WO2005049824A1 - 生体構造認識部位を提示する中空ナノ粒子およびその生産方法、並びにその利用 - Google Patents

生体構造認識部位を提示する中空ナノ粒子およびその生産方法、並びにその利用 Download PDF

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WO2005049824A1
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protein
tag
hbsag
recognition site
hollow
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PCT/JP2004/017282
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Masaharu Seno
Hiroko Tada
Shunichi Kuroda
Katsuyuki Tanizawa
Akihiko Kondo
Masakazu Ueda
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Japan Science And Technology Agency
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
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    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5169—Proteins, e.g. albumin, gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle

Definitions

  • the present invention relates to a hollow nanoparticle presenting a biostructure recognition site, a method for producing the same, and use thereof, and more specifically, comprises a protein having at least a particle forming ability
  • the present invention relates to a hollow nanoparticle which presents a biological structure recognition site to the present invention, a method for producing the same, and an example of typical use thereof.
  • DDS drug delivery system
  • Various methods have already been proposed as a method for introducing a gene into a cell or tissue (gene introduction method).
  • Representative examples include (1) an electoporation method in which an expression plasmid incorporating a gene encoding a protein that specifically acts as a drug is perforated into the cell membrane by electric pulse stimulation, and (2) particles A particle delivery method in which the protein is introduced into cells by introducing the gene into cells by introducing it into cells of interest by a gun (gene gun) or the like, and the like.
  • any of the conventional gene transfer methods is insufficient as a method for specifically transferring a gene to a target cell and expressing a protein serving as a drug in the cell.
  • a method of directly sending a protein serving as a drug to a target cell or a target tissue an effective method has been developed, and it has been in a situation.
  • the present inventors have proposed a novel gene transfer method, in which a target cell or tissue is treated with a substance.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-3162978. (Published: November 13, 2001).)
  • a protein having a particle-forming ability is introduced at the N-terminal of the amino acid sequence thereof with a biostructure recognition site capable of recognizing a specific cell or tissue.
  • a substance gene, protein, compound, etc.
  • the application of this technology to the fields such as gene therapy as described above is very promising.
  • hollow nanoparticles When the hollow nanoparticles are used in the gene transfer method, it is necessary to purify the hollow nanoparticles.
  • conventional methods for purifying hollow nanoparticles include, for example, a method of repeatedly performing ultracentrifugation using gradient CsCl or sucrose, a method of repeatedly performing dialysis, and the like. Purification methods are complicated and often Need time. Therefore, in order to enhance the practicality, it is very preferable to make the purification of the hollow nanoparticles more efficient.
  • the above-described hollow nanoparticle technology is a revolutionary technology itself, but further improvement is required in order to further enhance practicality.
  • the present invention provides hollow nanoparticles that are simple to purify and can efficiently introduce a cell-introduced substance into target cells or tissues, and provide an example of a method for producing and using the same.
  • the purpose is.
  • the present inventors have found that by using human hepatitis B virus surface antigen protein, various target recognition sites are fused to a portion other than the N-terminal portion (C-terminal region).
  • the present inventors have found that it is simple to purify, can efficiently introduce a cell-introducing substance into target cells or tissues, and can provide hollow nanoparticles with improved practicability.
  • the hollow nanoparticles according to the present invention are formed by proteins having a particle-forming ability, and the hollow nanoparticles presenting a biological structure recognition site for recognizing a chemical structure derived from a living body on the surface thereof. It should be noted that both the amino-terminal and the carboxyl-terminal of the protein having the particle-forming ability are provided with the above-mentioned biostructure recognition sites, and that the biostructures recognized by the respective biostructure recognition sites are different from each other. It is a feature.
  • At least one of the biological structure recognition sites is a target structure recognition site that recognizes a structure specific to a target cell or tissue.
  • the biological structure recognition site includes a host cell recognition structure derived from a virus, an antigenic determinant, and Riga. And / or ligand receptor.
  • the virus-derived host cell recognition structure includes, for example, a hepatocyte recognition site in the hepatitis B virus surface antigen protein.
  • examples of the antigenic determinant include a tag sequence.
  • the tag sequence may include at least one of Strep-tag II, HA-tag, and FLAG-tag.
  • the biostructure recognition site may be a combination of a plurality of types of tag sequences.
  • Examples of the ligand include a cell growth factor.
  • the cell growth factor can include epidermal growth factor or fibroblast growth factor.
  • ZZ-tag having a function as an antibody recognition site can be included as a ligand.
  • the biological structure recognition site may be a combination of a tag sequence and a ligand.
  • a specific example of the hollow nanoparticles is a surface antigen protein derived from a protein virus having the particle forming ability, and the host cell recognition structure present at the terminal portion of the surface antigen protein is recognized as the target structure. Examples of use as a recognition site can be given. At this time, examples of the protein having the particle forming ability include hepatitis B virus surface antigen protein.
  • the antigenic determinant and Z or ligand are provided as the identification site for specifically recognizing the hollow nanoparticle itself.
  • the biological structure recognition site may be introduced into the protein by substituting the amino acid sequence at the terminal side of the protein having particle forming ability.
  • the method for producing hollow nanoparticles according to the present invention relates to a method for producing hollow nanoparticles, which is formed of a protein having at least a particle-forming ability and has on its surface a biological structure recognition site for recognizing a chemical structure derived from a living body.
  • the hollow nanoparticle is provided with the above-mentioned biostructure recognition site at both the amino and carboxyl terminals of the protein having the particle forming ability, and is derived from a living body recognized by each biostructure recognition site.
  • a chimeric gene comprising a gene and a polynucleotide encoding the above-mentioned biostructure recognition site is constructed, and this is introduced into a eukaryotic cell and expressed.
  • the eukaryotic cells are preferably any of yeast, insect cells, and animal cells.
  • a gene encoding a surface antigen protein derived from a virus is used as a gene encoding the protein capable of forming particles, and the gene in the gene at the terminal end of lipoxyl of the surface antigen protein is used.
  • the above-mentioned chimeric gene may be constructed by connecting a polynucleotide encoding a biological structure recognition site to the side where At this time, it is preferable that the chimeric gene is constructed such that the amino acid sequence at the terminal side of the protein having the particle-forming ability is replaced with a biological structure recognition site in some cases.
  • the hollow nanoparticles are further purified using a substance having a chemical structure recognized by the identification site as a carrier.
  • An example of the use of the present invention includes a drug in which a cell-introducing substance is encapsulated in the hollow nanoparticles.
  • the cell introduction substance may be a compound having a gene or pharmacological action.
  • Other uses of the present invention include a method for treating a disease using this drug.
  • FIG. 1 is a schematic view showing a hollow protein nanoparticle presenting a plurality of biostructure recognition sites according to the present invention.
  • FIG. 2 (A) is a graph showing secretion of C-terminal-tagged HBsAg L protein particles into a culture supernatant in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 (B) is a graph showing secretion of a C-terminal-tagged HBsAg L protein particle into a culture supernatant in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 (C) is a graph showing secretion of C-terminal tag-fused HBsAg L protein particles into a culture supernatant in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 (A)] A diagram showing the results of immunoprecipitation of the HBsAg L protein particles fused with a C-terminal tag (tag) in one embodiment of the present invention using an anti-HBsAg antibody.
  • HBsAgL protein 2 negative control, 3 C-7-FLAG, 4 A25-6-FLAG, 5 ⁇ 54-6-FLAG, 6 C-7-HA, 7 ⁇ 25-6-HA, 8 ⁇ 54-6-HA, 9 is ⁇ 11-6-FLAG, 10 is ⁇ 33-6-FLAG, l ⁇ SA45-6-FLAG, 12 is ⁇ 58-6-FLAG, 13 is ⁇ 63-6-FLAG, 14 is This is a lane in which ⁇ 130-6-FLAG was electrophoresed.
  • FIG. 3 (B)] shows the results of immunoprecipitation of HBsAg L protein particles fused with a C-terminal tag (tag) in one embodiment of the present invention using an anti-HBsAg antibody.
  • FIG. 4 (A)] shows the results of immunoprecipitation of HBsAg L protein particles fused with a C-terminal tag in one embodiment of the present invention using an anti-tag antibody.
  • Is wild-type HBsAgL protein 2 is a negative control
  • 3 is C-7-FLAG
  • 4 is A25-6-FLAG
  • 5 is ⁇ 54-6-FLAG
  • 6 is C-7-HA
  • 7 is ⁇ 25-6-HA
  • 8 is ⁇ 54-6-HA
  • 9 is ⁇ 11-6-FLAG
  • 10 is ⁇ 33-6-FLAG
  • 12 is ⁇ 58-6-FLAG
  • 13 is ⁇ 63-6-FLAG
  • 14 are lanes in which ⁇ 130-6-FLAG was migrated.
  • FIG. 4 (B)] shows the results of immunoprecipitation of a C-terminal tag-fused HBsAg L protein particle according to an embodiment of the present invention with an anti-tag antibody.
  • 5 is ⁇ 54-6-FLAG
  • 6 is C-7-HA
  • 7 is ⁇ 25-6-HA
  • 8 is ⁇ 54-6-HA
  • 9 is ⁇
  • 11- 6-FLAG, 10 is ⁇ 33-6-FLAG, l ⁇ SA45-6-FLAG, 12 is ⁇ 58-6-FLAG, 13 is
  • ⁇ 63-6-FLAG and 14 are lanes in which ⁇ 130-6-FLAG was electrophoresed.
  • FIG. 5 is a view showing a DNA sequence (upper row) and a deduced amino acid sequence (lower row) of FLAG-BTC-His-tag fused to a C-terminus.
  • FIG. 6 is a diagram showing the DNA sequence (upper row) and the deduced amino acid sequence (lower row) of FLAG-ZZ-His-tag fused to the C-terminus.
  • the hollow nanoparticles according to the present invention and a method for producing the hollow nanoparticles
  • the hollow nanoparticle according to the present invention is not particularly limited as long as it is formed of at least a protein having a particle forming ability and has a hollow interior.
  • the nanoparticle here is not particularly limited as long as it has a three-dimensional shape and is a minute structure having a size on the order of nanometers. Generally, the shape is substantially spherical or elliptical spherical.
  • the nanometer order refers to a range within which it is appropriate to display in nm units.
  • the hollow nanoparticles that are useful in the present invention are formed by a protein having a particle-forming ability, so that a biological structure recognition site that recognizes a chemical structure derived from a living body is provided on the surface. Presenting.
  • the protein capable of forming particles, which forms the hollow nanoparticles according to the present invention is expressed in a eukaryotic cell, whereby a large number of the same protein is embedded in a lipid bilayer derived from the eukaryotic cell.
  • the protein is not particularly limited as long as it has a function (particle forming ability) capable of forming isolated hollow particles.Natural proteins derived from animal cells, plant cells, viruses, fungi, etc. Synthetic proteins and the like can be mentioned.
  • Typical examples include subviral particles obtained from various viruses, and specific examples include virus-derived surface antigen proteins.
  • a protein used as a protein having the above-mentioned particle-forming ability has a possibility of inducing an antibody in a living body, a modified protein having reduced antigenicity should be used.
  • HBV Hepatitis B virus
  • HBsAg Hepatitis B virus surface Antigen
  • the HBsAg protein includes the S protein, which is also composed of 226 amino acids.
  • pre-S2 peptide S protein with 55 amino acids (pre-S2 peptide) added on the N-terminal side
  • M protein, M protein with 108 or 119 amino acids (pre-SI peptide) on the N-terminal side Is the L protein.
  • the inventors of the present invention expressed the HBsAg L protein in a genetically modified yeast, and found that a large number of the same proteins were embedded in a yeast-derived lipid bilayer with a minor axis of about 20 nm and a major axis of about 150 nm. (J. Biol. Chem., Vol. 267, No. 3, 1953-1961, 1992) 0 Since these hollow particles do not contain any HBV genome, It does not function as a virus and is extremely safe for the human body. In addition, since the hepatocyte-specific receptor responsible for infecting HBV to hepatocytes is displayed on the particle surface, it also has a function as a carrier that specifically transports substances to hepatocytes. Therefore, in the present invention, HBsAg protein can be suitably used.
  • the L protein of the HBsAg protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto. It may be a mutant protein.
  • the hepatitis B virus surface antigen protein used in the present invention includes not only (a) the L protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, but also (b) the amino acid shown in SEQ ID NO: 2 In the sequence, one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z- or amino acid-sequenced, and L-protein variants having particle-forming ability are also included.
  • the phrase "one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added” refers to substitution or deletion by a known method for producing a mutant protein such as site-directed mutagenesis.
  • Insertions, and Zs or amino acids that can be added are substituted, deleted, inserted, and Z or added.
  • the protein of (b) is a mutation of the protein of (a). It is a protein.
  • mutation as used herein means a mutation mainly introduced artificially by a known method for producing a mutant protein, but may also be obtained by isolating and purifying the same naturally occurring mutant protein. ,.
  • the mutant protein of the L protein does not have to include a structure that functions as a host cell recognition structure as long as it has at least a particle-forming ability! This is because, as described later, the host cell recognition structure (Pre-S region) of the L protein may be replaced with another biological structure recognition site.
  • the hollow nanoparticle according to the present invention presents on its surface a biological structure recognition site for recognizing a chemical structure derived from a living body.
  • the biological structure recognition site is not particularly limited, and a molecule specific to a cell or tissue targeted by the hollow nanoparticle according to the present invention may be selected. Specific examples include at least one of a virus-derived host cell recognition structure, an antigenic determinant, a ligand and a ligand receptor.
  • the above-described virus-derived host cell recognition structure refers to a structure that recognizes a host cell to be infected with a virus of origin, and differs depending on the type of virus.
  • a virus of origin for example, in the case of the above HBV, there may be mentioned the Pre-S region which is a hepatocyte recognition site.
  • the antigenic determinant is not particularly limited as long as it is a site that binds to an antibody or a site that is recognized by a T cell receptor.
  • a tag sequence can be suitably used. Examples of the tag sequence include Strep-tag II, HA-tag, FLAG-tag, ZZ-tag and the like, but are not particularly limited.
  • the ligand is not particularly limited as long as it is a substance that specifically binds to a functional protein.
  • the ligand includes the antigenic determinant, the antigen, the host cell recognition structure, and the like.
  • the TAT peptide is a partial peptide of HIV tat which has permeability and can be used as a carrier that penetrates the blood
  • the receptor (receptor) for the ligand is not particularly limited as long as it is a functional protein that specifically binds to the ligand. Specific examples include the above-mentioned receptors for cell growth factors, receptors for cell function regulating molecules such as interleukin receptor, antibodies against antigens and antigenic determinants, and receptors such as non-proteinaceous ligands.
  • the hollow nanoparticles according to the present invention that is, those that recognize a structure specific to a target cell or tissue may be appropriately selected.
  • the biological structure recognition site may be a target structure recognition site that recognizes a structure specific to a target cell or tissue.
  • the target cell or tissue (or organ) is a liver
  • the above-mentioned Pre-S region of HBV may be adopted.
  • an antiviral protein antibody may be selected.
  • the hollow nanoparticles according to the present invention can be used for removing virus-infected cells.
  • the target cell is a cancer cell
  • various biostructure recognition sites can be employed.
  • a cancer-specific antibody, an EGF receptor that specifically appears on cancer cells, and the like can be mentioned.
  • substances (drugs, genes, etc.) for treating cancer in the hollow nanoparticles presenting them it becomes an effective therapeutic agent that acts specifically and effectively on cancer cells.
  • betacellulin which is a kind of the above-mentioned epidermal growth factor, is selected as an EGF receptor that specifically appears on cancer cells. can do.
  • This betacellulin has a high affinity for epidermal growth factor receptor (EGFR) on epithelial cells. For this reason, hollow nanoparticles that present this on the particle surface have been used for human squamous cell carcinoma-derived cells that are EGFR overexpressing cells. It is possible to have recognition ability.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • the biological structure recognition site in the present invention may be a combination of a tag sequence and a ligand.
  • a tag sequence for example, FLAG-BTC-His-tag used in Example 5 described later, and FLAG-ZZ-His-tag used in Example 10 can be mentioned.
  • a ZZ tag such as FLAG-ZZ-His-tag
  • hollow nanoparticles are used as a biostructure recognition site for various “antibodies” or “fusion proteins of antibody Fc regions and ligand proteins”. Can be presented on the surface.
  • the hollow nanoparticle according to the present invention includes the above-mentioned biostructure recognition site at both the amino and carboxyl terminals of the above-mentioned protein having particle-forming ability (which may be referred to as “particle-forming protein” for convenience of explanation).
  • particle-forming protein for convenience of explanation.
  • the biostructure recognition sites provided at both ends of the particle-forming protein are different peptide molecules.
  • FIG. 1 is a schematic view showing a hollow nanoparticle according to the present invention.
  • the hollow nanoparticles have a structure in which a plurality of particle forming proteins 2 are embedded in a lipid bilayer derived from eukaryotic cells.
  • the particle-forming protein 2 has penetrated the lipid bilayer a plurality of times, and the biostructure recognition site 3 is provided at least at the amino terminus (N-terminus).
  • the biological structure recognition site 3 is presented on the surface of the hollow nanoparticle.
  • the hepatocyte recognition site of HBV can be used as it is as the N-terminal biological structure recognition site 3. it can. That is, in the present invention, if the particle-forming protein is a virus-derived surface antigen protein, the host cell recognition structure present at the end of the surface antigen protein can be used as the target structure recognition site.
  • a hollow nanoparticle presenting a plurality of biological structure recognition sites is provided.
  • At least one, preferably both of the above-mentioned biological structure recognition sites may be a target structure recognition site for recognizing a structure specific to a target cell or tissue. Furthermore, it is more preferable that any one of the above-mentioned biological structure recognition sites functions as a recognition site for specifically recognizing the hollow nanoparticles themselves.
  • the biological structure recognition site serving as the identification site include an antigenic determinant such as the tag sequence and a ligand such as Z or cell growth factor.
  • the hollow nanoparticles can be efficiently delivered to a specific cell or tissue, and the purification of the hollow nanoparticles is simplified. As a result, the utility of the hollow nanoparticles according to the present invention can be further enhanced.
  • the target structure recognition site and the identification site can be reliably used. Therefore, efficient delivery to target cells or tissues can be more satisfactory. Furthermore, a non-peptide molecule biostructure recognition site may be introduced into the particle forming protein 2 by utilizing post-translational modification of the protein. As a result, the efficiency of delivery to target cells or tissues can be further improved.
  • a surface antigen protein derived from a virus such as HBV is used in the hollow nanoparticles that are effective in the present invention, it is not necessary to use a host cell recognition structure derived from the virus as the target structure recognition site. It can be replaced with another anatomical structure recognition site described above. For example, the hepatocyte recognition site of HBV may be modified to another target recognition site .
  • the L protein of the HBV-derived surface antigen protein HBsAg lacks the hepatocyte recognition site originally possessed.However, by introducing another target structure recognition site at the N-terminal side, or at the C-terminal side By introducing a target structure recognition site, it becomes possible to transport and introduce a substance specifically to any cell or tissue other than hepatocytes.
  • the hollow nanoparticles according to the present invention are constructed by constructing a chimeric gene in which a gene encoding the particle-forming protein and a polynucleotide encoding the biological structure recognition site are linked to each other, and introducing the gene into a eukaryotic cell for expression. It can be produced by doing.
  • a chimeric gene in which a gene encoding the particle-forming protein and a polynucleotide encoding the biological structure recognition site are linked to each other, and introducing the gene into a eukaryotic cell for expression. It can be produced by doing.
  • the proteins are expressed and accumulated as membrane proteins on the endoplasmic reticulum membrane and released (secreted) as hollow nanoparticles.
  • the eukaryotic cells used in the present invention are not particularly limited, and include any of yeast, insect cells, and animal cells.
  • the method for constructing the chimeric gene is not particularly limited, and any known gene recombination technique may be used. Specifically, for example, when a gene encoding a surface antigen protein derived from a virus is used as the gene encoding the particle-forming protein, the gene which is located on the carboxyl-terminal side of the surface antigen protein in the gene is used. A polynucleotide encoding a body structure recognition site may be connected to construct a chimeric gene, which may be used as an expression vector.
  • Various DNA segments such as a promoter contained in the expression vector are not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the type of eukaryotic cell to be a host.
  • a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be suitably used.
  • the present invention may be a mutated gene as long as it has a particle-forming ability that is not limited to this./, and is complementary to a DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. It may be a homologous gene that hybridizes with a DNA consisting of a base sequence under stringent conditions.
  • stringent conditions refers to hybridization only when at least 90% identity, preferably at least 95% identity, and most preferably at least 97% identity exists between the sequences. It means that Chillon will happen.
  • virus-derived host cell-recognizing structure, antigenic determinant, and ligand that can be used as a biological structure-recognizing site that is not particularly limited as to the polynucleotide encoding the biological structure-recognizing site
  • a gene encoding a peptide molecule or the like can be suitably used (for example, see the examples described below).
  • a biostructure recognition site when introducing a biostructure recognition site into the particle-forming protein, it is preferable to design a chimeric gene so as to replace the amino acid sequence on the terminal side of the particle-forming protein.
  • the chimeric gene be constructed so that the amino acid sequence at the terminal side of the protein having the ability to form particles is replaced with a biological structure recognition site.
  • unnecessary amino acid sequences can be eliminated, so that the biostructure recognition site can be reliably displayed on the surface of the hollow nanoparticle.
  • a spacer sequence having an arbitrary number of amino acid residues can be used. You can set it up. This enables efficient substitution or addition.
  • the expression of the chimeric gene in eukaryotic cells releases the eukaryotic cell hollow nanoparticles, which are further included in the biological structure recognition site.
  • a substance (carrier) having a chemical structure recognized by the identification site is immobilized according to the structure serving as the identification site to be used, and the hollow nanoparticle is purified using the solid phase. This allows for efficient purification.
  • the carrier used at this time is not particularly limited, and a known carrier can be suitably used.
  • the purification method is not particularly limited, and a known method such as column chromatography can be suitably used.
  • the hollow nanoparticles according to the present invention can be suitably used as various drugs by encapsulating a cell-introducing substance inside. That is, the hollow nanoparticles according to the present invention can be applied as nanocapsules for delivering genes and drugs specifically to disease sites. As a result, each of the biostructure recognition sites that can efficiently deliver genes and drugs encapsulated in hollow nanoparticles to target diseased cells or diseased tissues can be achieved. This allows the simultaneous delivery of genes and drugs to different cells and tissues, respectively. In the case of a gene, the present invention can be used not only for gene transfer methods such as various transformations but also for gene therapy.
  • the cell introduction substance used at this time is not particularly limited, but may be any compound having a gene or a pharmacological action. More specifically, there may be mentioned, for example, genes such as DNA and RNA; oligonucleotides; natural and synthetic proteins and peptides; drugs such as natural or synthetic compounds; and the like.
  • RNasel Jinno H, Ueda M, Ozawa S, Ikeda T, Enomoto K, Psarras K, Kitajima M, Yamada H, Seno M Life Sci. 1996) already reported by the inventors. ; 58 (21): 1901-8) or RNase3 (alias ECP: eosinophil cationic protein; Mallorqu G Fernandez G, Pous J, Peracaula R, Aymami J, Maeda T, Tada H, Yamada H, Seno M, de Llorens R, Gomis- Ruth FX, Coll M; J Mol Biol. 2000 Jul
  • tumor suppressor genes such as p53
  • interferons interleukins
  • cytokins colony stimulating factors
  • tumor necrosis factors tumor necrosis factors
  • platelet-derived growth factors And proteins such as erythropoietins and Fas antigens, or genes encoding the proteins.
  • the method for producing the drug according to the present invention that is, the method for encapsulating the above-mentioned cell-introduced substance into the above-mentioned hollow nanoparticles is not particularly limited, and various methods used in known chemical and molecular biological experimental techniques can be used. Applied. For example, an election port method, an ultrasonic method, a simple diffusion method, a method using a charged lipid, and the like can be used.
  • a method of forming particles by fusing the cell-introducing substance with the particle-forming protein is also available.
  • Cell-introduced material into particle-forming proteins can be performed by constructing a plasmid in which a gene encoding hepatitis B virus surface antigen protein and a gene encoding the above protein drug are linked in frame, and using this plasmid, Causes the nucleus cells to form particles.
  • a drug in which a protein drug is fused to the hepatitis B virus surface antigen protein can be produced.
  • the hollow nanoparticles according to the present invention are used as a drug, they can be used in a method for treating a disease using the drug.
  • the above drug is administered into the body by intravenous injection or the like, the particles circulate in the body, are guided to hepatocytes by the hepatocyte-specific receptor presented on the surface of the particles and the recognition site presented on the surface, and become infected. Then, the cell-introduced substance is fed into hepatocytes, and the liver tissue-specific introduction of the cell-introduced substance is performed.
  • the method of administering the drug include intravenous injection, oral administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, and subcutaneous administration.
  • a substance can be specifically introduced into cells or tissues in vivo, and the substance can be introduced into specific cells or fibroblasts in vitro.
  • the introduction can be done as a treatment or a step in the treatment of various diseases.
  • [0075] In addition to drugs, they can be used as various experimental reagents and kits. For example, more efficient gene transfer can be achieved by using the gene transfer method (transformation method).
  • HBsAg is a hepatitis B virus that is a coat protein of HBV. 5 shows the hepatitis B virus surface Antigen. HBsAg contains an S protein composed of 226 amino acids. S protein with 55 amino acids (pre-S2 peptide) added to the N-terminal side of M protein, M protein, and 108 or 119 amino acids (pre-Si peptide) at the N-terminal side of M protein The thing is L protein.
  • Pre-SI Pre-S2
  • pre-S1 has a site that directly binds to hepatocytes
  • pre-S2 is a polymerized albumin receptor that binds to hepatocytes via polymerized albumin in blood.
  • HBsAg L protein When HBsAg L protein is expressed in eukaryotic cells, the protein is expressed and accumulated as a membrane protein on the endoplasmic reticulum membrane.
  • the HBsAg L protein causes intermolecular aggregation and is released as particles into the rumen in a budding manner while taking up the endoplasmic reticulum membrane. Released inside.
  • the expression plasmid pTB1455 for animal cells (described in j. Biotechnol., Vol. 33 :, No. 2, 157-174, 1994) was cut with the restriction enzyme EcoRI, and the ends were blunt-ended by treatment with Klenow DNA polymerase. did.
  • HBsAg L protein expression plasmid PB0441 for animal cells.
  • the nucleotide sequence of the HBsAg L protein encoded by pB0441 is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • pB0611 a plasmid DNA into which the desired mutation was introduced
  • the Strep-tagll is a peptide that binds to streptavidin with high affinity like streptavidin, and also has the amino acid sequence strength of WSHPQFEK in the order of N-terminal strength.
  • C-4-Strep has a spacer sequence (SSSA) consisting of four amino acid residues between the C-terminal of HBsAg L protein and Strep-tagll! //.
  • SSSA spacer sequence
  • the name of the Strep-tagll fusion HBsAg L protein, the name of the plasmid DNA that expresses it, and the sequence actually fused to the C-terminus of the HBsAg L protein are shown in Table 1 (A).
  • Plasmid fusion protein name c-terminal amino acid sequence
  • Plasmid fusion protein name c-terminal amino acid sequence
  • PB0788 ⁇ 63-6-FLAG F L f Amino acid SEQ ID NO: is shown on the basis of S protein sequence.
  • a synthetic oligonucleotide (SEQ ID NO: 7 and its complementary SEQ ID NO: 8) encoding the HA-tag sequence was phosphorylated with T4 nucleotide kinase and then annealed.
  • the C-terminal Strep-tagll fusion HBsAg L protein expression plasmid pB0647 was cleaved with restriction enzymes Sacl and EcoRV to remove the Strep-tagll sequence, and then the synthetic oligonucleotide was inserted into the C-terminus.
  • This C-terminal HA-tag sequence fusion HBsAg L protein is the C-terminal of the HBsAg L protein. It has a spacer sequence (SSSGGSS) consisting of 7 amino acid residues between the and the HA-tag sequence.
  • Table 1 (A) shows the name of the HA-tag fusion HBsAg L protein, the name of the plasmid DNA that expresses it, and the sequence actually fused to the C-terminus of the HBsAg L protein.
  • HA-tag is an epitope peptide having a sequence of YPYDVPDYA from the N-terminus and binds to a commercially available anti-HA antibody (eg, Roche Diagnostics) with high affinity.
  • a synthetic oligonucleotide encoding a His-tag sequence (SEQ ID NO: 9 and its complementary SEQ ID NO: 10) was annealed after phosphorylation by T4 nucleotide kinase. Thereafter, the Strep-tagll fusion region of the C-terminal Strep-tagll fusion HBsAg L protein expression plasmid pB0647 was removed, and the C-terminal His-tag sequence was fused to the C-terminus by inserting the synthetic oligonucleotide. -A tag fusion HBsAg L protein expression plasmid was constructed.
  • the C-terminal His-tag sequence-fused HBsAg L protein has a spacer sequence (SSSGGSS) that has 7 amino acid residue power between the C-terminal of the HBsAg L protein and the His-tag sequence! / You.
  • Table 1 (A) shows the name of the His-tag-fused HBsAg L protein, the name of the plasmid DNA expressing the same, and the sequence actually fused to the C-terminus of the HBsAg L protein.
  • the His-tag is a peptide having a sequence of six consecutive His residues (HHHHHH) and has the ability to chelate a metal ion such as nickel or cobalt.
  • HHHHHH His residues
  • metal ion such as nickel or cobalt
  • the C-terminal FLAG-tag sequence fusion HBsAg L protein has a spacer sequence (SSSGGSS) consisting of 7 amino acid residues between the C-terminus of the HBsAg L protein and the FLAG-tag sequence! / RU Table 1 (A) shows the names of the FLAG-tag-fused HBsAg L proteins, the names of the plasmid DNAs that express them, and the sequences actually fused to the C-terminus of the HBsAg L protein.
  • SSSGGSS spacer sequence
  • FLAG-tag is a peptide having a DYKDDDDK sequence from the N-terminus, and binds to a commercially available anti-FLAG antibody (Sigma) with high affinity.
  • Example 2 Construction of plasmid expressing C-terminal FLAG-tag-fused HBsAg L protein with different spacer sequence lengths
  • the HBsAg L protein (C-7-FLAG) expression plasmid pB0747 having the FLAG-tag sequence fused to the C-terminus constructed in (4) of Example 1 was digested with the restriction enzymes Sacl and Xhol.
  • SEQ ID NO: 13 encoding the spacer sequence and a synthetic oligomer of SEQ ID NO: 14 complementary thereto, a synthetic oligomer of SEQ ID NO: 15 and complementary SEQ ID NO: 16, complementary to SEQ ID NO: 17
  • the terminal of the synthetic oligomer of SEQ ID NO: 18 or the synthetic oligomer of SEQ ID NO: 20 which encodes the thrombin recognition sequence in a spacer and its complementary SEQ ID NO: 20 was phosphorylated by T4 nucleotide kinase. The ones were each inserted.
  • Table 1 (A) shows the names of the FLAG-tag fusion HBsAg L proteins having spacer sequences of each length, the names of the expression plasmids, and the sequences actually inserted at the C-terminus of the HBsAg L protein. Show.
  • a plasmid expressing a fused HBsAg L protein having a long spacer sequence and having a thrombin recognition sequence, a FLAG-tag sequence, and a His-tag sequence simultaneously was also constructed.
  • the HBsAg L protein (C-17 (Trb) -FLAG) expression plasmid pB0767, in which the thrombin recognition sequence obtained above and the FLAG-tag sequence were fused was digested with the restriction enzyme EcoRV.
  • the synthetic sequence of SEQ ID NO: 21 encoding the His-tag sequence and its complementary SEQ ID NO: 22 One obtained by phosphorylating the end of the gomer with T4 nucleotide kinase was inserted.
  • Table 1 (A) shows the sequence of the C-terminal -tag portion encoded by the resulting plasmid # 0790.
  • Example 3 Construction of a plasmid expressing the HBsAg L protein in which a tag sequence is fused to the C-terminus with various C-terminal region deletions]
  • the HBsAg L protein expression plasmid pB0747 in which the FLAG-tag sequence was fused to the C-terminus constructed in Example 1 or the HBsAg L protein expression plasmid PB0710 in which the HA-tag sequence was fused was used as type III, and SEQ ID NO: 23 was used.
  • the site to be deleted is determined using the PCR-based site-directed mutagenesis method (QuickChangeTM Site-directed Mutagenesis Kit (Strategene)).
  • the restriction enzyme Sacl site was inserted before (specifically, after W201 in the S protein region).
  • digest with the restriction enzyme DpnI 10,000 U / ml: 1 cup, treat at 37 ° C for 1 hour, transform E. coli XL-1 Blue, extract the obtained colony force plasmid DNA, and A plasmid DNA having a Sacl site was selected.
  • PB0747 and pB0710 used as type ⁇ have a Sacl site at the C-terminal thereof, and this mutation means that the second Sacl site has been inserted.
  • the obtained plasmid DNA was digested with the restriction enzyme Sacl, and the ligation reaction was performed to remove the portion sandwiched between the Sacl sites (25 amino acid residues at the C-terminal region of the HBsAg L protein).
  • the lost FLAG-tag fused HBsAg L protein ( ⁇ 25-6-FLAG) expression plasmid ⁇ 0748 and the HA-tag fused HBsAg L protein ( ⁇ 25-6-HA) expression plasmid pB0744 were constructed.
  • the name, the name of the plasmid, and the sequence actually fused to the C-terminus of the HBsAg L protein are shown in Table 1 (B).
  • Example 3 (1) Using PB0747 or pB0710 as the type I plasmid DNA, and using the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 25 and the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 26 as the primer for mutation introduction, the same operation as in Example 3 (1) was performed.
  • HBsAg HBsAg L protein fused to FLAG-tag with deletion of 130 amino acid residues in C-terminal region of L protein ⁇
  • FLB-tag-fused HBsAg L protein ( ⁇ 11-6-FLAG) expression plasmid pB0792, pB0793 ( ⁇ 33-6-FLAG) with deletion of 63 amino acid residues (mutation introduction primers: SEQ ID NOs: 37 and 38) , PB0794 ( ⁇ 45-6-FLAG), pB0789 ( ⁇ 58-6-FLAG), pB0788 ( ⁇ 63-6-FLAG).
  • Table 1 (B) shows the name of each obtained tag fusion protein, the name of the plasmid, and the sequence actually fused to the C-terminus of the HBsAg L protein.
  • the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 25 and the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 26 were mutated to type II using the HBsAg L protein expression plasmid PBO790 in which the FLAG-tag and His-tag sequences were continuously fused.
  • An expression plasmid pB0791 was created.
  • the monkey kidney-derived cell line COS7 was cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 5% of fetal calf serum (FBS) at 37 ° C under 5% C02.
  • COS7 cells were suspended in DMEM medium containing 10% fetal calf serum (FBS) at a concentration of 3 ⁇ 104 cells / ml, and seeded in 3.5-cm dishes at 1.5 ml each, at 37 ° C and 5% C02. Cultured for 15 hours.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal calf serum
  • IMX HBsAg Atsay System manufactured by Dynabot
  • IMX HBsAg Atsay System manufactured by Dynabot
  • HBsAg antigen secreted into the culture supernatant was detected.
  • HBsAg antigen was detected in the culture supernatant, it was determined that HBsAg L particles were formed and secreted, whereby the presence of each C-terminal tag-fused HBsAg L particle in the culture solution was confirmed.
  • FIG. 2 (A) —FIG. 2 (C) shows each C-terminal tag detected by the above-described method using various C-terminal tag fusion H BsAg L protein expression plasmids constructed in Examples 1 and 3, respectively.
  • 4 is a graph showing the results of fusion HBsAg L particle secretion. The amount of secretion of each particle is shown as a relative value (%) of the HBs antigen equivalent when the wild-type HBsAg L protein is taken as 100.
  • the result of the culture supernatant using the plasmid containing no HBsAg L gene was used as a negative control (negative: mock in the figure).
  • FIG. 2 (A) As shown in Figure 2 (C), C- 7- ⁇ , ⁇ 54-6-HA, A54-6-FLAG, and A45-6-FLAG showed more than 40% of wild-type particles.
  • HBsAg L particle secretion force The secretion was low, about 10% of other tag fusion wild type particles.
  • Each experiment was performed three times or more, and the deviation value is indicated by a bar.
  • the protein in the obtained electrophoresis gel was electrotransferred to a PVDF membrane (Bio-rad), and the primary antibody was a goat anti-HBsAg antibody from IMX HBsAg Atssey System (Dynapot) 'Piotin conjugate, secondary HBsAg L particles in the culture supernatant were detected by Western blotting using an alkaline phosphatase-labeled ⁇ heron anti-biotin antibody as the antibody. Alkaline phosphatase activity is CDP-starTM
  • Detection was performed using Chemiluminescent Substrate (NEB) (Fig. 3A). As a result, a band of each tag fusion protein having a high intensity was detected, which is inconsistent with the result of measurement of the amount of secretion in the culture supernatant shown in FIGS. 2 (A) and 2 (C).
  • NEB Chemiluminescent Substrate
  • HRP activity was detected using Western LighteningTM and nemiluminescence Reagent Plus (Perkin Elmer Life Sciences) (Fig. 3B).
  • anti-FLAG-tag antibody-immobilized beads were added to 4 ml of the culture supernatant obtained by transfection of each expression plasmid DNA into COS7 cells according to the method described in Example 4, (1).
  • Anti-FLAGR M2 agarose affinity gel, Sigma (1: 1 suspension) or anti-HA-tag antibody immobilized beads ⁇ (Monoclonal anti-HA agarose conjugate clone HA-7, Sigma) (1: 1 suspension) was placed in each of 30 1 pans and placed at 1 ⁇ and 4 ° C. while slowly rotating the tubes.
  • the beads immobilized with anti-FLAG-tag antibody were treated with 10% Block Ace (Snow Brand Milk Products) and treated at 4 ° C for 30 minutes or more.
  • the particles in the medium were sedimented together with the beads using a table-top high-speed centrifuge for 3 minutes, and TBST (10 mM
  • Tris-HCl buffer pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20 was added to suspend, and the washing operation of collecting the precipitate by centrifugation was repeated 5 times.
  • This precipitate was subjected to SDS-PAGE under reducing conditions in the same manner as in Example 4, (3), and the primary antibody was a goat anti-HBsAg antibody 'Piotin conjugate of IMX HBsAg Assay System (Dynapot). Then, Western blotting was performed using an alkaline phosphatase-labeled ⁇ heron anti-biotin antibody as the secondary antibody (FIG. 4A).
  • the primary antibody has an anti-HA-tag antibody 'biotin conjugate (Anti- [HA] -biotin, Diagnostics)! /
  • An anti-FLAG-tag antibody-biotin conjugate (Anti- FLAGR biotinylated M2 monoclonal antibody (Sigma) was reprobed using horseradish peroxidase (HRP) -labeled avidin (Zymed) as a secondary antibody.
  • HRP activity was detected with Western LighteningTM and nemiluminescence Reagent Plus (Perkin Elmer Life Sciences) (Fig. 4B).
  • HRP activity was detected with Western LighteningTM and nemiluminescence Reagent Plus (Perkin Elmer Life Sciences) (Fig. 4B).
  • Example 6 Concentration and purification of C-terminal tag-fused HBsAg L particles by affinity chromatography
  • Anti-FLAG-tag antibody-immobilized beads (Anti-FLAG M2 agarose affinity gel, Sigma) are packed into the column so that the bed volume becomes 0.35 ml. And equilibrated with Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS). After passing 10 ml of the ⁇ 54-6-FLAG or ⁇ 45-6-FLAG expression culture supernatant obtained above through this column to adsorb the particles, 300 ⁇ L of 0.1 M phosphate buffer (pH 3.5) was added. The particles were eluted seven times.
  • PBS Dulbecco's phosphate buffered saline
  • the eluate was previously fractionated in a tube containing 27 ⁇ L of 2 ⁇ phosphate buffer (pH 8.0).
  • the concentration of particles contained in the culture supernatant and the column eluate was measured using an IMXHBsAg Atssey system, and the total protein concentration was estimated from the absorbance at 280 nm.
  • purified particles that were concentrated 4-to 5-fold by the purification of the anti-FLAG-tag antibody-immobilized column could be obtained with a recovery rate of 30 to 40%.
  • the results are summarized in Table 2 below. In each case, purification was 100 times or more.
  • the column was packed with TALON Co-resin (CLONETECH) so as to have a bed volume of 0.4 ml, and equilibrated with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) and 0.3 M NaCl.
  • 50 ml of the culture supernatant for expression of HBsAg L particles with His-tag obtained above was passed through this column to adsorb the particles.
  • the N-terminal PreS region (human hepatocyte recognition region) is conserved, so that human hepatocyte-specific infectivity is similar to that of wild-type HBsAg L particles. Hold
  • HBsAg L particles purified in the above-described manner were passed through a Sephadex G25 (Amersham) column equilibrated with Dulbecco's PBS to replace the buffer.
  • Particles (HBsAg concentration: 10-500 ng / ml) were mixed with luciferin (yellow fluorescent substance, Dotite) to a final concentration of 10 mM to make a liquid volume of 0.5 ml, and then placed in a electoration chamber for electoration. From the election port (condition: 220 V, 950 ⁇ F), luciferin was sealed inside the particles.
  • a human liver cancer-derived cell line HepG2, a human squamous cell carcinoma-derived cell line A431, and Hamster-derived CHO cells were seeded on 8-well chamber slides and cultured for 1 day to prepare 70-80% confluent cells. These cells were supplemented with the luciferin-encapsulated particles prepared above, and cultured for 8 to 16 hours. Each well was washed twice with a medium to remove free lucine, and then the luciferin incorporated into the cells was observed with a confocal laser microscope.
  • Example 7 Preparation of plasmid expressing C-terminal betacellulin (BTC) -fused HBsAg L protein particle
  • a human BTC sequence was further fused to the plasmid expressing the particle obtained by fusing the tag sequence to the C-terminus of the HBsAg L protein or the C-terminal region-deficient HBsAg L protein described in Examples 2 and 3 via a spacer.
  • an HBsAg L protein particle expression plasmid displaying BTC on the particle surface was prepared.
  • the BTC is a growth factor belonging to the human epidermal growth factor (EGF) family and has a high affinity for the EGF receptor (EGFR) on cells. Therefore, the ability to recognize EGFR-positive cells through binding of BTC fused to the C-terminus and EGFR is expected.
  • EGF epidermal growth factor
  • a plasmid encoding the human BTC sequence described in Growth Factors Vol. 13, pl81-191, pB041 as a type III, and a synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 39 to which an Ndel sequence was added and a PvuII sequence were synthesized.
  • a PCR reaction was performed using the added synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 40 as a primer to amplify a gene fragment containing the EGF domain sequence of BTC, and the amplified DNA was cloned into a pCRR2.1 vector (Invitrogen). .
  • the gene fragment containing the BTC sequence was cut out with restriction enzymes Ndel and PvuII.
  • the pB0790 or pB0791 prepared in Example 2 and Example 3 was digested with restriction enzymes Ndel and PvuII, and the above BTC gene fragments were inserted, respectively, to prepare a C-terminal BTC-fused HBsAg L particle expression plasmid. .
  • the BTC sequence fused to the C-terminus of the HBsAg L protein in these plasmids is shown in FIG. In the figure, HBsAg
  • the Sad site used for fusion with the L protein is indicated by a wavy line
  • the Ndel site introduced for insertion of the betacellulin (EGF domain) sequence is indicated by a dotted line
  • the PvuII site is indicated by a double underline.
  • the FLAG-tag sequence is shown in bold
  • the ZZ-tag sequence is underlined
  • the His-tag sequence is shown in italics.
  • Example 6 (1) the plasmid for expressing the C-terminal BTC-fused HBsAg L particles was transfected into COS7 cells, and the culture supernatant was collected. As a result of measuring the amount of particles in the culture supernatant using an IMX HBsAg assay kit using an anti-HBsAg antibody, secretion of particles into the culture supernatant was confirmed.
  • the C-terminal BTC-fused HBsAg L protein particle has a human hepatocyte-specific infectivity due to the N-terminal PreS region (human hepatocyte recognition region) and an infectivity due to the specificity of BTC newly displayed on the surface.
  • EGFR is overexpressed in many cancer cells, and ligand ⁇ antibodies that bind to EGFR have been used as targets for liver cancer cells.
  • wild-type HBsAg L particles or BTC protein were added to each cell and incubated at 4 ° C for 30 minutes to block the receptor on the cells. After that, luciferin-encapsulated particles were added and the cells were cultured for 6 hours and observed. HepG2 cells contain wild type lucine In the case of adding HBsAg L particles, the pretreatment of wild-type HBsAg L particles significantly reduced the introduction of calcein, whereas the addition of luciferin-encapsulated BTC-fused HBsAg L particles only reduced the amount slightly. Was.
  • Example 10 Preparation of plasmid expressing C-terminal ZZ-tag fused HBsAg L protein particle
  • the ZZ-tag sequence was further fused to the plasmid expressing the particle in which the tag sequence was fused to the C-terminus of the HBsAg L protein via a spacer described in Example 3, and the ZZ-tag sequence was further fused to the particle surface.
  • the indicated HBsAg L protein particle expression plasmid was constructed.
  • the ZZ-tag is defined as an amino acid sequence encoding the Fc region binding region of immunoglobulin G of ProteinA derived from Staphyrococcus aureus (the ZZ tag sequence:
  • FIG. 6 shows sequences added to the HBsAg L protein region in these plasmids.
  • Sacl site used for fusion with the HBsAg L protein is indicated by a wavy line
  • the Ndel site introduced for insertion of the ZZ_tag sequence is indicated by a dotted line
  • the PvuII site is indicated by a double underline.
  • the FLAG-tag sequence is shown in bold
  • the ZZ-tag sequence is underlined
  • the His-tag sequence is shown in italics.
  • Example 6 (1) the plasmid for expressing the C-terminal ZZ-tag-fused HBsAg L particles was transfected into COS7 cells, and the culture supernatant was collected. The amount of particles in the culture supernatant was measured using an IMX HBsAg Atssay kit using an anti-HBsAg antibody, and as a result, secretion of particles into the culture supernatant was confirmed.
  • the ZZ-tag sequence has high affinity for the Fc portion of the antibody molecule and specifically binds to, for example, the mouse monoclonal antibody 7G7B6 against the human EGF receptor (EGFR), which is a cancer-specific antibody be able to.
  • EGFR human EGF receptor
  • C-terminal ZZ-tag-fused HBsAg L protein particles were prepared by binding the antibody to the C-terminal ZZ-tag-fused HBsAg L protein particles described above.
  • the antibody-presented C-terminal ZZ_tag-fused HBsAg L protein particles are capable of infecting human hepatocytes specifically with the N-terminal PreS region (human hepatocyte recognition region) and the specificity of the newly displayed antibody on the surface. Sexually transmitted.
  • a human liver cancer-derived cell line, HepG2, and a human squamous cell carcinoma-derived cell line, A431, which overexpresses EGFR, and EGFR almost expressed! /, Na! /! Hamster-derived CHO cells Were seeded on 8-well chamber slides and cultured for 1 day.
  • the luciferin-encapsulated particles prepared above were added to these cells and cultured for 6 to 16 hours. After the free luciferin was washed with the medium, it was observed with a confocal laser microscope.
  • the use of C-terminal ZZ-tag-fused HBsAg L particles presenting anticancerin-encapsulated anti-EGFR antibody enhanced the introduction of luciferin into Hep G2 cells and A431 cells.
  • wild-type HBsAg L particles were added to each cell, incubated at 4 ° C for 30 minutes, and then fusion anti-EGFR antibody-presenting HBsAg L particles with luciferin were added. Furthermore, when observed after culturing for 6 hours, the ability to transduce A431 cells pretreated with wild-type HBsAg L particles was not reduced, but the transduction of luciferin into HepG2 cells was slightly reduced. When each cell was pretreated with an anti-EGF antibody or BTC protein, the introduction of luciferin into A431 cells only slightly reduced the ability to transduce HepG2 cells. Simultaneous pretreatment with wild-type HBsAg L particles and BTC protein greatly reduced the ability to transfect HepG2 cells.
  • C-terminal ZZ-tag-fused HBsAg L protein particles displaying the anti-TfR antibody on the particle surface and enclosing luciferin inside were produced.
  • a human hepatoma-derived cell line, HepG2, and a human breast cancer-derived cell line, MCF7, which overexpresses TfR, and mouse normal fibroblasts without human TfR, Balb / C 3T3 A31 cells, were each cultured at 8 Welch. Yambar slides were seeded and cultured for one day.
  • the anti-TfR antibody-presenting particles encapsulating luciferin prepared as described above were added to these cells, and cultured for 6 to 16 hours.
  • a human liver cancer-derived cell line HepG2 (CD40-positive) and a CD40-negative human breast cancer-derived cell line MCF7 were each seeded on 8-well chamber slides and cultured for 1 day.
  • the anti-CD40 antibody-presenting particles containing luciferin prepared as described above were added, and cultured for 6 to 16 hours. After free lucine was washed with the medium, it was observed with a confocal laser microscope.
  • the use of HBsAg L particles presenting anti-CD40 antibody encapsulating anti-CD40 antibody did not induce the transfection of HepG2 cells into MCF7 cells, which are non-hepatocytes that are negative for CD40 antigen. .
  • wild-type HBsAg L particles were added to each cell and incubated for 30 minutes, and then HBsAg L particles displaying the anti-CD40 antibody containing luciferin were added. Furthermore, observation after 6 hours of culture showed that the introduction of luciferin into HepG2 cells pretreated with wild-type HBsAg L particles was maintained. Forced lucein transduction into HepG2 cells pretreated with anti-CD40 antibody was also maintained. The induction of luciferin into HepG2 cells pretreated with anti-CD40 antibody and wild-type HBsAg L particles was greatly reduced.
  • the present invention enables efficient delivery of hollow nanoparticles to target cells and tissues, simplifies purification of the nanoparticles, and enhances its practicality when used as a drug or the like. Can be further increased.
  • the present invention can be used as a nanocapsule that can be used in a drug delivery system in various reagent industries that can be used only in the medical and pharmaceutical industries.

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Abstract

　精製が簡便で、標的となる細胞または組織に細胞導入物質を効率よく導入することが可能な中空ナノ粒子を提供する。 　本発明にかかる中空ナノ粒子は、粒子形成能を有するタンパク質により形成され、生体構造認識部位を表面に提示している。この生体構造認識部位は、上記タンパク質のＮ末端・Ｃ末端の双方に設けられており、それぞれの生体構造認識部位が認識する生体由来の化学構造は異なる。その少なくとも一方は、標的細胞・組織に特異的な構造を認識する標的構造認識部位であり、何れか一方は、中空ナノ粒子を特異的に認識する識別部位として機能することが好ましい。例えば、標的構造認識部位としては、Ｂ型肝炎ウィルスの肝細胞認識部位を、識別部位としては各種タグ配列等を挙げることができる。

Description

明 細 書
生体構造認識部位を提示する中空ナノ粒子およびその生産方法、並び にその利用
技術分野
[0001] 本発明は、生体構造認識部位を提示する中空ナノ粒子およびその生産方法とその 利用とに関するものであり、より詳細には、少なくとも粒子形成能を有するタンパク質 からなり、さら〖こ、表面に生体構造認識部位を提示する中空ナノ粒子およびその生 産方法と、その代表的な利用の一例とに関するものである。
背景技術
[0002] 近年、医学の分野にぉ 、て、患部に直接作用し、高 、効果を示す副作用の少な い薬品の開発が盛んに行われている。特に、ドラッグデリバリーシステム（DDS)と呼 ばれる方法は、目的細胞あるいは目的糸且織に対して特異的に薬剤等の有効成分を 運搬し、目的箇所で有効成分を作用させることのできる方法として注目されている。
[0003] また、最近の分子細胞生物学の分野においても特定細胞への遺伝子導入は必要 不可欠な技術として盛んに研究されている。さらに、ヒトゲノム計画の進展により各種 疾患の遺伝的な背景が明らかになりつつある現在、このような細胞および組織に対 する特異性の高 、遺伝子導入法が確立されれば、遺伝子治療の分野での応用も可 能となる。
[0004] 細胞または組織に遺伝子を導入する方法 (遺伝子導入法）としては、すでに様々な 方法が提案されている。代表的なものとしては、（1)特異的に薬剤となるタンパク質を コードする遺伝子が組み込まれた発現プラスミドを、電気パルス刺激により細胞膜に 穿孔を開けて流入させるエレクト口ポレーシヨン法、（2)パーティクルガン (遺伝子銃） 等により目的細胞に導入して、この遺伝子を細胞内で発現させることにより当該タン ノ ク質を細胞内に送り込むパーティクルデリバリー法等が挙げられる。
[0005] けれどもこれらの遺伝子導入法は、簡便ではあるが、細胞を物理的に傷つけ、遺伝 子導入部位を外科的に露出させる必要がある。そのため、生体内部の細胞や組織に は容易に適用できない。また、 100%近い導入率を得ることも困難となっている。 [0006] さらに、感染性ウィルスを用いて遺伝子導入法を行う技術が開発されている。この方 法は、ウィルス DNAに目的の遺伝子を組み込んだ感染性ウィルスを生成し、目的細 胞を感染させて遺伝子を導入する。この方法では、上述した各遺伝子導入法のよう に、導入部位を露出させる必要がなぐ個体にも応用でき、導入効率も 100%近い画 期的な方法として注目されている。し力しながら、ウィルスが広範囲の細胞に非特異 的に感染するため目的の細胞以外にも遺伝子が導入されてしまうという問題が生じる
[0007] このように、従来の遺伝子導入法は、いずれも、目的の細胞に対して特異的に遺伝 子を送り込み、細胞内で薬剤となるタンパク質を発現させる方法としては不十分なも のであった。他方、薬剤となるタンパク質を直接的に目的細胞、あるいは、目的組織 に送り込む方法にっ 、ては、未だ有効な方法が開発されて 、な 、状況にあった。
[0008] そこで本発明者らは、新規な遺伝子導入法として、目的とする細胞や組織に、物質
(遺伝子、タンパク質、化合物等)を運搬、導入するため方法として、粒子形成能を有 するタンパク質を用いて形成される中空ナノ粒子を用いた技術を提案した (特許文献 1 :特開 2001— 316298 (公開曰： 2001年 11月 13曰））。
[0009] この技術では、粒子形成能を有するタンパク質に対して、そのアミノ酸配列の N末 端に、特定の細胞または組織に対する認識能を有した生体構造認識部位を導入し て!、る。上記生体構造認識部位を導入したタンパク質を中空ナノ粒子として用いるこ とにより、物質 (遺伝子、タンパク質、化合物等)を特定の細胞あるいは組織に運搬、 導入することが可能となる。それゆえ、この技術は、上述したような遺伝子治療等の分 野への応用が非常に期待できるものとなっている。
発明の開示
[0010] ところで、上記中空ナノ粒子を利用する場合には、その用途に応じて、実用性を高 めるための工夫が必要となる。
[0011] また、上記遺伝子導入法に上記中空ナノ粒子を用いる場合には、当該中空ナノ粒 子を精製する必要がある。ここで、従来までの中空ナノ粒子の精製方法としては、例 えば、勾配をかけた CsClあるいはショ糖を用いた超遠心を繰返し行う方法、透析を 繰り返し行う方法等を挙げることができるが、これら精製方法は煩雑であり、多くの時 間を必要とする。それゆえ、実用性をより高めるためには、中空ナノ粒子の精製をより 効率的にすることが非常に好ましい。
[0012] また、 DDS等の用途においては、中空ナノ粒子内に封入した薬剤となる物質を効 率良く特定の細胞または組織に送達する必要がある。このように送達の効率性を高 めるためには、組織や細胞側の受容体数が少ない場合、 N末端に導入した生体構 造認識部位が何らかの物質で阻害された場合、さら〖こは、他の分子と競合して受容 体認識に支障がある場合を考慮する必要がある。
[0013] このように、上記中空ナノ粒子の技術は、それ自体画期的な技術ではあるものの、 実用性をより高めるためには、さらなる改良が求められる。
[0014] そこで、本発明は、精製が簡便で、標的となる細胞または組織に細胞導入物質を 効率よく導入することが可能な中空ナノ粒子とその生産方法、利用法の一例を提供 することを目的としている。
[0015] 本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ヒト B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を 利用して N末端部以外の部分 (C末端領域）に種々の標的認識部位を融合すること により、精製が簡便で、標的となる細胞または組織に細胞導入物質を効率よく導入す ることが可能で、実用性をより向上させた中空ナノ粒子を提供できることを見出し、本 発明を完成させるに至った。
[0016] すなわち、本発明にかかる中空ナノ粒子は、粒子形成能を有するタンパク質により 形成され、生体由来の化学構造を認識する生体構造認識部位を表面に提示する中 空ナノ粒子にぉ 、て、上記粒子形成能を有するタンパク質のァミノ末端およびカルボ キシル末端の双方に、上記生体構造認識部位が設けられているとともに、それぞれ の生体構造認識部位が認識する生体由来の化学構造は異なっていることを特徴とし ている。
[0017] 上記中空ナノ粒子においては、上記生体構造認識部位の少なくとも一方は、標的 となる細胞または組織に特異的な構造を認識する標的構造認識部位であり、上記生 体構造認識部位の何れか一方は、中空ナノ粒子そのものを特異的に認識するため の識別部位として機能することが好ま 、。
[0018] 上記生体構造認識部位は、ウィルス由来の宿主細胞認識構造、抗原決定基、リガ ンド、リガンドの受容体の少なくとも何れかを挙げることができる。このうち、上記ウィル ス由来の宿主細胞認識構造として、例えば、 B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質に おける肝細胞認識部位を挙げることができる。また、上記抗原決定基としては、例え ば、タグ配列を挙げることができる。このタグ配列としては、 Strep-tag II、 HA-tag、 FLAG-tagの少なくとも何れかを挙げることができる。さら〖こ、上記生体構造認識部位 は、複数種類のタグ配列を組み合わせてなるものであってもよ 、。
[0019] また、上記リガンドとしては、例えば、細胞増殖因子を挙げることができる。この細胞 増殖因子としては、上皮増殖因子または繊維芽細胞増殖因子を挙げることができる。 また、抗体認識部位としての機能をもつ ZZ-tagもリガントとして含むことができる。
[0020] さらに、上記生体構造認識部位は、タグ配列とリガンドとを組み合わせてなるもので あってもよい。
[0021] 上記中空ナノ粒子の具体的な一例としては、上記粒子形成能を有するタンパク質 力 ウィルス由来の表面抗原タンパク質であり、当該表面抗原タンパク質の末端部に 存在する宿主細胞認識構造を上記標的構造認識部位として用いる例を挙げることが できる。このとき、上記粒子形成能を有するタンパク質としては、 B型肝炎ウィルス表 面抗原タンパク質を挙げることができる。
[0022] また、上記中空ナノ粒子においては、上記抗原決定基および Zまたはリガンドが、 中空ナノ粒子そのものを特異的に認識するための上記識別部位として設けられてい ることが好ましい。
[0023] さらに、上記中空ナノ粒子においては、上記生体構造認識部位は、粒子形成能を 有するタンパク質の末端側のアミノ酸配列を置換することにより、当該タンパク質に導 入されていてもよい。
[0024] 本発明にかかる中空ナノ粒子の生産方法は、少なくとも粒子形成能を有するタンパ ク質により形成され、生体由来の化学構造を認識する生体構造認識部位を表面に提 示する中空ナノ粒子の生産方法において、当該中空ナノ粒子が、上記粒子形成能 を有するタンパク質のァミノ末端およびカルボキシル末端の双方に、上記生体構造 認識部位が設けられており、かつ、各生体構造認識部位が認識する生体由来の化 学構造は異なって ヽるものであり、上記粒子形成能を有するタンパク質をコードする 遺伝子と、上記生体構造認識部位をコードするポリヌクレオチドとをつなげたキメラ遺 伝子を構築し、これを真核細胞に導入して発現させることを特徴として ヽる。
[0025] 上記生産方法にお!、ては、上記真核細胞は、酵母、昆虫細胞または動物細胞の 何れかであることが好ましい。また、上記生産方法においては、上記粒子形成能を有 するタンパク質をコードする遺伝子として、ウィルス由来の表面抗原タンパク質をコー ドする遺伝子が用いられるとともに、当該遺伝子における、表面抗原タンパク質の力 ルポキシル末端側となる側に、生体構造認識部位をコードするポリヌクレオチドをつ なげること〖こより、上記キメラ遺伝子を構築すればよい。このとき、上記キメラ遺伝子は 、上記粒子形成能を有するタンパク質の末端側のアミノ酸配列を、生体構造認識部 位に置換するように構築されて 、ることが好ま 、場合がある。
[0026] 上記生産方法においては、さらに、上記識別部位により認識される化学構造を有 する物質を担体として用いて、上記中空ナノ粒子を精製することが好ましい。
[0027] 本発明の利用の一例としては、上記中空ナノ粒子に細胞導入物質が封入されてい る薬剤を挙げることができる。この薬剤においては、上記細胞導入物質が、遺伝子ま たは薬理作用を有する化合物であればよい。また、本発明の他の利用としては、この 薬剤を用いる疾患の治療方法等を挙げることができる。
[0028] 本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十 分わ力るであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白にな るであろう。
図面の簡単な説明
[0029] [図 1]本発明に係る複数の生体構造認識部位を提示するタンパク質中空ナノ粒子を 示す模式図である。
[図 2(A)]本発明の一実施形態における C末端タグ (tag)融合 HBsAg Lタンパク粒子 の培養上清への分泌を示すグラフである。
[図 2(B)]本発明の一実施形態における C末端タグ (tag)融合 HBsAg Lタンパク粒子 の培養上清への分泌を示すグラフである。
[図 2(C)]本発明の一実施形態における C末端タグ (tag)融合 HBsAg Lタンパク粒子 の培養上清への分泌を示すグラフである。 圆 3(A)]本発明の一実施形態における C末端タグ (tag)融合 HBsAg Lタンパク粒子 を、抗 HBsAg抗体によって免疫沈降させた結果を示す図であり、各泳動レーンは、 1が野生型 HBsAgLタンパク質、 2が陰性対照、 3が C-7-FLAG、 4が A25-6-FLAG 、 5が Δ54- 6- FLAG、 6が C- 7- HA、 7が Δ25- 6- HA、 8が Δ54- 6- HA、 9が Δ 11- 6- FLAG、 10が Δ33- 6- FLAG、 l ^SA45-6-FLAG、 12がΔ58-6-FLAG、 13が Δ 63- 6- FLAG、 14が Δ 130- 6- FLAGを泳動したレーンである。
圆 3(B)]本発明の一実施形態における C末端タグ (tag)融合 HBsAg Lタンパク粒子 を、抗 HBsAg抗体によって免疫沈降させた結果を示す図であり、各泳動レーンは、 1が野生型 HBsAgLタンパク質、 2が陰性対照、 3が C-7-FLAG、 4が A25-6-FLAG 、 5が Δ54- 6- FLAG、 6が C- 7- HA、 7が Δ25- 6- HA、 8が Δ54- 6- HA、 9が Δ 11- 6- FLAG、 10が Δ33- 6- FLAG、 l ^SA45-6-FLAG、 12がΔ58-6-FLAG、 13が Δ 63- 6- FLAG、 14が Δ 130- 6- FLAGを泳動したレーンである。
圆 4(A)]本発明の一実施形態における C末端タグ (tag)融合 HBsAg Lタンパク粒子 を、抗タグ (tag)抗体によって免疫沈降させた結果を示す図であり、各泳動レーンは、 1が野生型 HBsAgLタンパク質、 2が陰性対照、 3が C-7-FLAG、 4が A25-6-FLAG 、 5が Δ54- 6- FLAG、 6が C- 7- HA、 7が Δ25- 6- HA、 8が Δ54- 6- HA、 9が Δ 11- 6- FLAG、 10が Δ33- 6- FLAG、 l ^SA45-6-FLAG、 12がΔ58-6-FLAG、 13が Δ 63- 6- FLAG、 14が Δ 130- 6- FLAGを泳動したレーンである。
圆 4(B)]本発明の一実施形態における C末端タグ (tag)融合 HBsAg Lタンパク粒子 を、抗タグ (tag)抗体によって免疫沈降させた結果を示す図であり、各泳動レーンは、
1が野生型 HBsAgLタンパク質、 2が陰性対照、 3が C-7-FLAG、 4が A25-6-FLAG
、 5が Δ54- 6- FLAG、 6が C- 7- HA、 7が Δ25- 6- HA、 8が Δ54- 6- HA、 9が Δ
11- 6- FLAG、 10が Δ33- 6- FLAG、 l ^SA45-6-FLAG、 12がΔ58-6-FLAG、 13が
Δ 63- 6- FLAG、 14が Δ 130- 6- FLAGを泳動したレーンである。
[図 5]C末端に融合された FLAG-BTC-His-tagの DNA配列（上段）と推定アミノ酸配 列（下段)を示す図である。
[図 6]C末端に融合された FLAG-ZZ-His-tagの DNA配列（上段）と推定アミノ酸配列 (下段)を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
[0030] 本発明の実施の一形態について以下に詳細に説明する力 本発明は以下の記載 に限定されるものではない。
[0031] 本実施の形態では、本発明にかかる中空ナノ粒子、この中空ナノ粒子の生産方法
、並びに、この中空ナノ粒子の利用の順に、本発明を詳細に説明する。
[0032] (1)本発明にかかる中空ナノ粒子
<中空ナノ粒子の定義 >
本発明にかかる中空ナノ粒子は、少なくとも粒子形成能を有するタンパク質により 形成されており、内部が空洞となっている粒子であれば特に限定されるものではない 。ここでいうナノ粒子とは、立体的な形状を有し、かつナノメートルオーダーのサイズ を有する微小な構造体であればよぐその形状は特に限定されるものではない。一般 的には、略球状または楕円球状となっている。なお、ナノメートルオーダーとは、 nm 単位で表示することが妥当な範囲内を指す。
[0033] なお、以下に述べるように、本発明に力かる中空ナノ粒子は、粒子形成能を有する タンパク質により形成されることで、生体由来の化学構造を認識する生体構造認識部 位を表面に提示している。
[0034] <粒子形成能を有するタンパク質 >
本発明にかかる中空ナノ粒子を形成する、粒子形成能を有するタンパク質とは、真 核細胞内で発現させることにより、当該真核細胞由来の脂質二重膜に多数の同タン ノ^質が埋め込まれた中空粒子を形成させることができる機能 (粒子形成能)を有す るタンパク質であれば特に限定されるものではなぐ動物細胞、植物細胞、ウィルス、 菌類等に由来する天然タンパク質や、種々の合成タンパク質等を挙げることができる
。代表的なものとして、種々のウィルスから得られるサブウィルス粒子を挙げることがで き、具体的には、ウィルス由来の表面抗原タンパク質を挙げることができる。なお、上 記粒子形成能を有するタンパク質として用いられるタンパク質が、生体内において抗 体を惹起する可能性がある場合などは、改変して抗原性を減少させたものを用いて ちょい。
[0035] 上記ウィルス由来の表面抗原タンパク質としては、後述する実施例にも示すように、 B型肝炎ウィルス（Hepatitis B Virus :HBV)表面抗原（Hepatitis B virus surface Antigen,以下、説明の便宜上、適宜 HBsAgと略す)タンパク質を挙げることができる (例えば、国際出願 WO01Z64930参照)。
[0036] HBsAgタンパク質は、 226個のアミノ酸力も構成される Sタンパク質を含んでいる。
Sタンパク質の N末端側に 55アミノ酸 (pre-S2 peptide)が付カ卩したものが Mタンパク 質、 Mタンパク質の N末端側に、 108もしくは 119アミノ酸 (pre- SI peptide)が付カロし たものが Lタンパク質である。
[0037] 本発明者らは、遺伝子組換え酵母で上記 HBsAgの Lタンパク質を発現させると、 酵母由来の脂質二重膜に多数の同タンパク質が埋め込まれた短径約 20nm、長径 約 150nmの楕円状中空粒子が形成されることを見出し、報告している (J. Biol. Chem., Vol.267, No.3, 1953-1961, 1992) 0この中空粒子は、 HBVゲノムを全く含ま ないので、ウィルスとしては機能せず、人体への安全性が極めて高い。また、 HBVの 肝細胞への感染力を担う肝細胞特異的レセプターを粒子表面に提示しているため、 肝細胞に対して特異的に物質を運搬する運搬体としての機能も有している。それゆ え、本発明では、 HBsAgタンパク質を好適に用いることができる。
[0038] この HBsAgタンパク質の Lタンパク質は、配列番号 2に示すアミノ酸配列を有して いるが、これに限定されるものではなぐ上記粒子形成能を有していれば、その一部 が改変された変異タンパク質であってもよ 、。
[0039] すなわち、本発明で用いられる B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質には、（a)配 列番号 2に示されるアミノ酸配列からなる Lタンパク質のみならず、（b)配列番号 2に 示されるアミノ酸配列において、 1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び Z 又は付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ、粒子形成能を有する Lタンパク質の変 異タンパク質も含まれる。
[0040] 上記「1個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び Z又は付加された」と は、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失 、挿入、及び Z又は付加できる程度の数 (好ましくは 10個以下、より好ましくは 7個以 下、さらに好ましくは 5個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び Z又は付加され ることを意味する。このように、上記 (b)のタンパク質は、上記 (a)のタンパク質の変異 タンパク質である。なお、ここでいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法 により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク 質を単離精製したものであってもよ 、。
[0041] なお、上記 Lタンパク質の変異タンパク質は、少なくとも粒子形成能を有して!/ヽれば よぐ宿主細胞認識構造が機能する構造が含まれていなくてもよい。これは、後述す るように、 Lタンパク質の宿主細胞認識構造 (Pre-S領域)を他の生体構造認識部位に 置換してもよ 、ためである。
[0042] <生体構造認識部位 >
本発明にかかる中空ナノ粒子は、生体由来の化学構造を認識する生体構造認識 部位を表面に提示している。この生体構造認識部位としては、特に限定されるもので はなく、本発明にかかる中空ナノ粒子の標的とした 、細胞や組織に特異的な分子を 選択すればよい。具体的には、ウィルス由来の宿主細胞認識構造、抗原決定基、リ ガンドおよびリガンドの受容体の少なくとも何れかを挙げることができる。
[0043] 上記ウィルス由来の宿主細胞認識構造とは、由来となるウィルスの感染の対象とな る宿主細胞を認識する構造を指し、ウィルスの種類に応じてそれぞれ異なるものであ る。例えば、上記 HBVの場合は、肝細胞認識部位である Pre-S領域を挙げることがで きる。
[0044] 上記抗原決定基とは、抗体と結合する部位または T細胞受容体によって認識される 部位であれば特に限定されるものではなぐ抗原決定基を含む抗原そのものであつ てもよいが、本発明では、タグ (tag)配列を好適に用いることができる。このタグ配列と しては、例えば、 Strep-tag II、 HA-tag、 FLAG-tag、 ZZ-tag等を挙げることができるが 、特に限定されるものではない。
[0045] 上記リガンドとは、機能タンパク質に特異的に結合する物質であれば特に限定され るものではなぐ広義では、上記抗原決定基や抗原、宿主細胞認識構造等も含まれ る。具体的には、例えば、上皮増殖因子 (EGF)、繊維芽細胞増殖因子 (FGF)、神 経成長因子 (NGF)、血小板由来成長因子（PDGF)、骨由来成長因子（BDG)、ィ ンシュリン様成長因子 (IGF)等の細胞増殖因子 (成長因子）；インターロイキン等の 細胞機能調節分子；抗体；抗体を結合する ZZ-tag；細胞膜結合透過性の TATぺプ チド等の機能ペプチド、タンパク質結合性ペプチド;糖鎖、脂質等の非ペプチド性リ ガンド;上記抗原決定基や抗原;等を挙げることができる。ここで、 TATペプチドとは 、透過性を持つ HIVの tatの部分ペプチドで、血液脳関門（blood-brain barrier, BBB )を透過させるキャリアとして使用できると 、う報告がなされて 、る。
[0046] 上記リガンドの受容体 (レセプター）とは、上記リガンドと特異的に結合する機能タン パク質であれば特に限定されるものではない。具体的には、上記細胞増殖因子の受 容体、インターロイキン受容体等の細胞機能調節分子の受容体、抗原や抗原決定 基に対する抗体、非タンパク質性リガンド等のレセプター等を挙げることができる。
[0047] 上記生体構造認識部位としてはどのようなものを採用してもよ!/、。具体的には、本 発明にかかる中空ナノ粒子の用途、すなわち標的となる細胞または組織に特異的な 構造を認識するものを適宜選択すればよい。換言すれば、上記生体構造認識部位 は、標的となる細胞または組織に特異的な構造を認識する標的構造認識部位となつ ていればよい。
[0048] 具体的な例としては、標的となる細胞または組織 (あるいは器官）が肝臓である場合 、上記 HBVの Pre-S領域を採用すればよい。また、標的がウィルス感染細胞である場 合には、抗ウィルス性タンパク質抗体を選択すればよい。また、抗ウィルス性タンパク 質抗体を提示させた場合は、本発明にかかる中空ナノ粒子をウィルス感染細胞の除 去に利用することができる。
[0049] さらに、標的となる細胞が癌細胞である場合には、様々な生体構造認識部位を採 用することができる。例えば、癌特異的抗体や癌細胞に特異的に現れる EGF受容体 等が挙げられる。これらを提示した中空ナノ粒子に、癌を治療するための物質 (薬剤 や遺伝子等)を包含させることにより、癌細胞に対して特異的かつ効果的に作用する 有効な治療薬となる。
[0050] 癌細胞に特異的に現れる EGF受容体としては、標的となる細胞がヒト扁平上皮癌 由来細胞である場合には、上記上皮増殖因子の一種であるベータセルリン (BTC : Betacellulin)を選択することができる。このベータセルリンは、上皮細胞上の上皮細 胞増殖因子受容体 (EGFR)と高い親和性を有する。そのため、これを粒子表面に提 示した中空ナノ粒子は、 EGFR過剰発現細胞であるヒト扁平上皮癌由来細胞に対し て認識能をもつことが可能となる。
[0051] さらに、本発明における生体構造認識部位は、タグ配列とリガンドとを組み合わせ てなるものであってもよい。具体的には、例えば、後述する実施例 5で用いている FLAG- BTC- His- tagや、実施例 10で用いて!/、る FLAG- ZZ- His- tag等を挙げること ができる。特に、 FLAG-ZZ-His-tagのように、 ZZタグを介した場合、各種の「抗体」ま たは「抗体 Fc領域とリガンドタンパク質との融合タンパク質」を生体構造認識部位とし て中空ナノ粒子表面に提示することができる。
[0052] <本発明における生体構造認識部位の提示 >
本発明にカゝかる中空ナノ粒子は、上記粒子形成能を有するタンパク質 (説明の便 宜上、粒子形成タンパク質と称する場合がある）のァミノ末端およびカルボキシル末 端の双方に、上記生体構造認識部位が設けられており、それぞれの生体構造認識 部位が認識する生体由来の化学構造は異なっている。すなわち、本発明では、粒子 形成タンパク質の両末端に設けられて!/ヽる生体構造認識部位は、それぞれ異なるぺ プチド分子となっている。
[0053] 図 1は、本発明にかかる中空ナノ粒子を示す模式図である。図 1に示すように、中空 ナノ粒子は、真核細胞由来の脂質二重膜に複数の粒子形成タンパク質 2が埋め込ま れた構造を有している。埋め込まれた状態は、脂質二重膜に粒子形成タンパク質 2 が複数回貫通した状態となっており、少なくともそのアミノ末端 (N末端）に生体構造 認識部位 3が設けられている。これによつて、生体構造認識部位 3は中空ナノ粒子の 表面に提示されることになる。
[0054] ここで、粒子形成タンパク質 2として、上記 HBsAgの Lタンパク質を用いた場合を例 に挙げると、 N末端側の生体構造認識部位 3としては HBVの肝細胞認識部位をその まま用いることができる。すなわち、本発明では、上記粒子形成タンパク質が、ウィル ス由来の表面抗原タンパク質であれば、当該表面抗原タンパク質の末端部に存在す る宿主細胞認識構造を上記標的構造認識部位として用いることができる。
[0055] 本発明では、さら〖こ、 C末端側に、他の生体構造認識部位 1を設けることで、複数の 生体構造認識部位を提示する中空ナノ粒子として ヽる。
[0056] 従来の中空ナノ粒子は生体構造認識部位を N末端側に 1つしか有していなカゝつた 。そのため、組織や細胞側の受容体数が少ない場合、 N末端に導入した生体構造認 識部位が何らかの物質で阻害された場合、さらには、他の分子と競合して受容体認 識に支障がある場合等には、中空ナノ粒子を標的となる細胞や組織に効率的に送 達することが困難となっていた。これに対して、本発明では、それぞれ異なる生体構 造認識部位 1 · 3を有しているため、上記各場合にも十分に対応することが可能となり 、従来よりも標的に対する認識率をより高くすることが可能となる。
[0057] ここで、本発明では、上記生体構造認識部位の少なくとも一方、好ましくは双方とも 、標的となる細胞または組織に特異的な構造を認識する標的構造認識部位となって いればよいが、さら〖こ、上記生体構造認識部位の何れか一方は、中空ナノ粒子その ものを特異的に認識するための識別部位として機能することがより好ましい。この識 別部位となる生体構造認識部位としては、上記タグ配列等の抗原決定基および Zま たは細胞増殖因子等のリガンドを挙げることができる。
[0058] 例えば、 C末端側の生体構造認識部位 1を上述したタグ配列とすれば、固相化した 抗タグ抗体を用いることにより、ァフィユティー精製による精製が可能となる。それゆえ 、 N末端側の生体構造認識部位 3が標的構造認識部位であるので、特定の細胞また は組織へ中空ナノ粒子を効率的に送達できる上に、中空ナノ粒子の精製が簡便に なる。その結果、本発明にかかる中空ナノ粒子の実用性をより一層高めることができ る。
[0059] また、タグ配列とリガンドとを組み合わせたものを C末端側の生体構造認識部位 1と して用いれば、標的構造認識部位と識別部位とを確実に兼用することができる。それ ゆえ、標的となる細胞や組織への効率的な送達をより十分なものとすることができる。 さら〖こ、タンパク質に対する翻訳後修飾を利用することにより、非ペプチド分子である 生体構造認識部位を粒子形成タンパク質 2に導入しても良い。これにより、標的とな る細胞や組織への送達の効率をより一層十分なものとすることができる。
[0060] なお、本発明に力かる中空ナノ粒子において、上記 HBV等のウィルス由来の表面 抗原タンパク質を用いた場合、当該ウィルス由来の宿主細胞認識構造を上記標的構 造認識部位として用いる必要はなぐ前述した他の生体構造認識部位に置換するこ ともできる。例えば、 HBVの肝細胞認識部位を他の標的認識部位に改変してもよい 。この場合、 HBV由来の表面抗原タンパク質 HBsAgの Lタンパク質は、本来有して いる肝細胞認識部位を欠くことになるが、 N末端側に他の標的構造認識部位を導入 するか、 C末端側に標的構造認識部位を導入することで、肝細胞以外の任意の細胞 または組織に特異的に物質を運搬、導入することが可能となる。
[0061] (2)本発明にかかる中空ナノ粒子の生産方法
本発明にかかる中空ナノ粒子は、上記粒子形成タンパク質をコードする遺伝子と、 上記生体構造認識部位をコードするポリヌクレオチドとをつなげたキメラ遺伝子を構 築し、これを真核細胞に導入して発現させることにより生産することができる。真核細 胞内で粒子形成タンパク質を生産させることにより、同タンパク質は、小胞体膜上に 膜タンパク質として発現、蓄積され、中空ナノ粒子として放出 (分泌)される。本発明 で用いられる真核細胞は特に限定されるものではないが、酵母、昆虫細胞または動 物細胞の何れかを挙げることができる。
[0062] 上記キメラ遺伝子の構築方法は特に限定されるものではなぐ公知の遺伝子組換 え技術を用いればよい。具体的には、例えば、上記粒子形成タンパク質をコードする 遺伝子として、ウィルス由来の表面抗原タンパク質をコードする遺伝子を用いるときに は、当該遺伝子における、表面抗原タンパク質のカルボキシル末端側となる側に、生 体構造認識部位をコードするポリヌクレオチドをつなげてキメラ遺伝子を構築し、これ を発現ベクターとすればよい。発現ベクターに含まれるプロモーター等の各種 DNA セグメントについては特に限定されるものではなぐ宿主となる真核細胞の種類に応 じて適宜選択すればよい。
[0063] このとき用いられる粒子形成タンパク質をコードする遺伝子としては、本発明では、 配列番号 1に示される塩基配列を有するものを好適に用いることができる。もちろん、 本発明はこれに限定されるものではなぐ粒子形成能を有していれば、変異遺伝子 であってもよ!/、し、配列番号 1に示される塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配 列からなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする相同遺伝子であって もよい。なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも 90%の同一性、好ましく は少なくとも 95%の同一性、最も好ましくは少なくとも 97%の同一性が配列間に存在 するときにのみハイブリダィゼーシヨンが起こることを意味する。 [0064] 上記生体構造認識部位をコードするポリヌクレオチドにつ 、ても特に限定されるも のではなぐ生体構造認識部位として用いることのできる上記ウィルス由来の宿主細 胞認識構造、抗原決定基、リガンド等のペプチド分子をコードする遺伝子等を好適に 用いることができる (例えば、後述する各実施例参照)。
[0065] ここで、粒子形成タンパク質に生体構造認識部位を導入する場合、粒子形成タン ノ ク質の末端側のアミノ酸配列を置換するようにキメラ遺伝子を設計すると好ま 、。 換言すれば、上記キメラ遺伝子は、上記粒子形成能を有するタンパク質の末端側の アミノ酸配列を、生体構造認識部位に置換するように構築されていると好ましい。これ により、不必要なアミノ酸配列を排除することが可能となるので、中空ナノ粒子の表面 に生体構造認識部位を確実に提示することができる。なお、生体構造認識部位を導 入する場合に、粒子形成タンパク質の末端側のアミノ酸配列を置換する場合でも、置 換せず付加する場合でも、任意のアミノ酸残基数力もなるスぺーサー配列を設けても ょ 、。これにより効率的な置換または付加が可能となる。
[0066] 本発明にかかる中空ナノ粒子の生産方法では、真核細胞内で上記キメラ遺伝子を 発現させることにより、真核細胞力 中空ナノ粒子が放出されるが、さらに、生体構造 認識部位に含まれる識別部位となる構造に応じて、当該識別部位により認識される 化学構造を有する物質 (担体)を固相化し、これを用いて、中空ナノ粒子を精製する 。これにより効率的な精製が可能となる。このとき用いられる担体としては特に限定さ れるものではなぐ公知のものを好適に用いることができる。同様に精製方法も特に 限定されるものではなぐカラムクロマトグラフィー等の公知の方法を好適に用いるこ とがでさる。
[0067] (3)本発明に力かる中空ナノ粒子の利用
く薬剤としての利用 >
本発明にかかる中空ナノ粒子は、内部に細胞導入物質を封入することで各種薬剤 として好適に用いることができる。すなわち、本発明にカゝかる中空ナノ粒子は、遺伝 子や薬物を疾患部位特異的に送達するナノカプセルとして応用することができる。こ れによって、中空ナノ粒子に封入した遺伝子や薬物を、標的となる疾患細胞あるいは 疾患組織に効率的に送達することができるだけでなぐ生体構造認識部位をそれぞ れ変えることによって、異なる細胞や組織に対してそれぞれ遺伝子や薬物を同時に 送達することも可能になる。また、遺伝子の場合には、各種形質転換等の遺伝子導 入法に本発明を利用できるだけでなぐ遺伝子治療等にも利用することができる。
[0068] このとき用いられる細胞導入物質としては、特に限定されるものではないが、遺伝子 または薬理作用を有する化合物であればよい。より具体的には、例えば DNA、 RNA などの遺伝子 ·オリゴヌクレオチド；天然ある 、は合成タンパク質 ·ペプチド；天然また は合成化合物等の薬物;等を挙げることができる。
[0069] より具体的には、すでに発明者らにより報告されたヒト RNasel (Jinno H, Ueda M, Ozawa S, Ikeda T, Enomoto K, Psarras K, Kitajima M, Yamada H, Seno M Life Sci. 1996;58(21):1901- 8)または RNase3 (別名 ECP : eosinophil cationic protein； Mallorquト Fernandez G, Pous J, Peracaula R, Aymami J, Maeda T, Tada H, Yamada H, Seno M, de Llorens R, Gomis- Ruth FX, Coll M; J Mol Biol. 2000 Jul
28;300(5):1297-307.)等が適用される。これらのタンパク質は、細胞内外で作用し細 胞傷害活性を有するものであるが、これらの RNaseを本発明の物質運搬体 (薬剤）に 内包させて運搬することにより、細胞外では無毒化する一方、細胞内だけで作用させ ることができるので、より副作用の少な 、新 、癌治療方法として期待される。
[0070] 他にも、癌抑制遺伝子類 (p53等）、インターフェロン類、インターロイキン類、サイト 力イン類、コロニー刺激因子類、腫瘍壊死因子類、トランスフォーミング増殖因子 |8 類、血小板由来増殖因子類、エリスロポイエチン類、 Fas抗原類などのタンパク質ある いは当該タンパク質をコードする遺伝子も挙げることができる。
[0071] <薬剤の製造方法 >
本発明にかかる薬剤の製造方法、すなわち上記細胞導入物質を上記の中空ナノ 粒子に封入する方法は特に限定されるものではなぐ公知の化学的、分子生物学的 実験手法で用いられる様々な方法が適用される。たとえば、エレクト口ポレーシヨン法 、超音波法、単純拡散法、あるいは電荷を有する脂質を用いる方法等を挙げることが できる。
[0072] また、細胞導入物質としてタンパク質を用いる場合は、粒子形成タンパク質に細胞 導入物質を融合させて粒子形成する方法もある。粒子形成タンパク質に細胞導入物 質を融合させる方法とは、例えば、 B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質をコードする 遺伝子と、上記タンパク質薬剤をコードする遺伝子とがインフレームで連結されたプ ラスミドを構築し、このプラスミドを用いて真核細胞に粒子を形成させる。これによつて 、B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質にタンパク質薬剤が融合した薬剤を製造する ことができる。
[0073] <その他の禾 lj用 >
本発明にかかる中空ナノ粒子は、薬剤とした場合には、これを用いて疾患の治療 方法に利用することができる。上記薬剤を静脈注射などによって体内に投与すれば 、当該粒子は体内を循環し、粒子表面に提示した肝細胞特異的レセプターおよび表 面に提示された認識部位により肝細胞に導かれ、感染する。そして、細胞導入物質 が肝細胞中に送り込まれ、細胞導入物質の肝臓組織特異的な導入が行われる。な お、薬剤の投与方法としては、静脈注射による投与のほかに、経口投与、筋肉内投 与、腹腔内投与、皮下投与等が挙げられる。
[0074] このように、本発明の薬剤を用いれば、 in vivoある!/、は in vitroで細胞、または組織 に特異的に物質を導入することができ、特定細胞または糸且織に物質を導入することを 各種疾患の治療法あるいは治療法の 1ステップとして行うことも可能になるのである。
[0075] また、薬剤以外にも、各種実験用試薬類やキット類として利用することができる。例 えば、遺伝子導入法 (形質転換法）に利用することで、より効率的な遺伝子導入が可 能となる。
[0076] なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなぐ特許請求の範囲 に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技 術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に 含まれる。
[0077] 〔実施例〕
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに 詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなぐ細部につ V、ては様々な態様が可能であることは言うまでもな 、。
[0078] 以下の実施例において、 HBsAgとは、 HBVの外被タンパク質である B型肝炎ウイ ルス表面抗原（Hepatitis B virus surface Antigen)を示す。 HBsAgは、 226個のアミ ノ酸カゝら構成される Sタンパク質を含んでいる。 Sタンパク質の N末端側に 55アミノ酸（ pre-S2 peptide)が付カ卩したものが Mタンパク質、 Mタンパク質の N末端側に、 108も しくは 119アミノ酸 (pre-Si peptide)が付カ卩したものが Lタンパク質である。
[0079] HBsAg Lタンパク質の上記 Pre- S領域（pre- SI, pre- S2)は、 HBVが肝細胞に結 合する際に、それぞれ重要な役割を担うことが知られている。 pre- S1は、肝細胞に直 接結合する部位を持ち、 pre-S2は、血中の重合アルブミンを介して肝細胞に結合す る重合アルブミンレセプターである。
[0080] 真核細胞で HBsAg Lタンパク質を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に 膜タンパク質として発現、蓄積される。 HBsAgの Lタンパク質は、分子間で凝集を起 こし、小胞体膜を取り込みながら、出芽様式でルーメン側に粒子として放出され、動 物細胞を宿主とした場合には、最終的には培養上清中へ放出される。
[0081] 以下の実施例では、 HBsAgの Lタンパク質を用いた。
[0082] 〔実施例 1 : C末端に抗原となる各種のタグ配列を融合した HBsAg Lタンパク質を 発現するプラスミドの構築〕
(1) C末端にストレプタグ II (Strep-tagll)配列を融合した HBsAg Lタンパク質を発 現するプラスミドの構築
発明者らによって J. Biol. Chem., Vol. 267, No. 3, 1953-1961, 1992にて報告され た酵母用 HBsAg Lタンパク質発現プラスミド pGLDLIIP39— RcTを制限酵素 Xhol を用いて切断し、さらに T4 DNA polymerase処理により末端平滑化したのち、 HBsAg Lタンパク質をコードする遺伝子断片を得た。一方、動物細胞用発現プラスミド pTB 1455 (j.Biotechnol., Vol.33:, No.2, 157-174, 1994に記載）を制限酵素 EcoRIで切 断し、さらに Klenow DNA polymerase処理により末端平滑化した。その後、末端平滑 化した PTB1455の SR a，プロモーターの下流に上述した HBsAg Lタンパク質をコ ードする遺伝子断片を組み込んで、動物細胞用 HBsAg Lタンパク質発現プラスミド PB0441を得た。 pB0441がコードする HBsAg Lタンパク質の塩基配列は配列番 号 1に示され、アミノ酸配列は配列番号 2に示されて 、る。
[0083] 上記動物細胞用 HBsAg Lタンパク質発現プラスミド pB0441の終止コドンを、 Ser 残基をコードする塩基配列に置換するために、また同時に制限酵素 Saclサイトを挿 入するために、 pB0441を铸型として、 PCR法に基づく部位特異的変異導入操作を Quickし hangeTM； te— directed Mutagenesis Kit (Strategene社)を用 ヽてノフイマ ~~ には配列番号 3および 4の合成オリゴヌクレオチドを用いた。具体的には反応液 50 1 中に铸型 DNA 50nmol、合成 DNAプライマー（配列番号 3および 4の変異導入プライ マー）各 15pmol、 dATP 40nmol、 dCTP 40nmol、 dGTP 40nmol、 dTTP 40nmol、 Plu turbo DNA polymerase 2.5U、 lOmM KC1、 lOmM (NH4)2S02、 20mM Tris- HCl (pH 8.75)、 2mM MgS04、 0.1% Triton (登録商標） X- 100、 100 μ g/ml BSA中で、 95°C30 秒加熱後、 95°C30秒の変性、 45°C1分のアニーリング、 68°C20分の合成反応を 18 サイクル行った。その後、制限酵素 DpnI (10,000U/ml)を： 1カ卩えて 37°Cで 1時間処 理し、大腸菌 XL-1 Blueを形質転換し、得られたコロニーカゝらプラスミド DNAを抽出し 、制限酵素地図および塩基配列により、 目的の変異が導入されているプラスミド DNA (以下、 pB0611とする）を選抜した。
[0084] 次に、 Strep-tagll配列をコードする合成オリゴヌクレオチド（配列番号 5とこれに相 補的な配列番号 6、 EcoRVサイト挿入)の末端を T4ヌクレオチドキナーゼによりリン酸 化したのち、アニーリングし、上記 pB0611を制限酵素 Saclで切断したものに挿入す ることにより、 C末端に Strep-tagll配列が融合された HBsAg Lタンパク質 (以下、 C- 4- Strepとする）発現プラスミド pB0647を構築した。
[0085] ここで、 Strep-tagllとは、ストレプトアビジンに対してピオチンの様に高 、親和性で 結合するペプチドであり、 N末端力 順に WSHPQFEKのアミノ酸配列力もなる。な お、 C- 4- Strepは、 HBsAg Lタンパク質の C末端と Strep- tagllとの間に 4アミノ酸残 基からなるスぺーサー配列（SSSA)を有して!/ヽる。 Strep- tagll融合 HBsAg Lタン パク質の名称と、これを発現するプラスミド DNAの名称と、 HBsAg Lタンパク質の C 末端に実際に融合した配列を表 1 (A)に示す。
[表 1] (A)
プラスミド 融合タンパク質名 c末端部アミノ酸配列
名称 (C末-スぺ一サ一- taq)
226(0
PB0441 /^"-LAg - - - C L W V Y *
PB0647 C-4-Strep · • · c L W V Y S S S A W S H P O F E K I S *
pB0710 C-7-HA · • - c L W V Y S S S G G S S Y P Y D V P D Y A I S *
PB0711 C -了 - His · • - c L W V Y S S S G G S S H H H H H H I S *
PB0747 C-了- FLAG ■ • · c L W V Y S S S G G S S D Y K D D D D K I S *
PB0764 C-9-FLAG - - - c L W V Y S S S G G G S S S D Y K D D D D K I S *
PB0765 C-13-FLAG - - - c L V Y S S S G G G S G G G S S S D Y K D D D D K I S *
PB0766 C-17-FLAG - - - C L V Y S S S G G G S G G G S G G G S S S D Y K D D D D K i S *
PB0767 C - 17(Trb)- FLAG ' • · C L V Y S S S G G G S G G Gし V P R G S S D Y K D D D D K i S *
PB0790 C-17CTrb)-FLAG-His
' - - £7/ ^l K/S S S G G G S G G G L V P R G S S D Y K D D D D K I H Q L H H H H H H*
(B)
プラスミド 融合タンパク質名 c末端部アミノ酸配列
名称 （。末-スぺ一サ一- tag)
Figure imgf000021_0001
PB0792 ΔΙΙ-6-FLAG F
'93
PB0793 Δ33- 6- FLAG
18.
PB0794 △45-6-FLAG
PB0789 A58-6-FLAG A S V
164
PB0788 Δ63- 6-FLAG F L f アミノ酸配列番号は Sタンパク質配列を基準として表示した。 (2) C末端に HAタグ (HA-tag)配列を融合した HBsAg Lタンパク質を発現するプ ラスミドの構築
まず、 HA-tag配列をコードする合成オリゴヌクレオチド (配列番号 7とこれに相補的 な配列番号 8)の末端を T4ヌクレオチドキナーゼによりリン酸化したのちアニーリング させた。その後、上記 C末端 Strep- tagll融合 HBsAg Lタンパク質発現プラスミド pB 0647を制限酵素 Saclと EcoRVとで切断して Strep-tagll配列を除去したのちに、上記 合成オリゴヌクレオチドを挿入することにより C末端に HA-tag配列が融合された C末 端 HA- tag融合 HBsAg Lタンパク質発現プラスミド pB0710が構築された。なお、こ の C末端 HA-tag配列融合 HBsAg Lタンパク質は、 HBsAg Lタンパク質の C末端 と HA-tag配列との間に 7アミノ酸残基力 なるスぺーサー配列（SSSGGSS)を有し ている。 HA-tag融合 HBsAg Lタンパク質の名称と、これを発現するプラスミド DNA の名称と、 HBsAg Lタンパク質の C末端に実際に融合した配列とを表 1 (A)に示す
[0087] ここで、 HA-tagとは、 N末端より YPYDVPDYAの配列を有するェピトープペプチド で、市販の抗 HA抗体（例えば、 Roche Diagnostics社）と高い親和性で結合する。
[0088] (3) C末端に Hisタグ (His-tag)配列を融合した HBsAg Lタンパク質を発現するプ ラスミドの構築
まず、 His-tag配列をコードする合成オリゴヌクレオチド (配列番号 9とこれに相補的 な配列番号 10)の末端を T4ヌクレオチドキナーゼによりリン酸ィ匕したのちアニーリング させた。その後、上記 C末端 Strep- tagll融合 HBsAg Lタンパク質発現プラスミド pB 0647の Strep-tagll配列領域を除去し、上記合成オリゴヌクレオチドを挿入することに より C末端に His- tag配列が融合された C末端 His- tag融合 HBsAg Lタンパク質発現 プラスミドが構築された。なお、この C末端 His-tag配列融合 HBsAg Lタンパク質は 、 HBsAg Lタンパク質の C末端と His-tag配列との間に 7アミノ酸残基力もなるスぺ ーサー配列（SSSGGSS)を有して!/、る。 His- tag融合 HBsAg Lタンパク質の名称と 、これを発現するプラスミド DNAの名称と、 HBsAg Lタンパク質の C末端に実際に融 合した配列とを表 1 (A)に示す。
[0089] ここで、 His-tagとは、 His残基が 6個連続した配列（HHHHHH)を有するペプチド で、ニッケルやコバルトなどの金属イオンにキレートする能力をもつ。 His-tag配列を 付加することにより、 HBsAg Lタンパク質を金属キレートカラムによってァフィ-ティ 一精製することが可能となる。
[0090] (4) C末端に FLAGタグ（FLAG-tag)配列を融合した HBsAg Lタンパク質を発現 するプラスミドの構築
まず、 FLAG-tag配列をコードする合成オリゴヌクレオチド（配列番号 11とこれに相 補的な配列番号 12)の末端を T4ヌクレオチドキナーゼによりリン酸ィ匕したのちァニー リングさせた。その後、上記 C末端 Strep-tagll融合 HBsAg Lタンパク質発現プラスミ ド PB0647の Strep-tagll配列領域を除去し、上記合成オリゴヌクレオチドを挿入する ことにより C末端に FLAG-tag配列が融合された C末端 FLAG-tag融合 HBsAg Lタン ノ ク質発現プラスミドが構築された。なお、この C末端 FLAG- tag配列融合 HBsAg L タンパク質は、 HBsAg Lタンパク質の C末端と FLAG-tag配列との間に、 7アミノ酸残 基からなるスぺーサー配列（SSSGGSS)を有して!/、る。 FLAG- tag融合 HBsAg L タンパク質の名称と、これを発現するプラスミド DNAの名称と、 HBsAg Lタンパク質 の C末端に実際に融合した配列とを表 1 (A)に示す。
[0091] ここで、 FLAG- tagとは、 N末端より DYKDDDDKの配列を有するペプチドで、巿 販の抗 FLAG抗体 (Sigma社)と高 、親和性で結合する。
[0092] 〔実施例 2 :スぺーサー配列の長さの異なる C末端 FLAG-tag融合 HBsAg Lタンパ ク質を発現するプラスミドの構築〕
HBsAg Lタンパク質の C末端と FLAG-tag配列との間のスぺーサー配列の長さの 異なる、 4種類の C末端 FLAG- tag融合 HBsAg Lタンパク質発現プラスミドを構築し た。
[0093] 具体的には、実施例 1の (4)で構築した C末端に FLAG-tag配列が融合した HBsA g Lタンパク質（C-7-FLAG)発現プラスミド pB0747を制限酵素 Saclと Xholとで切断 し、スぺーサー配列をコードする配列番号 13とこれに相補的な配列番号 14の合成 オリゴマー、配列番号 15とこれに相補的な配列番号 16の合成オリゴマー、配列番号 17とこれに相補的な配列番号 18の合成オリゴマー、あるいはスぺーサ一中にスロン ビン認識配列をコードする配列番号 19とこれに相補的な配列番号 20の合成オリゴマ 一の末端を T4ヌクレオチドキナーゼによりリン酸ィ匕したものを、各々挿入した。各々の 長さのスぺーサー配列をもつ FLAG-tag融合 HBsAg Lタンパク質の名称と、各発現 プラスミドの名称と、 HBsAg Lタンパク質の C末端に実際に挿入された配列とを表 1 (A)に示す。
[0094] またスぺーサー配列が長く、スロンビン認識配列、 FLAG-tag配列、 His-tag配列を 同時に有する融合 HBsAg Lタンパク質を発現するプラスミドも構築した。具体的に は、上記で得られたスロンビン認識配列と FLAG-tag配列とを融合した HBsAg Lタ ンパク質（C- 17(Trb)-FLAG)発現プラスミド pB0767を制限酵素 EcoRVで切断し、こ れに His-tag配列をコードする配列番号 21とこれに相補的な配列番号 22の合成オリ ゴマーの末端を T4ヌクレオチドキナーゼによりリン酸ィ匕したものを、挿入した。その結 果得られたプラスミド ΡΒ0790がコードする C末端 -tag部分の配列を表 1 (A)に示す。 〔実施例 3：種々の C末端領域欠損体 C末端に tag配列を融合した HBsAg Lタンパ ク質を発現するプラスミドの構築〕
(1) C末端領域 25アミノ酸残基を欠失した HBsAg Lタンパク質の C末端に FLAG-tag配列あるいは HA-tag配列を融合した融合 HBsAg Lタンパク質の発現プ ラスミドの構築
まず、実施例 1で構築した C末端に FLAG-tag配列が融合した HBsAg Lタンパク 質発現プラスミド pB0747、あるいは HA-tag配列が融合した HBsAg Lタンパク質発 現プラスミド PB0710を铸型として用い、配列番号 23の合成オリゴヌクレオチドと配列 番号 24の合成オリゴヌクレオドとをプライマーとして用い、 PCR法に基づく部位特異 的変異導入法（QuickChangeTM Site-directed Mutagenesis Kit (Strategene社））を用 いて、欠損させたい部分の前 (具体的には Sタンパク質領域の W201の後ろ）に制限 酵素 Saclサイトを挿入した。反応液 50 μ 1中に铸型 DNA 50nmol、合成 DNAプライマー (配列番号 23および 24の変異導入プライマー）各 15pmol、 dATP 40nmol、 dCTP 40nmol、 dGTP 40nmol、 dTTP 40nmol、 Pfo turbo DNA polymerase 2.5U、 lOmM KC1 、 lOmM (NH4)2S02、 20mM Tris- HCl (pH 8.75)、 2mM MgS04、 0.1% Triton (登録 商標） X-100、 100 μ g/ml BSA中で、 95°C30秒加熱後、 95°C30秒の変性、 45°Cま たは 55°C1分のアニーリング、 68°C20分の合成反応を 18サイクル行った。その後、 制限酵素 DpnI (10,000U/ml)を: 1カ卩えて 37°Cで 1時間処理し、大腸菌 XL-1 Blue を形質転換し、得られたコロニー力 プラスミド DNAを抽出し、 2ケ所の Saclサイトを有 するプラスミド DNAを選抜した。铸型として用いた pB0747と pB0710とはその C末端 部に Saclサイトを有しており、今回の変異で第 2の Saclサイトが挿入されたことになる。 塩基配列を確認したのち、得られたプラスミド DNAを制限酵素 Saclで切断し、ライゲ ーシヨン反応を行うことにより Saclサイトに挟まれた部分 (HBsAg Lタンパク質の C末 端領域 25アミノ酸残基)を欠失した FLAG- tag融合した HBsAg Lタンパク質（ Δ 25- 6- FLAG)発現プラスミド ρΒ0748、および、 HA- tag融合した HBsAg Lタンパク 質（ Δ 25- 6- HA)発現プラスミド pB0744を構築した。得られた各 tag融合タンパク質の 名称、プラスミドの名称、 HBsAg Lタンパク質の C末端に実際に融合した配列とを 表 1 (B)に示す。
[0096] (2) C末端領域 54アミノ酸残基を欠失した HBsAg Lタンパク質の C末端に
FLAG-tag配列あるいは HA-tag配列を融合した融合 HBsAg Lタンパク質の発現プ ラスミドの構築
PB0747あるいは pB0710を铸型プラスミド DNAとして用い、変異導入用プライマー として、配列番号 25の合成オリゴヌクレオチドと配列番号 26の合成オリゴヌクレオチド を用いて、実施例 3 (1)と同様の操作を行うことにより、 HBsAg Lタンパク質の C末 端領域 54アミノ酸残基を欠失した FLAG-tag融合 HBsAg Lタンパク質（ Δ
54— 6— FLAG)発現プラスミド pB0749、 HA— tag融合 HBsAg Lタンパク質（ Δ 54-6-ΗΑ)発現プラスミド ρΒ0745を構築した。得られた各 tag融合タンパク質の名称 、プラスミドの名称、 HBsAg Lタンパク質の C末端に実際に融合した配列とを表 1 (B )に示す。
[0097] (3) C末端領域 130アミノ酸残基を欠失した HBsAg Lタンパク質の C末端に
FLAG-tag配列あるいは HA-tag配列を融合した融合 HBsAg Lタンパク質の発現プ ラスミドの構築
PB0747あるいは pB0710を铸型プラスミド DNAとして用い、変異導入用プライマー として、配列番号 27の合成オリゴヌクレオチドと配列番号 28の合成オリゴヌクレオチド を用いて、上記（1)と同様の操作を行うことにより、 HBsAg Lタンパク質の C末端領 域 130アミノ酸残基を欠失した FLAG-tag融合した HBsAg Lタンパク質（ Δ
130- 6- FLAG)発現プラスミド pB0750、 HA- tag融合した HBsAg Lタンパク質（ Δ 130- 6- HA)発現プラスミド ρΒ0746を構築した。得られた各 tag融合タンパク質の名称 、プラスミドの名称、 HBsAg Lタンパク質の C末端に実際に融合した配列とを表 1 (B )に示す。
[0098] (4)その他の C末端領域アミノ酸残基を欠失した HBsAg Lタンパク質の C末端に FLAG-tag配列を融合した融合 HBsAg Lタンパク質の発現プラスミドの構築 上記（1)と同様の操作を行うことにより、 HBsAg Lタンパク質の C末端領域がそれ ぞれ 11アミノ酸残基 (変異導入用プライマー：配列番号 29および 30)、 33アミノ酸残 基 (変異導入用プライマー:配列番号 31および 32)、45アミノ酸残基 (変異導入用プ ライマー：配列番号 33および 34)、 58アミノ酸残基 (変異導入用プライマー：配列番 号 35および 36)、 63アミノ酸残基 (変異導入用プライマー：配列番号 37および 38)を 欠失した FLAG-tag融合した HBsAg Lタンパク質（ Δ 11-6-FLAG)発現プラスミド p B0792、 pB0793 ( Δ 33- 6- FLAG)、 pB0794 ( Δ 45- 6- FLAG)、 pB0789 ( Δ 58- 6- FLAG)、 pB0788 ( Δ 63- 6- FLAG)を構築した。得られた各 tag融合タンパク質 の名称、プラスミドの名称、 HBsAg Lタンパク質の C末端に実際に融合した配列と を表 1 (B)に示す。
[0099] また、 FLAG-tagと His-tag配列が連続して融合された HBsAg Lタンパク質発現プ ラスミド PBO790を铸型に、配列番号 25の合成オリゴヌクレオチドと配列番号 26の合 成オリゴヌクレオチドを変異導入プライマーに用いて、上記と同様の操作を行うことに より、 C末端領域 54アミノ酸欠失した C末端 FLAG- His- tag融合 HBsAg Lタンパク 質（ Δ 54-17(Trb)-FLAG- His)発現プラスミド pB0791を作成した。
[0100] 得られた各種の tag融合 C末端欠失 HBsAg L蛋白質の名称と、プラスミドの名称、
C末端領域および tag部分の配列を、表 1 (B)に示す。
[0101] 〔実施例 4 : C末端に各種タグ配列を融合した HBsAg Lタンパク質の COS7細胞 による発現と粒子分泌の確認〕
( 1)トランスフエクシヨン試薬を用いたトランスフエクシヨン
サル腎由来細胞株 COS7は、ゥシ胎児血清 (FBS) 5%を含むダルベッコ改変ィー グル培地（DMEM)中で 37°C、 5%C02下で培養した。 COS7細胞を 3 X 104cell/ml となるようにゥシ胎児血清（FBS) 10%を含む DMEM培地に浮遊し、 3.5cmディッシュ へ 1.5mlずつ播種して、 37°C、 5%C02下で 14一 15時間培養した。 1.5mlチューブに 、 95 μ 1の DMEM培地と 4 μ 1のトランスフエクシヨン試薬 FuGene6 (Roche Diagnostics社 )とを加えて混合したのち、上述した実施例 1一 3でそれぞれ構築した各種 C末端 tag 融合 HBsAg Lタンパク質発現プラスミド DNA (1 μ g/ μ 1溶液)を 1 μ 1加えて混合した 。室温で 15分間放置して複合体を形成させたのち、その全量を上記 COS7細胞（ 3.5cmディッシュ）に添加した。 37°C、 5%C02の条件下で 14一 15時間培養したのち 、培地を 1.5mlの無血清培地 CHO- SFM II (インビトロジェン社）に交換し、さらに 3日 間培養後、培養上清を回収した。同様に、 10cmディッシュでトランスフエクシヨンを行う 場合は、 COS7細胞を 5 X 105cells/dishとなるように播種して、 DMEM培地： FuGene6 :プラスミド DNA= 665 ^ 1: 28 ^ 1: 7 ^ 1の複合体を添カ卩し、 10mlの培養上清 を回収した。
[0102] (2) C末端 tag融合 HBsAg L粒子分泌の検出
回収した培地 90 μ 1に 1%FBSを含むダルベッコリン酸緩衝液 (PBS) 90 μ 1を加えて 、抗 HBsAg抗体を用いた酵素免疫測定法である IMX HBsAgアツセィシステム (ダイ ナボット社製)により、培養上清中に分泌された HBs抗原を検出した。ここで、培養上 清中に HBsAg抗原が検出された場合、 HBsAg L粒子が形成されて分泌されたと 判断し、これにより培養液中に各 C末端 tag融合 HBsAg L粒子の存在を確認した。
[0103] 図 2 (A)—図 2 (C)は、実施例 1および 3でそれぞれ構築した各種 C末端 tag融合 H BsAg Lタンパク質発現プラスミドを用いて、上記の方法によって検出した各 C末端 tag融合 HBsAg L粒子分泌の結果を示したグラフである。各々の粒子分泌量は、野 生型 HBsAg Lタンパク質を 100とした場合の HBs抗原当量の相対値（％)で示して いる。また、 HBsAg L遺伝子を含まないプラスミドによる培養上清の結果を陰性対 照 (ネガティブ：図中 mock)とした。図 2 (A)—図 2 (C)に示すように C- 7-ΗΑ、 Δ 54-6-HA、 A 54-6-FLAG、 A 45-6-FLAGで野生型粒子の 40%以上の HBsAg L 粒子の分泌が見られた力 他の tag融合体の野生型粒子の 10%程度と分泌が低か つた。なお、各々の実験は 3回以上行い、偏差値をバーで示してある。
[0104] 次に、実施例 2で構築したスぺーサ一の長さを変えた各種 C末端 tag融合 HBsAg Lタンパク質発現プラスミドを用いた場合、図 2 (B)に示すように、 C-7-FLAGが野生 型粒子の 10%程度であつたのに対し、スぺーサ一の長い C- 9-FLAG、 C-13-FLAG 、 C-17-FLAGおよび C- 17(Trb)-FLAGでは培養上清への分泌量が 10%程度増加し ていることが、すなわち、野生型粒子の 20%程度分泌していることが示された。
[0105] (3) C末端 tag融合 HBsAg L粒子の免疫沈降による検出
抗 HBsマウスモノクローナル抗体による免疫沈降と、抗 HBsマウスモノクローナル 抗体あるいは抗 tag抗体によるウェスタンブロット法 (Western Blotting)を用いて、 C末 端 tag融合 HBsAg L粒子の分子量および分泌量を確認した。 [0106] 回収した培養上清 4mlに IMX HBsAgアツセィシステムの抗 HBsマウスモノクローナ ル抗体固定ィ匕マイクロパーティクルを 30 1加えて、ゆっくりチューブを回転させなが ら 1晚、 4°Cにおいた。 3分間卓上型高速遠心機を用いてマイクロパーティクルと共に 培養上清中の粒子を沈降させ、得られた沈澱に TBST (10mM Tris-HCl緩衝液 pH7.5, 150mM NaCl, 0.1% Tween20)をカ卩えて懸濁し、さらに遠心を行って沈澱を回 収する洗浄操作を 5回くり返した。この沈殿を、還元条件下で SDS-PAGEをおこなつ た。還元条件下とは、上記沈殿をメルカプトエタノールをカ卩えて 95°C、 5分間処理し てから SDS-PAGEを行ったもので、システィン残基同士のジスルフイド結合は切断さ れ、タンパク質はモノマーとして検出される。得られた電気泳動ゲル中のタンパク質を PVDF膜（Bio- rad社）に電気転写し、 1次抗体に IMX HBsAgアツセィシステム（ダイ ナポット社）のャギ抗 HBsAg抗体 'ピオチン結合体、 2次抗体にアルカリホスファタ一 ゼ標識ゥサギ抗ビォチン抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより、培養上清中の HBsAg L粒子を検出した。アルカリホスファターゼ活性は CDP-starTM
Chemiluminescent Substrate (NEB社）を用いて検出した（図 3A)。その結果、図 2 (A )および図 2 (C)で示した培養上清中の分泌量測定結果と矛盾しな 、強さの各 tag融 合タンパク質のバンドが検出された。
[0107] 次に、同じ PVDF膜について、 1次抗体に抗 HA-tag抗体 ·ピオチン結合体（
Anti- [HA]- biotin、 Diagnostics社）ある!/、は抗 FLAG- tag抗体 ·ビォチン結合体 ( Anti-FLAGR biotinylated M2 monoclonal antibody, Sigma社）を、 2次抗体に西洋ヮ サビパーォキシダーゼ（HRP)標識アビジン (Zymed社）を用いてリプロービングした。
HRP活'性 ίま、 Western LighteningTMし nemiluminescence Reagent Plus (Per kin Elmer Life Sciences社）で検出した（図 3B)。
[0108] その結果、図 3Aと同じ位置にバンドが検出されたことから、 C末端に tag配列が融合 した HBsAg Lタンパク質であることが確認された。
[0109] 〔実施例 5 :各種 C末端 tag融合 HBsAg L粒子表面への tag配列提示の確認〕
C末端に融合した tag配列が粒子の表面に提示されて ヽれば、抗 tag抗体を用いた 免疫沈降が可能となる。そこで、各種 C末端 tag融合 HBsAg L粒子について、抗 FLAG-tag抗体固定ィ匕ビーズある 、は抗 HA-tag抗体固定ィ匕ビーズを用いた免疫沈 降を行った。
[0110] 具体的には、実施例 4の（1)に記載した方法に従って COS7細胞に各発現プラスミ ド DNAをトランスフエクシヨンして得られた培養上清 4mlに抗 FLAG-tag抗体固定化ビ ーズ（Anti- FLAGR M2 agarose affinity gel, Sigma社） (1： 1懸濁液）あるいは抗 HA- tag抗体固定ィ匕ビ ~~ズ (Monoclonal anti- HA agarose conjugate clone HA- 7、 Sigma社）（1 : 1懸濁液）を各々30 1カ卩ぇて、ゆっくりチューブを回転させながら 1晚、 4°Cにおいた。抗 FLAG-tag抗体固定化ビーズは、予め 10%ブロックエース（雪印乳 業)を加えて 4°Cで 30分以上処理したものを使用した。 3分間卓上型高速遠心機を 用いてビーズと共に培地中の粒子を沈降させ、得られた沈澱に TBST (10mM
Tris- HCl緩衝液 pH7.5, 150mM NaCl, 0.1% Tween20)を加えて懸濁し、さらに遠心を 行って沈澱を回収する洗浄操作を 5回くり返した。この沈殿を、実施例 4の（3)と同様 の方法で、還元条件下で SDS-PAGEを行い、 1次抗体に IMX HBsAgアツセイシステ ム (ダイナポット社)のャギ抗 HBsAg抗体 'ピオチン結合体、 2次抗体にアルカリホス ファターゼ標識ゥサギ抗ビォチン抗体を用いたウェスタンブロッテイングを行った（図 4 A)。次に、同じ PVDF膜について、 1次抗体に抗 HA-tag抗体 'ピオチン結合体（ Anti- [HA]- biotin、 Diagnostics社）ある!/、は抗 FLAG- tag抗体 ·ビォチン結合体 ( Anti-FLAGR biotinylated M2 monoclonal antibody, Sigma社）を、 2次抗体に西洋ヮ サビパーォキシダーゼ（HRP)標識アビジン (Zymed社）を用いてリプロービングした。 HRP活'性 ίま、 Western LighteningTMし nemiluminescence Reagent Plus (Per kin Elmer Life Sciences社）で検出した（図 4B)その結果、 C- 7-HA、 Δ 54-6-ΗΑ、 Δ
45-6-FLAG, A 54-6-FLAG、 A 58-6-FLAGは、対応する抗 tag抗体で免疫沈降され たことから、 C末端 tag融合 HBsAg L粒子の表面に tag配列を提示していることが示 された。
[0111] 〔実施例 6 : C末端 tag融合 HBsAg L粒子のァフィ-テフィークロマトグラフィーによ る濃縮精製〕
粒子表面に提示されたタグ配列を利用することにより、抗タグ抗体によるァフィ-テ ィークロマトグラフィーによる簡易精製および濃縮が可能となる。
[0112] (1)エレクト口ポレーシヨンによる tag融合 HBsAg L粒子の大量発現 5%FBS- DMEM培地で COS7細胞を培養しておき、 80%コンフルェントに達した細 胞を用意する。培地を新しいものに交換し、 6— 8時間後にトリプシン処理して細胞を 集め、 1. 5mlチューブ 1本につき細胞が 4 X 106個になるように分注し、遠心した。 遠心条件は、 30秒、 l,2000rpmである。遠心後、上清を吸引除去し、エレクトロボレ ーシヨン溶液（Ep medium:RPMI-1640+ 10mMグルコース + 0.1mM DDT)を 30 0 1カ卩ぇ細胞を懸濁した。この細胞懸濁液に、表 1の各種 C末端 tag融合 HBsAg L 粒子発現プラスミド 5 gを加え、キュベット（4mmギャップ）に移した。これに 0.3KV、 950 Fの条件で電圧を印加（エレクト口ポレーシヨン)後、すぐに氷冷した。そして、キ ュベット内の細胞を 15mlの培地に再懸濁し、 10cmシャーレに播種した。 37°Cで 14一 15時間培養した後、培地をシャーレ 1枚につき無血清培地 CHO-S-SFM II (GIBCO 社) 8mlに交換し、さら〖こ 2日間培養した。培養上清を回収した後、再び CHO-S-SFM IIを 8πύ添加し、さらに 2日培養後の培養上清を集めた。数回分の培養上清を 4°Cで 保存しておいた。
(2)抗 FLAG-tag抗体固定ィ匕カラムによるァフィ二テフィークロマトグラフィー ベッドボリューム 0.35mlとなるよう抗 FLAG- tag抗体固定化ビーズ (Anti- FLAG M2 agarose Affinity gel, Sigma社）をカラムにつめて、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ PBS)で平衡化した。上記で得られた Δ 54-6-FLAGあるいは Δ 45-6-FLAG発現培養 上清 10mlをこのカラムに通して粒子を吸着させた後、 0.1Mリン酸 buffer (pH 3.5)を 300 μ Lづっ 7回通して粒子を溶出した。溶出液はあらかじめ 27 μ Lの 2Μリン酸 buffer (pH 8.0)を含むチューブに受けて分画した。培養上清およびカラム溶出液に含まれる粒 子濃度は、 IMXHBsAgアツセィシステムを用いて測定し、 280nmの吸光度より全タン ノ ク質濃度を概算した。その結果、抗 FLAG-tag抗体固定ィ匕カラム精製により、 4一 5 倍濃縮された精製粒子を、回収率 30— 40%の収率で得る事ができた。この結果を下 記の表 2にまとめた。いずれも場合も 100倍以上精製された。
[表 2] サンプル 精製前 p H 3 . 5溶出液
回収 液量 抗原量 液量 抗原量
(%)
(mL) (ng) (ml) (ng)
L-厶 45- FLAG 10 142 0.9 45.7 32
L- Δ 54 - FLAG 10 271 0.9 120 44
[0114] (3)コバルトカラムによるァフィ二テフィークロマトグラフィー
ベッドボリューム 0.4mlとなるよう TALON Co-レジン（CLONETECH社）をカラムにつ めて、 50mMリン酸カリウム緩衝液 (pH7.0)、 0.3M NaClで平衡化した。上記で得られ た His-tag付 HBsAg L粒子発現培養上清 50mlをこのカラムに通して粒子を吸着さ せた。約 5mlの 50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0)、 0.3M NaCl, 5 mMイミダゾー ルでカラムを洗浄した後、ゆっくりと 50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0)、 0.3M NaCl 、 150mMイミダゾールを通して粒子を溶出した。カラム溶出液に含まれる粒子濃度（ HBsAg当量)を IMX HBsAgアツセィシステムを用いて測定したところ、 150mMイミダ ゾール溶出液に His-tag融合 HBsAg L粒子が濃縮回収された。
[0115] (4)ァフィ-テフィー精製された C末端 tag融合 HBsAg L粒子のヒト肝細胞特異的 感染能
上記のァフィ-テフィー精製された C末端 tag融合 HBsAg L粒子では、 N末端の PreS領域 (ヒト肝細胞認識領域)が保存されているため、野生型 HBsAg L粒子同様 のヒト肝細胞特異的感染能を保持して 、る。
[0116] 上記でァフィ-テフィー精製した C末端 tag融合 HBsAg L粒子をダルベッコ PBSで 平衡ィ匕したセフアデックス G25 (アマシャム)カラムに通して緩衝液を置換した。粒子（ HBsAg濃度として 10-500ng/ml)に最終濃度 10mMとなるように力ルセイン (黄色蛍光 物質、ドータイト社）を混合して液量を 0.5mlとしたのち、エレクト口ポレーシヨン用チヤ ンバーに入れ、エレクト口ポレーシヨン（条件： 220V, 950 μ F)〖こより、力ルセインを粒 子内部に封入した。
[0117] あら力じめヒト肝癌由来細胞株 HepG2、ヒト扁平上皮癌由来細胞株 A431,および ハムスター由来 CHO細胞を、各々 8ウエルチヤンバースライドに播種し、 1日培養して 70-80%コンフルェント状態の細胞を準備しておいた。これらの細胞に、上記で調製 した力ルセイン封入粒子を添カ卩し、 8— 16時間培養した。各ゥエルを培地で 2回洗浄 して遊離の力ルセイン除 、た後、細胞に取り込まれた力ルセインを共焦点レーザー顕 微鏡で観察した。その結果、力ルセインを封入した tag融合 HBsAg L粒子では、野 生型 HBsAg L粒子に封入した場合と同様に、 HepG2細胞への力ルセイン導入増 強がみられたが、他の細胞では増強効果が見られな力つた。
[0118] 〔実施例 7 : C末端ベータセルリン (BTC)融合 HBsAg Lタンパク質粒子を発現す るプラスミドの作製〕
実施例 2および実施例 3に記載の、 HBsAg Lタンパク質あるいは C末端領域欠損 HBsAg Lタンパク質の C末端にスぺーサーを介して tag配列を融合した粒子を発現 するプラスミドに、さらにヒト BTC配列を融合することにより、 BTCを粒子表面に提示 する HBsAg Lタンパク粒子発現プラスミドを作成した。上記 BTCとは、ヒト上皮細胞 増殖因子 (EGF)ファミリーに属する増殖因子で、細胞上の EGF受容体 (EGFR)と 高い親和性を有する。従って、 C末端に融合された BTCと EGFRとの結合を介した E GFR陽性細胞認識能が期待される。
[0119] 具体的には、 Growth Factors Vol. 13,pl81-191記載のヒト BTC配列をコードするプ ラスミド、 pB041を铸型として、 Ndel配列を付加した配列番号 39の合成オリゴヌタレ ォチドと PvuII配列を付加した配列番号 40の合成オリゴヌクレオチドとをプライマーと して用いた PCR反応を行って、 BTCの EGFドメイン配列を含む遺伝子断片を増幅し 、増幅 DNAを pCRR2.1ベクター（Invitrogen社）にクローユングした。クロー-ングさ れた塩基配列を確認した後、 BTC配列を含む遺伝子断片を制限酵素 Ndelと PvuIIで 切り出した。実施例 2および実施例 3で作成した pB0790あるいは pB0791を制限酵 素 Ndelと PvuIIとで切断し、上記の BTC遺伝子断片を各々挿入することにより、 C末端 BTC融合 HBsAg L粒子発現用プラスミドを作成した。これらのプラスミドにおいて、 HBsAg L蛋白質 C末端に融合された BTC配列を図 5に示す。なお図中、 HBsAg
Lタンパク質との融合に使用した Sadサイトを波線で、ベータセルリン (EGFドメイン） 配列挿入用に導入した Ndelサイトを点線、 PvuIIサイトを二重下線で各々示した。また アミノ酸配列中、 FLAG-tag配列をボールド、 ZZ-tag配列を下線、 His-tag配列をィタリ ックで示した。
[0120] 〔実施例 8 : C末端 BTC融合 HBsAg Lタンパク質粒子の発現〕
実施例 6(1)記載の方法を用いて、上記 C末端 BTC融合 HBsAg L粒子発現用プ ラスミドを COS7細胞にトランスフエタトし、その培養上清を回収した。この培養上清中 の粒子量を、抗 HBsAg抗体を用いた IMX HBsAgアツセィキットで測定した結果、培 養上清への粒子分泌が確認された。
[0121] 〔実施例 9 : C末端 BTC融合 HBsAg Lタンパク質粒子の二つの認識部位による感 染能〕
C末端 BTC融合 HBsAg Lタンパク質粒子は、 N末端の PreS領域 (ヒト肝細胞認識 領域）によるヒト肝細胞特異的感染能と同時に、新たに表面に提示された BTCの特 異性による感染能を有する。 EGFRは多くの癌細胞に過剰発現されており、 EGFR に結合するリガンドゃ抗体は肝癌細胞標的に用いられて 、る。
[0122] 上記で作製された C末端 BTC融合 HBsAg L粒子（100-lOOOng/ml)に最終濃度 10mMとなるように力ルセインを混合したのち、エレクト口ポレーシヨン用チャンバ一に 入れ、エレクト口ポレーシヨン (条件：220V、 950 μ F)〖こより、力ルセインを粒子内部に 封入した。
[0123] あらカゝじめヒト肝癌由来細胞株 HepG2 (EGFRも陽性）、と EGFR過剰発現細胞で あるヒト扁平上皮癌由来細胞株 A431、および EGFRがほとんど発現して ヽな 、ノヽム スター由来 CHO細胞を、各々 8ウエルチヤンバースライドに播種し、 1日培養しておい た。これらの細胞に上記で調製した力ルセイン封入粒子を添加し、 6— 16時間培養し た。遊離の力ルセインを培地で洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。そ の結果、力ルセイン封入 BTC融合 HBsAg L粒子を用いることにより、 HepG2細胞 と A431細胞への力ルセイン導入増強がみられた力 CHO細胞では増強効果が見ら れなかった。
[0124] また、あら力じめ野生型 HBsAg L粒子あるいは BTCタンパク質を各細胞に添カロし て 4°Cで 30分インキュベートし、細胞上の受容体をブロックした。その後、力ルセイン 封入粒子を添加して、 6時間培養後観察した。 HepG2細胞に力ルセイン封入野生型 HBsAg L粒子を添加した場合には、野生型 HBsAg L粒子前処理によりカルセィ ン導入が大きく低下したのに対し、力ルセイン封入 BTC融合 HBsAg L粒子を添カロ した場合には、少し低下しただけだった。 A431細胞への力ルセイン封入 BTC融合 H BsAg L粒子を添加した場合、野生型 HBsAg L粒子前処理による力ルセイン導入 能の低下は見られなカゝつた。 BTCタンパク質で各細胞を前処理した場合、カルセィ ン封入 BTC融合 HBsAg L粒子の A431細胞への力ルセイン導入はほぼ消失したが 、 HepG2細胞への導入能は少し低下しただけだった。野生型 HBsAg L粒子と BT Cタンパク質とで同時に前処理した HepG2細胞への導入能は、大きく低下した。ヒト 肝癌細胞に対する二種の異なる認識部位 (本実施例の場合、 N末端部の PreSと C末 端部の BTC)が相補的に働くことにより、より確実に標的細胞への感染を達成できる ことが示された。
[0125] 〔実施例 10 : C末端 ZZタグ (ZZ-tag)融合 HBsAg Lタンパク質粒子を発現するプ ラスミドの作製〕
実施例 3に記載の、 HBsAg Lタンパク質 C末端にスぺーサーを介して tag配列を 融合した粒子を発現するプラスミドに、さらに ZZ-tag配列を融合することにより、 ZZ-tag配列を粒子表面に提示する HBsAg Lタンパク粒子発現プラスミドを作成し た。上記 ZZ-tagとは、 Staphyrococcus aureus由来 ProteinAの「ィムノグロブリン Gの Fc 領域結合領域をコードするアミノ酸配列 (ZZタグの配列: N末から、
Figure imgf000034_0001
APK)」であり、 ZZ-tag表面に提示した粒子ではこれを介することにより各種の「抗体」 あるいは「抗体 Fc領域とリガンドタンパク質との融合タンパク質」の粒子表面への提示 が可能となる。
[0126] 具体的には、 ZZ- tag配列をコードするプラスミド pMWIZl(Appl. Microbiol.
Biotechnol. Vol. 57, p.500-505, 2001に記載)を铸型として、 Ndel配列を付加した配 列番号 41の合成オリゴヌクレオチドと、 PvuII配列を付加した配列番号 42の合成オリ ゴヌクレオチドとを、プライマーとして用いて PCR反応を行い、 ZZ-tag配列を含む遺伝 子断片を増幅し、増幅 DNAを pCR(R)2.1ベクター（Invitrogen社）にクローユングした 。クローニングされた塩基配列を確認した後、 ZZ-tag配列を含む遺伝子断片を制限 酵素 Ndelと PvuIIで切り出した。実施例 2および 3で作成した pB0790あるいは pB079 1を制限酵素 Ndelと PvuIIとで切断し、上記の ZZ-tag遺伝子断片を各々挿入すること により、 C末端 ZZ-tag融合 HBsAg L粒子発現用プラスミドを作成した。これらのブラ スミドにおいて、 HBsAg L蛋白質領域に付加された配列を図 6に示す。なお図中、 HBsAg Lタンパク質との融合に使用した Saclサイトを波線で、 ZZ_tag配列挿入用に 導入した Ndelサイトを点線、 PvuIIサイトを二重下線で各々示した。またアミノ酸配列中 、 FLAG-tag配列をボールド、 ZZ-tag配列を下線、 His-tag配列をイタリックで示した。
[0127] 〔実施例 11 : C末端 ZZ- tag融合 HBsAg Lタンパク質粒子の発現〕
実施例 6 (1)と同様に、上記 C末端 ZZ-tag融合 HBsAg L粒子発現用プラスミドを C OS7細胞にトランスフエタトし、その培養上清を回収した。この培養上清中の粒子量 を、抗 HBsAg抗体を用いた IMX HBsAgアツセィキットで測定した結果、培養上清へ の粒子分泌が確認された。
[0128] 〔実施例 12 :抗体提示 ZZ- tag融合 HBsAg Lタンパク質粒子の二つの認識部位に よる感染能〕
ZZ-tag配列は、抗体分子の Fc部分に対して高い親和性を有しており、例えば癌特 異的抗体であるヒト EGF受容体 (EGFR)に対するマウスモノクローナル抗体 7G7B6 等と特異的に結合することができる。そこで、上記 C末端 ZZ-tag融合 HBsAg Lタン ノ^質粒子と抗体とを結合させることにより、粒子表面に抗体を提示した C末端 ZZ-tag融合 HBsAg Lタンパク質粒子を作成した。抗体を提示した C末端 ZZ_tag融 合 HBsAg Lタンパク質粒子は、 N末端の PreS領域 (ヒト肝細胞認識領域）〖こよるヒト 肝細胞特異的感染能と同時に、新たに表面に提示された抗体の特異性による感染 能を有する。
[0129] (1)抗 EGFR抗体提示粒子による EGFR高発現細胞への感染
実施例 11で作製された C末端 ZZ-tag融合 HBsAg L粒子（50-lOOOng/ml)に最終 濃度 ImMとなるように力ルセイン (黄色蛍光物質)を混合したのち、エレクト口ポレーシ ヨン用チャンバ一に入れ、エレクト口ポレーシヨン (条件： 220V、 950 F)により、力ルセ インを粒子内部に封入した。力ルセイン封入粒子に対し、等モル量のマウスモノクロ ーナル抗体 7G7B6を混合し、 PBS中で約 1時間反応させた。これにより粒子表面に抗 EGFR抗体を提示し内部に力ルセインを封入した C末端 ZZ-tag融合 HBsAg Lタン ノ ク質粒子が作製できた。
[0130] あら力じめヒト肝癌由来細胞株 HepG2と、 EGFR過剰発現細胞であるヒト扁平上皮 癌由来細胞株 A431と、 EGFRがほとんど発現して!/、な!/ヽハムスター由来 CHO細胞と を、各々 8ウエルチヤンバースライドに播種し、 1日培養しておいた。これらの細胞に、 上記で調製した力ルセイン封入粒子を添加し、 6— 16時間培養した。遊離の力ルセ インを培地で洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、カノレセイン 封入抗 EGFR抗体提示 C末端 ZZ- tag融合 HBsAg L粒子を用いることにより、 Hep G2細胞と A431細胞への力ルセイン導入増強がみられた力 CHO細胞では増強効 果が見られなカゝつた。
[0131] また、あら力じめ野生型 HBsAg L粒子を各細胞に添カ卩して、 4°C30分インキュべ ートした後、力ルセイン封入抗 EGFR抗体提示融合 HBsAg L粒子を添加した。さら に、 6時間培養後観察したところ、野生型 HBsAg L粒子で前処理した A431細胞へ の導入能は低下しな力つた力 HepG2細胞に対する力ルセイン導入は少し低下した 。抗 EGF抗体あるいは BTCタンパク質で各細胞を前処理した場合、 A431細胞への 力ルセイン導入は消失した力 HepG2細胞への導入能は少し低下しただけだった。 野生型 HBsAg L粒子と BTCタンパク質とで同時に前処理すると、 HepG2細胞へ の導入能が大きく低下した。
[0132] (2)抗ヒトトランスフ リン抗体提示粒子による TfR高発現細胞への感染
実施例 11で作製された C末端 ZZ-tag融合 HBsAg L粒子（50-lOOOng/ml)に最終 濃度 ImMとなるように力ルセイン (黄色蛍光物質)を混合したのち、エレクト口ポレーシ ヨン用チャンバ一に入れ、エレクト口ポレーシヨン (条件： 220V、 950 F)により、力ルセ インを粒子内部に封入した。力ルセイン封入粒子に対し、等モル量のマウス抗ヒトトラ ンスフヱリンレセプター（CD71)抗体（クロ-ン DF1513、 Ancell社等）を混合し、 PBS中 で約 1時間反応させた。これにより粒子表面に抗 TfR抗体を提示し内部に力ルセイン を封入した C末端 ZZ-tag融合 HBsAg Lタンパク質粒子が作製できた。 [0133] あら力じめヒト肝癌由来細胞株 HepG2と TfR過剰発現細胞であるヒト乳癌由来細 胞株 MCF7とヒト TfRを持たないマウス正常線維芽細胞 Balb/C 3T3 A31細胞を、各 々8ウエルチヤンバースライドに播種し、 1日培養しておいた。これらの細胞に上記で 調製した力ルセイン封入封入抗 TfR抗体提示粒子を添加し、 6— 16時間培養した。 遊離の力ルセインを培地で洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結 果、力ルセイン封入抗 TfR抗体提示 HBsAg L粒子を用いることにより、 HepG2細 胞と MCF7細胞への力ルセイン導入増強がみられた力 Balb/C 3T3 A31細胞へは 認められなかった。
[0134] (3)抗ヒト CD40抗体提示粒子によるヒト肝癌細胞株の二重標的化
ヒト肝細胞ガン表面特異的抗原に対する抗体、例えば抗ヒト CD10抗体ある ヽは抗 ヒト CD40抗体（BDファーミジェン社）は、 HepG2細胞をはじめ多くのヒト肝細胞ガン に結合することが知られている。実施例 12 (1)と同様にして、粒子表面に抗ヒト肝細 胞ガン抗体 (抗 CD40)を提示し内部に力ルセインを封入した C末端 ZZ-tag融合 HBs Ag Lタンパク質粒子を作製した。
[0135] あら力じめヒト肝癌由来細胞株 HepG2 (CD40陽性）と CD40陰性のヒト乳癌由来 細胞株 MCF7を、各々 8ウエルチヤンバースライドに播種し、 1日培養しておいた。こ れらの細胞に上記で調製した力ルセイン封入抗 CD40抗体提示粒子を添加し、 6— 16時間培養した。遊離の力ルセインを培地で洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡で 観察した。その結果、力ルセイン封入抗 CD40抗体提示 HBsAg L粒子を用いること により、 HepG2細胞への力ルセイン導入増強がみられた力 CD40抗原陰性の非肝 細胞である MCF7細胞への導入は認められなかった。
[0136] また、あら力じめ野生型 HBsAg L粒子を各細胞に添カ卩して、 30分インキュベート した後、力ルセイン封入抗 CD40抗体提示 HBsAg L粒子を添カ卩した。さらに、 6時 間培養後観察したところ、野生型 HBsAg L粒子で前処理した HepG2細胞に対す る力ルセイン導入は保たれて 、た。抗 CD40抗体で前処理した HepG2細胞に対す る力ルセイン導入も保たれていた。抗 CD40抗体と野生型 HBsAg L粒子で同時に 前処理した HepG2細胞に対する力ルセイン導入は大きく低下した。
[0137] 尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様また は実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような 具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなぐ本発明の精神と次に記 載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。 産業上の利用の可能性
[0138] 以上のように、本発明は、中空ナノ粒子を標的となる細胞や組織に効率的に送達 することができるとともに、その精製が簡便になり、薬剤等として用いた場合にその実 用性をより一層高めることができる。
[0139] 従って、本発明は、ドラッグデリバリーシステムに利用可能なナノカプセルとして、医 療関連産業や医薬品関連産業野に利用できるだけでなぐ各種試薬産業等にも利 用することが可能となる。

Claims

請求の範囲
[I] 粒子形成能を有するタンパク質により形成され、生体由来の化学構造を認識する 生体構造認識部位を表面に提示する中空ナノ粒子において、上記粒子形成能を有 するタンパク質のァミノ末端およびカルボキシル末端の双方に、上記生体構造認識 部位が設けられているとともに、それぞれの生体構造認識部位が認識する生体由来 の化学構造は異なって ヽることを特徴とする中空ナノ粒子。
[2] 上記生体構造認識部位の少なくとも一方は、標的となる細胞または組織に特異的 な構造を認識する標的構造認識部位であることを特徴とする請求項 1に記載の中空 ナノ粒子。
[3] 上記生体構造認識部位の何れか一方は、中空ナノ粒子そのものを特異的に認識 するための識別部位として機能することを特徴とする請求項 1または 2に記載の中空 ナノ粒子。
[4] 上記生体構造認識部位は、ウィルス由来の宿主細胞認識構造、抗原決定基、リガ ンド、リガンドの受容体の少なくとも何れかであることを特徴とする請求項 1から 3の何 れか 1項に記載の中空ナノ粒子。
[5] 上記ウィルス由来の宿主細胞認識構造が、 B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質に おける肝細胞認識部位であることを特徴とする請求項 4に記載の中空ナノ粒子。
[6] 上記抗原決定基が、タグ配列であることを特徴とする請求項 4に記載の中空ナノ粒 子。
[7] 上記タグ配列が、 Strep-tag II、 His-tag、 HA-tag、 FLAG-tagの少なくとも何れかで あることを特徴とする請求項 6に記載の中空ナノ粒子。
[8] 上記生体構造認識部位が、複数種類のタグ配列を組み合わせてなるものであるこ とを特徴とする請求項 6または 7に記載の中空ナノ粒子。
[9] 上記リガンドが、細胞増殖因子または ZZ-tagであることを特徴とする請求項 4に記 載の中空ナノ粒子。
[10] 上記細胞増殖因子が、上皮増殖因子または繊維芽細胞増殖因子であることを特徴 とする請求項 9に記載の中空ナノ粒子。
[II] 上記生体構造認識部位が、タグ配列とリガンドとを組み合わせてなるものであること を特徴とする請求項 6から 10の何れか 1項に記載の中空ナノ粒子。
[12] 上記粒子形成能を有するタンパク質が、ウィルス由来の表面抗原タンパク質であり 、当該表面抗原タンパク質の末端部に存在する宿主細胞認識構造を上記標的構造 認識部位として用いることを特徴とする請求項 2ないし 11の何れか 1項に記載の中空 ナノ粒子。
[13] 上記粒子形成能を有するタンパク質が、 B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質であ ることを特徴とする請求項 12に記載の中空ナノ粒子。
[14] 上記抗原決定基および Zまたはリガンドが、中空ナノ粒子そのものを特異的に認識 するための上記識別部位として設けられていることを特徴とする請求項 6から 13の何 れか 1項に記載の中空ナノ粒子。
[15] 上記生体構造認識部位は、粒子形成能を有するタンパク質の末端側のアミノ酸配 列を置換または付加することにより、当該タンパク質に導入されていることを特徴とす る請求項 1な 、し 14の何れ力 1項に記載の中空ナノ粒子。
[16] 少なくとも粒子形成能を有するタンパク質により形成され、生体由来の化学構造を 認識する生体構造認識部位を表面に提示する中空ナノ粒子の生産方法にお!ヽて、 当該中空ナノ粒子が、上記粒子形成能を有するタンパク質のァミノ末端およびカル ボキシル末端の双方に、上記生体構造認識部位が設けられており、かつ、各生体構 造認識部位が認識する生体由来の化学構造は異なっているものであり、上記粒子形 成能を有するタンパク質をコードする遺伝子と、上記生体構造認識部位をコードする ポリヌクレオチドとをつなげたキメラ遺伝子を構築し、これを真核細胞に導入して発現 させることを特徴とする中空ナノ粒子の生産方法。
[17] 上記真核細胞は、酵母、昆虫細胞または動物細胞の何れかであることを特徴とする 請求項 16に記載の中空ナノ粒子の生産方法。
[18] 上記粒子形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子として、ウィルス由来の表 面抗原タンパク質をコードする遺伝子が用いられるとともに、当該遺伝子における、 表面抗原タンパク質のカルボキシル末端側となる側に、生体構造認識部位をコード するポリヌクレオチドとをつなげることにより、上記キメラ遺伝子が構築されることを特 徴とする請求項 16または 17に記載の中空ナノ粒子の生産方法。
[19] 上記キメラ遺伝子は、上記粒子形成能を有するタンパク質の末端側のアミノ酸配列 を、生体構造認識部位に置換または付加するように構築されて ヽることを特徴とする 請求項 16から 18の何れか 1項に記載の中空ナノ粒子の生産方法。
[20] さらに、上記識別部位により認識される化学構造を有する物質を担体として用いて 、上記中空ナノ粒子を精製することを特徴とする請求項 16から 19の何れ力 1項に記 載の中空ナノ粒子の生産方法。
[21] 請求項 1から 15の何れか 1項に記載の中空ナノ粒子に細胞導入物質が封入されて いることを特徴とする薬剤。
[22] 上記細胞導入物質が、遺伝子または薬理作用を有する化合物であることを特徴と する請求項 21に記載の薬剤。
[23] 請求項 21または 22に記載の薬剤を用いる疾患の治療方法。
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