JPS63230639A - 新規なｂ型肝炎ウイルス表面抗原粒子とその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野Ｊ 本発明は新規なり型肝炎ウィルス表面抗原粒子とその製
法に関する。

〔従来の技術〕

Ｂ型肝炎ウィルス（以下ＨＢＶと異称）の感染に起因す
る幾多の疾病は公衆衛生医学上世界的に極めて重要な問
題である。極東及び中央アフリカの諸国ではＢ型肝炎ウ
ィルスの慢性保菌者が人口の１０チを越えると云われ、
また慢性の活性肝炎、肝硬変が肝細胞筋と密接な関係を
もつことが明らかになった（　ＴｉｏＡ’Ａｉａｉｓ、
　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒ曇８１７：４８９−
４９５．１９８５　”）。以上のような新しい知見から
ＨＢＶ感染の防御のためのワクチンの大屋調製法の確立
が強く要望されるようになった。

ＨＢＶは直径４２ｎｍの球状の粒子でその中心にＤＭＡ
鎖をもち、その５０％は二重鎖である。

ウィルスの外被上に特異的な抗原蛋白（表面抗原、以下
ＨＢ８Ａｇ　　と云う）をもち、この蛋白がウィルスの
感染に当って重要な役割を担っている。Ｂ型肝炎患者の
血清の中にはＨＢＶ粒子の他に直径２２ｎｍの粒状また
は繊維状の粒子が検出される。このものはＢ型肝炎ウィ
ルスのＤＭＡ鎖を含んでいないが、その表面上にＢ型肝
炎ウィルスと共通の抗原蛋白即ちＨＢｓＡｇを含んでい
る。この粒子には正式の呼称は未だ無いが、ここではこ
の粒子をＨＢ２２粒子と呼ぶことにする。

臨床的に抗ＨＢＳ抗体がＨＢＶの感染を防御することが
知られている。しかしＨＢＶ自体は非常に強い感染性を
有するため、これを免疫用の抗原として用いることは不
可能であるが、ＨＢ２２粒子は有益な免疫原として用い
ることができる。しかしＨＢＶは培養細胞中では増殖せ
ず、従ってＨＢ２２粒子を産生きせることが不可能であ
るため、現在免疫用ＨＢ２２粒子はＢ型肝炎患者の血清
から調製されている。その原料血清としては、ＨＢｓＡ
ｇ陽性であってＨＢＶが検出されない患者の血清が用い
られているが、感染力のあるＨＢＶの混入の可能性は否
めず、またその血清の供給量も非常に限られている。

近年、従来から知られているＨＢｓＡｇが詳細に検討さ
れ、ＨＢＶ粒子とＨＢ２２粒子の差違も含めて幾つかの
重要な知見が得られた。ＨＢＶ粒子には厳密には８つの
関連した抗原蛋白が含まれて居り、メジャー蛋白、ミド
ル蛋白及びラージ蛋白として分類されており、ＨＢＶ遺
伝子上の８領域、プレ８２−８領域及びプレＳ１−プレ
８２−８領域に各々コードされている（　Ｈｅｅｒｍａ
ｎｎ　、　Ｋ、ｅｔ　ａｌ　、　Ｊ　：ＶｉｒｏＡ！、
５２　：　８９６−４０２．１９８４　）。

従来メジャー蛋白が粒子の主な構成々分であり抗原の本
体と考えられていたが、最近に至りミドル蛋白のプレＳ
２領域に相当するペプチドは親水性で非常に抗原性が高
いことが知られ、（Ｎｅｕｒａｔｈ　。

Ｒ８ｅｔ　ａｌ、８ｃｉｅｎｃｅ　２２４　：　３９２
　（１９８４））またポリアルブミンとの親和性があり
、これを介して肝細胞ポリアルブミンレセプターと結合
する。

従って本ペプチドに対する抗体はＨＢＶの肝細胞への感
染を効果的に防止する可能性が示唆される。

（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　＋に、ｅｔ　ａ６．Ｊ、Ｉｍｍ
ｕｎｏＪ、１３６　：８４６７−３４７２．１９８６　
　）ラージ蛋白はそのブレＳ１領域にコードされた蛋白
が粒子上でスパイク構造物を作り、それがウィルス粒子
と感染細胞の固着に関わっていると考えられている。

ＨＢ２２粒子上に６共通な抗原蛋白が存在することが明
らかにされているが、その比率はＨＢＶとは大きく異っ
ている、ＨＢＶ粒子上ではラージ蛋白、ミドル蛋白が各
々総抗原蛋白の約１９ｂ及び約１０ｑ６を占めているが
、ＨＢ２２粒子上で６共とんどの場合、ラージ蛋白は認
められず、ミドル蛋白も１％前後である、各々の抗原蛋
白は共通の遺伝子領域Ｓにコードされた蛋白をもつため
共通の抗体によって認識されるが、ブレＳ１及びブレＳ
２Ｋコードされる構造物に対して各々特異的な単クロー
ン抗体も得られている、（公開特許公報Ａ昭６１−１１
１６９５　）各々の蛋白の分子量は糖修飾の度合によっ
て異った分子の対になっており、メジャー蛋白は２２キ
ロダルトン及び２７キロダルトン、ミドル蛋白は３３キ
ロダルトン及び３６キロダルトン、ラージ蛋白は３９キ
ロダルトン及び４１キロダルトンである、また各々の蛋
白に相当する遺伝子の塩基配列もａｄｒ型、ａｄｗ型、
ａｙｗ型の亜型について明らかにされている。（ａｄｗ
型、ａｄｒ型Ｏｎｏ　、　Ｙ、　、　ｅｔ　ａｌ　、　
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、ｖｏｌ
ｌ。

１１：　１７４７．（１９８Ｂ’）、ａｙｗ型Ｇａ１ｉ
ｂｅｒｔ　＋Ｆ、＋ｅｔ　ａｌ　、　Ｎａｔｕｒｅ　２
８１　：　６４６　（１９７９）　）〔発明が解決しよ
うとする問題点〕 現在臨床応用されているＨＢ２２ワクチンはＢ型肝炎患
者血清より得られるＨＢ２２粒子を用いるため原料を大
量供給するのが困難であること、感染性粒子の不活性化
のためホルマリン処理及び熱処理が不可欠で、その処理
が天然ＨＢ２２粒子の表面蛋白の抗原性を減弱すること
、などの欠陥が指摘される。さらに天然のＨＢ２２粒子
が前述のようにもともとラージ蛋白を含まず、ミドル蛋
白も１％前後しか含んでいるに過ぎないことなど、ＨＢ
Ｖ感染に対する免疫原として適当であるかどうか疑問で
ある。

近年遺伝子組み換え技術を応用したＨＢｓＡｇの産生が
進んでいる。そのうち大腸菌を宿主とした系によるＨＢ
ｓＡｇ産生（Ｆｕｊｉｓａｗａ　ｅｔ　ａｌ　、　Ｎｕ
ｃ７１！ｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１１　：
　８５８　（１９８８）　、　Ｐｕｍｐｅｎｅｔ　ａｌ
　、　Ｇｅｎｅ　３０　：　２０１　（１９８４））は
産生きれた蛋白が集合せず粒子を形成しない。さらに動
物・細胞由来の蛋白にみられるような翻訳後糖修飾がさ
れないため、天然のＨＢｓＡｇと比較してその抗原性は
遥かに及ばない。さらに細胞外への分泌が起らず、ＨＢ
　ｓ　Ａ　ｇの回収の際、細胞を破壊する必要があり、
そのことが抗原蛋白の精製を困難にしている。酵母を用
いた産生糸では、（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ。

Ａ、ｅｔ　ａｌ、ＰＮＡｓ　８０　：ＰＰ１　（１９８
８））　ＨＢｓＡｇの翻訳後糖修飾がおこり、さらに粒
子の形成もされる。しかし大腸菌の場合と同様に細胞か
ら抗原蛋白の分泌がおこらず精製が非常に困難である。

さらに糖修飾などが動物細胞と同様の形で行なわれるか
どうか検討する必要がある。

現在動物細胞を宿主としたＨＢ２２粒子産生糸色知られ
ている（　Ｈｉｓｕｎｇ、　Ｎ、ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　
Ｍｏ１．Ａｐｐｌｉｅｄ。

Ｇｅｎ、２：４８９−５０６（１９８４）、　　しかし
それらはメジャー蛋白を主成分として設計した遺伝子構
成を用いて産生細胞を作製しているため、ラージ蛋白、
ミドル蛋白の金員は少ない。また多ぐの場合癌原性を有
するベクター、例えばＢＰＶ（牛パピローマウィルス）
や５Ｖ−４０などに由来するＤＮＡを用いているため、
産生物中に有害な未知物質が混入してくる可能性が高い
。（Ｈｓｉｕｎｇ　＋Ｎ、、ｘｚｔ　ａｌ、ＪｏＭｏｌ
、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎ　２　：　４９７−５０６（１９８
４）、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ＊　Ｏ，、ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ
ｌ、ＣｄｔｌＢｉｏｌ、３　：　２２５０−２２５８（
１９８８））。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、これらの問題を解決すべく鋭意研究を進
桧た結果、ラージ蛋白及びミドル蛋白を極めて高濃度に
有するＨＢｓ（表面蛋白）粒子を得、このものが実験動
物に極めて高い抗体を誘導する能力を有することを見出
した。その有効性の高いＨＢｓ粒子はラージ蛋白を２チ
から５０％、ミドル蛋白を１０％から６０チも含んでい
た。この粒子は種々の方法で作製できるが、動物細胞特
にＱ幻細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）、Ｖｅ
ｒ。

細胞（サル腎由来）、Ｌ細胞（マウス１１Ｍ芽細胞由来
）を用いた遺伝子操作法による作製がよい結果を与えた
。本粒子産生細胞を作製する番ζ当ってＨＢＳ遺伝子は
色々な亜型のものを用いることが可能であるが、その中
でａｄｒ型及びａｙｗ型を用いた。

これらのＨＢｓ遺伝子は活性Ｂ型肝炎患者の血清から精
製したＨＢＶ粒子ゲノムより公知の方法で得られる（　
ＮｕｃＪｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１１　
：　１９４７（１９８８））。これらの遺伝子の８領域
、ブレ８２−８領域、ブレＳ１−ブレ８２−８領域の形
質を発現させるため、種々のプロモーターを用いること
ができる。特にＵ２プロモーター、Ｈ−２Ｋプロモータ
ー、ミクログロブリンプロモーター及びメタロサイアニ
ンプロモーターがよい結果を与える。

各々のプロモーターは公知の方法で得られる（　Ｍａｔ
ｔａｊ、　Ｉ　ｅｔ　ａｌ、ｍ１Ｂｏ、Ｊ、２：１８９
８（１９８９）その他）。これらの遺伝子群は大腸菌由
来のプラスミドに結合させ、大腸菌内で増殖させ、精製
した上で、通常リン酸カルシウム沈澱法で、（Ｃｏｐｅ
ｌａｎｄ。

Ｎ、ｅｔａｌ、０ｅｌ１１６：３４７（１９７９））動
物細胞内に導入される。形質転換導入するに当ってネオ
マイシン耐性遺伝子、或いはデハイドロフオレイトレダ
クターゼ（ＭＦＲ）遺伝子を導入することにより形質転
換細胞の単離を容易にすることができる（　Ｃｏ１ｂｄ
ｒｅ　Ｇａｒａｐｉｎ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、ＪｏＭｏ
ｌ。

Ｂｉｏｌ、　１５０　：　１−１４（１９８１）、Ｍｉ
ｃｈｅｌ、Ｍ。

ｅｔ　ａｌ、　ＰＮＡ８８１　ニア７０８−７７１２（
１９８４））。

すなわちＨＢｓ遺伝子と同時にネオマイシン耐性遺伝子
を形質転換することによってネオマイシン耐性でＨＢｓ
蛋白を産生ずる細胞を作り、初期のスクリーニングの際
遺伝子が導入されなかった細胞（ネオマイシンマイナス
）を培地中にネオマイシンを添加することによって除く
と云う方法をとることができる。

またＤＨＦ　Ｒ陰性の宿主細胞番ζ、ＤＨＦＲ遺伝子と
ＨＢｓ遺伝子を同時に形質転換することにより宿主細胞
をＤＨＦＲ陽性としメトトレキセイト耐性の発現を目安
に形質転換細胞を単離することができる。

これらの方法で得られた形質転換細胞は、例えば限界希
釈法によるクローニングを重ねることによって純化、安
定化することが可能である。ここに得られたＨＢｓ粒子
産生細胞は無限に増殖を続けることができる。培養には
１０％ＦＣ！８（牛胎児血清）を含むハムＦ−１２培地
が好ましい。このような条件で得たＢＢｓ粒子の産生量
は１０ｎｇ／１０ｃｅ＃／　ｄ　ａ　ｙにも達した。こ
の培地中にメトトレキセイト、グルココルチコイド、カ
ドミウム、鉛、　ＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ−１２−Ｍｙ
ｒｉｓｔａｔｅ　−１８−Ａｃｅｔａｔｅ　）等を添加
することによってＥＢｓの産生は飛躍的に増巾すること
が可能で、驚くべきことに最高５〜１０μび／　１０　
ｃｅｌｌ／　ｄａｙの値が達成された。さらに例えばロ
ーラーボトル法、マイクロキャリア法、フォローファイ
バー法などを応用することにより、より濃縮された状態
でＨＢｓ粒子を培地中に分泌させることができる。培養
液中の本粒子は公知の方法、例えばアフイニテイクロマ
トグラフ、ゲル濾過、ＰＥＧ　沈澱、セシウムクロライ
ド密度勾配遠心法などの組合せにより、容易に臨床応用
に足る純度（９９，９％）以上に精製することができる
。さらに前述したように、本法で２種以上の亜型のＨＢ
ｓ蛋白の遺伝子を同一細胞に形質導入することによって
キメラ構造をもつＨＢｓ粒子の作製が可能である。従っ
てこうして得られた粒子は２種以上の亜型のＨＢｓＡｇ
を粒子上に有し極めて効果的な免疫原となる。以上述べ
た本発明により得られるＨＢｓ粒子を原料として極めて
効果的なり型肝炎ワクチンを大量、安価に製造すること
が可能になった。

しかもこのようにして製造したワクチンは感染性ＨＢＶ
や感染性ゲノムを全く含まず、従って熱、ホルマリンな
ど不活化処理を必要としない極めて安全で効果の高いワ
クチンと云える。

本発明には他の態様も含まれる。例えばＨＢｓ粒子には
ラージ蛋白とメジャー蛋白によって構成されてもよく、
またミドル蛋白とメジャー蛋白によって構成されてもよ
い。それぞれの構成蛋白は天然ＨＢＶ粒子から分離精製
されたのちＨＢｓ粒子に再構成されてもよい。

この段階で異なった亜型のＨＢＳ粒子に由来する蛋白を
混ぜてもよい。遺伝子組み換え技術を用いた生産におい
て動物細胞以外に酵母或いは大腸菌を用いてもよい。大
腸菌を用いた場合粒子は構成されないが、その産生物は
人工的に構成するための構成蛋白として利用することが
可能である。

ＨＢｓ粒子産生動物細胞を作製するに当って導入するプ
ラスミドは１種類でもよく、また２種類以上を同時に用
いてもよい。さらに確立した産生細胞に再度導入するこ
とによって遺伝子のコピー数を上げること可能である。

また２種類以上を数珠つなぎにして導入することも効率
的である。

〔実施例Ｊ 実施例１　組み換えプラスミドの作製 （ａ）　　基礎実験材料 本実施例におけるプラスミドは以下の基本的プラスミド
を材料として構築した。

（１）　　ｐＢＰＶ−ＭＭＴ　ｎｅｏ　（８４２−１２
）第１図参照。

米国　ニーニスバイオ社より購入した。

（２）　　Ｉ）Ｕ２プロモーター Ｍａｔｔａｙ、　Ｉらの報告（Ｎａｔｕｒｅ、８１６：
１６Ｂ　−１６７（１９８５））に従ってアフリカッメ
ガエル卵細胞核ＲＮＡを原料としてＵ２プロモーターに
当る部分を制限酵素ＥｃｏＲＩ　（註１４）とＡｐａ　
ｌ　（註２８、）で切断して得たＤＮＡをクローニング
することで得た。

（３）ＨＢウィルスゲノムＤＮＡ　：　Ｂ型肝炎活性患
者の血清のａｄｒ型及びａｙｗ型の亜型を示すものを材
料としてセシウムクロライド平衡密度遠心法、フェノー
ル抽出、エタノール沈澱により得た。

（４）　　Ｐ　Ｓ　Ｐ　６４ポリリン力−プラスミド米
国　プロメガ社から購入（第■図参照）（ｂ）　　基礎
実験方法 イ）各段階での制限酵素反応は０．２〜１μｑのＤＮＡ
が２０μｌの容量中に含まれる反応規模で行なった。

酵素反応後必要なりＮＡ断片はサイズにより０．７チ〜
１．８チのアガロースゲル上を電気泳動（註１）して他
の断片から分離し、フェノール、クロロホルム抽出、エ
タノール沈澱して精製した。形質転換に用いる大腸菌（
註２）の調製及び形質転換は以下のように行なった。

口）−夜培養して高濃度に生育した大腸菌１鹸をとり、
これを１００ｇ１のＬＢ−培地（註３）に加えて、３７
°Ｃ培養器中で振とう培養した。培養液の０Ｄ５５０値
が０．７前後に達した時、培養液を１０分間氷水浴上に
保持することで細胞の生育を止める。その培養液８　ｔ
ｅｌをとり遠心分離して沈渣として回収した細胞を１．
５　ｐａｌの５０　ｍＭ塩化カルシウム、１０　ｍＭ　
トリス（註４）（ｐＨ８）の緩衝液に懸濁した。これを
１５分間氷水浴上に保持した後、再び遠心分離して細胞
を回収し、同じ緩衝液１．５１に懸濁し４°Ｃに一晩保
存した。調製したプラスミドＤＮＡ溶液（１０ｍＭトリ
ス、１ｍＭＥＤＴＡ　（註５）（ｐＨ７，５）７０　μ
ｌを上述の細胞液２・００μｌに加え、３０分間氷水浴
上に保持し、ＬＢ−培地１．０　ｔｘｔを加え、４２°
Ｃ水浴中に２分間保持した後、３７°Ｃ水浴中で一晩培
養する。

本培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン６）を含む寒
天培地上に撤き、アンピシリン耐性株として形質転換株
を得た。

ハ）形質転換した大腸菌からプラスミドＤＮＡを回収す
るには以下の方法を用いた。

形質転換株を１１容量のＬＢ−培地で０Ｄ６００値が０
．５になるまで培養した。これにクロラムフェニコール
（註７）を２００μｇ／ｍｌの濃度になるように加え、
細胞中のプラスミド数を増巾した。

この処理は１２〜２０時間３７℃で行なった。°この培
養液を８００Ｏｒｐｍで遠心分離して細胞を回収してこ
れを冷却した。１８ｇ／の蔗糖を含む５０ｍＭ）リス緩
衝液ｐ　Ｈ８，０に懸濁し、氷水浴上に保持した三角コ
ルベンに移し、５■／　ｍｌのリゾチーム（註８）を含
む２５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８，０を添加した。１０
〜１５分後６　ｍｌのＥＤＴＡ液（２５０ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ　ｐ　Ｈ８，０）を加え、さらに１５分間氷水浴上に
保持した。これに界面活性剤混液（０，０１チドリメン
Ｘ−１００（註９）、６０　ｍＭ　ＥＤＴＡ　。

５０ｍＭ１リスｐＨ８，０）を８０ｚｔ添加し、氷水浴
上に保持した後、こ汀をＬ−８Ｍ超遠心機に５ｗ−２８
０−ター（註１０）を用いて２５．００　Ｏｒｐｍ９０
分間遠心分間遠心上の上清にプロナーゼ（註１１）を２
５０μｇ／ｌｅｌになるように加えて、３０分間３７℃
に保持した。引きつづき、１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤ
ＴＡ　ｐＨ８，０緩衝液で飽和したフェノールで除蛋白
した後、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。

このＤＮＡ沈渣をエチジウムブロマイド（註１２）含有
セシウムクロライド液（セシウムクロライ１ｋ）９．４
　ｇ　、　６Ｗ／ｍｌのエチジウムブロマイド液ｏ、５
５ｍ１を蒸溜水１０ｍ１に調製したもの）に溶解し、Ｔ
ｉ７０ローター（ベツクスン製）を用いて４８．０００
ｒｐｍで遠心分離した。紫外線照射によりプラスミドＤ
ＮＡのバンドを確認、その部分を回収した。

エチジウムブロマイドをイソブタノール抽出により除い
た後、透析によりセシウムクロライドを除去した。これ
をフェノール抽出した後、水層に酢酸ナトリウムを８０
０ｍＭになるように加えてエタノール沈澱してプラスミ
ドＤＮＡを回収した。

二）ＮｅｏＲ断片は以下の方法で調製した（第１図参照
）。ＰＢＰＶ　８４２−１２　ＤＮＡ　Ｒｏｐｇ／４０
０ｐｌを制限酵素ＥｃｏＲＩ（註１４）及びＢａｍＨＩ
　（註１５）よって行なった。以上の方法によって木オ
マイシン耐性遺伝子をメタロサイアニンプロモーターの
制御下にもつＤＮＡ断片を得た。以下この断片をＮｅｏ
Ｒと称し、選択マーカーとして利用した。

ホ）　　ａｄｗ型及びａｙｗ型ＨＢウィルス表面抗原遺
伝子は以下の方法によって調製した。

ａｄｗ型或いはａｙｗ型の亜型を示す活性型゛Ｂ型肝炎
患者の血清１００ｇ１をｓｗ−−２８，ローターを用い
て２５．００Ｏｒｐｍ、１２時間４℃で遠心沈澱し、沈
渣として得られたＨＢＶ粒子を１００ａＩ／のダルベツ
コリン酸緩衝液（註１７）に懸濁し、再び上述の条件で
遠心分離し、その沈澱をとり、洗浄後Ｌｏｇ／の反応液
に懸濁した。

反応液は、１６０　ｍＭ　）リス（ｐＨ７，５）、４０
ｍＭ塩化マグネシウム、１２０ｍＭ塩化アンモニウム、
０．８Ｔｏ２−メルカプトエタノール（註１８）０．５
％ノニデットＰ−４０（註１９）１．０ｍＭｄＴＴＰ、
　ｄＡＴＰ、　ｄｃＴＰ％ｄＧＴＰからなる。この反応
液で１２時間、８７℃でインキュベートすることにより
、ＨＢＶゲノム中の単鎖部分を２重鎮にした。この方法
はＩｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ　１２　：　９９５−１
００５（１９７８）に詳しい記述がある。この反応液を
５ｗ２８　　ローターを用い、遠心分離し、得られた沈
澱を５　ｄのＤＮＡ抽出用緩衝液（０，０２Ｍトリス塩
酸ｐＨ７，６０，０２ＭＥＤＴＡ、１チソジウムドデテ
ールサルフエート（註２１）、プロティナーゼＫ（註２
２）（１μｇ／ｍｅ　）　）に懸濁し、８７”Ｃ，１６
時間インキュベートした後、フェノール抽出を２回行っ
て除蛋白し、その水層部分をとり、エタノール沈澱法に
よりそのＤＮＡを回収した。

へ）得られたａｙｗ型ＨＢウィルス遺伝子をＢｇｌ　ｌ
（註２８）で切断し、ブレＳ１−ブレｓ２−　Ｓ領域を
含む、、２．　＝ｌｉ　ｋ　ｂの断片をポリリンカープ
ラスミドＰ８Ｐ６４のＢｇｌ　ｌサイトに導入した。ま
た８、８１を保存し、大腸菌で増殖するためＥｃｏＲＩ
とＢｇｌｌで得られるＳ領域を含む２．１ｋｂの断片も
またポリリンカープラスミドＰ８Ｐ６４に導入した。

ト）Ｐ８Ｐ−Ｎｅｏプラスミド（第１図）は以下のよう
にして作製した。ポリリンカープラスミドＰＩ；ＩＰＡ
ＡＧ−作ｆｉＥｌ−−ＩＥ　　葺　Ｐｖｕ　　　Ｉ　　
　（註　２４　　　）　？”　七ｎ１ｌｉｒＬ−その粘
着性末端をＤＮＡポリメラーゼエ（註２５）。

ｄＴＴＰ　、ｄＯＴＰ　、ｄＡＴＰ　、ｄＧＴＰを用い
て非粘着性末端（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ　）とした。Ｎｅ
ｏ断片も同様の方法で非粘着性末端とした。反応には０
．５μ「のＤＮＡ量を総流ｆ１８０μｊの反応液中に懸
濁して行なった。反応液は５０　ｍＭ　）リス、５　ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、１０ｍＭ２−メルカプトエタノー
ル、０．１　ｍＭ　ｄＡＴＰ　、　ｄｃＴＰ　、　ｄＴ
ＴＰ　、　ｄＧＴＰ　。

５単位のＤＮＡポリメラーゼで構成した。反応は室温で
２時間インキュベートして行なった。これら２つのＤＮ
Ａ断片はフェノール抽出して得た、２つの断片各々０．
５μ「を１０μグのライゲーション緩衝液（０，９単位
のＴ４ＤＮＡリガーゼ（註２６）、１０　ｍＭ　ｈリス
、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７，５）中で１時間インキ
ュベートすることにより２つの断片をライゲートし、Ｎ
ｅｏＲをＥｃｏＲＩサイトに導入したＦＤＰ−Ｎｅｏ（
第１図）を得た。

チ）　　Ｕ２プロモーターと８遺伝子を以下の方法でＰ
８Ｐ−Ｎｅｏ　　にクローニングした。Ｐ８Ｐ−Ｎｅ。

をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（註２７）で切断しく第■
図）、そのうちに含まれる５ａｃＩ　、　Ｓｍａｌ　＋
　　及びＡｖａｌ　　サイトを除いた。残ったＤＮＡを
フェノール抽出、エタノール沈澱で回収した後、前出（
実験材料）のＵ２−プロモーター断片とＥｃｏＲＩサイ
ト同士をライゲートした（第Ｘ図）。

ワ）このＤＮＡをアガロース電気泳動、フェノール抽出
、エタノール沈澱で回収した後、ＨＢウィルス遺伝子の
プレＳ１−８２−８遺伝子部を含む２Ａｋｂ　Ｂｇｌ　
ｌ断片とライゲートした（第Ｖ図）。次にＵ２由来のＡ
ｐａｌ　（註２８）サイトとＨＢウィルス由来のＢｇｌ
■サイトを非粘着性末端にした上でライゲートし、プラ
スミドＰＵ２８１　　（第■図）を得た。このプラスミ
ドをフェノール抽出、エタノール沈澱した後、Ｅ、Ｃｏ
１１１０１株に形質転換し増殖させた。この形質転換株
は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託された（寄託
番号ＦＥＢＭＰ−９２６８）。

ヌ）プラスミドＰＵ２Ｓ（第１図）は上述のＰＵ２８１
を構築した方法に準じて以下の手順で構築した。

Ｕ２プロモーターのＥｃｏＲＩ　−Ａｐａ°Ｉ断片をＰ
ＳＰＮｅ。

（第■図）断片のＥｃｏＲＩ　　サイトにライゲートし
、さらにＨＢウィルスＥｃｏＲＩ　−Ｂｇ＃　ｌ断片と
ライゲートした。ＨＢウィルス断片のＢｇｌＩＩＢ’末
端とＰＳＰ　ＮｅｏのＢａｍＨＩ　５’末端がライゲー
トされた。

残るＡｐａｌ末端とＥｃｏＲＩ　　末端は非粘着性末端
化した上でライゲートシ、その結果プラスミドＰＵ２８
（第ｙＩ図）を得た。

プラスミドＰＯ２８１／Ｕ２Ｓ　（第１図）はＰＵ２Ｓ
１とＰＵ２Ｓを材料として作製した。

ル）　　ＰＵ２８をＥｃｏＲＩとｘｈｏｌ（註２９）に
より切断して、Ｕ２Ｓ断片を得た。２ぎにＰＵ２Ｓ１を
ｘｈ。

Ｎで切断して、Ｕ２Ｓ断片をそのｘｈｏ　Ｉ末端とライ
ゲートした。残るＥｃｏＲＩ末端とｘｈｏｌ末端は非粘
着性末端にした上でライゲートし、その結果プラスミド
ＰＵ２８／Ｕ２８　　（第１図）を得た。

オ）プラスミドＰＵ２Ｓ２　（第Ｘ図）はＰＵ２Ｓ　作
製の方法とはゾ同様の方法で作製された。

ＰＳＰＮｅｏをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ　　で切断し
た。

つぎにａｄｗ型ＨＢウィルスゲノムをＭ８ｔＨ註８０）
とＢｇｌ　ｌで切断し得られた４つの断片のうち２．２
ｋｂの８２−８領域を含む断片をアガロース電気泳動に
より精製、回収した。その断片のＳ領域側のＢｇｌｌ末
端とＰＳＰＮｅｏのＢａｍＨＩ末端をライゲートした。

つぎにＡｐａｌ末端を非粘着性末端とした上で、Ｍｓｔ
Ｉにより生じた非粘着性末端とライゲートシブラスミド
ＰＵ２Ｓ２　　（第Ｘ図）を得た。

！７）　　フラスＥ　ｔ’　ＰＵ２Ｓ２／Ｕ２Ｓ　（第
Ｘ図）　ｌ！　ＰＵ２８１／Ｕ２Ｓの作製方法に準じて
作製した。プラスミドＰＵ２ＳをＥｃｏＲＩとｘｈｏ　
ｌで切断し、０２８断片を回収した。つぎにＰＵ２Ｓ２
をｘｈｏｌで切断した。Ｕ２Ｓ断片とＰＵ２Ｓ２のｘｈ
ｏｌ　　末端をライゲートした上で残ったＥｃｏＲＩ末
端とｘｈｏ　［末端を非粘着性末端とした上でライゲー
トしてプラスミドＰＵ２８２／Ｕ２Ｓ　（第Ｘ図）を得
た。

註ＮＯ品　　　名 ２　　大　　腸　　菌　　　米国　ビーアールエル社Ｈ
Ｂ　１０１８　　ＬＢ−培地　　米国ディフェ社製４　
　ト　　　、ノ　　　ユ　　　　トリス（ヒドロキシ）
アミノメタン重さ　ｆ’ｎ卑蝕貧仙制 ６アンピシリン　　米国　シグマ社製 ７　クロラムフェニコール　　１ ８　リゾチーム　　東京　和光紬薬社製１１プロナーゼ
　　東京　和光紬薬社製１３　セシウムクロソイド　　
　１ １４　ＥｃｏＲＩ　　　　京都　宝酒造社製１５　Ｂａ
ｍＨｌ １６　リチウムクロライド　東京　和光紬薬社製１７　
ダルベツコ緩衝液　　東京　田水製薬社製１８２−メル
カプトエタノール東京　和光紬薬社製１９　ノニデット
Ｐ−４０米国　シグマ社製２１　ソジウムドデチルサル
フエート　ＳＤＳ　　東京　和光紬薬社製２２　ブロテ
ィナーゼＫ　　米国　ベセスダリサーチ社製２８　Ｂｇ
ｌ　ｌ　　　　　京都宝酒造社製２４　　Ｐｖｕ　　ｎ
　　　　　　　　米国　ベセスダリサーチ社製２５　　
ＤＮＡポリメラーゼ　ｌ１ ２６　　Ｔ４　　ＤＮＡ　　リガーゼ　　１２７　Ｂａ
ｍ　Ｈｌ　　　　京都宝酒造社２８　　Ａｐａ　　ｌ　
　　　　　　　　米国　ベセスダリサーチ社製２９　　
ｘｈｏ　　１ ８０　　Ｍｓｔ　　１ 実施例２　　ＨＢ８産生細胞の作製 実施例１で構築したプラスミドを動物細胞に形質転換し
た。形質転換はグラハムらによる方法（Ｇｒａｈａｍ　
Ｆ、Ｌ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　５２　
：　４５６（１９７８）　）に準じて行なった。

２０μｑの鮭精子ＤＮＡ（註１）を含む２４０ｍＭ塩化
カルシウム溶液０．５　ｍｌに１０μ「のＰＵ２ＳＩＤ
ＮＡを加えた。本溶液をヘペス（註２）　１．５ｍＭリ
ン酸ナトリウム、２８ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７，１
）の緩衝液にはげしく撹拌しながら添加して３０分間、
２５℃にインキュベートし沈澱を形成した。形質転換の
前日に１０個のＣＨＯ細胞（註３）を１０％牛脂児血清
（註４）を含むハムＦ−１２培地（註５）に懸濁して、
直径１５１１ｍのペトリー皿に撒いた。形質転換当日新
鮮な培地と交換した後前述の沈澱を、細胞を含むペトリ
ー皿に添加した。１時間毎に動揺しながら８時間インキ
ュベートした。つぎに培地を捨て２．０％グリセロール
を含むリン酸緩衝液を加えて２分間、３７°Ｃでインキ
ュベートした。リン酸緩衝液で一回洗浄した後、１０チ
牛脂児血清を含むハムＦ−１２培地を添那し、３７°Ｃ
，ＣＯ２詳卵器でインキュベートした。４日日に培地を
３００μｇ〜１■／　ｍｌのネオマイシンを含有する１
０％ＦＯ８（牛胎児血清）ハムＦ−１２培地と交換し、
培養を継続した。７日〜１０日日に生存している細胞を
シリンダー法でクローニングした。増殖した各クローン
の培養上清のＨＢＳ粒子産生能をベーリング社のエンザ
イグノストキット（註６）を用いて検討した。産生能陽
性の細胞について限界希釈法でクローニングした上で、
さらに詳しく産生能を検討した。

１００μｇ　／ｍｌ培地／　ｄ　ａ　７以上の産生能を
示すクローンを８１クローン得た。その中最高１．２μ
ｇ／ｍｌ培地／ｄａｙの産生能を示すクローンがあった
。

実施例８　異なった組成のＨＢＳ粒子を産生ずる細胞株
の作製 実施例２Ｋ示した方法を用いてＣＨＯ細胞をＰＵ２８　
、　ＰＵ２８１　、　ＰＵ２８１Ｕ２Ｓ　、　ＰＵ２Ｓ
２及びＰＵ２Ｓ　２Ｕ２８　　のプラスミドで形質転換
した。得られたＨＢ８産生細胞株を培養し、その上清に
産生される粒子のＨＢ８蛋白の組成を検討した（第１表
）。゛組成の決定には実施例５で示す銀染色デンシトメ
トリー法を用いた。

（以下余白） 実施例４　組換ＨＢ８粒子の精製と力価試験実施例２Ｋ
より得たＨＢＳ粒子産糸色ＨＯ細胞をローラーボトルを
用いて培養し、その上清中に分泌したＨＢＳ粒子を以下
の方法で精製した、培養液５０００＋＋ｔ／にｓｏｏｇ
のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００　（註７
）を加え室温で３時間撹拌した。これをサーパル遠心器
（註８）、ＯＳローターで（註９　）４．５０Ｏｒｐｍ
１時間遠心分離した。その上清にさらにａｏｏｇのＰ　
Ｅ　Ｇ　８０００を加えて３時間撹拌した後、上記のロ
ーターで１０．００Ｏｒｐｍ１時間遠心分離した。沈澱
を５０ｔｘｌのＰＢＳに懸濁し、この液をＢｉｏｒａｄ
　Ａ　−５ｍ　　カラム（註１０）を用いてゲル濾過し
、ＰＥＧからＨＢ８粒子を分離した。この粒子分画をＬ
ａｇ／ｌｉｔのセシウムクロライド液で密度勾配遠心分
離した。

ベックマンＬ５遠心機、５０Ｔｉローター（註１１）を
用い、４５．００Ｏｒｐｍ１５０時間、１５°Ｃで遠心
分離した。Ｌ２ｃｒ／ｘｌの密度域にバンドしたＨＢ８
粒子を回収し、ＰＢＳに対して透析し精製ＨＢ８粒子を
得た。以上の方法は公知のゲルリツヒらの方法（ウォル
フラム・バー・ゲルリッヒ特開昭６ｌ−１１１６９５）
を用いて行なった。このようにして得た精［ＥｆＢ　Ｓ
粒子を水酸化アルミニウムゲル（註１２）に吸着し、沈
降型ワクチンとした。

吸着量はアルミニウムを３００１Ｗ／　ｍｌに含有する
ゲル１’　ｙｓｔあたり４０μＪとした。

このワクチンをモルモット（第２表）とマウス（第３表
）に投与し、その血清中に現われた抗体価を投与４週間
後に検定した。ワクチンに含まれる抗原量は高塩濃度弱
アルカリ溶出させ（８ａｉｔｏ。

Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊａｐａｎ　Ｊ９Ｍｅｄ、Ｓｃ
ｉ、　ＢｉｏＣ８６，２７Ｂ。

（１９８３））、ベーリング社エンザイグノストキット
により測定した。被検動物血清中の抗体価は化血研社製
セロクリット抗ＨＢ８を用いた。動物は各群５匹で行な
った。３０ツトで行った結果いずれも血清由来ワクチン
に比較して同等以上の分画を示した。特にロット２は極
めて高い力価を示した。

実施例５　粒子に含まれるラージ蛋白、ミドル蛋白及び
メジャー蛋白の比の測定 ２つの方法で行なった。第１法は電気泳動パターンをデ
ンシトメトリーする方法で行なった。第２法はＥＬＩ８
Ａで行なった。

（第１法）　精製１ノだＨＢＳ粒子を５μｇ１５μｌに
調製し、これを１５μｌのゲル−ローディング緩衝液（
２％５Ｄ８１５％メルカプトエタノール、３チ蔗糖、５
０ｍＭ）リスｐＨ７，４）と混合し５分間沸騰水浴上に
保持した。これをＯ，ｔ　Ｓの８ＤＳを含む１２％ポリ
アクリルアミドスラブゲル上で電気泳動した。バイオラ
ッド社製銀染色試薬（註１８）を用いて染色し、染色像
をデンシトメーター（米国バイオラド社モデル６２０）
で測定しラージ蛋白部、ミドル蛋白部、メ・ジャー蛋白
部それぞれのピークを比較した。

（第２法）・ノラージ蛋白特異的及びミドル蛋白特異的
単一クローン抗体は公知である（ウォルフラム・ハーゲ
ルリツヒ特開昭６ｌ−１１１６９５）。

これらの抗体及びマウス抗ＨＢＳ抗体（註１４）を用い
てＥＬＩＳＡキットを作製した。家兎抗ＨＢｓ抗体（註
１５）の１００部ＰＢＳ希釈液をグイナボット社製ＥＬ
ＩＳＡ用９６大プレート（註１６）に各５０μｌ添加し
、−晩冷室に保持した。これを洗浄後０．１チ牛血清ア
ルゴミン（註１７）を含むＰＢＳでブロックし、これに
ＨＢＶ粒子及び本発明による粒子を添加した。その濃度
は５μｇ〜５０μｇ　／ｍｌを用いた。１時間、３７°
Ｃでインキュベートした後洗浄し、各々に抗ラージ蛋白
特異抗体、抗ミドル蛋白特異抗体及び抗ＨＢｓ抗体を５
０μｇ添加した。いずれも１００音希釈液を用いた。１
時間、３７°Ｃでインキュベートした後各ウェルにペル
オキシダーゼ標識山羊抗マウスＩｇＧ抗体（註１８）（
カッベル社）１００倍希釈液５０μｌを添加した。１時
間インキュベートした後、新たに調製した基質（１０ダ
オルトフエニレンジアミン。

（註１９）０．０１％過酸化水素）を５０μｌずつ添加
し、室温でインキュベートした。発色の度合を見て１規
定の硫酸を５０μｌ添加して反応を止めた。各ウェルの
吸光度を４９２ｎｍのフィルターを装着したフロー社製
マルチスキャン（註２０）を用いて吸光度を測定した。

ＨＢＶ粒子の各蛋白組成がラージ蛋白１チ、ミドル蛋白
１０％及びメジャー蛋白９０チであることを標準にして
、ＨＢＶ粒子のウェルにおける発色と本ＨＢｓ粒子にお
ける発色を比較してその成分比を得た（第４表）。

（以下余白） 実施例６　　Ｈ−２Ｋプロモーター（註２１）、ミクロ
グロブリンプロモーター（註２２）、メタロサイアニン
プロモーター（註２３）を用いたＨＢｓ粒子の発現 実施例１を踏襲して上記３種のプロモーターを用いｐＨ
−２ｋＳ１．　ｐＭＧ８を及びｐＭＴ　Ｓ　１のプラス
ミドを作製した。これをＣＨＯ細胞にネオマシン遺伝子
とともに形質転換し産生細胞を作製した。、スクリーニ
ングの後Ｉ（Ｂｓ粒子のもっとも産生能力の高いものの
効率を比較した。また薬剤による増巾効率についても検
討を行なった（第５表）。

（以下余白） 実施例７　各涌動物細胞による形質転換の比較実施例１
のＰＵ２Ｓ１をＶｅｒｒ　ｏ細胞（註２４）、Ｌ細胞（
註２５）、Ｗｌ−８８細胞（註２４）及びミエローマＰ
３Ｘ６８細胞（註２４）に形質転換した。

これらの細胞を１０個ずつ直径１５ｃｒＩＬのペトリー
皿に撒き一晩培養し、その上清に現われるＥＵＢｓ粒子
ヲベーリング社エンザイグノストを用いたＥＬＩＳＡで
定量した。Ｖｅｒｏ細胞、Ｌ細胞は良好な結果を示した
がＷｌ−１８由来細胞はほとんど粒子を産生じなかった
（第６表）。

第　　　　６　　　　表 実施例８　デバイドロフオレートレダクターゼを用いる
方法 Ｄｅｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ　Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝
子はシモンゼンらの報告（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ、　Ｃ，、
ＰＮＡＳ　　８０：２４９５（１９８８））の方法を用
いて得た。メトトレキセイト耐性を示す８Ｔ８細胞（註
２５）のメツセンジャーＲＮＡを抽出、常法により精製
してｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡにＦＵ２プロモ
ーターをライゲートし、ＰＢＲ８２２（註２６）に導入
した。

これらの方法は実施例１記載の方法に準じて行なった。

本プラスミドを実施例１に示したプラスミド群と縦列に
つないだ後、ＤｅｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅＲｅｄｕｃｔ
ａｓｅを欠損したＣＨｏ細胞の変異株にリン酸カルシウ
ム法で形質転換した。形質転換株はその培養液中にメト
トレキセイト（註２７）を加えることによって選択され
た。その濃度は０．１μｑ〜１．０μｇ１ｍｌが適当で
あった。このようにして選択されたＨＢｓ粒子産生株は
、さらにメトトレキセイトを用いてその産生量を安定し
て増巾することができた。培養液中に０．１μｇ〜１ｏ
ｏμｇ／１ｔｔｌの範囲でメトトレキセイトを加えるこ
とにより有為にその産生量は増巾された。（第７表）。

第　　　　７　　　　表 註Ｎｏ、　　品　　　　　名　　　　説　　　　　明１
　鮭精子ＤＮＡ　　東京　和光紬薬社製８　　ＣＨＯ細
　胞　　　　米国　フロー社から購入４′牛脂児血清　
　　東京　和光紬薬社製５　ハム−１２培地　　東京　
田水製薬社製６　エンザイクノストキット　　米国　ベ
ーリング社製８　サーバル遠心器　　　米国　サーバル
社ｉｔ！ＲＣ５ｂ９　　Ｇ８０−ター　　　米国　サー
バル社製１０　　Ｂｉｏｒａｄ　Ａ　−５ｍ　　　米国
　バイオラド社製カラム １１　５０Ｔｉ　Ｃ１−ター米国　　ベックマン社製１
８　銀染色試薬　　　米国　パイオシド社製１４　　マ
ウス抗ＨＢｓ抗体　　　　　　　自　　　製１５　　家
兎抗ＨＢｓ抗体　　　　　　自　　製１６　　ＥＬＩ８
Ａ用９６穴プレート東京　グイナボット社製【７　牛血
清アルブミン　　東京　和光紬薬社製Ｅ８　　山羊抗マ
ウスｘｇａ　　　米国　カッペル社製［９オルトフェニ
レンジアミン　　東京　和光紬薬社製シ０　マルチスキ
ャンナー　　米国　　フロー社製２７　　メトトレキセ
イト　東京　和光紬薬社製２８　　デキサメサゾン ２９　　硫酸カドミウム 〔発明の効果〕 本発明によればきわめて有効なり型肝炎ウィルスの抗原
粒子を遺伝子工業の手法によシ量産することができ、ま
たその粒子を用いて感染性のウィルスやゲノムを全く含
まない安全かつ有効なワクチンを製造することができる
。

【図面の簡単な説明】

第Ｘ図はプラスミドｐＤＢＰＶ−ＭＭＴｎ　ｅ　ｏを、
第Ｘ図はポリリンカープラスミド−ｐＳＰ６４とｎｅｏ
断片からプラスミドｐｓＰ−Ｎｅｏの作製を、第■、■
、Ｖ、ＶＩ図はｐＳＰ　　Ｎｅｏ、　Ｕ２プロモーター
断片ａよびＨＢウィルス遺伝子のＢｇｌｌ断片（２，４
Ｋｂ）からプラスミドｐＵ２Ｓ工の作製を、第１図はＨ
Ｂウィルス遺伝子のＥｃｏＲＩ−Ｂｇ１！ｎ断片（２，
ＩＫｂ）を用い上記同様にして得られたプラスミドｐＵ
２Ｓを、第１図はＩ）Ｕ２Ｓ１とｐＵ２Ｓの各断片を用
いて作製されたプラスミドｐＵ２　Ｓ　１／　Ｕ２　Ｓ
を、第ｆｆ図はＨＢウィルスの５２−Ｓ領域を含む断片
（２，２Ｋｂ）を用いて得られたプラスミドｐＵｚＳｚ
　を、第Ｘ図はｐＵ２ＳとＩ）Ｕ２Ｓ２との各断片から
作製したプラスミドｐＵ２　Ｓ　２／Ｕ２Ｓを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　天然のＢ型肝炎表面抗原粒子とは異なる比でプレＳ
   ＿１−プレＳ＿２−Ｓ蛋白（ラージ蛋白）、プレＳ＿２
   −Ｓ蛋白（ミドル蛋白）Ｓ蛋白（メジャー蛋白）を含む
   Ｂ型肝炎表面抗原粒子。 ２、ラージ蛋白が２〜５０％、ミドル蛋白が１０〜６０
   ％の範囲で任意の比率に含まれる特許請求の範囲第１項
   記載のＢ型肝炎表面抗原粒子。（以下粒子と略称） ３、遺伝子組み換技術で作製される特許請求の範囲第１
   項記載の粒子。 ４、動物細胞を宿主とした遺伝子組み換技術で作製され
   る特許請求の第１項記載の粒子。 ５　Ｕ−２プロモーターを用いる特許請求の範囲第４項
   記載の粒子。 ６　Ｈ−２Ｋプロモーターを用いる特許請求の範囲第４
   項記載の粒子。 ７　マクログロブリンプロモーターを用いる特許請求の
   範囲第４項記載の粒子。 ８　メタロサイアニンプロモーターを用いる特許請求の
   範囲第４項記載の粒子。 ９　宿主としてＣＨＯ細胞を用いる特許請求の範囲第４
   項記載の粒子。 １０　宿主としてＶｅｒｏ細胞を用いる特許請求の範囲
   第４項記載の粒子。 １１　宿主としてＬ細胞を用いる特許請求の範囲第４項
   記載の粒子。 １２　特許請求の範囲第１項記載の粒子を動物細胞を宿
   主とする遺伝子組み換え技術で作製するために用いる遺
   伝子の構造およびそれを含む大腸菌ベクター。 １３　Ｕ−２プロモーターを用いる特許請求の範囲第１
   ２項記載の遺伝子の構造およびそれを含む大腸菌ベクタ
   ー。 １４　Ｈ−２Ｋプロモーターを用いる特許請求の範囲第
   １２項記載の遺伝子の構造およびそれを含む大腸菌ベク
   ター。 １５　マクログロブリンプロモーターを用いる特許請求
   の範囲第１２項記載の遺伝子の構造およびそれを含む大
   腸菌ベクター。 １６　メタロサイアニンプロモーターを用いる特許請求
   の範囲第１２項記載の遺伝子の構造およびそれを含む大
   腸菌ベクター。 １７　特許請求の範囲第１項記載の粒子を動物細胞を宿
   主とする遺伝子組み換え技術で作製する場合、宿主の培
   養液中に薬剤を添加することを特徴とする粒子の産生を
   増巾する方法。 １８　薬剤がメトトレキセイドである特許請求の範囲第
   １７項記載の方法。 １９　薬剤がグルココルチコイドである特許請求の範囲
   第１７項記載の方法。 ２０　薬剤がホルボールミリステートアセテートである
   特許請求の範囲第１７項記載の方法。 ２１　特許請求の範囲第１項記載の粒子を含むワクチン
   。 ２２　特許請求の範囲第１項記載の粒子の２種以上の亜
   型を含む特許請求の範囲第２１項記載のワクチン。