DE68911019T2

DE68911019T2 - Kombiniertes Hepatitis A- und B-Vakzin mit Adjuvans.

Info

Publication number: DE68911019T2
Application number: DE68911019T
Authority: DE
Inventors: Syoji Kuzuhara; Kyosuke Mizuno; Koichi Odo
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1988-04-28
Filing date: 1989-04-28
Publication date: 1994-05-19
Anticipated expiration: 2009-04-29
Also published as: EP0339667B1; DE68911019D1; ES2059612T3; EP0339667A3; EP0339667A2; JPH085804B2; JPH01279842A; US5151023A; ATE97815T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein kombiniertes Hepatitis A- und B-Vakzin mit Adjuvans und insbesondere ein kombiniertes Hepatitis A- und B-Vakzin mit Adjuvans, das ein inaktiviertes Hepatitis A-Virus-Antigen (hier als "HAV" bezeichnet) und ein gereinigtes Hepatitis B-Oberflächenantigen (hier als "HBs-Antigen" bezeichnet) oder ein inaktiviertes gereinigtes an ein Aluminiumgel adsorbiertes HBs-Antigen umfaßt, wobei das inaktivierte HAV-Antigen durch Proliferation von HAV erhalten wurde, das aus dem Stuhl eines an Hepatitis A erkrankten Patienten isoliert und an die Vermehrung in großem Maßstab in Nierenzellen der grünen Meerkatze mittels Zellkulturtechniken angepaßt, und dann aus den infizierten Zellen isoliert und gereinigt wurde; und wobei das gereinigte HBs-Antigen von einem rekombinanten Mikroorganismus (Hefe) hergestellt wurde, dem die Fähigkeit zur Herstellung des HBs- Antigens mittels genetischer Rekombinationstechniken verliehen worden war oder das inaktivierte gereinigte HBs-Antigen aus dem Plasma von Hepatitis B-Virusträgern (hier als "Träger" bezeichnet) stammt.
Hepatitis ist eine Krankheit, die sporadisch durch orale Infektion mit HAV ausbricht. In fortschrittlichen Ländern wird jedoch in letzter Zeit selten über schwere Epidemien berichtet, da in diesen Ländern die hygienischen Bedingungen insgesamt verbessert wurden. Dennoch gibt es einen Bericht, der darlegt, daß bei i bis 1.5% der an akuter Hepatitis A erkrankten Patienten diese plötzlich ausbricht. Daher geht man davon aus, daß Hepatitis A eine Krankheit ist, die in epidemiologischer und klinischer Hinsicht ernst genommen werden sollte.
Die Anzahl der Menschen mit Anti-HAV-Antikörpern nimmt seit kurzem Jahr für Jahr ab, wie auch die Zahl der Berichte über Epidemien abgenommen hat. Folglich haben in den fortschrittlichen Ländern die meisten Menschen unter 35 Jahren keine Anti-HAV-Antikörper. Es wurden jedoch Fälle bekannt, wo solche jungen Leute ohne Antikörper in Regionen reisen, in denen Hepatitis A vorkommt, und infiziert wurden. Unter Berücksichtigung der jüngeren Entwicklung, daß Unternehmen sich in Entwicklungsländern niederlassen und die Gelegenheiten zunehmen, dorthin zu reisen, wurde die sofortige Entwicklung eines vorbeugenden Vakzins erforderlich. Bisher fanden jedoch keine derartigen Vakzine praktische Anwendung.
Hepatitis B ist andererseits eine Krankheit, die durch eine Infektion mit dem Hepatitis B-Virus (hier als "HBV" bezeichnet) mittels Blut oder einer Körperflüssigkeit verursacht wird. Ihre Prognose ist nicht gut und die Krankheit schlägt häufig in chronische Hepatitis, Zirrhose und sogar Leberzellenkarzinom um. Bisher wurde kein wirksames Mittel zur Behandlung von Hepatitis dieses Typs entwickelt. Unter diesen Umständen wurde zuerst ein aus dem Plasma der Träger stammendes Hepatitis B-Vakzin als ein vorbeugendes Mittel entwickelt. Um ferner die durch den Mangel an Trägerplasma bewirkte Schwierigkeit zu umgehen, Ausgangsmaterialien bereitzustellen, wurde kürzlich eine Technik zur Expression entwickelt, die das Inserieren eines Strukturgens des HBs- Antigens in als Wirtszellen dienende Hefe- oder tierische Zellen mittels einer genetischen Rekombinationstechnik umfaßt. Dies führt zur Herstellung einer großen Menge von ausschließlich HBs-Antigen als Ausgangsmaterial für Vakzine zur Vorbeugung von Hepatitis. Nach Reinigung erhält man hochgereinigtes Antigen (EP-A-0 156 242). Ferner offenbart WO-A-8601826 die Verwendung eines abgeschwächten Hepatitis A- Virus zur Herstellung eines Vakzins gegen Hepatitis A.
Man geht davon aus, daß die Zahl von Hepatitis B-Trägern in der Welt etwa zweihundert Millionen beträgt und daß die Zahl der Träger in Regionen, in denen HAV vorkommt, wie Südost- Asien und Afrika, beinahe 10 bis 15% ihrer Bevölkerung erreicht. Dies zeigt deutlich eine latente hohe Möglichkeit einer HBV-Infektion in Regionen, in denen HAV vorkommt. Daher besteht in diesen Regionen ein dringender Bedarf für die Entwicklung eines vorbeugenden Mittels nicht nur gegen die Infektion mit Hepatitis A, sondern auch mit Hepatitis B.
Kürzlich wurden aktiv viele Versuche unternommen, Vakzine zu entwickeln, die fähig sind, durch nur eine Impfung einer Vielzahl von zu bekämpfenden Krankheiten vorzubeugen, d.h. polyvalente Vakzine (kombinierte Vakzine) zur Verringerung der Anzahl der Impfungen zu entwickeln. Dies führt zu einer Verringerung von Unfällen, die möglicherweise während der Impfung auftreten und reduziert bei der Herstellung der Vakzine als Mittel zur Vorbeugung gegen verschiedene Infektionskrankheiten deren Herstellungskosten. Ein derartiges Mischen vermindert jedoch gelegentlich die Immunogenität der Vakzine (Interferenzwirkung). Dies ist gegenwärtig bei der Entwicklung eines polyvalenten Vakzins ein großes Problem.
Demgemäß ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines kombinierten Hepatitis A- und B-Vakzins mit Adjuvans, das die Probleme löst, die mit einer Vorbeugung gegen eine Infektion mit Hepatitis A und B verbunden sind und das sicher und rentabel ist.
Das vorstehende Ziel kann wirksam mittels eines kombinierten Hepatitis A und B-Vakzins mit Adjuvans erreicht werden, das ein inaktiviertes Hepatitis A-Virus-Antigen, ein HBs-Antigen und ein Adjuvans umfaßt.
In dem vorliegenden Vakzin wird ein durch Gewebekultur erhaltenes HAV als brauchbares HAV verwendet. Genauer wird eine große Menge HAV in Gewebekulturen mittels einer HAV mit hoher Produktivität herstellenden Zellinie, d.h. GL-37-Zellen, erhalten. Diese wird durch Clonierung von Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze gemäß einer Kolonie-Kultivierungstechnik und mittels des aus dem Stuhl von HAV-infizierten Patienten isolierten HAV-Stamms KRM 003 etabliert, für den die GL-37-Zellen sehr empfänglich sind. So erhaltenes HAV wird durch eine geeignete Kombination von verschiedenen Verfahren zur Isolierung und Reinigung von biologisch aktiven Stoffen gereinigt, wie Fraktionierung mit Polyethylenglykol, Ultrazentrifugation, Behandlung mit organischen Lösungsmitteln, Enzymbehandlung und Gelfiltration. Man erhält ein gereinigtes Antigen, das anschließend mit Formal in inaktiviert und zur Herstellung des kombinierten Vakzins der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Andererseits umfaßt das in der vorliegenden Erfindung verwendbare HBs-Antigen auch die, die mittels einer mit einer genetischen Rekombinationstechnik transformierten Rekombinanten hergestellt wurden, wobei man eine HBs-Antigen-Produktivität erhält oder inaktivierte und gereinigte aus dem Plasma von HBV-Trägern stammende HBs-Antigene. Das erstgenannte Antigen wird wie folgt hergestellt. Zunächst wird der Shuttle-Vektor pAM82 hergestellt, der den Replikationsstartpunkt (ori) des 2 u Plasmids, das pBR322 Plasmid und als chromosomale Hefe-DNA, das LEU-Gen aus Hefe, das Ampicillin- Resistenzgen aus Escherichia coli und die reprimierbare Promotorregion der sauren Phosphatase aus Hefe enthält. Zweitens wird das aus dem HBs-Antigen-positiven und HBE-e-Antigen- negativen Plasma von Blutspendern isolierte HBs-Gen der HBV- DNA cloniert und mit der reprimierbaren Promotorregion der sauren Phosphatase dieses Vektors kombiniert. Man erhält den Shuttle-Vektor pAM203. Drittens wird dieser Vektor pAM203 zum Erhalt einer transformierten Hefezelle in eine Hefezelle inseriert. Die Antigenproduktion wird durch anschließendes Kultivieren der Zelle bewirkt. Das in der Hefezelle hergestellte HBs-Antigen wird gemäß irgendeiner Kombination der folgenden Verfahren gereinigt, wie Zellaufschluß, Extraktion aus dem Rückstand, Aussalzen, Gel-Filtration, Ionenaustausch-Chromatographie, Saccharose und Cäsiumchlorid-Zentrifugation und ähnliche. Mehr Details sind in den Veröffentlichungen der nicht-geprüften japanischen Patentanmeldungen Nrn. 59-31799 und 60-193925 (hier als "J.P. KOKAI" bezeichnet) beschrieben.
Das aus dem Plasma stammende HBs-Antigen wird als hochgereinigtes Antigen aus HBs-Antigen-positivem Trägerplasma mittels Dichtegradienten-Zentrifugation mit Saccharose und Casiumchlorid oder irgendeiner Kombination verschiedener Ionenaustausch-Chromatographie-Techniken gewonnen. Die Herstellung wird in der von den Erfindern dieser Erfindung angemeldeten japanischen Patentveröffentlichung zum Zwecke des Einspruchs Nr. 61-045610 (hier als "J.P. KOKOKU" bezeichnet) ausführlich beschrieben.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendbare Adjuvans ist nicht kritisch. Es muß die Fähigkeit besitzen, die Immunaktivität bis zu einem gewünschten Ausmaß zu steigern und darf keine Nebenwirkungen verursachen. Aluminiumgel, insbesondere Aluminiumhydroxidgel und Aluminiumphosphatgel kann in geeigneter Weise in der vorliegenden Erfindung als Adjuvans verwendet werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform des kombinierten Vakzins dieser Erfindung wird durch Adsorption des gemäß der vorstehenden Verfahren gewonnenen inaktivierten HAV- und HBs-Antigens an Aluminiumgel erhalten.
Die Konzentration des Aluminiumgels liegt im Bereich von 100 bis 1000 ug/ml und beträgt vorzugsweise 400 ug/ml. Die Endkonzentrationen des inaktivierten HAV- und HBs-Antigens betragen nicht weniger als 50 ng/ml bzw. 2.5 ug/ml, und das Mischungsverhältnis beträgt 1:20 bis 1:200. Das Mischen kann in beliebiger Weise ausgeführt werden, bevorzugt werden jedoch die folgenden 5 Verfahren:
1. Das HAV- und das HBs-Antigen wird zu einer gewünschten Konzentration gemischt und das Gemisch mit einem Adjuvans in Kontakt gebracht, um die Antigene daran zu adsorbieren.
2. Das HAV-Antigen wird zuerst mit einem Adjuvans in Kontakt gebracht, um das HAV-Antigen daran zu adsorbieren. Anschließend wird das HBs-Antigen mit dem das HAV-Antigen tragenden Adjuvans in Kontakt gebracht, um das HBs- Antigen daran zu adsorbieren.
3. Das HBs-Antigen wird zuerst mit einem Adjuvans in Kontakt gebracht, um das HBs-Antigen daran zu adsorbieren. Anschließend wird das HAV-Antigen mit dem das HBs-Antigen tragenden Adjuvans in Kontakt gebracht, um das HAV- Antigen daran zu adsorbieren.
4. Das HAV- und das HBs-Antigen werden getrennt an verschiedene Adjuvantien adsorbiert und diese anschließend miteinander gemischt.
5. Ein Aluminiumgel-Adjuvans wird in einer das HAV-Antigen enthaltenden Lösung hergestellt und das HBs-Antigen anschließend mit dem Adjuvans in Kontakt gebracht, um das HBs-Antigen daran zu adsorbieren.
Das derart hergestellte kombinierte Vakzin ist ein brauchbares pharmazeutisches Präparat, das einer Infektion mit Hepatitis A und B vorbeugt ohne jegliche Verringerung der antigenen Wirksamkeit und Verschlechterung seiner Eigenschaften.
Ferner bewirkt dieses Präparat niemals eine durch das Mischen der Virusantigene bedingte sonst häufig, insbesondere für kombinierte Tiervakzine (wie Vakzine gegen Pseudo-Geflügelpest, infektiöse Bronchitis, Akabane- und Ibaraki-Krankheit) beobachtete Interferenz zwischen den Virusantigenen.
Demgemäß hat das Präparat keine hemmende Wirkung auf die Immun-Reaktion. Ferner bewirkt die Präparation des kombinierten Vakzins eine höhere die Hepatitis A Immunogenität steigernde Wirkung, als die, die bei der Verwendung von nur dem HAV-Antigen beobachtet wurde.
Zusätzlich kann gemäß der vorliegenden Erfindung die Menge des HAV-Antigens pro Dosierungseinheit durch Verwendung von Aluminiumgel als Adjuvans auf einen niedrigeren Spiegel reduziert werden, als der für Vakzine ohne Zusatz von Adjuvans benötigte. Ferner können die Kosten des Präparats niedriger gehalten werden als wenn die Präparate die einzelnen Antigene umfassen, da das Präparat der vorliegenden Erfindung polyvalent ist.

Wirksamkeit und Sicherheit des kombinierten Vakzins

Dr. MORITSUGU et al. des "National Institute of Health" berichten auf dem 33. Treffen der Gesellschaft japanischer Virologen (1986) und im Bericht über Forschung und Entwicklung eines Hepatitis A-Vakzins (1985) über die Wirksamkeit eines Hepatitis A-Vakzins des flüssigen Typs für Seidenäffchen. Diese Berichte legen dar, daß, wenn der erworbene Antikörpertiter eines mit einem inaktivierten Vakzin geimpften Seidenäffchens nicht weniger als 1000 mIU beträgt, die Infektion mit einem virulenten Virusstamm von 10³ MID&sub5;&sub0; unabhängig davon gehemmt werden kann, ob der Virus über die Ader oder durch den Mund in den lebenden Organismus gelangt.
Die Erfinder dieser Erfindung verglichen gemäß dem Test paralleler Linien unter Verwendung einer Maus die durch die Immunisierung mit von den Erfindern hergestellten inaktivierten und gereinigten Antigenen induzierten Antikörper-Titer mit dem vom von Dr. M0RITSUGU erhaltenen inaktivierten HAV-Antigen (Referenz). Als ein Ergebnis werden Linearität und Parallelität bezogen auf die Referenz bestätigt und die relative Wirksamkeit entspricht fast der der Referenz. Ferner wird, wie in den folgenden Beispielen beschrieben, durch Experimente unter Verwendung von Meerschweinchen und Mäusen gezeigt, daß bei Verwendung eines Aluminiumgels als Adjuvans eine 1000 mIU/ml oder mehr entsprechende Antikörper-Produktivität durch Immunisierung dieser Tiere mit nicht weniger als 50 ng/Dosis des HAV-Antigens induziert werden kann. Hinsichtlich der Sicherheit des gereinigten HAV-Antigens wurde ein Test auf das Fehlen abnormer Toxizität gemäß der vom japanischen Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt herausgegebenen "Mindestanforderung an biologische Produkte" und ein Test auf akute Toxizität gemäß dem "Japan GLP-Guide line" durchgeführt. Bei diesen Tieren wurde keinerlei Unregelmäßigkeit beobachtet.
Andererseits wurde von den Erfindern dieser Erfindung bereits in "KISO TO RINSHO (Clinical Report)" 21 (1987), 259, über die Wirksamkeit und Sicherheit von aus Hefe stammenden, gemäß einer genetischen Rekombinationstechnik erhaltenen und den aus Trägerplasma stammenden HBs-Antigenen berichtet. In diesem Bericht wurde ein aus Hefe stammendes 20 ug HBs-Antigen und 400 ug Aluminiumgel pro 1 ml Vakzin enthaltendes Hepatitis B-Vakzin 3 mal bei etwa 2200 Personen subcutan in einer Menge von 0.5 ml (10 ug HBs-Antigen entsprechend) pro Injektion bei Erwachsenen und 0.25 ml (5 ug HBs-Antigen entsprechend) pro Injektion bei einem Kind injiziert. Man fand, daß die Serokonversions-Rate bei Erwachsenen 94.5% und bei Kindern 98.3% betrug. Einige Nebenwirkungen wie lokale Schmerzen und Jucken wurden bei 11.6% aller Patienten und Unwohlsein bei 5.1% aller Patienten beobachtet. Diese Ergebnisse entsprechen jedoch denen, die mit dem vom Plasma stammenden Hepatitis B-Vakzin beobachtet wurden, das auf den Markt gebracht wurde und dessen Wirksamkeit und Sicherheit bestätigt wurde. Ferner wurde ein Test auf das Fehlen abnormer Toxizität gemäß der "Mindestanforderung an biologische Produkte" mit dem kombinierten Vakzin ausgeführt. Es wurden keine Unregelmäßigkeiten beobachtet.
Aus dem Vorstehenden geht hervor, daß das vorliegende kombinierte Vakzin hinsichtlich seiner Wirksamkeit und Sicherheit in geeigneter Weise praktisch angewendet werden kann.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen und Referenzbeispielen genauer erläutert, und die durch die Erfindung praktisch erhaltenen Wirkungen werden ebenfalls beschrieben.

Referenzbeispiel 1: Kultivierung und Reinigung von HAV

Aus den Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze stammende von Dr. MORITSUGU "Japan National Institute of Health" etablierte und verteilte GL-37-Zellen wurden wiederholt in Rollerflaschen kultiviert (Kultivierungsbereich = etwa 700 cm²). Nach 19 bis 23 Durchgängen in Folge wurden diese Zellen mit dem ebenfalls von Dr. MORITSUGU etablierten, aus menschlichem Stuhl stammenden HAV-Stamm KRM003 infiziert, so daß die Virus-Infektions-Dosis pro Zelle (M.o.I.) 0.1 bis 1.0 betrug. Die Zellen wurden anschließend in 2% fetales Rinderserum (hier als "FBS" bezeichnet) enthaltendem Eagles Minimal- Essential-Medium (E-MEM) 2 bis 3 Wochen kultiviert. Nach Abschluß der Kultivierung wurden die Zellen mit Phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (hier als PBS bezeichnet) gewaschen, gefolgt von dem Zusatz von 10 bis 15 ml eines lytischen 1% NP 40 (bei NAKARAI CHEMICAL CO., LTD. erhältlich), 0.4% Natriumdesoxycholat und 50 mM EDTA enthaltendem 10 mM Tris-HCL Puffers, pH 7.4 pro Rollerflasche und anschließender 1-stündiger Kultivierung der Zellen bei 37ºC in einem "Zell-Roller". Nach dem Ernten der Zellen wurden die Zelltrümmer durch 30 minütige Zentrifugation bei 8000 bis 10000 Upm entfernt. Eine 5fach konzentrierte Natriumchlorid enthaltende Polyethylenglykol 6000-Lösung (bei WAKO JUNYAKU CO., LTD. erhältlich) wurde zu dem erhaltenen überstand in einer Menge von 1 Volumen pro 4 Volumen des letzteren zugesetzt und die Lösung anschließend 2 bis 3 Stunden bei 4ºC gerührt und über Nacht stehengelassen. Anschließend wurde die Lösung 30 Minuten bei 8000 bis 10000 Upm zentrifugiert, und die erhaltenen Pellets in einem lytischen Puffer suspendiert. Die Suspension wurde über Nacht bei 20000 Upm weiter zentrifugiert, um den Virus zu pelletieren. Die erhaltenen Viruspellets wurden in PBS resuspendiert und ein äquivalentes Volumen Chloroform zu der Suspension zugesetzt. Der Virus wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur extrahiert. Nach dem Sammeln der wäßrigen Phase (die Virusphase) wurde das restliche Chloroform unter Vakuum entfernt und die Phase dann mit einem Enzym behandelt. Bei der Enzymbehandlung wurden DNase I (bei TAKARA SHUZO CO., LTD. erhältlich) und RNase A (bei Sigma Co., Ltd. erhältlich), deren Endkonzentrationen 20 bis 40 ug/ml betrugen und 50 ug/ml Proteinase K (bei Merck Co., Ltd. erhältlich) zu der wäßrigen Phase zugesetzt, um die aus den Wirtszellen stammenden Proteinbestandteile und Nucleinsäuren abzubauen. Diese Enzymbehandlung wurde 4 bis 6 Stunden bei 37ºC fortgesetzt. Zu dieser mit den Enzymen behandelten Lösung wurde ein äquivalentes Volumen 2.5 M Kaliumphosphat-Puffer (pH 7.5) und 0.8 Volumen eines Lösungsgemischs aus Ethoxyethanol und Butoxyethanol (2:1 V/V) zugesetzt und die Lösung mehrere Male gemischt. Durch diese Behandlung mit organischen Lösungsmitteln wurde das Virus in der mittleren Phase unter Bildung einer Bande konzentriert. Die Virusphase wurde gesammelt, in 0.1% Tween 80 (bei WAKO JUNYAKU CO., LTD. erhältlich) und 2 mM EDTA enthaltender 10 mM PBS (pH 7.4) suspendiert und dann nochmals mit dem organischen Lösungsmittel behandelt. Die zuletzt erhaltene Virussuspension wurde 15 Minuten bei 10000 Upm zentrifugiert und der erhaltene überstand über eine mit Sephacryl S 400 HR (bei Pharmacia Co., Ltd. erhältlich) gepackte Gelfiltrationssäule gegeben, wobei 0.002% Tween 80 enthaltende PBS als Elutionspuffer verwendet wurde. Antigen-positive Fraktionen wurden gesammelt und durch Filtration sterilisiert, um eine gereinigte Viruslösung zu erhalten. Die Lösung wurde anschließend durch eine Behandlung mit 2000- bis 4000-fach verdünntem Formal in (Endkonzentration) 12 Tage bei 37ºC inaktiviert. Man erhält eine inaktivierte, gereinigte Antigen- Lösung.

Referenzbeispiel 2: Herstellung eines kombinierten Hepatitis A- und B-Vakzins mit Adjuvans

Ein als Adjuvans verwendetes Aluminiumgel wurde gemäß einem Verfahren hergestellt, das den Zusatz einer 1 N Natriumhydroxidlösung nach und nach zu einer 10% Aluminiumchloridlösung umfaßt, bis der pH auf etwa 7 erhöht ist. Das erhaltene Gel wurde zur Entfernung von freien Aluminiumionen mindestens 5 mal mit PBS (pH 7.4) gewaschen und dann in dem gleichen Puffer zu einer Konzentration von 400 ug/ml suspendiert. Die Aluminiumgel-Suspension wurde mit dem inaktivierten HAV- und dem HBs-Antigen gemischt, so daß für diese Endkonzentrationen von 50 bis 100 ng/ml bzw. 2,5 bis 10 ug/ml eingestellt wurden. Das Lösungsgemisch wurde über Nacht bei 4ºC mit einem Rührer gerührt, um diese Antigene an das Aluminiumgel zu adsorbieren. Zur Bestätigung, ob die HAV- und HBs-Antigene vollständig an das Gel adsorbiert wurden, wurde der nach der Adsorption erhaltene Überstand einer quantitativen Analyse unterzogen, genauer für das HAV-Antigen einer ELISA-Technik und für das HBs-Antigen einer RIA-Technik. Der Überstand zeigte jedoch keinerlei Aktivität der HAV- und HBs- Antigene. Diese Antigene wurden daher als vollständig an das Gel adsorbiert betrachtet.

Referenzbeispiel 3: Bestimmung des Antigen- und Antikörper- Titers

Der HAV-Antigen-Titer wurde mittels einer ELISA-Technik bestimmt. Genauer ließ man nach Beschichtung einer 96 Vertiefungen enthaltenden Mikroplatte mit Anti-HAV-Kaninchenserum als ersten Antikörper und dessen Blockierung mit Rinderserum-Albumin (hier als "BSA" bezeichnet) eine Untersuchungsprobe über Nacht bei 4ºC mit dem ersten Antikörper reagieren. Anschließend ließ man das Reaktionsprodukt mit einem zweiten Antikörper 2 Stunden bei 37ºC reagieren, bei dem es sich um einen mit Meerrettich-Peroxidase konjugierten Anti-HAV Antikörper aus Kaninchen handelte. Zur Farbentwicklung der Untersuchungsprobe wurde eine Substratlösung (o-Phenylendiamin) zugesetzt. Nach dem Abstoppen der Reaktion wurde die Absorption bei 492 nm gemessen und der Antigen- Titer aus der mit einem Standardstoff erstellten Eichkurve abgeschätzt.
Der Anti-HAV Antikörper-Titer wurde gemäß einer kompetitiv hemmenden ELISA-Technik bestimmt. Genauer ließ man eine mit Anti-HAV-Kaninchenserum beschichtete und mit BSA blockierte Vertiefung mit HAV-Antigen über Nacht bei 4ºC reagieren (als Kontrolle wurde ein Verdünnungsmittel anstelle des Antigens verwendet). Dazu wurde ein Antikörper als Standardprobe oder eine Untersuchungsprobe gegeben. Eine 30-minütige Reaktion bei Raumtemperatur wurde durchgeführt. Anschließend wurde ein Peroxidase-markierter Anti-HAV-Antikörper aus Kaninchen zugesetzt. Eine 2-stündige Reaktion bei 37ºC wurde durchgeführt. Zur Farbentwicklung der Untersuchungsprobe wurde die Substratlösung zugesetzt. Nach dem Abstoppen der Reaktion wurde die Absorption bei 492 nm gemessen und der Antigen- Titer als ein Titer berechnet, bei dem die Hemmungsrate bezogen auf die Eichkurve eines Standardstoffs 50% betrug. Der als Standardstoff verwendete Antikörper wurde so hergestellt, daß er einen relativen Titer von 2 IU/ml aufwies, wenn der Anti-HAV-Antikörper-Titer des Anti-HAV Referenzglobulins Nr.1 aus der Biologieabteilung der U.S. "Food and Drug Administration" (F.D.A.) 100 IU/ml betrug.
Der Titer des HBs-Antigens wurde mittels eines AUSRIA II Kits (bei Abbott Co., Ltd. erhältlich) bestimmt und auf die Eichkurve des Standardstoffs bezogen.
Der Titer des Anti-HBs-Antikörpers wurde mittels eines AUSAB Kits (bei Abbott Co., Ltd. erhältlich) bestimmt, indem eine Standardprobe auf der Basis der WHO Internationalen Referenz (IR-HBIG Lot. 26-1-77 50 IU/ml) hergestellt und der Titer aus der Eichkurve berechnet wurde.

Beispiel 1

Zur Untersuchung der Reaktion auf in gleicher Weise wie in dem Referenzbeispiel hergestelltes kombiniertes Hepatitis A- und B-Vakzin mit Adjuvans wurden 4 Wochen alte SPF-Meerschweinchen (jede Gruppe umfaßt 10 Tiere) in den Rücken subcutan mit dem Vakzin in einer in Tabelle I angegebenen Menge pro Dosis immunisiert. Als Vergleichstest wurde auch jedes der Hepatitis A- und B-Vakzine verabreicht.
6 Wochen nach der Immunisierung wurde den Tieren Blut abgenommen. Der Anti-HAV-Antikörper wurde mit einer ELISA-Technik nachgewiesen und sein Titer (mIU/ml) wurde als ein Titer erhalten, bei dem die kompetitive Hemmung 50% betrug. Zusätzlich wurde der Titer des HBs-Antikörpers (mIU/ml) mittels eines AUSAB Kits bestimmt. Jeder Wert wurde als ein geometrischer Mittelwert ausgedrückt. Tabelle I: Zur Impfung verwendete Menge und Antikörper-Reaktion von A,B und kombinierten A- und B-Vakzinen Vakzin Al Gel (ug) Antikörper-Titer nach 6 Wochen (mIU/ml) A und B-Kombiniert
Aus den in Tabelle I aufgeführten Ergebnissen geht hervor, daß der Antikörper-Titer des kombinierten A- und B-Vakzins bezüglich der Reaktion auf den Anti-HAV-Antikörper 6 Wochen nach der Immunisierung 8 mal höher als der von nur dem Hepatitis A-Vakzin und 1.4 mal höher als der von nur dem Hepatitis B-Vakzin war. Es wurde keine durch das Mischen dieser Antigene bedingte Interferenz der Antikörper-Reaktionen beobachtet. Insbesondere wurde die Immunogenität des Anti-HAV-Antikörpers durch das Mischen stark erhöht.

Beispiel 2

Nach Änderung der HAV-Antigenmenge auf 200 und 50 ng/Dosis bei gleichzeitigem Konstanthalten des Mischungsverhältnisses von HAV-Antigen zu HBs-Antigen (Test 1) und nach Änderung der HBs-Antigenmenge auf 2.5, 5 und 10 Mg/Dosis bei gleichzeitigem Konstanthalten der HAV-Antigen- und Aluminiumgel-Mengen (HAV-Antigen: 100 ng, Aluminiumgel: 200ug) (Test 2), wurde in diesem Beispiel die Antikörper-Reaktion des Hepatitis A- Vakzins untersucht. Die Menge jedes zur Impfung verwendeten Vakzins und die bei den Immunisierungs-Tests erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen II bzw. III zusammengefaßt. Tabelle II: Menge jedes zur Impfung verwendeten Vakzins Vakzin Aluminium Gel (ug) Test : nur A nur B A und B-Kombiniert Tabelle III: Antikörper-Reaktion und 1000 mIU/ml Auftritts- Rate jedes Vakzins (Test ) Vakzin Antikörper-Titer (mIU/ml) Auftritts-Rate nur A nur B Kombiniert (i): HAV-Ag 200 ng + HBs-Ag 20ug + Aluminiumgel 400 ug/Dosis (ii): HAV-Ag 50 ng + HBs-Ag 5 ug +Aluminiumgel 100 ug/Dosis a: HAV-Ag 100 ng + HBs-Ag 10 ug + Aluminiumgel 200 ug/Dosis b: HAV-Ag 100 ng + HBS-Ag 5 ug + Aluminiumgel 200 ug/Dosis c: HAV-Ag 100 ng + HBs-Ag 2.5 ug + Aluminiumgel 200 ug/Dosis
Aus den im Test 1 erhaltenen Ergebnissen geht hervor, daß der Antikörper-Titer des Hepatitis A-Vakzins durch Mischen dieser beiden Vakzine sogar gesteigert wurde, wenn die HAV-Antigenmenge auf 200 oder 50 ng festgesetzt wurde, während das Mischungsverhältnis des HAV-Antigens zu dem HBs-Antigen konstant gehalten wurde (1:100). Zusätzlich wurde auch nachgewiesen, daß bedingt durch das Mischen dieser Vakzine die 1000 mIU/ml Auftritts-Rate ebenfalls anstieg. Andererseits wurde sichergestellt, daß der Titer des HBs-Antikörpers durch das Mischen nicht nachteilig beeinflußt wurde. Im Test 2 wurde die HBs-Antigenmenge auf 10, 5 und 2.5 ug festgesetzt, während die HAV-Antigen und Aluminiumgel-Mengen unverändert blieben. In jeder dieser Gruppen war jedoch der Anti-HAV- Antikörper-Titer höher als der nach Impfung mit nur dem Hepatitis A-Vakzin beobachtete. Ferner gab es bei einer HBs- Antigenmenge von 10 ug keinen signifikanten Unterschied in der 1000 mIU/ml Auftritts-Rate, während der Unterschied für die Gruppen signifikant hoch war, bei denen die zur Impfung verwendete HBs-Antigenmenge 2.5 oder 5ug betrug.

Beispiel 3

Zur Untersuchung des Einflusses des Aluminiumgels und auch der Antikörper-Reaktionen nach einer ersten Immunisierung mit dem kombinierten Hepatitis A- und B-Vakzin und nach einer Nachimmunisierung wurden 5 Wochen alte SPF-Meerschweinchen (jede Gruppe umfaßt 5 Tiere) in den Rücken subcutan mit einer in Tabelle IV aufgeführten Menge pro Dosis kombiniertem Hepatitis A- und B-Vakzin immunisiert und 6 Wochen nach der ersten Immunisierung nochmals mit der gleichen Vakzinmenge immunisiert. Als Vergleichs-Test wurden die Immunisierungs- Tests auch mit individuellen Vakzinen des flüssigen Typs, einem Vakzin mit Aluminiumgel als Adjuvans und einem kombinierten Vakzin des flüssigen Typs ausgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefaßt. Das kombinierte Vakzin und das kombinierte Vakzin mit Aluminiumgel als Adjuvans wiesen 6 und 10 Wochen nach der Immunisierung bezüglich des Antikörpertiters keinen signifikanten Unterschied zu denen der individuellen Vakzine auf. Es wurde keine durch das Mischen bedingte Interferenz der Antikörper- Reaktion beobachtet. Tabelle IV: Mengen verschiedener zur Impfung verwendeter Antigene Vakzin Al Gel ( ug) Flüssig A und B-Kombiniert A-Al Gel B-Al Gel A und B-Al Kombiniert Gel Tabelle V: Antikörper-Reaktionen auf verschiedene Antigene Vakzin Nach 6 Wochen (mIU/ml) Anti-HAV Antikörper Anti-HBS Antikörper Flüssig A und B-Kombiniert A-Al Gel B-Al Gel A und B-Al Kombiniert Gel

Beispiel 4

Die Wirkungen des kombinierten Hepatitis A- und B-Vakzins dieser Erfindung wurden bei verschiedenen Tierarten untersucht. 4 Wochen alte ddy-Mäuse (jede Gruppe umfaßt 9 Tiere) wurden mit nur dem Hepatitis A- oder dem kombinierten Hepatitis A- und B-Vakzin subcutan geimpft und den Tieren dann 6 Wochen nach der Impfung Blut abgenommen, um die Menge an Anti-HAV-Antikörper und die 1000 mIU/ml Auftritts-Rate zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle VI aufgeführt. Selbst beim Wechsel der Tierart vom Meerschweinchen zur Maus wurde keinerlei Interferenz beobachtet, wie aus dem durchschnittlichen Antikörper-Titer hervorgeht. Die Immunogenität des kombinierten Vakzins war im Vergleich zu der nach der Impfung mit nur dem Hepatitis A- Vakzin beobachteten Immunogenität signifikant erhöht. Tabelle VI: Immunisierungs-Test mit Mäusen (Anti-HAV- Antikörper-Titer) Vakzin Antikörper-Titer (mIU/ml) Auftritts-Rate nur A A und B-Kombiniert Gel Dosis

Beispiel 5: Verfahren zur Herstellung kombinierter A- und B- Vakzine

In diesem Beispiel wurde das Verfahren zur Herstellung des kombinierten A- und B-Vakzins bezüglich der Korrelation zwischen der Adsorptionsfähigkeit der beiden Antigene an das Aluminiumgel, der Art der Mischungsverfahren und auch der Immunogenität bei Mäusen untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle VII zusammengefaßt.
Das Mischen wurde auf verschiedene Weise durchgeführt: das Verfahren (A Alum + B) umfaßt zunächst die Adsorption des HAV- und dann des HBs-Antigens an das Aluminiumgel; das Verfahren (B Alum + A) umfaßt die Adsorption dieser Antigene in umgekehrter Reihenfolge; das Verfahren (A Alum + B Alum) umfaßt die getrennte Adsorption dieser Antigene an verschiedenes Aluminiumgel und das anschließende Mischen von diesen; das Verfahren ( A Innen B Außen) umfaßt den Zusatz einer gewünschten Aluminiumchloridmenge zu HAV-Antigen enthaltendem 0.15 M Acetatpuffer (pH 5.2) und das anschließende Einstellen des pH mit 1 N Natriumhydroxidlösung, um ein das HAV-Antigen beinhaltendes Aluminiumgel zu erhalten, und anschließende Adsorption des HBs-Antigens an das Gel; und das Verfahren (B Innen A Außen) umfaßt den Austausch der Reihenfolge bei der Verwendung der Antigene. Die Menge der an das Aluminiumgel adsorbierten Antigene wurde bestimmt, indem das Vakzin mit einer 20%igen Phosphat-Citrat-Lösung im Verhältnis 1:1 (für das HAV-Antigen) oder mit einer 10%igen Phosphat- Citrat-Lösung im Verhältnis 9:1 (für das HBs-Antigen) zum Lösen des Aluminiumgels gemischt und anschließend die Menge an HAV-Antigen gemäß einer ELISA-Technik und die Menge an HBs-Antigen gemäß einer RIA-Technik bestimmt wurde. Als ein Ergebnis wurde gefunden, daß fast alle der zugefügten HBs- Antigene unter derartigen Herstellungsbedingungen an das Gel adsorbiert wurden. Ferner lag die aus dem Gel herausgelöste Menge des HAV-Antigens bei nur etwa 60%. Da das HAV-Antigen jedoch außer einigen aus dem Mischungsverfahren stammenden Resten im Überstand nicht nachgewiesen wurde, läßt sich vermuten, daß die Lösungen zum Lösen des Aluminiumgels die Bestimmung des HAV-Antigens mittels ELISA inhibierten.
Bei den immunologischen Tests wurden 4 Wochen alte (ddy) weibliche SPF-Mäuse (jede Gruppe umfaßt 5 Tiere) mit den Vakzinen intraperitoneal geimpft und 6 Wochen nach der Impfung Blut abgenommen. Das verwendete kombinierte A- und B- Vakzin enthielt 50 ng HAV-Antigen, 5ug HBs-Antigen und 100 ug Aluminiumgel pro Dosis. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII aufgeführt. Bei dem aus einer Kombination von "Innen" und "Außen" zusammengesetzten Mischungsverfahren war nach Adsorption des Antigens an das Gel gemäß dem "Außen"-Verfahren die nicht an das Gel adsorbierte Antigenmenge groß, insbesondere wenn das HAV-Antigen gemäß dem "Außen"-Verfahren an das Gel adsorbiert wurde. Der mittels dieses Verfahrens (B Innen A Außen) erhaltene Antikörper-Titer des HAV-Vakzins entsprach annährend dem des nur das HAV-Antigen umfassenden Vakzins des flüssigen Typs, was die Ergebnisse in Tabelle VIII bestätigte. Die Mischungsverfahren mit Ausnahme des Verfahres (B Innen A Außen) lieferten keinen statistisch signifikanten Unterschied in der Anti-HAV-Antikörpermenge im Vergleich zu der, die von dem nur das Antigen umfassenden Vakzins induziert wurde. Hinsichtlich der berechneten Mittelwerte des Titers wies das durch das A "Innen" B "Außen"- Verfahren erhaltene kombinierte Vakzin im Vergleich zu den mittels der anderen Verfahren erhaltenen Vakzine eine hohe Immun-Reaktion auf. Tabelle VII: Adsorptionsfähigkeit der Antigene Mischungsverfahren Überstand Gel Innen Außen Tabelle VIII: Immuntest des kombinierten Vakzins Mischungsverfahren Anti-HAV Antikörper Anti-HBs Antikörper (nur A, Flüssig) Innen Außen
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß das kombinierte Hepatitis A- und B-Vakzin mit Adjuvans der vorliegenden Erfindung keinerlei Interferenz der Immunreaktion und der Immunogenität von beiden, dem HAV- und dem HBs-Antigen, induziert, insbesondere scheint die erstere anzusteigen, sofern eine Dosierungseinheit zur Impfung nicht weniger als 50 ng HAV- und 2.5 ug des HBs-Antigens umfaßt und sofern das kombinierte Vakzin gemäß den vorstehenden Mischungsverfahren mit Ausnahme des Verfahrens (B Innen A Außen) hergestellt wird. Diese Fakten zeigen, daß das Präparat dieser Erfindung ein wirksames, polyvalentes Vakzin ist, das vor der Infektion mit dem Hepatitis Virus des A- und B-Typs schützt.

Claims

1. Kombiniertes Hepatitis A- und B-Vakzin mit Adjuvans das ein inaktiviertes Hepatitis A-virus-Antigen, ein Hepatitis B-Virus-Cberf lächenantigen und ein Adjuvans umfaßt.

2. Kombiniertes Hepatitis A- und B-Vakzin init Adjuvans nach Anspruch 1, wobei das inaktivierte Antigen des Hepatitis A-Virus durch Züchten von für das Virus empfänglichen, mit Hepatitis A-Virus infizierten Zellen und Inaktivieren des erhaltenen Antigens erhalten wird.

3. Kombiniertes Hepatitis A- und B-Vakzin mit Adjuvans nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Hepatitis B-Virus-0berflächenantigen unter Verwendung einer Rekombinante hergestellt wird, die durch eine genetische Rekombinationstechnik transformiert wurde und ein Heptatitis B-Virus- Oberflächenantigen herstellen kann.

4. Kombiniertes Hepatitis A- und B-Vakzin mit Adjuvans nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Heptatitis B-Virus-0berflächenantigen ein inaktiviertes gereinigtes Hepatitis B- Virus-0berflächenantigen ist, das aus dem Plasma von Hepatitis B-virusträgern stammt.

5. Kombiniertes Hepatitis A- und B-Vakzin mit Adjuvans nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Adjuvans ein Aluminiumhydroxidgel oder ein Aluminiumphosphatgel ist.

6. Kombiniertes Hepatitis A- und B-Vakzin mit Adjuvans nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Vakzin mindestens 50 ng/ml inaktiviertes Antigen des Hepatitis A-Virus und mindestens 2,5 ug/ml des Heptatitis B-Virus-0berflächenantigens umfaßt, wobei die Antigene an 100 bis 1000 ug/ml des Adjuvans adsorbiert sind.

7. Kombiniertes Hepatitis A- und B-Vakzin mit Adjuvans nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Vakzin durch Mischen des Hepatitis A-Virus-Antigens mit dem Hepatitis B-Virus-0berflächenantigen in gewünschten Konzentrationen und anschließendem Inkontaktbringen des Adjuvans mit dem Gemisch erhalten wird, um die Adsorption der Antigene an das Adjuvans zu bewirken.

8. Kombiniertes Hepatitis A- und B-Vakzin mit Adjuvans nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Vakzin dadurch erhalten wird, daß zur Bewirkung der Adsorption des Hepatitis A-Virus-Antigens an das Adjuvans in einer gewünschten Menge das Adjuvans mit einer das inaktivierte Hepatitis A-Virus-Antigen enthaltenden Lösung in Kontakt gebracht wird und im Anschluß daran zur Bewirkung der Adsorption des Hepatitis B-Virus-0berflächenantigens an das Adjuvans in einer gewünschten Menge das erhaltene Adjuvans mit einer das Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen enthaltenden Lösung in Kontakt gebracht wird.

9. Kombiniertes Hepatitis A- und B-Vakzin mit Adjuvans nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Vakzin dadurch erhalten wird, daß zur Bewirkung der Adsorption des Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigens an das Adjuvans in einer gewünschten Menge das Adjuvans mit einer das Hepatitis B-Virus-0berflächenantigen enthaltenden Lösung in Kontakt gebracht wird und im Anschluß daran zur Bewirkung der Adsorption des Hepatitis A-Virus-Antigens an das Adjuvans in einer gewünschten Menge das erhaltene Adjuvans mit einer das inaktivierte Hepatitis A-Virus- Antigen enthaltenden Lösung in Kontakt gebracht wird.

10. Kombiniertes Hepatitis A- und B-Vakzin mit Adjuvans nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Vakzin dadurch erhalten wird, daß das Adjuvans gesondert mit einer das inaktivierte Hepatitis A-Virus-Antigen enthaltenden Lösung und einer das Hepatitis B-Virus- 0berflächenantigen enthaltenden Lösung zur Bewirkung der Adsorption jedes Antigens an das Adjuvans in einer gewünschten Menge in Kontakt gebracht wird und im Anschluß daran die erhaltenen Adjuvanzien gemischt werden.

11. Kombiniertes Hepatitis A- und B-Vakzin mit Adjuvans nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Vakzin dadurch erhalten wird, daß ein als das Adjuvans dienende Aluminiumgel in einer das inaktivierte Hepatitis A-Virus-Antigen enthaltenden Pufferlösung gebildet wird, und im Anschluß daran das Adjuvans zur Bewirkung der Adsorption des Heptatitis B-Virus-0berflächenantigens an das Adjuvans das Adjuvans mit dem Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen in Kontakt gebracht wird.