JP2022513001A

JP2022513001A - Ｂ型肝炎の治療のための免疫原性組成物

Info

Publication number: JP2022513001A
Application number: JP2021525603A
Authority: JP
Inventors: デビッド，エヴァンダーアンダーソン，; タンヴィールアハメド，
Original assignee: ヴァリエーションバイオテクノロジーズインコーポレイテッド
Priority date: 2018-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2022-02-07
Also published as: WO2020099927A1; CN113423423A; IL283039A; IL314712A; BR112021009234A2; MX2021005588A; IL283039B1; KR20210151047A; CA3119581A1; US20230079703A1; EP3880244A4; CN113423423B; EP3880244A1; ZA202103976B; US12128100B2

Abstract

本開示は、Ｂ型肝炎を患う対象におけるＴｈ１細胞応答の誘導に有用な組成物及び方法を提供する。本明細書に記載の通り、本開示の組成物は、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質を有するＨＢｓＡｇ並びにリン酸アルミニウムアジュバントを含む。好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、少なくとも２０μｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇ抗原を含み、非吸着抗原の量が、少なくとも３０％である。【選択図】なし

Description

[0002]本発明は、免疫原性組成物、特にＢ型肝炎感染症の治療に有用な免疫原性組成物の分野である。

[0003]Ｂ型肝炎は、急性及び慢性肝臓疾患の原因物質であるウイルス感染症である。Ｂ型肝炎は、ヒトにおいて感染者の血液又は他の体液との接触によって伝染する。Ｂ型肝炎感染症は、まん延しており、世界的に２億５０００万人以上に慢性肝臓疾患を引き起こし、１年に１００万人近く死亡する重大な健康問題である（ＧｌｏｂａｌＨｅｐａｔｉｔｉｓＲｅｐｏｒｔ２０１７年、世界保健機構）。感染すると、Ｂ型肝炎は、ほとんどの人で徴候が全くない疾患の急性期を引き起こす。徴候を示す人々は、黄疸、疲労及び腹痛を経験し、罹患者のごく一部は致死的であり得る急性肝臓不全を経験する。Ｂ型肝炎による感染後、患者の免疫系がウイルスを排除して治癒する場合もあり、又は患者が慢性Ｂ型肝炎感染症を発症する場合もある。慢性的に感染した成人の３０％が肝硬変及び／又は肝臓がんを最終的に発症するので、慢性Ｂ型肝炎の結果は重大である。慢性疾患を発症する可能性は年齢とともに減少し、乳児の慢性感染の可能性は９０％であり、一方で健常な成人の可能性は５％～１０％しかない。

[0004]Ｂ型肝炎感染症に対するワクチンが探究されてきたが、慢性Ｂ型肝炎患者に対する治療の改善、特に対象において細胞性免疫応答の増強を引き出すことができる治療の必要性が存在する。

[0005]Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２ドメインを含むＨＢｓＡｇ抗原及びリン酸アルミニウムアジュバントを含む免疫原性組成物、本開示の免疫原性組成物の使用、本開示の免疫原性組成物を投与することによってＴｈ１細胞応答を誘導する方法、並びに本開示の免疫原性組成物を投与することによってＢ型肝炎感染症を治療する方法に関する様々な実施形態が提供される。

[0006]一部の実施形態において、本開示は、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＳ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質）を含むＨＢｓＡｇエンベロープ抗原並びにリン酸アルミニウムアジュバントを含む免疫原性組成物を提供する。好ましい実施形態において、本開示は、少なくとも約２０μｇ／ｍＬ（例えば、少なくとも約３０μｇ／ｍＬ、少なくとも約４０μｇ／ｍＬ、少なくとも約５０μｇ／ｍＬ又は少なくとも約６０μｇ／ｍＬ）の、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２ドメインを含むＨＢｓＡｇエンベロープ抗原並びにリン酸アルミニウムアジュバントを含む免疫原性組成物を提供し、非結合抗原の量は、少なくとも３０％（例えば、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又はより多く）である。特に好ましい実施形態において、本開示は、約２０μｇ／ｍＬ～６０μｇ／ｍＬ（例えば、約２０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ、又は約６０μｇ／ｍＬ）の、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２ドメインを含むＨＢｓＡｇ抗原並びにリン酸アルミニウムアジュバントを含むワクチン製剤を提供し、非結合抗原の量は、少なくとも約３０％（例えば、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又はより多く）である。

[0007]一部の実施形態において、本開示の免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムアジュバントとして存在するアルミニウムを６２．５μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬ含む。好ましい実施形態において、本開示の免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウムを含む。特に好ましい実施形態において、本開示の免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウム並びに２０μｇ／ｍＬの、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質の３つ全てを有するＨＢｓＡｇ抗原を含む。

[0008]別の実施形態において、本開示は、対象においてＴｈ１応答を引き出すための免疫原性組成物を提供し、前記組成物は、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質を含むＨＢｓＡｇエンベロープ抗原並びにリン酸アルミニウムアジュバントを含む。好ましい実施形態において、本開示は、哺乳動物においてＴｈ１応答を引き出すための免疫原性組成物を提供し、前記組成物は、少なくとも２０μｇ／ｍＬの、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質を含むＨＢｓＡｇエンベロープ抗原並びにリン酸アルミニウムアジュバントを含み、非結合抗原の量が、少なくとも３０％である。特に好ましい実施形態において、本開示は、哺乳動物においてＴｈ１応答を引き出すための免疫原性組成物を提供し、前記組成物は、２０μｇ／ｍＬ～６０μｇ／ｍＬの、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質を含むＨＢｓＡｇ抗原並びにリン酸アルミニウムアジュバントを含み、非結合抗原の量が、少なくとも３０％である。一部の実施形態において、哺乳動物においてＴｈ１応答を引き出すための免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムアジュバントとして存在するアルミニウムを６２．５μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬ含む。好ましい実施形態において、哺乳動物においてＴｈ１応答を引き出すための免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬのアルミニウム並びに２０μｇ／ｍＬ～６０μｇ／ｍＬの、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質を含むＨＢｓＡｇ抗原を含む。特に好ましい実施形態において、哺乳動物においてＴｈ１応答を引き出すための免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬのアルミニウム並びに２０μｇ／ｍＬの、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質を含むＨＢｓＡｇ抗原を含む。

[0009]別の実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象においてＢ型肝炎を治療するための免疫原性組成物を提供し、前記組成物は、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質を含むＨＢｓＡｇエンベロープ抗原並びにリン酸アルミニウムアジュバントを含む。好ましい実施形態において、本開示は、B型肝炎の治療を必要とするヒト対象においてＢ型肝炎を治療するための免疫原性組成物を提供し、前記組成物は、少なくとも２０μｇ／ｍＬの、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質を含むＨＢｓＡｇエンベロープ抗原並びにリン酸アルミニウムアジュバントを含み、非結合抗原の量が、少なくとも３０％である。特に好ましい実施形態において、本開示は、B型肝炎の治療を必要とするヒト対象においてＢ型肝炎を治療するための免疫原性組成物を提供し、前記組成物は、２０μｇ／ｍＬ～６０μｇ／ｍＬの、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質を含むＨＢｓＡｇ抗原並びにリン酸アルミニウムアジュバントを含み、非結合抗原の量が、少なくとも３０％である。一部の実施形態において、B型肝炎の治療を必要とするヒト対象においてＢ型肝炎を治療するための免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムアジュバントとして存在するアルミニウムを６２．５μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬ含む。好ましい実施形態において、B型肝炎の治療を必要とするヒト対象においてＢ型肝炎を治療するための免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬのアルミニウム並びに２０μｇ／ｍＬ～６０μｇ／ｍＬの、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質を含むＨＢｓＡｇ抗原を含む。特に好ましい実施形態において、それを必要とするヒト対象においてＢ型肝炎を治療するための免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬのアルミニウム並びに２０μｇ／ｍＬ μｇ／ｍＬの、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質を含むＨＢｓＡｇ抗原を含む。

[0010]本開示は、Ｂ型肝炎感染症を治療することを目的とする医薬組成物の調製における本開示の免疫原性組成物のうちの少なくとも１つの使用も包含する。

[0011]本開示は、医薬組成物を必要とする対象に投与するための本開示の免疫学的組成物を含む医薬組成物を更に提供する。

[0012]本開示は、本開示の組成物の治療上有効な量を投与するステップを含む、哺乳動物でＴｈ１応答を誘導するための方法も提供する。

[0013]本開示は、本開示の組成物の治療上有効な量を、Ｂ型肝炎感染症を必要とする対象に投与するステップを含む、Ｂ型肝炎感染症、特に慢性Ｂ型肝炎感染症を治療するための方法も提供する。

[0014]本明細書に記載される態様又は実施形態のいずれかにおいて、組成物は、Ｓタンパク質（例えば、配列番号１のアミノ酸配列に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む又はそれからなるＳタンパク質）；Ｐｒｅ－Ｓ２タンパク質（例えば、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む又はそれからなるＰｒｅ－Ｓ２タンパク質）；及びＰｒｅ－Ｓ１タンパク質（例えば、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む又はそれからなるＰｒｅ－Ｓ１タンパク質）を含むことができる。本明細書に記載される実施形態は、約７５～９０重量％のＳタンパク質、約２～８重量％のＰｒｅ－Ｓ１タンパク質及び約５～１５重量％のＰｒｅ－Ｓ２タンパク質（例えば、８３±３．３％のＳタンパク質、６±３％のＰｒｅ－Ｓ１タンパク質、及び１１±３％のＰｒｅ－Ｓ２タンパク質）を含み得る。

[0015]本開示の他の特徴、目的及び効果は、あとに続く詳細な説明において明らかになる。しかしながら、その詳細な説明は、本開示の実施形態を示すが、例示のために与えられるものであり、限定するものでないことは理解されるべきである。本開示の範囲内にある様々な変更及び改変は、詳細な説明から当業技術者にとって明らかになろう。

［配列のリスト］
[0016]以下は、本明細書において参照される配列のリストである：
[0017]

[0018]

[0019]配列番号３は、ＨＢｓＡｇアミノ酸配列の大型タンパク質である：
MGLSWTVPLE WGKNQSTSNP LGFFPDHQLD PAFGANSNNPDWDLNSNKDH
WPQANQVGVG AFGPGFTPPH GGLLGWSSQA QGTLHTVPAVPPPASTNRQT
KRQPTPISPP LRDSHPQAMQ WNSTAFHQAL QHPRVRGLYFPAGGSSSGTV
NPAQNIASHI SSISSRTGDP APNMENITSG FLGPLLVLQAGFFLLTRILT
IPQSLDSWWT SLNFLGGSPV CLGQNSQSPT SNHSPTSCPPICPGYRWMCL
RRFIIFLFIL LLCLIFLLVL LDYQGMLPVC PLIPGSTTTSTGPCKTCTTP
AQGNSMFPSC CCTKPTDGNC TCIPIPSSWA FAKYLWEWGSVRFSWLSLLV
PFVQWFVGLS PTVWLSVIWM MWYWGPNLYN ILSPFIPLLPIFFCLWVYI

[0020]本出願の発明者らは、Ｔｈ１細胞免疫応答の誘導に有効な改善された治療的Ｂ型肝炎ワクチンを作製した。

[0021]Ｂ型肝炎ウイルスは、ウイルスのヘパドナウイルス科ファミリーの、オルトヘパドナウイルス属のメンバーである。Ｂ型肝炎ウイルスは、ヌクレオカプシド及びＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の外殻を含む小型で、エンベロープを持つＤＮＡウイルスである。ＨＢｓＡｇ抗原は、ウイルスＤＮＡ上の同じオープンリーディングフレーム（「ＳＯＲＦ」）によって全てコードされる３つの関連するエンベロープタンパク質で構成される。これら３つのタンパク質は、同じＣ末端を有するが、ＳＯＲＦを３つの領域に分ける３つのインフレームのＡＴＧ開始コドンが存在するため、Ｎ末端で異なっている。Ｓ又は「小型」エンベロープタンパク質は、最も豊富にあり、２２６アミノ酸で最も小さい。Ｍ又は「中型」表面タンパク質は、Ｓタンパク質を含み、ｐｒｅ－Ｓ２として公知の５５アミノ酸からなる追加のタンパク質ドメインを有する。Ｌ又は「大型」タンパク質として公知のタンパク質は、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ２、及び１１８アミノ酸を有するｐｒｅ－Ｓ１として公知の第３のタンパク質ドメインからなる。Ｂ型肝炎のウイルスゲノムは、複製エラーを起こしやすく、その結果多くの遺伝子型及び遺伝子バリアントが存在する。多くの突然変異に加えて、少なくとも１０個の異なる遺伝子型のウイルスが同定されており、その幾つかはＳ及びＰｒｅ－Ｓドメインに起こっている。従って、多くの配列変化が、３つのタンパク質ドメインのそれぞれに存在する。

[0022]一部の実施形態において、本明細書に記載されるＳタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む又はそれからなる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＳタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む又はそれからなる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＰｒｅ－Ｓ２タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含む又はそれからなる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＰｒｅ－Ｓ２タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む又はそれからなる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＰｒｅ－Ｓ１タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含む又はそれからなる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＰｒｅ－Ｓ１タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む又はそれからなる。

[0023]Ｂ型肝炎感染症に対する有効な治療は、発見されていない。急性感染症は、床上安静で治療される。慢性感染症は、抗ウイルス薬、具体的にはテノホビル、ラミブジン若しくはエンテカビルなどのヌクレオシド系抗ウイルス薬、又はペグ化インターフェロンアルファ（ＰＥＧ－ＩＦＮα）で通常治療される。抗ウイルス薬は、肝硬変の進行を遅らせ、肝臓がんの発生率を減少させ得るが、患者からのウイルスの排除を達成できないことが証明されている。更に、抗ウイルス薬は高コストであり、効果を維持するために患者の一生の間続けなければならない。ＰＥＧ－ＩＦＮαは副作用を伴い、約３０％の患者にしか持続的抗ウイルス応答をもたらさない。従って、慢性Ｂ型肝炎に対する薬物治療は、疾患の進行を遅らせることにしか一般に有効でなく、治癒としては成功してこなかった。Ｂ型肝炎ウイルスを排除し、それによって慢性症状を回避するには、患者は、強力で多様な免疫応答を起こさなければならない。特に、強く、特異的なＴ細胞応答が、Ｂ型肝炎のウイルス排除を達成するには必須である［Ｂｅｒｔｏｌｅｔｔｉ及びＲｉｖｉｎｏ（２０１４年）ＣｕｒｒＯｐｉｎＩｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ２７：５２８～５３４頁］。この型の応答は、ほとんど、成熟した免疫系を持つ成人患者のみに見られる［Ｂｅｒｔｏｌｅｔｔｉ及びＧｅｈｒｉｎｇ（２０１３年）ＰＬＯＳＰａｔｈ．９：１～４頁］。

[0024]Ｂ型肝炎感染症の健康への影響の重大さを踏まえて、多くの注目は、疾患の予防に集中した。Ｂ型肝炎に対する予防的ワクチンは、３０年以上にわたって利用可能であり、多くの国で、Ｂ型肝炎に対する広範なワクチン接種が子供に行われる。Ｂ型肝炎に対する第１の予防的ワクチンは、Ｂ型肝炎患者由来の血漿を使用して１９７０年代後半に開発された。改善されたＢ型肝炎ワクチンは、１９８０年代に利用可能になり、ＨＢｓＡｇのＳ－ドメインを発現させるために組換えＤＮＡ技術を使用して酵母細胞において生産された。これらのより最新のワクチンは、第１のワクチンに速やかに取って代わり、今日もなお市場に出ている主要な市販ワクチンである。より進歩したＢ型肝炎ワクチンは、１９９０年代に開発され、哺乳動物細胞において生産され、ＨＢｓＡｇの３つ全てのドメイン、具体的にはＳ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２を含有する。Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２ドメインの存在は、免疫原性応答の増強、並びにウイルス結合及び感染力の阻害と関係していた（米国特許第５，２４２，８１２号）。様々なエンベロープタンパク質の生物学的機能及び成分のそれぞれ（Ｓ、ｐｒｅ－Ｓ２及びｐｒｅ－Ｓ１）に対する免疫応答の性質は、部分的にしか理解されていない。しかしながら、急性Ｂ型肝炎感染症において、Ｐｒｅ－Ｓ１及びｐｒｅ－Ｓ２抗原並びに抗体は、急性感染後の早期に出現し、消滅し、Ｓドメインに対する抗体は、数週間後に出現することが公知である。上記の知見及びＰｒｅ－Ｓ１又はＰｒｅ－Ｓ２ドメイン抗原のいずれかを使用する研究は、ｐｒｅ－Ｓ１及びｐｒｅ－Ｓ２抗原が、Ｓドメインに対する抗体を産生するためのヘルパーＴ細胞の誘導に関係し得ることを示唆した［Ｍｉｌｉｃｈら（１９８５年）ＰＮＡＳ８２８１７０～８１７２頁；Ｍｉｌｉｃｈら（１９８６年）ＪＩｍｍｕｎｏｌ１３７３１５～３２２頁］。

[0025]市販の予防的Ｂ型肝炎ワクチンは、健康な対象、特に若く、免疫系に機能障害のない対象においてＨＢｓＡＧのＳタンパク質ドメインに対する強い抗体応答を成功裏に誘導することが証明されている。しかしながら、慢性Ｂ型肝炎患者において治療的処置としてこれらのワクチンを使用する試みは、不成功であると証明されている。ＨＢｓＡＧＳドメインを単独で並びにＰｒｅ－Ｓ２とＳドメインを一緒に含有するＢ型肝炎ワクチンの治療的効果を測定するために行われた臨床試験は、ワクチンが、Ｂ型肝炎ウイルスの排除を達成し得ないことを示した［Ｐｏｌら、（２００１年）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ３４：９１７～９２１頁］。慢性Ｂ型肝炎感染症を治療するための免疫原性治療の失敗は、「免疫寛容」という現象、すなわち、それによりＢ型肝炎患者の免疫系が、Ｂ型肝炎抗原、特にＨＢｓＡｇへの更なる曝露に応答しなくなる現象に一般に起因する。慢性Ｂ型肝炎患者における免疫寛容は、Ｂ型肝炎抗原のウイルスの大量産生と関係しており、その大量産生は、Ｔ細胞、具体的にはＢ型肝炎特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の消耗の原因となる［Ｂｏｎｉ，Ｃ．ら、（２００７年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：４２１５～４２２５頁］。消耗したＢ型肝炎特異的Ｔ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞の死を促進するプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）を過剰発現する。Ｂ型肝炎ウイルスの量が高い患者において、抗原特異的Ｔ細胞の破壊は、肝臓からのこれら細胞の完全な消失をもたらす可能性がある。その結果、Ｂ型肝炎抗原による刺激に対するＴ細胞応答は減弱する。

[0026]免疫寛容によって示される課題に加えて、ＨＢｓＡｇＳタンパク質だけを含有するＢ型肝炎ワクチンは、大部分の対象においてＴ細胞応答によって細胞性免疫を刺激する能力が弱いため慢性患者からのウイルスの排除を果たし得ない可能性がある。Ｔ細胞応答をより効果的に刺激する試みにおいて、治療的ワクチン接種研究が、慢性Ｂ型肝炎患者においてＰｒｅ－Ｓ１、Ｐｒｅ－Ｓ２及びＳタンパク質ドメインの３つ全てを含有するＢ型肝炎ワクチンを使用して実施された。これら研究は、一部の患者においてＢ型肝炎特異的なＴ細胞応答を示した。しかしながら、おそらく、ワクチンはＴｈ２応答を刺激したが、ＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を刺激しなかったので、効果は一過性であり、疾患の排除をもたらさなかった。［Ｊｕｎｇら、（２００２年）Ｖａｃｃｉｎｅ２０：３５９８～３６１２頁、Ｋｏｓｉｎｋａら（２０１５年）Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ２０４頁］。ＩＬ－４、ＩＬ－５及びＩＬ－１３サイトカインの分泌によって特徴付けられるＴｈ２細胞は、抗体産生を促進し、アレルギー応答と一般に関係しており、ＩＦＮ－γの分泌によって特徴付けられるＴｈ１細胞に比してウイルス感染症に対して有効でない。ＤＮＡワクチンを使用して良好な免疫学的応答を誘導する更なる試みも、持続的応答を達成できなかった［Ｂｅｒｔｏｌｅｔｔｉ及びＧｅｈｒｉｎｇ（２００９年）Ｅｘｐ．Ｒｅｖ、Ｇａｓｔｒｏ．Ｈｅｐ．３：５６１～５６９頁］。

[0027]多くの研究者は、Ｂ型肝炎の根治は何年も先のことであり、治療の組合せを使用することによって、慢性患者は、治療の停止後にＢ型肝炎ウイルス及び疾患の他のマーカーの持続的な減少並びに肝臓がんの発生率の減少を達成する、いわゆる「機能的治癒」を達成することが可能になり得ると結論した［Ｌｏｋら、（２０１７年）Ｊ．Ｈｅｐ．６７：８４７～８６１頁］。機能的治癒を達成するための抗ウイルス性治療単独及び予防的ワクチン単独の失敗のため、一部の研究者は、予防的ワクチンを、ウイルス量を減少させるＢ型肝炎治療と併用することが必要になり得ると結論した。ウイルス量の減少は免疫寛容のレベルを減少させ、それによりワクチン治療の能力を改善して、感染を制御できる免疫応答を誘導し得る［Ｚｏｕｌｉｍ，Ｆ．ら（２０１８年）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｍｅｄ．（２０１５年）：５：ａ２１５０１頁］。例えば、予防的ワクチンとヌクレオシド阻害剤との併用が試みられてきた。しかしながら、現在まで、市販のＢ型肝炎ワクチンを使用する併用療法は、慢性Ｂ型肝炎患者からのウイルス排除の達成に成功していない［Ｖａｎｄｅｐａｐｅｌｉｅｒｅら（２００７年）Ｖａｃｃｉｎｅ５１：８５８５～８５９７頁］。ベトナムの研究において、より新しいワクチンであるゲンヘバックＢ（ＧｅｎｈｅｖａｃＢ）（水酸化アルミニウムアジュバントを含むＰｒｅ－Ｓ１、Ｐｒｅ－Ｓ２及びＳタンパク質ワクチン）とヌクレオシド阻害剤（ラミブジン）とを併用することによって応答性を改善する試みが行われた。この併用は、患者においてウイルスＤＮＡのレベルを減少させるのに個々の療法単独より優れていた。しかしながら、ワクチン治療が中止された後、効果は持続的でなかった。従って、この併用治療は、患者の免疫系を回復してウイルスを効果的に排除することができなかった［Ｈｏａ、（２００９年）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓａｎｄＣｈｅｍｏ．５３：５１３４～５１４０頁］。

[0028]ヌクレオシド阻害剤及び予防的Ｂ型肝炎ワクチンに加えてＰＤ－１活性を遮断する抗体を含むより複雑な３重併用治療が提案されてきた。Ｂ型肝炎と類似のウイルスを使用するウッドチャックモデルにおいてこの３重併用の研究は、わずか１／３の動物にしか有効でなかった［Ｋｏｓｉｎｋａら、（２０１５年）上記：１０３～１１４頁；Ｌｉｕら、Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａ、（２０１４年）２９：１０～１６頁］。更に、この３重併用の有効性は、ヒトでは実証されておらず、３重併用は、高価な治療の使用をおそらく無期限に必要とする。従って、治療目的での従来通りの予防的ワクチンの使用は、他の薬物と併用しても、慢性患者におけるＢ型肝炎に対する機能的治癒として成功したとは証明しなかった。従って、慢性Ｂ型肝炎患者における持続的応答を達成するために、これら患者がウイルスに対するＴ細胞応答を開始する能力を増強する改善された手段を見出さなければならない。

[0029]慢性Ｂ型肝炎を治療するために遺伝子サイレンシング手法を利用するより新しい戦略が現れた。これら治療の例には、ウイルス遺伝子発現、特にＨＢｓＡｇに干渉する低分子干渉ＲＮＡ（ＳｉＲＮＡ）の使用がある。ヌクレオシド阻害剤の様に、これらの治療は、ウイルス量及び分泌されるＨＢｓＡｇのレベルを減少させる潜在性を有しており［Ｗｏｏｄｅｌｌら、（２０１５年）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１：９７３～９８５頁］、その治療が、免疫応答を誘導する治療との併用において有用であり得ることが示唆されてきた［Ｒｅｎら（２０１３年）ＰＬＯＳｏｎｅ８（３）：ｅ５７５２５頁］。しかしながら、この併用の有効性は確立されておらず、抗ウイルス薬による初期の研究の失敗を考えれば、その有効性は、旺盛なＴｈ１細胞応答を刺激する能力がある免疫学的作用物質を含む併用によって決まり得る。

[0030]これまでの試みは、ワクチン製剤を改変することによってＢ型肝炎ワクチンに対するＴ細胞応答を増強させるために行われてきた。広く使用されているＢ型肝炎ワクチン、エンゲリックスＢ（ＥｎｇｅｒｉｘＢ）（登録商標）、並びにＳ／Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２を含有するＢ型肝炎ワクチン、Ｓｃｉ－Ｂ－Ｖａｃ（登録商標）を含め、市販のＢ型肝炎ワクチンのほとんどは、水酸化アルミニウムアジュバントと共に製剤化される。水酸化アルミニウムアジュバントは、「ミョウバン」と非公式に呼ばれることもあるアルミニウム含有アジュバントのファミリーのうちの１つである（但し、単語「ミョウバン」は、ジフテリアトキソイドに対する初期アジュバントとして使用されたが、製造の困難さのため断念された水和硫酸アルミニウムカリウム［ＫＡｌ（ＳＯ_４）_２・１２Ｈ_２Ｏ］を記載するためにより正しく使用される）。アルミニウム系アジュバントは、１９３２年以降ヒトワクチンに使用されており、安全性の長期記録を有するが、その作用機序は完全には理解されていない。アルミニウム系アジュバントは、樹状細胞の活性化によって免疫応答を増強させると一般に信じられている。

[0031]アルミニウム系アジュバントをよりよく理解し、その有効性を増強させるために研究が行われてきた。最もよく使用されている２つのアルミニウム系アジュバントは、「リン酸アルミニウム」及び「水酸化アルミニウム」と呼ばれ、水酸化アルミニウムアジュバントが、商業的に最も広く使用されている。水酸化アルミニウムアジュバントは、Ａｌ（ＯＨ）_３ではなく、結晶水酸化アルミニウムより大きい表面積を有する結晶オキシ水酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）である。リン酸アルミニウムアジュバントは、実際に、水酸化アルミニウムアジュバントの水酸基のいくつかがリン酸基によって置き換えられている非晶質リン酸ヒドロキシアルミニウム［Ａｌ（ＯＨ）_ｘ（ＰＯ４）_ｙ］である。リン酸アルミニウムアジュバントの表面は、Ａｌ－ＯＨ及びＡｌ－ＯＰＯ_３基で構成されている。それらは化学的に類似しているが、２つのアジュバントの化学的特性は異なっている。水酸化アルミニウムアジュバントは、結晶構造、大きい表面積及び中性ｐＨで正電荷（＋３０ｍボルト）を有する。リン酸アルミニウムアジュバントは非晶質であり、中性ｐＨで負電荷（およそ－２０ｍボルト）を有する。また、リン酸アルミニウムアジュバントは、注射後により容易に溶解することが示されている。

[0032]抗原がアルミニウム系アジュバントに「吸着する」とは、抗原がアジュバントに付着し、表面に層を形成することを意味する。抗原は、静電相互作用、ファンデルワールス力及びリガンド（主にリン酸）交換によってアルミニウム系アジュバントの表面に吸着する。リガンド交換は、最も強い吸着力であり、静電的斥力が存在する場合でも起こり得る。ＨＢｓＡｇは、抗原内のリン酸基とアルミニウム系アジュバント内の表面ヒドロキシル間のリガンド交換によってアジュバントの水酸化ミネラル表面に強く吸着するリン酸基を含有するリン脂質で主に構成される。静電誘引は、ＨＢｓＡｇにとって支配的な吸着力ではない［Ｉｖｅｒら、（２００４年）Ｖａｃｃｉｎｅ、２２：１４７５～１４７９頁］。

[0033]伝統的に、吸着は注射部位で抗原を保持し、免疫系へ抗原を持続放出する「デポ」効果を生むため免疫賦活化効果に重要であると一般に考えられたので、アルミニウム系アジュバントへの抗原の吸着は意図的に最大化された。更に、抗原の完全な吸着により、長期貯蔵中のワクチン製剤のより高い長期安定性がもたらされる。エンゲリックスＢ（登録商標）は、水酸化アルミニウムアジュバントからのアルミニウム２５０μｇ当たりＨＢｓＡｇ１０μｇを含有する。この比、ＨＢｓＡｇ０．０４μｇ／μｇアルミニウムは、完全な吸着を確実にする。しかしながら、最近になって、抗体とＴ細胞免疫、有効性及び吸着の間の関係が不明確になってきた。免疫したマウスにおける抗体産生に対する水酸化アルミニウムへのＨＢｓＡｇの結合の緊密さの効果に関する研究は、アジュバントに対して最も緊密に吸着する抗原を含むワクチン製剤が、最も低い抗体応答を生じることを示した。［Ｃｌａｐｐら（２０１１年）Ｊ．ＰｈａｒｍＳｃｉ１００（２）３８８～４０１頁］。ＨＢｓＡｇＳ抗原ドメインを使用したある研究は、より高いリン酸含有量を有するアルミニウム系アジュバントが、吸着の減少、より弱い抗原結合及びより大きな抗体応答を示すことを示した［Ｅｇａｎら、（２００９年）Ｖａｃｃｉｎｅ２７：３１７５～３１８０頁］。同様に、リン酸アルミニウムアジュバントを含有する単一抗原のＢ型肝炎ワクチンは、水酸化アルミニウムアジュバントと共に製剤化された類似のワクチンより大きな抗体応答を引き出し、より低いアジュバント濃度で有効であった［Ｆａｚｅｌｉら、（２００８年）ＤＡＲＵ３：１４３～１４８頁］。少なくとも１つの研究が、アルミニウム系アジュバントによる抗原の吸着は、アジュバントが抗体応答を増強させるのに必要でないことを示しており、吸着ではなく炎症が免疫原性と関係するという結論に至った［Ｎｏｅら、（２０１０年）Ｖａｃｃｉｎｅ２８：３５８８～３５９４頁］。改変されたアルミニウム組成物及び量が、Ｔｈ２対Ｔｈ１Ｔ細胞免疫に影響を与える程度についてはほとんど知られていないが、より高い抗体応答を報告している研究は、Ｔｈ２の増強を促進したが、Ｔｈ１応答を促進しなかったと当業技術者に推測されるであろう。

[0034]アルミニウム系アジュバントが、免疫原性を改善することは周知であるが、アルミニウム系アジュバントが、主に抗体産生を増強するように作用し、従って、抗体との相互作用によって死滅又は阻害される病原体の標的化に最も有効であることも周知である。アルミニウム系アジュバントは、Ｔｈ１応答を引き出す効果は無く、むしろ抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原の誘引及び取り込みを改善することによって炎症性、Ｔｈ２応答を誘導すると一般に考えられている。従って、アルミニウム系アジュバントは、Ｔｈ１細胞免疫のより優れた刺激薬の探索には利用されてこなかった。

[0035]細胞性又は「自然」免疫応答を改善するために、より最新のアジュバントがＢ型肝炎ワクチンに添加された。そのような最新のアジュバントは、エンドトキシン、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、細菌リポ糖類である。国際公開第９３／１９７８０号は、アジュバントの併用によるＨＢｓＡｇワクチンによるＴ細胞応答の刺激について開示している。Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて水酸化アルミニウムに吸収されたＨＢｓＡｇによる免疫化後、いかなるＴ細胞応答（ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－４によって測定される）も観察されなかった。しかしながら、３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ－ＭＰＬ）が製剤に添加された場合、Ｔｈ１細胞応答が観察された（ＩＬ－２及びＩＦＮ－γによって測定される）。ＨＢｓＡｇ／３ＤＭＰＬワクチン製剤において水酸化アルミニウムの代わりにリン酸アルミニウムが使用された場合、同じ研究グループによって後に出願された特許、米国特許第５，９７２，３４６号は、液性免疫原性の改善を開示した。この発見は、商標名フェンドリックス（Ｆｅｎｄｒｉｘ）（登録商標）で販売される市販ワクチンの開発に至る。その後の研究は、フェンドリックスが、Ｔｈ１細胞性免疫応答を引き出すことを示した。しかしながら、フェンドリックスは、高価な製品であり、ヨーロッパにおいて腎臓欠損症を患う年齢１５歳超の患者における使用にのみ承認された。更に、他の研究において、３Ｄ－ＭＰＬアジュバントによる効果は、一時的なもので、注射部位及び局部リンパ節にほとんど限定されることが示された（ＤｅＰａｓｑｕａｌｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ２０１５年）。

[0036]より最近には、米国特許出願公開第２０１６０１３６２６４号は、Ｂ型肝炎抗原断片及びアジュバントからなるＢ型肝炎ワクチンを開示しており、そのアジュバントは、マウスにおいてＴｈ１応答を媒介することができるＣｐＧモチーフを含む免疫調節性ＤＮＡ配列からなる。しかしながら、Ｂ型肝炎ワクチンにおけるＣｐＧ系アジュバントの使用について安全性に対する懸念が生じ、販売認可は、全管轄区域において得られなかった。

[0037]本出願の発明者らは、３つ全てのＨＢｓＡｇタンパク質（Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅＳ－２）及びリン酸アルミニウムアジュバントを含む免疫原性組成物が、著しい量の非結合抗原を有する場合、哺乳動物においてＴｈ１細胞応答を刺激するのに有効であることを発見した。本開示の組成物の物理化学的分析は、アジュバントがＨＢｓＡｇ抗原に弱く結合していることを示す。本明細書の実施例において更に実証されているように、この結合は、水酸化アルミニウムアジュバントと処方されたＢ型肝炎ワクチンに見られるより有意に弱い。またこの結合は、より低い比のＨＢｓＡｇ抗原対リン酸アルミニウムアジュバントを有するＨＢｓＡｇ抗原及びリン酸アルミニウムアジュバントを含む製剤に見られるより有意に弱い。

[0038]驚くべきことに、本開示の組成物は、ＭＰＬ又はＣｐＧなど細胞性免疫を刺激することが公知である別の、より最新のアジュバントの非存在下で哺乳動物においてＴｈ１細胞応答の増強を誘導した。これらＴｈ１細胞応答は、異なる免疫学的マーカー、具体的には抗原特異的ＩＦＮ－γ応答及びＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比を使用して実験的に実証された。このことは、Ｔｈ１が、アルミニウム系アジュバント単独と処方される従来通りのＢ型肝炎ワクチンに全く応答しないことを示した以前の研究を考えると驚くべきである。

[0039]更に驚くべきことに、組成物において抗原の量と比較して濃度を有意に減少させたリン酸アルミニウムアジュバントが使用された場合、本開示の免疫原性組成物は、市販の予防的ワクチンと比較してＴｈ１細胞応答の増強に有効である。特に、本開示の組成物は、最も広く使用されている市販の予防的ワクチンと比較して、５０％低いリン酸アルミニウムアジュバント対抗原比でＴｈ１応答を増強するのに有効である。

[0040]本開示のワクチンは、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質の３つ全てを含むＨＢｓＡｇを含む。ＨＢｓＡｇは、Ｂ型肝炎の任意の遺伝子型、系統又は分離株に由来してもよい。更に、ＨＢｓＡｇは、天然のＨＢｓＡｇ又は修飾されたＨＢｓＡｇに由来してもよい。ＨＢｓＡｇ抗原は、感染した対象、培養細胞又は組織培養から採集される生体試料（例えば血液、血漿、血清、精液、唾液、組織切片、生検標本、等）などＢ型肝炎ウイルスの天然の供給源から単離されてもよい。ＨＢｓＡｇは、細胞において組換え技術を使用して生産されてもよい。一部の実施形態において、ＨＢｓＡｇは、哺乳動物細胞株において発現される。一部の実施形態において、ＨＢｓＡｇは、チャイニーズハムスター卵巣細胞株において発現される。Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２ドメインを含むＨＢｓＡｇ抗原は、米国特許第５，２４２，８１２号に開示されている方法を使用して生産されてもよい。異なるＨＢｓＡｇをコードしているヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋなどのデータバンク及び既刊の文献［例えばＦｕｋｉｍｏｒｉら（１９９０年）１８Ｎｕｃ．ＡｃｉｄＲｅｓ４５８７頁；Ｖａｕｄｉｎら（１９８８年）６９Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ．１３８３～１３８９頁］中に見ることができる。ＨＢｓＡｇの大型タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示される。好ましい実施形態において、本開示の免疫原性組成物は、２０μｇ／ｍＬ又はより多くの、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質の３つ全てを有するＨＢｓＡｇ抗原を含む。別の好ましい実施形態において、本開示の免疫原性組成物は、２０μｇ／ｍＬ～６０μｇ／ｍＬの、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質の３つ全てを有するＨＢｓＡｇ抗原を含む。

[0041]本開示のワクチン製剤は、リン酸アルミニウムアジュバントを更に含む。本開示の使用に適したリン酸アルミニウムアジュバントの一例は、Ｂｒｅｎｎｔａｇによって製造されるリン酸アルミニウム湿性ゲル懸濁液のアデュホス（Ａｄｊｕ－Ｐｈｏｓ）（登録商標）である。

[0042]実施例２に示すように、水酸化アルミニウムアジュバントを使用するＨＢｓＡｇワクチン製剤（商標Ｓｃｉ－Ｂ－Ｖａｃで販売されている、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２抗原の３つ全てを含有するワクチンの市販の予防的製剤を含める）は、非吸着抗原を５％未満含有する。表３に示すように、予防的ワクチンに使用されるのと同量の抗原、１０μｇ／ｍＬの、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－２ドメインの３つ全てを有するＨＢｓＡｇ抗原、並びに水酸化アルミニウムではなくリン酸アルミニウムアジュバントを含有する製剤の非吸着抗原の量は、増大しておらず、実際、表３に示すように、この製剤中に吸着されていない抗原は全く存在しなかった。リン酸アルミニウムアジュバントが、水酸化アルミニウムアジュバントより弱くＨＢｓＡｇ抗原に結合することは公知なので、このことは驚きであった。にもかかわらず、抗原濃度１０μｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇにおいて、リン酸アルミニウムアジュバントと水酸化アルミニウムアジュバントの両方を使用した際に、類似レベルの吸着が見られた。

[0043]しかしながら、驚くべきことに、濃度の増大したＨＢｓＡｇ抗原（Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質を含む）及び同濃度のリン酸アルミニウムアジュバントを有する製剤は、非吸着抗原の含有量の実質的増大を実証した。リン酸アルミニウムアジュバントからの５００μｇ／ｍＬのアルミニウム含有量は、２．２７ｍｇ／ｍＬのリン酸アルミニウムアジュバントに等しい。２０μｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇ濃度及びリン酸アルミニウムアジュバントとして存在する５００μｇ／ｍＬのアルミニウムの場合、非吸着抗原の量は、５４．８％であった。４０μｇ／ｍＬＨＢｓＡｇ濃度及びリン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウムの場合、非吸着抗原の量は、３５．８％であった。６０μｇ／ｍＬＨＢｓＡｇ濃度及びリン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウムの場合、非吸着抗原の量は、４７．４％であった。抗原吸着の低下は、水酸化アルミニウムアジュバントを含む同じＨＢｓＡｇ抗原濃度を含有する製剤では観察されなかった。実際のところ、水酸化アルミニウムアジュバントが使用された場合、抗原濃度が２倍の２０μｇ／ｍＬにされた場合でも、非吸着抗原の量は５％未満のままであった（表３を参照のこと）。従って、リン酸アルミニウムアジュバントの使用により、ＨＢｓＡｇ濃度の増大とともに非吸着抗原の著しく、驚くべき増加が得られた。

[0044]従って、本開示の好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムアジュバントとして６２．５～５００μｇ／ｍＬのアルミニウムを含む。特に好ましい実施形態において、本開示の免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬのアルミニウム並びに２０μｇ／ｍＬ～60μｇ／ｍＬの、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質の３つ全てを有するＨＢｓＡｇ抗原を含む。特に好ましい実施形態において、本開示の免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬのアルミニウム並びに２０μｇ／ｍＬの、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質の３つ全てを有するＨＢｓＡｇ抗原を含む。

[0045]マウスにおけるｉｎｖｉｖｏ研究を使用して、本開示の本発明者らは、本開示の免疫原性組成物がマウスにおいてＴｈ１応答を増強させるのに有効であることを実証した。水酸化アルミニウムアジュバントが使用された場合、抗原濃度が有意に増大された場合でも、ＨＢｓＡｇ組成物においてＴｈ１応答の増強は見られなかったので、この効果は予想外である。具体的には、実施例３に示すように、マウスにおいて水酸化アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬのアルミニウムを含む、より高い２０μｇ／ｍＬ濃度のＨＢｓＡｇ抗原（Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質を含む）は、市販の予防的ワクチン（１０μｇ／ｍＬの同じ抗原及び水酸化アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬのアルミニウムを有する）と比較してＴｈ１Ｔ細胞免疫を増強させなかった。しかしながら、実施例４及び５に更に記載されるように、ワクチンの予防的製剤（１０μｇ／ｍＬの同じ抗原及び水酸化アルミニウムアジュバントからの５００μｇ／ｍＬのアルミニウムを有する）と直接比較した場合、リン酸アルミニウムアジュバントからの５００μｇ／ｍＬのアルミニウムと共に処方された抗原２０μｇを有する本開示の好ましい免疫原性組成物は、有意により高いＴｈ１細胞応答を引き出した。更にまた、実施例６に記載の通り、ワクチンの予防的製剤（１０μｇ／ｍＬの同じ抗原及び水酸化アルミニウムアジュバントからの５００μｇ／ｍＬのアルミニウムを有する）と直接比較した場合、リン酸アルミニウムアジュバントからの５００μｇ／ｍＬアルミニウムと共に処方された抗原２０μｇ、４０μｇ及び６０μｇを有する本開示の免疫原性組成物の全てが、より高いＴｈ１細胞応答を引き出した。これらの結果は、本開示の好ましい免疫原性組成物においてアジュバント：抗原比を単に改変することは、Ｔｈ１Ｔ細胞免疫を増強させるのに充分でなかったことを示す。むしろ、抗原の濃度とアジュバントの型（水酸化アルミニウムアジュバントよりもむしろリン酸アルミニウムアジュバント）の両方を変えることが、Ｔｈ１Ｔ細胞免疫を増強させるために必要である。Ｔｈ１免疫の増強は、非吸着抗原の量が増大した組成物においてのみ見られた。

[0046]本開示は、患者においてＢ型肝炎感染症に対するＴｈ１細胞免疫応答を誘導する又は増強させるための医薬組成物を調製するための本開示の免疫原性組成物の使用も提供する。本開示は、患者においてＢ型肝炎感染症、特に慢性Ｂ型肝炎感染症を治療するための薬物を調製するための本開示の免疫原性組成物の使用を更に提供する。

[0047]本開示は、慢性Ｂ型肝炎感染症を患う個人における治療適用に有用な医薬組成物も提供する。

[0048]特定の実施形態において、提供される医薬組成物は、非経口的送達用、例えば注射に製剤化されてもよい。これらの実施形態において、製剤は、筋肉注射に適していてもよい。

[0049]一部の実施形態において、医薬組成物は、注射に適している液体剤形で提供される。一部の実施形態において、医薬組成物は、粉末剤（例えば、凍結乾燥及び／又は無菌化される）として、任意選択で、真空下で提供され、その医薬組成物は、注射前に水性希釈剤（例えば、水、緩衝液、食塩水、等）で再構成される。一部の実施形態において、医薬組成物は、水、ゲル、塩化ナトリウム溶液、酢酸ナトリウム溶液、ベンジルアルコール溶液、リン酸緩衝食塩水、等に希釈及び／又は再構成される。一部の実施形態において、粉末剤は、水性希釈剤と穏やかに混合されなければならない（例えば、振盪しない）。

[0050]一部の実施形態において、提供される医薬組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容できる賦形剤（例えば、保存剤、不活性希釈剤、分散剤、界面活性剤及び／又は乳化剤、緩衝剤、等）を含む。適切な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、ショ糖、トレハロース、グリセロール、エタノール又は類似物、及びその組合せがある。ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、２００６年）は、医薬組成物を処方するのに使用される様々な賦形剤及びその調製のための公知の技術を開示している。任意の従来の賦形剤媒体が、何らかの望ましくない生物学的効果を生じる、さもなければ医薬組成物の他の任意の成分（複数可）と有害な様式で相互作用するなどにより物質又はその誘導体と適合しない場合を除き、賦形剤の使用は、本開示の範囲内であると考えられる。一部の実施形態において、医薬組成物は、１つ又は複数の保存剤を含む。一部の実施形態において、医薬組成物は、保存剤を含まない。

[0051]本開示による医薬組成物は、大量に、単一単位用量として、及び／若しくは複数の単一単位用量として調製、包装、並びに／又は販売されてもよい。本明細書では、「単位用量」とは、活性成分の所定量を含む医薬組成物の別々の量である。活性成分の量は、対象に投与しようとする用量に一般に等しい及び／又は、例えばそのような用量の１／２若しくは１／３など、そのような用量の都合の良い画分である。

[0052]本明細書に記載される医薬組成物は、対象においてＴｈ１免疫応答を誘導する又は増強させるのに必要若しくは十分なように、そのような量、及びそのような期間で一般に投与されることになる。投薬レジメンは、単回用量又はある期間にわたる複数回用量からなってもよい。投与される組成物の正確な量は、対象間で変動する場合があり、いくつかの因子によって決まり得る。従って、一般に、使用される正確な用量は、処方医師によって決定されることになり、対象の体重及び投与経路だけでなく、対象の年齢並びに徴候の重症度によっても決まることになることは、認識されよう。特定の実施形態において、ワクチン組成物の特定の量は、単回用量として投与される。特定の実施形態において、組成物の特定の量は、複数の用量として投与される。

[0053]本開示は、哺乳動物に本開示の組成物を投与するステップを含む、哺乳動物においてＢ型肝炎感染症に対するＴ細胞免疫応答を誘導する又は増強させる方法も提供する。免疫応答は、好ましくは、Ｂ型肝炎抗原に対するＴｈ１応答である。投与は、任意の手段、例えば筋肉内注射による注射によって実行され得る。注射は、従来通りの注射器及び注射針又は当業者に利用可能な他の任意の適当なデバイスで行うことができる。

[0054]本開示は、本開示の組成物の治療上有効な量を投与するステップを含む、それを必要とする対象においてＢ型肝炎感染症、特に慢性Ｂ型肝炎感染症を治療する方法も提供する。投与は、任意の手段、例えば筋肉内注射による注射によって実行され得る。注射は、従来通りの注射器及び注射針又は当業者に利用可能な他の任意の適当なデバイスで行うことができる。

[0055]必要に応じて、本開示の方法又は使用は、Ｂ型肝炎感染症及び／又はＢ型肝炎媒介性疾患に対する１つ若しくは複数の従来通りの治療的治療と組み合わせて実施され得る。本開示の組成物の投与は、本開示の組成物の投与に先行しても、それと同時又はその後であってもよい。本開示の組成物と組み合わせられ得る治療的処置は、Ｂ型肝炎ウイルスの量を減少させる目的で本開示の免疫原性組成物の投与前又は同時に投与されてもよい。本開示の組成物と組み合わせられ得るＢ型肝炎治療の代表的な例には、ポリメラーゼ阻害剤、ＲＮａｓｅＨ阻害剤、ヌクレオシド類似体、ヌクレオチド類似体、ＴＬＲアゴニスト、Ｎ－グリコシル化阻害剤、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗Ｂ型肝炎抗体、カプシド阻害剤、コアタンパク質阻害剤、コアアッセンブリモジュレーター、核酸ポリマーを含めたＳ抗原低減剤又は隔離剤（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｅｒ）、ｃｃｃＤＮＡ阻害剤、インターフェロン及び免疫モジュレーターがあるがこれに限定されない。そのような標準的治療は、患者間で変動し得るが、最も一般的なＢ型肝炎治療には、サイトカイン（例えばＩＦＮα、ペグ化ＩＦＮα２ａ及びペグ化ＩＦＮα２ｂ）の有り若しくは無しでのヌクレオチド又はヌクレオシド類似体（ラミブジン、エンテカビル、テルビブジン、アデフォビル、ジピボキシル又はテノホビルなど）がある。しかしながら、Ｂ型肝炎ウイルス量及び／又は血漿若しくは血清中に存在する分泌されたＨＢｓＡｇのレベルを減少させるための新たな治療、例えばｓｉＲＮＡ若しくはＳ抗原隔離剤（Ｒｅｐｌｉｃｏｒ社によって生産されるＲＥＰ－２１３９、核酸ポリマー候補薬など）などは、本開示の組成物と効果的に組み合わせられ得る。Ｂ型肝炎治療は、単回用量で、別法として、標準的な手順、投薬量並びに数時間、数日間、数週間及び／又は数ヶ月間にわたるレジメンに従って複数回投与で提供され得る。

[0056]本開示の組成物は、更なるアジュバントを含んでもよい。

[0057]本発明は、例示的な様式で記載され、本発明の多くの修正及び変更が、上記の教示の観点から考え得る。従って、特許請求の範囲内で、本発明が、本明細書に具体的に記述されるものと異なる方法で実施され得ることは理解されるべきである。

[0058]あたかも各個々の特許、刊行物又は登録が、具体的に及び個別に示されて参照により組み込まれるかのように、上で引用した特許の開示、刊行物及びデータベース登録の全ては、同じ範囲でその全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる。

[0059]以下の例は、本明細書に記載されている特定の組成物を作る及び実施するいくつかの典型的な方法について記載する。これらの例は、例示的な目的のためにだけあり、本明細書に記載される組成物及び方法の範囲を限定することを意味しないことは理解されるべきである。

実施例１：ワクチン製剤の調製
[0060]Ｓ、ｐｒｅ－Ｓ１及びｐｒｅ－Ｓ２タンパク質の３つ全てからなるＢ型肝炎表面抗原を、米国特許第５，２４２，８１２号に記載される方法に従ってＣＨＯ細胞において調製した。

[0061]水酸化アルミニウムアジュバントを含むワクチン製剤を、以下の通りに調製した。簡潔には、アルミニウム含有量５００ｍｃｇ／ｍＬの水酸化アルミニウムアジュバント［アルハイドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）（登録商標）］を使用して異なる２濃度のＨＢｓＡｇ（１０ｍｃｇ／ｍＬ及び２０ｍｃｇ／ｍＬ）を、室温で１６±４時間の時間撹拌した。より具体的には、リン酸ショ糖緩衝液及びＨＢｓＡｇを、滅菌ガラスバイアルに添加し、ピペットで穏やかに混合した。別々の滅菌ガラスバイアルに小さい攪拌子を加え、その後１００±５０ｒｐｍで攪拌しながら０．９％生理食塩水及びアルハイドロゲルアジュバントを添加した。０．９％生理食塩水及びアルハイドロゲルを攪拌しながら、２０～２００μＬサイズのピペットを使用してＰＢＳ及びＨＢｓＡｇの混合物をゆっくり添加した（下の表１を参照のこと）。栓又は漏れ防止用の蓋を各バイアルに加え、確実に密閉した。アルハイドロゲルアジュバントのバイアルを、室温（１５～２５℃）で１６±４時間、１００±５０ｒｐｍで攪拌しておいた。攪拌を完了したら、ワクチン製剤を、分析又は免疫化まで２～８℃で貯蔵した。

[0062]リン酸アルミニウムアジュバント［アデュホス（Ａｄｊｕｐｈｏｓ）（登録商標）］を含むワクチン製剤を以下の通りに調製した。簡潔には、リン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬのアルミニウム（アデュホス）を使用して異なる２濃度のＨＢｓＡｇ（１０μｇ／ｍＬ及び２０ｍｃｇ／ｍＬ）を室温で６０分間、８～１２ｒｐｍで回転させた。より具体的には、アデュホスアジュバントを滅菌容器に添加し、その後１０ｍＭリン酸８％ショ糖緩衝液を添加した。ＨＢｓＡｇを同じ容器に添加し、ピペットを吸引することによってゆっくり混合した（下の表２を参照のこと）。容器を密閉し、アルミホイルで覆い、次いで室温で６０分間、８～１２ｒｐｍで回転させた。攪拌を完了したら、ワクチン製剤を、分析又は免疫化まで２～８℃で貯蔵した。

実施例２：アジュバントに対する抗原の吸着の評価
[0063]水酸化アルミニウムアジュバント及びリン酸アルミニウムアジュバントへのＢ型肝炎表面抗原の結合を、以下の通り測定した。簡潔には、滅菌したバイオセーフティキャビネット内で各ワクチン製剤５００μＬを、移す前にピペット操作によって１０～２０回混合して溶液を確実に均一にした後に滅菌したポリプロピレン遠心管に無菌的に移した。全てのアリコートを、１４，０００ｇで１２０分間次いで遠心分離した。上清（４５０μＬ）を、２０～２００μＬピペットを使用して免疫原性製剤を含有する遠心分離した管から慎重に取り出し、新たな滅菌ポリプロピレン遠心管に移した。免疫原性製剤のペレットを含有する遠心分離した管に、取り出した容量と等容量（４５０μＬ）の緩衝液を添加することによって再懸濁した。管を適切に標識した（遠心分離した免疫原性製剤の上清対再懸濁したペレット）。希釈したペレット（結合したＨＢｓＡｇを含有する）及び上清（遊離ＨＢｓＡｇを含有する）を冷蔵庫内で、２～８℃で貯蔵した。下の表３は、非結合／遊離ＨＢｓＡｇの量に対するＨＢｓＡｇ抗原濃度、アルミニウムアジュバントの選択及びアジュバント用量の影響を実証する。

[0064]試験物質６（ＴＡ６）は、市販の予防的Ｓｃｉ－Ｂ－Ｖａｃワクチンであり、上清中に検出され得る検出可能な非吸着（遊離）ＨＢｓＡｇは存在しなかった。抗原濃度を４倍に増大させる（ＴＡ４）ことによって抗原対アジュバント比を変化させることにより、非吸着抗原の量（２．５％）は実質的に変化しなかった。同様に、水酸化アルミニウムアジュバント（アルハイドロゲル）の量を減少させることによって抗原対アジュバント比を変化させることにより、非吸着抗原の量は５％を超えて増大しなかった（ＴＡ１～３）。

[0065]ＨＢｓＡｇの濃度を１０μｇ／ｍＬに保った場合、免疫原性組成物に使用するアジュバントを水酸化アルミニウムアジュバント（アルハイドロゲル）（ＴＡ６）からリン酸アルミニウムアジュバント（アデュホス）（ＴＡ１２）に変化させることにより、非吸着ＨＢｓＡｇの量（０％検出）を増大させることは、同様にできなかった。驚くべきことに、しかしながら、抗原の濃度を２倍に増大させる（ＴＡ１１）及び／又はリン酸アルミニウムアジュバントの濃度を低下させる（ＴＡ７～１０）ことにより、非吸着ＨＢｓＡｇの量は３０％を超えて実質的に増大した。特に、２０μｇ／ｍＬ濃度の抗原は、リン酸アルミニウムアジュバントからの５００μｇ／ｍＬのアルミニウムと共に製剤化した場合、極めて多量の非吸着ＨＢｓＡｇを実証した。このアジュバント濃度、具体的には５００μｇ／ｍＬは、リン酸アルミニウムアジュバントではなく水酸化アルミニウムアジュバントではあるが、市販のＨＢｓＡｇワクチンにおいて広く使用されている。

[0066]要約すると、Ｓｃｉ－Ｂ－Ｖａｃとして公知の市販の予防的ワクチン（ＴＡ６）中に非吸着ＨＢｓＡｇは存在しないが、２０μｇ／ｍＬＨＢｓＡｇ及びリン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬのアルミニウムを有する本開示の実施形態（ＴＡ１１）には、５０％を超える非吸着ＨＢｓＡｇが存在する。アルミニウム系アジュバントの型と抗原の濃度の両方の変化が、３０％を超える非吸着抗原の量を得るのに必要であった。

実施例３：Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２を含むＨＢｓＡｇ並びに水酸化アルミニウム抗原を含む異なる２つの免疫原性組成物でワクチン接種した後のマウスにおけるＴｈ１Ｔ細胞免疫の評価
[0067]この実施例は、異なる濃度の抗原（Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質を含むＨＢｓＡｇ）及び水酸化アルミニウムアジュバントからの５００μｇ／ｍＬのアルミニウムを含む異なる２つの免疫原性製剤（表３のＴＡ５及びＴＡ６）による免疫化後のマウスにおけるＴ細胞応答の評価について記載する。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ヒト用量製剤の１／２０のワクチン（即ちＴＡ６の抗原０．５μｇ及びＴＡ５の抗原１．０μｇ）を用いて０、３、１０（又は１３）週目に３回ワクチン接種した。マウスを、３回目のワクチン接種後６日目に屠殺し、下記の酵素結合免疫スポットアッセイ（「ＥＬＩＳＰＯＴ」）により重複するペプチドプールを使用してｐｒｅ－Ｓ１、ｐｒｅ－Ｓ２及びＨＢｓＡｇＳタンパク質に対する応答を測定した。同程度の抗ＨＢｓＡｇ抗体応答が、２つの製剤により誘導された（データ不掲載）。

[0068]Ｔｈ１Ｔ細胞応答を測定するためにＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴ分析を以下の通り実行した。マウスを、上述した２つの試験製剤で各々免疫化した８匹のマウス群に分割した。それぞれの試験製剤は、同濃度の水酸化アルミニウムアジュバントを有したが、異なる濃度のＨＢｓＡｇ抗原を有した。群当たり４匹のマウスを屠殺し、脾臓を取り出した。個々のマウスの脾臓を処理して、単一細胞懸濁液を作製した。赤血球を、市販の緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して溶解した。次いで、脾細胞を６×１０^６個脾細胞／ｍＬに再懸濁した。脾臓採集及び処理の１日前に、ＥＬＩＳＰＯＴプレートをインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）捕捉抗体でコーティングした。ペプチドなし、アクチンペプチド混合物、Ｐｒｅ－Ｓ１ペプチド混合物、Ｐｒｅ－Ｓ２ペプチド混合物、ＨＢｓＡｇペプチド混合物並びにホルボール１２－ミリステート１３－アセタート及びイオノマイシン（ＰＭＡ／ｉｏｎｏ）を、刺激薬として選択した。脾臓採集日に、刺激薬を、指定されたＥＬＩＳＰＯＴプレートウェルに添加した。１．５×１０^５個の脾細胞を、ＰＭＡ／ｉｏｎｏウェルに添加し、３×１０^５個の脾細胞を、他の全ての刺激薬に添加した。次いでＥＬＩＳＰＯＴプレートを、３７℃の高湿、５％ＣＯ_２インキュベーター内に４０～４８時間置いた。インキュベーション後、プレートを洗浄して脾細胞、刺激薬及び媒体を除去し、ＩＦＮ－γ捕捉抗体、その後ストレプトマイシンホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｓｔｒｅｐ－ＨＲＰ）を添加した。プレートを、市販の３－アミノ－９－エチルカルバゾール（ＡＥＣ）基質（ＢＤＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）で最終的に発色させた。観察されたスポットを、ＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダーを使用して計数し、最終的なデータを、脾細胞１，０００，０００個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として報告した。下の表４は、この免疫原性研究の結果を示す。

[0069]表４は、アジュバントとして水酸化アルミニウムを含有する製剤中のより多い量のＨＢｓＡｇ抗原が、Ｔｈ１Ｔ細胞応答の改善を示さなかったことを実証する。この結果は、表２のデータと一致し、両方の製剤が非吸着型抗原を有さないことを示した。

実施例４：Ｓｃｉ－Ｂ－Ｖａｃとして公知の市販の予防的ワクチン（Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２を含む１０μｇ／ｍＬＨＢｓＡｇ並びに水酸化アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウム）並びにＨＢｓＡｇ２０μｇ及びリン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウムを含む本開示の製剤によるワクチン接種後のマウスにおけるＴ細胞免疫の比較
[0070]この実施例は、異なる２つの免疫原性組成物によるワクチン接種後のマウスにおけるＴ細胞応答の評価について記載する。第１の組成物は、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質を含む１０μｇ／ｍＬＨＢｓＡｇ並びにリン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウムを含むＳｃｉ－Ｂ－Ｖａｃとして公知の市販の予防的ワクチン（表３においてＴＡ６）であった。第２の組成物は、２倍高濃度の同じＨＢｓＡｇ（２０μｇ／ｍＬ）及びリン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウムを含む本開示の免疫原性組成物（表３のＴＡ１１）であった。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ヒト用量の１／２０の各免疫原性組成物（即ちＴＡ６の抗原０．５μｇ及びＴＡ１１の抗原１．０μｇ）を用いて０、３、６（又は８）週目に３回ワクチン接種した。マウスを、３回目のワクチン接種後６日目に屠殺し、上記のＥＬＩＳＰＯＴにより重複するペプチドプールを使用してｐｒｅ－Ｓ１、ｐｒｅ－Ｓ２及びＨＢｓＡｇタンパク質に対する応答を測定した。同程度の抗ＨＢｓＡｇ抗体応答が、２つの製剤により誘導された。

[0071]表５から見て取れるように、ＨＢｓＡｇ２０μｇ及びリン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウムを含有する本開示の免疫原性組成物は、非常に低い濃度の同じ抗原（１０μｇ／ｍＬ）と水酸化アルミニウムアジュバントで製剤化されている市販の予防的バージョンのワクチンよりＰｒｅ－Ｓ２及びＳ抗原に対して実質的により大きなＴｈ１細胞応答を刺激する。この結果は、市販の予防的ＨＢｓＡｇワクチン（ＴＡ６）において非結合抗原が無いのと比較して本開示の免疫原性組成物（ＴＡ１１）において結合していない抗原の割合が高い（５４．８％）ことを示す表２のデータと一致する。応答は、Ｐｒｅ－Ｓ２に対して最大であったように見える。いずれの製剤でも、ｐｒｅＳ１抗原に対していかなる応答も検出されなかった。

実施例５：Ｓｃｉ－Ｂ－Ｖａｃとして公知の市販の予防的ワクチン（Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２を含む１０μｇ／ｍＬＨＢｓＡｇ並びに水酸化アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウム）並びにＨＢｓＡｇ２０μｇ及びリン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウムを含む本開示の製剤によるワクチン接種後のマウスにおける個々のＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比の比較
[0072]この実施例は、異なる２つの免疫原性組成物によるワクチン接種後のマウスにおける個々のＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比の比較について記載する。第１の組成物は、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質を含む１０μｇ／ｍＬＨＢｓＡｇ並びに水酸化アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウムを含むＳｃｉ－Ｂ－Ｖａｃとして公知の市販の予防的ワクチン（表３のＴＡ６）であった。第２の組成物は、２倍高濃度の同じＨＢｓＡｇ（２０μｇ／ｍＬ）及びリン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウムを含む本開示の免疫原性組成物（表３においてＴＡ１１）であった。Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝８）に、ヒト用量の１／２０の各免疫原性組成物（即ちＴＡ６の抗原０．５μｇ及びＴＡ１１の抗原１．０μｇ）を用いて０、３、６週目に３回ワクチン接種した。マウスを、３回目のワクチン接種後６日目に屠殺し、以下の通りにＥＬＩＳＡによって抗ＨＢｓＩｇＧ１及び抗ＨＢＩｇＧ２を測定した。

[0073]抗ＨＢｓＩｇＧ１：９６ウェルプレートを、組換えＢ型肝炎表面抗原タンパク質、Ａｂｃａｍ（ＤＰＢＳ中に０．２５μｇ／ｍＬ）で、４℃で終夜コーティングした。翌日、プレートを、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（ＰＢＳ中に０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）中の１０％ヤギ血清で、３７℃で１時間ブロッキングした。プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、その後個々のマウス血清の２倍希釈物；１：１０,０００で開始し１：１２８，０００まで、を添加した。プレートを３７℃で１．５時間インキュベートし、その後プレートを洗浄し、二次抗体を添加した。ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液中の１０％ヤギ血清に１：１０,０００希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ１（Ｂｅｔｈｙｌ）を添加し、プレートを、３７℃で１．５時間インキュベートした。ＴＭＢＯｎｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔＭｉｃｒｏｗｅｌｌｓｕｂｓｔｒａｔｅをプレートに添加し、室温で１０分間インキュベートし、次いで停止液を添加した。吸光度を、ＭＡＸｌｉｎｅプレートリーダーを使用して４５０ｎｍで読み取った。

[0074]抗ＨＢｓＩｇＧ２ａ：９６ウェルプレートを、組換えＢ型肝炎表面抗原タンパク質、Ａｂｃａｍ（ＤＰＢＳ中に０．２５μｇ／ｍＬ）で、４℃で終夜コーティングした。翌日、プレートを、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液中の１０％ヤギ血清で、３７℃で１時間ブロッキングした。プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、その後個々のマウス血清の２倍希釈物；１：５,０００で開始し１：６４０,０００まで、を添加した。プレートを３７℃で１．５時間インキュベートし、その後プレートを洗浄し、二次抗体を添加した。ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液中の１０％ヤギ血清に１：１０,０００希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ（Ｂｅｔｈｙｌ）を添加し、プレートを、３７℃で１．５時間インキュベートした。ＴＭＢＯｎｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔＭｉｃｒｏｗｅｌｌｓｕｂｓｔｒａｔｅをプレートに添加し、室温で１０分間インキュベートし、次いで停止液を添加した。吸光度を、ＭＡＸｌｉｎｅプレートリーダーを使用して４５０ｎｍで読み取った。

[0075]結果を、下の表６に示す。

[0076]表６から見て取れるように、ＨＢｓＡｇ２０μｇ及びリン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウムを含有する本開示の免疫原性組成物は、有意により低いＩｇＧ１対ＩｇＧ２ａの比を刺激する。ＩｇＧ２ａ刺激はＴｈ１活性に対するマーカーであるので、この比の改変は、ＨＢｓＡｇ２０μｇ及びリン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウムを含有する組成物が、ＨＢｓＡｇ２０μｇ及びリン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウムを含む組成物より強いＴｈ１応答を引き出すことを示す。

実施例６：Ｓｃｉ－Ｂ－Ｖａｃとして公知の市販の予防的ワクチン（Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２を含む１０μｇ／ｍＬＨＢｓＡｇ並びに水酸化アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウム）、並びにＨＢｓＡｇ２０μｇ、４０μｇ及び６０μｇ及びリン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウムを含む本開示の組成物の異なる３つの用量によるワクチン接種後のマウスにおける用量範囲研究
[0077]この実施例は、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質を含む１０μｇ／ｍＬＨＢｓＡｇ及び水酸化アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウムを含むＳｃｉ－Ｂ－Ｖａｃとして公知の市販の予防的ワクチン（表３のＴＡ６）、並びに本開示の同じＨＢｓＡｇ免疫原性組成物及びリン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウムを含む異なる３つの用量によるワクチン接種後のマウスにおいてＴｈ１活性を調べる用量範囲研究について記載する。異なる３つの用量は、ＨＢｓＡｇ（２０μｇ／ｍＬ）（表３のＴＡ１１）；ＨＢｓＡｇ（４０μｇ／ｍＬ）（表３のＴＡ１０）及びＨＢｓＡｇ（６０μｇ／ｍＬ）（表３のＴＡ１３）であった。

[0078]簡潔には、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝８／群）に、マウス用量の各組成物、具体的には３μｇ、２μｇ及び１μｇを用いて、３週間間隔で３回、筋肉内ワクチン接種した。脾細胞を、３回目のワクチン接種の７日後にマウスから採取し、ｐｒｅＳ１、Ｐｒｅ－Ｓ２及びＨＢｓＡｇに特異的な重複するペプチドプールで刺激した。ＩＦＮ－γを分泌するＴ細胞応答を、以下の通り培養４８時間後にＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。脾臓採集及び処理の１日前に、ＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、１５μｇ／ｍＬ濃度のインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）捕捉抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ）１００μＬでコーティングし、４℃で終夜インキュベートした。

[0079]脾臓採集及び処理の当日、コーティングしたＥＬＩＳｐｏｔプレートを、滅菌ＰＢＳ２００μＬで５回洗浄し、Ｒ１０媒体１００μＬで１～２時間ブロッキングした。脾細胞を単離し、計数したら、Ｒ１０ブロッキング媒体を除去し、脾細胞（３００，０００個細胞）５０μＬ及び刺激薬５０μＬを、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイプレート上に播いた。各マウス由来の脾細胞を、以下の刺激薬：ＰｒｅＳ１（最終刺激濃度＝１３．５μｇ／ｍＬ）、Ｐｒｅ－Ｓ２（最終刺激濃度＝５．５μｇ／ｍＬ）及びＨＢｓＡｇ（最終刺激濃度＝２７μｇ／ｍＬ）、陰性対照としてＲ１０並びに陽性対照としてホルボール１２－ミリステート１３－アセテート及びイオノマイシンＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍＬ）／イオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）で２つ組で刺激した。次いでＥＬＩＳＰＯＴプレートを、３７℃の高湿、５％ＣＯ_２インキュベーター内に４０～４８時間置いた。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２００μＬで５回洗浄して脾細胞、刺激薬及び媒体を除去し、１μｇ／ｍＬ濃度のＩＦＮ－γ捕捉抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ）１００μＬを各ウェルに次いで添加した。インキュベーション２時間後、ＥＬＩＳｐｏｔプレートをＰＢＣ－Ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、１：１０００希釈したストレプトマイシンホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｓｔｒｅｐ－ＨＲＰ）１００μＬを各ウェルに添加した。次いでプレートを更なる時間インキュベートし、３－アミノ－９－エチルカルバゾール（ＡＥＣ）基質（ＢＤＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）１００μＬを添加することによって室温で３０分間発色させた。観察されたスポットを、ＺｅｌｌＮｅｔＣｏｎｓｕｌｔｉｎｇによって計数し、最終的なデータを、１，０００，０００個脾細胞当たりのスポット形成単位（ＳＦＣ）として報告した。ＥＬＩＳＰＯＴによって測定された異なる組成物のＴｈ１活性を、表７に示す。

[0080]表７において見て取れるように、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質を含む１０μｇ／ｍＬＨＢｓＡｇ並びに水酸化アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウム（表３のＴＡ６）と比較した場合、２０μｇ及び４０μｇ及び６０μｇ用量の、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質を含むＨＢｓＡｇを含む組成物並びにリン酸アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウムは、ＥＬＩＳＰＯＴによってより多数のＰｒｅ－Ｓ２及びＨＢｓＡｇ特異的ＩＦＮ－γ分泌Ｔ細胞を引き起こすことができた。従って、本開示の免疫原性組成物の３つの用量のそれぞれは、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質を含む１０μｇ／ｍＬＨＢｓＡｇ並びに水酸化アルミニウムアジュバントとして５００μｇ／ｍＬアルミニウムを含む組成物より高いＴ細胞応答を誘導した。

［他の実施形態］
[0081]本開示の他の実施形態は、本明細書の考慮すべき点又は本明細書に開示される本開示の実施から当業技術者に明らかになろう。本明細書及び例は、典型例としてのみ考慮され、本開示の真の範囲は、以下の特許請求の範囲によって指示されるものとする。本明細書に参照される任意の参照文献の内容は、その全体を参照により本明細書に組み込む。

［関連出願に対する相互参照］
[0001]本出願は、２０１８年１１月１３日に出願の米国特許仮出願第６２／７６０，４３９号の利益を主張し、その内容を、その全体を参照により本明細書に組み込む。

Claims

（ａ）Ｓタンパク質、Ｐｒｅ－Ｓ１タンパク質及びＰｒｅ－Ｓ２タンパク質を含むＨＢｓＡｇ抗原；並びに
（ｂ）リン酸アルミニウムアジュバント
を含む免疫原性組成物であって、前記組成物が、少なくとも２０μｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇ抗原を含み、非吸着抗原の量が、少なくとも３０％である免疫原性組成物。
前記アルミニウムが、５００μｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
前記ＨＢｓＡｇ抗原が、２０μｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
前記ＨＢｓＡｇ抗原が、４０μｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
前記ＨＢｓＡｇ抗原が、６０μｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
哺乳動物においてＴｈ１細胞応答の誘導に使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
対象においてＴｈ１細胞応答を誘導するための薬物を製造するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用。
前記対象がＢ型肝炎に感染している、請求項７に記載の使用。
請求項１～５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物及び薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物。
Ｂ型肝炎を患っている対象の治療に使用するための、請求項９に記載の医薬組成物。
請求項１～５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む、哺乳動物においてＴｈ１細胞応答を誘導する方法。
請求項１～５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の治療上有効な量を対象に投与するステップを含む、対象のＢ型肝炎を治療する方法。
追加のＢ型肝炎治療が、対象に前記免疫原性組成物を投与する前、同時、又は後に前記対象に投与される、請求項１２に記載の方法。
前記追加のＢ型肝炎治療が、ヌクレオシド阻害剤又はペグ化インターフェロンアルファである、請求項１３に記載の方法。
前記追加のＢ型肝炎治療が、ポリメラーゼ阻害剤、ＲＮａｓｅＨ阻害剤、ＴＬＲアゴニスト、Ｎ－グリコシル化阻害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗Ｂ型肝炎抗体、カプシド阻害剤、コアタンパク質阻害剤、コアアッセンブリモジュレーター、Ｓ抗原低減剤若しくは隔離剤、核酸ポリマー、ｃｃｃＤＮＡ阻害剤、インターフェロン、免疫モジュレーター又はｓｉＲＮＡである、請求項１３に記載の方法。