JPH01279842A - Ａ型及びｂ型肝炎混合アジュバントワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 °。

本発明はＡ型及びＢ型肝炎混合アジュバントワクチン製
剤に間する。更に詳しくは、Ａ型肝炎患者の糞便から分
離しミドリザル腎細胞で馴化されたＡ型肝炎ウィルスを
細胞培養法により大量増殖させ、感染細胞から単離精製
した不活化Ａ型肝炎ウィルス抗原と、遺伝子組撓え技術
によってＢ型肝炎表面抗原（以下、ＨＢｓｔｉｔ原と称
する）産生能を付与された組換え体（酵母）が産生ずる
ＨＢｓ抗原の精製標品とをアルミニウムゲルに吸着させ
た液状混合アジュバントワクチンン製剤を提供するもの
である。

′　　　　　■　Ｌｌｔ　　　　゛　　　　Ｚ　ＱＩＩ
Ａ型肝炎は、Ａ型肝炎ウィルス（以下、Ｈ＾■と称する
）の経口感染によって散発的に起こる疾病であるが、近
年、わが国を含めた先進諸国では一最的な衛生環境の改
善によって大規模な流行例の報告は少なくなってきた。

しかしながら、年間２〜３万人のＡ型急性肝炎患者のう
ち１〜１．５％が劇症化するという報告もあり、Ａ型肝
炎が比較的軽い疾病であるという概念も打ち消されつつ
あり、疫学的にも臨床的にも非常に重要な感染症と考え
られる。ところで、流行例の報告の減少に伴い、年々、
抗）ＩＡｖ抗体保有率の低下がみられ、わが国において
は３５才以下の年齢では抗体陰性者がほとんどを占めて
いる。しかしながら、最近こうした若年層の人々が、Ａ
型肝炎常在性の高度汚染地域へ渡航して感染する例が目
だってきており、発展途上国への企業の進出や海外旅行
の機会が益々高まっている現実を考慮すると、早急にそ
の予防対策としてワクチンを開発する必要があると考え
られるが、未だ実用化までには至っていない。

一方、Ｂ型肝炎は、血液や体液を介してＢ型肝炎ウィル
ス（以下、）ＩＢＶと称する）が感染して起こる疾病で
あり、予後も悪く、慢性肝炎、肝硬変、ひいては肝臓癌
にも移行しやすい、この型の肝炎は、これまで有効な治
療方策が見いだされなかったこともあって、その予防対
策としてＢ型肝炎発症患者及びウィルス保菌者（キャリ
アー）に接触する機会の多い医療従事者、研究者や、患
者及びキャリアーの家族、新生児への１（ＢＹの感染を
防止する目的で、キャリアーの血漿由来のＢ型肝炎ワク
チンが開発されている。ところで、Ｂ型肝炎キャリアー
の数は、わが国で２００〜３００万人といわれ、■＾Ｖ
常在地域である東南アジアやアフリカ等では、その人口
の１０〜１５％に達するといわれており、ＨＡＹ常在地
域におけるＨＢＶの高度の潜在的感染を如実に示すもの
である。従って、該地域においてＡ型のみならずＢ型肝
炎の感染を防止する手段が切に盟まれる。それ故、該Ｂ
型肝炎ワクチンがわが国のみならず世界各地で使用でき
ることが望ましい、しかしながら、現在市販されている
Ｂ型肝炎ワクチン製剤は、キャリアー血漿に起因する原
料確保の困難さ、安全性、価格等で大きな問題がある。

このような状況のもと　最近、本出願人により組換えＤ
ＮＡ技術を利用して、酵母に■Ｂｓ抗原を構成するタン
パクをコードする　ＨＢＶ　−ＤＮＡを導入、発現させ
ることに成功し、ワクチンの原料となる１（Ｂｓ抗原の
みを大量に産生させて、その高度精製標品をワクチンと
する試みがなされた。このいわゆる第二世代ワクチンを
供給することで、上述の血漿由来のワクチン製造上の制
約を解消することができるようになった。

近年、種々の感染症に対する予防対策としてワクチンを
！Ｉｌ製するうえで、接種回数を削減しその結果接種時
の事故を減少させ、さらには低コスト化を図る目的で、
−度の接種で複数の対象疾患を予防することのできるワ
クチン、すなわち多価混合ワクチンの開発が活発に展開
されている。しかしながら、混合することによりお互い
の免疫原性を低下させる現象、すなわち干渉作用が生じ
る場合があり温きワクチン開発の際の大きな障壁となっ
ているのが現状である。

本題発明人は、上記の諸問題を解決するべく鋭意検討と
重ねた結果、Ａ型肝炎に対する感染予防と、Ｂ型肝炎の
感染予防の両問題を一挙に解決することのできる安全性
、及び経済性の面で優れた有用な製剤を提供することが
できる本発明を完成するに至った。

。　占卆　゛　　た 本発明に用いるＡ型肝炎ウィルスは、組織培養により得
られたウィルスが使用される。すなわち、アフリカミド
リザル腎培＃Ｒ１胞からコロニー培養法によるクローニ
ングにより樹立されたＩＩＡＶ高産生細胞株ａＬ−３７
ＭＡ胞と、Ａ型肝炎患者の糞便より分離しＧＬ−３７４
５胞に感受性のすぐれ”ＣイルＨＡＹ株ＫＲＭＯＯ３株
を用いた組織培養により、大量にＨＡＶ登得ることがで
きる。上記の方法により得られた）ＩＡＶは、ポリエチ
レングリコール分画、超遠心、有機ン容媒処理、酵素処
理、及びゲルろ過等の生物学的活性物質の分離・精製に
用いられる種々の方法を適宜組み合わせることにより、
高度に精製して精製標品とし、ホルマリンによる不活化
を施した後に本発明の混合ワクチンの製剤化に供する。

一方、本発明に用いられるＨＢｓ抗原は組換えＤＩＩＡ
法により形質転換されＨＢｓ抗原産生能を付与された組
換え体によって発現、産生されるものである。

すなわち、２μｏｒｉプラスミドの増殖起点、ｐＢＲ３
２２プラスミドの増殖起点、酵母染色体の増殖起点、酵
母のロイシン要求性遺伝子、大腸菌のアンピシリン耐性
遺伝子及び酵母の抑制性酸性フォスファターゼプロモー
ター領域からなるシャトルベクター（ｐＡＭ８２）を作
製し、この抑制性酸性フォスファターゼプロモーター領
域に）［ＢｓｖＬ原陽性かつＢ型肝炎ウィルスｅｖＬ原
陰性の供血者血漿から分離され、クローニングされたＨ
ＢＶ　ＤＮＡのＨＢｓ遺伝子を結合させたシャトルベク
ターｐＡ！４２０３を作製した。これを酵母に導入し、
形質転換酵母を得、培養してＨＢｓ抗原を産生させる。

産生された酵ｆ！国体中のＨＢｓ抗原は、菌体の破壊、
破壊物からの抽出、硫安塩析、ゲルろ過、イオン交換ク
ロマトグラフィー、ショ糖及び塩（ヒセシウム超遠心分
離等の方法を組み合わせることにより精製される。なお
、詳細については（特願昭５７−１４２４６０号）及び
（特願昭６０−１９３９２５号）に記載されている。

塩化アルミニウム溶液に、水酸化ナトリウムを作用させ
て調製したアルミニウムゲル溶液に、上記の方法で得ら
れたＨＡＶＡＶ不活化抗原Ｂｓ抗原を混合し、ゲルに吸
着させる。この際の、アルミニウムゲルの濃度は１００
〜４００μ９／履１、最適には２００μ９／１であり、
両抗原の濃度は最終濃度で各々５０〜１１００ｎ／ｍｌ
及び２．５〜１０μｑ／ｍｌであり、混合比は１：５０
〜１　：　２００、好ましくは１：１００である。また
、混合方法についてはいかなる形態も可能であるが、　
Ｉ（ＡＶ不活化抗原を含む溶液中でアルミニウムゲルを
調製し、その後ＨＢｓ抗原を添加してゲルに吸着させる
方法が、ワクチンとしての抗体産生量増加という観点か
ら最も好ましい。

かくして調製された混合ワクチンは、抗原力価の低下や
性状の劣下を伴うことなく、日本国内のみならず世界各
国においてもまだワクチンとして市販されていないＡ型
肝炎に対する感染予防と、従来の血漿由来ワクチンに比
べ、有効性、安全性、価格等の面で浸れたワクチンと考
えられる遺伝子組換え技術を利用した製剤によるＢ型肝
炎感染予防の両間頚を一挙に解決することができる有用
な製剤である。

また、本製剤は動物用混合ワクチン（例えば、ニューカ
ッスル・伝染性気管支炎や、アカバネ・イバラギ病ワク
チン等）にみられる混合することに起因するウィルスの
干渉作用がなく、従って、免疫応答の抑制作用を生ずる
ことなく、また、単独の場合に比べて混合するとＡ型の
免疫原性に増強作用がみられるという大きな特長をも有
している。

さらに、本発明によればアルミニウムゲルをアジュバン
トとして用いることにより、　１投与量当りのＡ型肝炎
抗原量をアジュバント無添加ワクチンの１７３〜１１５
に減少させることができることと、混合してワクチンに
多価性をもたらすことで、単独の場合に比べ製剤価格を
低下させることができ、供給価格をより安価にすること
ができる。

ム　　　　　１ 国立予防衛生研究所、森次博士等は第３４回日本ウィル
ス学会（１９８６年）及び昭和６０年度Ａ型肝炎ワクチ
ン開発研究報告書に、Ａ型肝炎液状試作ワクチンのマー
モセットにおける有効性試験について報告している。こ
れによると、不活化ワクチンを接種されたマーモセット
の獲得抗体価が１０ｈｌＵ以上であれば、１０３旧Ｄｓ
ｓの強毒ウィルス株の感染を静脈あるいは経口いずれの
経路であれ阻止することができる０本願発明人は、分与
された該不活化ＨＡＹ抗原を参照品として、マウスを用
いて本願発明人の調製した不活化精製抗原との調整　ｖ
ｉｖｏでの力価を平行線検定で比較した。その結果、参
照品に対し、直線性、平行性ともに認められ、相対力価
も参照品を１としたときに０．９であり、抗原性、抗体
産生能ともにほぼ同等であることが示唆された。

また、本願明細書の実施例で示されるように、アルミニ
ウムゲルをアジュバントとして用いると、ＨＡｖ抗原量
にして５０ｎｇ〜２００ｎｇ／投与量で免疫すれば１０
０＋ｓｌＵと同程度かそれ以上の抗体産生能と有するこ
とがモルモット及びマウスを用いた実験で示された。精
製ＨＡＹ抗原の安全性は、生物学的製剤基準に従い異常
毒性試験な、また、ＧＬＰガイドラインに従い急性毒性
試験を行った結果、動物レベルで同等異常はＪ２ぬられ
なかった。

一方、遺伝子組撓え技術による１ｇｌ母由来のＨＢｓ抗
原の有効性及び安全性については、本願出願人により既
に報告されている（基礎と臨床ｖｏ１．２１２５９へ°
−シ゛　１９８７年）、　すなわち、約２２００名を対
象とし、１１あたり２０μ９の）ＩＢｓ抗原と４００μ
９のアルミニウムゲルを含む酵母由来Ｂ型肝炎ワクチン
を成人には１回につき０．５ｍｌ　（）ＩＢｓ抗原量と
して１０μ９）、小児には０．２５■１（ＨＢｓ抗原量
として５μ９〉を皮下に３回接種すると、抗体陽転率は
成人で９４．５％、小児で９８．３％であった。また、
接種による副作用は全体の１１．６％に局所のとう痛、
掻痒感が、５．１％に倦怠感が認められたが、すでに上
布されているプラズマ由来のＢ型肝炎ワクチンと同等で
あった。また、該混合ワクチンについて生物学的製剤基
準に従って、異常毒性試験を行ったところ同等異常は認
められなかった。

なお、Ａ型及びＢ型肝炎ワクチンは組（負え酵母由来の
Ｂ型肝炎ワクチンの接種スケジュール（成人で１０μ９
／投与量３回投与）に合わせて接種する予定であるが、
上記のデータから、混合ワクチンにおけるＡ型の免疫原
性は、５０〜２００ｎｇ／投与量の抗原を２回接種する
ことで充分な抗ＨＡＶ抗体価を獲得できるものと考えら
れる。

以上のことから、本発明によって提供されるス剤はその
有効性及び安全性に関して、充分実用に耐え得るワクチ
ンであると結論される。

以下、本発明の効果を実施例及び９’！５例によりさら
に詳細に説明する。

り゛　　　ＨＶ　坪声　（−１ 国立予防衛生研究所、森次博士により確立され分与され
たアフリカミドリザル腎細胞由来のＧＬ−３７細胞をロ
ーラーボトル（培養面積：約６９０　ｃｍ２）で継代を
重ね、１９〜２３継伏目に同じく森次博士によって確立
された人糞ｆ更由来のＡ型肝炎ウィルス株（ＦＩＡＶ　
ＫＲＭＯＯ３）をＭ、Ｏ，１，（細胞当りのウィルス感
染１１）０．１〜１．０で接種後、２％の牛胎児血清（
以下、ＦＢＳと称する）を含むイーグルＭＥＭ培地で２
〜３週間培養する。培養終了後、リン１１！！！衝化生
理食塩水（以下、ＰＢＳと称する）で洗浄し、ローラー
ボトル１本当り１０〜１５１の可溶化バッファー（１％
ＮＰ４０　（牛丼化学社製”）　＋０．４％デオキシコ
ール酸ナトリウム）を加え、３７℃で１時間回転培養機
にかける１次に、ハーベストｆ＆８，０００〜１０．０
００ｒｐｍで３０分間遠心処理して細胞由来の夾雑物を
除去する。得られた遠心上清を１容当り４容の５倍濃度
のポリエチレングリコール６、０００　（和光綺薬社製
）・塩化ナトリウム溶液を加え、４℃で２〜３時閏撹拌
後−夜靜置装る０次に、８、０００〜１０．０００ｒｐ
＋＊で３０分間遠心し、そのペレットを可溶化バッファ
ーに懸濁させる。懸濁液をさらに２０．０００ｒｐ■で
一夜遠心処理してウィルスをベレッテイングする。得ら
れたベレットをＰＢＳに再浮遊させ、同容量のクロロホ
ルムを加えて室温で３０分閏抽出する。その水Ｎ（ウィ
ルス層）を採取後、引圧脱気により残留するクロロホル
ムを除去し、引続き酵素処理を行う、該酵素処理は宿主
細胞由来のタンパク成分及び核酸を分解する目的で、最
終濃度で２０〜４０周／膳ｌのＤＮａｓｅ　Ｉ　（宝酒
造社製）及びＲＮａｓｅ　Ａ（シグマ社製）と、５０μ
＋＋／ｍｌのＰｒｏｔｅ調整ａｓｅ　Ｋ（メルク社製）
を添加し、３７℃で３時間処理する。この酵素処理液に
同容量の２．５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７，
５）と０．８容量のエトキシエタノール′：ブトキシエ
タノール混液（２：１　ｖ／ｖ）を加え、数回混合する
。この有機溶媒処理により、ウィルスは中間層に濃縮さ
れバンドを形成する。このウィルス層を採取し、１０１
リン酸バツフアー＋　０．００２％Ｔｗｅｅｎ８０（和
光純薬社製）＋　２ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液に懸濁させ、再
度有機溶媒処理を繰り返す、最終的に得られたウィルス
懸濁液を１０．　ＯＯＯｒｐｍで１５分間遠心し、その
上清をＰＢＳ＋　０．００２％ｔｗｅｅｎ　８０を溶出
バッファーとするセファクリル５４００ＨＲ（ファルマ
シア社製）のゲルろ過カラムに通液する。素通りの抗原
陽性画分を蔑め、フィルターでろ過滅菌して精製ウィル
ス液とし、これを１：２，０００〜１：４，０００倍ホ
ルマリンで３７℃で１２日間不活化処理を施して最終精
製抗原液とした。

アジュバントであるアルミニウムゲルは１０％塩化アル
ミニウム溶液に１規定の水酸化ナトリウム溶液を少量ず
つ滴下し、ｐＨを９付近まで上げる方法でｉｌｌ製する
。得られたゲルを遊離のアルミニウムイオンを除く目的
でＰＢＳ（ｐＨ７，４）で少なくとも５回以上洗浄し、
同バッファーで４００ｕｇ／ＩＩ＋の濃度になるように
懸濁する。このアルミニウムゲル溶液に不活化したＭＡ
Ｙ抗原とＨＢｓ抗原を最終濃度で各々５０〜１１００ｎ
／＋＊１及び２．５〜１０μｑ　／ｍｌになるように混
合する。

その混液を４℃で一夜ローテーターで回転させながら両
抗原をアルミニウムゲルに吸着させる。　　）ｌＡｖ及
びＨＢｓ抗原がゲルに完全に吸着したかどうかを確認す
るため、吸着後の上清をＩＩＡＶはＥＬＩＳＡ法でＨＢ
ｓ抗原はＲＩＡ法で定量したが、上清にはＨＡＹ、ＨＢ
ｓ両抗原ともに活性はなく、はぼ１００％ゲルに吸着し
ているものと考えられた。

、′ ）ＩＡＶｖＬ原力価は、ＥＬＩＳＡ法により測定した。

すなわち、９６穴のマイクロプレートに一次抗体として
抗１（ＡＶウサギ血清をコーティングし、ウシ血清アル
ブミン（以下、ＢＳＡと称する）でブロッキング後、４
℃で一夜検体を反応させる０次に、抗ＨＡＹウサギ抗体
にパーオキシダーゼを結合させた二次抗体を３７℃で２
時間反応させ、基質（オルソフェニレンジ゛アミン）溶
液を加えて発色させる０反応停止後、４９２ｎｍで吸光
度を測定し、標準物質の検量線より抗原価を求めた。

抗ＨＡＹ抗体力価は、競合抑１１ｉ１１ＥＩ、ＩＳＡ法
により測定した。すなわち、抗ＨＡＹウサギ血清をコー
ティングしＢＳＡでブロッキングしたウェルに！（ＡＶ
抗原を４°Ｃで一夜反応させ（対照として抗原の代わり
に希釈液を作用させる）、標準試料となる抗体あるいは
検体を加え、室温で３０分間反応させる０次に、パーオ
キシダーゼ１に１１抗■ＡＹウサギ抗体を加え、３７℃
で２時間反応させた後、基質溶液を加えて発色させる。

反応停止後、４９２ｎｍで吸光度を測定し、５０％阻害
率を示すときの力価で標準試料の検１１線より算出する
。なお、標準物質として用いた抗体は米国、食品医薬品
局（ＦＤＡ）、生物学的製剤部の抗Ｂ型肝炎ウイルスイ
ムノグロブリン（ＨＢＩＧ）標準品中の抗）ＩＡＶ抗体
価を１０［１としたとき、２００ｍ１Ｕの相対力価を示
すように調製した。

ＨＢｓ抗原の力価はＡＵＳＲＩＡｎキット（アボット社
製）を用い、標準試料の検量線より算出した。

また、抗１（Ｂｓ抗体の力価は＾σＳＡＢキット（アボ
ット社製）を用い、ＷＨＯ国際参照品（ＩＲ−ＨＢＩＧ
　Ｌｏｔ、２６−１−７７５０１０／ｍｌ）を基に標準
試料を作製しその検量線より算出した。

実」［劃−」− 参考例で示された方法で調製した、Ａ型Ｂ型肝炎混合ア
ジュバントワクチンの抗体応答をみる目的で、４週齢の
ＳＰＦモルモット（１群１０匹）の冑部皮下に１投与量
当り表１に示す接種量で免疫した。また、対照試験とし
て各々の個別のワクチンの免疫試験も同時に行った。

免疫ｆ＆６週目に採血し、抗１（ＡＹ抗体はＥＬＩＳＡ
法により測定し５０％競合抑制率を示す抗体力価（ｍｌ
Ｕ）を求めた。また、抗ＨＢｓ抗体価（ｍＪＵ）はＡＵ
ＳＡＢキットにより測定した。

表１．八単独Ｂ単独及びへＢ混合ワクチンの接種量Ｂ単
独　　　　　　　　　ｘｏｐｇ　　　　　２００．ｇ表
２．各種ワクチンによる抗体応答 ＾単独　　　　　　２２±３ Ｂ単独　　　　　１８７０±５ 表に示すとうり、ＡＢ混合の場合の抗体力価は、６週目
の抗）ＩＡＶ抗体の応答でＡ型単独の約８倍、抗ｆｉｌ
ｌｓ抗体のそれで１．４倍となりいずれも混合すること
による抗体応答の干渉作用はみちれなかった。

とりわけ、抗ＨＡＹ抗体は混合することにより強い免疫
原性の上昇がみられた。

【Ｌｌ」 ）ＩＡＶ抗原とＨＢｓ抗原の混合比率を変えずに、■＾
Ｖ抗原量を２００ｎｇ／投与量及び５０ｎｇ／投与量と
した場合（実験　１）と、ＩＩＡＶ抗原量とアルミゲル
量を一定としく　ＨＡＶ−Ａｇ：　１１００ｎ、　　ア
ルミゲル：２００＋ｌｑ）、ＨＢｓ抗原量を２．５．及
び１０μ９／投与量と変化させた場合（実験２）のＡ型
の抗体応答について検討した０表３．に各ワクチンの接
種量、表４．に免疫試験の結果を示す。

表３．各ワクチンの接種量 （実験１）Ｂ単）虫　　　　　　　　　　２０しｇ　ｏ
ｒ　５１ｇ　　　　４００νｇ（ｌｏｏｐｇ）＾単独　
　　　１１００ｎ　　　　　　　−２００ｐｇ（実＠２
＞　Ｂ　ｌ−独　　　　　　　　　　１０．５　ｏｒ２
．５ｐｇ　　　　　２００１ｇ表４．各ワクチンの抗体
応答と１００ｍ１Ｕ出現率八単独　　５９．８±８３６
±１２１５０１５Ｂ単独　　５２４１　　　　３６３　
　−■ＨＡＶ−＾１１２００ｎｇ＋　ＨＢｓＡｇ　２０
１１１１＋アルミゲル４００ｐｇ／投与量■　ＩＩ　　
　５０ｎｇ÷　）ｊ　　５ｕｇ　＋　　　ｕ　−１１０
０ｐ／投与量７４．３±３　　　１３７１　　　　３／
１０混合ｂ　　　　　　　２２７　　　　１０８６　　
　　５／８１９９　　　　８０９　　　　４／８ ａＨ＾■−Ａｇ　１１００ｎ　＋　ＨＢｓ−Ａｇ　１０
ｕｇ＋アルミゲル２００ｕｇ／投与量１）　　　　　　
　　ｔ＋　　　　　　　　　＋　　　　７ノ　　　　　
ＳＬｌｇ　　十　　　　　　　　　　　　　ノ？ツノ÷
１ノ２．５．ｇ＋ツノ 実験１の結果により）ＩＡＶ抗原とＨＢｓ抗原の混合比
率（１：１００）を変化させないでＨＡＹ抗原量を２０
０ｎｇ及び５０ｎｇにしても、やはり混合することでＡ
単独の抗体価よりも高い値を示し、１００ｍ１Ｕ出現率
も混合した方が高いことが判明した。一方、ＨＢｓ抗体
価には混合による悪影響はないように思われる。実験２
において、さらに１１　Ａ　ＶｔＡ原量及びアルミゲル
量を一定にしてＨＢｓ抗原量を１０．５．２．５μ９に
変えたが、いずれの群でもＡ型単独より高い平均抗体価
を示した。また、１００ｍ１Ｕ出現率はＨＢｓ抗原１０
周で有！差がみちれないものの、５及び２．５μ９群で
は有意に高値を示した。

′支１１」 アルミニウムゲルの影響、Ａ型及びＢ型肝炎混合ワクチ
ンの初回及び追加免疫後の抗体応答をみる目的で、５週
齢のＳＰＦモルモット、１群５匹の背部皮下に１投与量
当り、表５．に示す接種量で免疫し、さらに６週目に同
量で免疫した。対照として、単独液状ワクチン、単独ア
ルミゲルワクチン、混合液状ワクチンの免疫試験も同時
に行った。結果を表６に示す、混合液状及び混合アルミ
ゲルアジュバントワクチンのいずれも、６週目、１００
週目もに単独と比較して抗体力価に有意な差はなく、混
合することによる抗体応答の干渉作用はみちれなかった
。

表５．各種抗原の接種量 ＾単独液状　　　　５０ｎｇ Ｂ単独液状　　　　　　　　　　５１１ｇＡＢ混合液状
　　　　５０ｎｇ　　　　５１１ｇ　　　　　　−＾単
独アルミゲル　　５０ｎｇ　　　　　　　　　　１０１
００ｌ１単独アルミゲル　　−　　　　ｓｕｇ　　　　
　１ｏｏ、＋ｇ表６．各種抗原による抗体応答 へ単独液状　　　　　１７±３　　　　　　　　３２±
２Ｂ単独液状　　　　　　　　　　２５７０　　　　　
　　　　１９０５４６八Ｂ混合液状　　　　１６±３　
　　１６９８　　　　４６±３　　１１２２０２＾単独
アルミゲル　　５６±４２４０±５Ｂ＊独アルミゲル　
　　−　　　１４４５４　　　　　　　　　４４６６８
４犬」Ｌ例」 動物種を変えで検討した。４適齢のｄｄｙマウスを１群
９匹とし、Ａ単独及び混合ワクチンを皮下に接種し、６
週後に採血して抗１１ＡＶ抗体と１０ｈｌＵの出現率を
調べた。結果を表７．に示す、動物種をモルモフトから
マウスに変えても干渉作用はみられず、平均抗体力価で
はやはりＡ型単独に比べて免疫原性の上昇が認められた
。

表７．マウスにおける免疫試験（抗ＨＡＶ抗体価）＾単
独　ＨＡＶ　１１００ｎ＋アルミゲル２００νｇ／投与
量八Ｂ混合、　　７１　　　＋　　　　　ＩＩ　　　　
＋ＨＢｓ　１０ｐｇ／投与量智　　　　　　　、ＪＢ　
！゛　１　　　　±」１皿」［組法混合ワクチンの調製
方法について、両抗原のアルミニウムゲルへの吸着性と
混合方法及びマウスにおける免疫原性を検討した。

混合方法は、＾＾ｌｕｍ＋Ｂが、Ａを先ずゲルに吸着さ
せその後Ｂを、Ｂ　ＡＩｕｍ＋Ａは逆の順序に吸着させ
た。Ａ　ＡＩｕｍ＋Ｂ　Ａｌｕｍは各々の抗原を別々に
ゲルに吸着後、それを混合した。Ａ調整　Ｂ　ｏｕｔの
調製方法は、Ａの抗原を含む０．１５Ｍ酢酸バッファー
（ｐＨ５，２）中に必用量の塩化アルミニウムを加え、
　１規定の水酸化ナトリウムでｐＨ１７，２に調整する
ことによって作製し、その後、他方の抗原をゲルに吸着
させた。

Ｂ　調整　Ａ　ｏｕｔは逆の順序で調製した。ゲルに吸
着した抗原は、ＨＡｖｖＬ原については２０％リン酸ク
エン酸溶液とワクチンを１＝１に混合して、また、１１
　Ｂ　Ｓ抗原については１０％リン酸クエン酸溶液とワ
クチンを９＝１に混合してアルミゲルを溶解し、ＨＡＶ
−Ａｇ量はＥＬＩＳＡ法によって、ＨＢｓ−Ａｇ量はＲ
１＾法によって測定した。この結果、本条件においては
投入した、ＨＢｓ−Ａｇのほとんどがゲルに吸着してい
ることが判明した。また、ＨＡＹ−Ａｇのゲルからの溶
出量は約６０％と低値を示したが、一部を除き上清中に
は抗原は検出されていないため、ＨＡＶ−Ａｇ７１１Ｊ
定用のＥＬＩＳＡがゲル溶解液の影響を受けているもの
と考えられる免疫試験は、ＳＰＦマウス（ｄｄＹ）４適
齢♀、１群５匹を用いて腹腔内に接種し、６週目に採血
した。ｌ投与量当りＨＡＶ−Ａｇ　５０ｎｇ、）ＩＢｓ
−Ａｇ　５μｑ、Ａｌｕｍ　１１００ｔｔを用いた０表
９．に結果を示す、　　Ｉｎと　ｏｕｔの組合せによる
混合方法では、両抗原とも　ｏｕｔで結合させた方が未
吸着抗原量が多く、特に後からＡをｏｕｔで結合させた
場合、未吸着抗原が多かった。ｉた、Ｂ　調整＾ｏｕｔ
のＡの抗体力価がＡ単独液状の抗体力価と同等であり、
表８．の結合量のデータを裏付ける結果であった。Ｂ調
整Ａｏｕｔの結合方法を除く他の方法では単独と比べて
抗ＨＡｖ抗体力価に統計学的有意差はみられないものの
、平均抗体価では、Ａ調整　Ｂ　ｏｕｔによる結合方法
が他の方法に比べＡ及びＢともに高い免疫応答を示した
。

表８、抗原の吸着性 ＾＾１ｕｓ＋＋Ｂ　　　　　　　　Ｏ６７，４０，２９
９Ｂ　　Ａｌｕｍ　　＋　八　　　　　　　　　　　　
　〇　　　　　　　　６３．２　　　　　０．１　　　
　　　１００＾　Ａｌｕｍ　　十　Ｂ　　Ａｌｕｍ　　
　　　　　　　Ｏ６４，２０，１１０８＾１ｎＢｏｕｔ
　　　　　　　８．８　　　５３．０　　３．６　　　
８２表９．混合ワクチンの免疫試験 ＾　Ａｌｕｍ　　　　　　　　　　　　　　　　３０９
±１＾＾１ｕｉ＊　＋　８　　　　　　２３４±２５２
３±３ＢＡｌｕＩｌ＋＾　　　　　　２４０±４３７２
±２＾＾ｌｕｇ◆Ｂ＾ｌｕ＋＊　　　　　２２４±１３
８９±２＾調整　Ｂ　ｏｕｔ　　　　　　　４０７±２
９０５±１以上の実施例より、本発明のＡ型及びＢ型肝
炎混合アジュバントワクチンは、ＨＡＹ抗原を５０〜２
００ｎｇ、）Ｉｎｓ抗原を２．５・〜１０μ９の範囲内
で接種投与量を設定し、かつ、ＡＢ両抗原の混合方法を
Ａ　Ｉｎ　Ｂｏｕｔにすれば、混合することで両ウィル
スの免疫応答に干渉作用は惹起されず、むしろ平均抗体
価ではＡＢ両抗ｉ（特にＡ型）の免疫原性に上昇傾向が
みられることが判明した。これらは、本発明の製荊がＡ
Ｂ両型の肝炎ウィルスからの感染を予防するに有効な多
価ワクチンとなることを示唆するものと考えられる。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）不活化Ａ型肝炎ウィルス抗原とＢ型肝炎ウィルス
   表面抗原及びアジュバントからなるＡ型及びＢ型肝炎混
   合アジュバントワクチン。
2. （２）Ａ型肝炎ウィルス抗原がＡ型肝炎ウィルスを感染
   させた該ウィルスに感受性のある細胞を培養することに
   より得られ不活化処理を施された、特許請求の範囲第（
   １）項記載の混合ワクチン。
3. （３）Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原が組換えＤＮＡ手法に
   より形質転換されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原産生能を
   付与された組換え体によつて発現、産生される特許請求
   の範囲第（１）項記載の混合ワクチン。
4. （４）前記不活化Ａ型肝炎ウィルス抗原とＢ型肝炎ウィ
   ルス表面抗原を最終濃度で各々５０〜１００ｎｇ／ｍｌ
   及び２．５〜１０μｇ／ｍｌになるように混合し、これ
   を１００〜４００μｇ／ｍｌのアルミニウムゲルに吸着
   させた特許請求の範囲第（１）項記載の混合ワクチン。
5. （５）前記不活化Ａ型肝炎ウィルス抗原を含むバッファ
   ー中に塩化アルミニウムを加え、水酸化ナトリウムでｐ
   Ｈ７．１〜７．３に調整してゲルを形成させ、その後前
   記Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原をゲルに吸着させることを
   特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載の混合ワクチ
   ン。