JP2004175665A - タンパク質中空ナノ粒子およびそれを用いた薬剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】目的の細胞や組織に特異的に物質を導入する中空ナノ粒子であって、安定した生産量が得られる中空ナノ粒子、およびこれを用いた薬剤を提供する。
【解決手段】肝細胞などの特定の細胞に対する認識能を有し、粒子形成能を有する第1のタンパク質(例えば、B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質)からなる中空ナノ粒子において、上記第1のタンパク質には、カプシド構造を形成する第2のタンパク質(例えば、B型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質)と相互作用しているものが含まれている。
【選択図】 なし
【解決手段】肝細胞などの特定の細胞に対する認識能を有し、粒子形成能を有する第1のタンパク質(例えば、B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質)からなる中空ナノ粒子において、上記第1のタンパク質には、カプシド構造を形成する第2のタンパク質(例えば、B型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質)と相互作用しているものが含まれている。
【選択図】 なし
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、疾患治療用の細胞導入物質を封入することができる中空ナノ粒子に関し、より詳細には、粒子内部に封入された疾患治療用の細胞導入物質を特定細胞または組織内に特異的に導入可能な薬剤に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
近年、医学の分野において、患部に直接作用し、高い効果を示す副作用の少ない薬品の開発が盛んに行われている。特に、ドラッグデリバリーシステム(DDS)と呼ばれる方法は、目的細胞、あるいは、目的組織に対して特異的に薬剤等の有効成分を運搬し、目的箇所で有効成分を作用させることのできる方法として注目されている。
【0003】
目的細胞、あるいは、目的組織に対して特異的に薬剤となるタンパク質を送り込む方法としては、従来、当該タンパク質をコードする遺伝子が組み込まれた発現ベクターをエレクトロポレーション法等により目的細胞に導入して、この遺伝子を細胞内で発現させることによりタンパク質薬剤を細胞内に送り込むいわゆる遺伝子導入方法が開発されてきた。しかし、このような従来の遺伝子導入方法では、何れも、目的細胞、あるいは、目的組織に対して特異的にタンパク質薬剤を送り込む方法としては不十分なものであった。
【0004】
【特許文献1】
国際公開第01/64930号パンフレット
【0005】
【非特許文献1】
「ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー」(”Journal of Biological Chemistry” ),(アメリカ合衆国),1992年,第267巻,第3号,p.1953−1961
【0006】
【非特許文献2】
「ジーン」(”Gene” ),(オランダ),1991年,第106号 p.143−149
【0007】
【非特許文献3】
「ワクチン」(”Vaccine” ),(イギリス),2001年,第19号,p.3154−3163
【0008】
【非特許文献4】
「ジャーナルオブバイロロジー」(”Journal of Virology” ),(アメリカ合衆国),1994年,第68号,p.1643−1650
【0009】
【非特許文献5】
「バイロロジー」(”VIROLOGY” ),(アメリカ合衆国),1997年,第228号 p.115−120
【0010】
【発明が解決しようとする課題】
以上のような状況に鑑み、本発明者らは、特許文献1において、粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子が導入された中空ナノ粒子を用いて、目的とする細胞や組織に、物質(遺伝子、タンパク質、化合物等)を特異的かつ安全に運搬、導入するための方法を提案しているが、この方法を応用しつつ上記中空ナノ粒子の安定した生産量を得るためのさらなる改良が課題となっていた。
【0011】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、安定した生産量が得られる、目的の細胞や組織に特異的に物質を導入するタンパク質中空ナノ粒子、およびこの中空ナノ粒子に細胞導入物質を包含させた薬剤を提供することにある。
【0012】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、粒子形成能を有するタンパク質とともに、カプシド構造を形成するタンパク質を発現することにより、粒子の生産量が飛躍的に高まることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【0013】
即ち、本発明に係る中空ナノ粒子は、特定の細胞(例えば肝細胞など)に対する認識能を有し、粒子形成能を有する第1のタンパク質からなる中空ナノ粒子において、上記第1のタンパク質には、カプシド構造を形成する第2のタンパク質と相互作用しているものが含まれている事を特徴としている。
【0014】
上記「粒子形成能を有する第1のタンパク質」としては、例えばB型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を挙げることができる。このタンパク質は、真核細胞で発現させると、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出される。
【0015】
また、上記「カプシド構造」とは、ウィルス粒子において、ウィルスゲノムを包み、保護しているタンパク質の殻を指し、上記「カプシド構造を形成する第2のタンパク質」としては、例えば、B型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質を挙げることができる。上記第2のタンパク質は、上記第1のタンパク質と共発現すると、相互作用し、粒子の形成を促す。なお、ここで言う「相互作用」とは、第1のタンパク質と第2のタンパク質とが直接接触をして作用しあっていることを言う。第1のタンパク質と第2のタンパク質とは少なくとも一つ直接接触していればよいが、その数は多ければ多いほど良い。また、上記相互作用は、必ずしも第2のタンパク質が、第1のタンパク質が形成する粒子の内部に包含されて行われる必要はなく、粒子の外側の第2のタンパク質と第1のタンパク質とが相互作用していても良い。これにより、第1のタンパク質の粒子形成が促され、粒子形成率が上がるとともに、中に細胞導入物質を包含させて、薬剤として利用することも可能となる。
【0016】
本発明の中空ナノ粒子は、このような粒子形成能を有する第1のタンパク質をコードする遺伝子、およびカプシド構造を形成する第2のタンパク質をコードする遺伝子を、ベクターによって同一の真核細胞(例えば酵母)に導入し、当該真核細胞に遺伝子発現させることにより製造することができる。
【0017】
上記第2のタンパク質をコードする遺伝子を導入するベクターとしては、オーレオバシジンA感受性遺伝子を有するベクター(例えば、宝酒造社製のpAUR123)にて導入することが望ましい。
【0018】
上記B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質およびB型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質を発現させて得られる粒子は、肝細胞を認識し、肝細胞に対して特異的に粒子内の物質を運搬することができるので、肝臓疾患治療用の物質(遺伝子等)を包含させることにより、肝細胞に対して特異的かつ効果的に作用する有効な治療薬となる。
【0019】
また、例えば上記B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を、本来の肝細胞に対する感染能を欠失するように改変し、さらに増殖因子や抗体を提示するように改変し、このように改変されたB型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を用いて粒子を形成することで、肝細胞以外の特定の細胞に対して特異的に粒子内の物質を運搬することができる。例えば、ベータセルリン(BTC)を提示させることで、膵臓β細胞を認識し、その膵臓β細胞に対して特異的に粒子内の物質を運搬することができる。また、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を提示させることで、血管内皮あるいは脳下垂体細胞を認識し、血管内皮あるいは脳下垂体細胞に特異的に粒子内の物質を運搬することができる。
【0020】
このような改変されたB型肝炎ウィルス表面抗原、特にBTC提示型B型肝炎ウィルス表面抗原、bFGF提示型B型肝炎ウィルス表面抗原は、B型肝炎ウィルス表面抗原だけを発現させた場合には非常に粒子を形成し難いが、上記カプシド構造を形成する第2のタンパク質とともに発現することで粒子形成率が飛躍的に向上するので、その効果が特に高いといえる。
【0021】
また、本発明の中空ナノ粒子に治療物質を包含させた薬剤では、静脈注射という簡便な方法で特定の細胞または組織における疾患を効果的に治療することができ、従来の治療方法と大きく異なり、多量の薬剤の投与や遺伝子治療等における外科手術を必要とせず、副作用の心配も極めて低く、そのまま臨床応用可能なものである。
【0022】
本発明の治療方法は、本発明の薬剤を投与することによる疾患の治療方法である。
【0023】
【発明の実施の形態】
本発明の中空ナノ粒子は、粒子形成能を有する第1のタンパク質からなる中空ナノ粒子において、上記第1のタンパク質には、カプシド構造を形成する第2のタンパク質と相互作用しているものを含んでなるものであるが、その粒子形成能を有する第1のタンパク質に生体認識分子(換言すれば、特定の細胞を認識する分子)を導入することによって、目的細胞あるいは目的組織に特異的に物質を運搬することができる。上記粒子形成能を有する第1のタンパク質としては、種々のウィルスから得られるサブウィルス粒子を適用することができる。具体的には、粒子形成能を有する第1のタンパク質として、B型肝炎ウィルス(Hepatitis B Virus:HBV)表面抗原タンパク質等が例示される(以下、このB型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を「HBsAgタンパク質」と略記する場合がある)。この場合、カプシド構造を形成する第2のタンパク質としては、B型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質(以下、このB型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質を「HBcAgタンパク質」と略記する場合がある)を用いれば良い。
【0024】
まず、粒子形成能を有する第1のタンパク質について説明する。粒子形成能を有するタンパク質からなるタンパク質粒子としては、真核細胞で上記第1のタンパク質を発現させることにより得られるものが挙げられる。つまり、真核細胞で粒子形成能を有するタンパク質を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出されるのである。このとき、真核細胞としては、哺乳類等の動物細胞、酵母等が適用できる。
【0025】
本発明者らは、遺伝子組換え酵母で上記HBsAgのLタンパク質を発現させることにより、発現されたHBsAgのLタンパク質から酵母由来の脂質二重膜に多数の同タンパク質が埋め込まれた短径約20nm、長径約150nmの楕円状中空粒子(以下HBsAgL粒子という)が形成されることを見出し、報告している(非特許文献1参照)。このような粒子は、HBVゲノムを全く含まないので、ウィルスとしては機能せず、人体への安全性が極めて高い。また、HBVの肝細胞への極めて高い感染力を担う肝細胞特異的レセプターを粒子表面に提示しているため、肝細胞に対して特異的に物質を運搬する運搬体としての効果も高いのである。
【0026】
このように遺伝子組換え酵母を用いてタンパク質粒子を形成する方法は、菌体内の可溶性タンパク質から高効率で粒子が生産される点で好適である。
【0027】
本発明者らは、後述する実施例に示されるとおり、上記HBsAgのLタンパク質を発現させる際に、HBcAgタンパク質を同時に発現させれば、上記HBsAgL粒子の形成率が飛躍的に高まることを見出した。これは、HBcAgタンパク質タンパク質がHBsAgのLタンパク質に作用し、HBsAgL粒子の形成を促しているためと考えられる。
【0028】
HBcAgタンパク質は、図2(a)に示すように、Assembly domainと、RNA−binding protamine domainからなる。上記Assembly domainは、カプシド構造を形成するための部位であり、本発明の中空ナノ粒子の形成にはこの部位が重要となる。HBcAgタンパク質は、図2(b)に示すように自身で集まってカプシド構造を形成する能力を有しているが、必ずしもカプシド構造を形成している必要はなく、個々の分子がHBsAgのLタンパク質に作用していてもよい。
【0029】
HBsAgのLタンパク質やHBcAgを導入するためのベクターとしては、様々なプロモーターを組み入れた発現ベクターがあるので、目的に応じたものを選択すればよい。特にHBcAgタンパク質を導入するためには、HBsAgのLには、例えば、pAUR123(Takara製)のようなオーレオバシジン感受性遺伝子aur1を有するベクターを用いれば、HBsAgの粒子形成の促進効果が高まることがわかっている。
【0030】
また、本発明のタンパク質中空ナノ粒子では、以上のような方法によって得られた粒子表面のレセプターを、図1に示すように、任意の生体認識分子に改変することにより、肝細胞以外にも、任意の細胞及び組織に極めて高い特異性で物質を運搬、導入することが可能となる。
【0031】
もちろん、粒子形成能を有する第1のタンパク質は、上記のB型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質に限られるものではなく、粒子を形成することができるタンパク質であれば、どのようなものでもよく、動物細胞、植物細胞、ウィルス、菌類等に由来する天然タンパク質や、種々の合成タンパク質等が考慮される。また、例えばウィルス由来の抗原タンパク質等が生体内において抗体を惹起する可能性がある場合などは、改変して抗原性を減少させたものを粒子形成能を有するタンパク質として用いてもよい。例えば、粒子形成能を有するタンパク質としては、特許文献1に開示される抗原性を減少させたB型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質であってもよいし、特許文献1に開示されるB型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を、遺伝子操作技術を用いて改変したタンパク質であってもよく、粒子構造が安定するように改変したものでもよい。また、B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質や同タンパク質を改変したタンパク質に、さらに増殖因子や抗体などの他のタンパク質を付加したものを、第1のタンパク質として用いてもよい。
【0032】
粒子形成能を有するタンパク質に導入される生体認識分子としては、例えば成長因子、サイトカイン等の細胞機能調節分子、細胞表面抗原、組織特異的抗原、レセプターなどの細胞および組織を識別するための分子、ウィルスおよび微生物に由来する分子、抗体、糖鎖、脂質などが好ましく用いられる。具体的には、癌細胞に特異的に現れるEGF受容体やIL−2受容体に対する抗体やEGF、またHBVの提示するレセプターも含まれる。これらは、目的とする細胞、あるいは組織に応じて適宜選択される。なお、ここで「生体認識分子」とは、特定の細胞を認識する分子(換言すれば、特定の細胞に対する認識能を本発明の中空ナノ粒子に付与する分子)のことをいう。なお、この生体認識分子は、粒子形成能を有する第1のタンパク質に生体認識分子が含まれる場合と、第1のタンパク質に生体認識分子を融合(または直接間接に結合)させる場合とを両方含む。
【0033】
上記のように、生体認識分子をHBsAgLタンパク粒子に付与する方法としては、HBsAgLタンパク質の有する肝細胞認識部位を任意の生体認識分子に改変して、発現させることが考えられる。このように肝細胞認識部位を改変されたHBsAgLタンパク質は、それだけでは粒子形成率が低いが、カプシド構造を形成する第2のタンパク質と相互作用することで、粒子形成が効果的に促進される。これは、特に、この方法でBTCやbFGFを提示するように改変したHBsAgLタンパク質の粒子に好適である。また、第2のタンパク質は粒子内部からでなく、外側から相互作用していても良い。
【0034】
また、カプシド構造を形成する第2のタンパク質も、上記のB型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質に限られるものではなく、カプシド構造を形成することができるタンパク質であれば、どのようなものでもよく、動物細胞、植物細胞、ウィルス、菌類等に由来する天然タンパク質や、種々の合成タンパク質等が考慮される。例えば、B型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質を、中空ナノ粒子の粒子形成能が向上するように改変したものでもよく、タンパク質の機能が変わらないように改変したものでもよい。
【0035】
以上のように作製された本発明の中空ナノ粒子は、特定の細胞に対して特異的に細胞導入物質を送り込むものとして有用である。例えば、本発明の中空ナノ粒子として、B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質からなる粒子を用い、これに細胞導入物質を包含した薬剤を静脈注射などによって体内に投与すれば、当該粒子は体内を循環し、粒子表面に提示した肝細胞特異的レセプターにより肝細胞に導かれ、感染する。そして、細胞導入物質が肝細胞中に送り込まれ、細胞導入物質の肝臓組織特異的な導入が行われる。
【0036】
このタンパク質中空ナノ粒子に内包される細胞導入物質としては、例えばDNA、RNAなどの遺伝子、天然あるいは合成タンパク質、オリゴヌクレオチド、ぺプチド、薬剤、天然あるいは合成化合物など、どのようなものであってもよい。
【0037】
これらの細胞導入物質を上記の中空ナノ粒子に封入する方法としては、通常の化学的、分子生物学的実験手法で用いられる様々な方法が適用される。たとえば、エレクトロポレーション法、超音波法、単純拡散法、あるいは電荷を有する脂質を用いる方法等が好ましく例示される。また、細胞導入物質としてタンパク質を用いる場合は、粒子形成能を有するタンパク質に細胞導入物質を融合させて粒子形成する方法も、上記細胞導入物質の封入に含まれると考えられる。粒子形成能を有するタンパク質に細胞導入物質を融合させる方法とは、例えば、B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質をコードする遺伝子と、その下流側に上記タンパク質薬剤をコードする遺伝子とが挿入されたプラスミドを作製し、このプラスミドを用いて真核細胞に粒子を形成させることによって、粒子を形成するB型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質にタンパク質薬剤が融合した薬剤を製造する方法である。
【0038】
なお、薬剤の投与方法としては、静脈注射による投与のほかに、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与等が挙げられる。
【0039】
このように、本発明の薬剤を用いれば、in vivoあるいはin vitroで細胞、または組織に特異的に物質を導入することができ、特定細胞または組織に物質を導入することを各種疾患の治療法あるいは治療法の1ステップとして行うことも可能になるのである。
【0040】
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【0041】
【実施例】
以下、HBsAgとは、HBVの外被タンパク質であるB型肝炎ウィルス表面抗原(Hepatitis B virus surface Antigen)を示し、HBcAgとは、HBV内部でカプシド構造を形成するB型肝炎ウィルス内部コア抗原(Hepatitis B virus core Antigen)を示す。
【0042】
HBsAgは、226個のアミノ酸から構成されるSタンパク質を含んでいる。Sタンパク質のN末端側に55アミノ酸(pre−S2 peptide)が付加したものがMタンパク質、Mタンパク質のN末端側に、108もしくは119アミノ酸(pre−S1 peptide)が付加したものがLタンパク質である。HBsAgLタンパク質の塩基配列は配列番号1に、アミノ酸配列は配列番号2に示している。
【0043】
HBsAg Lタンパク質の上記pre−S領域(pre−S1, pre−S2)は、HBVが肝細胞に結合する際に、それぞれ重要な役割を担うことが知られている。pre−S1は、肝細胞に直接結合する部位を持ち、pre−S2は、血中の重合アルブミンを介して肝細胞に結合する重合アルブミンレセプターを有するのである。
【0044】
真核細胞でHBsAgLタンパク質を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積される。HBsAgのLタンパク質は、分子間で凝集を起こし、小胞体膜を取り込みながら、出芽様式でルーメン側に粒子として放出される。以下、この粒子をB型肝炎ウィルス表面抗原粒子(HBsAgL粒子)という。
【0045】
以上の方法で大量に生産したHBsAgL粒子は、ウィルス由来の毒性物質を一切含まない中空のサブウィルス粒子である。発明者らはHBsAgL粒子がヒト肝臓特異的に感染する能力を有することに注目して、ヒト肝臓特異的な遺伝子または薬剤の導入技術を開発した。
【0046】
また、HBsAgL粒子表面に提示されているpre−S1ペプチドがヒト肝臓特異的な認識を行う部位であることから、同ペプチドを任意の生体認識分子に置換した改変型HBsAgL粒子を作製し、任意の臓器や細胞特異的に遺伝子および薬剤を導入する系を作製した。この置換は、pre−S1ペプチドが上記HBsAgのLタンパク質のN末端の3アミノ酸残基から77アミノ酸残基にあたることから、pre−S1ペプチドを任意の生体認識分子(リガンド、レセプター、抗体など)をコードする遺伝子に置換することで行われる。任意の生体認識分子を付加されたHBsAgのLタンパク質を、真核生物に発現させると、任意の生体認識分子を提示したHBsAgL粒子が生産される。
【0047】
上記方法により、ヒト肝細胞特異性を欠失した肝細胞認識部位欠失型HBsAgL粒子(Null型HBsAgL粒子)や、血管内皮、脳下垂体細胞に特異的に感染する塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)提示型HBsAgL粒子、悪性度の高い癌組織に特異的に感染する上皮細胞成長因子(EGF)提示型HBsAgL粒子、ベータセルリン(BTC)レセプターを認識して、膵臓β細胞に特異的に感染するベータセルリン(BTC)提示型HBsAgL粒子、任意の特異性を有する抗体をHBsAgL粒子に付与した抗体提示型HBsAgL粒子が作製できる。
【0048】
しかしながら、以上の改変型HBsAgL粒子は粒子形成の効率が悪く、野生型のHBsAgL粒子が、酒造用酵母を用いることにより全可溶性タンパク質の約40%もの大量発現に成功しているのに対し、改変型HBsAgL粒子は大量発現を起こすことはまれで、全可溶性タンパク質の数%未満しか発現されていない。特に、bFGF提示型Lタンパク質は全可溶性タンパク質の1%未満であった。
【0049】
これは、一般的な遺伝子組換えタンパク質の生産性と同等であるが、ドラッグデリバリーシステムとして改変型HBsAgL粒子を利用するには、より発現量を高める必要がある。また、HBsAgL粒子の生産量が付与される生体認識分子によって大きく変化することは、付与される生体認識分子がHBsAgL粒子の生産に関わっていることを示し、効率的な生産を行う上で障害となる不安定な発現量を改善できる可能性を示している。
【0050】
そこで、発明者らは、改変型HBsAgL粒子の発現率が低いのは、酵母菌体内でのHBsAgL粒子形成過程で必須なpre−S領域のN末端側からの小胞体膜透過を、置換した生体認識分子が立体障害を起こして妨げているためと考えた。
【0051】
一方、非特許文献4および非特許文献5によると、B型肝炎ウィルスの内部コア抗原タンパク質(HBcAg)が、ウィルス粒子形成過程において、Lタンパク質pre−S1領域のC末端部分と相互作用して肝細胞中の粒子形成を促すことが記されている。
【0052】
HBcAgは、図2(a)に示すように183個のアミノ酸から構成され、1〜144(もしくは149)アミノ酸までのAssembly domainと、それに続くRNA−binding protamine domainからなる。上記Assembly domainは、カプシド構造を形成するための部位であり、RNA−binding protamine domainはウィルスゲノムDNAと結合して安定に保持するための部位である。HBcAgは、図2(b)に示すように自身で集まってカプシド構造を形成する能力を有している。このカプシド構造は、一般的に、B型肝炎ウィルス粒子では、図2(c)に示されるように、ウィルス粒子の内部に存在しており、カプシド構造内に含んだウィルスゲノムDNAと相互作用して安定に保持するとともに、HBsAg L粒子とも相互作用して、ウィルス粒子形成を内側から促していると考えられている。そこで、以下の実施例で、HBsAgLタンパク質とともにHBcAgを発現させて粒子形成することにより、HBcAgがHBsAgL粒子形成を助け、HBsAgL粒子が安定に発現されるかを調べるため、HBsAgLタンパク質もしくは改変型HBsAgLタンパク質とHBcAgとを酵母に共発現させたHBsAgL粒子の粒子形成率を観察した。
【0053】
(実施例1)
上記改変型HBsLタンパク質の作製方法を以下に示す。図3(a)に示すように、本発明者らによって報告された特許文献1記載の、pGLDLIIP39−RcTのpre−S1領域(3アミノ残基から77アミノ残基)を削除したpGLDLIIP39−RcT△3−77のpre−S領域に、制限酵素NotIを用いて、例えば、BTCまたはbFGFをコードする遺伝子を挿入したHBsAgLタンパク質発現ベクターを、酵母に発現させる。これにより、生体認識分子としてBTCを提示するHBsAgのLタンパク質、すなわちBTC提示型HBsAgL粒子、あるいはbFGFを提示するbFGF提示型HBsAgL粒子を得た。
【0054】
(実施例2)HBcAgの酵母用発現プラスミドの作製
(2−1)プラスミドへのプロモーターTDH3の組み込み
野生型HBsAg発現プラスミドpRS405−2−LAGに組み込まれているプロモーターTDH3のDNA断片をPCR法により増幅した。PCR法は、表1に示す組成の反応液を使用し、プライマー(+)として配列番号3に、プライマー(−)として配列番号4に示される配列を用いた。
【0055】
【表1】
【0056】
上記反応液を4等分し、そのうち3つをそれぞれ以下の条件にてPCR反応を行った。94℃30秒加熱後、94℃1分、アニーリング1分、72℃1分の反応サイクルを30サイクル行い、その後72℃で5分加熱した。アニーリング温度は、条件検討のため、55℃、60℃、65℃の3種類で行った。このPCRでは、これら3種類すべて同様にDNA増幅が行われたため、3条件のPCR産物をまとめて回収し、TAクローニングを行った。また、4等分したうちの1つは鋳型DNAの代わりに等量の大塚蒸留水を加え、アニーリング温度60度でネガティブコントロールとした。
【0057】
図3(b)に示すように、PCR法にて得られたDNA断片をpGEM−T Easy vector (Promega)に連結し、塩基配列確認後、制限酵素KpnI,XhoI(Takara)で切断し、得られたDNA断片をオーレオバシジンA耐性酵母形質転換システム用の大腸菌・酵母シャトルベクターである、pAUR123(Takara製)にKpnI,XhoIで連結し、pAUR123−TDH3を得た。pAUR123は、オーレオバシジンA感受性遺伝子aur1を有しており、この遺伝子はIPC(inositolphosphorylceramide)合成酵素をコードしている。
【0058】
(2−2)プラスミドへのHBcAg遺伝子の組み込み
次に、HBV(adr)のゲノムを鋳型としてPCR法にてHBcAgのDNA断片を増幅した。HBVゲノムとしては、Nucleic Acids Res.11(6),1747−1757(1983)記載分のプラスミドpHBr330を使用した。なお、このゲノム配列は、GenBank アクセッション番号D00630に登録されている。また、HBcAgのアミノ酸配列は、アクセッション番号BAA00523に登録されている。
【0059】
このPCR法では、表1に示す組成の反応液を使用し、プライマー(+)として配列番号5に、プライマー(−)として配列番号6に示される配列を用いた。ここで、配列番号6には、外来遺伝子を挿入できるように設計したため、AACGCGTCC(ACGCGTがMluIサイトである)の余分な配列が含まれている。
【0060】
上記反応液を4等分し、そのうち3つをそれぞれ以下の条件にてPCR反応を行った。94℃30秒加熱後、94℃1分、アニーリング1分、72℃1分の反応サイクルを30サイクル行い、その後72℃で5分加熱した。アニーリング温度は、条件検討のため、55℃、60℃、65℃の3種類で行った。このPCRでは、60℃および65℃の2種類で同様にDNA増幅が行われたため、2条件のPCR産物をまとめて回収し、TAクローニングを行った。また、4等分したうちの1つは鋳型DNAの代わりに等量の大塚蒸留水を加え、アニーリング温度65度でネガティブコントロールとしてPCRを行った。
【0061】
PCR法にて得られたDNA断片をpGEM−T Easy Vectorに連結し、塩基配列確認後、制限酵素XhoI,SacI(TaKaRa)で切断し、得られたDNA断片をpAUR123−TDH3にXhoI,SacIで連結し、pAUR123−TDH3−HBcAgを得た。
【0062】
(実施例3)HBcAgとHBsAgとの酵母による共発現
実施例1で用いたHBsAgLタンパク質発現ベクターを、実施例2のHBcAg発現ベクターとコトランスフォーメーションさせた。すなわち、上記ベクターをS.cerevisiaeAH22R−株へ以下のスフェロプラスト法(Albert et al.,1978)により形質転換した。
【0063】
S.cerevisiaeAH22R−株をYPDA寒天培地(組成は表2参照)に接種し、2−3日30℃で培養し、得られたコロニーを一晩YPDA培地(組成は表2参照)50mlで30℃にて前培養した。前培養終了後、本培養開始時のOD600が0.05程度になるようにYPDA培地50mlに植菌し、OD6000.4−0.8になるまで30℃で8時間程度培養した。その後、培養液4mlを15mlチューブ(IWAKI製)に分注し、多本架冷却遠心機(トミー工業株式会社製)を用いて2000回転、4℃で5分間遠心分離を行い菌体を回収し、菌体を4mlの溶液A(クエン酸ナトリウム0.1M、EDTA2ナトリウム10mM、ソルビトール1.2M、pH 5.8)で洗浄した後、溶液A3.6mlとザイモリエース100T(生化学工業)溶液(1.0mg/ml)0.4mlを加え、30℃で1時間程度インキュベートして菌体をスフェロプラスト化させた。
【0064】
【表2】
【0065】
その後、多本架冷却遠心機(トミー工業株式会社製)を用いて1900回転、20℃で5分間遠心分離を行い菌体のみを回収し、溶液B(ソルビトール1.2M、塩化カルシウム10mM、Tris−HCl (pH7.0)10mM)4mlで洗浄した後、溶液B0.1mlで菌体を懸濁させ、野生型または改変型HBsAgL粒子発現用ベクター7μgとpAUR123−TDH3−HBcAg5μgを共に加えて室温で15分間放置した。次に溶液C(ポリエチレングリコール4000 20%、Tris (pH7.0) 10mM、塩化カルシウム10mM)2mlを加え、さらに15分間放置した後1900回転、20℃で5分間遠心分離を行い菌体を回収し、溶液D(ソルビトール 1.2M、ポリペプトン2%、粉末酵母エキス1%、グルコース2%、アデニン硫酸塩0.01%)0.3mlに懸濁して30℃で20分間インキュベートした。その後、菌体懸濁液に55℃に保った重層寒天培地5mlを加え、Y−Tf寒天培地(組成は表2参照)に重層した。30℃で6−14日培養後、出現したコロニーをロイシン無添加、オーレオバシジンA添加SD寒天培地(組成は表2参照)に接種し、生育した菌体のみを培養し、発現株の選抜を行った。
(実施例4)HBcAgとHBsAgLタンパク質との共発現L粒子の発現量測定
実施例3の形質転換された菌体は、Hi−Pi培地(組成は表3参照)1mlで3日間前培養し、多本架冷却遠心機(トミー工業株式会社製)を用いて2000回転、4℃で5分間遠心分離を行って菌体を回収し、その後8S5N−P400培地(組成は表3参照)1mlに培地を交換し3−4日間本培養を行った。培養条件は30℃とし、振盪培養を行った。
【0066】
【表3】
【0067】
図4に、bFGF提示型HBsAgLタンパク質およびHBcAgを共発現して得た粒子を抗bFBF抗体、および抗―Lタンパク質抗体にてウェスタンブロッティングした図を図4(a)に、BTC提示型HBsAgLタンパク質およびHBcAgを共発現して得た粒子を抗BTC抗体、および抗―Lタンパク質抗体にてウェスタンブロッティングした図を図4(b)に示す。これによれば、矢印に示されるように、BTCおよびLタンパク質を有するBTC提示型HBsAgLタンパク質、およびbFGFおよびLタンパク質を有するbFGF提示型HBsAgL粒子が良好に形成されていることがわかる。
(A)1mlスケール培養の発現確認
培養液1mlを1.5mlマイクロチューブに回収し、3000回転、4℃で5分間遠心分離を行い菌体を回収した後、表4の緩衝液A0.25mlで菌体を懸濁し、グラスビーズ(直径0.5mm、BioSpec,カタログ番号11079105)を加え、4℃で25分間激しく攪拌(ボルテックス)して菌体を破壊した。10000回転、4℃で5分間遠心分離を行い粗抽出液を回収し、IMxHBsAg・ダイナパック(V2)(血中HBs抗原検出用キット、Dainabot)、IMxHBeAg・ダイナパックAXを用いて、それぞれ各菌体における改変型HBsAg粒子、HBcAgの発現量を確認した。
【0068】
なお、HBeAgとは、HBcAgのN末端に余分に10アミノ酸が付加され、HBcAgのC末端の149アミノ酸残基より後ろのアミノ酸残基が欠失した159アミノ酸からなるタンパク質であり、細胞から分泌される。このHBeAgタンパク質は、HBcAgとは異なり、カプシド結合をとることはないが、HBcAgは、N末端10残基を除いたHBeAgの配列と全く同じであるため、このキットを用いてHBcAgの発現を測定可能である。ただし、このキットが測定したHBcAgが、単量体なのか2量体なのか、あるいはカプシド構造をとっているかは判断できない。
【0069】
また、上記ダイナパックを用いる際に、粗抽出液の希釈が必要な場合には、表4の組成のPBSを用いた。
【0070】
【表4】
【0071】
以上の方法を用いて、野生型HBsAgLとHBcAgとを共発現した場合の培養液50倍希釈液1サンプルについて、HBsAg抗原性を測定した。比較例として、HBcAg発現ベクターを加える以外は同様の操作を行った、野生型HBsAgLタンパク質を単独に発現した場合の20倍希釈培養液8サンプルについても、HBsAg抗原性を測定した。結果は、図5に示すとおりである。図5の縦軸は、上記のサンプルの平均のIMxHBsAg(V2)値を示しており、これはHBsAgL粒子の粒子が形成されているかどうかを表す値となっている。これによれば、HBsAgLタンパク質単独発現(20倍希釈)では、IMxHBsAg(V2)値の平均が5.27であるのに対し、HBsAgL粒子とHBcAgとを共発現したもの(50倍希釈)では213と著しく高い値を示した。したがって、HBsAgLタンパク質をHBcAgと共発現させることで、HBsAgL粒子の形成効率が著しく上がったと言える。
【0072】
同様の実験を、野生型HBsAgLタンパク質の代わりにEGF提示型HBsAgLタンパク質を発現させて行った結果を図6に示す。今回は、EGF提示型HBsAgLタンパク質を単独に発現した場合の20倍希釈培養液3サンプルと、EGF提示型HBsAgL粒子とHBcAgとを共発現した場合の培養液50倍希釈液17サンプルについて、IMxHBsAg(V2)値を測定した。これによれば、HBsAgLタンパク質単独発現(20倍希釈)では、IMxHBsAg(V2)値の平均が5.36であるのに対し、HBsAgL粒子とHBcAgとを共発現したもの(50倍希釈)では163と、著しく高い値を示した。
【0073】
さらに、同様の実験を、野生型HBsAgLタンパク質の代わりにNull型HBsAgLタンパク質を発現させて行った結果を図7に示す。Null型HBsAgLタンパク質を単独に発現した場合の20倍希釈培養液4サンプルと、Null型HBsAgL粒子とHBcAgとを共発現した場合の培養液100倍希釈液6サンプルについて、IMxHBsAg(V2)値を測定した。これによれば、HBsAgLタンパク質単独発現(20倍希釈)では、IMxHBsAg(V2)値の平均が2.75であるのに対し、HBsAgL粒子とHBcAgとを共発現したもの(100倍希釈)では151と、非常に高い値を示した。
(4−2)400mlスケール培養の発現確認
BTC提示型HBsAgLタンパク質およびHBcAgを発現した菌体を培養しているSDプレート、bFGF提示型HBsAgLタンパク質およびHBcAgを発現した菌体を培養しているSDプレートは2枚分の菌体を全てHi−Pi培地50mlに植菌し、3日間培養した後、Hi−Pi培地400mlで1日培養し、その後8S5N−P400培地400mlで3.5日間(86.5時間)培養した。培養終了後、それぞれを集菌し、菌体湿重量を測定した。また、培養終了前日(8S5N−P400培地にて54時間培養後)に、各クローンの培養液を1mlずつサンプリングし菌体湿重量を測定後、グラスビーズにて菌体を破砕しHBsAg粒子の発現量をIMxHBsAg・ダイナパック(V2)にて測定した。破砕方法および発現量の測定方法は、上記(4−1)の方法と同様である。
【0074】
得られたBTC提示型HBsAgL粒子とHBcAgとを共発現した場合の培養液100倍希釈液、および、比較例として、HBcAg発現ベクターを加える以外は同様の操作を行ったBTC提示型HBsAgLタンパク質を単独に発現した場合の培養液100倍希釈培養液との、HBsAg抗原性を測定した。結果は、図8に示すとおりである。これによれば、HBsAgLタンパク質単独発現では、IMxHBsAg(V2)値が0で発現菌体を獲得できなかったのに対し、HBsAgL粒子とHBcAgとを共発現したものでは81.92と高い値を示した。
【0075】
同様に、bFGF提示型HBsAgLタンパク質を単独に発現した場合の培養液100倍希釈培養液と、bFGF提示型HBsAgL粒子とHBcAgとを共発現した場合の培養液100倍希釈液について、HBsAg抗原性を測定した。結果は、図9に示すとおりである。これによれば、HBsAgLタンパク質単独発現では、IMxHBsAg(V2)値が2.77であるのに対し、HBsAgL粒子とHBcAgとを共発現したものでは37.4と高い値を示した。
【0076】
野生型HBsAgL粒子を100としたときのIMxHBsAg値の相対値は図10のとおりである。
【0077】
以上のように、HBcAgと改変型HBsAgLタンパク質とを酒造酵母内で共発現すると、改変型HBsAgL粒子の発現量が数10倍も亢進し、その量は全可溶性タンパク質の数十%に達した。
(実施例5)HBsAgL粒子の大量精製
まず、以下の方法で、HBcAgをLタンパク質あるいは改変型Lタンパク質と共発現して形成した、野生型HBsAgL粒子、Null型HBsAgL粒子、BTC提示型HBsAgL粒子、bFGF提示型HBsAgL粒子、EGF提示型HBsAgL粒子を作製して、粗サンプルを得る。なお、以下のHBsAgL粒子、Lタンパク質とは、上記の5種類の粒子およびそれを構成するLタンパク質を言う。
【0078】
HBcAgと改変型HBsAgLタンパク質との共発現菌体を培養した培養液400−1000mlから、上記菌体を取り出し、100mlの緩衝液A(表4参照)に懸濁し、氷冷しながら、ビードビーダー(BEAD BEATER)を用いてグラスビーズ(直径0.5mm)で5分間破砕、氷上放置5分間というサイクルを3回繰返して菌体を破砕した。その後、4℃で、5000回転にて10分間遠心分離を行い、回収した上清に、33%(w/v)ポリエチレングリコール6000(ナカライテスク)を溶液容量の75%(v/v)加えて30分間氷冷した。さらに、ローターNo.17N(トミー精工)を用いて、遠心分離機CX−250(トミー精工)により、4℃で5000回転の遠心分離を10分間行い、沈殿を回収して、緩衝液A15mlに懸濁した粗サンプルを得た。
【0079】
上記粗サンプルからHBsAgL粒子を精製するために、以下に示すように、塩化セシウム密度勾配遠心分離、スクロース密度勾配遠心分離、および限外ろ過を行った。
【0080】
まず、塩化セシウム密度勾配遠心分離を行った。この方法は、密度勾配をつけた塩化セシウム溶液内でサンプルに超遠心を行うことで、HBsAgL粒子の浮揚密度と等しい密度のCsCl溶液の画分にHBsAgL粒子を集めて精製を行うものである。
【0081】
密度勾配をつけた塩化セシウム溶液は、図12(a)に示すように、40PAチューブ(日立工機製)に下から40%(w/v)塩化セシウム溶液8ml、30%(w/v)塩化セシウム溶液8ml、20%(w/v)塩化セシウム溶液7ml、10%(w/v)塩化セシウム溶液7mlを重層させたものであり、その後上記粗サンプルを液表面に5−6ml重層した。その後、ローターP28SX(日立工機製)を用いて、超遠心分離機55P−72H(日立工機製)により24000回転、16℃で12−16時間密度勾配超遠心を行った。
【0082】
塩化セシウム密度勾配遠心を行った3−6本のチューブを、上層から2mlずつの画分に分けて回収し、各画分ごとに1本にまとめ、IMxHBsAgダイナパック(V2)で測定した。この中で、HBsAgL粒子が検出された画分を回収し、15mMEDTA・2Naを含むPBSにより、4℃下で3−5時間透析した。透析した溶液は、ローターNo.17Nを用いて、遠心分離機CX−250により5000回転、4℃で10分間の遠心分離を行って上清を回収した。
【0083】
次に、上記上清をスクロース密度遠心勾配にかけた。この方法は、密度勾配をつけたスクロース溶液内でサンプルに超遠心を行うことで、HBsAgL粒子はその沈降係数に従った速度で沈降し、その他の大きさが違う沈降速度の異なる分子から分離される。密度勾配をつけたスクロース溶液は、40PAチューブに50%(w/v)スクロース溶液6ml、40%(w/v)スクロース溶液5ml、30%(w/v)スクロース溶液6ml、20%(w/v)スクロース溶液5ml、10%(w/v)スクロース溶液5mlを重層させたものであり、その液表面に透析後の上清を8−9ml重層した。その後、ローターP28SXを用いて、超遠心分離機55P−72Hにより24000回転、4℃で8−10時間密度勾配超遠心を行った。
【0084】
スクロース密度勾配超遠心終了後、塩化セシウム密度勾配遠心の時と同様に、3−6本のチューブの上層から2mlずつの画分に分けて回収し、画分ごとに1本にまとめて、IMxHBsAg・ダイナパック(V2)で測定し、HBsAgL粒子が存在する画分を回収した。
【0085】
最後に、得られた画分を4℃で一晩、PBSで透析し、ULTRA FILTER UK−200(Advantec社製)を用いて限外ろ過を行い、容量が10mlになるまで濃縮した。
【0086】
以上の操作により、野生型HBsAgL粒子(Lタンパク質推定分子量52kDa)、Null型HBsAgL粒子(Nullタンパク質推定分子量40.2kDa)、BTC提示型HBsAgL粒子(BTC融合型Lタンパク質推定分子量45.7kDa)、bFGF提示型HBsAgL粒子(bFGF融合型Lタンパク質推定分子量57.3kDa)、EGF提示型HBsAgL粒子(EGF融合型Lタンパク質推定分子量47.2kDa)が得られた。
【0087】
(実施例6)精製により得られたbFGF提示型L粒子の物性解析
(6−1)ウェスタンブロットによる解析
bFGF提示型HBsAgL粒子がHBcAgタンパク質と相互作用しているかどうかを調べるため、bFGF提示型HBsAgL粒子をS抗体で免疫沈降した後、bFGF抗体とHBcAgタンパク質抗体とでウェスタンブロットを行ったのが、図11である。その結果、bFGFHBsAgL粒子は、矢印で示すように、bFGF抗体により検出され、HBcAgタンパク質抗体にも検出された。従って、bFGF提示型HBsAgL粒子は、bFGF、HBsAg領域、HBcAgタンパク質を併せ持つことが分かった。すなわち、HBcAgタンパク質は粒子上のbFGF提示型HBsAgLタンパク質と何らかの相互作用をしていることが分かった。
【0088】
(6−2)密度勾配遠心法によるHBsAgL粒子の密度測定
bFGF提示型HBsAgL粒子がHBcAgタンパク質を含んでいるかを調べるため、以下の方法で塩化セシウム密度勾配遠心を行って、bFGF提示型HBsAgL粒子の密度を推定した。
【0089】
得られたbFGF提示型HBsAgL粒子を、精製時に用いた塩化セシウム密度勾配遠心法と同様の方法で分離した結果を、図12(b)に示す。これは、遠心後のCsCl密度勾配沈殿の各画分の50倍希釈液のIMxHBsAg値およびIMxHBeAg値をプロットしたグラフである。上記、CsCl密度勾配沈殿の画分とは、上層から2mlずつ17個の画分に分けられたものであるが、IMxHBsAg値のピークは、フラクション3、すなわち上層から4mlから6mlの層に明確に示された。図12(a)のように重層した遠心管の上部より2mlずつ回収したため、フラクション3のサンプルは10%CsCl溶液中に存在すると考えられる。この10%CsCl溶液の密度は約1.20g/mlであるから、フラクション3に集まったbFGF提示型HBsAgL粒子の密度は約1.20g/mlと考えられる。これは、1.21g/mlの野生型HBsAgL粒子の密度と同程度である(非特許文献1参照)。
【0090】
一方、酵母にてS,M,LおよびHBcAgタンパク質の4つを同時に発現させ、HBcAgタンパク質をHBsAg粒子内に包含させたビリオン様粒子の密度は約1.25g/mlである(非特許文献2参照)。よって、Lタンパク質およびHBcAgタンパク質を共発現させて得られたHBsAgL粒子が、HBcAgタンパク質を包含して形成されているならば、約1.25g/mlの密度と等しい画分に含まれるはずである。したがって、推定密度約1.20g/mlのbFGF提示型HBsAgL粒子はHBcAgタンパク質を包含していないことが示された。
(6−3)プロテイナーゼによる解析
さらに、bFGF提示型HBsAgL粒子がHBcAgタンパク質を含んでいるかをプロテイナーゼ処理によって調べた。
【0091】
bFGF提示型HBsAgL粒子精製サンプル720μlに、抗HBsマウスモノクローナル抗体固定化マイクロパーティクルのIMxの抗体240μlを加えた計960μlの溶液をチューブ2本に分け、4℃で9時間振とうして免疫沈降し、プロテアーゼ阻害剤とTritonX−100を含まないリシスバッファーで3回洗浄し、沈殿物を4等分、計8等分した。これにより、bFGF提示型HBsAgL粒子の沈殿物を得た。
【0092】
10μg/mlのP.K.(プロテイナーゼK)を含むバッファー液(50mMトリス塩酸、5mM塩化カルシウム、pH7.6)を6つの沈殿物に20μlずつ加え、37℃にて、それぞれ5分、10分、15分、20分、25分、30分の時間で保温した。
【0093】
参照実験として、P.K.を含まない溶液(50mMトリス塩酸、5mM塩化カルシウム、pH7.6)を沈殿物に加え、保温しなかったもの(参照サンプル1)、および30分間37℃で保温したもの(参照サンプル2)を作製した。さらに別の参照実験として、PBS720μlに抗体240μlを加えた計960μlの溶液を遠心し、抗HBsAgマウスモノクローナル抗体固定化マイクロパーティクルに結合した沈殿物にP.K.を含まない溶液(50mMトリス塩酸、5mM塩化カルシウム、pH7.6)を加えて保温しなかったもの(参照サンプル3)も用意した。
【0094】
これらのサンプルをウェスタンブロットした図を図13に示す。図13(a)は、抗Lタンパク質Abによる、(b)は抗bFGFAbによる、(c)は抗−HBcAgAbによるウェスタンブロットである。レーン1に上記の参照サンプル3、レーン2に参照サンプル1、レーン3に参照サンプル2の参照サンプルを、レーン4からレーン9がP.K.を加えたサンプルである。なお、レーン4からレーン9は、レーン数の小さいものから順に、P.K.の加熱時間が5分、10分、15分、20分、25分、30分としたサンプルとなっている。
【0095】
これによれば、図13(a)、(b)に矢印に示されるbFGF提示型HBsAgLタンパク質のバンドが示される。また、矢頭に示すように、図13(a)の20kDaあたり、および図13(c)の20kDaより小さい部分にPKによる分解産物と考えられるバンドがある。これらのバンドは、参照サンプルであるレーン1から3には認められないのに対し、レーン4から9には認められる。
【0096】
図13(c)のPKによる分解産物のバンドはHBcAgタンパク質の分解物であると考えられるが、プロテイナーゼK処理の時間経過に従いバンドが薄くなっており、処理時間30分(レーン9)では、ほぼ完全になくなっている。つまり、HBcAgタンパク質がP.K.に短時間で分解されている。
【0097】
仮に、HBsAgL粒子内にHBcAgタンパク質が包含されているならば、HBcAgタンパク質は外部に晒されていないので、プロテイナーゼKによる分解を受けにくくなると考えられる。したがって、プロテイナーゼKにより、加温30分後にほぼ完全分解されているこの結果から判断するとbFGF提示型HBsAgL粒子内にHBcAgタンパク質は包含されていないと考えられる。
【0098】
(実施例7)精製により得られたBTC提示型L粒子の物性解析
bFGF提示型HBsAgL粒子で行った実験を同様の方法で、BTC提示型HBsAgL粒子も塩化セシウム密度勾配遠心法による分離を行った。結果を、図14に示す。図14にCsCl密度勾配沈殿の各画分の200倍希釈液のIMxHBsAg値およびIMxHBcAg値をプロットしたグラフを示している。IMxHBsAg値のピークは、フラクション5,6に明確に示された。このように、IMxHBsAg値がフラクションの途中でピークを形成しているので、BTC提示型HBsAgL粒子が粒子を形成していると言える。また、IMxHBcAg値のピークがこのIMxHBsAg値と一部重なっていることから、BTC提示型HBsAgL粒子の一部がHBcAgタンパク質と相互作用している可能性がある。
【0099】
CsCl密度勾配遠心後は、図14(a)のように重層した遠心管の上部より2mlずつ回収したため、フラクション6のサンプルは10%CsCl(密度1.20g/ml)と20%CsCl(密度約1.27g/ml)とのほぼ境界線付近に相当する。したがって、このグラフから求めた推定密度にてHBcAgタンパク質がHBsAgL粒子内に包含されているかの判断は不可能と考えられる。
【0100】
上記のフラクション5,6を含めたフラクション4〜7を回収し、PBS(15mM EDTAを含む)で透析した後、抗HBsAgL粒子Abによるウェスタンブロットを行ったものを図14(c)のレーン2に示している。これは、BTC提示型HBsAgL粒子の粗抽出液を、抗HBsAgL粒子Abによりウェスタンブロットしたもの(レーン1)とほぼ同程度の濃さのバンドであった。
【0101】
一方、同様にレーン2のサンプル(フラクション4〜7を回収し、透析したもの)を抗HBcAgAbによりウェスタンブロットしたもの(レーン4)は、BTC提示型HBsAgL粒子の粗抽出液を抗HBcAgAbによりウェスタンブロットしたもの(レーン3)より著しく検出量が低かった。つまり、BTC提示型HBsAgL粒子がフラクション4〜7に固まって存在しているのに対し、HBcAgはこれ以外の画分にも分散しているといえる。従って、HBcAgタンパク質が、BTC提示型HBsAgL粒子内に図15(b)のように内部に包含されている可能性は非常に低いと考えられ、仮に包含されているHBcAgタンパク質が存在した場合においてもその割合はきわめて低いと考えられる。すなわち、得られた粒子のほとんどは、図15(a)のように、粒子外部からHBsAgLタンパク質と相互作用していると考えられる。
【0102】
すなわち、得られる改変型HBsAgL粒子は、一部にしかHBcAgが含まれておらず、ほとんどが中空であったので、本発明の中空ナノ粒子は遺伝子等導入物質の運搬に好適に使用できることが示唆された。
【0103】
【発明の効果】
本発明の中空ナノ粒子は、以上のように、物質を細胞特異的に運搬するという機能を保ちつつ、粒子の形成を促進することで、効率的に粒子を製造できるという効果を奏する。
【0104】
さらに、本発明によれば、中空ナノ粒子の生体認識分子を置換した場合にも、粒子の形成能が落ちることがなく、安定した粒子形成が可能となる。中空ナノ粒子の形成が促進されると、中空ナノ粒子の安定した生産ができ、薬剤として利用するなどの応用が有効となるので、本技術の幅広い普及が期待できる。
【0105】
中空ナノ粒子に物質導入した薬剤は、静脈注射などといった簡便な方法で、特定の細胞または組織に対して選択的かつ効率的に疾患治療用の細胞導入物質を送り込むことができるので、従来の遺伝子治療と大きく異なり、外科手術を必要とせず、副作用の心配も極めて低く、そのまま臨床応用可能なものである。
【0106】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の一実施の形態に係るHBsAgL粒子の生体認識分子の改変を説明する図面である。
【図2】本発明の一実施の形態に係る中空ナノ粒子を構成するHBcAgタンパク質を示す図面であって、(a)はHBcAgタンパク質の概略図を示し、(b)はHBcAgが構成するカプシド構造を示し、(c)がカプシド構造を有するB型肝炎ウィルスをしている。
【図3】本発明の一実施の形態に係る中空ナノ粒子を作製するためのベクターを示した図面であり、(a)はHBsAgLタンパク質をコードする遺伝子を有するベクターを示し、(b)はHBcAgLタンパク質をコードする遺伝子を有するベクターを示す。
【図4】BTC提示型HBsAgL粒子およびbFGF提示型HBsAgL粒子のウェスタンブロッティング図を示す図面である。
【図5】本発明の一実施の形態に係る中空ナノ粒子である、HBcAgと野生型HBsAgLタンパク質とを共発現して得たHBsAgL粒子の抗原性を示す図面である。
【図6】本発明の一実施の形態に係る中空ナノ粒子である、HBcAgとEGF提示型HBsAgLタンパク質とを共発現して得たEGF提示型HBsAgL粒子の抗原性を示す図面である。
【図7】本発明の一実施の形態に係る中空ナノ粒子である、HBcAgとNull型HBsAgLタンパク質とを共発現して得たNull型HBsAgL粒子の抗原性を示す図面である。
【図8】本発明の一実施の形態に係る中空ナノ粒子である、HBcAgとBTC提示型HBsAgLタンパク質とを共発現して得たBTC提示型HBsAgL粒子の抗原性を示す図面である。
【図9】本発明の一実施の形態に係る中空ナノ粒子である、HBcAgとbFGF型HBsAgLタンパク質とを共発現して得たbFGF型HBsAgL粒子の抗原性を示す図面である。
【図10】本発明の一実施の形態に係るBTC提示型HBsAgL粒子およびbFGF提示型HBsAgL粒子の抗原性を、野生型HBsAgLタンパク質の単独発現により形成された粒子の抗原性を100としたときの相対値で示した図面である。
【図11】本発明の一実施の形態に係るbFGF提示型HBsAgL粒子のウェスタンブロッティング図を示す図面である。
【図12】本発明の一実施の形態に係るbFGF提示型HBsAgL粒子のCsCl密度勾配遠心を示す図面であり、(a)はCsCl密度勾配チューブを示しており、(b)はCsCl密度勾配遠心した後の画分ごとの抗原性を示している。
【図13】本発明の一実施の形態に係るbFGF提示型HBsAgL粒子をプロテイナーゼ処理した後、ウェスタンブロットを行った結果を示す図面であり、(a)は抗Lタンパク質抗体を、(b)は抗bFGF抗体を、(c)は抗HBcAg抗体を用いてウェスタンブロットを行った結果を示している。
【図14】本発明の一実施の形態に係るBTC提示型HBsAgL粒子のCsCl密度勾配遠心の結果を示す図面であり、(a)はCsCl密度勾配チューブを示しており、(b)はCsCl密度勾配遠心した後の画分ごとの抗原性を示しており、(c)は粗抽出液または密度勾配遠心画分のウェスタンブロットの結果を示す図面である。
【図15】本発明の一実施の形態に係るHBsAgL粒子を示す図面であり、(a)はHBcAgが、HBsAgL粒子の外側からHBsAgLタンパク質と相互作用している様子をあらわし、(b)はHBcAgが、HBsAgL粒子の内側に包含されてHBsAgLタンパク質と相互作用している様子をあらわしている。
【符号の説明】
1 B型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質
3 B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質
4 生体認識分子
5 B型肝炎ウィルス粒子
【発明の属する技術分野】
本発明は、疾患治療用の細胞導入物質を封入することができる中空ナノ粒子に関し、より詳細には、粒子内部に封入された疾患治療用の細胞導入物質を特定細胞または組織内に特異的に導入可能な薬剤に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
近年、医学の分野において、患部に直接作用し、高い効果を示す副作用の少ない薬品の開発が盛んに行われている。特に、ドラッグデリバリーシステム(DDS)と呼ばれる方法は、目的細胞、あるいは、目的組織に対して特異的に薬剤等の有効成分を運搬し、目的箇所で有効成分を作用させることのできる方法として注目されている。
【0003】
目的細胞、あるいは、目的組織に対して特異的に薬剤となるタンパク質を送り込む方法としては、従来、当該タンパク質をコードする遺伝子が組み込まれた発現ベクターをエレクトロポレーション法等により目的細胞に導入して、この遺伝子を細胞内で発現させることによりタンパク質薬剤を細胞内に送り込むいわゆる遺伝子導入方法が開発されてきた。しかし、このような従来の遺伝子導入方法では、何れも、目的細胞、あるいは、目的組織に対して特異的にタンパク質薬剤を送り込む方法としては不十分なものであった。
【0004】
【特許文献1】
国際公開第01/64930号パンフレット
【0005】
【非特許文献1】
「ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー」(”Journal of Biological Chemistry” ),(アメリカ合衆国),1992年,第267巻,第3号,p.1953−1961
【0006】
【非特許文献2】
「ジーン」(”Gene” ),(オランダ),1991年,第106号 p.143−149
【0007】
【非特許文献3】
「ワクチン」(”Vaccine” ),(イギリス),2001年,第19号,p.3154−3163
【0008】
【非特許文献4】
「ジャーナルオブバイロロジー」(”Journal of Virology” ),(アメリカ合衆国),1994年,第68号,p.1643−1650
【0009】
【非特許文献5】
「バイロロジー」(”VIROLOGY” ),(アメリカ合衆国),1997年,第228号 p.115−120
【0010】
【発明が解決しようとする課題】
以上のような状況に鑑み、本発明者らは、特許文献1において、粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子が導入された中空ナノ粒子を用いて、目的とする細胞や組織に、物質(遺伝子、タンパク質、化合物等)を特異的かつ安全に運搬、導入するための方法を提案しているが、この方法を応用しつつ上記中空ナノ粒子の安定した生産量を得るためのさらなる改良が課題となっていた。
【0011】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、安定した生産量が得られる、目的の細胞や組織に特異的に物質を導入するタンパク質中空ナノ粒子、およびこの中空ナノ粒子に細胞導入物質を包含させた薬剤を提供することにある。
【0012】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、粒子形成能を有するタンパク質とともに、カプシド構造を形成するタンパク質を発現することにより、粒子の生産量が飛躍的に高まることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【0013】
即ち、本発明に係る中空ナノ粒子は、特定の細胞(例えば肝細胞など)に対する認識能を有し、粒子形成能を有する第1のタンパク質からなる中空ナノ粒子において、上記第1のタンパク質には、カプシド構造を形成する第2のタンパク質と相互作用しているものが含まれている事を特徴としている。
【0014】
上記「粒子形成能を有する第1のタンパク質」としては、例えばB型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を挙げることができる。このタンパク質は、真核細胞で発現させると、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出される。
【0015】
また、上記「カプシド構造」とは、ウィルス粒子において、ウィルスゲノムを包み、保護しているタンパク質の殻を指し、上記「カプシド構造を形成する第2のタンパク質」としては、例えば、B型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質を挙げることができる。上記第2のタンパク質は、上記第1のタンパク質と共発現すると、相互作用し、粒子の形成を促す。なお、ここで言う「相互作用」とは、第1のタンパク質と第2のタンパク質とが直接接触をして作用しあっていることを言う。第1のタンパク質と第2のタンパク質とは少なくとも一つ直接接触していればよいが、その数は多ければ多いほど良い。また、上記相互作用は、必ずしも第2のタンパク質が、第1のタンパク質が形成する粒子の内部に包含されて行われる必要はなく、粒子の外側の第2のタンパク質と第1のタンパク質とが相互作用していても良い。これにより、第1のタンパク質の粒子形成が促され、粒子形成率が上がるとともに、中に細胞導入物質を包含させて、薬剤として利用することも可能となる。
【0016】
本発明の中空ナノ粒子は、このような粒子形成能を有する第1のタンパク質をコードする遺伝子、およびカプシド構造を形成する第2のタンパク質をコードする遺伝子を、ベクターによって同一の真核細胞(例えば酵母)に導入し、当該真核細胞に遺伝子発現させることにより製造することができる。
【0017】
上記第2のタンパク質をコードする遺伝子を導入するベクターとしては、オーレオバシジンA感受性遺伝子を有するベクター(例えば、宝酒造社製のpAUR123)にて導入することが望ましい。
【0018】
上記B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質およびB型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質を発現させて得られる粒子は、肝細胞を認識し、肝細胞に対して特異的に粒子内の物質を運搬することができるので、肝臓疾患治療用の物質(遺伝子等)を包含させることにより、肝細胞に対して特異的かつ効果的に作用する有効な治療薬となる。
【0019】
また、例えば上記B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を、本来の肝細胞に対する感染能を欠失するように改変し、さらに増殖因子や抗体を提示するように改変し、このように改変されたB型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を用いて粒子を形成することで、肝細胞以外の特定の細胞に対して特異的に粒子内の物質を運搬することができる。例えば、ベータセルリン(BTC)を提示させることで、膵臓β細胞を認識し、その膵臓β細胞に対して特異的に粒子内の物質を運搬することができる。また、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を提示させることで、血管内皮あるいは脳下垂体細胞を認識し、血管内皮あるいは脳下垂体細胞に特異的に粒子内の物質を運搬することができる。
【0020】
このような改変されたB型肝炎ウィルス表面抗原、特にBTC提示型B型肝炎ウィルス表面抗原、bFGF提示型B型肝炎ウィルス表面抗原は、B型肝炎ウィルス表面抗原だけを発現させた場合には非常に粒子を形成し難いが、上記カプシド構造を形成する第2のタンパク質とともに発現することで粒子形成率が飛躍的に向上するので、その効果が特に高いといえる。
【0021】
また、本発明の中空ナノ粒子に治療物質を包含させた薬剤では、静脈注射という簡便な方法で特定の細胞または組織における疾患を効果的に治療することができ、従来の治療方法と大きく異なり、多量の薬剤の投与や遺伝子治療等における外科手術を必要とせず、副作用の心配も極めて低く、そのまま臨床応用可能なものである。
【0022】
本発明の治療方法は、本発明の薬剤を投与することによる疾患の治療方法である。
【0023】
【発明の実施の形態】
本発明の中空ナノ粒子は、粒子形成能を有する第1のタンパク質からなる中空ナノ粒子において、上記第1のタンパク質には、カプシド構造を形成する第2のタンパク質と相互作用しているものを含んでなるものであるが、その粒子形成能を有する第1のタンパク質に生体認識分子(換言すれば、特定の細胞を認識する分子)を導入することによって、目的細胞あるいは目的組織に特異的に物質を運搬することができる。上記粒子形成能を有する第1のタンパク質としては、種々のウィルスから得られるサブウィルス粒子を適用することができる。具体的には、粒子形成能を有する第1のタンパク質として、B型肝炎ウィルス(Hepatitis B Virus:HBV)表面抗原タンパク質等が例示される(以下、このB型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を「HBsAgタンパク質」と略記する場合がある)。この場合、カプシド構造を形成する第2のタンパク質としては、B型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質(以下、このB型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質を「HBcAgタンパク質」と略記する場合がある)を用いれば良い。
【0024】
まず、粒子形成能を有する第1のタンパク質について説明する。粒子形成能を有するタンパク質からなるタンパク質粒子としては、真核細胞で上記第1のタンパク質を発現させることにより得られるものが挙げられる。つまり、真核細胞で粒子形成能を有するタンパク質を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出されるのである。このとき、真核細胞としては、哺乳類等の動物細胞、酵母等が適用できる。
【0025】
本発明者らは、遺伝子組換え酵母で上記HBsAgのLタンパク質を発現させることにより、発現されたHBsAgのLタンパク質から酵母由来の脂質二重膜に多数の同タンパク質が埋め込まれた短径約20nm、長径約150nmの楕円状中空粒子(以下HBsAgL粒子という)が形成されることを見出し、報告している(非特許文献1参照)。このような粒子は、HBVゲノムを全く含まないので、ウィルスとしては機能せず、人体への安全性が極めて高い。また、HBVの肝細胞への極めて高い感染力を担う肝細胞特異的レセプターを粒子表面に提示しているため、肝細胞に対して特異的に物質を運搬する運搬体としての効果も高いのである。
【0026】
このように遺伝子組換え酵母を用いてタンパク質粒子を形成する方法は、菌体内の可溶性タンパク質から高効率で粒子が生産される点で好適である。
【0027】
本発明者らは、後述する実施例に示されるとおり、上記HBsAgのLタンパク質を発現させる際に、HBcAgタンパク質を同時に発現させれば、上記HBsAgL粒子の形成率が飛躍的に高まることを見出した。これは、HBcAgタンパク質タンパク質がHBsAgのLタンパク質に作用し、HBsAgL粒子の形成を促しているためと考えられる。
【0028】
HBcAgタンパク質は、図2(a)に示すように、Assembly domainと、RNA−binding protamine domainからなる。上記Assembly domainは、カプシド構造を形成するための部位であり、本発明の中空ナノ粒子の形成にはこの部位が重要となる。HBcAgタンパク質は、図2(b)に示すように自身で集まってカプシド構造を形成する能力を有しているが、必ずしもカプシド構造を形成している必要はなく、個々の分子がHBsAgのLタンパク質に作用していてもよい。
【0029】
HBsAgのLタンパク質やHBcAgを導入するためのベクターとしては、様々なプロモーターを組み入れた発現ベクターがあるので、目的に応じたものを選択すればよい。特にHBcAgタンパク質を導入するためには、HBsAgのLには、例えば、pAUR123(Takara製)のようなオーレオバシジン感受性遺伝子aur1を有するベクターを用いれば、HBsAgの粒子形成の促進効果が高まることがわかっている。
【0030】
また、本発明のタンパク質中空ナノ粒子では、以上のような方法によって得られた粒子表面のレセプターを、図1に示すように、任意の生体認識分子に改変することにより、肝細胞以外にも、任意の細胞及び組織に極めて高い特異性で物質を運搬、導入することが可能となる。
【0031】
もちろん、粒子形成能を有する第1のタンパク質は、上記のB型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質に限られるものではなく、粒子を形成することができるタンパク質であれば、どのようなものでもよく、動物細胞、植物細胞、ウィルス、菌類等に由来する天然タンパク質や、種々の合成タンパク質等が考慮される。また、例えばウィルス由来の抗原タンパク質等が生体内において抗体を惹起する可能性がある場合などは、改変して抗原性を減少させたものを粒子形成能を有するタンパク質として用いてもよい。例えば、粒子形成能を有するタンパク質としては、特許文献1に開示される抗原性を減少させたB型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質であってもよいし、特許文献1に開示されるB型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を、遺伝子操作技術を用いて改変したタンパク質であってもよく、粒子構造が安定するように改変したものでもよい。また、B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質や同タンパク質を改変したタンパク質に、さらに増殖因子や抗体などの他のタンパク質を付加したものを、第1のタンパク質として用いてもよい。
【0032】
粒子形成能を有するタンパク質に導入される生体認識分子としては、例えば成長因子、サイトカイン等の細胞機能調節分子、細胞表面抗原、組織特異的抗原、レセプターなどの細胞および組織を識別するための分子、ウィルスおよび微生物に由来する分子、抗体、糖鎖、脂質などが好ましく用いられる。具体的には、癌細胞に特異的に現れるEGF受容体やIL−2受容体に対する抗体やEGF、またHBVの提示するレセプターも含まれる。これらは、目的とする細胞、あるいは組織に応じて適宜選択される。なお、ここで「生体認識分子」とは、特定の細胞を認識する分子(換言すれば、特定の細胞に対する認識能を本発明の中空ナノ粒子に付与する分子)のことをいう。なお、この生体認識分子は、粒子形成能を有する第1のタンパク質に生体認識分子が含まれる場合と、第1のタンパク質に生体認識分子を融合(または直接間接に結合)させる場合とを両方含む。
【0033】
上記のように、生体認識分子をHBsAgLタンパク粒子に付与する方法としては、HBsAgLタンパク質の有する肝細胞認識部位を任意の生体認識分子に改変して、発現させることが考えられる。このように肝細胞認識部位を改変されたHBsAgLタンパク質は、それだけでは粒子形成率が低いが、カプシド構造を形成する第2のタンパク質と相互作用することで、粒子形成が効果的に促進される。これは、特に、この方法でBTCやbFGFを提示するように改変したHBsAgLタンパク質の粒子に好適である。また、第2のタンパク質は粒子内部からでなく、外側から相互作用していても良い。
【0034】
また、カプシド構造を形成する第2のタンパク質も、上記のB型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質に限られるものではなく、カプシド構造を形成することができるタンパク質であれば、どのようなものでもよく、動物細胞、植物細胞、ウィルス、菌類等に由来する天然タンパク質や、種々の合成タンパク質等が考慮される。例えば、B型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質を、中空ナノ粒子の粒子形成能が向上するように改変したものでもよく、タンパク質の機能が変わらないように改変したものでもよい。
【0035】
以上のように作製された本発明の中空ナノ粒子は、特定の細胞に対して特異的に細胞導入物質を送り込むものとして有用である。例えば、本発明の中空ナノ粒子として、B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質からなる粒子を用い、これに細胞導入物質を包含した薬剤を静脈注射などによって体内に投与すれば、当該粒子は体内を循環し、粒子表面に提示した肝細胞特異的レセプターにより肝細胞に導かれ、感染する。そして、細胞導入物質が肝細胞中に送り込まれ、細胞導入物質の肝臓組織特異的な導入が行われる。
【0036】
このタンパク質中空ナノ粒子に内包される細胞導入物質としては、例えばDNA、RNAなどの遺伝子、天然あるいは合成タンパク質、オリゴヌクレオチド、ぺプチド、薬剤、天然あるいは合成化合物など、どのようなものであってもよい。
【0037】
これらの細胞導入物質を上記の中空ナノ粒子に封入する方法としては、通常の化学的、分子生物学的実験手法で用いられる様々な方法が適用される。たとえば、エレクトロポレーション法、超音波法、単純拡散法、あるいは電荷を有する脂質を用いる方法等が好ましく例示される。また、細胞導入物質としてタンパク質を用いる場合は、粒子形成能を有するタンパク質に細胞導入物質を融合させて粒子形成する方法も、上記細胞導入物質の封入に含まれると考えられる。粒子形成能を有するタンパク質に細胞導入物質を融合させる方法とは、例えば、B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質をコードする遺伝子と、その下流側に上記タンパク質薬剤をコードする遺伝子とが挿入されたプラスミドを作製し、このプラスミドを用いて真核細胞に粒子を形成させることによって、粒子を形成するB型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質にタンパク質薬剤が融合した薬剤を製造する方法である。
【0038】
なお、薬剤の投与方法としては、静脈注射による投与のほかに、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与等が挙げられる。
【0039】
このように、本発明の薬剤を用いれば、in vivoあるいはin vitroで細胞、または組織に特異的に物質を導入することができ、特定細胞または組織に物質を導入することを各種疾患の治療法あるいは治療法の1ステップとして行うことも可能になるのである。
【0040】
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【0041】
【実施例】
以下、HBsAgとは、HBVの外被タンパク質であるB型肝炎ウィルス表面抗原(Hepatitis B virus surface Antigen)を示し、HBcAgとは、HBV内部でカプシド構造を形成するB型肝炎ウィルス内部コア抗原(Hepatitis B virus core Antigen)を示す。
【0042】
HBsAgは、226個のアミノ酸から構成されるSタンパク質を含んでいる。Sタンパク質のN末端側に55アミノ酸(pre−S2 peptide)が付加したものがMタンパク質、Mタンパク質のN末端側に、108もしくは119アミノ酸(pre−S1 peptide)が付加したものがLタンパク質である。HBsAgLタンパク質の塩基配列は配列番号1に、アミノ酸配列は配列番号2に示している。
【0043】
HBsAg Lタンパク質の上記pre−S領域(pre−S1, pre−S2)は、HBVが肝細胞に結合する際に、それぞれ重要な役割を担うことが知られている。pre−S1は、肝細胞に直接結合する部位を持ち、pre−S2は、血中の重合アルブミンを介して肝細胞に結合する重合アルブミンレセプターを有するのである。
【0044】
真核細胞でHBsAgLタンパク質を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積される。HBsAgのLタンパク質は、分子間で凝集を起こし、小胞体膜を取り込みながら、出芽様式でルーメン側に粒子として放出される。以下、この粒子をB型肝炎ウィルス表面抗原粒子(HBsAgL粒子)という。
【0045】
以上の方法で大量に生産したHBsAgL粒子は、ウィルス由来の毒性物質を一切含まない中空のサブウィルス粒子である。発明者らはHBsAgL粒子がヒト肝臓特異的に感染する能力を有することに注目して、ヒト肝臓特異的な遺伝子または薬剤の導入技術を開発した。
【0046】
また、HBsAgL粒子表面に提示されているpre−S1ペプチドがヒト肝臓特異的な認識を行う部位であることから、同ペプチドを任意の生体認識分子に置換した改変型HBsAgL粒子を作製し、任意の臓器や細胞特異的に遺伝子および薬剤を導入する系を作製した。この置換は、pre−S1ペプチドが上記HBsAgのLタンパク質のN末端の3アミノ酸残基から77アミノ酸残基にあたることから、pre−S1ペプチドを任意の生体認識分子(リガンド、レセプター、抗体など)をコードする遺伝子に置換することで行われる。任意の生体認識分子を付加されたHBsAgのLタンパク質を、真核生物に発現させると、任意の生体認識分子を提示したHBsAgL粒子が生産される。
【0047】
上記方法により、ヒト肝細胞特異性を欠失した肝細胞認識部位欠失型HBsAgL粒子(Null型HBsAgL粒子)や、血管内皮、脳下垂体細胞に特異的に感染する塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)提示型HBsAgL粒子、悪性度の高い癌組織に特異的に感染する上皮細胞成長因子(EGF)提示型HBsAgL粒子、ベータセルリン(BTC)レセプターを認識して、膵臓β細胞に特異的に感染するベータセルリン(BTC)提示型HBsAgL粒子、任意の特異性を有する抗体をHBsAgL粒子に付与した抗体提示型HBsAgL粒子が作製できる。
【0048】
しかしながら、以上の改変型HBsAgL粒子は粒子形成の効率が悪く、野生型のHBsAgL粒子が、酒造用酵母を用いることにより全可溶性タンパク質の約40%もの大量発現に成功しているのに対し、改変型HBsAgL粒子は大量発現を起こすことはまれで、全可溶性タンパク質の数%未満しか発現されていない。特に、bFGF提示型Lタンパク質は全可溶性タンパク質の1%未満であった。
【0049】
これは、一般的な遺伝子組換えタンパク質の生産性と同等であるが、ドラッグデリバリーシステムとして改変型HBsAgL粒子を利用するには、より発現量を高める必要がある。また、HBsAgL粒子の生産量が付与される生体認識分子によって大きく変化することは、付与される生体認識分子がHBsAgL粒子の生産に関わっていることを示し、効率的な生産を行う上で障害となる不安定な発現量を改善できる可能性を示している。
【0050】
そこで、発明者らは、改変型HBsAgL粒子の発現率が低いのは、酵母菌体内でのHBsAgL粒子形成過程で必須なpre−S領域のN末端側からの小胞体膜透過を、置換した生体認識分子が立体障害を起こして妨げているためと考えた。
【0051】
一方、非特許文献4および非特許文献5によると、B型肝炎ウィルスの内部コア抗原タンパク質(HBcAg)が、ウィルス粒子形成過程において、Lタンパク質pre−S1領域のC末端部分と相互作用して肝細胞中の粒子形成を促すことが記されている。
【0052】
HBcAgは、図2(a)に示すように183個のアミノ酸から構成され、1〜144(もしくは149)アミノ酸までのAssembly domainと、それに続くRNA−binding protamine domainからなる。上記Assembly domainは、カプシド構造を形成するための部位であり、RNA−binding protamine domainはウィルスゲノムDNAと結合して安定に保持するための部位である。HBcAgは、図2(b)に示すように自身で集まってカプシド構造を形成する能力を有している。このカプシド構造は、一般的に、B型肝炎ウィルス粒子では、図2(c)に示されるように、ウィルス粒子の内部に存在しており、カプシド構造内に含んだウィルスゲノムDNAと相互作用して安定に保持するとともに、HBsAg L粒子とも相互作用して、ウィルス粒子形成を内側から促していると考えられている。そこで、以下の実施例で、HBsAgLタンパク質とともにHBcAgを発現させて粒子形成することにより、HBcAgがHBsAgL粒子形成を助け、HBsAgL粒子が安定に発現されるかを調べるため、HBsAgLタンパク質もしくは改変型HBsAgLタンパク質とHBcAgとを酵母に共発現させたHBsAgL粒子の粒子形成率を観察した。
【0053】
(実施例1)
上記改変型HBsLタンパク質の作製方法を以下に示す。図3(a)に示すように、本発明者らによって報告された特許文献1記載の、pGLDLIIP39−RcTのpre−S1領域(3アミノ残基から77アミノ残基)を削除したpGLDLIIP39−RcT△3−77のpre−S領域に、制限酵素NotIを用いて、例えば、BTCまたはbFGFをコードする遺伝子を挿入したHBsAgLタンパク質発現ベクターを、酵母に発現させる。これにより、生体認識分子としてBTCを提示するHBsAgのLタンパク質、すなわちBTC提示型HBsAgL粒子、あるいはbFGFを提示するbFGF提示型HBsAgL粒子を得た。
【0054】
(実施例2)HBcAgの酵母用発現プラスミドの作製
(2−1)プラスミドへのプロモーターTDH3の組み込み
野生型HBsAg発現プラスミドpRS405−2−LAGに組み込まれているプロモーターTDH3のDNA断片をPCR法により増幅した。PCR法は、表1に示す組成の反応液を使用し、プライマー(+)として配列番号3に、プライマー(−)として配列番号4に示される配列を用いた。
【0055】
【表1】
【0056】
上記反応液を4等分し、そのうち3つをそれぞれ以下の条件にてPCR反応を行った。94℃30秒加熱後、94℃1分、アニーリング1分、72℃1分の反応サイクルを30サイクル行い、その後72℃で5分加熱した。アニーリング温度は、条件検討のため、55℃、60℃、65℃の3種類で行った。このPCRでは、これら3種類すべて同様にDNA増幅が行われたため、3条件のPCR産物をまとめて回収し、TAクローニングを行った。また、4等分したうちの1つは鋳型DNAの代わりに等量の大塚蒸留水を加え、アニーリング温度60度でネガティブコントロールとした。
【0057】
図3(b)に示すように、PCR法にて得られたDNA断片をpGEM−T Easy vector (Promega)に連結し、塩基配列確認後、制限酵素KpnI,XhoI(Takara)で切断し、得られたDNA断片をオーレオバシジンA耐性酵母形質転換システム用の大腸菌・酵母シャトルベクターである、pAUR123(Takara製)にKpnI,XhoIで連結し、pAUR123−TDH3を得た。pAUR123は、オーレオバシジンA感受性遺伝子aur1を有しており、この遺伝子はIPC(inositolphosphorylceramide)合成酵素をコードしている。
【0058】
(2−2)プラスミドへのHBcAg遺伝子の組み込み
次に、HBV(adr)のゲノムを鋳型としてPCR法にてHBcAgのDNA断片を増幅した。HBVゲノムとしては、Nucleic Acids Res.11(6),1747−1757(1983)記載分のプラスミドpHBr330を使用した。なお、このゲノム配列は、GenBank アクセッション番号D00630に登録されている。また、HBcAgのアミノ酸配列は、アクセッション番号BAA00523に登録されている。
【0059】
このPCR法では、表1に示す組成の反応液を使用し、プライマー(+)として配列番号5に、プライマー(−)として配列番号6に示される配列を用いた。ここで、配列番号6には、外来遺伝子を挿入できるように設計したため、AACGCGTCC(ACGCGTがMluIサイトである)の余分な配列が含まれている。
【0060】
上記反応液を4等分し、そのうち3つをそれぞれ以下の条件にてPCR反応を行った。94℃30秒加熱後、94℃1分、アニーリング1分、72℃1分の反応サイクルを30サイクル行い、その後72℃で5分加熱した。アニーリング温度は、条件検討のため、55℃、60℃、65℃の3種類で行った。このPCRでは、60℃および65℃の2種類で同様にDNA増幅が行われたため、2条件のPCR産物をまとめて回収し、TAクローニングを行った。また、4等分したうちの1つは鋳型DNAの代わりに等量の大塚蒸留水を加え、アニーリング温度65度でネガティブコントロールとしてPCRを行った。
【0061】
PCR法にて得られたDNA断片をpGEM−T Easy Vectorに連結し、塩基配列確認後、制限酵素XhoI,SacI(TaKaRa)で切断し、得られたDNA断片をpAUR123−TDH3にXhoI,SacIで連結し、pAUR123−TDH3−HBcAgを得た。
【0062】
(実施例3)HBcAgとHBsAgとの酵母による共発現
実施例1で用いたHBsAgLタンパク質発現ベクターを、実施例2のHBcAg発現ベクターとコトランスフォーメーションさせた。すなわち、上記ベクターをS.cerevisiaeAH22R−株へ以下のスフェロプラスト法(Albert et al.,1978)により形質転換した。
【0063】
S.cerevisiaeAH22R−株をYPDA寒天培地(組成は表2参照)に接種し、2−3日30℃で培養し、得られたコロニーを一晩YPDA培地(組成は表2参照)50mlで30℃にて前培養した。前培養終了後、本培養開始時のOD600が0.05程度になるようにYPDA培地50mlに植菌し、OD6000.4−0.8になるまで30℃で8時間程度培養した。その後、培養液4mlを15mlチューブ(IWAKI製)に分注し、多本架冷却遠心機(トミー工業株式会社製)を用いて2000回転、4℃で5分間遠心分離を行い菌体を回収し、菌体を4mlの溶液A(クエン酸ナトリウム0.1M、EDTA2ナトリウム10mM、ソルビトール1.2M、pH 5.8)で洗浄した後、溶液A3.6mlとザイモリエース100T(生化学工業)溶液(1.0mg/ml)0.4mlを加え、30℃で1時間程度インキュベートして菌体をスフェロプラスト化させた。
【0064】
【表2】
【0065】
その後、多本架冷却遠心機(トミー工業株式会社製)を用いて1900回転、20℃で5分間遠心分離を行い菌体のみを回収し、溶液B(ソルビトール1.2M、塩化カルシウム10mM、Tris−HCl (pH7.0)10mM)4mlで洗浄した後、溶液B0.1mlで菌体を懸濁させ、野生型または改変型HBsAgL粒子発現用ベクター7μgとpAUR123−TDH3−HBcAg5μgを共に加えて室温で15分間放置した。次に溶液C(ポリエチレングリコール4000 20%、Tris (pH7.0) 10mM、塩化カルシウム10mM)2mlを加え、さらに15分間放置した後1900回転、20℃で5分間遠心分離を行い菌体を回収し、溶液D(ソルビトール 1.2M、ポリペプトン2%、粉末酵母エキス1%、グルコース2%、アデニン硫酸塩0.01%)0.3mlに懸濁して30℃で20分間インキュベートした。その後、菌体懸濁液に55℃に保った重層寒天培地5mlを加え、Y−Tf寒天培地(組成は表2参照)に重層した。30℃で6−14日培養後、出現したコロニーをロイシン無添加、オーレオバシジンA添加SD寒天培地(組成は表2参照)に接種し、生育した菌体のみを培養し、発現株の選抜を行った。
(実施例4)HBcAgとHBsAgLタンパク質との共発現L粒子の発現量測定
実施例3の形質転換された菌体は、Hi−Pi培地(組成は表3参照)1mlで3日間前培養し、多本架冷却遠心機(トミー工業株式会社製)を用いて2000回転、4℃で5分間遠心分離を行って菌体を回収し、その後8S5N−P400培地(組成は表3参照)1mlに培地を交換し3−4日間本培養を行った。培養条件は30℃とし、振盪培養を行った。
【0066】
【表3】
【0067】
図4に、bFGF提示型HBsAgLタンパク質およびHBcAgを共発現して得た粒子を抗bFBF抗体、および抗―Lタンパク質抗体にてウェスタンブロッティングした図を図4(a)に、BTC提示型HBsAgLタンパク質およびHBcAgを共発現して得た粒子を抗BTC抗体、および抗―Lタンパク質抗体にてウェスタンブロッティングした図を図4(b)に示す。これによれば、矢印に示されるように、BTCおよびLタンパク質を有するBTC提示型HBsAgLタンパク質、およびbFGFおよびLタンパク質を有するbFGF提示型HBsAgL粒子が良好に形成されていることがわかる。
(A)1mlスケール培養の発現確認
培養液1mlを1.5mlマイクロチューブに回収し、3000回転、4℃で5分間遠心分離を行い菌体を回収した後、表4の緩衝液A0.25mlで菌体を懸濁し、グラスビーズ(直径0.5mm、BioSpec,カタログ番号11079105)を加え、4℃で25分間激しく攪拌(ボルテックス)して菌体を破壊した。10000回転、4℃で5分間遠心分離を行い粗抽出液を回収し、IMxHBsAg・ダイナパック(V2)(血中HBs抗原検出用キット、Dainabot)、IMxHBeAg・ダイナパックAXを用いて、それぞれ各菌体における改変型HBsAg粒子、HBcAgの発現量を確認した。
【0068】
なお、HBeAgとは、HBcAgのN末端に余分に10アミノ酸が付加され、HBcAgのC末端の149アミノ酸残基より後ろのアミノ酸残基が欠失した159アミノ酸からなるタンパク質であり、細胞から分泌される。このHBeAgタンパク質は、HBcAgとは異なり、カプシド結合をとることはないが、HBcAgは、N末端10残基を除いたHBeAgの配列と全く同じであるため、このキットを用いてHBcAgの発現を測定可能である。ただし、このキットが測定したHBcAgが、単量体なのか2量体なのか、あるいはカプシド構造をとっているかは判断できない。
【0069】
また、上記ダイナパックを用いる際に、粗抽出液の希釈が必要な場合には、表4の組成のPBSを用いた。
【0070】
【表4】
【0071】
以上の方法を用いて、野生型HBsAgLとHBcAgとを共発現した場合の培養液50倍希釈液1サンプルについて、HBsAg抗原性を測定した。比較例として、HBcAg発現ベクターを加える以外は同様の操作を行った、野生型HBsAgLタンパク質を単独に発現した場合の20倍希釈培養液8サンプルについても、HBsAg抗原性を測定した。結果は、図5に示すとおりである。図5の縦軸は、上記のサンプルの平均のIMxHBsAg(V2)値を示しており、これはHBsAgL粒子の粒子が形成されているかどうかを表す値となっている。これによれば、HBsAgLタンパク質単独発現(20倍希釈)では、IMxHBsAg(V2)値の平均が5.27であるのに対し、HBsAgL粒子とHBcAgとを共発現したもの(50倍希釈)では213と著しく高い値を示した。したがって、HBsAgLタンパク質をHBcAgと共発現させることで、HBsAgL粒子の形成効率が著しく上がったと言える。
【0072】
同様の実験を、野生型HBsAgLタンパク質の代わりにEGF提示型HBsAgLタンパク質を発現させて行った結果を図6に示す。今回は、EGF提示型HBsAgLタンパク質を単独に発現した場合の20倍希釈培養液3サンプルと、EGF提示型HBsAgL粒子とHBcAgとを共発現した場合の培養液50倍希釈液17サンプルについて、IMxHBsAg(V2)値を測定した。これによれば、HBsAgLタンパク質単独発現(20倍希釈)では、IMxHBsAg(V2)値の平均が5.36であるのに対し、HBsAgL粒子とHBcAgとを共発現したもの(50倍希釈)では163と、著しく高い値を示した。
【0073】
さらに、同様の実験を、野生型HBsAgLタンパク質の代わりにNull型HBsAgLタンパク質を発現させて行った結果を図7に示す。Null型HBsAgLタンパク質を単独に発現した場合の20倍希釈培養液4サンプルと、Null型HBsAgL粒子とHBcAgとを共発現した場合の培養液100倍希釈液6サンプルについて、IMxHBsAg(V2)値を測定した。これによれば、HBsAgLタンパク質単独発現(20倍希釈)では、IMxHBsAg(V2)値の平均が2.75であるのに対し、HBsAgL粒子とHBcAgとを共発現したもの(100倍希釈)では151と、非常に高い値を示した。
(4−2)400mlスケール培養の発現確認
BTC提示型HBsAgLタンパク質およびHBcAgを発現した菌体を培養しているSDプレート、bFGF提示型HBsAgLタンパク質およびHBcAgを発現した菌体を培養しているSDプレートは2枚分の菌体を全てHi−Pi培地50mlに植菌し、3日間培養した後、Hi−Pi培地400mlで1日培養し、その後8S5N−P400培地400mlで3.5日間(86.5時間)培養した。培養終了後、それぞれを集菌し、菌体湿重量を測定した。また、培養終了前日(8S5N−P400培地にて54時間培養後)に、各クローンの培養液を1mlずつサンプリングし菌体湿重量を測定後、グラスビーズにて菌体を破砕しHBsAg粒子の発現量をIMxHBsAg・ダイナパック(V2)にて測定した。破砕方法および発現量の測定方法は、上記(4−1)の方法と同様である。
【0074】
得られたBTC提示型HBsAgL粒子とHBcAgとを共発現した場合の培養液100倍希釈液、および、比較例として、HBcAg発現ベクターを加える以外は同様の操作を行ったBTC提示型HBsAgLタンパク質を単独に発現した場合の培養液100倍希釈培養液との、HBsAg抗原性を測定した。結果は、図8に示すとおりである。これによれば、HBsAgLタンパク質単独発現では、IMxHBsAg(V2)値が0で発現菌体を獲得できなかったのに対し、HBsAgL粒子とHBcAgとを共発現したものでは81.92と高い値を示した。
【0075】
同様に、bFGF提示型HBsAgLタンパク質を単独に発現した場合の培養液100倍希釈培養液と、bFGF提示型HBsAgL粒子とHBcAgとを共発現した場合の培養液100倍希釈液について、HBsAg抗原性を測定した。結果は、図9に示すとおりである。これによれば、HBsAgLタンパク質単独発現では、IMxHBsAg(V2)値が2.77であるのに対し、HBsAgL粒子とHBcAgとを共発現したものでは37.4と高い値を示した。
【0076】
野生型HBsAgL粒子を100としたときのIMxHBsAg値の相対値は図10のとおりである。
【0077】
以上のように、HBcAgと改変型HBsAgLタンパク質とを酒造酵母内で共発現すると、改変型HBsAgL粒子の発現量が数10倍も亢進し、その量は全可溶性タンパク質の数十%に達した。
(実施例5)HBsAgL粒子の大量精製
まず、以下の方法で、HBcAgをLタンパク質あるいは改変型Lタンパク質と共発現して形成した、野生型HBsAgL粒子、Null型HBsAgL粒子、BTC提示型HBsAgL粒子、bFGF提示型HBsAgL粒子、EGF提示型HBsAgL粒子を作製して、粗サンプルを得る。なお、以下のHBsAgL粒子、Lタンパク質とは、上記の5種類の粒子およびそれを構成するLタンパク質を言う。
【0078】
HBcAgと改変型HBsAgLタンパク質との共発現菌体を培養した培養液400−1000mlから、上記菌体を取り出し、100mlの緩衝液A(表4参照)に懸濁し、氷冷しながら、ビードビーダー(BEAD BEATER)を用いてグラスビーズ(直径0.5mm)で5分間破砕、氷上放置5分間というサイクルを3回繰返して菌体を破砕した。その後、4℃で、5000回転にて10分間遠心分離を行い、回収した上清に、33%(w/v)ポリエチレングリコール6000(ナカライテスク)を溶液容量の75%(v/v)加えて30分間氷冷した。さらに、ローターNo.17N(トミー精工)を用いて、遠心分離機CX−250(トミー精工)により、4℃で5000回転の遠心分離を10分間行い、沈殿を回収して、緩衝液A15mlに懸濁した粗サンプルを得た。
【0079】
上記粗サンプルからHBsAgL粒子を精製するために、以下に示すように、塩化セシウム密度勾配遠心分離、スクロース密度勾配遠心分離、および限外ろ過を行った。
【0080】
まず、塩化セシウム密度勾配遠心分離を行った。この方法は、密度勾配をつけた塩化セシウム溶液内でサンプルに超遠心を行うことで、HBsAgL粒子の浮揚密度と等しい密度のCsCl溶液の画分にHBsAgL粒子を集めて精製を行うものである。
【0081】
密度勾配をつけた塩化セシウム溶液は、図12(a)に示すように、40PAチューブ(日立工機製)に下から40%(w/v)塩化セシウム溶液8ml、30%(w/v)塩化セシウム溶液8ml、20%(w/v)塩化セシウム溶液7ml、10%(w/v)塩化セシウム溶液7mlを重層させたものであり、その後上記粗サンプルを液表面に5−6ml重層した。その後、ローターP28SX(日立工機製)を用いて、超遠心分離機55P−72H(日立工機製)により24000回転、16℃で12−16時間密度勾配超遠心を行った。
【0082】
塩化セシウム密度勾配遠心を行った3−6本のチューブを、上層から2mlずつの画分に分けて回収し、各画分ごとに1本にまとめ、IMxHBsAgダイナパック(V2)で測定した。この中で、HBsAgL粒子が検出された画分を回収し、15mMEDTA・2Naを含むPBSにより、4℃下で3−5時間透析した。透析した溶液は、ローターNo.17Nを用いて、遠心分離機CX−250により5000回転、4℃で10分間の遠心分離を行って上清を回収した。
【0083】
次に、上記上清をスクロース密度遠心勾配にかけた。この方法は、密度勾配をつけたスクロース溶液内でサンプルに超遠心を行うことで、HBsAgL粒子はその沈降係数に従った速度で沈降し、その他の大きさが違う沈降速度の異なる分子から分離される。密度勾配をつけたスクロース溶液は、40PAチューブに50%(w/v)スクロース溶液6ml、40%(w/v)スクロース溶液5ml、30%(w/v)スクロース溶液6ml、20%(w/v)スクロース溶液5ml、10%(w/v)スクロース溶液5mlを重層させたものであり、その液表面に透析後の上清を8−9ml重層した。その後、ローターP28SXを用いて、超遠心分離機55P−72Hにより24000回転、4℃で8−10時間密度勾配超遠心を行った。
【0084】
スクロース密度勾配超遠心終了後、塩化セシウム密度勾配遠心の時と同様に、3−6本のチューブの上層から2mlずつの画分に分けて回収し、画分ごとに1本にまとめて、IMxHBsAg・ダイナパック(V2)で測定し、HBsAgL粒子が存在する画分を回収した。
【0085】
最後に、得られた画分を4℃で一晩、PBSで透析し、ULTRA FILTER UK−200(Advantec社製)を用いて限外ろ過を行い、容量が10mlになるまで濃縮した。
【0086】
以上の操作により、野生型HBsAgL粒子(Lタンパク質推定分子量52kDa)、Null型HBsAgL粒子(Nullタンパク質推定分子量40.2kDa)、BTC提示型HBsAgL粒子(BTC融合型Lタンパク質推定分子量45.7kDa)、bFGF提示型HBsAgL粒子(bFGF融合型Lタンパク質推定分子量57.3kDa)、EGF提示型HBsAgL粒子(EGF融合型Lタンパク質推定分子量47.2kDa)が得られた。
【0087】
(実施例6)精製により得られたbFGF提示型L粒子の物性解析
(6−1)ウェスタンブロットによる解析
bFGF提示型HBsAgL粒子がHBcAgタンパク質と相互作用しているかどうかを調べるため、bFGF提示型HBsAgL粒子をS抗体で免疫沈降した後、bFGF抗体とHBcAgタンパク質抗体とでウェスタンブロットを行ったのが、図11である。その結果、bFGFHBsAgL粒子は、矢印で示すように、bFGF抗体により検出され、HBcAgタンパク質抗体にも検出された。従って、bFGF提示型HBsAgL粒子は、bFGF、HBsAg領域、HBcAgタンパク質を併せ持つことが分かった。すなわち、HBcAgタンパク質は粒子上のbFGF提示型HBsAgLタンパク質と何らかの相互作用をしていることが分かった。
【0088】
(6−2)密度勾配遠心法によるHBsAgL粒子の密度測定
bFGF提示型HBsAgL粒子がHBcAgタンパク質を含んでいるかを調べるため、以下の方法で塩化セシウム密度勾配遠心を行って、bFGF提示型HBsAgL粒子の密度を推定した。
【0089】
得られたbFGF提示型HBsAgL粒子を、精製時に用いた塩化セシウム密度勾配遠心法と同様の方法で分離した結果を、図12(b)に示す。これは、遠心後のCsCl密度勾配沈殿の各画分の50倍希釈液のIMxHBsAg値およびIMxHBeAg値をプロットしたグラフである。上記、CsCl密度勾配沈殿の画分とは、上層から2mlずつ17個の画分に分けられたものであるが、IMxHBsAg値のピークは、フラクション3、すなわち上層から4mlから6mlの層に明確に示された。図12(a)のように重層した遠心管の上部より2mlずつ回収したため、フラクション3のサンプルは10%CsCl溶液中に存在すると考えられる。この10%CsCl溶液の密度は約1.20g/mlであるから、フラクション3に集まったbFGF提示型HBsAgL粒子の密度は約1.20g/mlと考えられる。これは、1.21g/mlの野生型HBsAgL粒子の密度と同程度である(非特許文献1参照)。
【0090】
一方、酵母にてS,M,LおよびHBcAgタンパク質の4つを同時に発現させ、HBcAgタンパク質をHBsAg粒子内に包含させたビリオン様粒子の密度は約1.25g/mlである(非特許文献2参照)。よって、Lタンパク質およびHBcAgタンパク質を共発現させて得られたHBsAgL粒子が、HBcAgタンパク質を包含して形成されているならば、約1.25g/mlの密度と等しい画分に含まれるはずである。したがって、推定密度約1.20g/mlのbFGF提示型HBsAgL粒子はHBcAgタンパク質を包含していないことが示された。
(6−3)プロテイナーゼによる解析
さらに、bFGF提示型HBsAgL粒子がHBcAgタンパク質を含んでいるかをプロテイナーゼ処理によって調べた。
【0091】
bFGF提示型HBsAgL粒子精製サンプル720μlに、抗HBsマウスモノクローナル抗体固定化マイクロパーティクルのIMxの抗体240μlを加えた計960μlの溶液をチューブ2本に分け、4℃で9時間振とうして免疫沈降し、プロテアーゼ阻害剤とTritonX−100を含まないリシスバッファーで3回洗浄し、沈殿物を4等分、計8等分した。これにより、bFGF提示型HBsAgL粒子の沈殿物を得た。
【0092】
10μg/mlのP.K.(プロテイナーゼK)を含むバッファー液(50mMトリス塩酸、5mM塩化カルシウム、pH7.6)を6つの沈殿物に20μlずつ加え、37℃にて、それぞれ5分、10分、15分、20分、25分、30分の時間で保温した。
【0093】
参照実験として、P.K.を含まない溶液(50mMトリス塩酸、5mM塩化カルシウム、pH7.6)を沈殿物に加え、保温しなかったもの(参照サンプル1)、および30分間37℃で保温したもの(参照サンプル2)を作製した。さらに別の参照実験として、PBS720μlに抗体240μlを加えた計960μlの溶液を遠心し、抗HBsAgマウスモノクローナル抗体固定化マイクロパーティクルに結合した沈殿物にP.K.を含まない溶液(50mMトリス塩酸、5mM塩化カルシウム、pH7.6)を加えて保温しなかったもの(参照サンプル3)も用意した。
【0094】
これらのサンプルをウェスタンブロットした図を図13に示す。図13(a)は、抗Lタンパク質Abによる、(b)は抗bFGFAbによる、(c)は抗−HBcAgAbによるウェスタンブロットである。レーン1に上記の参照サンプル3、レーン2に参照サンプル1、レーン3に参照サンプル2の参照サンプルを、レーン4からレーン9がP.K.を加えたサンプルである。なお、レーン4からレーン9は、レーン数の小さいものから順に、P.K.の加熱時間が5分、10分、15分、20分、25分、30分としたサンプルとなっている。
【0095】
これによれば、図13(a)、(b)に矢印に示されるbFGF提示型HBsAgLタンパク質のバンドが示される。また、矢頭に示すように、図13(a)の20kDaあたり、および図13(c)の20kDaより小さい部分にPKによる分解産物と考えられるバンドがある。これらのバンドは、参照サンプルであるレーン1から3には認められないのに対し、レーン4から9には認められる。
【0096】
図13(c)のPKによる分解産物のバンドはHBcAgタンパク質の分解物であると考えられるが、プロテイナーゼK処理の時間経過に従いバンドが薄くなっており、処理時間30分(レーン9)では、ほぼ完全になくなっている。つまり、HBcAgタンパク質がP.K.に短時間で分解されている。
【0097】
仮に、HBsAgL粒子内にHBcAgタンパク質が包含されているならば、HBcAgタンパク質は外部に晒されていないので、プロテイナーゼKによる分解を受けにくくなると考えられる。したがって、プロテイナーゼKにより、加温30分後にほぼ完全分解されているこの結果から判断するとbFGF提示型HBsAgL粒子内にHBcAgタンパク質は包含されていないと考えられる。
【0098】
(実施例7)精製により得られたBTC提示型L粒子の物性解析
bFGF提示型HBsAgL粒子で行った実験を同様の方法で、BTC提示型HBsAgL粒子も塩化セシウム密度勾配遠心法による分離を行った。結果を、図14に示す。図14にCsCl密度勾配沈殿の各画分の200倍希釈液のIMxHBsAg値およびIMxHBcAg値をプロットしたグラフを示している。IMxHBsAg値のピークは、フラクション5,6に明確に示された。このように、IMxHBsAg値がフラクションの途中でピークを形成しているので、BTC提示型HBsAgL粒子が粒子を形成していると言える。また、IMxHBcAg値のピークがこのIMxHBsAg値と一部重なっていることから、BTC提示型HBsAgL粒子の一部がHBcAgタンパク質と相互作用している可能性がある。
【0099】
CsCl密度勾配遠心後は、図14(a)のように重層した遠心管の上部より2mlずつ回収したため、フラクション6のサンプルは10%CsCl(密度1.20g/ml)と20%CsCl(密度約1.27g/ml)とのほぼ境界線付近に相当する。したがって、このグラフから求めた推定密度にてHBcAgタンパク質がHBsAgL粒子内に包含されているかの判断は不可能と考えられる。
【0100】
上記のフラクション5,6を含めたフラクション4〜7を回収し、PBS(15mM EDTAを含む)で透析した後、抗HBsAgL粒子Abによるウェスタンブロットを行ったものを図14(c)のレーン2に示している。これは、BTC提示型HBsAgL粒子の粗抽出液を、抗HBsAgL粒子Abによりウェスタンブロットしたもの(レーン1)とほぼ同程度の濃さのバンドであった。
【0101】
一方、同様にレーン2のサンプル(フラクション4〜7を回収し、透析したもの)を抗HBcAgAbによりウェスタンブロットしたもの(レーン4)は、BTC提示型HBsAgL粒子の粗抽出液を抗HBcAgAbによりウェスタンブロットしたもの(レーン3)より著しく検出量が低かった。つまり、BTC提示型HBsAgL粒子がフラクション4〜7に固まって存在しているのに対し、HBcAgはこれ以外の画分にも分散しているといえる。従って、HBcAgタンパク質が、BTC提示型HBsAgL粒子内に図15(b)のように内部に包含されている可能性は非常に低いと考えられ、仮に包含されているHBcAgタンパク質が存在した場合においてもその割合はきわめて低いと考えられる。すなわち、得られた粒子のほとんどは、図15(a)のように、粒子外部からHBsAgLタンパク質と相互作用していると考えられる。
【0102】
すなわち、得られる改変型HBsAgL粒子は、一部にしかHBcAgが含まれておらず、ほとんどが中空であったので、本発明の中空ナノ粒子は遺伝子等導入物質の運搬に好適に使用できることが示唆された。
【0103】
【発明の効果】
本発明の中空ナノ粒子は、以上のように、物質を細胞特異的に運搬するという機能を保ちつつ、粒子の形成を促進することで、効率的に粒子を製造できるという効果を奏する。
【0104】
さらに、本発明によれば、中空ナノ粒子の生体認識分子を置換した場合にも、粒子の形成能が落ちることがなく、安定した粒子形成が可能となる。中空ナノ粒子の形成が促進されると、中空ナノ粒子の安定した生産ができ、薬剤として利用するなどの応用が有効となるので、本技術の幅広い普及が期待できる。
【0105】
中空ナノ粒子に物質導入した薬剤は、静脈注射などといった簡便な方法で、特定の細胞または組織に対して選択的かつ効率的に疾患治療用の細胞導入物質を送り込むことができるので、従来の遺伝子治療と大きく異なり、外科手術を必要とせず、副作用の心配も極めて低く、そのまま臨床応用可能なものである。
【0106】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の一実施の形態に係るHBsAgL粒子の生体認識分子の改変を説明する図面である。
【図2】本発明の一実施の形態に係る中空ナノ粒子を構成するHBcAgタンパク質を示す図面であって、(a)はHBcAgタンパク質の概略図を示し、(b)はHBcAgが構成するカプシド構造を示し、(c)がカプシド構造を有するB型肝炎ウィルスをしている。
【図3】本発明の一実施の形態に係る中空ナノ粒子を作製するためのベクターを示した図面であり、(a)はHBsAgLタンパク質をコードする遺伝子を有するベクターを示し、(b)はHBcAgLタンパク質をコードする遺伝子を有するベクターを示す。
【図4】BTC提示型HBsAgL粒子およびbFGF提示型HBsAgL粒子のウェスタンブロッティング図を示す図面である。
【図5】本発明の一実施の形態に係る中空ナノ粒子である、HBcAgと野生型HBsAgLタンパク質とを共発現して得たHBsAgL粒子の抗原性を示す図面である。
【図6】本発明の一実施の形態に係る中空ナノ粒子である、HBcAgとEGF提示型HBsAgLタンパク質とを共発現して得たEGF提示型HBsAgL粒子の抗原性を示す図面である。
【図7】本発明の一実施の形態に係る中空ナノ粒子である、HBcAgとNull型HBsAgLタンパク質とを共発現して得たNull型HBsAgL粒子の抗原性を示す図面である。
【図8】本発明の一実施の形態に係る中空ナノ粒子である、HBcAgとBTC提示型HBsAgLタンパク質とを共発現して得たBTC提示型HBsAgL粒子の抗原性を示す図面である。
【図9】本発明の一実施の形態に係る中空ナノ粒子である、HBcAgとbFGF型HBsAgLタンパク質とを共発現して得たbFGF型HBsAgL粒子の抗原性を示す図面である。
【図10】本発明の一実施の形態に係るBTC提示型HBsAgL粒子およびbFGF提示型HBsAgL粒子の抗原性を、野生型HBsAgLタンパク質の単独発現により形成された粒子の抗原性を100としたときの相対値で示した図面である。
【図11】本発明の一実施の形態に係るbFGF提示型HBsAgL粒子のウェスタンブロッティング図を示す図面である。
【図12】本発明の一実施の形態に係るbFGF提示型HBsAgL粒子のCsCl密度勾配遠心を示す図面であり、(a)はCsCl密度勾配チューブを示しており、(b)はCsCl密度勾配遠心した後の画分ごとの抗原性を示している。
【図13】本発明の一実施の形態に係るbFGF提示型HBsAgL粒子をプロテイナーゼ処理した後、ウェスタンブロットを行った結果を示す図面であり、(a)は抗Lタンパク質抗体を、(b)は抗bFGF抗体を、(c)は抗HBcAg抗体を用いてウェスタンブロットを行った結果を示している。
【図14】本発明の一実施の形態に係るBTC提示型HBsAgL粒子のCsCl密度勾配遠心の結果を示す図面であり、(a)はCsCl密度勾配チューブを示しており、(b)はCsCl密度勾配遠心した後の画分ごとの抗原性を示しており、(c)は粗抽出液または密度勾配遠心画分のウェスタンブロットの結果を示す図面である。
【図15】本発明の一実施の形態に係るHBsAgL粒子を示す図面であり、(a)はHBcAgが、HBsAgL粒子の外側からHBsAgLタンパク質と相互作用している様子をあらわし、(b)はHBcAgが、HBsAgL粒子の内側に包含されてHBsAgLタンパク質と相互作用している様子をあらわしている。
【符号の説明】
1 B型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質
3 B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質
4 生体認識分子
5 B型肝炎ウィルス粒子
Claims (10)
- 特定の細胞を認識する生体認識分子を有し、粒子形成能を有する第1のタンパク質からなる中空ナノ粒子において、上記第1のタンパク質には、カプシド構造を形成する第2のタンパク質と相互作用しているものが含まれていることを特徴とする中空ナノ粒子。
- 上記第1のタンパク質が、B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質であることを特徴とする請求項1記載の中空ナノ粒子。
- 上記第1のタンパク質が、B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質における肝細胞認識部位を他の生体認識分子に改変してなることを特徴とする請求項2記載の中空ナノ粒子。
- 上記第1のタンパク質が、B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質における肝細胞認識部位をベータセルリンまたは塩基性線維芽細胞増殖因子に改変してなることを特徴とする請求項3記載の中空ナノ粒子。
- 上記第2のタンパク質は、B型肝炎ウィルス内部コア抗原タンパク質であることを特徴とする請求項1ないし4の何れか1項に記載の中空ナノ粒子。
- 上記第1のタンパク質をコードする遺伝子と、第2のタンパク質をコードする遺伝子とが、ベクターにて同一の真核細胞に導入され、当該真核細胞において双方の遺伝子が発現されることで形成されることを特徴とする請求項1ないし5の何れか1項に記載の中空ナノ粒子。
- 上記真核細胞は、酵母であることを特徴とする請求項6記載の中空ナノ粒子。
- 上記第2のタンパク質をコードする遺伝子を、オーレオバシジンA感受性遺伝子を有するベクターにて導入することを特徴とする請求項6または7に記載の中空ナノ粒子。
- 請求項1ないし8の何れか1項に記載の中空ナノ粒子に細胞導入物質が封入されていることを特徴とする薬剤。
- 請求項8に記載の薬剤を用いることを特徴とする疾患の治療方法。
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