CN110944662A - 用于治疗和/或预防hbv感染的组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本申请涉及用于治疗和/或预防HBV感染和HBV感染介导的疾病的组合物及其方法。在一些实施方案中，所述组合物包含聚核糖肌苷‑聚核糖胞苷酸(PIC)、至少一种抗生素或多氨基化合物、至少一种正价离子以及HBV表面抗原。在一些实施方案中，所述组合物包含PIC、至少一种抗生素或多氨基化合物、至少一种正价离子、HBV表面抗原和HBV核心抗原。本申请还涉及一种治疗和/或预防HBV感染的方法，特别是用于治疗慢性HBV感染。

Description

用于治疗和/或预防HBV感染的组合物及其用途

相关申请

本申请要求2017年8月10日提交的新加坡申请10201706540X的优先权。上述申请的全部内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本申请涉及用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒(HBV)感染和HBV感染介导的疾病的组合物。更具体地，本申请涉及组合物，其包括聚肌苷酸-聚胞苷酸(PIC)、至少一种抗生素或多氨基化合物、至少一种正价离子、HBV表面抗原、和/或HBV核心抗原。本申请还涉及治疗和/或预防HBV感染或HBV感染介导的疾病的方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)感染是世界范围的一个主要的健康问题。大约有20亿人携带乙肝病毒，而这些人当中大约有4亿人仍持续性感染(EuropeanAssociation for the Study of the Liver,EASL Clinical Practice Guidelines:management of chronic hepatitis B virus infection.J.Hepatol.2012.57(1):167–185)。15％至40％的慢性感染患者可发展为肝硬化、肝功能衰竭或肝癌(Lok AS,McMahonBJ,Chronic hepatitis B:update 2009.Hepatology.2009.50(3):661–662)。估计每年有600000人死于慢性感染的后果，如肝硬化和肝癌(Lok AS等人Chronic HepatitisB.Hepatology.2007.45:507–539；World Health Organisation,Hepatitis B(Fact sheetN°204).2013；National Institutes of H.National Institutes of Health consensusdevelopment conference statement:Management of Hepatitis B.Ann InternMed.2009.150:104-110)。

目前，预防性乙型肝炎疫苗中使用10μg或20μg HBV表面抗原(HBsAg)。然而，对于进行血液透析治疗的患者或者移植前的患者，施用40μg HBsAg(Mahoney FJ.,Update onDiagnosis,Management,and Prevention of Hepatitis B Virus Infection,Clin.Microbiol.Rev.1999，12:351–366；Bock M等人,Hepatitis B vaccination inhaemodialysis patients:Arandomized clinical trial.Nephrology 2009；14:267–272；Somi MH等人.Improving hepatitis B vaccine efficacy in end-stage renaldiseases patients and role of adjuvants.ISRN Gastroenterol.2012；2012:960413；Bauer T和Jilg W.,Hepatitis B surface antigen-specific T and B cell memory inindividuals who had lost protective antibodies after hepatitis B vaccination,Vaccine 2006；24:572–577)。在临床条件下，施用包含60μg、80μg和90μg HBsAg的疫苗是安全的。

乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg位于HBV颗粒的内部组分中，是HBV感染或HBV感染介导疾病的一个标志。美国专利申请20170049817披露了使用经改造的HBcAg来制备抗HBV组合物。所述美国专利申请20170049817的全部内容并入此处作为参考。

除此之外，某些患者对于HBV易感，并且对标准免疫程序具有抗性。终末期肾病患者在血液透析时，比一般人群具有更高的患病率和更差的预后。然而，针对尿毒症患者或移植前的患者进行HBV疫苗接种后，比具有免疫能力的个体呈现出显著降低的血清转化速率。即便产生了保护性抗体，峰值抗体滴度也很低，并且免疫反应持续时间短(Bauer T和JilgW.,Hepatitis B surface antigen-specific T and B cell memory in individualswho had lost protective antibodies after Hepatitis B vaccination,Vaccine2006；24:572–577；Bock M,Barros E and JV Veronese F,Hepatitis B vaccination inhaemodialysis patients:A randomized clinical trial,Nephrology 2009；14,267–272)。

当将包含40μg HBsAg(通常使用剂量的双倍)的疫苗施用给透析患者时，在透析患者中疫苗的效果不令人满意，并且仅仅在大约50-60％接受疫苗接种的受试者中表现出保护性抗体(Mary S等人，High-Dose Hepatitis B Vaccine in Patients Waiting forLung Transplantation,Presentation at the Fifth Annual Conference on VaccineResearch,Baltimore,Maryland,May 7,2002)。

另外，急性感染HBV后，只有5％的成人发展为慢性感染。如果受试者是在围产期感染，则其更可能发生慢性感染。初次急性感染之后，25％到30％的5岁以下的儿童发展成慢性感染，而90％的HBeAg阳性母亲生出的婴儿具有发展成慢性感染的风险(Mahoney FJ,Update on Diagnosis,Management,and Prevention of Hepatitis B Virus Infection,Clin.Microbiol.Rev.1999；12:351–366)。此外，急性感染后免疫抑制的患者(比如，HIV感染)容易发生慢性HBV感染(Mehta N等人Impaired generation of hepatitis B virus-specific memory B cells in HIV infected individuals followingvaccination.Vaccine.2010.7；28(21):3672-8)。

美国食品药品管理局(US FDA)已批准以下药物作为治疗慢性HBV感染的替代品：聚乙二醇(PEG)修饰的IFN-α和核苷或核苷酸类似物(例如拉米夫定等)。治疗慢性HBV感染与这些药物均旨在阻止疾病的进展，这意味着需要长期施用抗病毒药物或PEG修饰的IFN-α。

然而，目前的抗病毒治疗通常是失败的。约30％的患者达到治疗目标，而这些患者中仅有10％被认为治愈。长期的抗病毒疗法更有可能导致对病毒的抗性，而IFN-α可导致显著的副作用(Nebbia G等人.Hepatitis B infection:current concepts and futurechallenges.QJM.2012.105(2):109-13)。因此，仍然需要一种具有良好治疗效果的治疗用于慢性感染。

在急性感染后恢复的患者中观察到多特异性的抗病毒CD4⁺和CD8⁺T细胞反应。这些反应比慢性患者中的反应更加强烈，在慢性患者中病毒特异性的T细胞反应是微弱的并且是瞬时的(Webster,G.J等人.Longitudinal analysis of CD8⁺Tcells specific forstructural and nonstructural Hepatitis B virus proteins in patients withchronic Hepatitis B:implications for immunotherapy.J Virol.2004；78:5707–5719；Urbani,S等人.Acute phase HBV-specific T cell responses associated with HBVpersistence after HBV/HCV co-infection.Hepatology.2005；41:826–831)。

因此，有效地激活CD4⁺和CD8⁺T细胞免疫反应是开发治疗性疫苗的一种潜在策略(Sobao Y等人J Hepatol 2002；36:105-15；Sette AD等人The Journal of Immunology2001；166:1389–1397；Chang,J.J等人J Virol 2005；79:3038–3051；Guidotti LG等人Science 1999；284:825-9；Webster,G.J等人Hepatology 2000；32:1117-1124；Wieland,S.F.&Chisari,F.V.J Virol 2005；79:9369-9380；Webster,G.J等人J Virol 2004；78:5707–5719；Urbani,S等人Hepatology 2005；41:826–831；Maini,M.K等人J Exp Med 2000；191:1269–1280)。

曾有报道高滴度CD4⁺和CD8⁺T细胞免疫反应能够在急性HBV感染中清除病毒(MaryS等人,High-Dose Hepatitis B Vaccine in Patients Waiting for LungTransplantation,在2002年5月7日在马里兰州巴尔的摩举行的第五届疫苗研究年度会议上的演讲；Rehermann B等人.Nature Reviews Immunology 2005；5:215-229；BertolettiA等人.Journal of Hepatology 2003；39:115-124；Bertoletti A等人，Journal ofGeneral Virology 2006；87:1439–1449；Guidotti LG等人Ann Rev Immunol 2001；19:65-91；Ferrari C等人J Immunol 1990；145:3442-9；Penna A等人J Clin Invest 1996；98:1185-94；Penna A等人Hepatology 1997；25:1022-7；Rehermann B等人J Exp Med1995；181:1047-58；Jung M等人Virology 1999；261:165-72)。

基于临床前研究的观察，一些方法能够降低HBV DNA的载量。例如，一种方法是在疫苗接种之前采用拉米夫定(Lamivudine)进行短期抗病毒冲洗。还例如，一些方法包括激发对HBsAg疫苗的T细胞介导的免疫反应(Bertoletti A等人Curr Opin Immunol 2000；12:403-8；Chisari FV.American Journal of Pathology 2000；156:1117-1132；Kakimi K等人J Exp Med 2000；192:921-30；Kakimi K等人J Immunol 2001；167:6701-5；Thimme R等人J Virol 2003；77:68-76；Pol S等人Lancet.1994；344:342；Mancini M等人Proc NatlAcad Sci USA.1996；93:12496-12501)。

铝(Alum)佐剂通常用于激发抗体介导的免疫，并有助于建立对HBV感染有效的预防。但是，铝佐剂不能产生有效的T细胞介导的免疫反应。

在动物实验中已经证实聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC，也称为Poly I:C)是一种强效的免疫调节剂，但是在人类中效果不佳，这可能是由于快速被人血清核酸酶降解。

一种稳定化的PIC，也称为PIKA(一种包含PIC、一种或多种抗生素或多氨基化合物、一种或多种正价离子、及用于制备PIKA的任何其他物质的组合物)，能够溶于pH 6.0至8.0的溶液中。PIKA能够增强中和抗体的产生，并诱导T细胞介导的免疫(Li L等人ZhongGuo Mian Yi Xue Za Zhi 2006；22:983-986)。根据本公开，PIC、抗生素以及正价离子可以是WO2006/131023中公开的那些。通过引用，将WO2006/131023中的全部内容并入此处作参考。

美国专利申请公开号20090136538A1披露市售乙肝疫苗是液体悬液，其通过将纯化的HBsAg吸附于氢氧化铝佐剂而形成。乙肝疫苗是一种热稳定性的疫苗，但是据报道，在20-26℃放置9个月、在36-40℃放置1个月、以及在45℃放置3天后，能够观察到50％的疫苗效价丢失。因此需要一种稳定的乙肝疫苗，其能够扩大免疫接种的范围并且提高免疫接种的安全性，特别是在一些发展中国家或地区。美国专利公开号20090136538A1的所有内容并入此处作为引用。

发明内容

本公开提供了用于治疗和/或预防HBV感染或HBV感染介导的疾病的组合物及其使用方法。在一些实施方案中，所述组合物包含PIC、至少一种抗生素或多氨基化合物、至少一种正价离子和HBsAg。在一些实施方案中，所述组合物包含PIC、至少一种抗生素或多氨基化合物、至少一种正价离子、HBsAg和HBcAg。

在一些实施方案中，PIC在组合物中的浓度范围为250μg/单位剂量到6000μg/单位剂量。在一些实施方案中，HBsAg与PIC的比例为1：50到1：5。在一些实施方案中，HBcAg与PIC的比例为1:50到1:5。

在一些实施方案中，所述单位剂量以体积表示，其范围为0.1ml到250.0ml。

根据本公开的一方面，组合物能够引起保护性抗体产生，和/或CD4⁺及CD8⁺T细胞介导的免疫反应。所述组合物能够预防HBV感染、减轻HBV感染、阻止HBV感染发展和/或消除HBV。

根据本公开的一方面，所述组合物能够施用到未感染HBV的受试者、慢性HBV的受试者、以及急性HBV的受试者中，并引起或增强对HBV的免疫反应。

根据本公开的一方面，所述组合物以一定的频率施用到受试者。在一些实施方案中，所述频率包括两个月一次、两个月两次、两个月三次、两个月四次、两个月五次、一个月一次、一个月两次、三周一次、三周两次、两周两次、两周一次和一周一次。

根据本公开的另一方面，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含至少一个容器。在一些实施方案中，所述容器包含组合物，或者包含所述组合物中的至少一个组分。

附图说明

本公开进一步通过示例性实施方案的形式阐述。一些示例性实施方案的细节将联系附图进行说明。这些实施方案是非限制的示例性实施方案，其中类似的引用数字在附图的多个视图中代表相似的结构，其中：

图1表示根据本公开的一些实施方案施用后，小鼠抗HBsAg IgG的产生；

图2表示根据本公开的一些实施方案施用后，小鼠抗HBsAg IgG1的产生；

图3表示根据本公开的一些实施方案施用后，小鼠抗HBsAg IgG2a的产生；

图4是图，其表示根据本公开的一些实施方案施用后，小鼠脾细胞中IFN-γ斑点形成细胞的数量；

图5是图，其表示根据本公开的一些实施方案施用后，健康人受试者PBMC中IFN-γ斑点形成细胞的数量；

图6表示根据本公开的一些实施方案，全剂量组中一位受试者的流式图谱；

图7表示根据本公开的一些实施方案，疫苗接种的健康人受试者在一个单肽刺激下PBMC细胞因子的产生；

图8表示根据本公开的一些实施方案，组合物在HBV转基因小鼠中的效果。

具体实施方式

在以下详细描述中，许多具体细节是通过举例的形式进行揭示，以便于提供对本公开的全面理解。但应当注意的是，对于本领域的普通技术人员而言显而易见的是，可能无需这些细节就可以实现本公开的内容。对本领域的普通技术人员而言显而易见的是，对于已披露的实施方案可以有许多的修改，在不背离本公开的精神和范围的情况下，本公开限定的一般性原理仍然适用于其他实施方案和应用。

应当理解，除非另有定义，本公开的所有技术性和科学性术语与本领域普通技术人员理解的一致。

应当理解，单数形式“一种(a)”、“和”和“该”，都包括了复数指代，除非上下文另有明确说明。如本文所用，术语“和/或”包含了一个或多个相关列举事物的任何和所有组合。进一步地，应理解，当用于本公开时，术语“包括”和/或“包含”，限定元件、步骤、操作、和/或组分的存在，但是并不排除一个或多个其他元件、步骤、操作、和/或组分的存在或者添加。

应当注意，除非另有定义，术语“治疗”或“治疗”，是指通过施用组合物，和引起或增强免疫反应，减轻HBV感染、阻止疾病发展和/或消除HBV。除非另有定义，术语“预防”或“预防”，是指施用组合物，和引起或增强免疫反应，形成对病毒侵袭的有效防御。

本公开提供了一种用于治疗和/或预防HBV感染的组合物。在本公开的一些实施方案中，所述组合物包含PIC、至少一种抗生素或多氨基化合物、至少一种正价离子和HBsAg。在本公开的一些实施方案中，所述组合物还包含HBcAg和/或实施组合物的任何其他组分。

应当注意的是，所述组合物的组分是非限制性的。根据本公开的一些实施方案，所述组合物的组分是通过一个或多个具体因素，通常是一个或多个具体因素的组合来最好地定义。所述具体因素可包括分子量、分子大小、浓度、PH、溶解度，或根据本公开的任何其他因素。比如，所述组合物可包含一些物质(如碳酸氢钠)来调节组合物的PH。

根据本公开的一些实施方案，组合物的PIC分子在分子量上是异质的。本文所用的术语“异质”表示组合物中的PIC分子具有不同的分子量。在一些实施方案中，可用于组合物中的PIC分子的分子量等于或大于66,000道尔顿(66,000道尔顿的等于6.4沉降系数单位(Svedbergs))。例如，可用于组合物中的PIC分子的分子量为66,000道尔顿至1,200,000道尔顿(即，6.4至24.0沉降系数单位)。作为另一个示例，PIC分子的分子量可以大于150,000道尔顿。在一些实施方案中，PIC分子的分子量范围可以是100,000道尔顿至200,000道尔顿、300,000道尔顿至4,000,000道尔顿、500,000道尔顿至1,000,000道尔顿、1,000,000道尔顿至1,500,000道尔顿、1,500,000道尔顿至2,000,000道尔顿、2,000,000道尔顿至2,500,000道尔顿、2,500,000道尔顿至3,000,000道尔顿、3,000,000道尔顿至3,500,000道尔顿、3,500,000道尔顿至4,000,000道尔顿、4,000,000道尔顿至4,500,000道尔顿、或4,500,000道尔顿至5,000,000道尔顿。

根据本公开的一些实施方案，组合物中的抗生素可以是：泰百霉素、蒽环霉素、丁苷菌素硫酸盐、庆大霉素、潮霉素、艾米康丝菌素、双去氧卡那霉素、暗霉素、β-内酰胺、新霉素、嘌呤霉素、链霉素、链脲霉素、卡那霉素、或类似抗生素、或任何组合。在一些实施方案中，所述抗生素是卡那霉素。

根据本公开，抗生素的浓度范围为10单位/ml至100,000单位/ml。在一个具体的实施方案中，抗生素的浓度范围为100单位/ml至10,000单位/ml。在另一个具体的实施方案中，抗生素的浓度范围为500单位/ml至5,000单位/ml。应当注意的是，所述浓度可以根据多个因素来设定，如长期或高剂量使用抗生素的副作用、抗抗生素微生物的诱导等。在一些实施方案中，基于临床前的安全性和毒理学评价，抗生素(如卡那霉素)的浓度不超过1000IU/ml。

应当注意，对于本领域普通技术人员而言，抗生素和浓度是非限制性的。在一些实施方案中，抗生素和浓度可以根据受试者特征(如年龄、抗生素过敏性等)及任何其他特征来进行设定。比如说，对于年龄小于5岁的儿童，抗生素浓度可以降低。比如说，对于对青霉素类抗生素过敏的受试者，组合物中的抗生素可以是非青霉素类的抗生素(比如卡那霉素等)。

根据本公开的一些实施方案中，通过盐或者复合物提供正价离子，所述盐或复合物包括有机或无机的盐或复合物(比如，氯化物、氟化物、氢氧化物、磷酸盐、硫酸盐等)。例如，正价离子可以是钙，其可以通过碳酸钙、氯化钙、氟化钙、氢氧化钙、磷酸钙或硫酸钙提供。示例性正价离子包括，但不限于：钙、镉、锂、镁、铈、铯、铬、钴、氘、镓、碘、铁、和/或锌。在一个具体的实施方案中，所述的正价离子可以是钙离子。根据本公开的一些实施方案，正价离子的浓度范围可以是0.01μmol/单位剂量至10mmol/单位剂量。在一个具体的实施方案中，正价离子的浓度范围是0.02μmol/单位剂量至5mmol/单位剂量。在另一个具体的实施方案中，正价离子的浓度范围是0.1μmol/单位剂量至1mmol/单位剂量。在一个更具体的实施方案中，正价离子的浓度范围是0.1μmol/单位剂量至100μmol/单位剂量。

根据本公开的一些实施方案中，PIC的浓度范围为250μg/单位剂量至6000μg/单位剂量。在一些实施方案中，PIC的浓度可以是250μg/单位剂量、500μg/单位剂量、1000μg/单位剂量、1500μg/单位剂量、2000μg/单位剂量、3000μg/单位剂量、4000μg/单位剂量、5000μg/单位剂量、或6000μg/单位剂量。所述PIC的浓度是非限制性的。PIC的浓度可以是250μg/单位剂量和6000μg/单位剂量之间的任何数值。例如，PIC的浓度范围可以是500μg/单位剂量至4000μg/单位剂量、1000μg/单位剂量至3000μg/单位剂量、1000μg/单位剂量至2500μg/单位剂量。

根据本公开的一些实施方案，当组合物施用于成人时，PIC的浓度可以是500μg/单位剂量、1000μg/单位剂量、1500μg/单位剂量、2000μg/单位剂量、或500μg/单位剂量和2000μg/单位剂量之间的任何数值。当组合物施用于青少年(如儿童)时，PIC的浓度可以是250μg/单位剂量、500μg/单位剂量、1000μg/单位剂量、1250μg/单位剂量、或250μg/单位剂量和1250μg/单位剂量之间的任何数值。

根据本公开的一些实施方案，单位剂量可以代表重量、体积或具体剂量组合物的任何其他特征。比如，单位剂量可以代表组合物的一个单独包装(比如，片剂)的体积。单位剂量也可以代表组合物中某一种组分的重量、体积或者其他任何特征。比如单位剂量可以代表一个特定剂量组合物中PIC或PIKA的浓度。在一些实施方案中，单位剂量可以代表一个特定剂量的组合物的体积。仅仅举例而言，由一个单独包装的体积表示的单位剂量的数值可以是：0.1ml、0.15ml、0.2ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、10.0ml、20.0ml、30.0ml、40.0ml、50.0ml、60.0ml、70.0ml、80.0ml、90.0ml、100.0ml、150.0ml、200.0ml、250.0ml、或0.1ml和250.0ml之间的任何数值。本领域普通技术人员理解，过大或过小的单位剂量导致临床操作不便。所述单位剂量的数值可能根据一些因素来设置，所述因素包括施用方法(如鼻内递送、静脉注射，口内递送等)，受试者特征(如人、体重、免疫接种历史等)，组合物特征(如PIC浓度、组合物的PH等)，和/或其他因素。比如，当组合物通过注射施用于人类个体或具有类似高度或类似重量的其他受试者时，单位剂量的数值范围可以为0.5ml至1.0ml。作为另一个示例，当施用方法是鼻内递送时，单位剂量的数值范围可以为0.15ml至0.2ml。更具体地，作为另一个示例，当组合物通过静脉注射施用于人受试者或具有类似大小或重量的其他受试者时，单位剂量的数值范围可以是30.0ml至100.0ml。应当理解的是，虽然本文使用的单位剂量表示组合物的体积，但是这并不意味着将组合物限定为液体组合物。比如，当组合物是固体形式(例如，干粉、冻干粉等)且可进一步制备成液体形式时，单位剂量可以代表液体形式组合物的体积。

根据本公开的一些实施方案，组合物还可以包含稳定组合物的物质。仅仅举例而言，所述稳定组合物的物质包含明胶、蔗糖、白砂糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、低分子右旋糖酐、山梨醇、聚山梨醇酯20、甘露醇聚乙二醇、人血白蛋白、重组人血清白蛋白、辛酸钠、尿素、氢氧化铝、酚红、氯化镁、氯化钾、氯化钠、硫代硫酸钠、二氢钾、抗坏血酸、三氯甲烷、苯酚、硫柳汞等、或其任何组合。

根据本公开的一些实施方案，组合物还可以包含生理上可接受的缓冲液。仅仅举例而言，所述生理上可接受的缓冲液可包括乙酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(tris)、碳酸氢盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、或类似缓冲液、或其任何组合。所述生理上可接受的缓冲液的PH值为6.0-8.0。在一些实施方案中，生理上可接受的缓冲液的pH值可以是：6.0、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0或6.0和8.0之间的任何数值。在一些具体的实施方案中，生理上可接受的缓冲液是磷酸盐缓冲液(pH：7.3至7.5)。

根据本公开的一些实施方案，组合物可以为干燥粉末、溶液(例如肠胃外溶液、水性溶液、生理盐水溶液、悬浮液、油膏、滴剂、乳剂、凝胶、糖浆或浆液)、片剂、包衣片剂、栓剂、片剂、颗粒、糖衣锭、胶囊的形式、或类似形式、或其任何组合。在一些实施方案中，组合物被制备成肠胃外溶液。组合物的形式是非限制性的。一般性地描述在相关现有技术中(例如，Stanley A Plotkin等人，Vaccine第四版W.B.Saunders Company 2003)的组合物形式及其制备在本公开的主旨和范围内。

根据本公开的一些实施方案，HBsAg是由生物体产生的，所述生物体包括汉逊酵母(Hansenula Polymorpha)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO cell)、毕赤酵母、昆虫表达系统、或类似表达系统、或其任何组合。可以将纯度高于99％的HBsAg施用于婴儿、5岁以上的儿童以及成人。根据本公开的一些实施方案，HBcAg是通过重组DNA方法产生的。HBcAg可以由大肠杆菌、汉逊酵母、毕赤酵母、酿酒酵母、昆虫表达系统、或类似表达系统、或其任何组合产生。

在一些实施方案中，HBsAg与PIC的重量比可以是1:50、1:40、1:30、1:25、1:20、3:50、1：15，1:10、1:5或1:50和1:5之间的任何数值。在一些具体的实施方案中，HBsAg与PIC的重量比可以是1:25。应当注意的是，所述HBsAg与PIC的重量比是非限制性的。例如，所述HBsAg与PIC的重量比在1:25附近(比如，高于或低于10％)的组合物，能够提供充分的安全性，并且更早引起更强的体液免疫(即，产生更高滴度的抗体)反应和T细胞介导的免疫反应。

在一些实施方案中，HBsAg在组合物中的浓度范围为10μg/单位剂量至100μg/单位剂量。仅仅举例而言，所述HBsAg在组合物中的浓度可以为10μg/单位剂量、15μg/单位剂量、20μg/单位剂量、25μg/单位剂量、30μg/单位剂量、35μg/单位剂量、40μg/单位剂量、50μg/单位剂量、60μg/单位剂量、70μg/单位剂量、80μg/单位剂量、90μg/单位剂量、100μg/单位剂量，或10μg/单位剂量到100μg/单位剂量之间的任何数值。在一些实施方案中，所述HBsAg在组合物中的浓度可以为20μg/单位剂量、40μg/单位剂量或60μg/单位剂量。

在一些实施方案中，HBcAg在组合物中的浓度范围为10μg/单位剂量至100μg/单位剂量。仅仅举例而言，HBcAg在组合物中的浓度可以为10μg/单位剂量、15μg/单位剂量、20μg/单位剂量、25μg/单位剂量、30μg/单位剂量、35μg/单位剂量、40μg/单位剂量、50μg/单位剂量、60μg/单位剂量、70μg/单位剂量、80μg/单位剂量、90μg/单位剂量、100μg/单位剂量、或10μg/单位剂量至100μg/单位剂量之间的任何数值。在一些实施方案中，HBcAg的浓度范围为10μg/单位剂量至50μg/单位剂量，或50μg/单位剂量至100μg/单位剂量。

根据本公开的一些实施方案，组合物也可施用于未感染HBV的受试者、慢性HBV感染的受试者(在本公开中也称为“慢性受试者”或“慢性HBV受试者”)、和急性HBV感染的受试者(也称为“急性受试者”或“急性HBV受试者”)。在一些实施方案中，相较于抗原和铝佐剂的组合，本公开的组合物能够引起更强的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞免疫反应。例如，本公开的组合物与抗原和铝佐剂的组合相比，可以引起更高(2倍至30倍)的细胞因子产生。

在一个具体的实施方案中，组合物可以包含20μg/单位剂量的HBsAg、20μg/单位剂量HBcAg和500μg/单位剂量PIC。在另一个具体的实施方案中，组合物可以包含40μg/单位剂量HBsAg、40μg/单位剂量HBcAg和1000μg/单位剂量PIC。

根据本公开的一个方面，组合物可以用于治疗或预防HBV感染，优选用于慢性HBV感染。

根据本公开的一个方面，用于治疗和/或预防HBV感染的组合物是干粉或冻干粉形式。

根据本公开的一个方面，组合物可以用于制备用于治疗和/或预防HBV感染的药物。在一些实施方案中，所述的药物可以包括预防性疫苗、治疗性疫苗、疫苗制剂、或类似形式、或其任何组合。在一个具体的实施方案中，组合物可以用于制备用于治疗和/或预防慢性HBV感染的药物。

根据本公开的另一方面，提供了一种用于治疗和/或预防HBV感染的方法。所述方法可根据组合物的特征(例如，单位剂量、PH等)，施用方法(例如口内递送、鼻内递送、静脉注射等)，受试者特征(例如年龄、性别、抗生素过敏性等)，使用目的(例如治疗或者预防HBV感染)，和/或其他任何因素设定，用于实施向受试者施用组合物。仅仅举例而言，在一些实施方案中，当组合物用于治疗HBV感染时，所述方法可包括将治疗有效量的组合物施用到受试者。相似地，当组合物用于预防HBV感染时，所述方法可包括将预防有效量的组合物施用到受试者。本文中使用的术语“治疗有效量”是指足以引起T细胞介导的免疫反应，并减轻或清除感染的量。本文使用的术语“预防有效量”是指足以引起针对病毒感染的保护性抗体的量。比如，如世界卫生组织(WHO)推荐的，预防性抗体浓度可以是至少10mIU/ml。

在一些实施方案中，所述方法可以根据组合物的特征来设定。所述组合物的特征可以包括单位剂量、组合物PH、或类似特征。比如，所述方法可以包括通过向组合物中添加生理上可接受的缓冲液调节组合物的PH至6.0-8.0。作为另一个示例，所述方法可以包括根据单位剂量的值，向受试者施用某一量的组合物(例如，小于、大于或等于单位剂量)的量。

在一些实施方案中，所述方法可以通过施用方法来设定。例如，可以全身或局部施用。施用方法可以包括肠胃道外注射(如肌肉内注射、腹腔内注射、静脉内注射、皮下注射、皮内递送、瘤内递送、瘤周递送等)、经皮递送、和任何其他方式的施用，来实施该方法。更具体地，在一些实施方案中，施用方法可进一步包括直肠递送、阴道递送、鼻内递送、口内递送、眼递送、舌下递送和吸入。需要注意的是，施用方法是非限制性的。对于本领域普通技术人员而言，任何修改和变化仍包括在本公开的主旨和范围内。

在一些实施方案中，所述方法可以通过施用频率来设定。施用频率可以是两个月1次、两个月2次、两个月3次、两个月4次、两个月5次、一个月1次、一个月2次、三周1次、三周2次、两周两次、两周一次、每周一次、或任何其他合适的施用频率，用于实施该方法。例如，当组合物施用于未感染HBV的受试者时，可以两个月3次、一个月2次、或六个月3次向该受试者施用预防有效量的组合物。作为另一个示例，当组合物施用于HBV感染的受试者时，可以两个月4次、两个月5次、一个月2次、三周1次、三周2次、或每周一次向该受试者施用治疗有效量的组合物。根据本公开，一个月等同于28、29、30或31天，一周等同于7天。

在一些具体的实施方案中，所述方法可包括每两个月3次向受试者施用(例如，通过肌肉内注射)组合物。例如，方法可包括下列步骤：

1)在第0天，向受试者施用第一量的组合物；

2)在第25至第31天，向受试者施用第二量的组合物。

3)在第53至第59天，向受试者施用第三量的组合物。

第一量、第二量、第三量可能相同或彼此不同。比如，第一量、第二量和第三量中的至少一个等于治疗有效量或预防有效量。再比如，第一量、第二量和第三量中的至少一个根据HBsAg的浓度(如20μg/单位剂量,40μg/单位剂量等)、HBcAg的浓度(如10μg/单位剂量，20μg/单位剂量，50μg/单位剂量，100μg/单位剂量等)、和/或PIC的浓度(如500μg/单位剂量,1000μg/单位剂量等)设定。在一些实施方案中，第一量、第二量和第三量中的至少一个包括20μg/单位剂量的HBsAg和500μg/单位剂量的PIC。在一些实施方案中，第一量、第二量和第三量中的至少一个包括40μg/单位剂量HBsAg和1000μg/单位剂量的PIC。在一些实施方案中，第一量、第二量和第三量中的至少一个包括10μg/单位剂量至50μg/单位剂量的HBcAg。在一些实施方案中，第一量、第二量和第三量中的至少一个包括50μg/单位剂量至100μg/单位剂量的HBcAg。

根据本公开的一些实施方案，提供了一种用于治疗和/或预防HBV感染的试剂盒。所述试剂盒包含一个容器、一个针头、注射用水、使用说明书中的至少一个、或其他类似组分，或其任何组合。比如，所述试剂盒可包含三个容器。所述容器中包含的组合物可以包含相同或不同的组合物形式和/或量。比如，至少一个容器(比如，两个、三个容器)可以包含20μg/单位剂量的HBsAg和500μg/单位剂量的PIC。至少一个容器(比如两个或三个)可以包含10μg/单位剂量至20μg/单位剂量的HBcAg。再比如，至少一个容器(比如，两个或三个容器)可以包含40μg/单位剂量的HBsAg和1000μg/单位剂量的PIC。至少一个容器(比如两个或三个容器)可以包含50μg/单位剂量至100μg/单位剂量的HBcAg。在一些实施方案中，一个容器中的组合物可以是液体形式(如悬浮液、溶液等)。在一些实施方案中，一个容器中的组合物可以是固体形式(如干粉、冻干粉等)。在使用前可将固体形式的组合物制备成液体形式(如悬浮液、溶液等)，并储存在一个或多个无菌容器(如管、瓶、安瓿、注射器等)内。

实施例

实施例1.组合物的制备

在一些实施方案中，组合物包含HBsAg、PIC、卡那霉素和氯化钙，其中，HBsAg与PIC的比为1:25。更具体地，组合物包含40μg/单位剂量的HBsAg、1000μg/单位剂量的PIC、800IU/单位剂量的卡那霉素以及0.16μmol/单位剂量的Ca2⁺。

在一些实施方案中，组合物包含HBcAg、HBsAg、PIC、卡那霉素和氯化钙。组合物包含40μg/单位剂量的HBsAg、1000μg/单位剂量的PIC、800IU/单位剂量的卡那霉素和0.16μmol/单位剂量的Ca2⁺。更具体地，HBcAg的浓度范围是10μg/单位剂量至50μg/单位剂量。

在一些实施方案中，组合物包含HBcAg、HBsAg、PIC、卡那霉素和氯化钙。组合物包含40μg/单位剂量的HBsAg、1000μg/单位剂量的PIC、800IU/单位剂量的卡那霉素和0.16μmol/单位剂量的Ca2⁺。更具体地，HBcAg的浓度范围为50μg/单位剂量至100μg/单位剂量。

实施例2.临床前毒理学研究

实施例2描述了根据本公开的一些实施方案的组合物及其主要成分(包括PIC、至少一种抗生素或多氨基化合物、和至少一种正价离子，统称为“PIKA”)的临床前毒理学研究。如表1所示，实施例2中使用的小鼠平均体重是0.019kg，能够耐受0.2ml组合物，所述组合物包含8μg HBsAg(0.4mg/kg)和200μg PIC(10mg/kg)；或能够耐受0.2ml PIKA，所述PIKA包含200μg PIC(10mg/kg)。小鼠中使用的组合物剂量比推荐在人中使用的剂量(20μgHBsAg(0.0003mg/kg))和500μg PIKA(0.0083mg/kg))高约1,200倍。推荐的最高人用剂量是推荐的最低人用剂量的两倍，这将仍然提供600的安全边界(MoS)。基于啮齿类大鼠的慢性毒理学试验研究，对于推荐的最低和最高人用剂量，该MoS值分别达到600和300。而基于临床前灵长类动物的研究，对于推荐的最低和最高人用剂量，该MoS值也分别达到40和20。

表1.临床前毒理学研究中的MoS

实施例3.啮齿类动物免疫反应的临床前研究

试验方法：

实施例3中使用的啮齿类动物是6周龄的BALB/c小鼠，分为6组。每组包括18只小鼠(9只雄性，体重范围17.3g至20.7g；9只雌性，体重范围19.0g至23.7g)。如表2所示，在第1、8、22、36、50、64和78天通过胫骨前肌注射施用组合物和其他物质。

表2.施用方案

在第3、24、38、52、66、80和106天，收集血液样本，测量抗HBsAg抗体的滴度以确定体液免疫反应。

在第38、80和106天，从每组处死3只雄性和3只雌性小鼠，用来确定T细胞介导的免疫反应。用HBsAg或HBsAg CD8⁺肽离体刺激脾细胞。通过ELISPOT测量产生IFN-γ的脾细胞的频率。

结果：

如图1、图2和图3所示，组合物(包含HBsAg和PIKA)引起更强的体液免疫反应(由IgG、IgG1、IgG2a的产生表示)，这表明PIKA显著增强对HBsAg的免疫反应。

根据图3，组合物产生强的Th1型免疫反应，并显著提高IgG2a的产生。

根据图4，ELISPOT试验结果显示，在体外刺激后，产生IFN-γ的脾细胞数显著增加。组合物(包括HBsAg和PIKA)显著增强T细胞介导的免疫反应。

IgG2a滴度值的增加表明组合物引起的主要免疫反应属于Th1型免疫反应。Th1型免疫反应和细胞免疫反应是治疗性疫苗的重要作用。Th1型免疫反应预防病毒感染，并清除已感染的细胞。此外，产生IFN-γ的脾细胞数的增加也表明组合物显著增强细胞免疫反应。

实施例4.灵长类动物中的慢性毒理学研究

实验室：

实施例4在原中国药品生物制品标准化研究中心，国家药物安全评价监测中心，现中国食品药品检定研究院，国家药物安全评价监测中心(National Center for SafetyEvaluation of Drugs,National Institute for the Control of Pharmaceutical andBiological Products,P.R.China)进行。

方法：

实施例4中使用的灵长类动物是分为五组的恒河猴。每组包括8只恒河猴(雌性4只，雄性4只，1.6至3.2岁，3至3.5kg)。根据表3，3个月内，向灵长类动物施用5次(在第0、14、28、56、84天)组合物、HBsAg、PIKA或PBS：

表3.分组以及施用方案

每组接受40μg HBsAg和1,000μg PIC(或PIKA)或60μg抗原HBsAg和1,500μg PIC(或PIKA)。

观察局部(例如，施用部位)和全身的临床症状，在第2至第126天5次采取血液样本。在第85天(即，第五次施用后24小时)和第126天时处死猴子，雌性猴子的36个器官以及雄性猴子的32个器官用于组织学检验。

组织学检查

组织学检查包括：

-临床症状；

-外观、毛发、活动性、反应、呼吸、姿态、头肩(包括眼、耳、口、鼻)、腹部、肛门、会阴、肤色、肌肉张力、创伤、肿瘤；

-症状相关行为；

-施用部位的症状；

-体重；

-进食；

-体温；

-血液学：T、APTT、RBC、WBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、PLT、MPV、网织红细胞计数％、Neut％、Lymph％、Mono％、Eos％、Baso％；

-生化检测：AST、ALT、BUN、CHO、GLU、TBIL、CRE、ALP、CK、LDH、TP、ALB、TG、GGT、Ca、P、K⁺、Na⁺、Cl^-、IgA、IgG、IgM、C3、C4；

-尿液检测；

-以下器官的病理学和组织学分析：脑、脊髓、心脏、动脉、肺(包括支气管)、肝、肾、脾、胰腺、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠、盲肠、睾丸、附睾、前列腺、卵巢、子宫、阴道、膀胱、脑垂体、甲状腺、甲状旁腺、颌下腺、肾上腺、坐骨神经、肌肉、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、胸腺、乳腺、胸骨、施用部位；

-体液免疫反应：用ELISA检测血清中的抗体滴度。

结果：

没有观察到局部或全身临床症状。血液学测试和血清生化测试未发现异常变化。脾脏的组织学测试结果显示脾白髓生发中心中增加的活化巨噬细胞数量和有丝分裂。脾白髓生发中心是淋巴细胞增殖的主要区域，尤其是在抗原刺激后B细胞活化的主要区域。PIKA增强针对抗原的免疫反应，引起淋巴细胞增殖。没有观察到脾坏死或细胞死亡。因此，结果表明脾脏的组织学变化并不是病理性的，而是生理性的；免疫反应是可逆的。任何其他器官的组织学结果中也没有观察到异常现象。

血清中的抗体滴度表明，在施用了包含HBsAg和PIKA的组合物后，灵长类动物发生了增强的体液免疫反应。表4显示灵长类动物的免疫反应。

表4.血清中的抗体滴度

实施例5.组合物在健康人受试者中的临床研究

实验室：

新加坡中央医院(Singapore General Hospital)的肠胃科和肝病科；以及樟宜医院(Changi General Hospital)的临床试验研究部门。

方法：

健康人受试者随机分为3组。三组中的两组接受递增剂量的组合物，第三组接受市售的HBV疫苗。在上臂三角肌区肌肉内注射施用组合物和疫苗。

组合物和疫苗

组A(或“半剂量”组)：包含20μg HBsAg和500μg PIKA的组合物；

组B(或“全剂量”组)：包含40μg HBsAg和1000μg PIKA的组合物；

组C(“对照”组)：包含20μg HBsAg和500μg Alum佐剂的疫苗(例如，GSK的市售HBV疫苗：ENGERIX^TM-B)；

施用方案：

在6个月内，受试者接受三次组合物或疫苗和1次安慰剂，以实施双盲测试，如表5所示。

表5.施用时间表

×表示施用组合物或疫苗，○表示施用安慰剂。

结果：

1.剂量的安全性考量

用于实施例5的组合物和疫苗的剂量是在实施例1的剂量基础上选择的。临床前的灵长类和啮齿类动物的毒理学研究为安全性考量提供了主要信息。实施例2评估了组合物或仅PIKA的耐受性。

也考量了市售疫苗的使用。市售疫苗通常在6个月内施用3次(10μg或20μgHBsAg)。对于透析受试者和将接受移植的受试者，疫苗施用4次(40μg HBsAg)，每次施用可以在第0、1、2和6个月时进行。

临床前的免疫学研究进一步证实了推荐的剂量提供充分的免疫反应。基于结果可见，当抗原和PIKA的比例等于或接近1：25时，体液免疫反应和T细胞介导的免疫反应达到很好地平衡。对于本领域普通技术人员而言，提高抗原和PIKA的比例(1：25)能够增强体液免疫反应。

为了将高剂量HBsAg(40μg)应用至临床研究，按照比例(1:25)，组合物包含1000μgPIKA。根据实施例1的结果可知，受试者能够耐受40μg HBsAg和1000μg PIKA。为了降低临床风险，半剂量组中的受试者施用20μg HBsAg和500μg PIKA。半剂量组的安全性考量表明，40μg HBsAg和1000μg PIKA的组合最佳。

2优化的施用方案

通过改变常规的施用方案(6个月内3次)，组合物更加有效。本公开还提供了一种加速的施用方案，以便引起保护性抗病毒抗体的产生。更具体而言，加速的施用方案比常规施用方案的施用频率更高，结果，加速的施用方案可以引起T细胞介导的免疫反应。在实施例5中，施用方案(2个月内三次)提供足够的时间在两次施用间隔降低受试者的风险，还为观察免疫反应提供了足够的时间。

3抗体滴度：

体液免疫反应的结果基于对第0、56、84和196天收集的每组血液样本的评价。评估血液样本以获得抗HBV抗体的滴度。结果表明组合物比对照组(组C，市售疫苗ENGERIX^TM-B)更具免疫原性。根据表6，结果表明，一旦应用加速施用方案，全剂量组(组B)和半剂量组(组A)均产生更强和更早的免疫反应。

表6.获得滴度10mIU/mL的受试者数和百分比N表示该组中的受试者数。

WHO推荐标准的抗病毒抗体滴度是10mIU/ml，以提供对HBV感染的保护。根据表6，在全剂量组的所有受试者在第56天(即，第二次施用后)都获得了标准滴度，而在半剂量组的72.73％受试者和对照组的54.55％受试者获得标准滴度。在第196天，在全剂量组、半剂量组和对照组中，具有标准滴度的受试者的百分比分别为：100％、90.91％和81.82％。

表7.获得滴度150mIU/mL的受试者数和百分比

N表示受试者的总数。

根据表7，全剂量组(组B)和半剂量组(组A)中的受试者分别在第84和196天达到了更强的体液免疫反应。在全剂量组的所有受试者在第84天获得了超过150mIU/ml的抗体滴度；在半剂量组的81.82％的受试者获得了超过150mIU/ml的抗体滴度，在对照组的36.36％的受试者获得了超过150mIU/ml的抗体滴度。在第196天，在全剂量组、半剂量组和对照组中获得超过150mIU/ml滴度的受试者的百分比分别为100％、90.91％和45.45％。

临床研究进一步研究了HBV特异性T细胞介导的免疫反应。HBV特异性T细胞介导的免疫反应通过每孔(包含10⁵个细胞)中的斑点形成单位(SFU)来评估。如图5所示，在第56天，全剂量组(组B)和半剂量组(组A)中受试者的平均SFU分别为230和138，而在对照组(组C)中没有观察到SFU。在第84天，全剂量组和半剂量组受试者的平均SFU分别为134和157，而在对照组中受试者的平均SFU为186。在第196天，全剂量组和半剂量组中受试者的平均SFU与第84天相似，而在对照组中，受试者的平均SFU仅为24。

此外，通过流式细胞术评估了依据ELISPOT的结果选择的一名受试者中CD4⁺T细胞的细胞因子产生。如图7所示，在一个单肽的刺激下，全剂量组(组B)受试者的CD4⁺T细胞表达3种细胞因子(包括IFN-γ、TNF-α和IL-2)，而半剂量组(组B)和对照组(组C)受试者的CD4⁺T细胞表达3种细胞因子中的两种。图6显示全剂量组中一位受试者的流式细胞术结果。

该临床研究的结果显示全剂量组和半剂量组均表现出对组合物的充分耐受性。高滴度体液免疫反应和T细胞介导的免疫反应表明组合物可以在慢性HBV受试者中引起有效的保护。

实施例6.组合物对HBV感染患者的效果

患者一：

赵某，男，39岁，已经感染HBV(HBsAg+；HBeAg+；HBcAb+)9年。曾接受拉米夫定或恩替卡韦的抗病毒治疗。停抗病毒治疗2个月后，测试表明HBV-DNA的浓度为3.6×106拷贝/ml；HBsAg的浓度大于225ng/ml；HBeAg的浓度大于76.5PEIU/ml；抗HBeAg抗体阴性；抗HBcAg抗体的浓度为3PEIU/ml。每2周或4周1次施用组合物。每次施用包含40μg HBsAg和1000μgPIKA的组合物。从第一次施用后的第112天到第330天(最后一次施用)，组合物剂量增加至50μg HBsAg和1500μg PIKA。从第260天起，HBV-DNA的浓度开始下降。在第302天，HBV-DNA的浓度为1.5×104拷贝/ml。同时，HBeAg的浓度缓慢下降。自第一次施用2年后，HBeAg的浓度达到38.27PEIU/ml。组合物施用期间，ALT和AST的浓度在第42天显示暂时的增加，自第260天浓度恢复至正常值。

患者二：

宋某，男，46岁，已经感染HBV(HBsAg+；HBeAb+；HBcAb+)4年。曾接受抗HBV TF的抗病毒治疗。施用组合物前，测试表明HBV-DNA的浓度为6.0×103拷贝/ml；HBsAg的浓度大于225ng/ml；HBeAg阴性；抗HBeAg抗体的浓度大于2.0PEIU/ml；抗HBcAg抗体的浓度大于3.9PEIU/ml；ALT异常(57U/L)。每2周或4周1次施用组合物。每次施用包含40μg HBsAg和1000μg PIKA的组合物。从第一次施用后112天开始，组合物剂量增加至50μg HBsAg和1500μg PIKA。在第171天，HBV-DNA的浓度降低(<500拷贝/ml)。HBsAg的浓度降至77.35ng/ml，ALT恢复至正常值。从第246天至第330天，每2周或4周1次施用包含60μg HBsAg和2000μg PIKA的组合物。自第一次施用2年后，HBV-DNA的浓度低于500拷贝/ml，HBsAg的浓度为3.17ng/ml，ALT的浓度也恢复正常。

患者三：

张某某，男，32岁，已经感染HBV(HBsAg+；HBeAb+；HBcAb+)8年。施用组合物前，测试显示HBV-DNA阴性；HBsAg的浓度大于225ng/ml；HBeAg阴性；抗HBeAg抗体的浓度大于2.0PEIU/ml；抗HBcAg抗体的浓度大于3.9PEIU/ml。每2周或4周1次施用组合物。每次施用包含40μg HBsAg和1000μg PIKA的组合物。自初次施用后第112天起，组合物的剂量增加至50μg HBsAg和1500μg PIKA。在第171天，HBsAg的浓度降至49.86ng/ml。

实施例7.不同类型组合物的效果

在实施例7中，使用18只HBV转基因小鼠，其表达高水平的HBV DNA。所有小鼠分为3组(A组、B组和C组)，每组包括6只小鼠。根据表8，组合物和其他物质被施用于每组的小鼠。每周一次向小鼠施用组合物和其他物质，持续12周。最后一次施用后观察7天。每周2次测定每只小鼠的体重。第一次施用后，分别在第0、21、和42天测量HBV DNA。

表8.施用于小鼠的组合物

根据图8可知，即使是在表达高水平HBV DNA的小鼠中，将组合物施用至B组和C组的小鼠后，HBV DNA下降，这说明组合物显著预防和治疗HBV感染。

应当注意，实施例7仅仅是示例性的。本领域普通技术人员在不违背本公开精神和范围的条件下，可以对实施例7的形式和细节进行变化。比如，HBsAg和/或HBcAg相对于PIC(或PIKA)的比例可以为1:50、1:40、1:30、1:25、1:20、3:50、1：15，1:10、1:5或1:50和1:5之间的任何数值。

实施例8.组合物的稳定性

在实施例8中，使用三批组合物。每批分为2组(将2组放置在孵育箱中，温度分别调整到37℃和25℃)。使用含Alum佐剂和HBsAg的乙肝疫苗作为对照。将放置于37℃1周、2周和4周的一组组合物进行系列稀释，并施用于小鼠。收集血液样本，测量HBsAb。测量组合物和对照疫苗的ED₅₀的比例。将放置于25℃1个月、2个月、3个月、4个月的一组组合物进行系列稀释，并施用于小鼠。收集血液样本，测量HBsAb。测量组合物和对照疫苗的ED₅₀的比例。

根据表9可知，在放置于37℃后，本公开组合物比对照乙肝疫苗具有更高的效价；在放置于25℃后，本公开组合物也比对照乙肝疫苗具有更高的效价和稳定性。

表9.组合物的稳定性研究

应当注意，在实施例8中，尽管只使用了一种类型的组合物(即，包含PIKA+HBsAg)，但实施例8仅仅是示例性的，并不限制范围。对于本领域技术人员而言，在不违背本公开精神和范围的条件下，可以对实施例8的形式和细节进行各种变化。仅作为举例，可以在实施例8中使用另一类型的组合物(例如，包含PIKA、HBsAg和HBcAg的组合物)。又例如，本领域技术人员可以使用不同浓度的组合物、或不同浓度的组合物的各物质。比如，HBsAg和/或HBcAg相对于PIC(或PIKA)的比例可以为1:50、1:40、1:30、1:25、1:20、3:50、1：15，1:10、1:5或1:50和1:5之间的任何数值。

根据本公开，组合物提供以下优势中的至少一项：

-在急性和慢性毒性研究中，均体现出良好的安全性；

-增强体液免疫反应，产生更高滴度和更早期的抗体产量；

-有效激活T细胞介导的免疫反应；

-降低HBV感染受试者中的HBV DNA载量。

应当理解，尽管参考具体实施方案对本公开进行了描述，但这些实施方案是示例性的，并不限制范围。对于本公开所属领域的普通技术人员而言，本公开的替代实施方案是显而易见的。这样的替代实施方案被认为包含在本公开的主旨和范围内。

Claims (32)

1.一种用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒感染的组合物，其包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、至少一种抗生素或多氨基化合物、至少一种正价离子和HBsAg。

2.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含HBcAg。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述HBsAg通过汉逊酵母、CHO细胞、昆虫表达系统、酿酒酵母或毕赤酵母生产。

4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述HBcAg通过大肠杆菌、汉逊酵母、昆虫表达系统、酿酒酵母或毕赤酵母生产。

5.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物能够施用于未感染乙型肝炎病毒的受试者、慢性乙型肝炎病毒的受试者、或者急性乙型肝炎病毒的受试者。

6.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物以选自以下的途径施用于受试者：肌肉内注射、腹腔内注射、静脉内注射、皮下注射、透皮递送、皮内递送、鼻内递送、眼内递送、口内递送、舌下递送、瘤周递送和瘤内递送。

7.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述的抗生素选自：泰百霉素、蒽环霉素、丁苷菌素硫酸盐、庆大霉素、潮霉素、艾米康丝菌素、双去氧卡那霉素、暗霉素、β-内酰胺、新霉素、嘌呤霉素、链霉素、链脲霉素和卡那霉素。

8.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述的多氨基化合物选自：亚精氨酸盐、精眯、N-(3-氨基丙基)、N-(3-氨基丙基)-1,4-丁二胺、精素BR、精素、OS-二甲基胺基硫代磷酸酯、多聚赖氨酸和氨基糖苷。

9.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述的正价离子选自钙、镉、锂、镁、铈、铯、铬、钴、氘、镓、碘、铁和锌。

10.根据权利要求1或2所述的组合物，其中HBsAg相对于PIC的比例范围为1:50到1:5。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述HBsAg相对于PIC的比例为1:50、1:40、1:30、1:25、1：20、3：50、1:15、1:10或1:5。

12.根据权利要求2所述的组合物，其中所述HBcAg相对于PIC的比例范围为1:50到1:5。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述HBcAg相对于PIC的比例为1:50、1:40、1:30、1:25、1:20、3:50、1:15、1:10或1:5。

14.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述PIC在组合物中的浓度范围为250μg/单位剂量至6000μg/单位剂量。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述PIC在组合物中的浓度为500μg/单位剂量、1000μg/单位剂量、1250μg/单位剂量、1500μg/单位剂量、2000μg/单位剂量或3000μg/单位剂量。

16.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述HBsAg在组合物中的浓度范围为10μg/单位剂量至100μg/单位剂量。

17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述HBsAg在组合物中的浓度为10μg/单位剂量、20μg/单位剂量、30μg/单位剂量、40μg/单位剂量、50μg/单位剂量、60μg/单位剂量、70μg/单位剂量、80μg/单位剂量、90μg/单位剂量或100μg/单位剂量。

18.根据权利要求2所述的组合物，其中所述HbcAg在组合物中的浓度范围为10μg/单位剂量至100μg/单位剂量。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述HbcAg在组合物中的浓度为10μg/单位剂量、20μg/单位剂量、30μg/单位剂量、40μg/单位剂量、50μg/单位剂量、60μg/单位剂量、70μg/单位剂量、80μg/单位剂量、90μg/单位剂量或100μg/单位剂量。

20.根据权利要求14-19中任意一项所述的组合物，其中一个单位剂量的范围为0.1ml至250.0ml。

21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述单位剂量为0.1ml，0.15ml，0.2ml，0.5ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，3.0ml，4.0ml，5.0ml，10.0ml，20.0ml，30.0ml，40.0ml，50.0ml，60.0ml，70.0ml，80.0ml，90.0ml，100.0ml，150.0ml，200.0ml或250.0ml。

22.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物进一步包含选自以下的至少一种物质：

明胶、蔗糖、白砂糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、低分子右旋糖酐、山梨醇、聚山梨醇酯20、甘露醇聚乙二醇、人血白蛋白、重组人血清白蛋白、辛酸钠、尿素、氢氧化铝、酚红、氯化镁、氯化钾、氯化钠、硫代硫酸钠、磷酸二氢钾、抗坏血酸、三氯甲烷、苯酚和硫柳汞。

23.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物还包含至少一种生理上可接受的缓冲液，其中所述生理上可接受的缓冲液选自：乙酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。

24.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物的pH值范围为6.0至8.0。

25.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物为液体或固体形式；其中所述液体形式选自肠胃外溶液、悬浮液、油膏、乳剂、滴剂、糖浆和凝胶；其中所述的固体形式选自干粉、冻干粉、片剂、胶囊、栓剂、颗粒和糖衣锭。

26.一种治疗和/或预防乙型肝炎病毒感染的方法，包括向受试者施用组合物，其中所述组合物包含PIC、至少一种抗生素或多氨基化合物、至少一种正价离子和HBsAg。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述组合物进一步包含HBcAg。

28.根据权利要求26或27所述的方法，所述方法进一步包括：两个月一次，两个月两次，两个月三次，两个月四次，两个月五次，一个月一次，一个月两次，三周一次，三周两次，两周两次，两周一次，或一周一次向受试者施用组合物。

29.根据权利要求26-28任意一项所述的方法，其中所述受试者是未感染HBV的受试者、慢性HBV受试者、或者急性HBV受试者。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述受试者是人或者动物。

31.一种用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒感染的稳定的组合物，其包含PIC、至少一种抗生素或多氨基化合物、至少一种正价离子和HBsAg；其中，HBsAg相对于PIC的比例范围为1:50到1:5。

32.根据权利要求31所述的稳定的组合物，其包含HBcAg，其中HBsAg相对于PIC的比例范围为1:50到1:5。

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