DE69534617T2

DE69534617T2 - Hepatitis b-impfstoff

Info

Publication number: DE69534617T2
Application number: DE69534617T
Authority: DE
Inventors: Peter Karayiannis; Howard Christopher Thomas
Original assignee: Imperial College of Science Technology and Medicine
Current assignee: Imperial College of Science Technology and Medicine
Priority date: 1994-02-02
Filing date: 1995-02-02
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2015-02-03
Also published as: US5856084A; CN1057774C; WO1995021189A1; AU693154B2; PL315784A1; CN1143373A; ES2258767T3; EP0741745A1; CA2182375A1; ATE310014T1; JPH09508284A; SG49631A1; MX9603182A; JP3812949B2; EP0741745B1; AU1542695A; GB9401987D0; NZ278937A; KR100370341B1; DE69534617D1

Description

Diese Erfindung betrifft rekombinante DNA-Moleküle, die für Polypeptide codieren, die eine Spezifität gegenüber einem viralen Hepatitis-B-Antigen aufweisen.
Im einzelnen betrifft diese Erfindung eine Impfstoffzusammensetzung für die Stimulierung der Produktion von Antikörpern gegen eine Variante des Hepatitis-B-Virus im Menschen.
Die Klonierung der Genome von Hepatitis-B-Virionen unterschiedlicher Serotypen ist in diesem Fachgebiet gut bekannt (Miller et al.). Dane-Partikel, die Hepatitis-B-Virionen sind und aus infizierten Patienten isoliert werden können, haben einen Durchmesser von ungefähr 42 nm. Jedes besteht aus einer Hülle, die das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg) aufweist, einem Capsid (HBcAg), einer endogenen Polymerase und einem DNA-Genom. Ein drittes Polypeptid, das „e"-Antigen (HBeAg), wird vom Hepatitis-B-Virus hergestellt und findet sich in gelöster Form im Serum.
Die Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) ist ein ernstes und weit verbreitetes Problem, aber Impfstoffe zum Einsatz in der Massenimmunisierung sind nun allgemein verfügbar. Die kommerziell verfügbaren Impfstoffe gegen das HBV umfassen das Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen (HBsAg) entweder in nativer oder in rekombinanter Form. Das authentische (oder Wildtyp-) Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen kann aus dem Plasma infizierter Individuen als ein Teilchen von ungefähr 22 nm gewonnen werden, das zwei Proteine umfasst, die als P24 und dessen glycosyliertes Derivat GP28 bekannt sind, die beide durch eine für 226 Aminosäuren codierende Sequenz im HBV-Genom codiert. werden, die als die S-Protein-codierende Sequenz oder das HBV-S-Gen bekannt ist (Tiollais et al. (1985)). Die vollständige Aminosäuresequenz sowie die für das HBsAg codierende Nucleotidsequenz sind bei Valenzuela et al., Nature 280, 815 (1979) angegeben. Es wird hier das von Tiollais et al. verwendete Nummerierungssystem zur Definition der Nucleotid- und Aminosäurepositionen verwendet.
Die Insertion codierender Sequenzen des HBV-S-Gens unter der Kontrolle von Hefe-Promotoren in Expressionsvektoren zur Ermöglichung der Expression des HBsAg in S. cerevisiae für die Impfstofferzeugung wurde von Harford et al., Develop. Biol. Standard 54, 125 (1983), Valenzuela et al., Nature 298, 347 (1982) und Bitter et al., J. Med. Virol. 25, 123 (1988) beschrieben. Die Expression in Pichia pastoris wurde von Gregg et al., Biotechnology 5, 479 (1987) (siehe auch die Europäische Patentschrift Nr. 0226846) beschrieben, wie auch die Expression in Hansenula polymorpha (Europäische Patentschrift Nr. 0299108).
Impfstoffe wurden auch aus hybriden immunogenen Partikeln erzeugt, die das HBsAg-Protein aufweisen, wie es in der Europäischen Patentschrift Nr. 0278940 beschrieben wurde. Derartige immunogene Partikel können zum Beispiel das gesamte HBsAg-Vorläuferprotein oder Teile von ihm enthalten, die von der codierenden Sequenz codiert werden, die dem HBV-S-Gen auf dem HBV-Genom unmittelbar vorangeht und die hier als die PräS-codierende Sequenz bezeichnet wird. Die PräS-codierende Sequenz codiert normalerweise für 163 Aminosäuren (im Falle des av-HBV-Subtyps) und umfasst eine PräS1-codierende Sequenz und eine PräS2-codierende Sequenz. Die letztere codiert für 55 Aminosäuren und geht der für das S-Protein codierenden Sequenz unmittelbar voraus (Europäische Patentschrift Nr. EP-A-0278940).
Der offene Leserahmen des Oberflächenantigens (des S-Antigens) der HBV-DNA besteht aus drei Bereichen, PräS1, PräS2 und S. Er codiert für drei Hüllproteine des HBV, die als großes Protein, mittleres Protein und Hauptprotein bezeichnet werden. Das Hauptprotein, HbsAg, besteht aus 226 Aminosäuren und wird vom S-Gen codiert (Tiollais et al. (1981), Tiollais et al. (1987) und Lau et al.). Alle drei Hüllproteine enthalten antigenische Stellen des HBsAg und können mit herkömmlichen Immunoassays für das HBsAg leicht nachgewiesen werden. Diese Immunoassays werden zur Diagnose der HBV-Infektion und für das Screenen von Blutspendern weltweit extensiv eingesetzt. Die HBsAg-Reaktivität hängt von der strukturellen Konformation des hydrophilen Bereiches der Aminosäuren 124–147 ab, der als die a-Determinante definiert ist (Ashton-Rickardt et al. und Brown et al.). Diese ist allen HBV-Subtypen gemeinsam, und gegen sie gerichtete Antikörper bewirken einen Schutz gegen eine erneute Infektion mit einem beliebigen Subtyp.
HBV-DNA-Sequenzen, die unter hochstringenten Bedingungen mit einer HBV-Sonde hybridisieren, wurden in der Leber, im Serum und in mononukleären Zellen des Blutes von Subjekten nachgewiesen, die negativ bezüglich HBsAg im Serum waren (Brechot et al. (1985) und Thier et al.). Jüngere Ergebnisse aus verschiedenen Laboratorien, die eine Dot-Blot-Hybridisierung oder eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) einsetzten, bestätigen das Vorkommen von HBV-DNA-Sequenzen im Serum von HBsAg-negativen Subjekten. Die Entwicklung von PCR-Techniken hat den Nachweis einer sehr geringen HBV-Replikation bei vielen Patienten erlaubt, und sie hat die Sequenzierung vieler Isolate ermöglicht, die zur Identifizierung genetischer Varianten in einigen Isolaten des Virus geführt hat (Carman et al. (1990), Brechot et al. (1991), Blum et al.). In Taiwan und Sardinien, wo das HBV hochendemisch vorkommt, hatten 1,7 % und 0,3 % der HBsAg-negativen gesunden Blutspender HBV-DNA in ihren Seren, wie mittels Dot-Blot-Hybridisierung nachgewiesen werden konnte (Lai et al. (1989) und Sun et al.). Im Festlandchina zeigte eine molekularepidemiologische Untersuchung unter Einsatz der PCR bei Anti-HB-positiven Individuen das Vorhandensein von HBV-Trägern mit nicht-nachweisbarem HbsAg in einer Häufigkeit, die 3 % der chinesischen Gesamtbevölkerung entspricht (Luo et al.).
Die antigenischen Subtypen des HBV werden serologisch definiert, und es wurde für sie gezeigt, dass sie durch einzelne Basenveränderungen im Bereich des für das HBsAg codierenden Genoms verursacht werden (Okamoto et al.). Allerdings enthalten alle derzeit bekannten antigenischen Subtypen die a-Determinante, die aus den Aminosäuren 124 bis 147 des HBsAg besteht. Antikörper gegen die a-Determinante bewirken einen Schutz vor allen Subtypen. Es wurde durch In-vitro-Mutagenese gezeigt, dass das Cystein in der Position 147 und das Prolin in der Position 142 für die volle Antigenität der a-Determinante wichtig sind (Ashton-Rickardt et al.).
Außerdem haben Howard Thomas und William Carman in WO 91/14703 eine Variante eines HBsAg-Fragments bei einem geimpften Kind beschrieben, das von einer HBV-infizierten Mutter geboren worden war. Die Sequenzierung zeigte eine Punktmutation von Guanosin nach Adenosin in der Nucleotidposition 587, was zu einem Aminosäureaustausch von Glycin nach Arginin in der Position 145 in der a-Determinante des HBsAg führte (sehe auch Carman et al. (1990)). Für ähnliche HBV-Mutanten wurde berichtet, dass sie im Wirt unter dem Druck des humoralen Immunsystems, und zwar entweder aktiv (Impfstoff) oder passiv (Hyperimmunglobulin) induziert, replizieren (Okamoto et al. (1992) und McMahon et al.). Allerdings legt die persistierende Gegenwart von sowohl HBsAg als auch Anti-HBs (Impfstoffinduziert), die mittels herkömmlicher Immunoassays nachgewiesen wurde, im Serum einiger dieser Patienten nahe, dass die Mutation nicht zu einem vollständigen Verlust der Antigenität führt (Carman et al. (1990), Okamoto et al (1992) und McMahon et al.).
Vom klinischen und epidemiologischen Standpunkt aus ist es wichtiger, die molekularen Eigenschaften des HBV von Subjekten ohne irgendeine HBsAg-Reaktivität in Standardtests zu untersuchen. Die Sequenzierungsergebnisse eines japanischen Patienten, der HbeAg- und HBV-DNA- sowie Anti-HBsAg-positiv war, zeigte, dass die Aminosäuren 9 bis 22 und die PräS2-Region deletiert waren, während die Aminosäuren in der Position 3 und 8 des PräS2-Bereichs und 126, 131 und 133 der ersten Schleife der a-Determinante der HBs substituiert waren (Moriyama et al.). Die Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenz eines anderen Isolats zeigte Substitutionen in den Positionen 3, 53 und 210 des Haupt-HBs-Proteins, die alle außerhalb der gemeinsamen a-Determinante liegen und das Fehlen von HBsAg im Serum nicht wirklich erklären können (Liang et al.).
Innerhalb der letzten zehn Jahre wurden verschiedene vermutete Varianten oder Mutanten des Hepatitis-B-Virus beschrieben. Zum Beispiel beschrieben McMahon et al. eine Substitution eines Glycins durch ein Arginin in einer vermuteten Bindungsdomäne des HBsAg (wie es durch eine DNA-Sequenzanalyse abgeleitet wurde) für einen monoklonalen Antikörper in einem Lebertransplantationspatienten, der mit einem monoklonalen Anti-HBsAg-Antikörper behandelt worden war (Cold Spring Harbor Symposium on the Molecular Biology of Hepatitis B Viruses, September 1989).
In einer Untersuchung von Cayman et al. und bei dem Subjekt der Patentanmeldung WO 94/26904 lag ein mutiertes Hepatitis-B-Virus mit einer modifizierten a-Determinante vor, bei der zwei spezifische Aminosäuren, Asparagin und Threonin, in der Position 122 der HBsAg-Sequenz insertiert waren. Weiterhin wurde auch eine Mutation in der Position 145, die das Wildtyp-Arginin durch ein Glycin ersetzte, in der Aminosäuresequenzliste aufgeführt.
In einem weiteren Bericht wurden Kinder und Erwachsene mit zirkulierendem Hepatitis-B-Oberflächenantigen, was eine Virusreplikation anzeigte, gefunden, und zwar trotz des Vorhandenseins spezifischer Antikörper (Anti-HBs) nach der Immunisierung mit einem von zwei lizenzierten Hepatitis-B-Impfstoffen (Zanetti et al.). Die Analyse des HBsAg mit monoklonalen Antikörpern ergab, dass das zirkulierende Antigen nicht die a-Determinante trug oder dass diese Determinante maskiert war. Es wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass das Auftauchen einer Variante des Hepatitis-B-Virus, möglicherweise aufgrund eines epidemiologischen Druckes, der mit der Immunisierung in einem Gebiet einer endemischen Infektion assoziiert war, nachgewiesen worden war. Die Variante wurde jedoch nicht weiter charakterisiert.
Aus der Arbeit von Zanetti et al. ist klar, dass ein großer Nachteil der derzeit verfügbaren Hepatitis-B-Impfstoffe darin besteht, dass sie, zumindest bei einem Wirt mit einer prädisponierenden immungenetischen Ausstattung, zum Auftauchen einer „Escape-Mutante" führen können, d.h. eines replizierenden infektiösen Virus, das sich durch eine Mutation einer neutralisierenden Immunität entzogen hat. Eine derartige Virusvariante hat offensichtlich die Fähigkeit zur Verursachung von Krankheiten, und man kann annehmen, dass sie übertragbar ist. Die Virusvariante kann deshalb zu einem ernsten Immunisierungsproblem führen, da sie durch die Antikörper, die über Impfstoffe auf der Basis von normalem HBsAg erzeugt werden, nicht wirkungsvoll neutralisiert wird. Es wurden weitere Mutationen des HBV beschrieben, aber ihre Bedeutung in bezug auf eine veränderte Antigenität ist unklar (Moriyama et al. und Lai et al. (1990)).
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein modifiziertes Hepatitis-B-Oberflächenantigen-Protein (mHBsAg) bereitgestellt, wobei das genannte Protein eine gegenüber der Antigenität des Wildtyp-HBV-Oberflächenantigens (HBsAg) veränderte Antigenität aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Protein eine antigenisch modifizierte Hüllregion umfasst, bei der entweder Arginin und Alanin, in dieser Reihenfolge, oder Arginin, Glycin und Alanin, in dieser Reihenfolge, zwischen der Codonposition 122 und der Codonposition 124 der HBsAg-Sequenz insertiert sind.
Für China, wo HBV-Infektionen hoch endemisch vorkommen, haben mittels PCR durchgeführte Studien nahegelegt, dass 30–40 % der HBsAg-negativen Patienten mit entweder kryptogener Zirrhose, chronisch aktiver Hepatitis (CAH) oder chronisch persistierender Hepatitis (CPH) replizierende HBV-DNA im Serum oder im Lebergewebe haben (Zhang et al.). Diese Studien zeigen, dass in der chinesischen Bevölkerung eine Variante des HBV vorkommt, die durch ein nicht nachweisbares HBsAg im Serum gekennzeichnet ist. Überraschenderweise wurde eine derartige vermutete Mutante nie auf molekularer Ebene charakterisiert.
Die Isolate aus unseren chinesischen Patienten (d.h. Patienten ohne irgendein nachweisbares HBsAg) sind Insertionsmutanten, bei denen zusätzliche Aminosäuren zwischen die Codons 122 und 124 unmittelbar vor der a-Determinante eingefügt sind. Diese Sequenzvariante wurde bisher bei keinem der bekannten HBV-Subtypen beschrieben, und man hat sie auch nicht in 30 HbsAg-positiven chinesischen Patienten aus der gleichen Region gesehen. Es ist interessant zu sehen, dass die Region, in der die Insertion erfolgte, ein wichtiger Epitopbereich des HBsAg ist. Die insertierte Sequenz findet sich unmittelbar stromabwärts des Codons 122, das die Subtypdeterminante d bestimmt, und unmittelbar stromaufwärts der a-Determinante. Alle Nucleotid- und Aminosäuresequenzen vor und nach der Codonposition 122 sind so, wie sie für das Wildtyp-HBV dargelegt wurden (6 und 7). Ohne uns auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, nehmen wir an, dass diese Mutation zu einer Konformationsänderung führt, die Epitope der a-Determinante und des d-Subtyps beeinflusst. Eine wahrscheinliche Möglichkeit ist, dass die Insertion der Aminosäuren die Epitope verändert, indem sie die räumliche Organisation der zwei Schleifen auf der a-Determinante beeinflusst. Eine andere Möglichkeit ist, dass die erste Schleife auf der a-Determinante, die durch monoklonale Antikörper definiert wurde (Waters et al.), mehr stromaufwärts liegende Aminosäuren (als früher gedacht wurde) einschließt. Wir schlagen vor, dass diese Aminosäuren durch eine Disulfidbrücke stromaufwärts von 122 und nicht 124, wie früher vorgeschlagen worden war (Waters et al. und Ashton-Rickardt et al.), gebildet werden. Die insertierten Aminosäuren würden die Größe der Schleife von 14 auf 16 oder 17 Aminosäuren erhöhen und dadurch die Konformation dieser Schleife verändern, was die Bindung eines neutralisierenden Antikörpers verhindern würde.
In dieser Erfindung beschreiben wir eine neue Variante oder „Escape-Mutante" des HBV, die aus chinesischen Patienten isoliert wurde, deren Serum positiv bezüglich HBV-DNA bei einer Dot-Blot-Hybridisierung war, aber HbsAg-negativ bei Einsatz kommerzieller Immunoassays auf der Basis polyklonaler Antikörper. Außerdem überwindet die vorliegende Erfindung die mit bekannten HBV-Impfstoffen verbunden Nachteile, da diese Impfstoffe hinsichtlich der neu entdeckten Mutanten unwirksam sind, oder sie schwächt die Nachteile zumindest ab.
Die vorliegende Erfindung liefert die Charakterisierung neu entdeckter Mutanten des HBV, die wenigstens zwei Aminosäureinsertionen unmittelbar stromabwärts der Position 122 in dem Bereich der HBV-Hülle aufweisen. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens des mutierten HBV in einer Testprobe sowie Reagenzien, die für diese Verfahren nützlich sind, bereit. Alle Aspekte dieser Erfindung stellen eine Modifikation der a-Determinante bereit, bei der eine Insertion von wenigstens zwei Aminosäuren stromabwärts der Position 122 der HBsAg-Sequenz vorliegt, was einer Insertion von wenigstens sechs Nucleotiden stromabwärts des Nucleotids 519 des HBsAg-Genoms entspricht.
Die von mutierten HBV gewonnene Nucleinsäuresequenz, oder ein Teil davon, ist als Sonde zur Bestimmung des Vorliegens eines mutierten HBV in Testproben nützlich. Die Sequenz macht auch Polypeptidsequenzen eines mutierten HBV-Antigens oder mutierter HBV-Antigene, die vom Genom bzw. Genomen derartiger mutierter HBV codiert werden, verfügbar, und sie ermöglicht die Erzeugung von Polypeptiden, die als Standards oder Reagenzien in diagnostischen Tests und/oder als Komponenten von Impfstoffen nützlich sind. Monoklonale und polyklonale Antikörper, die gegen ein Epitop gerichtet sind, das innerhalb dieser Polypeptidsequenzen lokalisiert ist, sind auch nützlich für diagnostische Tests sowie als therapeutische Mittel zum Screenen auf antivirale Mittel und zur Isolierung des mutierten HBV, aus dem diese Nucleinsäuresequenzen gewonnen wurden.
Es sollte klar sein, dass dieses mutierte HBsAg auch, wenn es gewünscht wird, PräS-Sequenzen einschließen kann.
Die erfindungsgemäße Variante des HBsAg-Proteins oder das erfindungsgemäße Fragment davon wird hier im Folgenden als „mHBsAg" abgekürzt.
Es versteht sich, dass diese mHBsAg-Mutanten nicht in einer „natürlich vorkommenden" Form vorliegen, sondern dass sie ein synthetisches oder hochgereinigtes Material sind, das frei von Blutprodukten ist.
Vorzugsweise entsprechen diese Mutanten, wie sie in der Erfindung beschrieben werden, dem vollständigen HBsAg und sind mit dem Wildtyp-HBsAg abgesehen von der Insertion von wenigstens zwei Aminosäureresten stromabwärts der Position 122 identisch Vorzugsweise liegen die HBsAg-Mutanten in hochgereinigter Form vor, zum Beispiel in einer Reinheit von über 75 %, bevorzugter von über 90 % und am bevorzugtesten von 95–100 %.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Impfstoffzusammensetzung bereitgestellt, die eine wirksame Menge dieser HbsAg-„Escape-Mutanten" in einer Mischung mit einem geeigneten Träger oder Hilfsstoff umfasst.
Weitere Aspekte der Erfindung werden hier im Folgenden beschrieben.
Das erfindungsgemäße mHBsAg und der erfindungsgemäße Impfstoff können dazu verwendet werden, die Probleme zu überwinden, die mit dem Auftauchen einer „Escape-Mutante", wie sie hier weiter oben definiert wurde, klar geworden sind, bei der der Bereich unmittelbar stromaufwärts einer a-Determinante (der Hüllbereich) des viralen HBsAg modifiziert wurde. Im Einzelnen hat der erfindungsgemäße Impfstoff den Vorteil, dass er für den Schutz gegen eine HBV-Variante und die Verhinderung des Auftauchens oder der Transmission einer HBV-Variante nützlich sein kann, die hier so definiert ist, dass sie eine modifizierte HBV-Hüllregion in der HBsAg-Aminosäuresequenz hat, wobei wenigstens zwei Aminosäuren stromabwärts der Position 122 insertierf sind.
Dementsprechend wird auch die Verwendung einer sicheren und wirksamen Menge des erfindungsgemäßen Impfstoffes bei der Herstellung eines Medikaments zum Schutze eines Menschen vor Krankheitssymptomen, die mit einer Infektion durch die genannte HBV-Variante assoziiert sind, bereitgestellt.
In einem weiteren Aspekt stellen wir mHBsAg für die Verwendung in der Therapie, insbesondere der Prophylaxe, bereit.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung von mHBsAg bei der Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung zum Schutze eines Menschen gegen eine mit dem HBV assoziierte Erkrankung bereit.
Bei der Verwendung zur Immunisierung von Menschen gegen eine existierende Variante des HBV-Virus sollte klar sein, dass die mHBsAg-Sequenz im Impfstoff normalerweise mit der mHBsAg-Sequenz in der Variante des HBV-Virus übereinstimmt oder dieser antigenisch äquivalent ist.
Die Aminosäurereste, die nach der Position 122 im erfindungsgemäßen mHBsAg eingefügt sind, sind von der Art, dass sie durch die Insertion von sechs oder mehr Nucleotiden erhalten werden können. Die eingefügten Nucleotide, die für die zusätzlichen Aminosäuren codieren, können ein beliebiges der drei Nucleotide des Codons 123 im normalen HBsAg betreffen.
Theoretisch kann jede beliebige Mutation, die die Hydrophilie der Hüllproteine verändert, zu einer Veränderung der Antigenität und des Aussehens der HBV-Variante führen. Die Hydrophilie des Wildtyps und diejenige der Mutante in diesem Bereich sind ziemlich unterschiedlich. Eine Verminderung der Hydrophilie, wie sie hier beschrieben wird, korreliert häufig mit einem Verlust der Antigenität. Die erhöhte Hydrophobie der Mutante in der ersten Schleife könnte auch zu einem veränderten Protein des Hauptproteins im Lipid der Hülle führen, wodurch sie eine ausgeprägte Wirkung auf die Konformation hat.
In der vorliegenden Erfindung können die Reste nach der Position 122 des normalen HBsAg die Hydrophilie der a-Determinante verringern.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das mHBsAg mit dem normalen (Wildtyp-) HBsAg-S-Protein mit Ausnahme der Insertion von wenigstens zwei Aminosäureresten stromabwärts der Position 122 identisch.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Modifikation stromabwärts der Position 122 eine Insertion von Arginin und dann Alanin. Außerdem kann vorzugsweise eine Insertion von Arginin, Glycin und Alanin, in dieser Reihenfolge, stromabwärts der Position 122 insertiert werden.
Bevorzugte Merkmale eines jeden Aspektes der Erfindung gelten auch, mutatis mutandis, für jeden anderen Aspekt.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Die Beispiele beziehen sich auf die folgenden begleitenden Zeichnungen:
1 veranschaulicht aufeinanderfolgende Messungen der Spiegel der Serum-Aminotransferase (ALT) des Patienten Nr. 1. Die normalen Spiegel liegen unter 40 iμ/L. Die Serum-HBV-Marker wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten bestimmt. Im August 1992 wurde HBV-DNA mittels PCR gefunden, aber HBsAg und die anderen HBV-Marker konnten nicht nachgewiesen werden.
2 veranschaulicht aufeinanderfolgende Messungen der ALT-Spiegel im Serum des Patienten Nr. 2 sowie von Hepatitis-B-Virus-Markern im Serum. Abkürzungen: w, Wildtyp; m, Mutante.
3 ist ein Diagramm, das den offenen Leserahmen des Oberflächengens, die Position der PCR- und Sequenzierungsprimer und den überlappenden offenen Leserahmen der Polymerase (P ORF) darstellt. Ausgefüllte Kreise stellen die Initiations- und Stopp-Codons dar, während der schraffierte Kasten den Hot-Spot der Insertion in bezug auf die a-Determinante (Positionen 522–593) zeigt. Die Nucleotidnummerierung leitet sich von einer hypothetischen EcoRI-Stelle ab, wie sie in veröffentlichten HBV-DNA-Sequenzen vorliegt, da die vorliegenden Isolate keine EcoRI-Stelle besaßen.
4 ist eine Autoradiographie, die die Nucleotidinsertion in den Isolaten 1 und 2 (links und rechts) im Vergleich zum Wildtyp (Mitte) nach der direkten Sequenzierung der PCR-Produkte zeigt. Die Pfeile bezeichnen den Insertionspunkt.
5 veranschaulicht die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen der Isolate 1 und 2 im Vergleich zum Wildtyp (adw). Die insertierten Sequenzen sind unterstrichen.
6 veranschaulicht die vollständige Nucleotidsequenz des mHBsAg-Isolats 1. Die obere Sequenz repräsentiert diejenige des Oberflächengens und der a-Determinante des HBsAg-Isolats der Mutante, während die untere Sequenz die Wildtypsequenz repräsentiert. (---) repräsentiert Stellen einer Aminosäureinsertion.
7 veranschaulicht die vollständige Nucleotidsequenz des mHBsAg-Isolats 2. Die obere Sequenz repräsentiert diejenige des Oberflächengens und der a-Determinante des HBsAg-Isolats der Mutante, während die untere Sequenz die Wildtypsequenz repräsentiert. (---) repräsentiert Stellen einer Aminosäureinsertion.
Tabelle 1 zeigt die synthetischen Oligonucleotidprimer, die für die Polymerase-Kettenreaktion und die Sequenzierungsreaktionen verwendet wurden.
Tabelle 2 veranschaulicht positive/negative Bindungsverhältnisse des Serum HBsAg von Patient Nr. 1 und 2 an monoklonale Antikörper, wobei der Wildtyp adw als Kontrolle verwendet wurde.
Tabelle 3 stellt die Nucleotid- und Aminosäuresequenzhomologien mutierter S-Gene im Vergleich zur früher veröffentlichten Sequenz des Wildtyps (adw) und der eines chinesischen Isolates aus der gleichen Region wie der Wildtyp dar.
HBV-Mutationen werden in bestimmten Sequenzbereichen, die durch Abschnitte aus sich wiederholenden Basen gekennzeichnet sind, häufiger gefunden. In dem hier untersuchten Falle ist die Insertion mit vier Adeninen assoziiert. Dieser Bereich ist anscheinend bei einigen Isolaten aus chinesischen HBsAg-negativen HBV-Trägern ein „Hot Spot" für eine Insertion.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung des mHBsAg und der daraus erhaltenen Impfstoffzusammensetzung bereitgestellt.
Vorzugsweise wird das mHBsAg synthetisch gewonnen, entweder über eine Peptidsynthese oder, bevorzugter, über gentechnologische Verfahren.
Verfahren zur Konstruktion, Manipulation und Verifizierung rekombinanter DNA-Moleküle und Sequenzen sind in diesem Gebiet gut bekannt. Für die Modifizierung des HBV-S-Proteins des HBsAg und zur Gewinnung der erfindungsgemäßen mHBsAgs ist es erwünscht, die Codons CGG und GCA oder jede andere beliebige Triplett-Codon-Kombination, die für Arginin bzw. Alanin stromabwärts der Position 122 codiert, einzufügen. Alternativ können die Codons CAC, GGG oder GCG oder jede beliebige andere Triplett-Codon-Kombination, die für Arginin, Glycin bzw. Alanin codiert, zwischen den Nucleotidpositionen 122 und 124 insertiert werden.
Es stehen verschiedene Verfahren zur geeigneten Veränderung der Sequenz zur Verfügung. Ein geeignetes Verfahren ist eine vollständige De-novo-Synthese der gewünschten codierenden Sequenz über eine Phosphit- oder Phosphoramidit-Chemie unter Verwendung der Codonhäufigkeiten des Virus oder der Hefe.
Eine DNA-Synthese wird von verschiedenen Firmen auf kommerzieller Basis durchgeführt. Ein Beispiel einer derartigen Gensynthese wird von Hayden und Mandecki, DNA 7, 571 (1988) und darin angegebenen Literaturstellen beschrieben.
Ein zweites Verfahren besteht darin, auf einem einsträngigen Vektor ein geeignetes Restriktionsfragment eines Vektors zu klonieren, der bereits das HBV-Genom umfasst, und anschließend eine ortsspezifische In-vitro-Mutagenese durchzuführen, wie es von Botstein und Shortle, Science 229, 1193 (1982) beschrieben wurde. Eine Kultur des E.-coli-K12-Stammes C600, der das rekombinante Plasmid pRIT10601 enthält, das ein auf pBR322 kloniertes HBV-Genom eines beliebigen Subtyps umfasste, wurde gemäß dem Budapester Vertrag am 2. Juni 1982 in der American Type Culture Collection unter der Zugangs-Nr. ATCC 39132 hinterlegt. Die für das S-Gen, das für das HBsAg-Protein von 226 Aminosäuren codiert, oder für längere Sequenzen, die für PräS-Polypeptide codieren, codierende Sequenz kann aus derartigen Klonen mittels gentechnologischer Standardverfahren herausgeschnitten werden.
Ein geeignetes Restriktionsfragment ist das XbaI-AccI-Fragment von 575 bp aus der für das S-Gen codierenden Region von pRIT10601. Vektorsysteme, die für eine In-vitro-Mutagenese nützlich sind, sind kommerziell erhältlich. Das so erhaltene mutierte Genfragment wird erneut in das S-Gen insertiert.
Ein drittes Verfahren besteht darin, die gewünschte Mutationsveränderung mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu erzielen, wie es von Ho et al., Gene 77, 51 (1989) beschrieben wurde.
In allen Fällen kann die für das mHBsAg codierende Sequenz unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors in jedem beliebigen Wirt exprimiert werden.
Expressionsvektoren, die die für das mHBsAg codierende DNA-Sequenz umfassen, sind neuartig und stellen einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung dar. Wirte, die mit den genannten Expressionsvektoren transformiert wurden, bilden noch einen weiteren Aspekt der Erfindung.
In einem bevorzugten Aspekt können S. cerevisiae, Pichia pastoris oder Hansenula polymorpha als Wirt eingesetzt werden, und die Expression erfolgt unter der Kontrolle eines Hefepromotors, beispielsweise des TDH3-Promotors (Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-Gen, siehe Valenzuela et al., 1982, Bitter et al., 1988) oder von PHO5 (Miyanohara et al., 1983), MOX, FMDH (siehe EP-A-0299108) und AOX (siehe EP-A-0226846) der Hefe.
Der transformierte Wirt kann mittels herkömmlicher Verfahren kultiviert oder fermentiert werden, und das mHBsAG kann extrahiert und gereinigt werden. Die Reinigung des HBsAg aus Hefezellen ist in diesem Fachgebiet gut bekannt und kann nach einem beliebigen der US-Patente Nr. 4 649 192, 4 683 294, 4 654 074 oder 4 738 526 erfolgen. Die Reinigung des erfindungsgemäßen mHBsAg erfolgt auf analoge Weise.
Impfstoffe, die das mHBsAg enthalten, werden mittels herkömmlicher Techniken hergestellt und enthalten eine immunprotektive Menge des mHBsAg, vorzugsweise in gepufferter physiologischer Saline und gemischt mit einem beliebigen oder adsorbiert an ein beliebiges der bekannten verschiedenen Adjuvanzien, einschließlich von Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat. Unter „immunprotektiv" verstehen wird, dass genügend mHBsAg verabreicht wird, um eine ausreichend protektive antikörper- oder zellvermittelte Immunreaktion zur Bewirkung eines Schutzes gegen das infektiöse Agens ohne ernste Nebenwirkungen zu bewirken. Die zu verabreichende Menge des mHBsAg hängt davon ab, ob der Impfstoff ein Adjuvans enthält, und umfasst allgemein zwischen 1 und 100 μg Protein. Vorzugsweise werden 1 bis 200 μg Protein eingesetzt oder, bevorzugter, 5 bis 40 μg Protein. Die Größe und die Zahl der Dosen, die verabreicht werden sollen, können in Standarduntersuchungen zur Dosisfindung bestimmt werden, die das Beobachten der Antikörpertiter und anderer Reaktionen in den Subjekten beinhalten.
Das mHBsAg kann zur Formulierung eines Impfstoffes auch mit einem anderen HBsAg gemischt werden, wie einem normalen HbsAg, oder homogenen oder zusammengesetzten HBsAg-Partikeln, die die gesamten PräS1- oder Preä-S2-Polypeptide oder einen Teil oder Teile von diesen enthalten. Es kann auch mit hybriden HBsAg-Partikeln gemischt werden, die Epitope von Proteinen anderer Organismen tragen, sowie mit anderen Immunogenen, um bivalente oder multivalente Impfstoffe zu bilden. Die Impfstoffherstellung wird allgemein in „Vaccines", herausgegeben von Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978, beschrieben.
Das mHBsAg ist für die Aufnahme als immunologisches Reagenz in Nachweiskits für Infektionen mit HBV-Virusvarianten und dergleichen nützlich. Es kann auch dazu eingesetzt werden, Polyklonale und monoklonale Antikörper mittels bekannter Verfahren zu gewinnen, wobei es sein kann, dass einige der monoklonalen Antikörper für die Antigenvariante spezifisch sind und normales HBsAg nicht erkennen.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind Polypeptide, die immunologisch mit Serum reagieren, das Antikörper gegen mutiertes HBV und Komposite von diesen enthält, und die Antikörper, die gegen die für mutierte HBV-spezifischen Epitope in diesen Polypeptiden gewonnen wurden, für Immunoassays zum Nachweis des Vorliegens von Antikörpern gegen mutiertes HBV oder das Vorliegen des Virus und/oder viraler Antigene in biologischen Testproben nützlich. Das Design dieser Immunoassays kann variiert werden, und man kennt auf diesem Fachgebiet verschiedene. Verschiedene von ihnen sind hier beschrieben worden. Der Immunoassay kann ein virales Antigen einsetzen, wie ein Polypeptid, das aus einem beliebigen Klon, der eine mutierte HBV-Nucleinsäuresequenz enthält, oder aus den zusammengesetzten Nucleinsäuresequenzen, die aus den mutierten HBV-Nucleinsäuresequenzen in diesen Klonen gewonnen wurden, oder aus dem Genom des mutierten HBV, von dem die Nucleinsäuresequenzen in diesen Klonen abstammen, gewonnen wurde. Oder der Immunoassay kann eine Kombination viraler Antigene, die aus diesen Quellen gewonnen wurden, einsetzen. Er kann zum Beispiel einen monoklonalen Antikörper einsetzen, der gegen das gleiche virale Antigen gerichtet ist, oder polyklonale Antikörper, die gegen unterschiedliche virale Antigene gerichtet sind. Zu den Assays können solche gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, die auf einer Kompetition beruhen, auf einer direkten Reaktion oder auf Assays vom Sandwichtyp. Die Assays können Festphasen einsetzen, oder sie können über eine Immunpräzipitation oder beliebige andere Verfahren durchgeführt werden, die keine festen Phasen einsetzen. Beispiele für Assays, die Markierungen als signalerzeugende Verbindungen einsetzen, und diese Markierungen werden hier beschrieben.
Signale können auch durch Verwendung von Biotin und Avidin, von Enzymmarkierungen oder Biotin-Antibiotin-Systemen verstärkt werden, wie denjenigen die in den anhängigen US-Patentanmeldungen mit den Seriennummern 608 849, 070 647, 418 981 und 687 785 beschrieben werden. Rekombinante Polypeptide, die Epitope aus immundominanten Regionen des mutierten HBV enthalten, können für den Nachweis viraler Antikörper in biologischen Testproben infizierter Individuen nützlich sein. Man stellt sich auch vor, dass Antikörper für die Unterscheidung akuter von nicht-akuten Infektionen nützlich sein könnten. Kits, die für eine Immundiagnose geeignet sind und die die geeigneten Reagenzien enthalten, werden konstruiert, indem die geeigneten Materialien, einschließlich der erfindungsgemäßen Polypeptide, die die mutierten HBV-Epitope enthalten, oder von Antikörpern, die gegen die mutierten HBV-Epitope gerichtet sind, in geeigneten Behältern verpackt werden, zusammen mit den restlichen Reagenzien und Materialien, die für die Durchführung des Assays benötigt werden, sowie geeigneten Testanleitungen.
Demgemäß wird in einem bevorzugten Aspekt der Erfindung ein Kit zum diagnostischen In-vitro-Nachweis von Anti-mHBsAg-Antikörpern in einem biologischen Medium, und insbesondere neutralisierender Antikörper nach einer Impfung, bereitgestellt, dadurch gekennzeichnet, dass er umfasst:

a) mHBsAg, wie es hier definiert wurde, und
b) eine Einrichtung zum Nachweis der Antigen-Antikörper-Reaktion.

In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Antikörperpräparation bereit, die Anti-mHBsAg-Antikörper für den Einsatz bei der Diagnose, der Prävention oder der Behandlung von Hepatitis-B-Infektionen beim Menschen umfasst. Es wird auch ein Verfahren zur Behandlung von Menschen mit einer wirksamen Menge eines solchen Anti-mHBsAg-Antikörpers zur Verhinderung oder Behandlung einer Hepatitis-B-Infektion bereitgestellt.
Die Erfindung wird nun durch das folgende Beispiel veranschaulicht.
BEISPIEL
Der Patient Nr. 1 war ein 58 Jahre alter Mann mit einer Vorgeschichte einer sechsjährigen chronischen Hepatitis, bei der es sich weder um A noch um B handelte. Im August 1992 wurde HBV-DNA mittels PCR in Abwesenheit von HBsAg oder anderen HBV-Markern gefunden (1). In diesem Stadium hatte der Patient eine Zirrhose.
Der Patient Nr. 2 war eine 23 Jahre alte Frau aus Südchina, die bei einer Routineuntersuchung im März 1993 einen leicht erhöhten Spiegel der Serumaminotransferase (ALT) hatte und positiv bezüglich HBsAg und HBeAg, aber negativ sowohl bezüglich Immunglobulin (Ig)M als auch IgG-Anti-HBs war. Bei der Nachuntersuchunung im Januar 1994 war sie weiterhin positiv hinsichtlich HBV-DNA, und sie war nun auch Anti-HB-positiv, aber negativ hinsichtlich HBsAg, HBeAg und Anti-HBs (2).
Beide Patienten waren negativ bezüglich des Hepatitis-C-Virus (HCV) und HCV-RNA. Dreißig HBsAg-positive chinesische Patienten mit chronischer Lebererkrankung oder hepatozellulärem Karzinom wurden aus der gleichen Region untersucht.
Serologische Untersuchung
HBsAg, HBeAg, gesamtes Anti-HBc, IgM-Anti-HBs und Anti-HBs wurden mittels kommerziell verfügbarer Enzymimmunoassays (Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois, USA) getestet. Die HBsAg- und Anti-HBs-Ergebnisse wurden in Großbritannien bestätigt.
Bindung monoklonaler Antikörper
Es wurden verschiedene monoklonale Anti-HBs-Antikörper, von denen bekannt war, dass sie an die a-Determinante binden, für die spezifischere Definition von Veränderungen in den Epitopen der a-Determinante verwendet. Polystyrolkügelchen (Northumbria Biologicals, Northumberland, GB) wurden mit den Antikörpern RFHBs-1, RFHBs-2 und RFHBs-7 beschichtet und dann mit den Serumproben, die 1:2 in 50%igem Serum neugeborener Kälber in phosphatgepufferter Saline, pH 7,2, verdünnt waren, inkubiert. Gebundenes HBsAg wurde mit ¹²⁵I-Anti-HBs aus einem „AusRIA II"-Kit (Abbott Diagnostics), nachgewiesen, RFHBs-1 und RFHBs-2 binden an ein cyclisches Peptid, das die Aminosäuren 124–137 der Sequenz enthält, und RFHBs-7 bindet an ein cyclisches Peptid aus den Aminosäuren 139–147 des HBsAg.
Hepatitismarker
HBsAg, HBeAg, gesamtes Anti-HBc, IgM-Anti-HBc und Anti-HBs wurden mittels Immunoassays (Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois) getestet.
Dot-Blot-Hybridisierung
HBV-DNA wurde durch Dot-Blot-Hybridisierung mittels einer Modifikation eines von Weller et al., J. Med. Virol. 9, 273–280 (1982), beschriebenen Verfahrens nachgewiesen.
Extraktion der HBV-DNA, PCR und direkte Sequenzierung
50 μl Serum wurden in Gegenwart von 0,5 % Natriumdodecylsulfat, 25 mM Natriumacetat, 2,5 mM EDTA, 1 mg/ml Proteinase K (Boehringer Mannheim, Lewes, GB) in einem Volumen von 200 μl 2 Stunden bei 68°C verdaut, an zwei Phenol-Chloroform-Extraktionen schlossen sich zwei Chloroform-Extraktionen an, und die HBV-DNA wurde mit Ethanol ausgefällt. Nach zweimaligem Waschen mit 70 % Ethanol wurden die DNA-Pellets in 10 μl Wasser resuspendiert.
5 μl der extrahierten HBV-DNA wurden als Matrize für die PCR-Amplifizierung verwendet. Es wurde ein Paar von Primern (Subtyp adw), PO5' (5'-TGCGGGTCACCATAT, Position 2816–2833) und POL3 (5'-AAGGATCCAGTTGGC, Position 1409–1395) (Tabelle 2) verwendet, um ein Fragment von 1800 bp zu enthalten, das das PräS1-, das PräS2- und das S-Gen enthielt (3). Ein weiteres Paar von Primern, M3 (5'-CTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATT, Position 1781–1755) und 3C (5'-CTAACATTGAGATTCCCGAGA, Position 2460–2439) wurde eingesetzt, um die Prä-C- und C-Regionen zu amplifizieren. Die gleiche Serumprobe wurde unabhängig voneinander in China und in Großbritannien mittels unterschiedlicher Primerpaare analysiert.
Die direkte Sequenzierung der PCR-Produkte erfolgte mit dem „fmol" Sequencing Kit (Promega Co., Southampton, England). Die Sequenzierungsprimer (Tabelle 1) wurden mit 25 μCi ³²P-Adenosintriphosphat (Amersham International, Amersham, GB) in einem Volumen von 10 μl unter Verwendung von 10 Einheiten Polynucleotidkinase (Boehringer Mannheim) 10 Minuten bei 37°C endmarkiert. 1,5 μl der Reaktionsmischung wurden direkt in Sequenzierungsreaktionen eingesetzt. 90 μl des PCR-Produkts wurden mit einem gleichen Volumen an 4 mol/l Natriumacetat und 2 Volumina Isopropanol 10 Minuten bei Raumtemperatur gefällt, 10 Minuten abzentrifugiert und dann zweimal mit 70 % Ethanol gewaschen. Nach dem Resuspendieren in 20 μl Wasser wurden 9,5 μl DNA zum Reaktionspuffer mit dem endmarkierten Primer und 5 Einheiten Taq-Enzym (Promega Co.) gegeben. Eine Didesoxynucleotid-Kettenabbruchsequenzierung wurde nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die cyclische Sequenzierung erfolgte über 30 Runden. Die Dauer der Denaturierungs-, Annealing- und Verlängerungsschritte lagen bei 30 Sekunden, 30 Sekunden bzw. 1 Minute.
Klonierung und Sequenzierung des S-Gens
Die Ergebnisse der direkten Sequenzierung zeigten, dass das erste Serum des Patienten 2 (Februar 1993) Hinweise auf eine Mischung von Wildtypviren und mutierten Viren zeigte. Die PCR-Produkte dieser Serumprobe und der nachfolgenden des Patienten Nr. 2 wurden in den pUC19-Vektor kloniert, um die Ergebnisse der direkten Sequenzierung zu bestätigen. Die Nucleotidsequenzen der amplifizierten HBV-DNA wurden mit dem Sequenase-DNA-Sequenzierungskit (Version 2.0, USB, Cambridge, England) bestimmt.
Hydrophobie-Plot
Die Aminosäuren 122 bis 137 und 122 bis 139 oder 140 (einschließlich insertierter Aminosäuren) der a-Determinante des HBsAg aus den Isolaten des Wildtyps und der Virusvarianten wurden mittels der Prosis-Software (Pharmacia, St. Albans, England) analysiert.
Dot-Blot-Hybridisierung
HBV-DNA war nach der Amplifizierung mittels PCR zweimal unabhängig voneinander im Serum des Patienten Nr. 1 nachweisbar. Beim Patienten Nr. 2 war sie mittels Dot-Blot-Hybridisierung im März 1993 und im September 1993 in einer Konzentration von 10 μg/50 μl Serum nachweisbar. Unter der Annahme, dass 1,0 μg HBV-DNA 2,3 × 106 HBV-Genomen äquivalent ist, wurde abgeschätzt, dass das Serum dieses Patienten ungefähr 4,6 × 10⁷ Viruspartikel pro ml enthielt. HBsAg war in der ersten, aber nicht in der zweiten Probe nachweisbar. Im Januar 1994 war HBV-DNA nur mittels PCR nachweisbar, und HBsAg war immer noch nicht nachweisbar.
Untersuchungen zur Bindung monoklonaler Antikörper
Bindungsstudien an den Patienten Nr. 1 und Nr. 2 und an einem HBsAg-positiven Patienten, der als Kontrolle eingesetzt wurde (adw), zeigten, dass das HBsAg im Serum beim Patienten 2 an alle drei monoklonalen Antikörper band und mittels des polyklonalen Anti-HBs aus dem AusRIA II-Kit nachgewiesen werden konnte (Tabelle 2).
Sequenzierung des PräS-S-Gens und der Prä-C/C-Region
Die S-Gene bestehen aus 687 bp im Isolat 1, aus 690 im Isolat 2 und aus 683 bp in den Wildtypen. Die S-Nucleotid- und -Aminosäuresequenzen der Mutanten wurden mit einer veröffentlichten Sequenz des gleichen Subtyps (adw) verglichen und auch mit der eines Wildtyp-Stammes aus einem HBeAg-positiven Träger aus der gleichen Region (wie in der Tabelle 3 gezeigt ist).
Die Ergebnisse der Sequenzierung zeigten eine Insertion in das S-Gen (4). Die insertierten Sequenzen codieren für zwei zusätzliche Aminosäuren (Arg-Ala) zwischen den Codons 122 und 123 im Isolat 1 und für drei zusätzliche Aminosäuren (Arg-Gly-Ala) zwischen den Codons 123 und 124 im Isolat 2 (5). Diese Insertionen liegen unmittelbar vor der a-Determinante des HBsAg. Derartige Insertionen sind nicht in den veröffentlichten Sequenzen bekannter HBV-Subtypen beschrieben worden, und sie waren nicht in den Konsensussequenzen enthalten, die aus 30 chinesischen HBsAg-positiven Patienten aus der gleichen Region Chinas erhalten worden waren.
Die Ergebnisse der direkten Sequenzierung wurden durch eine Klonierungssequenzierung verifiziert. Von 10 Klonen des ersten Serums, das vom Patienten Nr. 2 entnommen worden war, hatten 8 eine In-Phase-Insertion, wie sie oben beschrieben wurde, 2 davon waren vom Wildtyp, während alle 15 Klone der zweiten und der dritten Serumprobe von der Variante stammten. Somit zeigte das erste Serum des Patienten Nr. 2 Hinweise auf eine Mischung von Wildtyp-Viren und mutierten Viren, was ein allmähliches Auftauchen der Mutante anzeigte, die in den nachfolgenden Seren zur vorherrschenden Spezies wurde.
Es lagen keine früher beschriebenen Aminosäuredeletionen oder -substitutionen in den PräS1- oder PräS2-Genen vor.
Hydrophobie-Plot
Dieser wurde mittels des Verfahrens von Kyte und Doolittle durchgeführt und ergab einen mittleren Hydrophobieindex von –0,48 für die Aminosäuren 122–137 der a-Determinante vom Wildtyp, von –0 für die Aminosäuren 122–139 im Isolat 1 und von –0,89 für die Aminosäuren 122–140 im Isolat 2. Somit waren die a-Determinanten der Mutante hydrophober als der gleiche Bereich aus dem Wildtyp-Virus.
LITERATURSTELLEN

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PATENTE

Europäisches Patent Nr. 0226846
Europäisches Patent Nr. 0278940
Europäisches Patent Nr. 0299108
PCT-Anmeldung Nr. 91/14703
PCT-Anmeldung Nr. 94/26904
US-Patent 4 649 192
US-Patent 4 683 294
US-Patent 4 694 074
US-Patent 4 738 926

Claims

Modifiziertes Hepatitis-B-Oberflächenantigen-Protein (mHBsAg), wobei das genannte Protein eine gegenüber der Antigenität des Wildtyp-HBV-Oberflächenantigens (HBsAg) veränderte Antigenität aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Protein eine antigenisch modifizierte Hüllregion umfasst, bei der entweder Arginin und Alanin, in dieser Reihenfolge, oder Arginin, Glycin und Alanin, in dieser Reihenfolge, zwischen der Codonposition 122 und der Codonposition 124 der HBsAg-Sequenz insertiert sind.
mHBsAg, wie es im Anspruch 1 beansprucht wird, das mit dem Wildtyp-HBsAg identisch ist, mit Ausnahme der Insertion von entweder Arginin und Alanin, und zwar in dieser Reihenfolge, oder Arginin, Glycin und Alanin, und zwar in dieser Reihenfolge, zwischen der Codonposition 122 und der Codonposition 124.
mHBsAg, wie es im Anspruch 1 oder im Anspruch 2 beansprucht wird, wobei das mHBsAg Prä-S-Sequenzen einschließt.
mHBsAg, wie es im Anspruch 1, 2 oder 3 beansprucht wird, mit einer Reinheit von über 75 %.
Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz umfasst, die für ein mHBsAg gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 codiert.
Expressionsvektor, wie er im Anspruch 5 beansprucht wird, wobei die DNA-Sequenz diejenige ist, die in der 1 oder der 2 der begleitenden Zeichnungen dargelegt ist.
Wirtszelle, die mit dem Vektor aus Anspruch 5 oder aus Anspruch 6 transformiert wurde.
Wirtszelle, wie sie im Anspruch 7 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Wirtszelle eine Hefezelle ist.
Impfstoffzusammensetzung, die eine wirksame Menge eines mHBsAg, wie es in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 beansprucht wird, als eine Mischung mit einem geeigneten Träger oder Adjuvans umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines mHBsAg, wie es in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 beansprucht wird, wobei das Verfahren die Schritte des Kultivierens einer Wirtszelle gemäß Anspruch 7 oder Anspruch 8 in einem geeigneten Kulturmedium und des Reinigens des erzeugten mHBsAg bis zur benötigten Reinheit umfasst.
Verwendung eines mHBsAg gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 bei der Herstellung eines Impfstoffs zum Schutz eines Menschen gegen eine mit dem HBV assoziierte Krankheit.
Kit zum diagnostischen In-vitro-Nachweis von Anti-mHBsAg-Antikörpern in einem biologischen Medium, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit umfasst a) mHBsAg gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, und b) eine Vorrichtung zum Nachweis der Antigen-Antikörper-Reaktion.
Antikörper, der gegen ein mutiertes HBV-spezifisches Epitop des mHBsAg, wie es in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 definiert ist, und das durch die Insertion der genannten Aminosäuren verändert ist, gerichtet ist.
Monoklonaler Antikörper, der für mHBsAg, wie es in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 definiert ist, spezifisch ist, und der normales HBsAg nicht erkennt.
Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens von mHBsAg, wie es in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 definiert ist, in einer Probe eines Wirts, wobei das mHBsAg mittels einer Antikörperpräparation nachgewiesen wird, die Antikörper gegen mHBsAg, wie es in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 definiert ist, umfasst.
Kit aus Bestandteilen, die mHBsAg umfassen, wie es in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 definiert ist, sowie eine Antikörperpräparation, die Antikörper gegen mHBsAg, wie es in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 definiert ist, umfasst.