EA040981B1

EA040981B1 - Фармацевтическая композиция, которая включает поверхностные и нуклеокапсидные антигены вируса гепатита b

Info

Publication number: EA040981B1
Application number: EA201892212
Authority: EA
Inventors: РУБИДО Хулио Сесар АГИЛАР; МАТО Ядира ЛОБАЙНА; ПЕРЕС Энрике ИГЛЕСИАС; АРИАС Эдуардо ПЕНТОН; Ньето Херардо Энрике Гильен; Сантиаго Хорхе Агустин Агиар; БЛАНКО Сонья ГОНСАЛЕС; Эрнандес Хорхе Вальдес; КАСТИЛЬО Мариэла ВАСКЕС
Original assignee: Сентро Де Инхеньерия Хенетика И Биотекнолохия
Priority date: 2016-03-31
Filing date: 2017-03-14
Publication date: 2022-08-26

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к области вакцинологии, в частности к разработке вакцинных композиций с повышенной эффективностью. Эти композиции включают антигены вируса гепатита В (ВГВ), которые имеют модификации в своем химическом составе, что неожиданно повысило их иммуногенность. Антигенами ВГВ, которые модифицировали по их химическому составу, являлись поверхностный антиген (HBsAg) и ядерный антиген (HBcAg).

Уровень техники

Согласно данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), около трети населения мира инфицировано вирусом гепатита В, что основано на присутствии серологических маркеров инфекции. По оценкам примерно у 5-10% взрослых и до 90% новорожденных, инфицированных ВГВ, развивается хронический гепатит В (НВС). В настоящее время 350 миллионов человек имеют персистентную или хроническую инфекцию. Устойчивая репликация вируса в течение длительного времени приводит к воспалительному процессу в печени, что приводит к гибели 25% инфицированной популяции вследствие цирроза, гепатоцеллюлярной карциномы или других осложнений, таких как асцит, кровотечения из пищевода и спленомегалия. Несмотря на общую вакцинацию новорожденных и младенцев в последние годы и на последующее снижение числа новых случаев заражения НВС, НВС по-прежнему является серьезной проблемой здравоохранения во всем мире [Hilleman, M.R. Вакцина (2001), 19, 1837-48].

Лечение интерфероном-альфа (IFN-α), его пегилированным вариантом (ПЭГ-IFN), а также нуклеотидными и нуклеозидными аналогами, такими как тенофовир, энтекавир, ламивудин, адефовир дипивоксил и тельбивудин, представляет собой современный стандарт лечения ХГВ. В целом эти лекарственные средства имеют низкую эффективность в отношении устойчивой элиминации ВГВ после лечения, при этом их применение связано с серьезными неблагоприятными явлениями (AD), что широко известно [Nash K. Adv Ther (2009), 26:155-169; Yang N, Hepatol Int. 2015 Sep 12. [электронная публикация до выхода в печать] PubMed PMID: 26363922].

Использование вакцинных композиций в качестве иммунотерапевтической стратегии при лечении ХГВ представляет собой интересный подход. Вирусную персистенцию связывали с нарушением развития клеточного иммунитета против ВГВ. С начала 1980-х годов стратегии вакцинации были направлены на увеличение и усиление слабого ответа Т-клеток у больных ХГВ. В таких иммунотерапевтических стратегиях первоначально применяли коммерческие вакцины против ВГВ с целью индукции специфических CD4+ и CD8+ ответов против ВГВ, а также провоспалительных цитокинов для контроля репликации вируса. Таким образом, почти все коммерческие профилактические вакцины исследовали отдельно или в комбинации с традиционными противовирусными терапиями. В предыдущих исследованиях терапевтической вакцинации вакцины применяли с другими противовирусными терапиями или без них. Кроме того, иммунотерапия с применением коммерческих вакцин также предоставила схемы с большими количествами прививок, при этом исследовали альтернативные парентеральные пути. Основные исследования кратко описаны ниже.

Экспериментальное исследование вакцинации у больных ХГВ с применением Genhevac В® (Aventis Pasteur, France, получена в клетках млекопитающих -СНО) продемонстрировало снижение репликации ВГВ у приблизительно 50% хронических носителей [Pol S, et al., С R Acad Sci III (1993), 316:688-91]. В другом многоцентровом плацебо-контролируемом исследовании также проведили оценку вакцины Genhevac В®, вакцины Recombivax® (Merck Sharp Dohme-Chibret, France, полученной в дрожжах). При этом значимое отличие наблюдали в шестой месяц (3, 20 и 22%) между группами, получавшими Genhevac® и Recombivax®, соответственно. Однако к 12 месяцу отличие исчезло [Pol S, J Hepatol (2001); 34:917-21]. В результате пришли к выводу, что явное положительное действие отсутствовало, и антиген pre-S2, присутствующий в вакцине Genhevac®, по-видимому, не оказывал какого-либо дополнительного эффекта.

Другие исследования, в которых оценивали терапевтическую вакцину Genhevac® [Yalcin K, et al. Infection (2003), 31:221-225; Dikici В, et al., J Gastroenterol Hepatol (2003), 18 (2):218-22] показал лишь небольшую эффективность, связанную с лечением.

Hepagene® (Medeva Ltd., UK), полученная в СНО вакцина, включает три варианта HBsAg (L, S и М), и их результаты на здоровых добровольцах и нереспондерах продемонстрировали высокий уровень иммуногенности [Page M, et al., Intervirology (2001), 44:88-97; Yap I, et al., Ann Acad Med Singapore (1996), 25: 120-122; Zuckerman JN, et al., BMJ (1997), 314: 329; Jones CD, et al., Vaccine (1999), 17 (20-21): 2528-37]. Принимая это во внимание, проводили исследование для оценки его терапевтического потенциала. Восемь доз по 20 мкг вакцины вводили в двух курсах из 4 прививок, с 5-месячным интервалом между ними [Carman WF, et al., J Hepatol (2001); 34:917-921]. В конце схемы, 8 из 22 пациентов, которые прошли схему, имели длительное отсутствие вируса гепатита В, а у 7 пациентов был устранен HBeAg. Это неконтролируемое ограниченное исследование сопровождалось контролируемым исследованием с большим количеством пациентов. В этом втором клиническом исследовании, включавшим 103 хронических больных, которые были HBeAg положительными, четыре дозы вакцины или плацебо вводили с интервалами в один и 8 месяцев, а затем все пациенты получали 8 дополнительных доз с одномесячными

- 1 040981 интервалами. В конце лечения не было получено никаких значимых положительных клинических результатов [Medeva PLC http://www.investegate.со.uk/αrticle.aspx?id=200001171532169093D (консультации 20 октября 2015 года)].

Чтобы способствовать развитию противовирусного иммунного ответа, использовали методы лечения, объединяющие в себе терапевтическую вакцинацию со стандартными противовирусными терапиями. Такая стратегия учитывает результат, связанный с действием ламивудина, который увеличивает содержание специфических ВГВ Т-клеток в периферической крови в результате ингибирования репликации вируса [Bertoletti A et al., Expert Rev Gastroenterol Hepatol (2009), 3(5):561-9].

Комбинированная стратегия противовирусной вакцинации должна способствовать большей реактивности Т-клеточного ответа против ВГВ, но должна считаться более безопасной, поскольку она должна исключать поражение печени вследствие активации иммунной системы. Однако нет никаких подтверждений того, что активация специфического иммунного ответа вакциной у больных ХГВ может вызывать фульминантный гепатит.

В исследовании, опубликованном в 2002 году, оценивали внутрикожное введение (в/к) вакцины Энджерикс В® (GlaxoSmithKine) с ламивудином [Dahmen A, et al., J Med Virol 2002; 66:452-60] у больных ХГВ. Шесть доз Энджерикс В® вводили один раз в месяц в комбинации с ежедневным введением ламивудина. Дополнительная группа получала такое же лечение в сочетании с ежедневным подкожным (п/к) введением интерлейкина-2 (IL-2). После завершения терапии, у 7 из 9 пациентов в первой группе и у 2 из 5 пациентов во второй группе вирусная нагрузка уменьшилась до не поддающихся определению уровней. У четырех респондеров вирус был устранен, и нормализовались уровни трансаминаз. В другом клиническом исследовании комбинацию терапевтической вакцинации в/к путем оценивали при использовании вакцины, содержащей HBsAg в алюмокалиевых квасцах, с ежедневным введением ламивудина в течение одного года [Horiike N, et al., J Clin Virol (2005), 32:156-161]. Эти исследования показали, что комбинированная терапия эффективна и имеет мало осложнений у больных ХГВ. Однако в обоих случаях использовали в/к путь, который может способствовать иммуногенности вакцины.

Тот же поверхностный антиген, включенный в активный адъювант, неэффективен при комбинированной терапии ламивудином, что указывает на то, что влияние пути иммунизации не следует игнорировать, и что это, возможно, решающий фактор, определяющий будущее вакцинации.

Исследование, которое завершило длительный период клинической оценки кандидатных вакцин для подавления вирусной нагрузки, представлено в отчете Vandepapeliere с соавт. [Vandepapeliere P, et al., Vaccine (2007) Dec 12; 25(51):8585-97]. В этом исследовании проводили клиническую оценку кандидатной вакцины на основе композиции адсорбированного HBsAg, вводимой внутримышечным (в/м) путем в дозе 100 г HBsAg, в сочетании с масляным адъювантом и мощными иммуномодуляторами, такими как монофосфориллипид А и сапонин QS21. Десять введений в условиях пониженной вирусной нагрузки не продемонстрировали никаких преимуществ по отношению к вирусологическому ответу, по сравнению с контрольной группой, которая получала только противовирусный препарат.

Накопленные знания о характеристиках иммунного ответа хозяина и о терапевтическом применении обычных вакцин показывают, что стратегии, направленные на индукцию сильной и долговременной реактивности Т-клеток против антигенов ВГВ, возможны и дают надежду на успешное лечение больных ХГВ.

Отсутствие иммунной стимуляции против нуклеокапсидных антигенов, вероятно, является основным иммунологическим маркером неэффективности терапевтической вакцинации на основе HBsAg. Фактически, цель терапевтической вакцинации при ХГВ заключается в активации тех же природных иммунных механизмов, которые преобладают во время острого гепатита В и которые является самоконтролируемым, или при ХГВ, который подвергается сероконверсии. Если иммунотерапия не стимулирует такие иммунные ответы, она, вероятно, не сможет вызвать сероконверсию.

Улучшение композиций с точки зрения стратегии антигенной селекции и вакцинации может стать способом преодоления таких трудностей. Характеристики белков оболочки оправдывают их включение в терапевтическую вакцину. Фактически, белки оболочки содержат многочисленные эпитопы В и Т-клеток [Penna A, et al., J Virol (1992), 66 (2):1193-6; Nayersina R, et al., J Immunol (1993), 150:4659-71], и предполагается, что антитела против белков оболочки играют важную роль в подавлении вируса, устраняя свободные вирусные частицы из кровотока и предотвращая повторное инфицирование восприимчивых клеток. С другой стороны, высокие уровни HBsAg циркулируют в сыворотке больных ХГВ, этот факт может играть главную роль в поддержании иммунной толерантности, в результате истощения Т-клеток и подавления продукции антител против HBs [Nagaraju K, et al., J Viral Hepat (1997), 4:221-30).

В этом направлении HBcAg был предложен в качестве основного кандидатного антигена для включения в терапевтическую вакцину для ХГВ. Во время острого саморазрешающегося гепатита эпитопный ответ Т-клеток предпочтителен и преобладает в ходе сероконверсии при спонтанном или вызванном лечением ХГВ [Ferrari С, et al., J Clin Invest (1991), 88:214-22; Marinos G, et al., Hepatology (1995), 22:1040-9; Tsai SL, et al., Clin Invest (1992), 89:87-96].

До сих пор ни одна из коммерческих вакцин против гепатита В не продемонстрировала достаточ

- 2 040981 ные клинические результаты, которые позволят им конкурировать с существующими методами лечения или просто вызовут одобрение их внедрения в медицинскую практику. Тем не менее, эти вакцины дали большие надежды в области лечения, не только в отношении иммунотерапии против гепатита В, но также и для других патологий, таких как инфекция, вызванная вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), и рак, среди прочих хронических заболеваний, передающихся или непередающихся. Таким образом, эта стратегия требует клинической оценки новых концепций вакцин и оптимизации всех связанных факторов. В связи с этим кандидатная терапевтическая вакцина, включающая HBcAg, помимо HBsAg, является результатом разработки таких стратегий иммунотерапии.

Центр генной инженерии и биотехнологии Кубы (CIGB) производит HBsAg в виде рекомбинантного белка, получаемого в дрожжах Pichia pastoris в качестве хозяина. Этот антиген был включен в профилактическую вакцину Heberbiovac HB® с начала 1990-х годов [Muzio V, et al., Biotecnologia Aplicada (2001) 18; 103-104; ul-Haq N, et al., Vaccine (2003) 21:3179-85].

Кроме того, в CIGB разработали композицию, которая обеспечивает длительный иммунный ответ против гепатита В, указанная композиция включает в качестве основных компонентов HBsAg и HBcAg, антигены вводят через слизистую оболочку с развитием системного и мукозального ответа [Европейский патент ЕР 1136077]. В другом патентном документе центра CIGB описана генерация агрегированных антигенных структур, образующих частицы. В этом документе показано, что агрегация, делипидизация или окисление, а также отбор частиц 30-500 нм и включение таких агрегатов в подходящий адъювант способствует иммуногенности полученного антигенного препарата [Европейский патент EP 1346727]. Объединив стратегии, предложенные в обоих патентных документах, в CIGB разработали кандидатную терапевтическую вакцину под названием NASVAC [Lobaina Y, et al., Mol Immunol (2015), 63:320-327], которую вводят с применением комбинации путей иммунизации. Клинические результаты вакцинации крайне перспективны, однако эффективность продукта необходимо повысить с применением более сильных иммуногенов.

Стратегии вакцинации, которые включают основные антигены ВГВ, такие как HBsAg и HBcAg, привели к появлению композиций, обладающих некоторой противовирусной эффективностью. Однако их улучшение необходимо для увеличения числа пациентов с длительным противовирусным ответом, а также числа пациентов, у которых наблюдается сероконверсия HBsAg в анти-HBsAg.

Описание изобретения

Изобретение помогает решить вышеуказанную проблему путем разработки фармацевтической композиции, которая характеризуется: 1) антигеном HBcAg, который включает матричную рибонуклеиновую кислоту (мРНК) в процентной доле более 45% от общего количества рибонуклеиновой кислоты (РНК) указанного антигена, и 2) антигеном HBsAg HBV. В варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит HBsAg, содержащий фосфатидилсерин в процентной доле более 5% от общего количества фосфолипидов, формирующих указанный антиген.

Включение антигенов HBsAg и HBcAg, которые были модифицированы по своему химическому составу таким определенным способом, способствует иммунологическим и противовирусные свойствам этой композиции для иммунотерапии. Однако вышеуказанные модификации не влияют на белковый состав антигенов HBsAg и HBcAg изобретения, так как их первичная, вторичная и третичная структуры остаются идентичными по сравнению с их немодифицированными вариантами. Тем не менее, такие модификации приводят к неожиданным свойствам этих антигенов, что дает более сильные иммуногены. Кроме того, комбинация таких модифицированных антигенов приводит к получению композиции с более высокой терапевтической противовирусной эффективностью для лечения ХГВ.

В изобретении HBcAg был получен с мРНК на уровне более 45%. В конкретном случае этот модифицированный антиген был получен благодаря комбинации изменений параметров его процесса ферментации. В этом случае применение химически определенной среды и низкой удельной скорости роста обеспечивает получение варианта HBcAg, где доля мРНК увеличена по сравнению с остальной РНК, присутствующей в нем.

Хотя была описана высокая иммуногенность HBcAg, полученного в Escherichia coli, как и участие компонента нуклеиновых кислот в иммуногенности полноразмерных антигенов (183 аминокислот) в форме частиц, до настоящего изобретения относительный эффект каждого варианта РНК был неизвестен в отношении их определенного вклада в конечную иммуногенность HBcAg. Неожиданно было обнаружено, что HBcAg с уровнем мРНК выше 45% был более иммуногенным и вызывал развитие более сильного ответа Th1 по сравнению с немодифицированным HBcAg.

Изменения процентной доли обнаруженной мРНК не влияли на содержание суммарной РНК, присутствующей в частице, относительно содержания белка. Неожиданно было обнаружено, что HBcAg, содержащий больше 45% мРНК в суммарной РНК, обладал более высокой иммуногенностью по сравнению с HBcAg, полученным без какого-либо изменения содержания мРНК. Такое увеличение иммуногенности включало значительное увеличение цитокинов Th1 и повышенную способность к устранению циркулирущего HBsAg после иммунизации трансгенных мышей и пациентов с ХГВ.

С другой стороны, в настоящем изобретении оценивали HBsAg, который содержит фосфатидилсерин на уровне больше 5% от общего количества фосфолипидов, присутствующих в этом липопротеино- 3 040981 вом антигене. В частности, увеличение процентной доли фосфатидилсерина более чем до 5% от общего количества фосфолипидов было продемонстрировано в отношении изменения таких параметров, как увеличение концентраций кальция и магния в среде ферментации, низкой удельной скорости роста и низкого pH. Однако изобретение не было ограничено HBsAg, полученным при таких условиях. Увеличение процентной доли фосфатидилсерина более чем до 5% связывали с увеличением иммуногенности полученного в результате антигена при сравнении его с HBsAg с более низким содержанием этого фосфолипида. Наблюдали значительное повышение цитокинов Th1, а также более высокую способность устранения циркулирующего HBsAg после иммунизации HBsAg трансгенных мышей и больных ХГВ при использовании HBsAg, содержащего больше 5% фосфатидилсерина относительно общего % фосфолипидов.

В настоящем изобретении особым образом модифицированные антигены HBsAg и HBcAg были выбраны на основе более высокой интенсивности иммунного и противовирусного ответа в сравнении с композициями, в которых использовались немодифицированные антигены. Кроме того, композиция, содержащая оба антигена, могла вызывать сероконверсию HBsAg в анти-HBsAg у большего числа пациентов по сравнению с антигенами, которые вводили отдельно, что демонстрирует важность и функциональность модификаций, обнаруженных в антигенах, являющихся частью композиции настоящего изобретения, а также превосходство комбинированных композиций по сравнению с отдельными антигенами.

В настоящем изобретении предложено новое решение проблемы, существующей в уровне техники, связанной с необходимостью новых композиций, которые позволяют усилить иммунный ответ против HBsAg и против HBcAg, для создания более эффективных способов лечения для контроля хронической инфекции, вызванной ВГВ. Объект настоящего изобретения не может считаться очевидным или полученным из уровня техники специалистами, поскольку он является результатом идентификации новых характеристик описанных антигенов. Хотя такие модифицированные антигены сохраняют свой белковый состав, они различаются по химическому составу молекул, связанных с ними.

Таким образом, в рамках изобретения модифицированный HBcAg является препаратом из HBcAg, который включает мРНК в процентной доле более 45% от суммарной РНК данного антигена. В то же время, модифицированный HBsAg является препаратом HBsAg, который содержит фосфатидилсерин в процентной доле более 5% от общего количества фосфолипидов данного антигена.

В одном варианте осуществления изобретения композиция, содержащая антиген HBcAg с мРНК в процентной доле более 45% от суммарной РНК данного антигена и антиген HBsAg ВГВ, отличается тем, что она изготовлена для введения парентеральным и мукозальным путями. Для введения композиции согласно изобретению мукозальным путем и, в частности, назальным путем могут применяться устройства, которые были разработаны и/или выпущены в продажу для введения фармацевтических композиций таким путем.

В конкретном варианте осуществления указанная композиция дополнительно отличается тем, что она содержит вакцинный адъювант. Среди вакцинных адъювантов, которые могут присутствовать в композиции согласно изобретению, были обнаружены, например, такие, которые хорошо известны специалистам в этой отрасли, такие как соли алюминия, эмульсии вода в масле, разработанные для медицинского применения, стимуляторы иммунной системы и т.д.

Кроме того, изобретение относится к применению антигена HBcAg, который включает мРНК в процентной доле более 45% от суммарной РНК данного антигена, и антигена HBsAg для производства лекарственного средства для иммунопрофилактики или иммунотерапии против инфекции, вызванной ВГВ. В одном варианте осуществления изобретения, HBsAg, входящий в состав указанного лекарственного средства, содержит фосфатидилсерин в процентной доле более 5% от общего количества фосфолипидов данного антигена. В конкретном варианте осуществления указанное лекарственное средство изготовлено для введения парентеральным и мукозальным путем. В предпочтительном варианте осуществления лекарственное средство с HBcAg, содержащим мРНК в процентной доле более 45% от суммарной РНК данного антигена, и антигеном HBsAg, применяют для лечения больных ХГВ или больных с коинфекциями, где одним из инфицирующих вирусов является ВГВ. Кроме того, при лечении больных ХГВ указанным лекарственным средством применение направлено на предотвращение гепатоцеллюлярного рака, возникшего в результате инфекции, вызванной ВГВ.

В случае когда лекарственное средство, содержащее HBcAg с процентной долей мРНК более 45% от суммарной РНК данного антигена и антиген HBsAg, применяется для лечения больных ХГВ путем иммунотерапии, ее можно проводить активным способом (путем иммунизации пациентов этим лекарственным средством) или в пассивной форме, путем клеточной стимуляции. Благодаря своим компонентам фармацевтическая композиция по изобретению может применяться для стимуляции аутологичных или гетерологичных клеток. Таким образом, в изобретении предложен способ клеточной стимуляции с применением указанной композиции и последующей пассивной иммунизации больных ХГВ на основе максимальной стимуляции, in vivo или in vitro, аутологичных или гетерологичных клеток, которые включают дендритные клетки, В-клетки и макрофаги.

Кроме того, в настоящем изобретении раскрыт способ иммунопрофилактики или иммунотерапии

- 4 040981 против ВГВ-инфекции, который отличается введением пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества фармацевтической композиции, включающей антиген HBcAg, который содержит мРНК в процентной доле более 45% от суммарной РНК данного антигена, и HBsAg антиген ВГВ. В одном варианте осуществления изобретения HBsAg включает фосфатидилсерин в процентной доле более 5% от общего количества фосфолипидов данного антигена. В варианте осуществления изобретения указанную фармацевтическую композицию вводят парентеральным и мукозальным путями. В предпочтительном варианте осуществления пациент, получающий иммунотерапию, является больным ХГВ. В этом случае применение способа согласно изобретению для иммунотерапии у больных ХГВ обеспечивает предотвращение гепатоцеллюлярного рака, возникшего в результате инфекции, вызванной ВГВ.

Цель настоящего изобретения также состоит в применении HBcAg антигена, который содержит мРНК в процентной доле больше 45% от суммарной РНК данного антигена, и антигена HBsAg для усиления иммунного ответа против дополнительного антигена, который совместно вводят со смесью этих антигенов. В варианте осуществления изобретения HBsAg, входящий в состав смеси антигенов, содержит фосфатидилсерин в процентной доле более 5% от общего количества фосфолипидов данного антигена.

Смесь антигенов, указанных выше, может применяться в потенцировании иммунного ответа против ХГВ (в терапевтической схеме) или в соответствии со стратегиями профилактической вакцинации, где вакцина является поливалентной. Это обусловлено тем, что в дополнение к повышению иммуногенности антигенов HBsAg и HBcAg, измененных определенным способом, можно было проверить, что они способны вызвать эффект потенцирования иммуногенности гетерологичных антигенов. Результаты экспериментальных оценок демонстрируют, что эти антигены, присутствующие в поливалентных композициях, могут использоваться в профилактическом или терапевтическом применении.

Хотя в отношении композиций в настоящем изобретении можно исключить применение адъювантов, стабилизаторов, консервантов или других добавок, это не ограничивает введение добавок, вспомогательных веществ, разбавителей, которые не снижают иммуногенность композиции или получаемого конечного продукта, или противовирусную эффективность вводимой композиции.

С использованием фармацевтической композиции и способа иммунопрофилактики или иммунотерапии согласно изобретению достигается длительный противовирусный ответ, при этом число пациентов с сероконверсией HBsAg в анти-HBsAg увеличивается по сравнению с применением композиций и способов, известных в данной области техники.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 - продукция антител IgG против HBcAg после введения двух доз.

Фиг. 2 - антитела IgG против CR3.

Фиг. 3 - пролиферативный ответ CD8+ CR3 (ВИЧ-1)-специфических Т-клеток.

Подробное описание вариантов осуществления/примеров осуществления

Пример 1. Получение белка HBcAg с различными процентными долями вариантов РНК.

HBcAg получали из штамма Е. coli, который генетически трансформировали плазмидой, которая несла ген, кодирующий этот антиген [Aguilar JC, et al., Immunol Cell Biol (2004) 82:539-46].

При исследовании частиц HBcAg, полученных в результате ферментативного процесса, проводимого в различные периоды времени, наблюдали увеличение доли мРНК, включаемой в препараты HBcAg, полученные при более длительных периодах ферментации. После 20 ч ферментации уровни мРНК в антигене возросли более чем на 20% по сравнению с HBcAg, полученным в процессах продолжительностью до 14 ч, как показано в табл. 1. Никаких существенных изменений в содержании суммарной РНК в частице не обнаружили, поскольку не было обнаружено значимых различий в уровнях суммарной РНК или в отношении содержания РНК/содержания белка. Однако наблюдали значительное увеличение уровня мРНК по сравнению с другими вариантами, в частности рибосомной РНК (рРНК), которая показала снижение своего содержания с повышением мРНК. Никаких других значимых изменений не было обнаружено в отношении связанных с HBcAg минорных компонентов или характерных контаминирующих примесей при исследовании с помощью масс-спектрометрии или других химических и физических анализов.

Таблица 1. Изменение процентного содержания относительно основных типов РНК в HBcAg в зависимости от длительности процесса ферментации

Вариант	тРНК (%)	рРНК (%)	мРНК (%)
1 (10ч)	0, 1	76,3	23, 6
2 (12 ч)	о, 1	60, 0	39, 9
3 (14 ч)	0, 09	54,9	45, 0
4 (16ч)	0, 09	40, 0	59,1 (*)
5 (18ч)	0, 1	34,5	65,5(*)
6 (20 ч)	0, 1	32,8	67,1 (*)

Результаты представляют собой средние значения из пяти измерений. В столбце с названием Вариант продолжительность ферментации указана в круглых скобках. тРНК: транспортная РНК, рРНК:

- 5 040981 рибосомная РНК и мРНК: матричная РНК. (*): значимое различие (р<0,05).

Оценка на мышах Balb/c иммуногенности вариантов HBcAg с различным процентным содержанием мРНК.

После получения различных вариантов HBcAg с различным процентным содержанием мРНК в частице (табл. 1), иммунологические оценки этих препаратов выполняли на мышах Balb/c. Для этого исследования использовали самок мышей возрастом 8-12 недель, сделав две иммунизации в дни 0 и 15, п/к путем, с дозой 1 мкг HBcAg в фосфатно-солевом буфере (PBS), вводимой в конечном объеме 100 мкл. Подробное описание схемы показано в табл. 2.

Таблица 2. Схема иммунизации для оценки влияния процентного содержания мРНК в частице HBcAg на иммуногенность этого антигена

Группа	Лечение	Кол-во животных
1	1 мкг НВсАд (23% мРНК)	10
2	1 мкг НВсАд (39% мРНК)	10
3	1 мкг НВсАд (45% мРНК)	10
4	1 мкг НВсАд (60% мРНК)	10
5	1 мкг НВсАд (65% мРНК)	10
6	1 мкг НВсАд (67% мРНК)	10
7	PBS 1х	10

Забор крови для оценки продукции специфичных антител в результате иммунизации проводили через 10 дней после введения второй дозы. Измерение продукции антител против HBcAg проводили с помощью методики ИФА.

Как показано на фиг. 1, на которой представлены титры антител IgG против HBcAg, полученные в каждой исследуемой группе, продукция IgG против HBcAg была значительно выше в группах, получавших HBcAg с содержанием мРНК выше 45% (группы 3-6 в табл. 2). Между группами 3, 4, 5 и 6 не было обнаружено значимых различий, хотя наблюдали некоторую тенденцию к увеличению ответа IgG, связанному с увеличением процента содержания мРНК. Результаты показывают, что увеличение процентной доли мРНК, содержащейся в частице HBcAg на уровнях выше 45% по отношению к суммарному содержанию РНК, придает этому белку более высокую гуморальную иммуногенность. Предварительные анализы структуры субклассов IgG указывают на аналогичную активность на уровне иммунного ответа клеточного типа.

Пример 2. Получение вирусоподобных частиц (VLP) HBsAg с различными процентными долями фосфатидилсерина.

Рекомбинантный HBsAg получали из штамма генетически трансформированных P. pastoris при использовании гена, который кодирует этот антиген [европейский патент EP 480525]. Как известно, HBsAg, экспрессируемый в дрожжах этого вида, содержит фосфатидилсерин в своих структурных липидах [Lobaina Y, et al., Biotecnologia Aplicada (2008), 25:325-331]. Однако до настоящего изобретения влияние присутствия данного липида на иммуногенность этого антигена не было изучено.

С целью исследования того, как процентная доля фосфатидилсерина влияет на иммуногенность HBsAg, получали препараты указанных VLP при различных условиях ферментации. Во время культивирования в ферментерах для рекомбинантных дрожжей повышали концентрацию Mg⁽²⁺⁾ в среде культивирования до процентного содержания 1,0-2,0%, что приводило к увеличению указанного фосфолипида, связанного с VLP HBsAg. Это было обнаружено с помощью тонкослойной хроматографии в ходе исследования HBsAg, полученного при разных условиях роста.

Фосфатидилсерин связан с VLP HBsAg, что характерно для липида. Результаты, показанные в табл. 3, представляют собой средние значения из пяти разных повторностей. Очистка была аналогичной для всех препаратов HBsAg, полученных при различных экспериментальных условиях. Как можно видеть из таблицы, фосфатидилсерин не было обнаружен в образцах, полученных при ферментации с культуральной средой, содержащей концентрацию Mg⁽²⁺⁾ ниже 1,2%. Уровни фосфатидилсерина, обнаруженные в препарате, полученном с культуральной средой, содержащей 2,0% Mg⁽²⁺⁾, были значительно выше уровней, обнаруженных в препарате, полученном с культуральной средой, содержащей 1,4% Mg⁽²⁺⁾ (вариант С).

- 6 040981

Таблица 3. Получение вариантов HBsAg с повышающимся количеством фосфатидилсерина

Вариант	Концентрация Мд⁽²⁺⁾ (%)	ФС (%)
А	1,0	ND
В	1,2	ND
С	1,4	2,5+0,3
D	1, 6	5,0+0,4 (*)
Е	1,8	6,1+0,4 (*)
F	2,0	7,7+0,5 (**)

ND: не обнаружен, Mg⁽²⁺⁾ (%): концентрация иона Mg (в процентах), обнаруженная в солевых добавках среду культивирования,

ФС (%): процент фосфатидилсерина от общего содержания фосфолипидов, определенный после выделения очищенного HBsAg, (*): значимые различия (р<0,05), (**): высокозначимые различия (р<0,01).

Препараты HBsAg, представленные в табл. 3, были идентичны по белковому составу согласно исследованию, проведенному с целью изучения их первичной, вторичной и третичной структуры, сравниваемой с исходным вариантом. Важно отметить, что отношение концентрации липидов/концентрации белков не изменилось ни для одного из исследуемых вариантов. Тот же результат был получен с процентной долей общего содержания фосфолипидов относительно общего содержания белка. Никакие другие существенные изменения не были зарегистрированы в ходе анализа примесей HBsAg или других минорных соединений в результате анализа их состава с помощью масс-спектрометрии.

Пример 3. Иммунологическая оценка препаратов HBsAg, содержащих различные процентные доли фосфатидилсерина.

С целью оценки, влияет ли присутствие фосфатидилсерина на иммунный ответ против HBsAg, проводили исследование иммуногенности на трансгенных мышах, которые экспрессировали HBsAg в сыворотке [Castro FO, et al., Interferon y Biotecnologia (1989) 6:251-257; Perez A, et al., Acta Biotechnol (1993) 13:373-383]. Использовали семь групп по шесть мышей в каждой. Самок мышей возрастом 8-12 недель иммунизировали интраназальным путем (и/н). Первые шесть исследуемых групп получали по 5 мкг различных вариантов HBsAg, описанных в табл. 3, с адъювантом Фрейнда. Седьмая группа использовалась в качестве контрольной группы и получала PBS 1х. Все группы лечения получали 10 доз иммуногена, который вводили раз в 14 дней. Забор крови проводили перед первичной иммунизацией и через 10 дней после каждой дозы, начиная с третьей дозы. В табл. 4 показаны уровни HBsAg в крови трансгенных мышей, а также уровни цитокинов (IFN гамма (IFN-γ), фактора некроза опухоли (ФНО-α) и IL-2, индуцированных в супернатантах культур спленоцитов, выделенных после введения 10 доз. Анализ проводили при использовании методики ИФА.

После введения 5 мкг HBsAg и/н путем в 10 последовательных иммунизациях, концентрация HBsAg в крови трансгенных мышей по HBsAg была значительно снижена, когда уровень фосфатидилсерина в указанном HBsAg составлял 5% или больше (варианты D, Е и F в табл. 3, пример 2). Аналогичным образом, варианты HBsAg, содержащие 5% или больше фосфатидилсерина, индуцировали значительно более высокие уровни IFN-γ, TNF-α и IL-2 по сравнению с вариантами с низкими (вариант С) или неподдающимися обнаружению уровнями фосфатидилсерина, что указывает на дозозависимый эффект. Это можно видеть в табл. 4.

При сравнении с HBsAg, который не содержит фосфатидилсерин, наблюдали значимое увеличение цитокинов Th1, при этом более высокая способность к элиминации циркулирующего HBsAg была обнаружена после иммунизации трансгенных мышей HBsAg вариантами HBsAg, содержащими уровни фосфатидилсерина больше 5% (табл. 4, варианты D-F). Уровни цитокинов, которые были обнаружены для вариантов D-F, были значительно выше, чем при условиях А-С. Варианты D-F индуцировали наибольшее снижение концентрации HBsAg, а также наиболее активную секрецию цитокинов после in vitro стимуляции клеток селезенки у иммунизированных трансгенных животных.

Таблица 4. Оценка циркулирующего HBsAg и уровней цитокинов после иммунизации трансгенных мышей вариантами HBsAg с разным процентным содержанием фосфатидилсерина

Вариант HBsAg

% снижения концентрации HBsAg

Секреция ΙΕΝ-γ (пг/мл)

Секреция ФНО-α (пг/мл)

Секреция IL-2 (пг/мл)

- 7 040981

А	20+3	5 0+7	37+6	14+6
В	23+4	65+12	45+18	22+4
С	2 6+5	149+15	200+26	3 6+7
D	66+5 (*)	250+20 (*)	570+30 (*)	50+5 (*)
Е	70+6 (*)	300+27 (*)	660+27 (*)	77+8 (*)
F	90+5 (**)	359+31 (**)	750+37 (**)	90+10 (**)

A-F: варианты HBsAg, полученные с повышающимися уровнями фосфатидилсерина в своем составе, показанные в табл. 3, (*): значимые различия (р<0,05), (**): высокозначимые различия (р<0,01).

Наблюдали значимое увеличение цитокинов Th1 и более высокую способность к элиминации циркулирующего HBsAg при иммунизации мышей, которые были трансгенными по HBsAg, вариантами HBsAg, имеющими более высокое содержание фосфатидилсерина, что продемонстрирует увеличение иммуногенности антигена при увеличении процентной доли данного липидного компонента в липидах, связанных с VLP, формируемых этим антигеном.

О введении фосфатидилсерина в частицы HBsAg ранее сообщалось в уровне техники. Однако не было исследовано, каким образом процентная доля этого компонента влияет на иммуногенность указанных частиц. Хотя в 2008 году Лобаина с соавт. обсуждали роль фосфатидилсерина в более высокой иммуногенности HBsAg, продуцируемого в P. pastoris [Lobaina Y, et al., Applied Biotechnology (2008), 25:325-331], в том же сообщении было продемонстрировано, что две вакцины на основе HBsAg, полученные в том же хозяине, отличались по иммуногенности, хотя уровни фосфатидилсерина предположительно были одинаковыми, из-за вида дрожжей, в которых они были получены.

Пример 4. Демонстрация повышения иммуногенности у больных ХГВ вариантов HBcAg, содержащих более высокую процентную долю инкапсулированной мРНК.

В примере 1 было показано на мышах, что присутствовало увеличение иммуногенности HBcAg при увеличении процентной доли мРНК в общем количестве инкапсулированной РНК. С учетом таких результатов, исследовали иммунологические свойства и противовирусный ответ in vivo композиций, включающих HBcAg и HBsAg, с модификациями в отношении их мРНК и фосфатидилсерина, соответствен но.

С этой целью проводили рандомизированное двойное слепое клиническое исследование фазы II у хронических больных гепатитом В. В начале исследования отбирали пациентов с вирусной нагрузкой выше 10000 копий/мл и положительным HBeAg. Пациентов распределяли в 6 групп по 15 пациентов, которым назначали лечение, описанное в табл. 5. В общей сложности вводили 10 доз, которые были разделены на два курса по 5 доз каждый, с интервалом один месяц между ними. Первые 5 доз вводили только и/н путем, а остальные 5 доз вводили одновременно и/н и п/к. В обоих курсах введения дозы вводили с интервалом 14 дней.

Таблица 5. Группы лечения в клиническом исследовании фазы II, в котором проводили оценку антигенов HBcAg и HBsAg с модификациями по содержанию мРНК ___________и фосфатидилсерина, соответственно___________

Группы	Лечение
1	50 мкг mHBsAg+50 мкг mHBcAg
2	100 мкг mHBsAg+100 мкг mHBcAg
3	1000 мкг mHBsAg+1000 мкг mHBcAg
4	50 мкг HBsAg+50 мкг HBcAg
5	100 мкг HBsAg+100 мкг HBcAg
6	1000 мкг HBsAg+ЮОО мкг HBcAg

mHBcAg: HBcAg, содержащий мРНК с процентной долей

50% от суммарной РНК этого антигена, mHBsAg: HBsAg, содержащий 7% фосфатидилсерина от липидных компонентов VLP.

Неожиданно, значительно более высокие уровни сероконверсии в HBeAg и HBsAg были обнаружены в группе пациентов, получавших препарат, содержащий оба модифицированных антигена (т.е. препарат, который содержал HBsAg с уровнями фосфатидилсерина больше 5% и HBcAg с мРНК больше 45%), по сравнению с группами пациентов, получавших препараты без этих характеристик (см. табл. 6). Это демонстрирует значимость таких изменений для улучшения качества противовирусного ответа, который был вызван у пациентов.

У людей антигены оценивали в диапазоне концентраций от 50 мкг каждого антигена на дозу до 1000 мкг каждого антигена на дозу, с подтверждением противовирусного ответа, в отношении сероконверсии в HBsAg и HBeAg, вирусологического контроля и долговременного вирусологического ответа до 10000 копий ДНК ВГВ в мл в течение более 1 года после завершения лечения.

- 8 040981

Таблица 6. Доля пациентов с сероконверсией в HBeAg и HBsAg через год после завершения лечения в клиническом исследовании фазы II с HBeAg и HBsAg, имеющими модификации по содержанию мРНК ________и фосфатидилсерина, соответственно________

Группы лечения	Сероконверсия в HBeAg	Сероконверсия в HBsAg
1	6/15	2/15
2	7/15	3/15
3	12/15	6/15
4	3/15	0/15
5	3/15	0/15
6	4/15	0/15

Подобные результаты также были получены в модели на мышах, которые были трансгенными по HBsAg, где исследование проводили для оценки таких же групп лечения, как описанные в табл. 5, при этом было получено большее уменьшение циркулирующего HBsAg, а также более высокие титры антител против HBsAg и с более ранним появлением, для групп, получающих композиции, которые содержали антигены с модификациями, описанными выше.

Примечательно, что композиции, содержащие варианты модифицированных HBeAg и HBsAg, развивали более высокую Th1 иммуногенность у мышей, трансгенных по ВГВ, и у пациентов по сравнению с реакцией, полученной с композициями, содержащими немодифицированные антигены, или композициями, которые содержали только один из этих модифицированных антигенов.

Пример 5. Адъювантный эффект антигенов HBeAg и HBsAg, имеющих модификации по содержанию мРНК и фосфатидилсерина, соответственно, в поливалентных композициях.

В этом исследовании сравнивали адъювантную способность, т.е. усиление иммунного ответа против антигенов, которые вводили совместно, в смеси рекомбинантных белков HBeAg и HBeAg с модификациями по содержанию мРНК и фосфатидилсерина, соответственно, со смесью немодифицированных HBeAg и HBsAg, парентеральным и мукозальным путями. Для этой цели был выбран рекомбинантный химерный белок CR3, который является мультиэпитопным антигеном ВИЧ-1 [Iglesias E et al., J Biochem Mol Biol & Biophys (2001) 1:109-122]. В восьми группах по восемь самок мышей Balb/c (H-2^d) возрастом 6-8 недель вводили:

1) PBS (плацебо) путем п/к иммунизации (далее именуемый плацебо (п/к));

2) натрий-ацетатный буфер (NaAc), pH 5,2, путем и/н иммунизации (плацебо (и/н));

3) смесь HBcAg (С) и HBsAg (S) п/к (C+S (п/к));

4) смесь HBcAg, содержащего мРНК в процентной доле 50% от суммарной РНК данного антигена (mC), и HBsAg, содержащего 7% фосфатидилсерина от липидных компонентов (mS) п/к (mC+mS (п/к));

5) C+S и/н (C+S (и/н));

6) mC+mS и/н (mC+mS (и/н));

7) смесь CR3 с HBcAg (С) и HBsAg (S) п/к (CR3+C+S (п/к));

8) CR3+mC+mS (п/к);

9) CR3+C+S (и/н) и

10) CR3+mC+mS (и/н).

Используемая доза составляла 5 мкг каждого антигена на каждый путь введения, при этом иммуногены вводили в дни 0, 7 и 21 схемы иммунизации. Для п/к иммунизации белки растворяли в PBS и адсорбировали в 1,4 мг/мл гидроксида алюминия (Superfos Biosector A/S, Vedbaek, Denmark). Для и/н пути белки растворяли в NaAc, pH 5,2. Животным, помещенным в положение лежа на спине, делали анестезию путем внутрибрюшинного (в/б) введения 30 мкг кетамина (10 мг/мл) и медленно вводили иммуногены в 50 мкл (25 мкл/в ноздрю) через наконечник пипетки. Через десять дней после иммунизации сыворотку всех животных собирали и пять животных умерщвляли (случайным образом) в конце исследования для получения их селезенки для исследований клеточного иммунного ответа.

Продукцию IgG в сыворотке оценивали с помощью непрямого ИФА, в котором планшеты были покрыты белком CR3. Методика количественного анализа секреции IFN-γ в супернатантах культур, стимулируемых с CR3, была описана ранее [Garcia Diaz D et al., Immunol Lett (2013) 149:77-84].

Распределение Гаусса оценивали для статистического анализа данных с использованием критерия Колмогорова-Смирнова и равенства дисперсий с критерием Бартлетта. Образцы с нормальным распределением (или такие, в которых определяли распределение Гаусса) и с равной дисперсией сравнивали с параметрическими критериями; в противном случае использовали альтернативный непараметрический критерий. Все титры IgG были преобразованы в log 10 для получения нормального распределения значений. Сывороткам животных, которые не достигали сероконверсии, присваивали произвольный титр 1:10 для статистической обработки. Значение р<0,05 считали статистически значимым.

Результаты определения IgG антитела против CR3 (ВИЧ-1), наблюдаемого на фиг. 2, показали более высокий ответ (р<0,05) после введения п/к и и/н путями в группах животных, иммунизированных смесью CR3+mC+mS (группы 8 и 10) в сравнении с CR3+C+S (группы 7 и 9), соответственно. В соответ

- 9 040981 ствии с предыдущими результатами более высокую секрецию IFN-γ также наблюдали в супернатантах культур мышей в тех же группах, которые представлены в табл. 7. Для этого анализа через десять дней после последней иммунизации (день 31) культивировали спленоциты пяти мышей из каждой группы. Суспензии спленоцитов отдельных животных подготавливали для группы плацебо. Их стимулировали ex vivo 2,5 мкг/мл белка CR3 в течение пяти дней. В супернатантных жидкостях CR3-специфический IFN-γ определяли количественно с помощью ИФА сэндвич-типа. Предел обнаружения составлял 0,80 нг/мл.

Таблица 7. Секреция IFN-γ, измеренная в супернатантных жидкостях культур

Группа	Инокулят	Повторность (мышь)	IFN-γ (нг/мл)
1	Плацебо (п/к)	Пул	<0, 80
2	Плацебо (и/н)	Пул	<0, 80
		1	<0, 80
		2	<0, 80
3	C+S (п/к)	3	<0, 80
		4	<0, 80
		5	<0, 80
		1	<0, 80
		2	<0, 80
4	mC+mS (п/к)	3	<0, 80
		4	<0, 80
		5	<0, 80
		1	<0, 80
	C+S (и/н)	2	<0, 80
5	3	<0, 80
		_ 4	<0, 80
		5	<0, 80
		1	<0, 80
		2	<0, 80
6	mC+mS (и/н)	3	<0, 80
		4	<0, 80
		5	<0, 80
		1	6,35
		2	7,86
7	CR3+C+S(п/к)	3	3,32
		4	4,45
		5	3,54
		1	10,35
		2	9,86
8	CR3+mC+mS (п/к)	3	8,62
		4	9,05
		5	11,24
		1	<0, 80
		2	2,03
9	CR3+C+S(и/н)	3	1,68
		4	0,97
		5	2,25
		1	4,55
		2	5,36
10	CR3+mC+mS (и/н)	3	3,87
		4	2,54
		5	3,98

Наконец, процент CD8+ клеток, которые являются специфичными к CR3 (ВИЧ-1), сравнивали после ex vivo стимуляции в группах, иммунизированных п/к путем. Более высокий процент CD8+ клеток был получен в группе, стимулируемой CR3+mC+mS (п/к) в сравнении с CR3+C+S (п/к) (р<0,05), что можно наблюдать на фиг. 3.

Эти результаты в целом показывают, что смесь HBcAg, содержащего мРНК выше 45% (mC), и HBsAg с уровнями фосфатидилсерина выше 5% (mS) проявляет более сильный Th1 адъювантный эффект при введении парентеральным и мукозальным путями. В частности, в случае вакцинации против ВИЧ, этот результат крайне важен, поскольку противовирусный Th1 ответ связывали с защитой от инфекции и прогрессирования в СПИД.

Хотя целью этого эксперимента не было измерение гуморального ответа против антигенов HBsAg и HBcAg (сокращенно обозначенных в данном примере как С и S), наблюдали ответы IgG против HBcAg и против HBsAg, которые были более высокими и статистически значимыми, в группах мышей, иммунизированных смесью модифицированных антигенов HBsAg и HBcAg (mC+mS), по сравнению со смесью немодифицированных HBsAg и HBcAg (C+S, данные не показаны). Это подтверждало приведенные выше результаты.

- 10 040981

Пример 6. Пассивная иммунизация посредством адоптивного переноса клеток от мышей Balb/c, иммунизированных композициями HBcAg и HBsAg с модификациями по содержанию мРНК и фосфатидилсерина, соответственно, трансгенным мышам Balb/c, экспрессирующим HBsAg.

В этом изобретении авторы постарались усилить иммунный ответ против HBsAg и против HBcAg у доноров посредством активной иммунизации пациентов композицией, содержащей антигены HBsAg и HBcAg, которые включают модификации по содержанию фосфатидилсерина и мРНК, соответственно, и, кроме того, клетки, подлежащие переносу, будут активировать in vitro до переноса, поэтому ответ на эти антигены будет максимальным, когда клетки будут инокулировать в организм реципиента. Таким образом, тип ответа, который не существует у пациентов, получают искусственно, что позволяет расширить группу доноров до лиц с подобными гаплотипами, независимо от того, были ли они инфицированы ВГВ или нет.

В текущем примере с помощью адоптивного переноса клеток оценивали влияние иммунного ответа, вызванного в результате вакцинации с использованием композиции, состоящей из антигенов HBsAg и HBcAg с модификациями по содержанию фосфатидилсерина и мРНК, соответственно, которую применяли и/н/парентеральным путями, в отношении трансгенной мыши, которая экспрессирует HBsAg, модели персистентной инфекции ВГВ. Одной из целей исследования являлась оценка влияния перенесенного иммунного ответа на концентрацию HBsAg (антигенемия) в сыворотке трансгенной мыши. Кроме того, сравнивали влияние ответа, вызванного комбинацией и/н/парентерального путей при введении композиции антигенов HBsAg и HBcAg в сравнении с влиянием, вызванным переносом клеток, стимулируемых только HBsAg in vivo и in vitro. Кроме того, изучали кинетику перенесенной продукции антител против HBsAg в отношении трансгенной мыши для этого антигена. Использовали мышей Balb/c и мышей, которые были HBsAg (+) трансгенными (с генетическим фоном Balb/c, полученных в CIGB).

Получение мышей Balb/c с иммунитетом против HBsAg Курс иммунизации проводили на самках мышей Balb/c возрастом 8-12 недель. Мышей иммунизировали препаратом вакцины, содержащим модифицированные антигены HBsAg (с содержанием фосфатидилсерина больше 5%) и HBcAg (с содержанием мРНК больше 45%), одновременно и/н и парентеральным путями. В случае парентерального введения тестировали в/м, п/к и в/к пути. Дозу (в объеме 100 мкл) вводили в дни 0 и 14 и повторную иммунизацию делали в день 100 перед переносом. Забор крови делали из ретроорбитального сплетения в дни 2, 10 и 25. В табл. 8 показана схема иммунизации, включающая лечение, полученное каждой группой.

Таблица 8. Схема иммунизации у нетрансгенных мышей Balb/c

Группа	Лечение	Путь введения	Количество животных
1	тНВзАд+тНВсАд+квасцы/тНВзАд+тНВсАд	в/м/и/н	13
2	mHВsАд+тНВсАд+квасцы/mHВsАд+тНВсАд	п/к/и/н	13
3	mHВsАд+тНВсАд+квасцы/mHВsАд+тНВсАд	в/к/и/н	13
4	тНВзАд+тНВсАд/тНВзАд+тНВсАд	в/м/и/н	13
5	тНВзАд+тНВсАд/тНВзАд+тНВсАд	п/к/и/н	13
6	тНВзАд+тНВсАд/тНВзАд+тНВсАд	в/к/и/н	13
7	квасцы/PBS	в/м/и/н	9

mHBcAg: HBcAg, содержащий мРНК в процентной доле 50% от суммарной РНК данного антигена, mHBsAg: HBsAg, содержащий 7% фосфатидилсерина от общего содержания липидных компонентов VLP.

Оценку иммунного гуморального ответа, полученного в результате лечения, проводили путем измерения продукции IgG и субклассов IgG против HBsAg, после каждой прививки, с помощью методики ИФА. Для оценки клеточного иммунного ответа, через 10 дней после первого введения, проводили исследование по типу ELISPOT, для измерения секреции специфического IFN-γ против HBsAg CD8+ лимфоцитами селезенки. Результаты этих оценок указывают, что группа 5 производит наиболее сильный клеточный ответ и гуморальный ответ, который не отличается от остальной части исследуемых групп. На основе этого отобрали двух животных из этой группы в качестве доноров спленоцитов для адоптивного переноса. Выбор иммуногена проводили при соотношении 1:1 (HBsAg:HBcAg)

Получение иммунных спленоцитов.

Через пятнадцать дней после получения бустерной иммунизации, двух мышей из группы 5 и трех мышей из группы 7 (плацебо) умерщвляли и забирали их селезенку. Селезенки из группы 5 и из группы 7, соответственно, группировали. Селезенки обрабатывали для получения спленоцитов. Их делили на аликвоты по 30х10⁶ клеток в 100 мкл PBS 1х для переноса реципиентным мышам.

Адоптивный перенос иммунитета.

Трансгенные мыши, экспрессирующие HBsAg, которых использовали в качестве реципиентов, имели возраст 16-20 недель и были представлены обоими полами. Их распределяли в различные группы лечения, как показано в табл. 9. Перед переносом спленоцитов проводили частичный забор крови для проверки уровней HBsAg в сыворотке. Затем вводили (в/б путем) 30х10⁶ спленоцитов в объеме 100 мкл PBS 1х. Забор крови для оценки эффекта адоптивного переноса иммунитета производили из ретроорбиталь

-

Claims

ного сплетения раз в неделю в течение 5 недель. В неделю 8 после переноса у животных забирали кровь и умерщвляли.

Таблица 9. Схема эксперимента по адоптивному переносу иммунитета

Группа Лечение Количество животных

1 Перенос спленоцитов мышей Balb/c с ответом против HBsAg и HBcAg 3

2 Перенос спленоцитов мышей Balb/c из группы плацебо 3

3 PBS 1х 3

Количественный анализ HBsAg в сыворотке мышей, трансгенных по HBsAg.

Уровни HBsAg в сыворотке определяли с помощью ИФА. Планшеты покрывали моноклональным антителом против HBsAg, названным Нер4 (произведства CIGB). Все мыши, получавшие клетки с предыдущим иммунитетом к HBsAg, показали при оценке через неделю после переноса заметное уменьшение HBsAg в сыворотке, со значимыми различиями между нулевым моментом и 2-й и 3-й неделями (р<0,05).

В четвертую неделю (день 35) заметили, что концентрации HBsAg в сыворотке начали увеличиваться, что указывало на то, что контроль антигенемии посредством перенесенного иммунитета снижается. С этого момента и до недели 8 (день 63) не наблюдали никаких различий в антигенемии, наблюдаемой в нулевой момент исследования.

В случае мышей, подвергнутых переносу спленоцитов со специфическим иммунитетом против HBsAg, обнаружили заметные снижения HBsAg в сыворотке, которые были наболее заметными в дни 728. Однако мыши, которые получали плацебо перенос спленоцитов или PBS, хотя и имели изменения концентрации HBsAg в сыворотке, но они не достигали значимого различия с нулевым моментом, и значения ниже 5 мкг/мл никогда не регистрировали.

Эти результаты указывают, что с помощью адоптивного переноса иммунитета, опосредованного клетками, можно эффективно снизить уровни HBsAg, циркулирующего в сыворотке этих животных, трансгенных по этому белку. Контроль, установленный в отношении антигенемии иммунным ответом, перенесенным в данном случае, был эффективным и продолжался в течение приблизительно 3 недель после однократного переноса клеток.

Продукция IgG против HBsAg в сыворотке.

Специфичный гуморальный иммунный ответ IgG против HBsAg был обнаружен у всех мышей, подвергнутых переносу спленоцитов с предшествующим иммунитетом к этому антигену. Это согласуется с полученными результатами по антигенемии. У животных с ответом против HBsAg обнаруженные титры были высокими (титр>10⁴) и начинали снижаться в третью неделю, что может быть связано с повышением антигенемии, которое наблюдали у этих животных приблизительно в 4-ю неделю (день 35). Группы, подвергнутые переносу плацебо клеток или PBS, не показали наличия специфичных антител.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Фармацевтическая композиция, содержащая ядерный антиген вируса гепатита В (HBcAg) и поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg), отличающаяся тем, что ядерный антиген вируса гепатита В (HBcAg) включает матричную рибонуклеиновую кислоту (мРНК) в процентной доле от 45 до 67,1% от общего количества рибонуклеиновой кислоты (РНК) этого антигена, и поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg) включает фосфатидилсерин в количестве от 5 до 8,2% от общего количества фосфолипидов этого антигена.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что она содержит пропорции антигенов 1:1 от концентрации белков.
3. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что она составлена для введения парентеральным и мукозальным путями.
4. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно включает адъювант вакцины.
5. Применение фармацевтической композиции, которая содержит ядерный антиген вируса гепатита В (HBcAg), который включает матричную рибонуклеиновую кислоту (мНК) в количестве от 45 до 67,1% от общего количества рибонуклеиновой кислоты (РНК) этого антигена, и поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg), который включает фосфатидилсерин в количестве от 5 до 8,2% от общего количества фосфолипидов этого антигена, в получении лекарственного средства, предназначенного для применения в иммунной профилактике или иммунотерапии против инфекции, вызываемой вирусом гепатита В (ВГВ).
6. Применение по п.5, где лекарственное средство предназначено для введения парентеральным и мукозальным путями.
7. Применение по п.5, где лекарственное средство используют в лечении пациентов с хроническим гепатитом В (ХГВ) или пациентов с коинфекциями, где одним из инфицирующих вирусов является вирус гепатита В.

-