KR20210151047A

KR20210151047A - B형 간염 치료를 위한 면역원성 조성물

Info

Publication number: KR20210151047A
Application number: KR1020217018153A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 에반다 앤더슨; 탄비르 아메드
Original assignee: 배리에이션 바이오테크놀로지스 아이엔씨.
Priority date: 2018-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2021-12-13
Also published as: MX2021005588A; IL283039A; BR112021009234A2; WO2020099927A1; CN113423423A; EP3880244A1; ZA202103976B; EP3880244A4; JP2022513001A; CA3119581A1; US20230079703A1

Abstract

본 발명은, B형 간염을 앓고있는 대상에서 Th1 세포 반응을 유도하는데 유용한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 조성물은, S, Pre-S1 및 Pre-S2 단백질을 갖는 HBsAg 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트를 포함하여 구성된다. 바람직한 구현예에서, 면역원성 조성물은, 적어도 20 ㎍/㎖의 HBsAg 항원을 포함하여 구성되고, 비-흡착 항원의 양은 적어도 30%이다.

Description

B형 간염 치료를 위한 면역원성 조성물

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2018 년 11 월 13 일에 출원된 미국 가출원 62/760,439호의 이익을 주장하며, 그 내용은 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 통합된다.

본 발명은 면역원성 조성물, 특히 B형 간염 감염증의 치료에 유용한 면역원성 조성물 분야에 속한다.

B형 간염은 급성 및 만성 간 질환의 원인이 되는 바이러스 감염증이다. 감염된 개인의 혈액 또는 기타 체액과의 접촉을 통해 인간에게 전염된다. B형 간염 감염증은 전 세계적으로 2억 5천만 명이 넘는 사람들에게 만성 간질환을 일으키는 광범위하고 중대한 건강 문제이며, 전 세계적으로 연간 약 백만 명이 사망한다(세계 간염 보고서 2017, 세계 보건기구). 감염되면, B형 간염은 대부분의 사람들에게 증상이 없는 급성기(acute phase) 질환을 유도한다. 증상을 보이는 사람들은 치명적일 수 있는 급성 간부전을 경험하는 소수의 환자들과 함께 황달, 피로 및 복통을 경험한다. B형 간염에 감염되면, 환자의 면역 체계가 바이러스를 제거하여 치료하거나, 만성 B형 간염 감염증으로 발전할 수 있다. 만성 감염된 성인의 30%가 결국 간경변 및/또는 간암에 걸리기 때문에, 만성 B형 간염의 결과는 중요하다. 만성 질환이 발생할 가능성은 나이가 들면서 감소하며, 영아는 90%, 건강한 성인은 5% 내지 10% 의 만성 감염 가능성을 갖는다.

B형 간염 감염증에 대한 백신이 요구되어 왔지만, 만성 B형 간염 환자를 위한 개선된 치료, 특히 대상(subjects)에서 향상된 세포 면역 반응을 유도할 수 있는 치료에 대한 요구가 존재한다.

제공되는 것은, S, Pre-S1 및 Pre-S2 도메인을 포함하여 구성되는 HBsAg 항원 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트(adjuvant)를 포함하여 구성되는 면역원성 조성물, 본 발명의 면역원성 조성물의 용도, 본 발명의 면역원성 조성물의 투여에 의해 Th1 세포 반응을 유도하는 방법 및 본 발명의 면역원성 조성물을 투여함으로써 B형 간염 감염증을 치료하는 방법에 관한 다양한 구현예이다,

일부 구현예에서, 본 발명은 S, Pre-S1 및 Pre-S2 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 S, Pre-S1 및 Pre-S2 단백질) 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트를 포함하여 구성되는 HBsAg 외피 항원을 포함하여 구성되는 면역원성 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은, 적어도 약 20 ㎍/㎖(예를 들어, 적어도 약 30 ㎍/㎖, 적어도 약 40 ㎍/㎖, 적어도 약 50 ㎍/㎖, 또는 적어도 약 60 ㎍/㎖)의 HBsAg 외피 항원을 포함하여 구성되고, 여기서 비-결합 항원(unbound antigen)의 양이 적어도 30%(예를 들어, 적어도 약 35%) , 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 그 이상)인 면역원성 조성물을 제공한다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은, S, Pre-S1 및 Pre-S2 도메인과 알루미늄 포스페이트 아쥬반트를 포함하여 구성되는 HBsAg 항원을, 약 20 ㎍/㎖-60 ㎍/㎖(예를 들어, 약 20 ㎍/㎖, 약 30 ㎍/㎖, 약 40 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖ 또는 약 60 ㎍/㎖) 포함하여 구성되고, 여기서 비-결합 항원의 양이 적어도 약 30%(예를 들어 : 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 약 80% 또는 그이상)인, 백신 포뮬레이션(vaccine formulation)을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 존재하는 62.5 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖의 알루미늄을 포함하여 구성된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 500 ㎍/㎖의 알루미늄을 포함하여 구성된다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 500 ㎍/㎖의 알루미늄 및 3 개의 단백질 S, Pre-S1 및 Pre-S2를 모두 갖는 HBsAg 항원 20 ㎍/㎖를 포함하여 구성된다.

다른 구현예에서, 본 발명은, S, Pre-S1, Pre-S2 단백질을 포함하여 구성되는 HBsAg 외피 항원, 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트를 포함하여 구성되어, 대상에서 Th1 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 포유 동물에서 Th1 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 S, Pre-S1, Pre-S2 단백질을 포함하여 구성되는 적어도 20 ㎍/㎖의 HBsAg 외피 항원, 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트를 포함하여 구성되고, 여기서 비-결합 항원의 양이 적어도 30%이다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은, 포유 동물에서 Th1 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물을 제공하며, 상기 조성물은, S, Pre-S1, Pre-S2 단백질을 포함하여 구성되는 20 ㎍/㎖ - 60 ㎍/㎖의 HBsAg 항원, 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트를 포함하여 구성되고, 여기서 비-결합 항원의 양이 적어도 30%이다. 일부 구현예에서, 포유 동물에서 Th1 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물은, 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 존재하는 62.5 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖ 알루미늄을 포함하여 구성된다. 바람직한 구현예에서, 포유 동물에서 Th1 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물은, 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 500 ㎍/㎖의 알루미늄과, S, Pre-S1, Pre-S2 단백질을 포함하여 구성되는 20 ㎍/㎖ - 60 ㎍/㎖의 HBsAg 항원을 포함하여 구성된다. 특히 바람직한 구현예에서, 포유 동물에서 Th1 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물은, 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 500 ㎍/㎖의 알루미늄과, S, Pre-S1, Pre-S2 단백질을 포함하여 구성되는 20 ㎍/㎖의 HBsAg 항원을 포함하여 구성된다.

다른 구현예에서, 본 발명은 S, Pre-S1, Pre-S2 단백질을 포함하여 구성되는 HBsAg 외피 항원, 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트를 포함하여 구성되는, B형 간염 치료를 필요로 하는 인간 대상의 B형 간염 치료용 면역원성 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은, B형 간염 치료를 필요로 하는 인간 대상의 B형 간염 치료용 면역원성 조성물을 제공하며, 상기 조성물은, S, Pre-S1, Pre-S2 단백질을 포함하여 구성되는 적어도 20 ㎍/㎖의 HBsAg 외피 항원, 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트를 포함하여 구성되고, 여기서 비-결합 항원의 양이 적어도 30%이다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은, B형 간염 치료를 필요로 하는 인간 대상에서 B형 간염 치료를 위한 면역원성 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 S, Pre-S1, Pre-S2를 포함하여 구성되는 HBsAg 항원 20㎍/㎖-60㎍/㎖, 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트를 포함하여 구성되고, 여기서 비-결합 항원의 양이 30% 이상이다. 일부 구현예에서, B형 간염 치료를 필요로 하는 인간 대상에서 B형 간염을 치료하기 위한 면역원성 조성물은, 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 존재하는 62.5 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖ 의 알루미늄을 포함하여 구성된다. 바람직한 구현예에서, B형 간염 치료를 필요로 하는 인간 대상에서 B형 간염을 치료하기 위한 면역원성 조성물은, 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 500 ㎍/㎖의 알루미늄, 및 S, Pre-S1, Pre-S2 단백질을 포함하여 구성되는 20-60 ㎍/㎖의 HBsAg 항원을 포함하여 구성된다. 특히 바람직한 구현예에서, B형 간염 치료를 필요로 하는 인간 대상에서 B형 간염을 치료하기 위한 면역원성 조성물은, 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 500 ㎍/㎖의 알루미늄, 및 S, Pre -S1, Pre-S2 단백질을 포함하여 구성되는 20 ㎍/㎖의 HBsAg 항원을 포함하여 구성된다.

본 발명은 또한, B형 간염 감염증을 치료하기 위한 약학 조성물의 제조에서 본 발명의 면역원성 조성물 중 적어도 하나의 용도를 포함한다.

본 발명은 또한, 투여를 필요로 하는 대상에게 투여하기 위한, 본 발명의 면역 학적 조성물을 포함하여 구성되는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여 구성되는, 포유 동물에서 Th1 반응을 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 치료적 유효량의 본 발명의 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하여 구성되는, B형 간염 감염증, 특히 만성 B형 간염 감염증의 치료 방법을 제공한다.

본 명세서에 기재된 임의의 태양 또는 구현예에서, 조성물은 S 단백질[예를 들어, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 구성되거나 이로 구성된 S 단백질]; Pre-S2 단백질(예를 들어, SEQ ID NO:2의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성를 갖는 아미노산 서열을 포함하여 구성되거나 이로 구성된 Pre-S2 단백질); 및 Pre-S1 단백질(예를 들어, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 구성되거나 이로 구성된 Pre-S1 단백질);을 포함하여 구성될 수 있다. 본 명세서에 기재된 구현예는, 약 75-90 중량% 의 S 단백질, 약 2-8 중량% 의 Pre-S1 단백질, 및 약 5-15 중량%의 Pre-S2 단백질(예를 들어, 83±3.3% S 단백질, 6±3% Pre-S1 단백질 및 11±3% Pre-S2 단백질)을 포함하여 구성될 수 있다.

본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 다음의 상세한 설명을부터 명백하다. 그러나, 상세한 설명은 본 발명의 구현예를 나타내면서, 제한이 아니라 단지 예시로서 제공된다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명의 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 상세한 설명으로부터 이 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

서열 목록

다음은 본 명세서에서 잠조되는 서열 목록이다.

SEQ ID NO:1은 HBsAG 아미노산 서열의 소형 단백질(Small Protein)이다.

SEQ ID NO:2는 HBsAG 아미노산 서열의 중형 단백질(Medium Protein)이다.

SEQ ID NO:3은 HBsAG 아미노산 서열의 대형 단백질(Large Protein)이다.

본 출원의 발명자들은 Th1 세포 면역 반응을 유도하는데 효과적인 개선된 치료용 B형 간염 백신을 만들었다.

B형 간염 바이러스는 헤파드나바이러스 과(Hepadnaviridae family of viruses)의 오르쏘헤파드나바이러스 속(genus Orthohepadnavirus)의 일원(member)이다. 그것은 뉴클레오캡시드 및 B형 간염 표면 항원(surface antigen)(HBsAg)의 외부 외피(outer envelope)를 포함하여 구성되는 작은, 외피 DNA 바이러스이다. HBsAg 항원은, 동일한 오픈 리딩 프레임(same open reading frame, "S ORF")에 의해 바이러스 DNA에 모두 인코딩되는 세 가지 관련 외피 단백질로 구성된다. 이 3 개의 단백질은, 동일한 C 말단을 갖지만 S ORF를 3 개의 영역으로 나누는 3 개의 인프레임(in-frame) ATG 시작 코돈(start codons)의 존재로 인해 N-말단에서 다르다. S 또는 "소형" 외피 단백질은 226 개 아미노산으로 가장 풍부하고 가장 작다. M 또는 "중형" 표면 단백질은 S 단백질을 포함하고, 55 개의 아미노산으로 구성되고 Pre-S2로 알려진 추가 단백질 도메인을 가지고 있다. L 또는 "대형" 단백질로 알려진 단백질은 S, Pre-S2 및 118 개의 아미노산이 있는 Pre-S1로 알려진 세 번째 단백질 도메인으로 구성된다. B형 간염의 바이러스 게놈은 복제 오류가 발생하기 쉬우며, 그 결과 많은 유전자형과 유전적 변이가 존재한다. 바이러스의 적어도 10 개의 상이한 유전자형이, 많은 돌연변이와 함께 확인되었으며, 그 일부는 S 및 Pre-S 도메인에서 발생한다. 따라서, 세 가지 단백질 도메인 각각에 대해 많은 서열 변이가 존재한다.

일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 S 단백질은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 포함하여 구성되거나 그로 구성된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 S 단백질은, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 데헤 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 구성되거나 그로 구성된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 Pre-S2 단백질은, SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하여 구성되거나 그로 구성된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 Pre-S2 단백질은, SEQ ID NO:2의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 구성되거나 그로 구성된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 Pre-S1 단백질은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하여 구성되거나 그로 구성된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 Pre-S1 단백질은, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 구성되거나 그로 구성된다.

B형 간염 감염증에 대한 효과적인 치료법은 발견되지 않았다. 급성 감염증은 병상 안정으로 치료된다. 만성 감염증은 일반적으로 항 바이러스제, 특히 테노포비르, 라미부딘 또는 엔테카비르와 같은 뉴 클레오시드-계(nucleoside-based) 항 바이러스제 또는 페길화된 인터페론 알파(pegylated interferon alpha: PEG-IFNα)로 치료된다. 항 바이러스제는 간경변의 진행을 늦추고 간암 발병률을 줄일 수 있지만 환자로부터 바이러스를 제거할 수 없는 것으로 증명되었다. 또한, 항 바이러스 제는 비용이 많이 들고 효과를 유지하려면 환자의 평생 동안 계속되어야 한다. PEG-IFNα는 부작용과 관련이 있으며 약 30%의 환자에서만 지속적인 항 바이러스 반응을 일으킨다. 따라서, 만성 B형 간염증에 대한 약물 치료는 일반적으로 질병의 진행을 늦추는데만 효과적이며, 치료법으로 성공적이지 못했다. B형 간염 바이러스를 제거하여 만성 질환을 예방하기 위해서는, 환자가 강력하고 다양한 면역 반응을 생성하여야 한다. 특히, 강력하고 특이적인(strong and specific) T 세포 반응은 B형 간염의 바이러스 제거를 달성하는데 필수적이다(Bertoletti and Rivino(2014) Curr Opin Infect. Dis 27 : 528?534). 이러한 유형의 반응은 성숙한 면역 체계를 가진 성인 환자에게서 거의 배타적으로 나타난다(Bertoletti and Gehring,(2013) PLOS Path. 9 : 1-4).

B형 간염 감염증이 건강에 미치는 중대한 영향을 고려할 때, 이 질병의 예방에 많은 관심이 집중되었다. B형 간염에 대한 예방 백신은 30년 넘게 이용가능했으며, 많은 국가에서 B형 간염에 대한 보편적인 예방 접종이 어린이에게 시행되고 있다. B형 간염에 대한 최초의 예방 백신은 1970년대 후반 B형 간염 환자의 혈장을 사용하여 개발되었다. 개선된 B형 간염 백신은 1980년대에 출시되었으며, HBsAg의 S-도메인을 발현하는 재조합 DNA 기술을 사용하여 효모 세포에서 생산되었다. 이러한 보다 현대적인 백신은 빠르게 첫 번째 백신을 대체했으며, 오늘날 시장에서 여전히 주요 상용 백신이다. 보다 발전된 B형 간염 백신은 1990년대에 개발되었으며, 포유류 세포에서 생산되며 HBsAg의 세 가지 도메인, 구체적으로 S, Pre-S1 및 Pre-S2를 모두 포함한다. Pre-S1 및 Pre-S2 도메인의 존재는 향상된 면역원성 반응 그리고, 바이러스 결합 및 감염의 억제와 관련이 있다(US 5,242,812). 다양한 외피 단백질의 생물학적 기능과 각 성분(S, Pre-S2 및 Pre-S1)에 대한 면역 반응의 특성은 부분적으로만 이해되고 있다. 그러나, 급성 B형 간염 감염증에서는 Pre-S1 및 Pre-S2 항원과 항체가 급성 감염 후 조기에 나타나고 사라지며, S 도메인에 대한 항체는 몇 주 후에 나타나는 것이 알려져 있다. 이것은, Pre-S1 또는 Pre-S2 도메인 항원을 사용하는 연구와 함께, Pre-S1 및 Pre-S2 항원이 S 도메인에 대한 항체 생성을 위한 T-세포 도움(T-cell help)을 유도하는데 관련될 수 있음을 시사했다(Milich 등(1985) PNAS 82 8170-8172; Milich 등(1986) J Immunol 137 315-322).

상업적으로 이용 가능한 예방용 B형 간염 백신은 건강한 대상, 특히 젊고 면역 체계에 손상이 없는 대상에서 HBsAG의 S 단백질 도메인에 대해 강력한 항체 반응을 성공적으로 유도하는 것으로 증명되었다. 그러나, 이러한 백신을 만성 B형 간염 환자의 치료제(therapeutic treatments)로 사용하려는 시도는 성공하지 못했다. HBsAG S 도메인 단독으로 포함하는 그리고 Pre-S2 및 S 도메인을 함께 포함하는 B형 간염 백신의 치료 효과를 측정하기 위해 수행된 임상 시험은, 그 백신들이 B형 간염 바이러스의 제거를 달성할 수 없음을 보여주었다(Pol et al,(2001) J. Hepatol 34 : 917-921). 만성 B형 간염 감염증을 치료하기 위한 면역원성 치료의 실패는, 일반적으로 B형 간염 환자의 면역 체계가 B형 간염 항원, 특히 HBsAg에 대한 추가 노출에 반응하지 않는 현상인, "면역 내성(immune tolerance)"에 기인한다. 만성 B형 간염 환자의 면역 내성은, 바이러스의 B형 간염 항원의 대량 생산(the virus' large production of Hepatitis B antigens)과 관련이 있으며, 이는 T 세포, 특히 B형 간염 특이적(Hepatitis B specific) CD8+T 세포의 소진(exhaustion)을 유도한다(Boni, C. et al,(2007) J. Virol .81 : 4215-4225). B형 간염 특이적 T 세포의 소진(exhausted Hepatitis B specific T cells)은, 항원 특이적 T 세포(antigen-specific T cells)의 사멸을 자극하는, 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(programmed cell death protein 1, PD-1)을 과다 발현시킨다. B형 간염 바이러스가 많은 환자의 경우, 항원 특이적 T 세포의 파괴(destructio)는, 간에서 이러한 세포가 완전히 사라지게 할 수 있다. 그 결과는, B형 간염 항원에 의한 자극에 대한 T 세포 반응의 약화이다.

면역 내성에 의해 제시되는 도전 외에도, HBsAg S 단백질만을 함유하는 B형 간염 백신은 대부분의 대상에서 T 세포 반응에 의한 세포 면역을 자극하는 능력이 약하기 때문에 만성 환자로부터 바이러스를 제거하지 못할 수 있다. T 세포 반응을 보다 효과적으로 자극하기 위한 노력으로, Pre-S1, Pre-S2 및 S 단백질 도메인을 모두 포함하는 B형 간염 백신을 사용하여 만성 B형 간염 환자를 대상으로 치료용 백신 접종(therapeutic vaccination) 연구들이 수행되었다. 이 연구들은, 일부 환자에서 B형 간염 특이적 T 세포 반응을 보여주었다. 그러나, 그 효과는 일시적이고 질병의 깨끗한 제거로 이어지지 않았는데, 이는 아마도 백신이 Th2 반응을 자극했지만, CD8 + T-림프구 반응을 자극하지 않았기 때문일 수 있다(Jung 등,(2002) Vaccine 20 : 3598-3612, Kosinka 등(2015) Med. Microbiol. Immunol 204). IL-4, IL-5 및 IL-13 사이토카인의 분비를 특징으로하는 Th2 세포는, 항체 생산을 촉진하고, 그리고 일반적으로 알레르기 반응과 연관되며, 그리고 IFN-

의 분비를 특징으로 하는 Th1 세포보다 바이러스 감염증에 대해 덜 효과적이다. DNA 백신을 사용하여 성공적 면역 반응을 유도하려는 추가 시도도 지속적인 반응을 달성하지 못했다(Bertoletti 과 Gehring(2009) Exp. Rev,Gastro. Hep. 3: 561-569).

많은 연구자들은 B형 간염에 대한 완전한 치료법은 수년이 지나야 하며, 여러 요법을 조합하여 만성 환자가 지속적인 치료를 받을 수 있는 "기능적 치료(functional cure)"를 달성할 수 있고, 그에 따라 B형 간염 바이러스 및 다른 질병 마커(markers of disease )의 감소 및 치료 중단 후 간암 발생 감소를 달성할 수 있다고 결론지었다. (Lok et al,(2017) J. Hep. 67 : 847-861). 항 바이러스 치료와 예방 백신만으로 기능적 치료를 달성하지 못하기 때문에 일부 연구자들은 예방 백신과 바이러스 양(viral load)을 줄이는 B형 간염 치료를 병행해야 할 수도 있다고 결론지었다. 바이러스 양의 감소는 면역 내성 수준을 감소시켜 감염을 제어할 수 있는 면역 반응을 유도하는 백신 치료 능력을 향상시킬 수 있다(Zoulim, F. et al(2018) Cold Spring Harb. Perspect. Med.(2015) : 5 : a21501). 예를 들어, 예방 백신과 뉴클레오시드 억제제의 조합이 시도되었다. 그러나, 현재까지 상업적으로 이용 가능한 B형 간염 백신을 사용한 병용 요법은 만성 B형 간염 환자로부터 바이러스 제거를 달성하는데 성공하지 못했다(Vandepapeliere et al(2007) Vaccine 51 : 8585-8597). 베트남에서의 연구에서 새로운 백신인 Genhevac B(Pre-S1, Pre-S2 및 S 단백질 백신과 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트)를 뉴클레오시드 억제제(라미부딘)와 결합하여 반응성을 개선하려는 시도가 있었다. 이 조합은 환자의 바이러스 DNA 수준을 줄이는데 있어 개별 치료법보다 우수했다. 그러나, 백신 치료가 중단된 후에도 효과는 지속되지 않았다. 따라서, 이 병용 치료는 바이러스를 효과적으로 제거하기 위한 환자의 면역 체계를 만들지 못했다(Hoa,(2009) Antimicrob. Agents and Chemo. 53 : 5134-5140).

뉴클레오시드 억제제 및 예방적 B형 간염 백신과 함께 PD-1 활성을 차단하는 항체를 포함하는 보다 복잡한 삼중 조합 치료가 제안되었다. B형 간염과 유사한 바이러스를 사용하는 마멋(woodchuck) 모델에서, 이 삼중 조합에 대한 연구는 동물의 1/3에서만 효과적이었다(Kosinka et al,(2015) supra : 103-114; Liu et al, Virologica,(2014) 29 : 10-16). 더욱이, 이 삼중 조합의 효능은 인간에게서 입증되지 않았으며, 비용이 많이 드는 치료법을 무기한으로 사용하여야 한다. 따라서, 치료 목적으로 기존의 예방 백신을 다른 약물과 병용해도 만성 환자의 B형 간염 감염증에 대한 기능적 치료법으로 성공적으로 사용되지는 않았다. 따라서, 만성 B형 간염 환자에서 지속적인 반응을 얻으려면, 이러한 환자가 바이러스에 대한 T 세포 반응을 증가시키는(mount) 능력을 향상시킬 수 있는 개선된 방법을 찾아야 한다.

유전자 발현 억제(gene silencing) 접근법을 활용하는 만성 B형 간염 치료를 위한 새로운 전략이 등장했다. 이러한 치료의 예는, 바이러스 유전자 발현, 특히 HBsAg를 방해하기(interfere) 위한 작은 간섭(interfering) RNA(SiRNA)의 사용이 포함된다. 뉴클레오시드 억제제와 마찬가지로 이러한 치료법은, 바이러스 양과 분비된 HBsAg 수준을 감소시킬 수 있는 잠재력이 있으며(Woodell et al,(2015) Mol. Ther. 21 : 973-985), 그리고 면역 반응을 유도하는 치료와 병행하여 유용할 수 있다고 제안되었다(Ren et al.(2013) PLOSone 8(3) : e57525). 그러나, 이 조합의 효과는 확립되지 않았으며, 항 바이러스제에 대한 초기 연구의 실패를 감안할 때, 효과는 강력한 Th1 세포 반응을 자극할(stimulating) 수 있는 면역제를 포함하여 구성되는 조합에 따라 달라질 수 있다.

백신 포뮬레이션을 변경하여 B형 간염 백신에 대한 T 세포 반응을 향상시키려는 이전의 시도가 있었다. 널리 사용되는 B형 간염 백신인 Engerix B^®와, S/Pre-S1 및 Pre-S2를 포함하는 B형 간염 백신인 Sci-B-Vac^®을 포함하여, 대부분의 시판중인 B형 간염 백신은 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트와 함께 제제화된다(formulated). 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트는 때때로 비공식적으로 "alum" ( "alum"이라는 단어는, 디프테리아 톡소이드(diphtheria toxoid)의 초기 아쥬반트로 사용되었지만 제조상의 어려움으로 인해 폐기된, 수화된 칼륨 황산 알루미늄(KAl(SO₄)₂·12 H₂O)을 설명하는데 더 정확하게 사용되기는 함) 이라고 불리는, 알루미늄 함유 아쥬반트 계열 중 하나이다. 알루미늄계 아쥬반트는 1932년부터 인간 백신에 사용되어 왔으며 오랜 안전성 기록을 가지고 있지만 그 작용 방식(mode of action)은 완전히 이해되지 않았다. 일반적으로 알루미늄계 아쥬반트는 수지상 세포(dendritic cells)의 활성화에 의해 면역 반응을 향상시키는 것으로 믿어진다.

알루미늄계 아쥬반트의 효과를 더 잘 이해하고 향상시키기 위한 연구가 수행되었다. 가장 자주 사용되는 두 가지 알루미늄계 아쥬반트는 "알루미늄 포스페이트" 및 "알루미늄 하이드록사이드"으로 불리며, 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트는 상업적으로 가장 널리 사용된다. 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트는 Al(OH)₃가 아니라 결정질 알루미늄 하이드록사이드보다 표면적이 더 큰 결정질 알루미늄 옥시하이드록사이드(AlOOH)이다. 알루미늄 포스페이트 아쥬반트는 실제로 무정형 알루미늄 하이드록시 포스페이트(Al(OH)_x(PO4)_y)로서, 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트의 하이드록실기 중 일부가 포스페이트기로 대체된 것이다. 알루미늄 포스페이트 아쥬반트의 표면은 Al-OH 기 와 Al-OPO₃기로 구성되어 있다. 화학적으로 유사하지만 두 아쥬반트는 화학적 특성이 다르다. 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트는 결정질 구조, 넓은 표면적 및 중성 pH에서 양전하((+30 mVolts))를 갖는다. 알루미늄 포스페이트 아쥬반트는 무정형이며 중성 pH에서 음전하(약 -20mVolts)를 띠고 있다. 또한, 알루미늄 포스페이트 아쥬반트는 주사 후에 더욱 쉽게 용해되는 것으로 나타났다.

항원은 알루미늄계 아쥬반트에 "흡착"하는데, 이는 항원이 아쥬반트에 부착되어 표면에 층을 형성하는 것을 의미한다. 항원은 정전기적 상호 작용, 즉 반데르 발스 힘(van der Waals forces) 및 리간드(주로 포스페이트) 교환을 통해 알루미늄계 아쥬반트의 표면에 흡착한다. 리간드 교환은 가장 강력한 흡착력이며, 정전기 반발력이 있는 경우에도 발생할 수 있다. HBsAg는 주로, 항원의 포스페이트기와 알루미늄계 아쥬반트의 표면 하이드록실기 사이의 리간드 교환에 의해 아쥬반트의 하이드록실화 미네랄 표면에 강하게 흡착하는 포스페이트기를 포함하는, 인지질로 구성된다. 정전기 인력(electrostatic attraction)은 HBsAg의 주요 흡착력이 아니다(Iver et al,(2004) Vaccine, 22 : 1475-1479).

전통적으로, 알루미늄계 아쥬반트에 대한 항원의 흡착은, 일반적으로 주사 부위에 항원이 머무르면서, 면역 체계에 대한 항원의 장기 방출로 "저장소(depot)" 효과를 생성하므로, 면역 자극 효과(immunostimulatory effect)에 중요하다고 일반적으로 생각되었기 때문에 의도적으로 최대화되었다. 더욱이, 항원의 완전한 흡착은 장기간 보관 동안 백신 포뮬레이션의 장기 안정성을 향상시킨다. Engerix B^®는 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트로부터의 알루미늄 250㎍ 당 10㎍의 HBsAg를 함유한다. 0.04 ㎍ HBsAg/㎍ 알루미늄의 비율은 완전한 흡착을 보장한다. 그러나, 최근에는 항체와, T 세포 면역, 효능, 흡착 간의 관계가 덜 명확하게 되었다. 면역화된 쥐에서의 항체 생산에 있어서의 알루미늄 하이드록사이드에 대한 HBsAg의 결합의 견고성에 대한 연구에 따르면, 항원이 아쥬반트에 가장 단단히 흡착된 백신 포뮬레이션이 가장 낮은 항체 반응을 나타냈다는 것을 보여주었다(Clapp 등(2011) J. Pharm Sci 100(2) 388-401). HBsAg S 항원 도메인을 사용한 한 연구에 따르면, 포스페이트 함량이 높은 알루미늄계 아쥬반트는 흡착 감소, 항원 결합 약화 및 항체 반응 증가를 나타낸다(Egan 등,(2009) Vaccine 27 : 3175-3180). 유사하게, 알루미늄 포스페이트 아쥬반트를 함유하는 단일 항원 B형 간염 백신이, 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트로 제제화된 유사한 백신보다 더 큰 항체 반응을 유도하고, 더 낮은 아쥬반트 농도에서 효과적이었다(Fazeli et al,(2008) DARU 3 : 143-148). 적어도 하나의 연구는, 알루미늄계 아쥬반트에 의한 항원의 흡착이 아쥬반트가 항체 반응을 향상시키기 위해 필요하지 않으며, 흡착이 아닌 염증이 면역원성과 관련이 있다는 결론에 이른다(Noe 등,(2010) Vaccine 28 : 3588-3594). 이 분야의 통상의 기술자로 하여금 더 높은 항체 반응이 Th1 반응이 아닌 Th2 반응의 강화를 촉진하는 것으로 가정하게 하는 연구들이 보고되어 있지만, 변경된 알루미늄 조성(altered aluminum compositions) 및 양이 Th2 대 Th1 T 세포 면역에 영향을 미치는 정도에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.

알루미늄계 아쥬반트는, 면역원성을 향상시키는 것으로 잘 알려져 있지만, 주로 항체 생산을 향상시키는 역할을 하므로, 항체와의 상호 작용을 통해 사멸되거나 억제된 병원체를 표적화(targeting)하는데 가장 효과적이라는 것도 잘 알려져 있다. 이들은 일반적으로 Th1 반응을 유도하는데 효과적이지 않고, 오히려 항원 제시 세포(antigen-presenting cells, APC)에 의한 항원의 끌어 당김과 흡수(attraction and uptake of antigen)를 개선함으로써 염증성 Th2 반응(inflammatory, Th2, response)을 유도하는 것으로 간주된다. 따라서, 알루미늄계 아쥬반트는 Th1 세포 면역의 더 나은 자극제(stimulants)를 찾기 위해 사용되지 않았다.

세포의 또는 "선천적" 면역 반응을 개선하기 위해 보다 현대적인 아쥬반트가 B형 간염 백신에 추가되었다. 그러한 현대적인 아쥬반트 중 하나는, 박테리아 리포사카라이드인, 내독소(endotoxin), 모노포스포릴 지질 A(MPL)이다. WO 93/19780은 아쥬반트들의 조합을 가진 HBsAg 백신에 의한 T 세포 반응의 촉진을 개시한다. 알루미늄 하이드록사이드에 흡수된 HBsAg로 면역화한 후, Balb/c 쥐에서는 T 세포 반응(IL-2, IFN-

및 IL-4로 측정)이 관찰되지 않았다. 그러나, 3-de-O-아크릴화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)를 포뮬레이션에 첨가한 때에는, Th1 세포 반응이 관찰되었다(IL-2 및 IFN-

로 측정). 이후 동일한 연구 그룹에 의해 출원된 미국특허 제5,972,346호는 HBsAg/3D MPL 백신 포뮬레이션에 알루미늄 하이드록사이드 대신 알루미늄 포스페이트를 사용했을 때 개선된 체액 면역원성을 개시했다. 이 발견은, 브랜드 이름 Fendrix^®로 판매되는 상용 백신의 개발로 이어졌다. 후속 연구에 따르면 Fendrix^®는 Th1 세포 면역 반응을 유도한다. 그러나, Fendrix^®는 값 비싼 제품이며 신장 부전(renal deficiency)으로 고통받는 15 세 이상의 환자에게만 유럽에서 사용하도록 승인되었다. 또한, 다른 연구에서 3D-MPL 아쥬반트의 효과는, 수명이 짧고 대부분 주사 부위와 국소 림프절(regional lymph nodes)에 국한되는 것으로 나타났다(De Pasquale 등, Vaccine 2015).

보다 최근에, 미국특허출원 공개 제20160136264호는, B형 간염 항원 단편과 쥐에 Th1 반응을 매개할(mediate) 수 있는 CpG 모티프를 포함하는 면역 조절 DNA 서열로 구성된 아쥬반트로 구성된 B형 간염 백신을 공개했다. 그러나, B형 간염 백신에서 CpG 계(CpG-based) 아쥬반트의 사용에 대한 안전성 문제가 제기되었으며, 모든 관할구역(jurisdictions)에서 판매 승인을 얻지 못했다.

본 출원의 발명자들은 3 개의 HBsAg 단백질(S, Pre-S1 및 Pre S-2) 모두와 알루미늄 포스페이트 아쥬반트를 포함하는 면역원성 조성물이, 그 조성물이 상당한 양의 비-결합 항원을 가질 때, 포유류에서 Th1 세포 반응을 자극하는데 효과적이라는 것을 발견하였다. 본 발명의 조성물의 물리화학적 분석은 아쥬반트가 HBsAg 항원에 약하게 결합됨을 보여준다. 본 발명의 실시예에서 추가로 입증된 바와 같이, 이러한 결합은 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트로 제제화된 B형 간염 백신에서 보이는 것보다 상당히 약하다. 그것은 또한, HBsAg 항원 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트를 포함하여 구성되고, 보다 낮은 HBsAg 항원 대 알루미늄 포스페이트 비율을 가지는 포뮬레이션에서 볼 수 있는 것보다 상당히 약하다.

놀랍게도, 본 발명의 조성물은, MPL 또는 CpG와 같은 세포 면역을 자극하는 것으로 알려진 다른, 더 현대적인 아쥬반트의 존재없이 포유 동물에서 향상된 Th1 세포 반응을 유도했다. 이러한 Th1 세포 반응은 상이한 면역 학적 마커, 특히 항원 특이적 IFN-

반응 및 IgG2a/IgG1 비율을 사용하여 실험적으로 입증되었다. 이는, 알루미늄계 아쥬반트만으로 제제화된 기존의 B형 간염 백신에 대한 Th1 반응을 보이지 않은 종전 연구를 고려할 때, 놀라운 사실이다.

더욱 놀랍게도, 본 발명의 면역원성 조성물은, 상업적으로 입수 가능한 예방 백신과 비교하여, 조성물 내의 항원의 양에 비해 상당히 감소된 농도의 알루미늄 포스페이트 아쥬반트가 사용되었을 때, Th1 세포 반응을 향상 시키는데 효과적이다. 특히, 본 발명의 조성물은, 가장 널리 사용되는 시판되는 예방 백신과 비교하여, 항원에 대한 알루미늄 포스페이트 아쥬반트의 50% 더 낮은 비율이 Th1 반응을 향상시키는데 효과적이다.

본 발명의 백신은, S, Pre-S1 및 Pre-S2 단백질의 3 개 모두를 포함하는 HBsAg를 포함하여 구성된다. HBsAg는, B형 간염의 유전자형, 균주 또는 분리물(isolate)에서 유래할 수 있다. 또한, HBsAg는 천연 HBsAg 또는 변형된 HBsAg에서 유래할 수 있다. HBsAg 항원은, 감염된 대상, 배양된 세포 또는 조직 배양물에서 수집한 생물학적 샘플(예 : 혈액, 혈장, 혈청, 정액, 타액, 조직 절편, 생검 표본 등)과 같은 B형 간염 바이러스의 자연 발생원(natural source)으로부터 분리될 수 있다. HBsAg는 또한, 세포에서 재조합 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, HBsAg는 포유류 세포주에서 발현된다. 일부 구현예에서, HBsAg는, 차이니즈 햄스터 난소 세포주에서 발현되고, S, Pre-S1 및 Pre-S2 도메인을 포함하여 구성되는 HBsAg 항원은 US 5,242,812 호에 개시된 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 상이한 HBsAg를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은, Genbank와 같은 데이터 뱅크 및 출판된 문헌(예를 들어 Fukimori 등(1990) 18 Nuc. Acid Res 4587; Vaudin 등(1988) 69 J. Gen Virol. 1383-1389)에서 찾을 수 있다. HBsAg의 대형 단백질에 대한 아미노산 서열은, SEQ ID NO. 1에 나타나 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은, S, Pre-S1 및 Pre-S2 단백질 중 3 개 모두를 갖는 20 ㎍/㎖ 또는 그 이상의 HBsAg 항원을 포함하여 구성된다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 S, Pre-S1 및 Pre-S2 단백질 중 3 개 모두를 갖는 20㎍/㎖ - 60㎍/㎖의 HBsAg 항원을 포함하여 구성된다.

본 발명의 백신 포뮬레이션은, 알루미늄 포스페이트 아쥬반트를 추가로 포함하여 구성된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 알루미늄 포스페이트 아쥬반트의 한 예는 Brenntag 회사에서 제조한 알루미늄 포스페이트 함습 겔 현탁액(wet gel suspension)인 Adju-Phos^®이다.

실시예 2에 나타낸바와 같이, 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트를 사용한 HBsAg 백신 포뮬레이션(상표 Sci-B-Vac과 관련하여 판매되는, S, Pre-S1 및 Pre-S2 항원을 모두 포함하는 백신의 시판되는 예방 포뮬레이션 포함)은 비-흡착 항원을 5% 미만 포함한다. 표 3에 나타난 바와 같이, 그 예방 백신에 사용된 것과 동일한 양의 항원으로서, S, Pre-S1 및 Pre-2 도메인 모두를 포함하고 알루미늄 하이드록사이드가 아닌 알루미늄 포스페이트 에주번트를 가지는 10 ㎍/㎖의 HBsAg 항원을 포함하는 포뮬레이션은, 증가된 양의 비-흡착 항원을 가지지 않았고, 그리고 실제로, 표 3에 나타난 바와 같이 이 포뮬레이션에는 비-흡착 항원이 없었다. 알루미늄 포스페이트 아쥬반트가 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트보다 HBsAg 항원에 더 약하게 결합하는 것이 알려져 있기 때문에, 이 사실은 놀라운 것이었다. 그럼에도 불구하고, 10㎍/㎖의 HBsAg 항원 농도에서, 알루미늄 포스페이트 아쥬반트를 사용하는 경우와 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트를 사용하는 경우는 모두 유사한 수준의 흡착이 관찰되었다.

그러나, 놀랍게도, (S, Pre-S1 및 Pre-S2 단백질을 포함하여 구성되는) 증가된 농도의 HBsAg 항원 및 동일한 농도의 알루미늄 포스페이트 아쥬반트를 갖는 포뮬레이션은, 비-흡착 항원의 실질적으로 증가된 함량을 보여 주었다. 알루미늄 포스페이트 아쥬반트에 들어 있는 알루미늄의 양 500 ㎍/㎖는 2.27 mg/㎖의 알루미늄 포스페이트 아쥬반트와 동일하다. HBsAg 농도 20 ㎍/㎖ 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 존재하는 알루미늄 500 ㎍/㎖에서, 비-흡착 항원의 양은 54.8%였다. HBsAg 농도 40 ㎍/㎖ 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 알루미늄 500 ㎍/㎖에서, 비-흡착 항원의 양은 35.8%였다. HBsAg 농도 60 ㎍/㎖ 및 루미늄 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 알루미늄 500 ㎍/㎖에서, 비-흡착 항원의 양은 47.4%였다. 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트를 가지며, 동일한 HBsAg 항원 농도를 포함하는 포뮬레이션에서는, 항원 흡착 감소가 관찰되지 않았다. 실제로, 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트를 사용한 경우, 항원 농도가 20 ㎍/㎖로 두 배가 되더라도 비-흡착 항원의 양은 5% 미만으로 유지되었다(표 3 참조). 따라서, 증가된 HBsAg 농도에서, 알루미늄 포스페이트 아쥬반트의 사용은 비-흡착 항원의 유의하고 놀라운 증가를 가져왔다.

따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 면역원성 조성물은 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 62.5 내지 500 ㎍/㎖의 알루미늄을 포함하여 구성된다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 500 ㎍/㎖의 알루미늄 및 S, Pre-S1 및 3 가지 모두를 갖는 HBsAg 항원 20 ㎍/㎖ - 60 ㎍/㎖를 포함하여 구성된다. Pre-S2 단백질. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 500 ㎍/㎖의 알루미늄 및 3 개의 S, Pre-S1 및 Pre-S2 단백질을 모두 갖는 HBsAg 항원 20 ㎍/㎖를 포함하여 구성된다.

쥐에서의 생체 내 연구를 사용하여, 본 발명의 발명자들은, 본 발명의 면역원성 조성물이 쥐에서 Th1 반응을 향상시키는 데 효과적임을 논증하였다. 이 효과는, 심지어 항원 농도가 크게 증가한 때에도, 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트가 사용된 HBsAg 조성물에서는 Th1 반응이 향상되지 않았기 때문에, 예상치 못한 것이다. 구체적으로, 실시예 3에 나타난 바와 같이, 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트로서 500 ㎍/㎖의 알루미늄과 함께 더 높은 20 ㎍/㎖ 농도의 HBsAg 항원(S, Pre-S1 및 Pre-S2 단백질 포함하여 구성됨)은, 시판되는 예방 백신(동일한 항원 10 ㎍/㎖ 및 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트로서 알루미늄 500㎍/㎖ 포함)과 비교해, 쥐에 Th1 T 세포 면역을 향상시키지 않았다. 그러나, 실시예 4 및 5에 추가로 기술된 바와 같이, 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로부터의 알루미늄 500 ㎍/㎖로 제제화된 20 ㎍의 항원을 갖는 본 발명의 바람직한 면역원성 조성물은, 상당히 더 높은 Th1 세포 반응을 유도하였다. (동일 항원 10 ㎍/㎖ 및 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트로부터 알루미늄 500 ㎍/㎖를 가지는) 백신의 예방적 포뮬레이션과 정면으로 비교하였을 때, 상당히 더 높은 Th1 세포 반응을 유도하였다. 더욱이, 실시예 6에 기재된 바와 같이, 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로부터의 알루미늄 500 ㎍/㎖로 제제화된 항원 20 ㎍, 40 ㎍ 및 60 ㎍을 갖는 본 발명의 면역원성 조성물은, (동일 항원 10 ㎍/㎖ 및 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트로부터 알루미늄 500 ㎍/㎖를 가지는) 백신의 예방적 포뮬레이션과 정면으로 비교하였을 때, 모두 더 높은 Th1 세포 반응을 유도하였다. 이러한 결과는, 본 발명의 바람직한 면역원성 조성물에서 아쥬 반트 : 항원 비율을 단순히 변경하는 것이 Th1 T 세포 면역을 향상시키기에 충분하지 않음을 나타낸다. 오히려, Th1 T 세포 면역을 향상시키기 위해서는, 항원의 농도와 아쥬반트의 유형(알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트보다는 알루미늄 포스페이트 아쥬반트)을 모두 변경하는 것이 필요했다. 강화된 Th1 면역은, 증가된 양의 비-흡착 항원을 가지는 조성물에서만 나타났다.

본 발명은 또한, 환자에서 B형 간염 감염증에 대한 Th1 세포 면역 반응을 유도 또는 향상시키기 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 본 발명의 면역원성 조성물의 용도를 제공한다. 본 발명은 나아가, 환자에서 B형 간염 감염증, 특히 만성 B형 간염 감염증을 치료하기 위한 약물의 제조를 위한 본 발명의 면역원성 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 만성 B형 간염 감염증을 앓고있는 개인의 치료 적용에 유용한 약학 조성물을 제공한다.

특정 구현예에서, 제공된 약학 조성물은, 예를 들어 비경구적(parenteral) 전달, 예를 들어 주사용으로 제제화될 수있다. 이러한 구현예에서, 그 포뮬레이션은 근육 내 주사에 적합할 수있다.

일부 구현예에서, 약학 조성물은 주사에 적합한 액체 투여 형태로 제공된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은, 임의선택적으로 진공하에, 분말(예를 들어, 동결 건조 및/또는 멸균됨)으로 제공되며, 이는 주사 전에 수성 희석제(예를 들어, 물, 완충제, 염 용액 등)로 환원된다(reconstituted). 일부 구현예에서, 약학 조성물은, 물, 겔, 염화나트륨 용액, 아세트 산 나트륨 용액, 벤질 알코올 용액, 포스페이트 완충 식염수 등에 희석 및/또는 환원된다. 일부 구현예에서, 그 분말은 수성 희석제와 조심스럽게(gently)(예를 들어, 흔들리지 않게) 혼합되어야 한다.

일부 구현예에서, 제공된 약학 조성물은 하나 또는 그 이상의 제약 상 허용되는 첨가제(excipient)(예를 들어, 보존제, 불활성 희석제, 분산제, 계면 활성제 및/또는 유화제, 완충제 등)를 포함하여 구성된다. 적합한 첨가제는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 수크로스, 트레할로스, 글리세롤, 에탄올, 또는 이와 유사한 것 및 이들의 조합을 포함한다. Remington의 The Science and Practice of Pharmacy(21st Edition, A. R. Gennaro,(Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006)는 약학적 조성물의 제제화에 사용되는 다양한 첨가제 및 이의 제조를 위한 공지 기술을 개시한다. 임의의 통상적인 첨가제 매질이 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 생성하거나 그렇지 않으면 약학적 조성물의 임의의 다른 성분(들)과 유해한 방식으로 상호 작용함으로써 물질 또는 이의 유도체와 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 그 사용은 본 발명의 범위 내에있는 것으로 고려된다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 하나 이상의 보존제(preservative)를 포함하여 구성된다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 보존제를 포함하지 않는다.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 단일 단위 용량(single unit dose)으로 및/또는 복수의 단일 단위 용량으로서, 대량으로 제조, 포장 및/또는 판매될 수있다. 본 명세서에 사용된 "단위 용량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하여 구성되는 약학 조성물의 개별적(discrete) 양이다. 활성 성분의 양은, 일반적으로 대상에게 투여될 용량 및/또는 이러한 용량의 편리한 분획, 예를 들어, 이러한 용량의 1/2 또는 1/3과 동일하다.

본 명세서에 기재된 약학적 조성물은 대상에서 Th1 면역 반응을 유도 또는 향상시키는데 필요하거나 충분한 양으로 그리고 그러한 시간 동안 투여되는 것이 일반적일 것이다. 투여 계획(dosing regimens)은 단일 용량 또는 일정 기간에 걸친 복수 용량으로 구성될 수 있다. 투여되는 조성물의 정확한 양은 대상마다 다를 수 있으며 여러 요인에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 일반적으로, 사용되는 정확한 복용량은 처방 의사에 의해 결정되고, 대상의 체중 및 투여 경로뿐만 아니라 대상의 연령 및 증상의 심각성에 좌우되는 것으로 함이 좋을 것이다. 특정 구현예에서, 특정 량의 백신 조성물이 단일 복용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 특정 양의 조성물이 1 회 초과 복용량으로 투여된다.

본 발명은 또한, 포유 동물에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하여 구성되는, 포유 동물에서 B형 간염 감염증에 대한 T 세포 면역 반응을 유도하거나 향상시키는 방법을 제공한다. 면역 반응은 바람직하게는, B형 간염 항원에 대한 Th1 반응이다. 투여는 임의의 수단, 예를 들어 근육 내 주사에 의해 주사에 의해 수행될 수 있다. 주사는 통상적인 주사기 및 바늘, 또는 당 업계에서 이용 가능한 임의의 다른 적절한 장치로 이루어질 수있다.

본 발명은 또한, B형 간염 감염증, 특히 만성 B형 간염 감염증을 치료하는 방법을 제공하며, 그 방법은 B형 간염 감염증 치료를 필요로 하는 대상에 치료적 유효량의 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하여 구성된다. 그러한 투여는, 임의의 수단, 예를 들어 근육 내 주사에 의해 주사에 의해 수행될 수 있다. 주사는 통상적인 주사기 및 바늘, 또는 당 업계에서 이용 가능한 임의의 다른 적절한 장치로 이루어질 수있다.

원하는 경우, 본 발명의 방법 또는 용도는, B형 간염 감염증 및/또는 B형 간염 매개 질환에 대한 하나 이상의 통상적인 치료제(therapeutic treatments)와 조합하여 수행될 수 있다. 통상적인 치료제의 투여는, 본 발명의 조성물의 투여에 선행하거나, 수반되거나, 후속으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 조성물과 조합될 수 있는 치료제는, 본 발명의 면역원성 조성물의 투여 전 또는 그와 동시에 B형 간염 바이러스의 양을 감소시키기 위한 목적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물과 조합될 수 있는 B형 간염 치료제의 대표적인 예는, 폴리머라제 억제제, RNase H 억제제, 뉴클레오시드 유사체, 뉴클레오타이드 유사체, TLR 작용제, N-글리코실화 억제제, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항-B형 간염 항체, 캡시드 억제제, 코어 단백질 억제제, 코어 어셈블리 조절제, 핵산 폴리머를 포함하는 S-항원 환원제 또는 격리제, cccDNA 억제제, 인터페론 및 면역 조절제를 포함하되 그에 한정되지 않는다. 이러한 치료 기준은 환자마다 다를 수 있지만 가장 일반적인 B형 간염 치료제는 사이토카인(예 : IFNα, 페길화된 IFNα2a 및 페길화된 IFNα2b)이 있거나 없는, 뉴클레오타이드 또는 뉴 클레오시드 유사체(예 : 라미부딘, 엔테카비르, 텔비부딘, 아데포비르, 디피복실 또는 테노포비르)를 포함한다. 그러나, 혈장 또는 혈청에 존재하는 B형 간염 바이러스 양 및/또는 분비된 HBsAg의 수준을 감소시키기 위한 새로운 치료제, 예를 들어 siRNA 또는 S 항원 격리제(예 : Replicor Inc.에서 생산한 핵산 고분자 약물 후보인 REP-2139) )는 본 발명의 조성물과 효과적으로 조합될 수 있다. B형 간염 치료제는 단일 용량으로 또는 대안적으로 표준 프로토콜, 용량 및 요법에 따라 수 시간, 수 일 , 수 주 및/또는 수개월에 걸쳐 복수의 용량으로 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 추가 아쥬반트를 포함할 수 있다.

본 발명은 예시적인 방식으로 설명되었으며, 위의 가르침에 비추어 본 발명의 많은 수정 및 변형이 가능하다. 따라서, 청구항의 범위 내에서 본 발명은 본 명세서에 특이적으로 설명된 것과 다른 방식으로 실시될 수 있음을 이해하여야 한다.

특허, 간행물 및 데이터베이스 항목으로 상기 인용된 모든 개시 내용은 각각의 그러한 개별 특허, 간행물 또는 항목이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시되는 것과 동일한 정도로 그 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 통합된다.

실시예

다음의 실시예는, 본 명세서에 기재된 특정 조성물을 만들고 실시하는 일부 예시적인 모드를 설명한다. 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것이며 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법의 범위를 제한하는 것을 의미하지 않는다는 것을 이해하여야 한다.

실시예 1 : 백신 포뮬레이션의 제조

S, Pre-S1 및 Pre-S2 단백질 3 개 모두로 구성된 B형 간염 표면 항원을 US 5,242,812 호에 기재된 방법에 따라 CHO 세포에서 제조하였다.

알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트를 포함하여 구성되는 백신 포뮬레이션을 다음과 같이 제조하였다. 간단히 말하면, 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트(Alhydrogel^®)의 알루미늄 함량 500mcg/㎖를 사용하는 두 가지 다른 농도(10mcg/㎖ 및 20mcg/㎖)의 HBsAg를 실온에서 16±4 시간 동안 교반했다. 보다 구체적으로, 포스페이트 수크로스 완충액과 HBsAg를 멸균 유리 바이알에 첨가하고 피펫으로 부드럽게 혼합했다. 별도의 멸균 유리 바이알에 작은 교반 막대를 첨가한 다음 100±50 rpm으로 교반하면서 0.9% 식염수와 Alhydrogel^® 아쥬반트를 첨가했다. 0.9% 식염수와 Alhydrogel^®을 교반하면서 PBS와 HBsAg의 혼합물을 20 - 200㎕ 크기의 피펫을 사용하여 천천히 첨가했다(아래 표 1 참조). 마개 또는 누출 방지 뚜껑으로 각 바이알을 씌우고 단단히 밀봉했다. Alhydrogel^®아쥬반트가 첨가된 바이알을 100±50 rpm으로 16±4 시간 동안 실온 (15-25 ℃)에서 교반되는 상태로 두었다. 교반이 완료되고나서, 백신 포뮬레이션을 분석 또는 면역화 때까지 2-8 ℃로 보관했다.

표 1: 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트를 가지는 면역원성 조성물

	포뮬레이션 볼륨				최종 시험 물품 목표 사양
최종 HBsAg 농도 (㎍/mL)	멸균 PBS의 볼륨 (μL)	10mg/㎖ HBsAg의 볼륨 (μL)	0.9% (154mM) 염화나트륨의 볼륨 (μL)	2% Alhydrogel의 볼륨 (10 mg/mL Al+++) (μL)	최종 볼륨 (μL)	최종 알루미늄 농도 (㎍/mL Al +++)
20	219	181	3400	200	4000	500
10	309	91	3400	200	4000	500

알루미늄 포스페이트 아쥬반트(Adjuphos®)를 포함하여 구성되는 백신 포뮬레이션을 다음과 같이 제조하였다. 간단히 말해, 알루미늄 포스페이트 아쥬반트(Adjuphos)로서 500 ㎍/㎖의 알루미늄을 사용하는 두 가지 다른 농도의 HBsAg(10㎍/㎖ 및 20mcg/㎖)를 실온에서 60 분 동안 8-12rpm으로 회전시켰다. 보다 구체적으로, Adjuphos 아쥬반트를 멸균 용기에 첨가 한 다음 10mM 포스페이트 8% 수크로스 완충액을 첨가했다. HBsAg를 동일한 용기에 넣고 피펫을 흡입하여 천천히 혼합했다(아래 표 2 참조). 용기를 밀봉하고 알루미늄 호일로 덮은 다음 실온에서 8-12rpm으로 60 분 동안 회전시켰다. 교반이 완료되면, 백신 포뮬레이션는 분석 또는 면역화 때까지 2-8 ℃로 보관했다.

표 2: 알루미늄 포스페이트 아쥬반트를 가지는 면역원성 포뮬레이션

최종 HBsAG 농도 (㎍/mL)	10 mM 포스페이트 버퍼, 8% 자당의 볼륨 (μL)	HBsAg의 볼륨 (μL)	2% AdjuPhos의 볼륨 (5 mg/mL Al+++) (μL)	최종 볼륨 (μL)	최종 알루미늄 농도 (㎍/mL)
60	0	9000*	3000	30000	500
40	3000	6000*	3000	30000	500
20	3619	181**	200	4000	500
10	3709	91**	200	4000	500

*HBsAg (농도 = 200 ㎍/mL; Lot# B-061-6 diluted),

** HBsAg (농도 = 441 ㎍/mL; Lot# B-054-3),

실시예 2 : 항원의 아쥬반트에 대한 흡착 평가

알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트에 대한 B형 간염 표면 항원의 결합을 다음과 같이 측정하였다. 간단히 말해서, 멸균 바이오세이프티 캐비닛(sterile biosafety cabinet) 내에서, 용액이 균질하다는 것을 확인하기 위해, 옮기기에 앞서 피펫팅에 의해 10-20 회 혼합한 후, 각각의 백신 포뮬레이션 500μL를 멸균 폴리프로필렌 원심 분리 튜브로 무균으로(aseptically) 옮겼다. 모든 분취량(aliquots)을 120 분 동안 14,000g에서 원심 분리시켰다. 20-200 μL 피펫을 사용하여 면역원성 포뮬레이션이 들어있는 원심 분리된 튜브에서 상징액(450㎕)을 조심스럽게 제거하여, 새로운 멸균 폴리프로필렌 원심 분리 튜브로 옮겼다. 원심분리된 튜브에 들어있는 면역원성 포뮬레이션의 펠릿을, 제거된 상징액과 동일한 부피(450 ㎕)의 완충액을 상기 원심분리된 튜브에 첨가하여 재현탁시켰다. 튜브를 적절하게 표지하였다(상징액 대 원심분리된 면역원성 포뮬레이션의 재현탁된 펠릿). 희석된 펠릿(결합된 HBsAg 함유) 및 상징액[유리(free) HBsAg 함유]을 냉장고에 2-8 ℃에서 보관했다. 아래 표 3은, HBsAg 항원 농도의 영향, 알루미늄 아쥬반트의 선택 및 비-결합/유리 HBsAg의 양에 대한 아쥬반트 양을 보여준다.

표 3: 시험용 HBsAg 조성물의 비-흡착 항원 함량

시험 물품	목표 HBsAg (㎍/mL)	목표 알루미늄 ㎍/mL [Al+++]	전체 단백질 (㎍/mL)			비-흡착 HBsAg
시험 물품	목표 HBsAg (㎍/mL)	목표 알루미늄 ㎍/mL [Al+++]	원형	상징액(유리))	펠릿(결합)
1	40	62.5 Alhydrogel	31.9	0.8	32.1	2.8%
2	40	125 Alhydrogel	33.2	검출 안됨	35.8	0%
3	40	250 Alhydrogel	41.6	1.1	39.6	2.7%
4	40	500 Alhydrogel	44.8	1.2	47.6	2.5%
5	20	500 Alhydrogel	39.8	검출 안됨	36.6	0%
6	10	500 Alhydrogel	32.5	검출 안됨	34.3	0%
7	40	62.5 Adjuphos	10.2	5.9	4.9	54.6%
8	40	125 Adjuphos	10.1	5.1	4.2	54.8%
9	40	250 Adjuphos	10.5	4.5	5.2	46.4%
10	40	500 Adjuphos	12.2	3.8	6.8	35.8%
11	20	500 Adjuphos	10.0	3.4	2.8	54.8%
12	10	500 Adjuphos	3.5	검출 안됨	3.1	0%
13	60	500 Adjuphos	11.84	7.6	8.43	47.4%

시험 물품 6(TA6)은 시판되는 예방적 Sci-B-Vac 백신이며, 상징액에서 검출될 수 있는 검출 가능한 비-흡착(유리) HBsAg가 없었다. 항원 농도를 4 배(TA4) 증가시켜 항원에 대한 항원의 비율을 변경해도 비-흡착 항원의 양(2.5%)은 실질적으로 변화하지 않았다. 마찬가지로, 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트(Alhydrogel)의 양을 줄여 항원에 대한 아쥬반트의 비율을 변경해도 비-흡착 항원의 양이 5%(TA1-3) 이상으로 증가하지 않았다.

HBsAg의 농도가 10 ㎍/㎖로 유지되었을 때, 면역원성 조성물에 사용된 아쥬반트를 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트(Alhydrogel)(TA6)에서 알루미늄 포스페이트 아쥬반트(Adjuphos)(TA12)로 바꾼 경우도 마찬가지로 비-흡착 HBsAg(0% 검출)의 양을 증가시키지 못했다. 그러나, 놀랍게도 항원(TA11)의 농도를 2 배 증가시키고 그리고/또는 알루미늄 포스페이트 아쥬반트(TA7-10)의 농도를 감소시키면 비-흡착 HBsAg의 양이 30% 이상으로 실질적으로 증가했다. 특히, 20 ㎍/㎖ 농도의 항원은, 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로부터 500 ㎍/㎖의 알루미늄으로 제제화되었을 때, 매우 많은 양의 비-흡착 HBsAg를 나타냈다. 이 아쥬반트 농도, 구체적으로 특히 500 ㎍/㎖는, 알루미늄 포스페이트 아쥬반트가 아닌 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트를 사용하기는 하지만, 상업적으로 이용 가능한 HBsAg 백신에 널리 사용된다.

요약하면, Sci-B-Vac로 알려진 시판 예방 백신에는 비-흡착 HBsAg가 없지만 (TA6), 20 ㎍/㎖의 HBsAg 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 500 ㎍/mL 알루미늄을 갖는 본 발명의 하나의 구현예에서, 비-흡착 HBsAg가 50% 보다 많았다 (TA11). 30% 이상의 비-흡착 항원의 양을 얻기 위해서는 알루미늄계 아쥬반트의 유형과 항원 농도의 변화가 필요했다.

실시예 3 : S, Pre-S1 및 Pre-S2과 알루미늄 하이드록사이드를 포함하는 HBsAg 항원를 포함하여 구성되는 2 개의 상이한 면역원성 조성물로 백신 접종 후 쥐에서 Th1 T 세포 면역성의 평가.

이 실시예는, 상이한 농도의 항원(S, Pre-S1 및 Pre-S2 단백질을 포함하여 구성되는 HBsAg) 및 알루미늄 하이드록사이드아쥬반트(표 3의 TA5 및 TA6)로부터 알루미늄 500 ㎍/㎖를 포함하여 구성되는 두 가지 상이한 면역원성 포뮬레이션으로 면역화한 후 쥐에서 T 세포 반응을 평가하는 것을 설명한다. Balb/c 쥐가 0 주, 3 주, 10 주(또는 13 주)에 백신 포뮬레이션의 인간 복용량(즉, TA6 항원 0.5㎍ 및 TA5 항원 1.0㎍)의 1/20으로 3 회 백신 접종을 받았다. 쥐를 3 차 백신 접종 후 6 일째에 희생시켜서 하기 기재된 바와 같이 효소 결합 면역 스팟 분석(enzyme linked immunospot)( "ELISPOT")에 의한 중첩 펩티드 풀(overlapping peptide pools)을 사용하여 Pre-S1, Pre-S2 및 HBsAg S 단백질에 대한 반응을 측정하였다. 비교 가능한 항-HBsAg 항체 반응이 두 가지 포뮬레이션으로 유도되었다(데이터는 표시되지 않음).

Th1 T 세포 반응을 측정하기 위한 IFN-

ELISPOT 분석이 다음과 같이 수행되었다. 쥐를 각각 동일한 농도의 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트를 갖지만 상이한 농도의 HBsAg 항원을 갖는 상기 기재된 2 개의 시험 포뮬레이션으로 각각 면역화된 8 마리씩의 쥐의 그룹으로 나누었다. 그룹당 4 마리의 쥐를 희생시키고 비장을 제거하였다. 개별 쥐의 비장을 처리하여 단일 세포 현탁액을 생성했다. 적혈구를 시판되는 완충액(BioLegend)을 사용하여 용해시켰다. 그 다음, 비장 세포를 6x106 비장 세포/mL로 재현탁시켰다. 비장 수집 및 처리 하루 전에 ELISPOT 플레이트를 인터페론 감마(IFN-

) 포획 항체(capture antibody)로 코팅했다. 펩타이드, 액틴 펩타이드 믹스, Pre-S1 펩타이드 믹스, Pre-S2 펩타이드 믹스, HBsAg 펩타이드 믹스, 그리고 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 및 이오노마이신(PMA/iono)은 자극제로 선택되지 않았다. 비장 수집 당일, 지정된 ELISPOT 웰 플레이트(well plates)에 자극제를 첨가했다. 1.5x10⁵ 비장 세포를 PMA/이오노 웰에 첨가하고, 3x10⁵ 비장 세포를 다른 모든 자극제에 첨가했다. 그 ELISPOT 플레이트를 5% CO2 인큐베이터가 있는 습한 37 ℃에서 40-48 시간 동안 두었다. 배양 후, 비장 세포, 자극제 및 배지를 제거하기 위해 플레이트를 세척하고 IFN-

포획 항체를 첨가한 다음 스트렙토마이신 서양 고추 냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)(strep-HRP)를 첨가하였다. 그 플레이트를 최종적으로, 시판되는 3-아미노-9-에틸카르바졸(AEC) 기질(BD BioSciences 회사제)로 발현시켰다(developed). 관찰된 면역 스팟을 ELISPOT 플레이트 판독기를 사용하여 계산하고, 최종 데이터는 백만 비장 세포 당 면역 스팟 형성 세포(SFC)로 보고되었다. 아래 표 4는 이 면역원성 연구의 결과를 보여준다.

표 4: ELPISPOT에 의해 측정한 Th1 활성

면역원성 조성물	Pre-S1 (IFN-γ+ SFC/10⁶ 비장 세포		Pre-S2 (IFN-γ+ SFC/10⁶ 비장 세포		sAg (IFN-γ+ SFC/10⁶ 비장 세포
면역원성 조성물	GM	SE	GM	SE	GM	SE
500 ㎍/mL [Al+++] 포함 10㎍ HBsAg 포뮬레이션(Alhydrogel)	6.048	2.549	124.6	38.31	1056	225.9
500 ㎍/mL[Al+++] 포함 20㎍ HBsAg 포뮬레이션(Alhydrogel)	6.328	2.918	112.3	48.17	1094	214.6

주석: GM= 기하 평균(Geometric mean); SE= 표준 오차(Standard Error)

표 4는 아쥬반트로서 알루미늄 하이드록사이드를 함유하는 포뮬레이션에서 더 많은 양의 HBsAg 항원이 개선된 Th1 T 세포 반응을 나타내지 않았다는 것을 보여준다. 이 결과는, 두 포뮬레이션 모두 비-흡착 항원이 없음을 보여주는 표 2의 데이터와 일치한다.

실시예 4 : Sci-B-Vac(S, Pre-S1 및 Pre-S2를 포함하여 구성되는 10 ㎍/㎖ HBsAg 및 알루미늄 하아드록사이드 아쥬반트로서 500 ㎍/㎖ 알루미늄을 포함하여 구성되는 10 ㎍/㎖ HBsAg)로 알려진 상업적으로 이용가능한 예방 백신과, 20 ㎍ HBsAg 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 500 ㎍/㎖ 알루미늄을 포함하여 구성되는 본 발명의 포뮬레이션으로 백신 접종 후 쥐에서의 T 세포 면역성의 비교.

이 실시예는 2 개의 상이한 면역원성 조성물로 백신 접종한 후의 쥐에서의 T 세포 반응의 평가를 설명한다. 첫 번째 조성물은, S, Pre-S1 및 Pre-S2 단백질을 포함하여 구성되는 10 ㎍/㎖의 HBsAg, 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트((표 3의 TA6)로 500 ㎍/mL 알루미늄을 포함하여 구성되는 Sci-B-Vac로 알려진 시판 예방 백신이다 두 번째 조성물은, 2 배 더 높은 농도의 동일한 HBsAg(20 ㎍/㎖), 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트(표 3의 TA11)로 500 ㎍/mL의 알루미늄을 포함하여 구성되는 본 발명의 면역원성 조성물이었다. Balb/c 쥐가 0 주, 3 주, 6 주(또는 8 주)에 각각의 면역원성 조성물의 인간 복용량의 1/20(즉, 0.5㎍의 TA6 항원 및 1.0㎍의 TA11 항원)으로 3 회 백신 접종을 받았다. 상기 기재된 바와 같이, ELISPOT에 의한 중첩 펩티드 풀을 사용하여 Pre-S1, Pre-S2 및 HBsAg 단백질에 대한 반응을 측정하기 위해 3 차 백신 접종 후 6 일째에 쥐를 희생시켰다. 비교 가능한 항-HBsAg 항체 반응이 두 가지 포뮬레이션으로 유도되었다.

표 5: ELPISPOT에 의해 측정한 Th1 활성

면역원성 조성물	Pre-S1 (IFN-γ+ SFC/10⁶ 비장 세포		Pre-S2 (IFN-γ+ SFC/10⁶ 비장 세포		sAg (IFN-γ+ SFC/10⁶ 비장 세포
면역원성 조성물	GM	SE	GM	SE	GM	SE
500 ㎍/mL[Al+++] 포함 10㎍ HBsAg 포뮬레이션(Alhydrogel)	5.833	0.4951	53.66	7.991	160.3	35.78
500 ㎍/mL[Al+++] 포함 20㎍ HBsAg 포뮬레이션 Adjuphos)	5.439	0.8325	271.7	62.9	333.0	35.51

표 5에서 알 수 있듯이, HBsAg 20㎍ 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서알루미늄 500㎍/㎖를 함유하는 본 발명의 면역원성 조성물은, 훨씬 낮은 농도의 동일한 항원(10 ㎍/㎖) 및 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트로 제제화된 예방용 백신으로시판되는 것보다 Pre-S2 및 S 항원에 대해 실질적으로 더 큰 Th1 세포 반응을 자극한다. 이 결과는, 상업적으로 입수 가능한 예방 적 HBsAg 백신(TA6)에서 비-결합 항원이 없는 것과 비교하여, 본 발명의 면역원성 조성물(TA11)에서 비-결합 항원(54.8%)의 ㄷ더 은 비율을 보여주는 표 2의 데이터와 일치한다. 그 반응은 Pre-S2에 대해 가장 큰 것으로 보인다. 두 제제 모두 Pre-S1 항원에 대한 반응은 검출되지 않았다.

실시예 5 : Sci-B-Vac(S, Pre-S1 및 Pre-S2를 포함하여 구성되는 10㎍/㎖ 의 HBsAg 및 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트로서 알루미늄 500㎍/㎖)으로 알려진 시판 예방 백신 및 및 20 ㎍ HBsAg 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 500 ㎍/㎖ 알루미늄을 포함하여 구성되는 본 발명의 포뮬레이션의 백신 접종 후 쥐에서의 개별 IgG1/IgG2a 비율의 비교.

이 실시예는 2 개의 상이한 면역원성 조성물로 백신 접종 후 쥐에서의 개별 IgG1/IgG2a 비율의 비교를 설명한다. 첫 번째 조성물은, S, Pre-S1, Pre-S2 단백질을 포함하여 구성되는 10㎍/㎖의 HBsAg 및 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트로 500㎍/mL 알루미늄을 포함하여 구성되는, Sci-B-Vac으로 알려진 시판되는 예방 백신이다(표 3의 TA6). 두 번째 조성물은, 2 배 더 높은 농도의 동일한 HBsAg(20 ㎍/㎖) 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트(표 3의 TA11)로서 500 ㎍/mL 알루미늄을 포함하여 구성되는 본 발명의 면역원성 조성물이었다. Balb/c 쥐(n = 8)에게 0 주, 3 주, 6 주에 각 면역원성 조성물의 인간 복용량의 1/20(즉, TA6 항원 0.5㎍ 및 TA11 항원 1.0㎍)으로 3 회 백신 접종을 했다. 다음과 같이 ELISA에 의해 Anti-HBs IgG1 및 Anti-HB IgG2를 측정하기 위해 3 차 백신 접종 후 6 일째에 쥐를 희생시켰다.

항-HBs IgG1 : 96 웰 플레이트를 4 ℃에서 하룻밤 동안 재조합 B형 간염 표면 항원 단백질인 Abcam(DPBS에서 0.25㎍/mL)으로 코팅하였다. 다음 날, 37 ℃에서 1 시간 동안 ELISA 세척 완충액(PBS 중 0.05% Tween-20)내의 10% 염소 혈청으로 플레이트를 차단했다. 그 플레이트를 세척 완충액으로 세척한 다음, 개별 쥐 혈청의 2 배 희석(two fold dilution)을 1:10,000부터 시작하여 1:1280,000까지 하였다; 플레이트를 37 ℃에서 1.5 시간 동안 배양 한 다음, 그 플레이트를 세척하고 2 차 항체를 첨가하였다. ELISA 세척 완충액 중 10% 염소 혈청에 1 : 10,000으로 희석된 염소 항-쥐(Goat anti-mouse) IgG1(Bethyl)을 첨가하고 플레이트를 37 ℃에서 1.5 시간 동안 배양했다. TMB One component Microwell 기판을 플레이트에 첨가하고 실온에서 10 분 동안 배양한 다음 Stop 용액을 첨가했다. 흡광도는 MAXline 플레이트 판독기를 사용하여 450nm로 판독되었다.

항-HBs IgG2a : 96 웰 플레이트를 4 ℃에서 하룻밤 동안 재조합 B형 간염 표면 항원 단백질인 Abcam(DPBS 중 0.25 ㎍/㎖)으로 코팅하였다. 다음 날, 37 ℃에서 1 시간 동안 ELISA 세척 완충액 중 10% 염소 혈청으로 그 플레이트를 차단했다. 그 플레이트를 세척 완충액으로 세척한 다음, 개별 쥐 혈청의 2 배 희석을 1:5,000에서 시작하여 1:640,000까지 하였다; 플레이트를 37 ℃에서 1.5 시간 동안 배양 한 다음 플레이트를 세척하고 2 차 항체를 첨가하였다. ELISA 세척 완충액 중 10% 염소 혈청에 1 : 10,000으로 희석된 염소 항-쥐 IgG2a(Bethyl)를 첨가하고, 그 플레이트를 37 ℃에서 1.5 시간 동안 배양했다. TMB One component Microwell 기판을 그 플레이트에 첨가하고 실온에서 10 분 동안 배양한 다음 Stop 용액을 첨가했다. 흡광도는 MAXline 플레이트 판독기를 사용하여 450nm로 판독되었다.

그 결과는 하기 표 6과 같다.

표 6: 개별 Ig G1 /IgG2 비율

개별 쥐의 번호	IgG1/IgG2a 비율 500 ㎍/mL[Al+++] ((Alhydrogel) 포함 10㎍ HBsAg 포뮬레이션	IgG1/IgG2a 비율 500 ㎍/mL [Al+++] (Adjuphos) 포함 20㎍ HBsAg 포뮬레이션
1	5.3	2.5
2	36.5	3.6
3	118.3	5.6
4	19.9	0.1
5	35.9	6.9
6	2.0	4.6
7	20.5	0.9
8	N/A	9.4

표 6에서 알 수 있는 바와 같이, HBsAg 20㎍ 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 알루미늄 500㎍/㎖를 함유하는 본 발명의 면역원성 조성물은, 유의적으로 낮은 IgG2a에 대한 IgG1의 비율(IgG1/IgG2a 비율)을 자극한다. IgG2a 자극은 Th1 활성의 지표이기 때문에, 이 변경된 비율은 HBsAg 20㎍ 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 알루미늄 500㎍/㎖를 포함하여 구성되는 조성물이 20㎍ HBsAg 및 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트로서 500㎍/㎖ 알루미늄을 포함하여 구성되는 조성물보다 더 강한 Th1 반응을 유도함을 나타낸다.

실시예 6 : Sci-B-Vac(S, Pre-S1 및 Pre-S2를 포함하여 구성되는 10 ㎍/㎖ HBsAg 및 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트로서 500 ㎍/㎖ 알루미늄)로 알려진 상업적으로 입수 가능한 예방 백신 및 20 ㎍, 40 ㎍, 60 ㎍ HBsAg 및 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 500 ㎍/㎖ 알루미늄을 포함하여 구성되는 본 발명의 조성물의 3 가지 상이한 투여량으로 백신 접종 후 쥐에서의 투여량 범위 연구.

본 실시예는, S, Pre-S1 및 Pre-S2 단백질을 포함하여 구성되는 10 ㎍/㎖ HBsAg 및 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트로서 500 ㎍/mL 알루미늄(표 3의 TA6)를 포함하여 구성되는 Sci-B-Vac으로 알려진 시판 예방 백신, 및 동일한 HBsAg와 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로서 500 ㎍/mL 알루미늄을 포함하여 구성되는 3 가지 상이한 용량의 본 발명의 면역원성 조성물으로 백신 접종 후 쥐에서 Th1 활성을 조사하는 복용량 범위 연구를 설명한다. 본 발명의 면역원성 조성물의 세 가지 다른 복용 량은 다음과 같았다; HBsAg(20 ㎍/㎖)(표 3의 TA11); HBsAg(40 ㎍/㎖)(표 3의 TA10) 및 HBsAg(60 ㎍/㎖)(표 3의 TA 13).

간단히 말하면, Balb/c 쥐(n = 8/그룹)는 각 조성물, 구체적으로 3㎍, 2㎍ 및 1㎍의 쥐 복용량으로 3 주 간격으로 3 회 근육 내 백신 접종을 하였다. 3 차 백신 접종 7 일 후 쥐로부터 비장 세포를 채취하고, preS1, Pre-S2, HBsAg에 특이적인 중첩 펩티드 풀로 자극했다. IFN-

- 분비 T 세포 반응은 다음과 같이 배양 48 시간 후 ELISPOT에 의해 평가되었다. 비장 수집 및 처리의 하루 전에 ELISpot 플레이트(Millipore)를 100㎕ 인터페론 감마(IFN-

) 포획 항체(Mabtech)로 15㎍/mL (Mabtech)의 농도로 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양했다.

비장 채취 및 처리 당일, 코팅된 ELISpot 플레이트를 200㎕ 멸균 PBS로 5 회 세척하고, 100㎕의 R10 배지로 1-2 시간 동안 차단하였다. 비장 세포를 분리하여 수를 계산한 후 R10 차단 배지를 제거하고, 50㎕의 비장 세포(300,000 개 세포)와 50㎕의 자극제를 ELISpot 분석 플레이트에 플레이팅했다. 각 쥐의 비장 세포를, PreS1(최종 자극 농도 = 13.5㎍/㎖), Pre-S2(최종 자극 농도 = 5.5㎍/㎖) 및 HBsAg(최종 자극 농도 = 27㎍/mL), 음성 대조군으로서의 R10, 및 양성 대조군으서의 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 이오노마이신(PMA(20ng/㎖)/이오노마이신(1㎍/㎖)을 사용하여 이중으로 자극했다. ELISpot 플레이트를 5% CO₂ 인큐베이터와 함께 습한 37 ℃로 두었다. 배양 후, 비장 세포, 자극제 및 배지를 제거하기 위해 200㎕ PBS-Tween으로 그 플레이트를 5 회 세척 한 다음 1㎍/㎖ 농도의 IFN-

포획 항체(Mabtech) 100㎕를 2 시간 배양 후, ELISpot 플레이트를 PBC-Tween으로 5 회 세척하고 1 : 1000으로 희석된 스트렙토마이신 서양 고추 냉이 퍼옥시다제(strep-HRP) 100㎕를 각 웰에 첨가했다. 그 다음, 3-아미노-9-에틸 카르 바졸(AEC) 기질(BD ??BioSciences) 100μL를 첨가하여 상온에서 30 분간 발현시키기에 앞서, 그 플레이트를 1 시간 더 배양했다. 관찰된 면역 스팟은 ZellNet Consulting에 의해 계수되었으며, 최종 데이터는 백만 비장 세포 당 면역 스팟 형성 단위(SFC)로 보고되었다. ELISPOT에 의해 측정된 상이한 조성물의 Th1 활성이 표 7에 제시되어 있다.

표 7: 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트를 가지는 면역원성 조성물

면역원성 조성물	Pre-S1 (IFN-γ+ SFC/10⁶ 비장 세포		Pre-S2 (IFN-γ+ SFC/10⁶ 비장 세포		sAg (IFN-γ+ SFC/10⁶ 비장 세포
면역원성 조성물	M	SE	M	SE	M	SE
500 ㎍/mL[Al+++] 포함 20㎍ HBsAg 포뮬레이션( Adjuphos)	1.665	1.044	261.2	62.43	498.0	125.4
500 ㎍/mL[Al+++] 포함 40㎍ HBsAg 포뮬레이션( Adjuphos)	0.9514	0.4951	222.6	69.20	649.6	109.1
500 ㎍/mL[Al+++] 포함 60㎍ HBsAg 포뮬레이션( Adjuphos)	0.7136	0.7136	148.9	31.01	422.0	102.0
500 ㎍/mL[Al+++] 포함 10㎍ HBsAg 포뮬레이션(Alhydrogel)	0.0	0.0	108.4	36.95	226.4	28.54

표 7에서 알 수 있듯이, S, Pre-S1 및 Pre-S2 단백질을 포함하여 구성되는 HBsAg와 알루미늄 포스페이트 아쥬반트로 500 ㎍/mL 알루미늄을 포함하여 구성되는 조성물의 20㎍, 40㎍ 및 60㎍ 복용량은, S, Pre-S1 및 Pre-S2 단백질을 포함하여 구성되는 10 ㎍/㎖ HBsAg와 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트로서 500 ㎍/mL 알루미늄의 경우(표 3의 TA6)에 비해, 더 많은 수의 Pre-S2 및 HBsAg 특이적 IFN-

- 분비 T 세포를 유도할 수 있다는 것이 ELISPOT에 의해 측정되었다. 따라서, 본 발명의 면역원성 조성물의 3 개 복용량 각각은, S, Pre-S1 및 Pre-S2 단백질을 포함하여 구성되는 10 ㎍/㎖ HBsAg 및 알루미늄 하이드록사이드 아쥬반트로서 500 ㎍/mL 알루미늄을 포함하여 구성되는 조성물보다 더 높은 T 세포 반응을 유도하였다.

다른 구현예

본 발명의 다른 구현예는 본 명세서에 개시된 발명의 명세서 또는 실시를 고려함으로써 이 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 간주되며, 본 발명의 진정한 범위는 다음의 청구 범위에 의해 표시된다. 본 명세서에서 언급된 임의의 참고 문헌의 내용은 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 통합된다.

Claims

(a) S 단백질, Pre-S1 단백질 및 Pre-S2 단백질을 포함하여 구성되는 HBsAg 항원; 및
(b) 알루미늄 포스페이트 아쥬반트;를 포함하여 구성되며,
HBsAg 항원을 적어도 20 ㎍/㎖ 포함하여 구성되고, 비-흡착 항원의 양이 적어도 30%인, 면역원성 조성물.
청구항 1에 있어서, 알루미늄이 500 ㎍/㎖의 농도로 존재하는, 면역원성 조성물.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 HBsAg 항원이 20 ㎍/㎖의 농도로 존재하는, 면역원성 조성물.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 HBsAg 항원이 40 ㎍/㎖의 농도로 존재하는, 면역원성 조성물.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 HBsAg 항원이 60 ㎍/㎖의 농도로 존재하는, 면역원성 조성물.
청구항 1 내지 5의 어느 한 항에 있어서, 포유 동물에서 Th1 세포 반응을 유도하기 위한, 면역원성 조성물.
대상에서 Th1 세포 반응을 유도하기 위한 약물의 제조를 위한 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 용도.
청구항 7에 있어서, 상기 대상이 B형 간염에 감염된, 면역원성 조성물의 용도.
청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하여 구성되는, 약학 조성물.
청구항 9에 있어서, B형 간염을 앓고 있는 대상를 치료하는데 사용하기 위한, 약학 조성물.
청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하여 구성되는, 포유 동물에서 Th1 세포 반응을 유도하는 방법.
청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 치료적 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하여 구성되는, 대상에서 B형 간염을 치료하는 방법.
청구항 12에 있어서, 추가 B형 간염 치료제가 상기 대상에게 면역원성 조성물을 투여하기 전에, 동시에 또는 그 후에 대상에게 투여되는, 방법.
청구항 13에 있어서, 상기 추가 B형 간염 치료제가 뉴클레오시드 억제제 또는 페길화된 인터페론 알파인, 방법.
청구항 13에 있어서, 상기 추가 B형 간염 치료제가, 폴리머라제 억제제, RNase H 억제제, TLR 작용제, N-글리코실화 억제제, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항-B형 간염 항체, 캡시드 억제제, 코어 단백질 억제제, 코어 어셈블리 조절제, S-항원 환원제 또는 격리제, 핵산 폴리머, cccDNA 억제제, 인터페론, 면역 조절제 또는 siRNA 인, 방법.