　Ｂ）表面抗原
（ｐｒｅＳ−ＨＢｓＡｇ）である。

Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）の粒子形成性タンパク質は
、その全体を使用することができ、その粒子形成断片と
して使用することができる。これは通常少なくとも約９
０％のアミ’ｉｌ配列を存し、とくにＮ−末端を有し、
ｐｒｅＳの少なくとも一部分を含むことが望ましく（通
常少なくとも５％好ましくは少なくとも約２５％）、こ
こでアミノ酸はｐｒｅＳ部分の任意の部分（通常Ｎ末端
において）から除去されうる。ｐｒｅＳポリペブ千ドは
１６８のアミノ酸を有し、そして断片が用いられるとき
、それは通常約１０〜１００個のアミノ酸を佇するであ
ろう。

ｐｒｅＳ部分は天然に産出するｐｒｅＳ部分、とくにＣ
末端部分の約２５〜７５個のアミノ酸、通常３５〜６５
個のアミノ酸を含むことができる。

粒子形成性タンパク質のための遺伝子は入手可能である
か、あるいは常用の技術に従って得ることができる。ｌ
ｌＢｓＡｇを暗号化する遺伝子はハレンズエラ（Ｖａｌ
ｅｎｚｕｅｌａ）等の前記の文献（１９１３２）に記載
されているが、前駆体ｐｒｅＳ−１１８ｓＡｇ遺伝子は
１９８４年６月１８日提出の米国特許出願第６２Ｉ　、
　７５６号に記載されているので、詳細はその文献を参
照されたい。

粒子形成性タンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子が入
手不可能である場合、このタンパク質を分離し、部分的
に配列さぜ、そしてアミノ配列に基づかせることができ
、ＤＮＡプローブを調製することができる。次いでウィ
ルスを単離し、適当ならば断片にして約５〜２０　ｋ　
＋）の断片を形成し７、そして断片を分７−量シこ従い
分離しかつ二重らせんの形成についてプローブを用いて
スクリーニングすることができる。二重らせんを形成す
る断片をクローニングし、精要し、そしてサブクロ−ニ
ングしてより小さい断片を形成することができ、そして
これらをクローニングする。次いでサブクローニングし
た断片を分子呈に従い分離し、そして再び二重らせんの
形成についてプローブでサブクローニングする。二重ら
せんを形成するこれ、−・の断片は、ここで順次にウィ
ルスのゲノムをスクリーニングするためのプローブとし
、て使用することができ、これはムンク・ビーン（ｍｕ
ｎｇ　ｂｅａｎ）ヌクレアーゼで開裂されている。この
酸素は遺伝子の末端付近で切離すことがわかった。マク
カチャン（ＭｅＣｕ　ｔｃｈａｎ）等、丈光Ｉ　７７−
　（ｓｃｊ−ａｎ−９−）　（１９８４）臣：６２５−
６２８参照。

別法として、クローニングした断片を配列し、開いたリ
ーディングフレームを決定し、そして粒子形成性タンパ
ク質の既知の配列に一敗する配列を単離し、そして構造
遺伝子を定めるために使用することができる。適当なら
ば、種々の遺伝子を操作して１１Ｎ造遺伝子の部分を除
去し、特定のヌクレオチドを変更するたとができ、これ
は天然アミノ酸を変化させあるいは保持することができ
、制限部位を導入しあるいは他の操作上の便宜などを提
供することができる。

余分のＤ　Ｎ　Ａ　！！、制限、エキソヌクレアーゼの
消化、例え：よ、Ｆ１ａ１３１、ブライマーの修復、生
体突然変異誘発、または他の操作技術により除去するこ
とができる。断片の各操作をハイブリット配列の形成に
使用した後、断片をクローニングし、精製し、次のスク
リーニング操作にかける。特定の粒子形成性ポリペプチ
ドに依存して、ハイプリントタンパク質はＮ−末端区域
またはＣ末端区域に問題のエピトープを有することがで
きる。こうして、問題のエピトープ部位の遺伝情報を指
定するＤＮＡの配列は、粒子形成性タンパク質の遺伝情
報を指定する断片の有意なりＮＡ一本積のそれぞれ５′
または３′末端から３′または５′末端においてリーデ
ィングフレーム内で接合した有音なりＮＡ一本積を有す
ることができる。

問題のオリゴペプチドの遺伝情報を指定する配列は、天
然に産出する源、合成源またはそれふの組み合わせのい
ずれからも得ることができるが、粒子形成性タンパク質
には自然には接合しないであろう。天然に産出する配列
は短くするか、そうでなければ変更して制限部位Ｑこ導
入し、発現宿主優先コドンなどを提供することができる
。一般に、配列は粒子形成性ポリペプチドの能力を妨害
しないものであろう。典型的には、この配列は肖５０ア
ミノ酸以下、しばしば、１０〜２０アミノ酸の遺伝情報
を指定するが、５アミノ酸以下であることができる。

とくに興味あるものはオリゴペプチドの少なくとも１つ
のエピトープ部位の遺伝情報を指定する配列であり、前
記エピトープ部位は毒素とに、あるいは病原体の部分、
例えば、表面または膜タンパク質、分泌されたタンパク
質、コンヘロープタンパク質またはカプシドタンパク賃
上に存在する。

こうして、ワクチンとしての粒子の使用は典型的；こは
感染因子（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ａｇｅｎｔ）と関連
する問題のポリペプチドまたはオリゴペプチドを包含す
る。このような感染因子は、例えば、次のものを包含す
るがこれらに限定されないニゲラム陰性バクテリアおよ
びグラム陽性バクテリア；ウィルス、とくにヘルペスウ
ィルス、ＡＩＤＳに関連するレトロ寸ヌイルス（ｒｅｔ
ｒｏｖｉｒｕｓ）など；寄生体、例えばヒトマラリア寄
生体、プラスモジーグ≠−・フルシバル在＜Ｐｌａｓｍ
ｏｄｉｕｍ　　ｆｕｌｃｉｐａｒｕｍ）など。感染因子
は全件エピトープまたは反復単位から構成されているも
のを有するとき、それらの配列を、本発明の構成体中に
包含するのが好ましい。用いる配列は末端において制限
、アダプターまたはリンカ−などの連絡、生体外突然変
異誘発、プライヤーの修復などしこより操作して、粒子
形成性タンパク質の遺伝情報を指定する配列に接合する
ことができる。

ＤＮＡを接合する挿ケの技術が存在する。しばしば、２
つの断片の意図する接合部位に近接して制限部位が存在
する。この場合において、２つの末端は付着性でありか
つ相補的であり、そしてロストコントン（（！　ｏｓｔ
　ｃｏｄｏｎ）が必要でないとき、２つの末端を一緒に
接合することができ、ここで適切なリーディングフレー
ムが確立される。別法として、アダプターを使用するこ
とができ、ここでアダプターは失なわれたヌクレオチド
の一部分または全部を修復し、２つの断片を適切なリー
ディングフレーム中に存在させるかあるいは異なるヌク
レオチドを提供し、これは接合部において天然に産出す
るアミノ酸と異なるアミノ酸の遺伝情報を指定する。便
利には、断片の１つをあるベクター上でクローニングし
、適切な部位において制限し、次いでさらに、例えば、
制限し、アダプターのそう人などにより操作し、他の断
片をそう人し、次いでハイブリッド配列をクローニング
する。

いったんハイブリッド配列が調製されると、それをさら
に発現のために変更することができる。

これには、ハイブリッド配列を発現宿主内で発現のため
に転写調節および翻訳信号へ適切な配向で接合すること
が必要である。単細胞の微生物または哺乳動物細胞の発
現宿主として、真核生物または原核生物を使用できる。

いずれの場合においても、ハイブリッド粒子形成性タン
パク質の発現のために十分な発現ベクターが存在する。

原核生物７こついて、Ｅ、　’ｃｏｌｉ、　Ｂ、　５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ、　Ｂ、　ｔｈｅｒｍｏ−ｐｈｉｌｕｓな
どを使用できる。単細胞の真核生物について、Ｓ、　ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ、　Ｓ、　ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅ
ｓ、　Ｓ。

ｐｏｍｂｅ　　なとを使用できる。より高等の哺乳動物
の細胞；よマウスの細胞、ヒト細胞、サル細胞などを包
含する。

酵母菌細胞中のハイブリッドタンパク質の発現はとくに
重要である。酵母菌細胞中の発現のため、種々の発現−
、フタ−を使用することができ、通常、構造遺伝子の組
み込み以外を望むとき、２μの複製系を使用する。組み
込みを望むとき、ベクターは組み込みを伴う形質転換の
効率を高くするためａｒＳ−を用いることができる。ベ
クターは酵母菌内の選択のため１種または２種以上の遺
伝標識を通常有し１、ここで遺伝標識は生物致死剤、例
えば、抗生物質、例えば、６４１８、ツニカマイシンま
たは重金属、例えば、銅または亜鉛に１氏抗性の栄養要
求変異種の宿主にプロトトロフィー（ｐｒｏｔｏｔｒｏ
ｐｈｙ）を与えることができ、あるいは他の選択技術を
提供することができる。

酵母菌の転写調節開始配列は、種々の遺伝子、とくにグ
リコリンス遺伝子、例えば、アルコールデヒドロゲナー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ、トリセフオスフェートイソメラーゼ、ホスホフルク
トキナーゼ、など、または他の遺伝子、例えば、酸ホス
ファターゼ、ベーターアクチン、アルファーアミラーゼ
、熱衝撃タンパク賃、メタロチオネインなどから誘導す
ることができる。転写停止配列、便利には開始配列と同
一の遺伝子に関連する停止配列を用いて操作可能である
、任意の便ｆすな転写停止配列を用いることができる。

さらに、狽み込みが含まれるとき、ハイブリッド遺伝子
は増幅を可能とする他の遺伝子、例えば、メタロチオネ
イン遺伝子、例えば、銅ギレイチン（ｃｈｅｉａｔｉｎ
）遺伝子、ンヒドロフオレート１ノダクターゼ遺伝子な
どと直列に配置することができる。

他の配列に加えて、各段階におけるクローニングを可能
とするために、原核生物複製系を含めることもできる。

種々の原核生物複製系、例えば、Ｃ・）ＩＦｌ、ｌ”ｌ
不適合性プラスミド、Ｒ６、例えば、ラムダなどが存在
する。

本発明の構成体は、次式により概略的に示すことができ
る。

ＬＴｐ；’−Ｔｌ；’−Ｇ−Ｔｉｔ’−Ｔｐｔ’）　　
Ｍ−Ｅ、−ＣＴＩ）ｉ”−Ｔｌｉ”−＋ｍ−ｙｔｔＪ　
ｆ−（Ｒｐｅ）ａ−（Ｒ＋）ｐ）ｃ−（Ｍ）ｄ一式中、 Ｔｐｉは転写開始の調節信号である； ＴＩ、は翻訳開始の調節信号である； ＴＮＬは翻訳停止の調節配列である； Ｔ　ｐ　ｔは転写停止の調節配列である；ここで上付き
の１および２は種々の調節配列は同一であるかあるいけ
異ることができることを示し、ここで調節配列のすべて
は同一宿主により認識されることができ、かつ同一宿主
中で発現する機能をすることがある； Ｇは発現重工をストレス、例えば、抗生物質または重金
属から保護しかつ遺伝子およびフランキング区域（ｆｌ
ａｎｋｉｎｇ　ｒｅ４ｉｏｎ）を増幅させ、遺伝子およ
びフランキング区域の直列のコピーを形成する生産物の
遺伝情報を指定する遺伝子である；望ましくは、この構
成体を構成する遺伝子およびフランキング区域は、発現
宿主のゲノムと相同性を有する配列を含んで、ゲノム中
への組み込みの可能性を増大させるであろう；問題の特
定の遺伝子は、ジヒドロフオレートリダクターゼを暗号
化する（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）遺伝子、カナマイシン抵抗
性の遺伝情報を指定する遺伝子（ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｃ
ｏｄｉｎｇ　ｆｏｒｋａｎａｍｙｃｉｎ　ｒｅｓｉｓｔ
ａｎｃｅ）（Ｇ４１Ｂ）、ツニカマイシン抵抗性の遺伝
情報を指定する遺伝子および、重金属に対する抵抗性を
与えるため、メタロチオネインの遺伝情報を指定する遺
伝子を含む； Ｅは転写速度を増加する増加因子（ｅｎｈａｎｃｅｒ）
である； Ｉｍは式（八ｇｉ）ｋ−（ｐｒｅＰＰ）　ｂ−Ａｇｐを
有する免疫原であり、式中、 Ａｇｉ　は問題の抗原であり、これはＡ　ｇ　ｐへ自然
に接合しないエピトープ部位を提供し、そのＡ　ｇ　ｐ
はこのエビ＋−−プ部位に対して特異性の抗体の形成の
ための免疫応答を誘導できるものである；ｐｒｅＰＰは
ポリペプチドであり、これは通常天然に産出するＮ−末
端ポリペプチドの全部または一部分であり、一般により
大きいポリペプチドから切離され、通常Ａ、　ｇ　ｐを
含み、そしてＡｇ、とＡ　ｇ　、との間の結合の役目を
することができる；ｍ、ｎおよびｂは０または１である
； におよびｆは各々１以上、典型的には２または３であり
、そして典型的には、ｋが１より大であるとき、ｆは１
であり、そしてその逆である。

Ａｇｐは粒子形成性抗原であり、これは天然に産出する
粒子形成性抗原またはその一部分と実質的に同一であり
、前記部分はＡｇｉ　と−ｒＦｉに粒子を形成すること
ができ、そして宿主内で粒子を形成しかつ抗体の生産の
ためのＡｇｉ、とくにＨＢｓＡｇ抗原を暴露するいかな
るウィルスからも誘導されうる； ＲｐｅおよびＲｐ　ｐは真核生物および原核生物の細胞
のための複製系である； ａおよびＣはＯまたは１である； Ｍはクローニングまたは発現宿主の選択を提供する遺伝
標識であり、ここで遺伝標識は同一あるいは異ることが
でき、そして生物致死剤、例えば、抗生物質、重金属な
どに対する抵抗；栄養要求変異種の宿主へのプロトトロ
フィーの提供−などを包含する； ｄはＯ〜５、通常１〜４である； カッコ内の配列はＤＮＡ配列の出現の好ましい順序の指
示を与え、一方力フコの外側の部分は他の順序であるこ
とができる。

種々の配列は常用の技術に従って接合することができる
。制限部位が機能配列、例えば、調節配列、解読配列な
どの外側に存在する場合、制限部位が相補的であるとき
２つの配列を接合することができ、あるいは２つの配列
の接合にリンカ−（β１ｎｋｅｒ）を使用できる。通常
、構成体を増分的に、通常クローニングベクターを使用
し構成され、ここで断片をクローニングベクター中に段
階的にそう人し、クローニングし、そしてベクターを単
離しかつ精製する。制限部位が機能配列の外側に存在し
ないかある機能配列に関し、て不都合に位置するとさ、
アダプターを使用することができ、前記アダプターは機
能配列のすべてまたは一部分を再びつくりかつ２つの機
能配列を適切な配列で一緒に接合する。別法として、便
利なｆＩ＋ｉ部位は配列の突然変異誘発によりつくるこ
とができ、そしてこのような部位は接合手順で使用する
ことができる。前記配列を一緒に接合する効率を改良す
る種々の技術は、１つの配列のアルカリ性ホスファター
ゼ処理、プラント末端（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ）の連結、
ティリング（ｔａｉｌｉｎｇ）を形成する配列の充填（
ｆｉｌｌｉｎｇ　ｉｎ）などを包含する。

必要な機能的配列を有する構成体がいったん調製される
と、この発現構成体を適合性宿主中に任意の便利な技術
により、例えば、形質転換、例えばポリエチレングリコ
ールの沈澱、接合（ｃｏｎｊｕｇ−ａｔｉｏｎ）、トラ
ンスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、形質
導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）などにより導入する
ことができる。次いで、受容（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）細
胞を適当な栄養培地中で所望審度に生長させ、細胞を収
穫し、リゼイト（Ｉｙｓａｔｅ）を便利な手段、例えば
、ガラスピーズの存在下の攪拌により調製し、そして所
望のタンパク質を収穫する。

本発明のタンパク質は自然に凝集して発現宿主内で粒子
を形成する。粒子を包んで（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）脂質膜
のコート（ｃｏａｔ）を有するようＱこすることができ
、このコートはウィルスにより暗号化された（ｅｎｃｏ
ｃｌｅｄ　ｆｏｒ）膜タンパク質を含むかあるいは含ま
ないことができる。あるいは、粒子は脂質膜を含まない
ことができ、あるいは膜は始めに存在することができ、
あるいは全体的にまたは部分的に除去することができる
。

粒子は広範な種類の方向で免疫原として使用できる。粒
子は、存在する抗原のいずれかあるいは両者を認識する
カラムを用いる親和性クロマトグラフィーにより単離す
ることができ、あるいは別法として、分離は密度勾配、
ゲル濾過などを用いて実施できる。これらの技術は個々
にあるいは組み合わせて用いることができる。

死亡したウィルスのワクチンを投与する常法のいずれを
用いることもできる。これらは固体の生理学的に許容さ
れうる基剤上の適用あるいは生理学的に許容されうる分
散液中の、非経口的な、注射による適用などを包含する
。ワクチンの適量は投与の道筋に依存し、そして宿主の
大きさに従って変化するであろう。ワクチンは、もって
いたとしても、副作用はわずかであるので、宿主に［員
傷を与えないで、比較的大きい投与量を用いることがで
きる。ワクチンの星は、ワクチンによる免疫感作を増大
するために適当な担体または補助薬と混合した後、約ｌ
μｇ′〜２０Ｂ／ｋｇ宿主（より通常には約５μｇ〜２
　”Ｏ，１，＋　ｇ　”）であり、皮下的にまたは筋肉
内に与えられる。

ワクチンのための補助剤の作用を達成する種々の方法は
、アルミニウムの水酸化物またはリン酸塩（みょうばん
）のような物質の使用を包含し、前記物質は通常リン酸
塩緩衝生理的食塩水中の０．０５〜０．１％の／８液と
して使用され、［類の合成ポリマー（ｃａｒｂｏｐｏｌ
）　　とン昆合され、ハクテリー７細胞、例えばＣ，胆
■憇またはエンドトキンンまたはグラム陽性バクテリア
のリポ多糖成分との０．２５％の溶液混合物として使用
され、生理学的に許容されうる油状賦形剤、例えば、マ
ンニドモノーオレエー）　（Ａｒａｃｅｌ　Ａ）中の乳
剤またはｆｆｍ液の代替物質として使用されるパーフル
オロカーボン（Ｆ　ｌ　ｕｏｓｏ　Ｉ　−ＤＡ）の２０
％溶液との乳剤として使用される。

補助剤の使用量は、補助剤の性質に依存して広く変化し
、−最に免疫原の重量の０．１〜１００倍であり、より
通常約１〜１０倍であろう。

多くの場合において、ワクチンの多数回の投与が望まし
いであろう。通常、接種は６回を越えず、より通常４回
を越えず、好ましくは１回以上、通常約３回である。接
種は通常は２〜１２週の間隔、より通常には３〜５週の
間隔であり、必要に応じて１〜５年の間隔で周期的に促
進剤を用いる。免疫惑体の過程は、問題の抗原に対する
抗体について検定することにより追跡することができる
。

本発明の粒子は、また、問題の抗原に対する抗体の存在
を検出する検定において使用できる。検定における使用
゛において、個々のタンパク質または粒子を、検定に使
用される種々の標識の１種で通常標識付けされるであろ
う。これらの標識は特許および技術文献に広範に報告さ
れてきており、そして放射性核種、蛍光物質、化学ルミ
ネセンス物質、酵素、酵素基質、小さい分子などを包含
する。

本発明の粒子は、種々の哺乳動物の宿主、ネズミ、ウシ
、ブタ、ウサギ、ヒトなどにおける抗体の生産に使用す
ることができる。次いで、抗体を用いて問題の抗原の存
在を検出する免疫検定において使用することができる。

別法において、抗体は受動免疫感作に使用することがで
き、そして常法で哺乳動物の宿主へ生体内投与すること
ができる。

本発明の粒子は常法で抗血清またはモノクローナル抗体
の生産に使用できる〔コーラ＝（Ｋｏｈｌｅｒ）および
マイルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ　
（１９７５）２５６　：４９５−４９７、この開示をこ
こに引用によって加える〕。モノクローナル抗体につい
て、ハイブリドーマを培養して生長させるか、腹水症の
流体を形成するために腹腔内に注射するか、あるいは異
型的宿主またはイミノコンプロマイズド（ｉｍｍｕｎｏ
−ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）宿主の血液中に注射するこ
とができる。次いで、抗体を常法でｊｕｌすることがで
きる。

〔実施例〕

以下、実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、
これは本発明を限定するものではない。

去−を ＴＥ　　　１０ミリモルのトリス（Ｔｒｉｓ）　−）Ｉ
　Ｃｅ　。

ｐＨ８，０，１ミリモルのＥＤＴＡ ＥＤＴＡ　　　エチレン−ジアミノ−四酢酸ＰＢＳ　　
　リン酸塩緩衝化生理的食塩水ＳＯ５ドデシル硫酸ナト
リウム ＢＳＡ　　　ウシ血清アルブミン ＡＤＨアルコールデヒドロゲナーゼ ＧＡＰＤＨグリセルアルデヒド デヒドロゲナーゼ ＋１ｓＶ　　　単純性庖疹ウィルス（Ｉｌｅｒｐｅｓ　
ｓｉｍｐｌｅｘｖｉｍｓ） ｇＤ　　　糖タンパク質Ｄ １１ＢＶ　　　Ｂ型肝炎ウィルス １１Ｂｓ１１４　　Ｂ型肝炎表面抗原 ｐｒｅ−Ｓ　　前表面（ｐｒｅ−ｓｕｒｆａｃｅ）＋１
ＲＰ　　　セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｉｌｏｒ
ｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）ｋｂｐ　　
　キロ塩基対 すべてのＤ　Ｎ　Ａ　掻作は標準手順に従って実施した
。モノキュラー・クローニング（Ｍ。ＩｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎ（Ｈ）　、　Ｔ．マニアチス（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ）　ら、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリーズ（ｃｏｌｄ　ｓｐｒｉｎｇ　ｔｌａｒｂｏｒ　
Ｌａｂ．）、−ニーヨーク、１９８２参照。クローニン
グに使用した酵素はニュー・イングランド・バイオラプ
ス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｉ！ｉｏ−ｌａｂｓ）ま
たはヘセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
）がら入手し、そして供給者の指示に従って使用した。

酵母菌を形質転換し、そして種々の培地、例えば、選択
的培地（ロイシンを含まない酵母菌の窒素塩基）；１％
（Ｗ／Ｖ）の酵母エキス、２　％（Ｗ／　Ｖ）　（７）
ペプトンおよび２％（Ｗ／Ｖ）のグリコースを含有する
ＹＥＰＤ培地、および他の適当なおよび／または下に詳
述する培地を用いて生長させた。平板培養の場合におい
ては培地は２％（Ｗ／Ｖ）の寒天を、および形質転換の
ため、３％の上部の寒天（ｔｏｐ　ａｇａｒ）を含有し
た。培地の組成は、ジャーマン（Ｓｈｅｒ＋ｍａｎ）ら
、１９７９、算象ｌら１社１旋乱ザる　法：　験室のマ
ニュアル（九劫崩ｓ　ｉｎ別主１ｅｎｅｔｉｃｓ：　Ａ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　　Ｍａｎｕａｌ）、コールド゛
スプリング・ハーバ−・ラボラトリーズ、ニューヨーク
に記載されている。

以下仝白 １、ハイブリッド抗原の酵母菌発現ベクターのは欧州特
許（ＥＰＯ）　８３／３０６５０７．１参照。その関連
部分を引用によってここに加える。

Ｉｂ、プラスミドｐＹＨ５１１９ このベクターは、ｐｃｉ／１　　（前述）の−Ｂａｍ旧
部位にクローニングされたグリセルアルデヒド−３−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＩＩ）発現カ七
ノ）　（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃａｓｓｅｔｔｅ）中
に部分ｇＤＤ伝子を含有する。クローニングされた部分
ｇＤＤ伝子はそれぞれ５′および３′末端の解読区域に
６００ｂｐおよび２４００ｂｐの２つの欠失を含有する
。これらの欠失は信号配列（５′）の大部分とアンカー
（ａｎｃｈｏｒ）配列（３′）解読区域のすべてとから
なる。ｐＹＨＳ　１１９を構成するため、２つの断片を
得た＝（ｉ　）　　ｐＢＲ３２２配列、ＧＡＰＤＨプロ
モーター＋Ｇ　Ａ　Ｐ　Ｄ　Ｉ＋構造遺伝子の最初の７
つのコドンおよびＧＡＰＤＩ＋終止因子からなるＮ匹１
−　Ｓａｌ　ｌ消化ベクター（６，８ｋｂｐ）　、この
ベクターはｐＬＩＨ２８（後述する）の）Ｊｃｏｌ消化
、引き＋Ａ＜５ａｌＩを用いる部分的消化およびゲル電
気泳動による精製によりｊ周製された。

（ｉｉ　）部分的ｇＤＤ伝子を含有するＮｃｏｌ−（Ｎ
ａｒｌ）−盈旦１断片（８７３ｂｐ）。この断片は次の
ようにして得たニブラスミドｐＹＩＩＳ　１１５　（後
述する）をと９１およびΣｍｌで消化し、ｇＤＤ伝子を
含有する生ずる１４３０ｂｐ断片をゲル電気泳動により
精製し、引き続いて凡ど１で消化する。

８７３ｂｐ　Ｎｃｏ　に狛工■　（断片をゲル電気泳動
により単離した。次の配列の合成アダプター二５　　’
　　−ＣＧＣＣＧＣＡＡＡＴＣＴＡＣ−３’ＧＧＣＧＴ
ＴＴＡＧＡＴＣＡＧＣＴ ↑　　　　　　　↓ Ｎ虹Ｉ　　　　Σ吋ｉ はＮａｒ１５’オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）　
、リーディングフレーム中の３コドン、停止コドンおよ
びＳａｌ　Ｉの５′オーバーハングに対する相補的ヌク
レオチドを提供し、このアダプターを８７３ｂｐ　Ｎ印
１−ＮａｒＩ断片に結合し、次いでΣ旦Ｉで消化してＮ
９Ｉ−（Σ肛■）主計Ｉ断片を生成した。

これらの２つの断片を一緒に結合してｐＢＲ３２２誘導
ベクターを生成した。このベクターはリーディングフレ
ームにおいてｃＡｐｏｎ遺伝子の７つの最初のコドンに
融合された部分的ｇＤＤ伝子を含有し、ＧＡＰＤ１１プ
ロモータがその５′末端およびＧＡＰＤＩ＋終止因子が
その３′末端に側面的に位置していた。このプラスミド
を旦す１目で消化し、そして３．４ｋｂｐ断片をゲル電
気泳動により精製することによってｇＤ発発現上セント
得た。

この断片を旦」旧消化、アルカリ性ホスファターゼ処理
ｐＣ１／１　　（前述した）に結合して、ｐＶｌｌ５１
１９を生成させた。

ｌｃ、　プラスミドＶＨ２８の　１ プラスミドｐＶｌ＋　２８は、正しくないリーディング
フレームにおいてＧＡＰＤＨ構造１１伝子の最初の７コ
ドンへ融合したＢ型肝炎表面抗原（ｌＩＢｓＡｇ）遺伝
子の解読および３′非解読区域を含有する。この融合物
の５′末端においてＧＡＰＤＩ＋プロモーターおよび３
′末端においてＧＡＰＤ１１解読区域の部分が側面に位
置し、次いでＧＡＰＤＨ柊止因子が位置する。このプラ
スミドは、次の配列をもつＧＡＰＤＩＩ　ｔ：４造遺伝
子の最初の７コドンの３′末端にΣμＵ部位を佇するよ
うに構成した： ｅｔ ５　　’　　−ＡＡＡＣＡＡＡＩＧＴＴ八Ｇ八″ＧＴＴ
ＧＣＴへＡへＴＣＣ−３へ’ＴＴＴＧＴＴＴＡＣＣ八八
ＴＣＴＣ八八ＣＧへへＴ八八ＧへへＴＡＣ３へへＧＡＰ
ＤＨ５’　ＧＡＰＤＨＮ並１部位プロモーター解読区域 このＮｃａｌ末端を部分的ｇＤ断片に結合するとき（前
述のｐＶｌｌ５１１９の構成を参照）、ｇＤタンパク質
についての正しいリーディングフレームを再生する。断
片（ｉ）の調製において使用したΣ１■部位（前述した
）はＧ　Ａ　Ｐ　Ｄ　１１終止因子の５′区域に存在す
る。したがって、Ｉｆ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ解読（ｃｏｄｉ
ｎＰ、）　＋非解読（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ）区域およ
びＧＡＰＤＨ解涜区域を、ｐＶｌｌ　２８をＮｃｏｌで
かつ部分的にとユＩで消化することにより得た。

ｐｆｌ１３ｓ５−３１１ａｅ２−１　（ｉ’！述する）
から２ｍ　製！ｗ　ｆｓ　６　Ｑ　７　ｂ　ｐの３　′
ノＦ−解Ｅｋ区域およびｌｌＢｓＡｇを含有する断片を
ＧＡＰＤＩ＋含有ヘクターｐＧＡＰ’ｚ（後述する）中
にクローニングすることを、ｐＶＨ２８の構成は含む。

前記断片を調製するため、ｐ）ＩＢＳ５−３１１ａｅ２
−１をヱｓ−ｉ＋消化により直線化し、ΣＰ口で部分的
に消化し、そしてｐＢＲ３２２配列、ｔｌ　Ｂ　ｓ　Ａ
　ｇ解読および３′配列を含有する１、９ｋｂｐのＰｓ
ｔ、Ｉ　一連速Ｉ断片をゲル電気泳動により精製した。

この断片を引き続いてＥｃｏＲｌで消化し、そして）ｌ
　Ｂ　ｓ　Ａ　ｙ解読および３′非解読区域を含有する
１、２ｋｂｐのＮｃｏ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断片をゲル電
気泳動により精製した。プラスミドｐＧＡＰ　’　ｚを
入国１で直線化し、そして見計３１で処理してほぼ１０
０ｂｐを除去した。このプラスミドをＮｃｏｌで引き続
いて消化し、そして杓９　ｋｂｐのヘクター断片をゲル
電気泳動により精製した。このヘクターの　凡９■末端
および１．２ｋｂｐのＮｃｏｌ　−−ＥｃｏＲＩ断片（
ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇを暗号化する）を結合した。

リセスド末端（ｒｅｃｅｓｓｅｄ　ｅｎｄ）をフレナラ
（！（Ｉｅｎｏｗ）で充填し、そして生ずるプラント末
端（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ）を、丸環−３１哨化己こより
得ふれたヘクターのプラント末端に結合してｐｖＨ２Ｂ
を生成した。

ｐＨＢｓ５−３　ｔｌａｅ２−１は、ＩＩ　Ｂ　ｓ　Ａ
　ｇ解読区域および６０７ａｐの３′フランキング配列
（ｆｌａｎｋｉｎｇ　５ｅｑｕ−ｅｎｃｅ）を含有する
。このプラスミドは同一のインサー）　（ｉｎｓｅｒｔ
）を含有するが６０７ｂｐＯ代わりに１２８ｂｐの３′
の翻訳されない区域のみを含有するｐＨＢ５５−３の誘
導体である。プラスミドｐＨＢｓ５−３は１９８４年５
月１１日提出の米国特許出願第６０９，５４０号（１３
〜１４ページ）に記載されている。ｐＨＢ５５−３＋Ｉ
刊２−１は次のようにして構成した。ＩＩＢＶゲノム（
３，２ｋｂ）はｐＨＢ−３２００Ｃバレンズエラ（Ｖａ
ｌｅｎｚｕｅｌａ）等、ネイチャーΩ恒遵」ヅー（１９
７９）劉０　：８１５−８１９）からＥｃｏＲＩで制限
消化することにより切除し７た６３．２ｋｈｐの断片を
ゲル電気泳動により精製し、そしてＥｃｏＲＩ付着末端
により再環化した。この閉じた！１ＢＶゲノムを且す■
で消化した。Ｈ；４．−ｔ＝　ＩＩは３′非解読区域に
おいて切断する。リセスド末端をフレナラ断片で充填し
、そしてＨｉｎｄｌＩＩリンカ−を結合した。このＤＮ
ＡをＨｉｎｄｕで、引き続いてＸｂａｌで切断した。こ
れはｔｌ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ解読区域に単一の部位を有す
る。５８６塩基対のＩｆ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇの解読配列お
よび６０７塩基対の３′非解読区域を含有する１　、　
２ｋｂｐの入夙■一旦ｉｎｄ　ｌＩ［ｌ折片を、ゲル電
気泳動により単雛した。この断片を、ＸｂａｌおよびＨ
ｉｎｄｌＩＩで前もって切断しかつアルカリ性ホスファ
ターゼで処理したｐＨＢｓ５−３中にクローニングして
、ｐＨＢｓ５−３　Ｈａｅ２−１を生成した。

ｐＧＡＰ−２は、ＧＡＰＤＩ！解読配列、５′および３
′フランキング区域を有するＢａｍ１ｌｒインサートを
含有するｐＢＲ３２２ｊＷ導ヘクターである。このプラ
スミド中に１よ２つの囚血１部位が存在し、１つは解読
区域中に存在し、そして１つは３′フランキング配列中
に存在する。ｐＧＡｌ”−２’はｐＧＡＰ−２の誘導体
であり、３′フランキング区域中に存在する菱田Ｉ部位
は排除されている。この目的に、５０μｇのｐＧＡＰ−
２をＸｂａｌで部分的に消化し、且虹３１で処理して、
２５塩基対／端を除去し２、そして連結した。このプラ
スミドを使用して−Ｅ　、　ｃｏｂ　ｉ　；ｌ８１０１
を形質転換し、この形質転換体を３′フランキング区域
中のＸ、ｂａｒ部位の損失じこついて選択した。

１ｄ、ｐυＪ−ジ」」５の構成 ｐｃｔ／１　（ｎｉ述＞のシ月旧部位中にりじ１−ニン
グされたグリセルアルデヒド−３−ホスフェ−１−デヒ
ドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）発現カヤノド中にｇＤｉｆ
ｆ伝子を、プラスミドｐＹＩｌｓ　１１５は金白−する
。

ＧＡＰＤＨ発現カセットは次のようにして構成した。

３つの断片を調製した（下に詳述する）：（ａｌ　　３
１１６　ｂ　ｐのｐＢｌ？　３２２および１０６１ｂｐ
のＧＡＰυ１１プロモーターを含イ■する址明１１１−
且ｉｎｄ　１１１１所片（１４０７ｂｐ）、 （ｂ）ｇＤ遺伝子を含有するＨ　１−ｎｄ　ＩＴ＋−、
、Ｓａｌ　ｌ　１１片（１４３０ｂｐ）、および （ＣＩ　　Ｇ　Ａ　ｒ’　Ｄ　Ｉ＋終止因子を含有する
δ、＞−ｊ−１−−Ｅｐす、−ＩＩ＋断片（９００ｂｐ
）。

これらの断片を一緒に結合し、そしてこの混合物をＢａ
ｍ１Ｂで消化した。３．７ｋｂｐのｆｉ）られるカセ。

トをゲル電気泳動により１１１．■し、ぞしてＵ−ρ−
！Ｉ！ＩＩ＋切断し、アルカリ性ホスファターど処理し
７たｐｃｌ・ｌに結合した。

断片（ａｌは、ｐＧＡＰ　３４７　（２＆述する）をＢ
ａｍ１ｌ＋で完全に消化し、次いでＨｉｎｄＩ［［で部
分的に消化することにより調製した。　３４６ｂｐのｐ
ＢＲ３２２および１０６１ｂｐのＧＡＰＤＩＩプロモー
ターを含有する生ずる１４０７ｂｐの断片を、ゲル電気
泳動により単離した。

ｐＨ＋７３２２中にクローニングされたＧＡＰＤＩＩプ
ロモーター（１０６１ｂｐ）を含有するプラスミドρＧ
ＡＰ　３４７を構成した（　１９８３年２月２２日提出
の米国特許出願第４６８，５８９　号参照）。

Ｐｏ１ｙＡ　　↓ＲＮＡ　をＳ、　ｃｃｒｅｖｉｓｉａ
ｅ酵母菌株八３６４Ａから屯離へた。ＡＭＶ逆トランス
クリプターゼおよびＥ、　ｃｏｌｉ　　ＤＮＡポリメラ
ーゼＩを用し）で、二本鎖ｃＤＮΔを合成した。Ｐｏ１
ｙ−ｄｃ−テイル（ｔａｉｌ）を、デオキシヌクレオチ
ド末端トランスフェラーゼを使用して、二本鎖ｃ　Ｄ　
Ｎ　Ａ分子に付加した。Ｐｏ１ｙ−ｄｃ−ティルト（ｔ
ａｉｌｅｄ）ｃＤＮＡをポリーｄＧ−ティルトｐＢＲ３
２２にアニーリングし、そしてＥ、　ｃｏｌｉ　ｔｌＢ
ｌｏｌを形質転換するために使用した。１０００の形質
転換体を標識Ｉ”Ｏ１ｙ八＋ＲＮ八へのコロニーハイブ
リッド形成によりスクリーニングし、そしてサブセット
（ｓｕｂｓｅｔ）　全制限エンドヌクレアーゼのマツピ
ング（ｍａｐｐｉｎｇ）およびＤＮＡ配列化（ｓｅｑｕ
ｅｎｃ　ｉ　−ｎｇ）によりさらに検査した。ＧＡＰＤ
Ｈ配列を含有する３つのクローンがプールから単離され
た。１つのクローン（ρｅＧＡＰ−９）は約１２００塩
基付のインサートを含有し、そしてこれをそれ以上の研
究に使用した。

プラノトナー（Ｂｌａｔｔｎｅｒ）等、サイエンス（釘
工！瓜搬−（１９７７）貝６　：　１６１−１６９に従
い、ラムダファージチャロン（Ｃｈａｒｏｎ）　２８中
で制限エンドヌクレアーゼＳ　ａｎ３Ａで酵母菌ＤＮＡ
全体を部分的に消化した後に得られる断片をそう人する
ことにより、酵母菌遺伝子のライブラリー（ｌｉｂｒａ
ｒいを調製した。このファージライブラリーをｐｃＧＡ
Ｐ−９からの標識ＤＮＡでスクリーングすることにより
、酵母菌ＧＰＤＨ解読配列を含有するいくつかの断片を
単離した。これらのクローンの１つの酵母菌ＧＡＰＤＨ
遺伝子を１．　ｐＢＲ３２２中で２．１ｋｂｐの且飽ｄ
ｌｌ＋断片（ｐＧＡＰ−１）としてサブクローニングし
た。

ＧＡＰＤＩ＋プロモーター区域をこれらのクローンから
単離した。プロモーターの３′部分を含有する約３５０
ｂｐの且匝Ｉ−基襖ｄｕｌｌ断片を、次のようにして得
た：　（ａｌｐＧＡＰ−１を助ｆｌで消化して、プロモ
ーターの３′部分およびＧＡＰＤＩＩのＮ−末端アミノ
酸を暗号化する区域を含むほぼ５００ｐｂの断片を発生
させる：　（ｂ）ＢａＬ　３１で切除して、ＧＡＰＤ１
１解読区域を欠＜　４００ｂｐの断片を生成する（ＡＴ
Ｇ開始フトンから１塩基上流の３′末端）；（Ｃ）１江
ｄｌｌｌリンカ−の付力旧および（ｄ）　Ｈ匝■で切り
離して３５０ｂｐのＨｈａ　Ｉ　−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断
片を生成する。プロモーターの５′部分を含有する約７
００ｂｐの第２且ｉｎｄ■一旦田■断片をｐＧＡＰ−Ｔ
から単離し、３５０ｂｐの一町匝Ｉ一旦ｎｄｌＩＩ肌片
に結合し、そして旦±１■で処理する。生ずる１０６１
ｂｐのＨｊｎｄＩＩＩ断片をゲル電気泳動により単離し
、そしてＨｉｎｄｌｌｒ消化し、アルカリ性ホスファタ
ーゼ処理したｐＢＲ３２２中でクローニングしてｐＧＡ
Ｐ　３４７を生成する。

４捷は次のようにして得た。

Ｉｔｓシー１バノトン（Ｐａｔｔｏｎ）　　ライブラリ
ーから単離したクローンＨをΣａｃｌで消化した。２．
９ｋｂｐの５ａｃｌ′＠片をゲル電気泳動により精製し
、引き続ル電気泳動により精製し、次の配列 ５　’　−ＴＧＡＴＡＡＧ−３’ ＡＣＴＡＴＴＣＡＧＣＴ のＮｒｕ　Ｉ　−Ｓａｌ　ｌアダプターに結合し、そし
て見計■で消化した。

断片ｆｃｌは次のようにして得た。ＧΔＩＩ　Ｄ　Ｉ＋
終止因子を含有する９００ｂｐ断片を、ｐＶＨ２８（前
述）の旦だ旧および５ａｉｌの消化およびゲル電気泳動
による精製により得た。

ｌｅ、プラスミドｐＤｃ１０１の構成 このベクターは、ｐＢＲ３２２誘導体（ｐＢＲΔＲ１−
３ａｌ−１後述する）のＢａｍ旧部位中にクローニング
されたＧＡＰＤＩ（発現カセット中にｐｒｅＳ−ＨＢｓ
Ａｇ遺伝子（ｐｒｅ−３区域の５５コドンを含む）を含
有する。このプラスミドを構成するため、３．２ｋｂｐ
の一膓ａｍｌｌ１発現部位をｐＨｌ１ｐｒｅＳＧＡＰ３
４７／１９Ｔ　　（後述する）からＢａｍｆｌｌ消化に
より切除した。ゲル電気泳動による精製後、３．２ｋｂ
ｐの旦ａｍｌｌｌ断片を、旦ａｍｌｌｌ消化し、アルカ
リ性ボスファターセ処理したｐＢＲΔＲ１−３ａｔに結
合し、そして旦、他生でクローニングしてｐＤｃｌｏｌ
を生成した。

ｉｆ、プラスミドｐＢＩ？ΔＲ１−３ａｌの構成このプ
ラスミドはｐＢＲ３２２の誘導体であり５．乳９Ｐ１部
位とΣａｊ１部位との間の区域が欠失されかつ実〜ザ旧
部位がつくられている。このプラスミドは、ｐ）＋１１
１３２２をＥｃｏＲＩおよび５ａｉｌで消化することに
よす構成された。オーバーバンキング末端にフレナラ断
片を充填した後、旦占旧リンカ−を結合し、次いでＢａ
ｍ旧で消化し、そしてこのヘクターを再環化し、クロー
ニングしてｐＢＩ’ｌΔＲ１−５ａｔを生成し、これは
ＥｃｏＲ１部位を含有しない。

１　ｇ　−ｐＨＢｐｒｅＳＧＡＰ３４７／ｉ９Ｔの４戊
酵母菌グリセルアルデヒド−３−ホスファターゼデヒド
ロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター区域、５５アミ
ノ酸を暗号化する１６５ｂｐからなるｐｒｅ−３ＢＶ区
域；’ｐｒｅ表面（ｐｒｅ−３）配列をもつり一ディン
グフレーム中の表面抗原（ｔｌＢｓＡｇ　）のための解
読配列；およびＧ　Ａ　Ｐ　ｌ）！Ｉ終止天了を含有す
るカセットを、次の４つの断片を結合することにより調
製した：　（ａｌ　ＧＡＰＤＩ（ブｏ　モーターを含有
する１４０７ｂｐのＢａｍ旧〜ＨｉｎｄｌＩ！断片；　
（ｂｌｐｒｅ−５区域の最初の３アミノ酸の遺伝情報を
指定する１４ｂｐのｊｌｉｒｌ、ｄｍ　−ＥｃｏＲＩア
ダプター分子；　（ｃｌｐｒｅ−３区域のセグメント（
５２アミノ酸）およびＨＢｓＡｇ　Ｎ−末端区域の最初
の３２アミノ酸を暗号化する（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）２５
０ｂｐのＥｃｏＲＩ　−Ｘ　ｂａ　Ｉ断片、および（ｄ
ｌ　ｓＡｇ解工売区域およびＧ　Ａ　Ｐ　Ｄ　１１終止
因子を含有するほぼ１５８０ｂｐの一＼匝Ｉ一旦Ｕ旧断
片。

これらの４つの断片を、次のようにして段階的に結合し
た：４ピコモルの断片（ａｌ　（ＧＡＰＤＩ＋プロモー
ター）を２６０ピコモルのホスボリル化断片（ｂｌ　（
１４ｂｐの合成アダプター）に１０単位のＴ４　ＤＮＡ
ＩＪガーゼの存在下に結合した。生成物（断片ａ−ｂ）
を過剰のアダプター分子から調製用ゲル電気泳動Ｑこよ
り分離した。はぼ１．５ピコモルの分離断片＋ａ＋　−
（ｂ）を、はぼ１．５ピコモルの断片（Ｃ）、２５ｔ）
ｂｐの旦９Ｒ１−Ｘ　ｂａ　Ｉ　ｐｒｅ−５および１１
　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ　Ｎ−末端区域にｌ　Ｑ　ｉ１ｉ位の
Ｔ４　ＤＮＡリガーゼの存在下に結合した。

！Ｚ　！：Ｌ　１　ヒＪ　モ／Ｌ／の生成＃５Ａ（断片
ａ−ｂ−ｃ）を、１ピコモル（７）断片（ｄ）（１５８
０ｂｐのＸｂａ　Ｉ　−Ｂａｍ　Ｈ＋、［ｌＢｓ八８へ
−末端区域およびＧ　Ａ　Ｐ　Ｄ　Ｉ＋終止因子）およ
び０，０１ピコモルのシ月ｔｌＩ消化した酵母菌ヘクタ
ｐＣｉ／ｌ　ｃこ、５単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼの存
在下に結合した。ｐｃｉ／１中でクローニングされたカ
セットを含有するプラスミドを、Ｅ、　ｑｏｌｉ　１１
８１０１の形質転換後に単離した。このプラスミドをｐ
ＨＢｐｒｅｓＧＡＰ３１１７／１９Ｔと命名した。断片
ｔａ）　、　（ｂｌ　、　（Ｃ１および（ｄｉ発得るた
めＳこ用いた方決を次に説明する。

１祈片（ａ１３４６ｂｐのｐＢＲ３２２およびｌ０６１
ｂｐのＧＡＰｆｌｌｌフ゛ロモーターを含有する１４０
７ｂｐのｌ挫旧−Ｈ１ｎｄＩＩＩ断片は、５０μｇのプ
ラスミドＩ）ｌｌＢｓ５６−ＧＡＰ３４７／３３（後述
する）をＢａｍ１ｉｌおよび且ｉｎｄ　１ＩＩ（各１０
単位）で消化することによって調製した。この断片を１
％のアガロース中で調製用ゲル電気泳動により単離した
。

Ｇ　Ａ　Ｐ　Ｄ　Ｉ＋プロモーターおよびＡＤＨ終止因
子の制御のちとにＩＩ８ｓＡｇを含有するプラスミド−
・フタ−ｐＨＢ５−５６ＧＡＰ３４７／３３を、次のよ
うにして構成した。

ｐＧＡＰ−３４７（前述）をΣｐｈ＋で完全に消化し、
次いで旦ｉｎｄ　ｉＩｌで部分的に消化して、杓１０６
０ｂｐ　（腸ＰＤＨプロモーターを含む）および約５３
０ｂｐの、）ＢＲ３２２を有するほぼ１７００ｂｐの）
叫ロー田ｉｎｄ　ＩＩＩ断片を生成した。この１７００
ｂｐの）囮＋Ｉ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩＧＡＰＤＩＩプロモ
ーター断片を、８４０ｂｐの五〇、ｄｌｌ！−μ」−復
ｄ■断片（ＨＢｓＡｇ解読区域、２６塩基の５′非解読
区域および１２８ｂｐ　３　’非解読区域を含有する、
後述するように、ｐｌ＋Ｂｓ−５６から得た）は粘合し
１、次いでＡＤｌｌ−１終止区域を含有する。３５０ｂ
ｐのＭ巾ｄｌｌ−ｍＩ断片（ｐＨＢ５−５６から単離し
た）と結合した。

２９００ｂｐの印Ｉ発現カセットを単離し、そして５ｐ
ｈｌで前もって消化したｐＨＢｓ−５６中でクローニン
グした。プロモーター、遺伝子および終止区域が適切な
配向にある生ずるプラスミド（ｐＨＢｓ−５６ＧＡＰ３
４７／３３）を単離した。

ＡＤＨプロモーターおよび終止因子の調節のもとεこＩ
ｔ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ遺伝子を含有するプラスミドｐＨ［
１ｓ５６を、次のよう６ごして得た：　２６ｂｐのｐｒ
ａ−５区域、６８１ｂｐの。Ａｇ区域および１２８ｂｐ
の３′−未翻訳区域を含有するｌｌＢｓＡｇ解読区域か
ら得られる工ｕｌ−焦肥１１ｔｌｉ片〔ハレンズエラ（
Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ）等、ネイチャ匍肛煎（１９７９
）　２他：８１５−８１９）　）　を、旦ｃｏ　ＲＩリ
ンカ−に結合し、そしてＥｃｏ　Ｒ１部位においてｐＢ
Ｉ？３２２中でクローニングした。Ｅｃｏ　ＲＩ　　リ
ンカ−は配列ＧＧＡＡＴＴＣＣを有する。プラスミドｐ
　ＨＢ　Ｓ　５はこのようにして得られる。

ｐ　ＨＢ　Ｓ　５のＨＢｓＡ８−ＤＮＡ断片をＥｃｏＲ
Ｉ消化により切除し、フレナラ断片でプラント末端化（
ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄｅｄ）　シ、そして両端において次
の配列（ＣＡＡＧＣＴＴＧ）の１１　ｎｄ　ＩＩＩリン
カ−で接合する。Ｈｉｎｄｌｌｌで消化した後、このＩ
Ｉ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ断片を、ＡＤＨＩプロモーターと終
止配列との中間においてＨ４ｎｄｌ１１部位で消化され
たプラスミドｐＡＤＨ５（後述する）の−Ｈａｎｄ■部
泣Ｇコそう人した。制限分析により決定して正しい配向
で１１　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ遺伝子をもつプラスミドｐＨＢ
ｓ２２と表示した。ｐ　ＨＢ　Ｓ　２２をΣＱＩで消化
してｌｌＢｓＡｇ発現カセットを含有する約１５００ｂ
ｐの断片を得、これをΣｐｈｒで消化ｐｃｉ／１中にそ
う人してｐＨＢｓ５６を形成した。

プラスミドｐＡＤＨ５は１５００ｂｐＡＤＩ１１プロモ
一ター断片を含有し、このプロモーターは位置−９にお
いて終止し〔ヒノッマン（ｌｌｉｔｚｅｍａｎ）等、王
土五二　便ｑ９μ牡、　（１９８１２２！υニア１７　
）　、Ｈ↓ｎｄ−ｍ部位でヌクレオチド９１３〜１３６
８からほぼ４５０ｂｐの終止単位に接合されており、ベ
クターＹＥｐ１３のＢａｎ旧部位中にクローニングされ
ている〔ブローチ（Ｂｒ。

ａｃｈ）およびヒソクス（Ｈ４ｃｋｓ）　、遺伝子　−
り…」尤（１９７９）８　：１２１　）。

断片ｆｂ）ｐｒｅ−５区域の最初の３アミノ酸（ｍｅｔ
−ｇｌｕ−ｔｒｐ）の遺伝情報を指定しかつ制限部位の
ために５つの追加の塩基を含む１４ｂｐの焦圓ｄｌｌＩ
一旦ｃｏ　Ｒ■アダプター分子を、化学合成により得た
：ｅｔ ５　’　−ＡＧＣＴＴ山ＣＡＧＴＧＧ−３’３　’　−
ＡＴＡＣＧＴＣＡＣＣＴＴＡＡ−５’。

断片（ｃ）ｐｒｅ−３区域のセグメント（５２アミノ酸
）および（ＨＢｓＡｇ　）　Ｎ−末端区域の最初の３２
アミノ酸を暗号化する２５０ｂｐの旦憇Ｒ１−人ｈａ＋
断片は、ゲラ：ｌミドｐＨＢＶ−３２００（５０ｕｇ＞
　　Ｃハレ７ズエラ単位）で消化するごとより生成し、
そして６％のポリアクリルアミド中の調製用ゲル電気泳
動により単離した。

断片（ｄｌｌｌＢｓＡｌ！タンパク質の残りのＣ−末端
区域（１９４アミノ酸）の遺伝情報を指示する約６８０
ｂｐおよび３　’　ｌｌＢｓＡｇ非解読区域およびＧ　
Ａ　Ｐ　Ｄ　ＩＩ終止区域に相当するほぼ９ｏｏｂｐを
含有するほぼ］、５８０ｂｐの■−匝Ｉ−シＩＩＩ断片
。この断片は、（５０μｇ）のプラスミドｐＨＢ５７０
−７Δ（後述する）を−に山旦■および−Ｂａｎ旧　（
各１０単位）で消化し、そして生ずる１５８０ｂｐの断
片を調調用ゲル電気泳動により単離することによって得
た。

プラスミドｐＨＢ５７０−７Δは、ｐａｍ旧部位中にク
ローニングされた１１　Ｂ　ｓＡ　ｇ遺（立子のための
Ｇ　Ａ　！”　Ｄ　１１発現カ七ノドを含有するｐｃｉ
／１　誘導体である。このカセ、１・は、次のように、
ｐ　Ｕ　ＩＩ　’／から構成されたｐＢＲ３２２誘導体
であるプラスミドｐＵＨ−７Δから得た。

プラスミドｐｔｌＨ７は、５′末端においてＧ　Ａ　Ｐ
　Ｄ　Ｉｔプロモーターが側面に位置し、３′末端にお
いてＧＡＰＤＨ解読区域が側面に位置し、次いでＧＡＰ
ＤＩＩ終止因子が位置する、ｔｌ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ遺伝
子の解読および３′非解読区域を含有する。このプラス
ミドはｐｉｌ＋（２８（前述）とほとんど同一であり、
唯一の相違はｐＨ８７が、ｐＨＨ２８中に存在するＧＡ
Ｐ叶構造遺伝子の７つの最初のコドンを含有しないこと
がある。プラスミドｐＨＨ７はｐＵＨ−２８のように構
成するが、唯一の差はｐＧＡＰｚのＢａす１切除の程度
にあるので、ｐＵＨ７においてＧＡＰＤＨ構造遺伝子の
最初のコドンに相当するすべてのヌクレオチドをＢａ１
３１により除去した。

ｐＵＨ−７Δは、ＨＢｓＡｇ遺伝子の３′非解読区域の
一部分およびＧＡＰＤＨ遺伝子の解読区域が欠失されて
いる、ｐｌＪＨ７からＬＭ　導されたプラスミドである
。

これを構成するため、２つの断片を調製した。第１の断
片は、ｐＢＲ３２２配列およびＧＡＰ［ｌｌｌブロモ−
クーおよび終止配列を含有する。この断片は、ｐ　Ｕ　
１１７をＮμｌで消化し、次いでΣａｌ［で部分的に消
化することによって得た。Ｎｃｏ　Ｉ　−Ｓａｌ　Ｉヘ
クターのハンド（ｂａｎｄ）　　（はぼ７　ｋｂｐ）を
ゲル電気泳動により精製した。１２８塩基対の３′未翻
訳区域をもつｌｌＢｓＡｇ解読区域を含有する第２断片
は、Ｎｃｏｌ−Ｈｐａｌでｐ　ＩＪ　ＩＩ　’７を消化
することによって得た。

０．８　ｋｂｐの断片をゲル精製によって得た。両者の
断片をそれるのＮｃｏｒ付着末端で結合し、リセスド末
端にフレナラ断片を充填し、そして得られたプラント末
端を結合してｐＵｆｆ−７Δを得た。

レンチルレクチンのカラムを用いるＩ（ＳＶＩの親和性
クロマトグラフィーにより、Ｈ５Ｖｌｔ唐タンパク質を
調製した。この糖タンパク質混合物を使用してウサギを
免疫感作した。

２　ｂ　、　）ｌｓＶ１ｔＪ！タンパク質に対するウサ
ギ抗婆レンチルレクチンのカラムに結合したｌｌ５ＶＩ
Ｉ！タンパク質に、＋１　Ｓ　Ｖ　Ｉ　Ｉｆタンパク質
に対する血清（ａにおけるようにして調製した）を吸着
させた。吸着された物質を引き続いて溶、唱Ｉして、Ｉ
Ｉｓシ１糖タンパク質に対する精製された抗体を得た。

２ｃ、坦怪Ｎ（−暮−り＝ｔｔａ西−右λ−！−ニザ沙
−１馳（３八１１） パレンズエラ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ）等１．１ｓ−（
−５−＋　二（Ｎａｔｕｒｅ）（１９８２）２９８　：
３４７−３５０に記載されるように遺伝子工学にかけら
れた酵母菌により、ｌｌＢｓＡｇを生産した。この抗原
を常法に従い使用してマウスのモノクローナル抗体を調
製した〔コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）およびマイルスティ
ン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、ネイ合成ＣＳペプチドに対す
るモノクローナル抗体は、ニューヨーク大学の■、ヌセ
ンズウエイグ（Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ）博士から人手
した。

以下余白 ３、免」Ｕ１定 Ｉ　Ｓ　Ｖ　Ｉ　Ｉ％ｉタンパク質に対する抗体で被覆
されたポリスチレンビーズを、ミクロタイターのウェル
（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｗｅｌｌ）中で４２℃におい
て２時間異なる希釈度の酵母菌抽出物（または対照）と
ともにインキュベーションした。インキュベーションの
際にｇＤ抗原は固体用抗体と結合する。結合しない物質
を除去するためにビーズを洗浄した後、ＨＲＰ［アボッ
ト・オーザイムＳキット（ＡｂｂｏｔｔＡｕｚｙｍｅ　
’Ｕ　Ｋｉｔ）から〕と接合したＩＩ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ
に対する第２抗体を、ビー・ズ上の抗体抗原複合体とと
もに、室温において２時間そして４℃において一夜イン
キユヘーションした。抗体−抗原−抗体のサンドイッチ
は、両者の抗原決定因子（ｇＤおよび１１ＢｓＡｇ）を
含有する抗原分子に依存して形成すべきである。ビーズ
を洗浄して結合しない接合体を除去した。ペルオキシダ
ーゼの活性（これはＨＢｓＡｇの量に比例する）を０−
フェンレンジアミン（ＯＰ　Ｄ、アボット（ａｂｂｏｔ
ｔ）　）の使用により潤色方により検定し、そして色の
発生を４９２〜６００ｎｍにおける吸収により決定した
。限界内で、試料中の抗原の量が多くなればなるほど、
４９２〜６００ｎｍにおける吸収は高くなる。結果は、
酵母菌抽出物の１ｍｌにつき”４９２−６００単位の合
計数で表わす。

ＨＢｓＡｇに対するモルモットの抗体で被覆されたビー
ズ（アボット・オーザイム且キットから）を、酵母抽出
物（または対照）とともに４２゛Ｃにおいて２時間イン
キュベーションした。水で洗浄した後、Ｈ３ＶＩ−糖タ
ンパク質に対する第２ウサギ抗体の１／２００希釈物を
加えた。インキエ・＼−ジョンを室温において２時間、
次いで４°Ｃにむいて−ｉ実施した。水で洗浄した後、
第３のベルオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギ抗体を加え、
そしてインキユベーシヨンを室温において一時間続けた
。ペルオキシダーゼの活性を上のようにして決定し、そ
して発色を４９２〜６００ｎｍにおいて決定した１、３
　ｃ　、　ｌｌＢｓＡｇ　Ｅ５ＩＳＡ　の検定１１８ｓ
ＡＧに対するモルモットの抗体で被覆されたビーズ（ア
ボット・オーザイム目キットから）を、酵母菌抽出物（
または対照）とともに４２℃において２時間インキニベ
ーションした。水洗後、第２のベルオキンダーゼ接合ヤ
ギ抗モルモット抗体を加え、そしてインキュベーション
を室温において１時間続けた。ペルオキシダーゼの゛活
性を上のようにして決定し、そして発色を４９２〜６０
０ｎｍにおいて測定した。

４、ウェスクーン分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ａｎａｌｙｓ
ｉｓ）形質転換した酵母菌の細胞を１０％のポリアクリ
ルアミドゲル上で電気泳動させ〔ラエミリ（Ｌａｅｍｍ
ｌｉ）　、：Ｊイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　（１９７
０）２７７　：６８０）、そしてタンパク質を引き続い
てイントロセルロース（ｉｎｔｒｏｃｅｌ　Ｉｕｌｏｓ
ｅ）上にエレクトロブｃ　７テイング（ｅｌｅｃｔｒｏ
ｂｌｏｔｔｉｎｇ）　Ｌ、た〔ｌ・ウビン（ｔｏｗｂｉ
ｎ）等、虱＜１９７９）亜：３４５０　：］。２枚の同
一フィルターをブロッティングした。一方のフィルター
をＰＢＳ中の１０％のヤギ血清とともに１時間予備イン
キュベーションし、引き続いてウサギ抗ｎ　ｓ　ｖ　Ｉ
　を店タンパク質抗血清であるいはｃｓタンパク質に対
するモノクローナル抗体（２Ａ−１０）で４°Ｃにおい
て１２時間処理した。フィルターをＰＢＳ中の５９Ａの
ヤギ血清で洗浄し、そしてセイヨウワサビのペルオキシ
ダーゼと接合した第２のヤギ抗ウサギまたは抗マウス抗
体〔ヘーリンガーーマンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　）を加えた。最後に、このフィ
ルターをセイヨウワサビのペルオキシダーゼの発色剤〔
バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）　〕とどもにインキュ
ベーションし、そして洗浄した。

第２のフィルターをＰＢＳ中の０．５％のゼラチンで１
時間洗浄し、引き続いて前述のようにして調製したＨＢ
ｓＡｇに対するモノクローナル抗体（３Ａ１１）ととも
に室温において１２時間インキユヘーションした。この
フィルターをＰＢＳで洗浄し、そしてセイヨウワサビの
ペルオキシダーゼど接合した第２のヤギ抗マウス抗体（
ベーリンガーーマンヘイム）を加えた。ｇ＜＆に、フィ
ルターをセイヨウワサビのペルオキシダーゼの発色剤（
ハイオーラド）ととも２こインキュベーションし、そし
て洗浄した。

ＡＮ−米 ｇＤｉ１２伝子を含有する断片を、プラスミドｐＤｃ１
０１（前述）のｐｒｅ−３区域に存在する単一の旦ｃｏ
Ｒ１部位中にクローニングした。ＥｃｏＲ１部位はこの
区域のコド３および４に広がる。ｇＤｉｆｆ伝子を含有
する断片の調製、ヘクターｐりＣ１ｏ１の直線化および
ホスファターゼ処理、ｇＤ断片およびヘクターの結合、
および旦、　ｃｏｌｉ　ＩＩＢＩＯＩの形質転換につい
て以下に説明する。

以下、′Ｉ、白 ｌａ、迎」１ごＩ℃及化末ネで−丸ふ７１−二（処理１
０μｇのｐＤｃｌｏｌを旦ｃｏＲＩで直線化しまた。

ＥｃｏＲＩはｐｒｅ−３区域の第３および第４のコドン
内で切断する。直線化されたプラスミドを３３　ｊｉｉ
位の子牛の腸のホスファターゼ（ヘーリンガー（Ｂｏｅ
ｋｒｉｎｇｅｒ）　’ｌで３７゛Ｃにおいて４５分間処
理する。ＥＤＴＡ　ｓよびＳＤＳをそれぞれ２０ミリモ
ルｉ′３よび０．５％の最終濃度に添）Ｊ■ｌ、、そし
て６５て；こ１０分間加熱することにより、反応を停ｉ
ｆ、した。

反応混合物をフェノール：クロロポルム：イソ７ミルア
ルコール（２５：２４：ｌ）で抽出し、水相をＣ１，６
Ｂカラムに通過させてＳＤＳを除去し、そし７てブタノ
ールで６０μｌにン農縮した。

この試料を１％の調製用アガロースゲル−にへ装入し、
そして６９３０　ｂ　ｐのハンド（ｂａｎｄ）を電気溶
離した。電気溶離した混合物をブタノールで７１縮し、
フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２
５：２４：１）で抽出し、エタノールで沈澱させた。

この直線化されかつホスファターゼ処理されたヘクター
を、ＴＥ中にほぼ５０ｎｇ／μｌの濃度に再懸濁させた
。

ｌｂ、ｇＤ遺伝子を含有する断片の調製ｇＤ含有断片を
ｐＹＩＩ５１１９（前述）から得た。この目的に、１０
μｇのｐＹＨ５１１９を１００単位の各Ｂａｍ１ｌｌお
よびＮｃｏｌで３００μ２の反応媒質中で消化した。３
７°Ｃにおいて３時間インキュベーションした後、この
反応混合物を調製用の１％アガロースゲル上に装入し、
そしてｇＤ断片およびＧ　Ａ　Ｐ　Ｄ　Ｉｔターミネー
タ−を含有する１７８８ｂｐの且ａｍｌｌｌ−Ｎｃｏ！
断片をゲルから電気溶離した。ブタノールで濃縮した後
、電気溶離したＤ　Ｎ　Ａ断片をフェノール：クロロホ
ルム：イソアミルアルコール（２５：２４　：　ｌ）で
抽出し、エタノールで沈澱し、そしてＴＥ中に５０μｇ
／μｌの濃度で再懸濁させた。

はぼ２．５１’　ｇの１７８８ｂｐ断片を３０単位のＮ
＋ａｒｌで消化した。ＮａｒＴはｇＤ遺伝子を３′末端
で切断して２つのハンド（それぞれｇＤおよびＧ　：ｉ
　Ｐ　Ｄ　Ｉ＋終止因子を含有する断片８８８ｂｐおよ
び９００ｂｐ）した。この反応混合物をフェノール；ク
ロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：ｌ）
で抽出し、エタノールで）土酸させた。沈澱物を２０μ
ｅのＴＥ中に再懸濁させた。

次の配列を有するＥｃｏＲＩ　　；Ｉアダプターを合成
した： ｐｒｅ−５ｇＤ このアダプターは、それぞれｐＤｃ１０１ヘクターおよ
びｇＤ断片へ結合したとき、旦ｃｏＲｌおよびＮｃ。

１部位を再生する。それはまた、ｐｒｅ−５区域のコド
ン４〜７およびｇＤ断片の最初のコドンを提供する。次
の配列を有する第２アダプターが合成された： に虹Ｉ　　　　　　　　　　　　（」」昶１）↓　　　
　　　　　　　　　　　↓ ＣＧＣＣＧＣＡＡＡＴＣ ＧＧＣＧＴＴＴＡＧＴＴＡＡ ｇ　Ｄ　　　　　　　　　　　　　ｐｒｅ−Ｓこのアダ
プターΣａｒ　Ｉ　−（ＥｃｏＲＩ）は、それぞれｐＤ
ｃ１０１ベクターおよびｇＤ断片へ結合するとき、Ｎａ
ｒ１部位を再生するが、ＥｃｏＲＩを再生しない。

それは、また、ｇＤ断片の最後の３コドンおよびｐｒｅ
−Ｓ遺伝子の８コドンを提供する。

両者のアダプターを、ｇＤを含有する８８ＯＮｃａｌ−
Ｎａｒｌ断片に結合した。結合は１４°Ｃにおいて１７
時間実施した。次いでこの混合物を１％のアガロースゲ
ル中で電気泳動し、そして８７３Ｍと１０７８　ｂ　ｐ
との間の区域におけるハンド（φＸ／Ｈａｅｌｒ１ＭＷ
の標準に従う）を電気抽出した。ＤＮＡ　溶液をブタノ
ールで濃縮し、フェノール：クロロホルム：イソアミル
アルコール（２５：２４：ｌ）で抽出し、そしてエタノ
ールで沈澱させた。沈澱物を水（３０μβ）中に再懸濁
させた。

１ｃ−４ｏ冷およびＥ　、　ｃｏｌｉ、１ＩＢ１０１（
２υ氏頃（原端製したｇＤ断片（結合されたアダプター
をもつ）をキナーゼ処理し、そしてＥｃｏＲＩ直線化し
、アルカリホスファターゼ処理したｐＤｃｌｏｌに結合
した。結合は室温において２．５時間実施した。反応混
合物をエタノールで沈澱させ、水中に再懸濁させ、そし
てＥ　、　ｃｏｌｉｌｌＢｌｏｌを形質転換するために
使用した。このようにしてプラスミドｐＤｃ１０２が得
られた。

プラスミドｐＤｃ１０２をＢａｍ１ｌｌで部分的に消化
した。

Ｇ　Ａ　Ｐ　Ｄ　１１プロモーターおよび終止因子の制
御下でハイブリッド抗原を含有する生ずる４２０３ｂｐ
断片を、ゲル電気泳動により精製し、そしてＢａｍ１ｌ
Ｉ消化し、アルカリ性ホスファターゼ処理したｐｃｉ／
１　（前述）に結合した。結合は室温において３時間実
施した。

反応混合物をエタノールで沈澱させ、水中に再懸濁させ
、旦、９旦１１８ＩＯＩの形質転換に使用した。

このようにしてプラスミドｐＤｃ１０３が得られた。

至ζζｐ二」更 ２ａ、免疫検定 ＋１ＳＶｇＤおよびＩｆ　［１ｓ　Ａ　ｇエピトープが
同一分子中に存在するかどうかを決定するために、ｐＤ
ｃ１０３またはｐＨＢｌ）ｒｅＳＧＡＰ３４７／１９Ｔ
（対照プラスミド、１１５Ｊ述）で形質転換した細胞の
酵母菌リゼイ）　（Ｉｙｓａｔｅ）を、前述の免疫検定
の２つの各々を用いて試験した。

プラスミドｐＤｃ１０３またはｐｔｌＢｐｒｅｓＧＡＰ
３４７／　１９Ｔを、−２−３（Ｍａｔ　ａ、ａｄｅ　
１．ｌｅｕ　２−０４．ｃｉｒ’）を形質転換した。形
質転換体を１ｅｕ−プレート（ｐｌａｔｅ）上で選択し
た。

単一の形質転換体のコロニーを２．５ｍｌの選択的ｌｅ
ｕ培地中に接種し、そして３０℃において２４時間生長
させた。この飽和した培養物の０．５ｍｌのアリコート
を０．００２％のアデニンを含有するＹＥＰＤの５０ｍ
７！中に接種し、そして０Ｄｂｓｏ　　６〜１０に生長
させた。溶解（ｌｙｓｉｓ）緩衝液−］１０ミリモルの
ＮａＰＯ４、ｐＨ７，５，０，１％のトリトンＸ−１０
０）中でガススビーズとともに攪拌し、そして遠心分離
により細胞の破片を除去することにより、細胞不含リゼ
イトを調ｌ！！シた。リゼイトを検定緩衝液（５０ミリ
モルの’ＩａＰＯ４、ｐＨ７，０，１％のＢＳＡ）中に
希釈し、そしてい（つかの希釈物を試験した。

抗原を捕）便するために固定化抗ＨＳ　Ｖ　Ｉ　糖タン
パク質抗体および第２のＨＲＰ接合可溶性抗ＩＩ　Ｂ　
ｓ　Ａ　ｙ、抗体を使用して、サンドイッチ検定におい
て得られた結果を表１に詳しく示す。発色は、抗ＩＩ　
Ｓ　Ｖ　Ｉ　糖タンパク質抗体で被覆されたビーズへ結
合した抗原中に存在する、ＩＩ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇエピト
ープに比例する。表１が示すように、ｐＤｃ１０３を収
容する形質転換体からの酵母菌リゼイトは固定化抗体お
よび可溶性抗体の両者と複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を形
成できるハイブリッド抗原を含有したが、ＨＢｓＡｇを
生産する対照プラスミドを指示する細胞からの対照リゼ
イトはこのような能力をもたなかった。結果が示すよう
に、ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇエピトープおよびｇＤエピトープ
の両者は、ｐυＣｌＯ３形質転換体からのリゼイト中の
同一分子中９存在ＬＪ、＝・　　　　　　　　　以下全
白１：Ｉｏｏ　　　　　２　μ　Ｉ　　　　　　　Ｏ，
０４５０，０５８１・１００　　　　５　ｐ　　ｌ　　
　　　　　Ｏ，０７６０，０７１１；１．００　　　　
１０μ　Ｉ　　　　　　　Ｏ，０７１０，１０９１＋１
００　　　　　２０　ｌノ　Ｉ　　　　　　　　　Ｏ，
０６８０，１４３１：Ｉｏｏ　　　　５０μ　ｌＯ，０
４６０，２４４抗原を浦Ｓ伍するために固定化抗ＩＩ　
Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ抗体、および［Ｄエピトープを検出する
ために第２の可溶性抗ｎ　ｓ　ｖ　ｒ　ｔｔｘタンパク
質を用いると、同様な結果がｉｔられる。この場合にお
いて、発色は抗ＩＩ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ抗体で被覆された
ビーズに結合した抗原中に存在するｔすＤエピトープに
比例する。

以下余白 １：５００　　　１０μ＋　　　　　　−０，００６０
，１４７１：１００　　　１０μ　Ｉ　　　　　　　Ｏ
，１３６０，、＋５８１：１００　　　５０μＩ　　　
　　　　Ｏ，１７０１，３９１１：１００　　　１００
μ　Ｉ　　　　　　　Ｏ，４７９＞２．０表１および表
２に記載する結果が示すように、ｇＤエピトープおよび
ｉｆ　Ｂ　ｓＡ　ｇエピトープの両者は同一分子中に存
在した。さらに、これらの結果から明らかなように、酵
母菌中で合成されるハイブリッド抗原は粒子に組み立て
られた。なぜなら、ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇモノマーはＨＢｓ
Ａｇへの結合のために用いられたアボット・オーザイム
（／＋ｂｂｏｔｔ　Ａｕｚｙｍ０免疫検定における抗体
との反応に非常に劣るからである。

２ｂ・ウエスタ”　分析（Ｗｅｓｔ−ゴル人り−Ｉ−ｙ
ｓｉｓ）ｇＤおよび）ＩＢｓＡｇエピトープを含有する
融合夕ンバク質が合成されつつあったことをさらに確認
するために、ウェスターン分析（前述）を、ｇＤに対す
る血清またはｌｌＢｓＡｇに対するモノクローナル抗体
を用いて、酵母菌抽出物について実施した。

この目的に、酵母菌株２１５０−２−３をｐＤｃ１０３
　、　ｐＹＩＩｓ１１９　　、　ｐ１１ＢｐｒｅｓＧＡ
Ｐ３４７／１９ＴまたはｐＣ１／１（後者の３つは対照
である）で形質転換した。形質転換体を１ｅｕ−プレー
ト（ｌｅｕ−ｐｌａｔｅ）上で選択した。

単一の形質転換のコロニーを２．５ｍ１１！のｉ！沢的
１ｅｕ−培地中に接種し、そして３０°Ｃにおいて２４
時間生長させた。この飽和培養物の０．５　ｍｌのアリ
コートを０．００２％のアデニンを含有するＹＥＰＤの
５０ｍｆｆ中に接種し、そして低い密度（Ａ６５゜１．
２−２．３）に生長させた。細胞を収穫し、そしてほぼ
１５０〜３００μｌの詰めた細胞をタンパク質ゲルのた
めの１００μｌの試料バッファー中に懸濁させた〔ラム
エリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）　、ネイチャー（ｊｌａｔｕｒ
ｅ）　（１９７０）２２７　：６８０）　、試料を沸と
うさせ、うず形成させ、そして不溶性物質を遠心により
除去した。

各試料のアリコート（２５μｍ）を２つの１０％のポリ
アクリルアミドゲルの各々上に装入した（ラムエリ、上
述）。両者のゲルを同時に電気泳動させた。電気泳動後
、タンパク質をトウビンいニトロセルロースのフィルタ
ー（Ｂへ〇５．０．４５ｘｊｍシュレイバー（Ｓｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒ）およびシュエル（Ｓｃｈｕｅｌｌ）　）
上にブロッティングした。

１つのフィルターをウサギ抗１１ｓＶ＋糖クンバク質抗
体で処理し、そしてセイヨウワサビのペルオキシダーゼ
と接合した第２のヤギ抗ウサギ抗体（前述）を使用して
発色させた。この手順を用いて、はぼ６５ｋｄの強いハ
ンドがｐＤｃ１０３で形質転換した酵母菌細胞の抽出物
中に検出された。この分子量はｐｒｅ−５４１ＢｓＡｇ
−ｇＤ融合体の期待された大きさく６４．６　ｋ　ｄ　
’）　（クローニングしたＤＮＡ配列から計算した）に
非常に近接する。したがって、結果に示すように、融合
タンパク質がｐＤｃＩ０３で形質転換した酵母菌中で合
成されていた。期待するように、ｇＤについて期待する
大きさを有する非常に小さいバンド（約３０ｋｄ）はｐ
ＹＩｌｓ１１９で形質転換した酵母菌細胞の抽出物中で
検出されたが、抗ｇＤと反応性のバンドは、］　Ｃ１／
　１またはｐＨＢｐｒｅｓＧＡＰ３４７／１９Ｔの形質
転換体からの抽出物中に検出されなかった。

第２の同一フィルターをＨＢｓＡｇに対するモノクロー
ナル抗体（３Ａ１１）で処理し、そしてセイヨウワサビ
のペルオキシダーゼと接合し、た第２のヤギ抗マウス抗
体（前述）を用いて発色させた。この手順を用いると、
５５ｋｄのバンドがｐＤｃ１０３で形質転換した酵母菌
細胞の抽出物中で検出されたが、３０ｋｄのバンドはｐ
ＨＢｐｒｅｓＧＡＰ３４７／１９Ｔで形質転換した細胞
からの抽出物中には検出されず、そしてハントはｐＹｌ
１３１１９またはｐｃｉ／１形質転換体の抽出物中には
存在しなかった。これらの結果から明らかなように、ｇ
ＤエピトープおよびｌｌＢｓＡｇエピトープの両者を含
有する融合タンパク質がｐＤｃ１０３を支持する酵母菌
細胞中で合成されていた。この融合タンパク質は、ｇＤ
　（３０ｋｄ）およびｌｌＢｓＡｇ　　（３０ｋ　ｄ）
断片について計１１されるｊｌＪｌ待した大きさく６５
ｋｄ）を有した。

３、　ｇＤ−ＨＢｓＡｇＭ虫合タンパクＭ遅ｔｉ　’ｆ
’−に３且；ｐ　泣Ｔ、　９芥玉・ ｐｒｅＳ−１１８ｓＡｇ−ｇＤ融合タンパク質が粒子に
組み立てられつつあることを確認するため、ｐＤｃ１０
３で形質転換した菌株のリゼイトをＣ５ＣＪ中の密度勾
配にかけた。ｐｔｌＢｐｒｅｓＧＡＰ３４７／　１９Ｔ
を収容する細胞からのリゼイトを対ＩＱとして使用した
。

単一の形質転換体のコロニーを２．５　ｍ　ｌの選択的
１ｅｕ−培地中に接種し、そして３０°Ｃにおいて３０
時間生長させた。この飽和した培養物の２ｒｎｌのアリ
コートを使用して２ＱＱｍ５のｍＪＲ的１ｅｕ−培地を
接種し、そして細胞を３０℃において０Ｄ６ＳＯ１〜３
まで生長させた。溶解緩衝液（１０ミリモルのＮａＰＯ
４、ｐＨ７，５、Ｏ，１％のトリトンＸ−１００）中で
ガラスピーズとともに攪拌し、そして細胞破片を遠心に
より除去することによって、細胞不含リゼイトを調製し
た。１ｒｎＩ！のｌＯミリモルのＮａＰＯ，、ｐＨ７、
５につき１．４ｇのＣ５（Ｊ！の溶液の５．３ｍ７！を
添加し、そしてその上に外−４１ポリアロマ−（ｐｏｌ
ｙａｌｉｏｍａｒ）管中の１ｍｆｆの同一緩衝液トこづ
き１．４ｇのＣｓＣβの溶液の５．３ｍ／を横たえるこ
とにより調製したＣ５Ｃｊ！勾配上に、０．６ｍｆのア
リコートを通用した。

勾配を３０　Ｋｒｐｍで４°Ｃにおいて３６時間遠心し
た。２３の０．５ｍｌの分画を集め、そしてアポ７ト・
オーザイム９検定を用いてそれらの各々を１（ＢｓＡｇ
活性について検定した。タンパク質をバイオ−ラド検定
により決定した。得られた結果を表３に示す。バイブリ
ソＦ″構成体を収容する細胞からのリゼイトは、分画１
８〜１２においてＨＢｓＡｇ活性の単一のピークを含有
し、分画１０において最大の活性が示され、これは約１
．２５ｇ　Ｃ５（ｊ！　／ｍｌに相当する。この・活性
は対照リゼイト中に検出されるものと同時に移動しくｃ
ｏｍｉｇｒａｔｅ）　、このことによりｐｒｅＳ−１１
８ｓＡｇ−ｇＤ融合タンパク質はエンベロープされてい
るように思われる１ｌＢｓＡ６単独で得られるものに類
似する粒子に組み立てられつつあることが示される。

＊アポフト・オーザイム（Ａｂｂｏｔｔ　Ａｕｚｙｍｅ
４））検定により決定したＨ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ活性。

十勾配に適用したリゼイトのＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ活性；６
．５ｇｇ／　ｍ　Ｉ！　。

千十勾配に適用したリゼイトのｔｌＢｓＡｇ活性；３４
ｇｇ／ｍｌ！。

プラスミドｐｃｔ／１−門ＣＳは、ＩＩＢｓＡｇ−ｐｒ
ｅＳと組み合わされたプラスモジウム・ファルシパルム
・シルクムスボロゾイテＣＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ　　ハ
江並肛憇ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）　（Ｃ５
）からの反復区域のハイブリッドである。上、旦尽」虹
憇のＣＳタンパク質を暗号化する遺伝子はクローニング
されており、そしてこれらのポリペプチド頚の構造は明
らかにされている〔デイム（Ｄａｍｅ）等、サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　（１９８４）２２５：５９３およ
びエネア（！Ｅｎｅａ）等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）　（１９８４）２２５＋６２８　、詳細については
これらの両者の記載を参照されたい〕。主なイムノドミ
ナント（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎＬ）エピトープは
、直列に反復する配列により形成されたＣＳ分子ｐ大き
な領域（ｄｏｍａｉｎン内に位置ずイ・。

４つのアミノ酸の繰返しＡｓｎ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｐｒ
ｏを暗号化するオリゴマーはＰ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕ
ｍ　Ｃ５の４１の反復する四つＭｌ（ｔｅｔｒａｄ）の
うちの３７からなる。

前記オリゴマーをキナーゼ処理し、そして結合して変化
する長さの鎖状体を形成した。Ａｓｎ、シミ１．Ａｓｐ
、Ｐｒｏ（４／４１の四つ頃）を暗号化するキナーゼ処
理したリンカ−を両端に結合して配向をスクリーニング
するためＥｃｏＲＩオーバーハングおよびいくつかの他
の制限部位をつくる。

反復する四つ組およびエンドリンカ− （ｅｎｄｌｉｎｋｅｒ）の両者の配列を下に示す。

Ｐ、　：　　Ｃ３ （コアー３６ｍｅｒの二重らせん）ｎ ＾ｓｎＡ　１ａＡｓｎＰｒｏ八ｓｎＡ　１ａＡｓｎＰｒ
ｏ八ｓｒ＋＋Ｘ１ａＡｓｎＰｒ。

ＡＡＴＧＣＣＡＡＣＣＣＡＡＡＣＧＣＴＡＡＴＣＣ丁Ａ
ＡＣＧＣＡＡＡＣＣＣＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＣＧＡＴＴ
ＡＧＧＡＴＴＧＣＧＴＴＴＧＧＧＡＡＴＴＡＣＧＧ以下
二？、白 リンカ−１および２　　　　リンカ−３および４Ｓａｉ
ｌ　　Ｓｍａｌ ＡｓｎＳｅｒＡｓｎνａ１八５ｐＰｒｏ　　　　　　　
ＡｓｎＡＩａＡｓｎＰｒｏＡｓｎＶａＩＰｒｏＧＩｙ　
　　ＥｃｏＲＩＡＡＴＴＣＣＡＡＴＧＴＡＧＡＴＣＣＡ
　　　　　　　　ＡＡＴＧＣＣＡＡＴＣＣＴＡＡＣＧＴ
ＣＧＡＣＣＣＣＧＧＧＧＧＴＴＡＣＡＴＣＴＡＧＧＴ’
ｒＴＡＣＧＧ　　　　　　　ＴＴＡＧＧＡＴＴＧＣハＧ
ＣＴＧＧＧＧＣＣＣＴＴＡ八旦ｃｏＲＬ この結へ混合物をＥｃｏＲＩで消化し、そして５％の自
然アククロアミトゲｒし上で展開した。３００〜６００
塩基対に広がるハンドを切り出し、溶離し、そしてｐＤ
ｃｌｏｌ　（前述）（１３節に記載するようにしてＥｃ
ｏＲＩで直線化しかつホスファターゼ処理されている）
中に結合した。

１〜１０反復の大きさの範囲の７つのインサートが単離
されたく表４参照）。ｐｃｉ／１　（前述）中にクロー
ニングするためにＣ８反復体を含有する旦３ｍｔ１１発
現カセットを単離するために、反復体を初めにｐＨＧ１
０１中にクローニングした。このベクターはｐＤｃｌｏ
ｌと同一であるが、ｐｒｅＳ解読区域中においてＢａｍ
１１１部位を欠く。

ｐＨＧ１０１を構成するため、次の手順に従った：ｐＤ
ｃ１０１をＥ　ｃｏＲｌで完全に消化し、次いでＢａｍ
１ｌｌで部分的に消化した。この消化から生ずる最大の
断片を、１％のアガＩ：１−スゲルの中から灯心するバ
ンドを切り力・つＤＮＡを？８離すき、ことＯこよって
１青製した。この断片を引き続いてフＡｌ・フエ・イズ
化（ｐｈｏｔｏｐｈａｓｅｄ）　　シた。この手順によ
り、ＥｃｏＲ１部位とＢａａｉｌ１１部位との間のｐｒ
ｅｓＭ読区域の３０塩基対が除去された。欠失された配
列をキナーゼ処理された３０マー（３０ｍｅｒ）の断片
への結合により置換した。この断片はｐＤｃｌｏｌ中に
存在する同一のアミノ酸の遺伝情報を指定するが、ｌ岬
旧部位を再生しない（配列を下に示す）。

八５ｎＳｃｉｒＴｈｒＡＩａＰｈｅｔｌｉｓＧｌｎＴｈ
ｒｌ、ｅｕＧＩｎＡｓｐ５’　　　　ＡＡＴＴＣＣＡＣ
ＴＧＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡＡＣＴＣＴＧＣＡ八３’　
　　　　　　　ＧＧＴＧＡＣＧＧＡＡＧＧＴＧＧＴＴへ
ＧＡＧＡＣＧＴＴＣＴＡＧＥｃｏＲＩ　　　　　　　　
　　　Δ旦ザｌｌＩ４つのｐＤｃ１０１クローンからの
Ｅ　ｃｏＲ１断片（表４に示す）をｐＨＧ１０１にサブ
クローニングした。この目的に、ｐＤｃｌｏｌ−ＭＣＳ
プラスミドを旦工甥１で消化した。インサートをゲル電
気泳動により精製し、そしてｐＨＧ１０１　＜前もって
Ｅ　ｃｏＲｌで消化されかつアルカリ性フォヌファター
ゼで処理されている）に結合した。得られるプラスミド
（ｐＨＧ１０１−ＭＣＳ　、表４参照）を酵母菌発現ベ
クターの調製おいて使用した。

ＭＣ３２９本　　　　　１　　　　　ｐＤｃｌｏｌ−Ｍ
Ｃ３２９ｐＨＧ１０１−ＭＣ５２９ＭＣ５３６本　　　
　　３　　　　　ｐＤｃｌｏｌ−ＭＣＳ　　３６ＭＣ５
３３本　　　　　４　　　　　ｐＤｃｌｏｌ−ＭＣＳ　
　３３　　　　ｐＨＧ１０１−ＭＣ５３３ＭＣ５３１本
　　　　　６　　　　　ｐＤｃ］０１−にＣ５３１ＭＣ
５１２本　　　　　１０　　　　　ｐＤｃｌｏｌ−ＭＣ
５１２’ＩＣ３２８本　　　　　７　　　　　ｐＤｃｌ
ｏｌ−ＭＣ５２８ＭＣ５３４＊　　　　１　　　ｐＤｃ
ｌｏｌ−閃Ｃ３３４＊インサートはＭ１３ジデオキシ法
（前述）により配列化されている。

以下余白 ４　ｂ、　！ＩＣＩｌＣｌ０Ｌ−からｑ旦ｙ哄ＵしＷた
１、イードｑの構成 プラスミドｐＨＧ１０１−門ＣＳ２９、ｐｉ（ＧＩＯＩ
−ＭＣ５３３およびｐＨＧ１０１−ＭＣ３３１を旦憇旧
で消化した。ＧＡＰ［ｌｌ＋プロモータおよび終止因子
の制御のもとにハイブリッド抗原を含有する得られる断
片を、ゲル電気泳動により精製し、そしてＢａｎ旧消化
し、アルカリ性ホスファターゼ処理したｐｃ１／１（前
述）へ結合した。

結合は室温において３時間実施した。反応混合物をエタ
ノールで沈澱させ、水中に再）懸濁させ、そしてこれを
使用して旦、　ｃｏｌｉ　１ＩｒｔＬＯ１を形質転換し
た。このようにしてプラスミドρＣ１ノ１−ＭＣ５２９
、ｐｃｉ／１−ＭＣ３３３およびρＣ１／１−ＭＣ５３
１が得られた。

ＭＣ５およびＩＩ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇのエピトープを含有
する融合タンパク質が合成されつつあることを立証する
ために、ウェスターン分析（前述）をＭＣ３または１１
　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇに対するモノクローナル抗体の使用に
より酵母菌抽出物について実施した。

この目的に、酵母菌株サッカロンミセス・セレビシアエ
（ｓａｃｃｈａｒｏｎｍｙｃｅ　　５ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）ｐｏｌ？（ｍａｔａ　、ｌｅｕ　２−０４　、ｃ
ｉｒ’）をｐｃｔ／１−ＭＣ５２９（もしくはｐｃ１／
１−ＭＣ５３１もしくはｐｃｔ／ｌ−門Ｃ５３３）　ｐ
＋１ＢｐｒｅｓＧＡ３４７／１９ＴまたはＩ）Ｃ１／１
＜後者のの２つは対照であるノで形質転換した。形質転
換体を１ｅｕ−ブＬ・−ロヒで選択した。

ｉｌ【−の形質転換体のコロニーを２．５　ｍ　ｌの選
択的１ｅｕ−培地中に接種し、そして３０℃において２
４時間生長させた。この飽和した培養物の０．５ｍ７！
のアリコートを５０ｍ／のＹＥＰＤ中に接種し、低い密
度（Ａｈｓｏ　１．２〜２．３）に生長させた。細胞を
収１便シ、そしてほぼ１５０〜３００μｅの詰めた細胞
をタンパク質ゲルのための１００μｌの試料緩衝液中に
再ｉε濁させた〔ラエムリ（Ｌ、ｌ！ｅｌＩＩＩＩｌｌ
ｉ）、ネイ±２二（Ｎａｔｕｒｅ）　（１９７０）２２
７６ｄＯ）　、試料を沸とうさせ、うす形成し、そして
不溶性物質を遠心により除去した。

各試料のア１１コート（２５μｌ）を、２つの１０％の
ポリアクリルアミドゲルの各々上に適用した〔ラエムリ
（ｌａｅｍｍｌｉ）　、上記文献〕。両者のゲルを同時
に電気泳動させた。電気泳動後、トウ（ｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａ　、Ｓｃｉ、）　Ｕ、Ｓ、Ａ、（１９７９）
７６：４３５０の手順に従い、タンパク質をニトロセル
ロースのフィルター（ＢＡ８５．０．４５．ｃｒｍ、シ
工しイヘル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）およびシュエル（
Ｓｃｈｕｅｌｌ）　：ｌ上にブロッティングした。一方
のフィルターをモ、ツクローナル抗ＭＣ３抗体（２Ａ−
１０）で処理し、そしてセイヨウワサビのペルオキシダ
ーゼと接合した第２のヤギ抗マウス抗体（前述）で色を
発現させた。

期待されるように、抗ＭＣ３と反応性のハンドはｐＤｃ
１０３形質転換体からの抽出物中で検出されなかった。

ｐｃ１／１−ＭＣ３２９（１反復）、ρＣ１／１−ＭＣ
５３３（４反復）およびｐｃ１／１−門Ｃ５３１（６反
復）で形質転換した酵母菌からの抽出物中に、約３０ｋ
ｄ、３４　ｋｄのハンドが検出された。第２の同一フィ
ルターをウェスターン分析にかけたとき、すべてのバン
ドはモノクローナル抗体と（３Ａ１１）と反応した。

これらの結果が示すように、ＭＣＳエピトープおよびｌ
ｌＢｓＡｇエピトープを含有する融合タンパク質は、ｐ
ｃ１／１−ＭＣ５プラスミドを収容する酵母菌細胞中で
合成されつつあった。融合タンパク質はＭＣ３およびＩ
Ｉ　Ｂ　Ｓ　Ａ　ｇの両断片を考慮して予想される寸法
をもっていた。

酵母菌中のハイブリッド抗原が存在しかつ粒子に、■み
立てられることをさらに確認するために、形質転換体の
抽出物を用いてｌｌＢｓＡｇについてのＥＬＩＳＡ険定
を実検定た。ＩＩＢｓＡＧモノマーはアボノ１−オーザ
イム９免疫険定におし・て抗体との反応に非常に劣るの
で、ＥＬＩＳＡにおける抽出物の反応性は組み立てられ
た粒子の存在を支持する。

ｐＣ１／　ｌ　−ＭＣ５２９で形質転換した酵母菌の抽
出物からのＥＬｉＳＡの結果は、約０．６３〜２．０６
ｍ　ｇ　／　ｅの粒子の発現レヘルを示し、これに対し
てｐｃ１／　１−　ＭＣ５３３については、この値はｌ
Ｊｏ、２２〜１．２２ｍ　ｇ　／１２であった。

上の結果から明らかなように、問題のエピ１−−プを有
するポリペプチドへ融合された粒子形成性ポリペプチド
を発現するハイブリッドＤ　Ｎ　Ａ構成体を使用するこ
とにより、粒子を細胞内で、とくに単細胞の微生物内で
生産することができ、ここで粒子形成性タンパク質およ
び問題のエピトープの両者のエピトープ部位が提供され
る。このようにして、粒子形成性ポリペプチドのエピト
ープおよび粒子形成性ポリペプチドへ融合した問題の自
然ポリペプチドのエピトープの両者に対する抗体の生産
を可能とする免疫原が生産される。ここで、問題のポリ
ペプチドは粒子形成性ポリペプチドへ自然に接合されな
い。このようにして、低い抗原性のエピトープは高い結
合特異性および／または高い力価を有する抗体を形成す
ることができる。

また、有効な免疫応答を得ることのできる安全で有効な
ワクチンを提供することができる。さらに、複数のハイ
ブリッド遺伝子を用いることにより、異る病原体のエピ
トープを有する粒子を得ることができるので、同一の粒
子は同一種の異る株、病原体などに対するワクチンの担
体の役目をすることができる。

−２−３（ｐＤｃ１０３）は１９８４年９月７日にＡ　
ｉ’　ＣＣに寄託され、ＡＴＣＣＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　
　Ｎａ２０７２６を与えられた。また、サツカロミセス
・丸しビシη舌ユ憬匹ｃ　ｈ　ａ　ｒ　ｏ　ｇ　ｃ　ｅ
　５ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　　、Ｐ０１７（ｐｃｉ／
１−ＭＣ３２９）は１９８５年９月５日にＡ　Ｔ　ＣＣ
に寄託され、ＡＴＣＣＡｃｃｅｓｓｉ＊ｎＮａ２０７７
０を与えられた。

上記の説明においては本発明の理解を目的として具体例
等によって詳細を記載したが、特許請求の範囲に属する
限り、変形および変法が実施できることは言うまでもな
い。

以下余白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、問題の１種または２種以上のポリペプチドに融合し
   た粒子形成性ポリペプチドの少なくとも一部分を含んで
   なり、問題のポリペプチドの少なくとも１種のエピトー
   プの少なくとも１種の提供による発現の際に細胞宿主内
   で粒子を形成することのできることを特徴とする、新規
   ハイブリッドポリペプチド。 ２、前記粒子形成性ポリペプチドはＢ型肝炎表面抗原か
   ら誘導される特許請求の範囲第１項記載のハイブリッド
   ポリペプチド。 ３、前記問題のポリペプチドは、Ｂ型肝炎表面抗原の前
   表面ポリペプチドの少なくとも約２５アミノ酸を介して
   前記粒子形成性ポリペプチドへ結合している特許請求の
   範囲第２項記載のハイブリッドポリペプチド。 ４、前記宿主は単細胞の微生物である特許請求の範囲第
   １項記載のハイブリッドポリペプチド。 ５、前記問題のポリペプチドの少なくとも１種は、エン
   ベロープポリペプチドまたは病原体の他のオリゴペプチ
   ドである特許請求の範囲第１項記載のハイブリッドポリ
   ペプチド。 ６、１種または２種以上のオリゴペプチドへ融合したＢ
   型肝炎表面抗原の少なくとも主要部分を含んでなり、少
   なくとも１種のオリゴペプチドの少なくとも１種のエピ
   トープの提供による発現の際に細胞宿主内で粒子を形成
   することができる特許請求の範囲第１項記載のハイブリ
   ッドポリペプチド。 ７、前表面ポリペプチドの少なくとも一部分を介して単
   純疱疹（Ｈｅｒｐｅｓ　Ｓｉｍｌｅｘ）ウィルスのエン
   ベロープＤタンパク質または￥プラスモジウム￥・￥フ
   ァルシパルム￥（￥Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ￥　￥ｆａｌ
   ｃｉｐａｒｕｍ￥）のサーカムスポロゾイテ（ｃｉｒｃ
   ｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク質の少なくとも一
   部分へ結合したＢ型肝炎表面抗原を含んでなる、特許請
   求の範囲第１項記載のハイブリッドポリペプチド。 ８、問題の１種または２種以上のポリペプチドに融合し
   た粒子形成性ポリペプチドの少なくとも一部分を含んで
   なり、問題のポリペプチドの少なくとも１種のエピトー
   プの少なくとも１種の提供による発現の際に細胞宿主内
   で粒子を形成することのできるハイブリッドポリペプチ
   ドを少なくとも一部分含んでなる粒子。 ９、細胞宿主を粒子で免疫感作することからなり、前記
   粒子は問題の１種または２種以上のポリペプチドへ融合
   した粒子形成性ポリペプチドの少なくとも一部分を含ん
   でなるハイブリッドポリペプチドから少なくとも一部分
   がなり、ここで前記ハイブリッドポリペプチドは問題の
   ポリペプチドの１種の少なくとも１種のエピトープの提
   供による発現の際に細胞宿主内で粒子を形成することが
   できることを特徴とする、問題の１種または２種以上の
   エピトープに対する抗体を生産する方法。 １０、前記粒子形成性ポリペプチドはＢ型肝炎表面抗原
   の少なくとも一部分である特許請求の範囲第９項記載の
   方法。 １１、前記問題のポリペプチドは前表面ポリペプチドの
   少なくとも一部分を介して前記粒子形成性ポリペプチド
   へ融合している特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、問題の１種または２種以上のポリペプチドに融合
   した粒子形成性ポリペプチドの少なくとも一部分を含ん
   でなり、問題のポリペプチドの少なくとも１種のエピト
   ープの少なくとも１種の提供による発現の際に細胞宿主
   内で粒子を形成することのできる新規ハイブリッドポリ
   ペプチドの遺伝情報を指定するＤＮＡ配列。 １３、問題の１種または２種以上のポリペプチドに融合
   した粒子形成性ポリペプチドの少なくとも一部分を含ん
   でなり、問題のポリペプチドの少なくとも１種のエピト
   ープの少なくとも１種の提供による発現の際に細胞宿主
   内で粒子を形成することのできるハイブリッドポリペプ
   チドを含んでなる多価ワクチン。 １４、１種または２種以上の問題のポリペプチドへ融合
   した粒子形成性ポリペプチドの少なくとも一部分を含ん
   でなり、問題のポリペプチドの１種のエピトープの少な
   くとも１種の提供によって発現する際に細胞宿主内で粒
   子を形成できるハイブリッドポリペプチドを生産する方
   法であって、リーディングフレームにおいて前記粒子形
   成性ポリペプチドの前記部分の遺伝情報を指定する第１
   ＤＮＡ配列を、前記問題のポリペプチドの遺伝情報を指
   定するＤＮＡ配列へ、前記細胞宿主により認識される転
   写および翻訳の調節信号を有するフランキング区域で連
   結して発現ＤＮＡ構成体を形成し、 前記ＤＮＡ構成体を前記細胞宿主中に導入し、そして前
   記宿主を増殖させ、これにより前記ハイブリッドポリペ
   プチドを形成しかつ粒子に凝集させる、ことを含んでな
   る、前記のハイブリッドポリペプチドを生産する方法。