JPWO2005049824A1 - 生体構造認識部位を提示する中空ナノ粒子およびその生産方法、並びにその利用 - Google Patents

Abstract

精製が簡便で、標的となる細胞または組織に細胞導入物質を効率よく導入することが可能な中空ナノ粒子を提供する。 本発明にかかる中空ナノ粒子は、粒子形成能を有するタンパク質により形成され、生体構造認識部位を表面に提示している。この生体構造認識部位は、上記タンパク質のＮ末端・Ｃ末端の双方に設けられており、それぞれの生体構造認識部位が認識する生体由来の化学構造は異なる。その少なくとも一方は、標的細胞・組織に特異的な構造を認識する標的構造認識部位であり、何れか一方は、中空ナノ粒子を特異的に認識する識別部位として機能することが好ましい。例えば、標的構造認識部位としては、Ｂ型肝炎ウィルスの肝細胞認識部位を、識別部位としては各種タグ配列等を挙げることができる。

Description

本発明は、生体構造認識部位を提示する中空ナノ粒子およびその生産方法とその利用とに関するものであり、より詳細には、少なくとも粒子形成能を有するタンパク質からなり、さらに、表面に生体構造認識部位を提示する中空ナノ粒子およびその生産方法と、その代表的な利用の一例とに関するものである。

近年、医学の分野において、患部に直接作用し、高い効果を示す副作用の少ない薬品の開発が盛んに行われている。特に、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）と呼ばれる方法は、目的細胞あるいは目的組織に対して特異的に薬剤等の有効成分を運搬し、目的箇所で有効成分を作用させることのできる方法として注目されている。

また、最近の分子細胞生物学の分野においても特定細胞への遺伝子導入は必要不可欠な技術として盛んに研究されている。さらに、ヒトゲノム計画の進展により各種疾患の遺伝的な背景が明らかになりつつある現在、このような細胞および組織に対する特異性の高い遺伝子導入法が確立されれば、遺伝子治療の分野での応用も可能となる。

細胞または組織に遺伝子を導入する方法（遺伝子導入法）としては、すでに様々な方法が提案されている。代表的なものとしては、（１）特異的に薬剤となるタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれた発現プラスミドを、電気パルス刺激により細胞膜に穿孔を開けて流入させるエレクトロポレーション法、（２）パーティクルガン（遺伝子銃）等により目的細胞に導入して、この遺伝子を細胞内で発現させることにより当該タンパク質を細胞内に送り込むパーティクルデリバリー法等が挙げられる。

けれどもこれらの遺伝子導入法は、簡便ではあるが、細胞を物理的に傷つけ、遺伝子導入部位を外科的に露出させる必要がある。そのため、生体内部の細胞や組織には容易に適用できない。また、１００％近い導入率を得ることも困難となっている。

さらに、感染性ウィルスを用いて遺伝子導入法を行う技術が開発されている。この方法は、ウィルスＤＮＡに目的の遺伝子を組み込んだ感染性ウィルスを生成し、目的細胞を感染させて遺伝子を導入する。この方法では、上述した各遺伝子導入法のように、導入部位を露出させる必要がなく、個体にも応用でき、導入効率も１００％近い画期的な方法として注目されている。しかしながら、ウィルスが広範囲の細胞に非特異的に感染するため目的の細胞以外にも遺伝子が導入されてしまうという問題が生じる。

このように、従来の遺伝子導入法は、いずれも、目的の細胞に対して特異的に遺伝子を送り込み、細胞内で薬剤となるタンパク質を発現させる方法としては不十分なものであった。他方、薬剤となるタンパク質を直接的に目的細胞、あるいは、目的組織に送り込む方法については、未だ有効な方法が開発されていない状況にあった。

そこで本発明者らは、新規な遺伝子導入法として、目的とする細胞や組織に、物質（遺伝子、タンパク質、化合物等）を運搬、導入するため方法として、粒子形成能を有するタンパク質を用いて形成される中空ナノ粒子を用いた技術を提案した（特許文献１：特開２００１−３１６２９８（公開日：２００１年１１月１３日））。

この技術では、粒子形成能を有するタンパク質に対して、そのアミノ酸配列のＮ末端に、特定の細胞または組織に対する認識能を有した生体構造認識部位を導入している。上記生体構造認識部位を導入したタンパク質を中空ナノ粒子として用いることにより、物質（遺伝子、タンパク質、化合物等）を特定の細胞あるいは組織に運搬、導入することが可能となる。それゆえ、この技術は、上述したような遺伝子治療等の分野への応用が非常に期待できるものとなっている。

ところで、上記中空ナノ粒子を利用する場合には、その用途に応じて、実用性を高めるための工夫が必要となる。

また、上記遺伝子導入法に上記中空ナノ粒子を用いる場合には、当該中空ナノ粒子を精製する必要がある。ここで、従来までの中空ナノ粒子の精製方法としては、例えば、勾配をかけたＣｓＣｌあるいはショ糖を用いた超遠心を繰返し行う方法、透析を繰り返し行う方法等を挙げることができるが、これら精製方法は煩雑であり、多くの時間を必要とする。それゆえ、実用性をより高めるためには、中空ナノ粒子の精製をより効率的にすることが非常に好ましい。

また、ＤＤＳ等の用途においては、中空ナノ粒子内に封入した薬剤となる物質を効率良く特定の細胞または組織に送達する必要がある。このように送達の効率性を高めるためには、組織や細胞側の受容体数が少ない場合、Ｎ末端に導入した生体構造認識部位が何らかの物質で阻害された場合、さらには、他の分子と競合して受容体認識に支障がある場合を考慮する必要がある。

このように、上記中空ナノ粒子の技術は、それ自体画期的な技術ではあるものの、実用性をより高めるためには、さらなる改良が求められる。

そこで、本発明は、精製が簡便で、標的となる細胞または組織に細胞導入物質を効率よく導入することが可能な中空ナノ粒子とその生産方法、利用法の一例を提供することを目的としている。

本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ヒトＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を利用してＮ末端部以外の部分（Ｃ末端領域）に種々の標的認識部位を融合することにより、精製が簡便で、標的となる細胞または組織に細胞導入物質を効率よく導入することが可能で、実用性をより向上させた中空ナノ粒子を提供できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明にかかる中空ナノ粒子は、粒子形成能を有するタンパク質により形成され、生体由来の化学構造を認識する生体構造認識部位を表面に提示する中空ナノ粒子において、上記粒子形成能を有するタンパク質のアミノ末端およびカルボキシル末端の双方に、上記生体構造認識部位が設けられているとともに、それぞれの生体構造認識部位が認識する生体由来の化学構造は異なっていることを特徴としている。

上記中空ナノ粒子においては、上記生体構造認識部位の少なくとも一方は、標的となる細胞または組織に特異的な構造を認識する標的構造認識部位であり、上記生体構造認識部位の何れか一方は、中空ナノ粒子そのものを特異的に認識するための識別部位として機能することが好ましい。

上記生体構造認識部位は、ウィルス由来の宿主細胞認識構造、抗原決定基、リガンド、リガンドの受容体の少なくとも何れかを挙げることができる。このうち、上記ウィルス由来の宿主細胞認識構造として、例えば、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質における肝細胞認識部位を挙げることができる。また、上記抗原決定基としては、例えば、タグ配列を挙げることができる。このタグ配列としては、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇの少なくとも何れかを挙げることができる。さらに、上記生体構造認識部位は、複数種類のタグ配列を組み合わせてなるものであってもよい。

また、上記リガンドとしては、例えば、細胞増殖因子を挙げることができる。この細胞増殖因子としては、上皮増殖因子または繊維芽細胞増殖因子を挙げることができる。また、抗体認識部位としての機能をもつＺＺ−ｔａｇもリガントとして含むことができる。

さらに、上記生体構造認識部位は、タグ配列とリガンドとを組み合わせてなるものであってもよい。

上記中空ナノ粒子の具体的な一例としては、上記粒子形成能を有するタンパク質が、ウィルス由来の表面抗原タンパク質であり、当該表面抗原タンパク質の末端部に存在する宿主細胞認識構造を上記標的構造認識部位として用いる例を挙げることができる。このとき、上記粒子形成能を有するタンパク質としては、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を挙げることができる。

また、上記中空ナノ粒子においては、上記抗原決定基および／またはリガンドが、中空ナノ粒子そのものを特異的に認識するための上記識別部位として設けられていることが好ましい。

さらに、上記中空ナノ粒子においては、上記生体構造認識部位は、粒子形成能を有するタンパク質の末端側のアミノ酸配列を置換することにより、当該タンパク質に導入されていてもよい。

本発明にかかる中空ナノ粒子の生産方法は、少なくとも粒子形成能を有するタンパク質により形成され、生体由来の化学構造を認識する生体構造認識部位を表面に提示する中空ナノ粒子の生産方法において、当該中空ナノ粒子が、上記粒子形成能を有するタンパク質のアミノ末端およびカルボキシル末端の双方に、上記生体構造認識部位が設けられており、かつ、各生体構造認識部位が認識する生体由来の化学構造は異なっているものであり、上記粒子形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子と、上記生体構造認識部位をコードするポリヌクレオチドとをつなげたキメラ遺伝子を構築し、これを真核細胞に導入して発現させることを特徴としている。

上記生産方法においては、上記真核細胞は、酵母、昆虫細胞または動物細胞の何れかであることが好ましい。また、上記生産方法においては、上記粒子形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子として、ウィルス由来の表面抗原タンパク質をコードする遺伝子が用いられるとともに、当該遺伝子における、表面抗原タンパク質のカルボキシル末端側となる側に、生体構造認識部位をコードするポリヌクレオチドをつなげることにより、上記キメラ遺伝子を構築すればよい。このとき、上記キメラ遺伝子は、上記粒子形成能を有するタンパク質の末端側のアミノ酸配列を、生体構造認識部位に置換するように構築されていることが好ましい場合がある。

上記生産方法においては、さらに、上記識別部位により認識される化学構造を有する物質を担体として用いて、上記中空ナノ粒子を精製することが好ましい。

本発明の利用の一例としては、上記中空ナノ粒子に細胞導入物質が封入されている薬剤を挙げることができる。この薬剤においては、上記細胞導入物質が、遺伝子または薬理作用を有する化合物であればよい。また、本発明の他の利用としては、この薬剤を用いる疾患の治療方法等を挙げることができる。

本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。

本発明に係る複数の生体構造認識部位を提示するタンパク質中空ナノ粒子を示す模式図である。 本発明の一実施形態におけるＣ末端タグ（ｔａｇ）融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク粒子の培養上清への分泌を示すグラフである。 本発明の一実施形態におけるＣ末端タグ（ｔａｇ）融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク粒子の培養上清への分泌を示すグラフである。 本発明の一実施形態におけるＣ末端タグ（ｔａｇ）融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク粒子の培養上清への分泌を示すグラフである。 本発明の一実施形態におけるＣ末端タグ（ｔａｇ）融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク粒子を、抗ＨＢｓＡｇ抗体によって免疫沈降させた結果を示す図であり、各泳動レーンは、１が野生型ＨＢｓＡｇＬタンパク質、２が陰性対照、３がＣ−７−ＦＬＡＧ、４がΔ２５−６−ＦＬＡＧ、５がΔ５４−６−ＦＬＡＧ、６がＣ−７−ＨＡ、７がΔ２５−６−ＨＡ、８がΔ５４−６−ＨＡ、９がΔ１１−６−ＦＬＡＧ、１０がΔ３３−６−ＦＬＡＧ、１１がΔ４５−６−ＦＬＡＧ、１２がΔ５８−６−ＦＬＡＧ、１３がΔ６３−６−ＦＬＡＧ、１４がΔ１３０−６−ＦＬＡＧを泳動したレーンである。 本発明の一実施形態におけるＣ末端タグ（ｔａｇ）融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク粒子を、抗ＨＢｓＡｇ抗体によって免疫沈降させた結果を示す図であり、各泳動レーンは、１が野生型ＨＢｓＡｇＬタンパク質、２が陰性対照、３がＣ−７−ＦＬＡＧ、４がΔ２５−６−ＦＬＡＧ、５がΔ５４−６−ＦＬＡＧ、６がＣ−７−ＨＡ、７がΔ２５−６−ＨＡ、８がΔ５４−６−ＨＡ、９がΔ１１−６−ＦＬＡＧ、１０がΔ３３−６−ＦＬＡＧ、１１がΔ４５−６−ＦＬＡＧ、１２がΔ５８−６−ＦＬＡＧ、１３がΔ６３−６−ＦＬＡＧ、１４がΔ１３０−６−ＦＬＡＧを泳動したレーンである。 本発明の一実施形態におけるＣ末端タグ（ｔａｇ）融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク粒子を、抗タグ（ｔａｇ）抗体によって免疫沈降させた結果を示す図であり、各泳動レーンは、１が野生型ＨＢｓＡｇＬタンパク質、２が陰性対照、３がＣ−７−ＦＬＡＧ、４がΔ２５−６−ＦＬＡＧ、５がΔ５４−６−ＦＬＡＧ、６がＣ−７−ＨＡ、７がΔ２５−６−ＨＡ、８がΔ５４−６−ＨＡ、９がΔ１１−６−ＦＬＡＧ、１０がΔ３３−６−ＦＬＡＧ、１１がΔ４５−６−ＦＬＡＧ、１２がΔ５８−６−ＦＬＡＧ、１３がΔ６３−６−ＦＬＡＧ、１４がΔ１３０−６−ＦＬＡＧを泳動したレーンである。 本発明の一実施形態におけるＣ末端タグ（ｔａｇ）融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク粒子を、抗タグ（ｔａｇ）抗体によって免疫沈降させた結果を示す図であり、各泳動レーンは、１が野生型ＨＢｓＡｇＬタンパク質、２が陰性対照、３がＣ−７−ＦＬＡＧ、４がΔ２５−６−ＦＬＡＧ、５がΔ５４−６−ＦＬＡＧ、６がＣ−７−ＨＡ、７がΔ２５−６−ＨＡ、８がΔ５４−６−ＨＡ、９がΔ１１−６−ＦＬＡＧ、１０がΔ３３−６−ＦＬＡＧ、１１がΔ４５−６−ＦＬＡＧ、１２がΔ５８−６−ＦＬＡＧ、１３がΔ６３−６−ＦＬＡＧ、１４がΔ１３０−６−ＦＬＡＧを泳動したレーンである。 Ｃ末端に融合されたＦＬＡＧ−ＢＴＣ−Ｈｉｓ−ｔａｇのＤＮＡ配列（上段）と推定アミノ酸配列（下段）を示す図である。 Ｃ末端に融合されたＦＬＡＧ−ＺＺ−Ｈｉｓ−ｔａｇのＤＮＡ配列（上段）と推定アミノ酸配列（下段）を示す図である。

本発明の実施の一形態について以下に詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。

本実施の形態では、本発明にかかる中空ナノ粒子、この中空ナノ粒子の生産方法、並びに、この中空ナノ粒子の利用の順に、本発明を詳細に説明する。

（１）本発明にかかる中空ナノ粒子
＜中空ナノ粒子の定義＞
本発明にかかる中空ナノ粒子は、少なくとも粒子形成能を有するタンパク質により形成されており、内部が空洞となっている粒子であれば特に限定されるものではない。ここでいうナノ粒子とは、立体的な形状を有し、かつナノメートルオーダーのサイズを有する微小な構造体であればよく、その形状は特に限定されるものではない。一般的には、略球状または楕円球状となっている。なお、ナノメートルオーダーとは、ｎｍ単位で表示することが妥当な範囲内を指す。

なお、以下に述べるように、本発明にかかる中空ナノ粒子は、粒子形成能を有するタンパク質により形成されることで、生体由来の化学構造を認識する生体構造認識部位を表面に提示している。

＜粒子形成能を有するタンパク質＞
本発明にかかる中空ナノ粒子を形成する、粒子形成能を有するタンパク質とは、真核細胞内で発現させることにより、当該真核細胞由来の脂質二重膜に多数の同タンパク質が埋め込まれた中空粒子を形成させることができる機能（粒子形成能）を有するタンパク質であれば特に限定されるものではなく、動物細胞、植物細胞、ウィルス、菌類等に由来する天然タンパク質や、種々の合成タンパク質等を挙げることができる。代表的なものとして、種々のウィルスから得られるサブウィルス粒子を挙げることができ、具体的には、ウィルス由来の表面抗原タンパク質を挙げることができる。なお、上記粒子形成能を有するタンパク質として用いられるタンパク質が、生体内において抗体を惹起する可能性がある場合などは、改変して抗原性を減少させたものを用いてもよい。

上記ウィルス由来の表面抗原タンパク質としては、後述する実施例にも示すように、Ｂ型肝炎ウィルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ：ＨＢＶ）表面抗原（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ、以下、説明の便宜上、適宜ＨＢｓＡｇと略す）タンパク質を挙げることができる（例えば、国際出願ＷＯ０１／６４９３０参照）。

ＨＢｓＡｇタンパク質は、２２６個のアミノ酸から構成されるＳタンパク質を含んでいる。Ｓタンパク質のＮ末端側に５５アミノ酸（ｐｒｅ−Ｓ２ ｐｅｐｔｉｄｅ）が付加したものがＭタンパク質、Ｍタンパク質のＮ末端側に、１０８もしくは１１９アミノ酸（ｐｒｅ−Ｓ１ ｐｅｐｔｉｄｅ）が付加したものがＬタンパク質である。

本発明者らは、遺伝子組換え酵母で上記ＨＢｓＡｇのＬタンパク質を発現させると、酵母由来の脂質二重膜に多数の同タンパク質が埋め込まれた短径約２０ｎｍ、長径約１５０ｎｍの楕円状中空粒子が形成されることを見出し、報告している（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６７，Ｎｏ．３，１９５３−１９６１，１９９２）。この中空粒子は、ＨＢＶゲノムを全く含まないので、ウィルスとしては機能せず、人体への安全性が極めて高い。また、ＨＢＶの肝細胞への感染力を担う肝細胞特異的レセプターを粒子表面に提示しているため、肝細胞に対して特異的に物質を運搬する運搬体としての機能も有している。それゆえ、本発明では、ＨＢｓＡｇタンパク質を好適に用いることができる。

このＨＢｓＡｇタンパク質のＬタンパク質は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有しているが、これに限定されるものではなく、上記粒子形成能を有していれば、その一部が改変された変異タンパク質であってもよい。

すなわち、本発明で用いられるＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質には、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＬタンパク質のみならず、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、粒子形成能を有するＬタンパク質の変異タンパク質も含まれる。

上記「１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質である。なお、ここでいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。

なお、上記Ｌタンパク質の変異タンパク質は、少なくとも粒子形成能を有していればよく、宿主細胞認識構造が機能する構造が含まれていなくてもよい。これは、後述するように、Ｌタンパク質の宿主細胞認識構造（Ｐｒｅ−Ｓ領域）を他の生体構造認識部位に置換してもよいためである。

＜生体構造認識部位＞
本発明にかかる中空ナノ粒子は、生体由来の化学構造を認識する生体構造認識部位を表面に提示している。この生体構造認識部位としては、特に限定されるものではなく、本発明にかかる中空ナノ粒子の標的としたい細胞や組織に特異的な分子を選択すればよい。具体的には、ウィルス由来の宿主細胞認識構造、抗原決定基、リガンドおよびリガンドの受容体の少なくとも何れかを挙げることができる。

上記ウィルス由来の宿主細胞認識構造とは、由来となるウィルスの感染の対象となる宿主細胞を認識する構造を指し、ウィルスの種類に応じてそれぞれ異なるものである。例えば、上記ＨＢＶの場合は、肝細胞認識部位であるＰｒｅ−Ｓ領域を挙げることができる。

上記抗原決定基とは、抗体と結合する部位またはＴ細胞受容体によって認識される部位であれば特に限定されるものではなく、抗原決定基を含む抗原そのものであってもよいが、本発明では、タグ（ｔａｇ）配列を好適に用いることができる。このタグ配列としては、例えば、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、ＺＺ−ｔａｇ等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。

上記リガンドとは、機能タンパク質に特異的に結合する物質であれば特に限定されるものではなく、広義では、上記抗原決定基や抗原、宿主細胞認識構造等も含まれる。具体的には、例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、骨由来成長因子（ＢＤＧ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）等の細胞増殖因子（成長因子）；インターロイキン等の細胞機能調節分子；抗体；抗体を結合するＺＺ−ｔａｇ；細胞膜結合透過性のＴＡＴペプチド等の機能ペプチド、タンパク質結合性ペプチド；糖鎖、脂質等の非ペプチド性リガンド；上記抗原決定基や抗原；等を挙げることができる。ここで、ＴＡＴペプチドとは、透過性を持つＨＩＶのｔａｔの部分ペプチドで、血液脳関門（ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ，ＢＢＢ）を透過させるキャリアとして使用できるという報告がなされている。

上記リガンドの受容体（レセプター）とは、上記リガンドと特異的に結合する機能タンパク質であれば特に限定されるものではない。具体的には、上記細胞増殖因子の受容体、インターロイキン受容体等の細胞機能調節分子の受容体、抗原や抗原決定基に対する抗体、非タンパク質性リガンド等のレセプター等を挙げることができる。

上記生体構造認識部位としてはどのようなものを採用してもよい。具体的には、本発明にかかる中空ナノ粒子の用途、すなわち標的となる細胞または組織に特異的な構造を認識するものを適宜選択すればよい。換言すれば、上記生体構造認識部位は、標的となる細胞または組織に特異的な構造を認識する標的構造認識部位となっていればよい。

具体的な例としては、標的となる細胞または組織（あるいは器官）が肝臓である場合、上記ＨＢＶのＰｒｅ−Ｓ領域を採用すればよい。また、標的がウィルス感染細胞である場合には、抗ウィルス性タンパク質抗体を選択すればよい。また、抗ウイルス性タンパク質抗体を提示させた場合は、本発明にかかる中空ナノ粒子をウィルス感染細胞の除去に利用することができる。

さらに、標的となる細胞が癌細胞である場合には、様々な生体構造認識部位を採用することができる。例えば、癌特異的抗体や癌細胞に特異的に現れるＥＧＦ受容体等が挙げられる。これらを提示した中空ナノ粒子に、癌を治療するための物質（薬剤や遺伝子等）を包含させることにより、癌細胞に対して特異的かつ効果的に作用する有効な治療薬となる。

癌細胞に特異的に現れるＥＧＦ受容体としては、標的となる細胞がヒト扁平上皮癌由来細胞である場合には、上記上皮増殖因子の一種であるベータセルリン（ＢＴＣ：Ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ）を選択することができる。このベータセルリンは、上皮細胞上の上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）と高い親和性を有する。そのため、これを粒子表面に提示した中空ナノ粒子は、ＥＧＦＲ過剰発現細胞であるヒト扁平上皮癌由来細胞に対して認識能をもつことが可能となる。

さらに、本発明における生体構造認識部位は、タグ配列とリガンドとを組み合わせてなるものであってもよい。具体的には、例えば、後述する実施例５で用いているＦＬＡＧ−ＢＴＣ−Ｈｉｓ−ｔａｇや、実施例１０で用いているＦＬＡＧ−ＺＺ−Ｈｉｓ−ｔａｇ等を挙げることができる。特に、ＦＬＡＧ−ＺＺ−Ｈｉｓ−ｔａｇのように、ＺＺタグを介した場合、各種の「抗体」または「抗体Ｆｃ領域とリガンドタンパク質との融合タンパク質」を生体構造認識部位として中空ナノ粒子表面に提示することができる。

＜本発明における生体構造認識部位の提示＞
本発明にかかる中空ナノ粒子は、上記粒子形成能を有するタンパク質（説明の便宜上、粒子形成タンパク質と称する場合がある）のアミノ末端およびカルボキシル末端の双方に、上記生体構造認識部位が設けられており、それぞれの生体構造認識部位が認識する生体由来の化学構造は異なっている。すなわち、本発明では、粒子形成タンパク質の両末端に設けられている生体構造認識部位は、それぞれ異なるペプチド分子となっている。

図１は、本発明にかかる中空ナノ粒子を示す模式図である。図１に示すように、中空ナノ粒子は、真核細胞由来の脂質二重膜に複数の粒子形成タンパク質２が埋め込まれた構造を有している。埋め込まれた状態は、脂質二重膜に粒子形成タンパク質２が複数回貫通した状態となっており、少なくともそのアミノ末端（Ｎ末端）に生体構造認識部位３が設けられている。これによって、生体構造認識部位３は中空ナノ粒子の表面に提示されることになる。

ここで、粒子形成タンパク質２として、上記ＨＢｓＡｇのＬタンパク質を用いた場合を例に挙げると、Ｎ末端側の生体構造認識部位３としてはＨＢＶの肝細胞認識部位をそのまま用いることができる。すなわち、本発明では、上記粒子形成タンパク質が、ウィルス由来の表面抗原タンパク質であれば、当該表面抗原タンパク質の末端部に存在する宿主細胞認識構造を上記標的構造認識部位として用いることができる。

本発明では、さらに、Ｃ末端側に、他の生体構造認識部位１を設けることで、複数の生体構造認識部位を提示する中空ナノ粒子としている。

従来の中空ナノ粒子は生体構造認識部位をＮ末端側に１つしか有していなかった。そのため、組織や細胞側の受容体数が少ない場合、Ｎ末端に導入した生体構造認識部位が何らかの物質で阻害された場合、さらには、他の分子と競合して受容体認識に支障がある場合等には、中空ナノ粒子を標的となる細胞や組織に効率的に送達することが困難となっていた。これに対して、本発明では、それぞれ異なる生体構造認識部位１・３を有しているため、上記各場合にも十分に対応することが可能となり、従来よりも標的に対する認識率をより高くすることが可能となる。

ここで、本発明では、上記生体構造認識部位の少なくとも一方、好ましくは双方とも、標的となる細胞または組織に特異的な構造を認識する標的構造認識部位となっていればよいが、さらに、上記生体構造認識部位の何れか一方は、中空ナノ粒子そのものを特異的に認識するための識別部位として機能することがより好ましい。この識別部位となる生体構造認識部位としては、上記タグ配列等の抗原決定基および／または細胞増殖因子等のリガンドを挙げることができる。

例えば、Ｃ末端側の生体構造認識部位１を上述したタグ配列とすれば、固相化した抗タグ抗体を用いることにより、アフィニティー精製による精製が可能となる。それゆえ、Ｎ末端側の生体構造認識部位３が標的構造認識部位であるので、特定の細胞または組織へ中空ナノ粒子を効率的に送達できる上に、中空ナノ粒子の精製が簡便になる。その結果、本発明にかかる中空ナノ粒子の実用性をより一層高めることができる。

また、タグ配列とリガンドとを組み合わせたものをＣ末端側の生体構造認識部位１として用いれば、標的構造認識部位と識別部位とを確実に兼用することができる。それゆえ、標的となる細胞や組織への効率的な送達をより十分なものとすることができる。さらに、タンパク質に対する翻訳後修飾を利用することにより、非ペプチド分子である生体構造認識部位を粒子形成タンパク質２に導入しても良い。これにより、標的となる細胞や組織への送達の効率をより一層十分なものとすることができる。

なお、本発明にかかる中空ナノ粒子において、上記ＨＢＶ等のウィルス由来の表面抗原タンパク質を用いた場合、当該ウィルス由来の宿主細胞認識構造を上記標的構造認識部位として用いる必要はなく、前述した他の生体構造認識部位に置換することもできる。例えば、ＨＢＶの肝細胞認識部位を他の標的認識部位に改変してもよい。この場合、ＨＢＶ由来の表面抗原タンパク質ＨＢｓＡｇのＬタンパク質は、本来有している肝細胞認識部位を欠くことになるが、Ｎ末端側に他の標的構造認識部位を導入するか、Ｃ末端側に標的構造認識部位を導入することで、肝細胞以外の任意の細胞または組織に特異的に物質を運搬、導入することが可能となる。

（２）本発明にかかる中空ナノ粒子の生産方法
本発明にかかる中空ナノ粒子は、上記粒子形成タンパク質をコードする遺伝子と、上記生体構造認識部位をコードするポリヌクレオチドとをつなげたキメラ遺伝子を構築し、これを真核細胞に導入して発現させることにより生産することができる。真核細胞内で粒子形成タンパク質を生産させることにより、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、中空ナノ粒子として放出（分泌）される。本発明で用いられる真核細胞は特に限定されるものではないが、酵母、昆虫細胞または動物細胞の何れかを挙げることができる。

上記キメラ遺伝子の構築方法は特に限定されるものではなく、公知の遺伝子組換え技術を用いればよい。具体的には、例えば、上記粒子形成タンパク質をコードする遺伝子として、ウィルス由来の表面抗原タンパク質をコードする遺伝子を用いるときには、当該遺伝子における、表面抗原タンパク質のカルボキシル末端側となる側に、生体構造認識部位をコードするポリヌクレオチドをつなげてキメラ遺伝子を構築し、これを発現ベクターとすればよい。発現ベクターに含まれるプロモーター等の各種ＤＮＡセグメントについては特に限定されるものではなく、宿主となる真核細胞の種類に応じて適宜選択すればよい。

このとき用いられる粒子形成タンパク質をコードする遺伝子としては、本発明では、配列番号１に示される塩基配列を有するものを好適に用いることができる。もちろん、本発明はこれに限定されるものではなく、粒子形成能を有していれば、変異遺伝子であってもよいし、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする相同遺伝子であってもよい。なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。

上記生体構造認識部位をコードするポリヌクレオチドについても特に限定されるものではなく、生体構造認識部位として用いることのできる上記ウィルス由来の宿主細胞認識構造、抗原決定基、リガンド等のペプチド分子をコードする遺伝子等を好適に用いることができる（例えば、後述する各実施例参照）。

ここで、粒子形成タンパク質に生体構造認識部位を導入する場合、粒子形成タンパク質の末端側のアミノ酸配列を置換するようにキメラ遺伝子を設計すると好ましい。換言すれば、上記キメラ遺伝子は、上記粒子形成能を有するタンパク質の末端側のアミノ酸配列を、生体構造認識部位に置換するように構築されていると好ましい。これにより、不必要なアミノ酸配列を排除することが可能となるので、中空ナノ粒子の表面に生体構造認識部位を確実に提示することができる。なお、生体構造認識部位を導入する場合に、粒子形成タンパク質の末端側のアミノ酸配列を置換する場合でも、置換せず付加する場合でも、任意のアミノ酸残基数からなるスペーサー配列を設けてもよい。これにより効率的な置換または付加が可能となる。

本発明にかかる中空ナノ粒子の生産方法では、真核細胞内で上記キメラ遺伝子を発現させることにより、真核細胞から中空ナノ粒子が放出されるが、さらに、生体構造認識部位に含まれる識別部位となる構造に応じて、当該識別部位により認識される化学構造を有する物質（担体）を固相化し、これを用いて、中空ナノ粒子を精製する。これにより効率的な精製が可能となる。このとき用いられる担体としては特に限定されるものではなく、公知のものを好適に用いることができる。同様に精製方法も特に限定されるものではなく、カラムクロマトグラフィー等の公知の方法を好適に用いることができる。

（３）本発明にかかる中空ナノ粒子の利用
＜薬剤としての利用＞
本発明にかかる中空ナノ粒子は、内部に細胞導入物質を封入することで各種薬剤として好適に用いることができる。すなわち、本発明にかかる中空ナノ粒子は、遺伝子や薬物を疾患部位特異的に送達するナノカプセルとして応用することができる。これによって、中空ナノ粒子に封入した遺伝子や薬物を、標的となる疾患細胞あるいは疾患組織に効率的に送達することができるだけでなく、生体構造認識部位をそれぞれ変えることによって、異なる細胞や組織に対してそれぞれ遺伝子や薬物を同時に送達することも可能になる。また、遺伝子の場合には、各種形質転換等の遺伝子導入法に本発明を利用できるだけでなく、遺伝子治療等にも利用することができる。

このとき用いられる細胞導入物質としては、特に限定されるものではないが、遺伝子または薬理作用を有する化合物であればよい。より具体的には、例えばＤＮＡ、ＲＮＡなどの遺伝子・オリゴヌクレオチド；天然あるいは合成タンパク質・ペプチド；天然または合成化合物等の薬物；等を挙げることができる。

より具体的には、すでに発明者らにより報告されたヒトＲＮａｓｅ１（Ｊｉｎｎｏ Ｈ，Ｕｅｄａ Ｍ，Ｏｚａｗａ Ｓ，Ｉｋｅｄａ Ｔ，Ｅｎｏｍｏｔｏ Ｋ，Ｐｓａｒｒａｓ Ｋ，Ｋｉｔａｊｉｍａ Ｍ，Ｙａｍａｄａ Ｈ，Ｓｅｎｏ Ｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．１９９６；５８（２１）：１９０１−８）またはＲＮａｓｅ３（別名ＥＣＰ：ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｍａｌｌｏｒｑｕｉ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ Ｇ，Ｐｏｕｓ Ｊ，Ｐｅｒａｃａｕｌａ Ｒ，Ａｙｍａｍｉ Ｊ，Ｍａｅｄａ Ｔ，Ｔａｄａ Ｈ，Ｙａｍａｄａ Ｈ，Ｓｅｎｏ Ｍ，ｄｅ Ｌｌｏｒｅｎｓ Ｒ，Ｇｏｍｉｓ−Ｒｕｔｈ ＦＸ，Ｃｏｌｌ Ｍ；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０００ Ｊｕｌ ２８；３００（５）：１２９７−３０７．）等が適用される。これらのタンパク質は、細胞内外で作用し細胞傷害活性を有するものであるが、これらのＲＮａｓｅを本発明の物質運搬体（薬剤）に内包させて運搬することにより、細胞外では無毒化する一方、細胞内だけで作用させることができるので、より副作用の少ない新しい癌治療方法として期待される。

他にも、癌抑制遺伝子類（ｐ５３等）、インターフェロン類、インターロイキン類、サイトカイン類、コロニー刺激因子類、腫瘍壊死因子類、トランスフォーミング増殖因子β類、血小板由来増殖因子類、エリスロポイエチン類、Ｆａｓ抗原類などのタンパク質あるいは当該タンパク質をコードする遺伝子も挙げることができる。

＜薬剤の製造方法＞
本発明にかかる薬剤の製造方法、すなわち上記細胞導入物質を上記の中空ナノ粒子に封入する方法は特に限定されるものではなく、公知の化学的、分子生物学的実験手法で用いられる様々な方法が適用される。たとえば、エレクトロポレーション法、超音波法、単純拡散法、あるいは電荷を有する脂質を用いる方法等を挙げることができる。

また、細胞導入物質としてタンパク質を用いる場合は、粒子形成タンパク質に細胞導入物質を融合させて粒子形成する方法もある。粒子形成タンパク質に細胞導入物質を融合させる方法とは、例えば、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質をコードする遺伝子と、上記タンパク質薬剤をコードする遺伝子とがインフレームで連結されたプラスミドを構築し、このプラスミドを用いて真核細胞に粒子を形成させる。これによって、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質にタンパク質薬剤が融合した薬剤を製造することができる。

＜その他の利用＞
本発明にかかる中空ナノ粒子は、薬剤とした場合には、これを用いて疾患の治療方法に利用することができる。上記薬剤を静脈注射などによって体内に投与すれば、当該粒子は体内を循環し、粒子表面に提示した肝細胞特異的レセプターおよび表面に提示された認識部位により肝細胞に導かれ、感染する。そして、細胞導入物質が肝細胞中に送り込まれ、細胞導入物質の肝臓組織特異的な導入が行われる。なお、薬剤の投与方法としては、静脈注射による投与のほかに、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与等が挙げられる。

このように、本発明の薬剤を用いれば、ｉｎ ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞、または組織に特異的に物質を導入することができ、特定細胞または組織に物質を導入することを各種疾患の治療法あるいは治療法の１ステップとして行うことも可能になるのである。

また、薬剤以外にも、各種実験用試薬類やキット類として利用することができる。例えば、遺伝子導入法（形質転換法）に利用することで、より効率的な遺伝子導入が可能となる。

なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。

以下の実施例において、ＨＢｓＡｇとは、ＨＢＶの外被タンパク質であるＢ型肝炎ウィルス表面抗原（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）を示す。ＨＢｓＡｇは、２２６個のアミノ酸から構成されるＳタンパク質を含んでいる。Ｓタンパク質のＮ末端側に５５アミノ酸（ｐｒｅ−Ｓ２ ｐｅｐｔｉｄｅ）が付加したものがＭタンパク質、Ｍタンパク質のＮ末端側に、１０８もしくは１１９アミノ酸（ｐｒｅ−Ｓ１ ｐｅｐｔｉｄｅ）が付加したものがＬタンパク質である。

ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質の上記Ｐｒｅ−Ｓ領域（ｐｒｅ−Ｓ１，ｐｒｅ−Ｓ２）は、ＨＢＶが肝細胞に結合する際に、それぞれ重要な役割を担うことが知られている。ｐｒｅ−Ｓ１は、肝細胞に直接結合する部位を持ち、ｐｒｅ−Ｓ２は、血中の重合アルブミンを介して肝細胞に結合する重合アルブミンレセプターである。

真核細胞でＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積される。ＨＢｓＡｇのＬタンパク質は、分子間で凝集を起こし、小胞体膜を取り込みながら、出芽様式でルーメン側に粒子として放出され、動物細胞を宿主とした場合には、最終的には培養上清中へ放出される。

以下の実施例では、ＨＢｓＡｇのＬタンパク質を用いた。

〔実施例１：Ｃ末端に抗原となる各種のタグ配列を融合したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質を発現するプラスミドの構築〕
（１）Ｃ末端にストレプタグＩＩ（Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）配列を融合したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質を発現するプラスミドの構築
発明者らによってＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６７，Ｎｏ．３，１９５３−１９６１，１９９２にて報告された酵母用ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現プラスミドｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴを制限酵素ＸｈｏＩを用いて切断し、さらにＴ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理により末端平滑化したのち、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質をコードする遺伝子断片を得た。一方、動物細胞用発現プラスミドｐＴＢ１４５５（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．３３：，Ｎｏ．２，１５７−１７４，１９９４に記載）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、さらにＫｌｅｎｏｗ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理により末端平滑化した。その後、末端平滑化したｐＴＢ１４５５のＳＲα’プロモーターの下流に上述したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質をコードする遺伝子断片を組み込んで、動物細胞用ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現プラスミドｐＢ０４４１を得た。ｐＢ０４４１がコードするＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質の塩基配列は配列番号１に示され、アミノ酸配列は配列番号２に示されている。

上記動物細胞用ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現プラスミドｐＢ０４４１の終止コドンを、Ｓｅｒ残基をコードする塩基配列に置換するために、また同時に制限酵素ＳａｃＩサイトを挿入するために、ｐＢ０４４１を鋳型として、ＰＣＲ法に基づく部位特異的変異導入操作をＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）を用いてプライマーには配列番号３および４の合成オリゴヌクレオチドを用いた。具体的には反応液５０μｌ中に鋳型ＤＮＡ ５０ｎｍｏｌ、合成ＤＮＡプライマー（配列番号３および４の変異導入プライマー）各１５ｐｍｏｌ、ｄＡＴＰ ４０ｎｍｏｌ、ｄＣＴＰ ４０ｎｍｏｌ、ｄＧＴＰ ４０ｎｍｏｌ、ｄＴＴＰ ４０ｎｍｏｌ、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２．５Ｕ、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ２、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ中で、９５℃３０秒加熱後、９５℃３０秒の変性、４５℃１分のアニーリング、６８℃２０分の合成反応を１８サイクル行った。その後、制限酵素ＤｐｎＩ（１０，０００Ｕ／ｍｌ）を１μｌ加えて３７℃で１時間処理し、大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅを形質転換し、得られたコロニーからプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素地図および塩基配列により、目的の変異が導入されているプラスミドＤＮＡ（以下、ｐＢ０６１１とする）を選抜した。

次に、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ配列をコードする合成オリゴヌクレオチド（配列番号５とこれに相補的な配列番号６、ＥｃｏＲＶサイト挿入）の末端をＴ４ヌクレオチドキナーゼによりリン酸化したのち、アニーリングし、上記ｐＢ０６１１を制限酵素ＳａｃＩで切断したものに挿入することにより、Ｃ末端にＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ配列が融合されたＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質（以下、Ｃ−４−Ｓｔｒｅｐとする）発現プラスミドｐＢ０６４７を構築した。

ここで、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩとは、ストレプトアビジンに対してビオチンの様に高い親和性で結合するペプチドであり、Ｎ末端から順にＷＳＨＰＱＦＥＫのアミノ酸配列からなる。なお、Ｃ−４−Ｓｔｒｅｐは、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端とＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩとの間に４アミノ酸残基からなるスペーサー配列（ＳＳＳＡ）を有している。Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質の名称と、これを発現するプラスミドＤＮＡの名称と、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端に実際に融合した配列を表１（Ａ）に示す。

（２）Ｃ末端にＨＡタグ（ＨＡ−ｔａｇ）配列を融合したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質を発現するプラスミドの構築
まず、ＨＡ−ｔａｇ配列をコードする合成オリゴヌクレオチド（配列番号７とこれに相補的な配列番号８）の末端をＴ４ヌクレオチドキナーゼによりリン酸化したのちアニーリングさせた。その後、上記Ｃ末端Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現プラスミドｐＢ０６４７を制限酵素ＳａｃＩとＥｃｏＲＶとで切断してＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ配列を除去したのちに、上記合成オリゴヌクレオチドを挿入することによりＣ末端にＨＡ−ｔａｇ配列が融合されたＣ末端ＨＡ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現プラスミドｐＢ０７１０が構築された。なお、このＣ末端ＨＡ−ｔａｇ配列融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質は、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端とＨＡ−ｔａｇ配列との間に７アミノ酸残基からなるスペーサー配列（ＳＳＳＧＧＳＳ）を有している。ＨＡ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質の名称と、これを発現するプラスミドＤＮＡの名称と、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端に実際に融合した配列とを表１（Ａ）に示す。

ここで、ＨＡ−ｔａｇとは、Ｎ末端よりＹＰＹＤＶＰＤＹＡの配列を有するエピトープペプチドで、市販の抗ＨＡ抗体（例えば、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）と高い親和性で結合する。

（３）Ｃ末端にＨｉｓタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）配列を融合したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質を発現するプラスミドの構築
まず、Ｈｉｓ−ｔａｇ配列をコードする合成オリゴヌクレオチド（配列番号９とこれに相補的な配列番号１０）の末端をＴ４ヌクレオチドキナーゼによりリン酸化したのちアニーリングさせた。その後、上記Ｃ末端Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現プラスミドｐＢ０６４７のＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ配列領域を除去し、上記合成オリゴヌクレオチドを挿入することによりＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇ配列が融合されたＣ末端Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現プラスミドが構築された。なお、このＣ末端Ｈｉｓ−ｔａｇ配列融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質は、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端とＨｉｓ−ｔａｇ配列との間に７アミノ酸残基からなるスペーサー配列（ＳＳＳＧＧＳＳ）を有している。Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質の名称と、これを発現するプラスミドＤＮＡの名称と、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端に実際に融合した配列とを表１（Ａ）に示す。

ここで、Ｈｉｓ−ｔａｇとは、Ｈｉｓ残基が６個連続した配列（ＨＨＨＨＨＨ）を有するペプチドで、ニッケルやコバルトなどの金属イオンにキレートする能力をもつ。Ｈｉｓ−ｔａｇ配列を付加することにより、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質を金属キレートカラムによってアフィニティー精製することが可能となる。

（４）Ｃ末端にＦＬＡＧタグ（ＦＬＡＧ−ｔａｇ）配列を融合したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質を発現するプラスミドの構築
まず、ＦＬＡＧ−ｔａｇ配列をコードする合成オリゴヌクレオチド（配列番号１１とこれに相補的な配列番号１２）の末端をＴ４ヌクレオチドキナーゼによりリン酸化したのちアニーリングさせた。その後、上記Ｃ末端Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現プラスミドｐＢ０６４７のＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ配列領域を除去し、上記合成オリゴヌクレオチドを挿入することによりＣ末端にＦＬＡＧ−ｔａｇ配列が融合されたＣ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現プラスミドが構築された。なお、このＣ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ配列融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質は、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端とＦＬＡＧ−ｔａｇ配列との間に、７アミノ酸残基からなるスペーサー配列（ＳＳＳＧＧＳＳ）を有している。ＦＬＡＧ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質の名称と、これを発現するプラスミドＤＮＡの名称と、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端に実際に融合した配列とを表１（Ａ）に示す。

ここで、ＦＬＡＧ−ｔａｇとは、Ｎ末端よりＤＹＫＤＤＤＤＫの配列を有するペプチドで、市販の抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社）と高い親和性で結合する。

〔実施例２：スペーサー配列の長さの異なるＣ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質を発現するプラスミドの構築〕
ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端とＦＬＡＧ−ｔａｇ配列との間のスペーサー配列の長さの異なる、４種類のＣ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現プラスミドを構築した。

具体的には、実施例１の（４）で構築したＣ末端にＦＬＡＧ−ｔａｇ配列が融合したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質（Ｃ−７−ＦＬＡＧ）発現プラスミドｐＢ０７４７を制限酵素ＳａｃＩとＸｈｏＩとで切断し、スペーサー配列をコードする配列番号１３とこれに相補的な配列番号１４の合成オリゴマー、配列番号１５とこれに相補的な配列番号１６の合成オリゴマー、配列番号１７とこれに相補的な配列番号１８の合成オリゴマー、あるいはスペーサー中にスロンビン認識配列をコードする配列番号１９とこれに相補的な配列番号２０の合成オリゴマーの末端をＴ４ヌクレオチドキナーゼによりリン酸化したものを、各々挿入した。各々の長さのスペーサー配列をもつＦＬＡＧ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質の名称と、各発現プラスミドの名称と、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端に実際に挿入された配列とを表１（Ａ）に示す。

またスペーサー配列が長く、スロンビン認識配列、ＦＬＡＧ−ｔａｇ配列、Ｈｉｓ−ｔａｇ配列を同時に有する融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質を発現するプラスミドも構築した。具体的には、上記で得られたスロンビン認識配列とＦＬＡＧ−ｔａｇ配列とを融合したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質（Ｃ−１７（Ｔｒｂ）−ＦＬＡＧ）発現プラスミドｐＢ０７６７を制限酵素ＥｃｏＲＶで切断し、これにＨｉｓ−ｔａｇ配列をコードする配列番号２１とこれに相補的な配列番号２２の合成オリゴマーの末端をＴ４ヌクレオチドキナーゼによりリン酸化したものを、挿入した。その結果得られたプラスミドｐＢ０７９０がコードするＣ末端−ｔａｇ部分の配列を表１（Ａ）に示す。

〔実施例３：種々のＣ末端領域欠損体Ｃ末端にｔａｇ配列を融合したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質を発現するプラスミドの構築〕
（１）Ｃ末端領域２５アミノ酸残基を欠失したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端にＦＬＡＧ−ｔａｇ配列あるいはＨＡ−ｔａｇ配列を融合した融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質の発現プラスミドの構築
まず、実施例１で構築したＣ末端にＦＬＡＧ−ｔａｇ配列が融合したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現プラスミドｐＢ０７４７、あるいはＨＡ−ｔａｇ配列が融合したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現プラスミドｐＢ０７１０を鋳型として用い、配列番号２３の合成オリゴヌクレオチドと配列番号２４の合成オリゴヌクレオドとをプライマーとして用い、ＰＣＲ法に基づく部位特異的変異導入法（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社））を用いて、欠損させたい部分の前（具体的にはＳタンパク質領域のＷ２０１の後ろ）に制限酵素ＳａｃＩサイトを挿入した。反応液５０μｌ中に鋳型ＤＮＡ ５０ｎｍｏｌ、合成ＤＮＡプライマー（配列番号２３および２４の変異導入プライマー）各１５ｐｍｏｌ、ｄＡＴＰ ４０ｎｍｏｌ、ｄＣＴＰ ４０ｎｍｏｌ、ｄＧＴＰ ４０ｎｍｏｌ、ｄＴＴＰ ４０ｎｍｏｌ、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２．５Ｕ、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ２、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ中で、９５℃３０秒加熱後、９５℃３０秒の変性、４５℃または５５℃１分のアニーリング、６８℃２０分の合成反応を１８サイクル行った。その後、制限酵素ＤｐｎＩ（１０，０００Ｕ／ｍｌ）を１μｌ加えて３７℃で１時間処理し、大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅを形質転換し、得られたコロニーからプラスミドＤＮＡを抽出し、２ヶ所のＳａｃＩサイトを有するプラスミドＤＮＡを選抜した。鋳型として用いたｐＢ０７４７とｐＢ０７１０とはそのＣ末端部にＳａｃＩサイトを有しており、今回の変異で第２のＳａｃＩサイトが挿入されたことになる。塩基配列を確認したのち、得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩで切断し、ライゲーション反応を行うことによりＳａｃＩサイトに挟まれた部分（ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端領域２５アミノ酸残基）を欠失したＦＬＡＧ−ｔａｇ融合したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質（Δ２５−６−ＦＬＡＧ）発現プラスミドｐＢ０７４８、および、ＨＡ−ｔａｇ融合したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質（Δ２５−６−ＨＡ）発現プラスミドｐＢ０７４４を構築した。得られた各ｔａｇ融合タンパク質の名称、プラスミドの名称、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端に実際に融合した配列とを表１（Ｂ）に示す。

（２）Ｃ末端領域５４アミノ酸残基を欠失したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端にＦＬＡＧ−ｔａｇ配列あるいはＨＡ−ｔａｇ配列を融合した融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質の発現プラスミドの構築
ｐＢ０７４７あるいはｐＢ０７１０を鋳型プラスミドＤＮＡとして用い、変異導入用プライマーとして、配列番号２５の合成オリゴヌクレオチドと配列番号２６の合成オリゴヌクレオチドを用いて、実施例３（１）と同様の操作を行うことにより、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端領域５４アミノ酸残基を欠失したＦＬＡＧ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質（Δ５４−６−ＦＬＡＧ）発現プラスミドｐＢ０７４９、ＨＡ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質（Δ５４−６−ＨＡ）発現プラスミドｐＢ０７４５を構築した。得られた各ｔａｇ融合タンパク質の名称、プラスミドの名称、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端に実際に融合した配列とを表１（Ｂ）に示す。

（３）Ｃ末端領域１３０アミノ酸残基を欠失したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端にＦＬＡＧ−ｔａｇ配列あるいはＨＡ−ｔａｇ配列を融合した融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質の発現プラスミドの構築
ｐＢ０７４７あるいはｐＢ０７１０を鋳型プラスミドＤＮＡとして用い、変異導入用プライマーとして、配列番号２７の合成オリゴヌクレオチドと配列番号２８の合成オリゴヌクレオチドを用いて、上記（１）と同様の操作を行うことにより、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端領域１３０アミノ酸残基を欠失したＦＬＡＧ−ｔａｇ融合したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質（Δ１３０−６−ＦＬＡＧ）発現プラスミドｐＢ０７５０、ＨＡ−ｔａｇ融合したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質（Δ１３０−６−ＨＡ）発現プラスミドｐＢ０７４６を構築した。得られた各ｔａｇ融合タンパク質の名称、プラスミドの名称、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端に実際に融合した配列とを表１（Ｂ）に示す。

（４）その他のＣ末端領域アミノ酸残基を欠失したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端にＦＬＡＧ−ｔａｇ配列を融合した融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質の発現プラスミドの構築
上記（１）と同様の操作を行うことにより、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端領域がそれぞれ１１アミノ酸残基（変異導入用プライマー：配列番号２９および３０）、３３アミノ酸残基（変異導入用プライマー：配列番号３１および３２）、４５アミノ酸残基（変異導入用プライマー：配列番号３３および３４）、５８アミノ酸残基（変異導入用プライマー：配列番号３５および３６）、６３アミノ酸残基（変異導入用プライマー：配列番号３７および３８）を欠失したＦＬＡＧ−ｔａｇ融合したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質（Δ１１−６−ＦＬＡＧ）発現プラスミドｐＢ０７９２、ｐＢ０７９３（Δ３３−６−ＦＬＡＧ）、ｐＢ０７９４（Δ４５−６−ＦＬＡＧ）、ｐＢ０７８９（Δ５８−６−ＦＬＡＧ）、ｐＢ０７８８（Δ６３−６−ＦＬＡＧ）を構築した。得られた各ｔａｇ融合タンパク質の名称、プラスミドの名称、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端に実際に融合した配列とを表１（Ｂ）に示す。

また、ＦＬＡＧ−ｔａｇとＨｉｓ−ｔａｇ配列が連続して融合されたＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現プラスミドｐＢＯ７９０を鋳型に、配列番号２５の合成オリゴヌクレオチドと配列番号２６の合成オリゴヌクレオチドを変異導入プライマーに用いて、上記と同様の操作を行うことにより、Ｃ末端領域５４アミノ酸欠失したＣ末端ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質（Δ５４−１７（Ｔｒｂ）−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ）発現プラスミドｐＢ０７９１を作成した。

得られた各種のｔａｇ融合Ｃ末端欠失ＨＢｓＡｇ Ｌ蛋白質の名称と、プラスミドの名称、Ｃ末端領域およびｔａｇ部分の配列を、表１（Ｂ）に示す。

〔実施例４：Ｃ末端に各種タグ配列を融合したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣＯＳ７細胞による発現と粒子分泌の確認〕
（１）トランスフェクション試薬を用いたトランスフェクション
サル腎由来細胞株ＣＯＳ７は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）５％を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。ＣＯＳ７細胞を３×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌとなるようにウシ胎児血清（ＦＢＳ）１０％を含むＤＭＥＭ培地に浮遊し、３．５ｃｍディッシュへ１．５ｍｌずつ播種して、３７℃、５％ＣＯ２下で１４〜１５時間培養した。１．５ｍｌチューブに、９５μｌのＤＭＥＭ培地と４μｌのトランスフェクション試薬ＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）とを加えて混合したのち、上述した実施例１〜３でそれぞれ構築した各種Ｃ末端ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現プラスミドＤＮＡ（１μｇ／μｌ溶液）を１μｌ加えて混合した。室温で１５分間放置して複合体を形成させたのち、その全量を上記ＣＯＳ７細胞（３．５ｃｍディッシュ）に添加した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１４〜１５時間培養したのち、培地を１．５ｍｌの無血清培地ＣＨＯ−ＳＦＭ ＩＩ（インビトロジェン社）に交換し、さらに３日間培養後、培養上清を回収した。同様に、１０ｃｍディッシュでトランスフェクションを行う場合は、ＣＯＳ７細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈとなるように播種して、ＤＭＥＭ培地：ＦｕＧｅｎｅ６：プラスミドＤＮＡ＝６６５μｌ：２８μｌ：７μｌの複合体を添加し、１０ｍｌの培養上清を回収した。

（２）Ｃ末端ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子分泌の検出
回収した培地９０μｌに１％ＦＢＳを含むダルベッコリン酸緩衝液（ＰＢＳ）９０μｌを加えて、抗ＨＢｓＡｇ抗体を用いた酵素免疫測定法であるＩＭＸ ＨＢｓＡｇアッセイシステム（ダイナボット社製）により、培養上清中に分泌されたＨＢｓ抗原を検出した。ここで、培養上清中にＨＢｓＡｇ抗原が検出された場合、ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子が形成されて分泌されたと判断し、これにより培養液中に各Ｃ末端ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子の存在を確認した。

図２（Ａ）〜図２（Ｃ）は、実施例１および３でそれぞれ構築した各種Ｃ末端ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現プラスミドを用いて、上記の方法によって検出した各Ｃ末端ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子分泌の結果を示したグラフである。各々の粒子分泌量は、野生型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質を１００とした場合のＨＢｓ抗原当量の相対値（％）で示している。また、ＨＢｓＡｇ Ｌ遺伝子を含まないプラスミドによる培養上清の結果を陰性対照（ネガティブ：図中ｍｏｃｋ）とした。図２（Ａ）〜図２（Ｃ）に示すようにＣ−７−ＨＡ、Δ５４−６−ＨＡ、Δ５４−６−ＦＬＡＧ、Δ４５−６−ＦＬＡＧで野生型粒子の４０％以上のＨＢｓＡｇ Ｌ粒子の分泌が見られたが、他のｔａｇ融合体の野生型粒子の１０％程度と分泌が低かった。なお、各々の実験は３回以上行い、偏差値をバーで示してある。

次に、実施例２で構築したスペーサーの長さを変えた各種Ｃ末端ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現プラスミドを用いた場合、図２（Ｂ）に示すように、Ｃ−７−ＦＬＡＧが野生型粒子の１０％程度であったのに対し、スペーサーの長いＣ−９−ＦＬＡＧ、Ｃ−１３−ＦＬＡＧ、Ｃ−１７−ＦＬＡＧおよびＣ−１７（Ｔｒｂ）−ＦＬＡＧでは培養上清への分泌量が１０％程度増加していることが、すなわち、野生型粒子の２０％程度分泌していることが示された。

（３）Ｃ末端ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子の免疫沈降による検出
抗ＨＢｓマウスモノクローナル抗体による免疫沈降と、抗ＨＢｓマウスモノクローナル抗体あるいは抗ｔａｇ抗体によるウェスタンブロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を用いて、Ｃ末端ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子の分子量および分泌量を確認した。

回収した培養上清４ｍｌにＩＭＸ ＨＢｓＡｇアッセイシステムの抗ＨＢｓマウスモノクローナル抗体固定化マイクロパーティクルを３０μｌ加えて、ゆっくりチューブを回転させながら１晩、４℃においた。３分間卓上型高速遠心機を用いてマイクロパーティクルと共に培養上清中の粒子を沈降させ、得られた沈澱にＴＢＳＴ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を加えて懸濁し、さらに遠心を行って沈澱を回収する洗浄操作を５回くり返した。この沈殿を、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥをおこなった。還元条件下とは、上記沈殿をメルカプトエタノールを加えて９５℃、５分間処理してからＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったもので、システイン残基同士のジスルフィド結合は切断され、タンパク質はモノマーとして検出される。得られた電気泳動ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）に電気転写し、１次抗体にＩＭＸ ＨＢｓＡｇアッセイシステム（ダイナポット社）のヤギ抗ＨＢｓＡｇ抗体・ビオチン結合体、２次抗体にアルカリホスファターゼ標識ウサギ抗ビオチン抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、培養上清中のＨＢｓＡｇ Ｌ粒子を検出した。アルカリホスファターゼ活性はＣＤＰ−ｓｔａｒＴＭ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＮＥＢ社）を用いて検出した（図３Ａ）。その結果、図２（Ａ）および図２（Ｃ）で示した培養上清中の分泌量測定結果と矛盾しない強さの各ｔａｇ融合タンパク質のバンドが検出された。

次に、同じＰＶＤＦ膜について、１次抗体に抗ＨＡ−ｔａｇ抗体・ビオチン結合体（Ａｎｔｉ−［ＨＡ］−ｂｉｏｔｉｎ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）あるいは抗ＦＬＡＧ−ｔａｇ抗体・ビオチン結合体（Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧＲ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｍ２ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｓｉｇｍａ社）を、２次抗体に西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識アビジン（Ｚｙｍｅｄ社）を用いてリプロービングした。ＨＲＰ活性は、Ｗｅｓｔｅｒｎ ＬｉｇｈｔｅｎｉｎｇＴＭ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で検出した（図３Ｂ）。

その結果、図３Ａと同じ位置にバンドが検出されたことから、Ｃ末端にｔａｇ配列が融合したＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質であることが確認された。

〔実施例５：各種Ｃ末端ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子表面へのｔａｇ配列提示の確認〕
Ｃ末端に融合したｔａｇ配列が粒子の表面に提示されていれば、抗ｔａｇ抗体を用いた免疫沈降が可能となる。そこで、各種Ｃ末端ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子について、抗ＦＬＡＧ−ｔａｇ抗体固定化ビーズあるいは抗ＨＡ−ｔａｇ抗体固定化ビーズを用いた免疫沈降を行った。

具体的には、実施例４の（１）に記載した方法に従ってＣＯＳ７細胞に各発現プラスミドＤＮＡをトランスフェクションして得られた培養上清４ｍｌに抗ＦＬＡＧ−ｔａｇ抗体固定化ビーズ（Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧＲ Ｍ２ ａｇａｒｏｓｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇｅｌ、Ｓｉｇｍａ社）（１：１懸濁液）あるいは抗ＨＡ−ｔａｇ抗体固定化ビーズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ＨＡ ａｇａｒｏｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｃｌｏｎｅ ＨＡ−７、Ｓｉｇｍａ社）（１：１懸濁液）を各々３０μｌ加えて、ゆっくりチューブを回転させながら１晩、４℃においた。抗ＦＬＡＧ−ｔａｇ抗体固定化ビーズは、予め１０％ブロックエース（雪印乳業）を加えて４℃で３０分以上処理したものを使用した。３分間卓上型高速遠心機を用いてビーズと共に培地中の粒子を沈降させ、得られた沈澱にＴＢＳＴ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を加えて懸濁し、さらに遠心を行って沈澱を回収する洗浄操作を５回くり返した。この沈殿を、実施例４の（３）と同様の方法で、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１次抗体にＩＭＸ ＨＢｓＡｇアッセイシステム（ダイナポット社）のヤギ抗ＨＢｓＡｇ抗体・ビオチン結合体、２次抗体にアルカリホスファターゼ標識ウサギ抗ビオチン抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った（図４Ａ）。次に、同じＰＶＤＦ膜について、１次抗体に抗ＨＡ−ｔａｇ抗体・ビオチン結合体（Ａｎｔｉ−［ＨＡ］−ｂｉｏｔｉｎ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）あるいは抗ＦＬＡＧ−ｔａｇ抗体・ビオチン結合体（Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧＲ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｍ２ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｓｉｇｍａ社）を、２次抗体に西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識アビジン（Ｚｙｍｅｄ社）を用いてリプロービングした。ＨＲＰ活性は、Ｗｅｓｔｅｒｎ ＬｉｇｈｔｅｎｉｎｇＴＭ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で検出した（図４Ｂ）その結果、Ｃ−７−ＨＡ、Δ５４−６−ＨＡ、Δ４５−６−ＦＬＡＧ、Δ５４−６−ＦＬＡＧ、Δ５８−６−ＦＬＡＧは、対応する抗ｔａｇ抗体で免疫沈降されたことから、Ｃ末端ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子の表面にｔａｇ配列を提示していることが示された。

〔実施例６：Ｃ末端ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子のアフィニテフィークロマトグラフィーによる濃縮精製〕
粒子表面に提示されたタグ配列を利用することにより、抗タグ抗体によるアフィニテイークロマトグラフィーによる簡易精製および濃縮が可能となる。

（１）エレクトロポレーションによるｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子の大量発現
５％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地でＣＯＳ７細胞を培養しておき、８０％コンフルエントに達した細胞を用意する。培地を新しいものに交換し、６〜８時間後にトリプシン処理して細胞を集め、１．５ｍｌチューブ１本につき細胞が４×１０６個になるように分注し、遠心した。遠心条件は、３０秒、１，２０００ｒｐｍである。遠心後、上清を吸引除去し、エレクトロポレーション溶液（Ｅｐ ｍｅｄｉｕｍ：ＲＰＭＩ−１６４０＋１０ｍＭグルコース＋０．１ｍＭ ＤＤＴ）を３００μｌ加え細胞を懸濁した。この細胞懸濁液に、表１の各種Ｃ末端ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子発現プラスミド５μｇを加え、キュベット（４ｍｍギャップ）に移した。これに０．３ＫＶ、９５０μＦの条件で電圧を印加（エレクトロポレーション）後、すぐに氷冷した。そして、キュベット内の細胞を１５ｍｌの培地に再懸濁し、１０ｃｍシャーレに播種した。３７℃で１４〜１５時間培養した後、培地をシャーレ１枚につき無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ（ＧＩＢＣＯ社）８ｍｌに交換し、さらに２日間培養した。培養上清を回収した後、再びＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩを８ｍｌ添加し、さらに２日培養後の培養上清を集めた。数回分の培養上清を４℃で保存しておいた。

（２）抗ＦＬＡＧ−ｔａｇ抗体固定化カラムによるアフィニテフィークロマトグラフィー
ベッドボリューム０．３５ｍｌとなるよう抗ＦＬＡＧ−ｔａｇ抗体固定化ビーズ（Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｇａｒｏｓｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇｅｌ，Ｓｉｇｍａ社）をカラムにつめて、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化した。上記で得られたΔ５４−６−ＦＬＡＧあるいはΔ４５−６−ＦＬＡＧ発現培養上清１０ｍｌをこのカラムに通して粒子を吸着させた後、０．１Ｍリン酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ３．５）を３００μＬづつ７回通して粒子を溶出した。溶出液はあらかじめ２７μＬの２Ｍリン酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を含むチューブに受けて分画した。培養上清およびカラム溶出液に含まれる粒子濃度は、ＩＭＸＨＢｓＡｇアッセイシステムを用いて測定し、２８０ｎｍの吸光度より全タンパク質濃度を概算した。その結果、抗ＦＬＡＧ−ｔａｇ抗体固定化カラム精製により、４〜５倍濃縮された精製粒子を、回収率３０〜４０％の収率で得る事ができた。この結果を下記の表２にまとめた。いずれも場合も１００倍以上精製された。

（３）コバルトカラムによるアフィニテフィークロマトグラフィー
ベッドボリューム０．４ｍｌとなるようＴＡＬＯＮ Ｃｏ−レジン（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社）をカラムにつめて、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．３Ｍ ＮａＣｌで平衡化した。上記で得られたＨｉｓ−ｔａｇ付ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子発現培養上清５０ｍｌをこのカラムに通して粒子を吸着させた。約５ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．３Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾールでカラムを洗浄した後、ゆっくりと５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾールを通して粒子を溶出した。カラム溶出液に含まれる粒子濃度（ＨＢｓＡｇ当量）をＩＭＸ ＨＢｓＡｇアッセイシステムを用いて測定したところ、１５０ｍＭイミダゾール溶出液にＨｉｓ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子が濃縮回収された。

（４）アフィニテフィー精製されたＣ末端ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子のヒト肝細胞特異的感染能
上記のアフィニテフィー精製されたＣ末端ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子では、Ｎ末端のＰｒｅＳ領域（ヒト肝細胞認識領域）が保存されているため、野生型ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子同様のヒト肝細胞特異的感染能を保持している。

上記でアフィニテフィー精製したＣ末端ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子をダルベッコＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ２５（アマシャム）カラムに通して緩衝液を置換した。粒子（ＨＢｓＡｇ濃度として１０−５００ｎｇ／ｍｌ）に最終濃度１０ｍＭとなるようにカルセイン（黄色蛍光物質、ドータイト社）を混合して液量を０．５ｍｌとしたのち、エレクトロポレーション用チャンバーに入れ、エレクトロポレーション（条件：２２０Ｖ，９５０μＦ）により、カルセインを粒子内部に封入した。

あらかじめヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２、ヒト扁平上皮癌由来細胞株Ａ４３１，およびハムスター由来ＣＨＯ細胞を、各々８ウエルチャンバースライドに播種し、１日培養して７０−８０％コンフルエント状態の細胞を準備しておいた。これらの細胞に、上記で調製したカルセイン封入粒子を添加し、８〜１６時間培養した。各ウェルを培地で２回洗浄して遊離のカルセイン除いた後、細胞に取り込まれたカルセインを共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、カルセインを封入したｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子では、野生型ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子に封入した場合と同様に、ＨｅｐＧ２細胞へのカルセイン導入増強がみられたが、他の細胞では増強効果が見られなかった。

〔実施例７：Ｃ末端ベータセルリン（ＢＴＣ）融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質粒子を発現するプラスミドの作製〕
実施例２および実施例３に記載の、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質あるいはＣ末端領域欠損ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＣ末端にスペーサーを介してｔａｇ配列を融合した粒子を発現するプラスミドに、さらにヒトＢＴＣ配列を融合することにより、ＢＴＣを粒子表面に提示するＨＢｓＡｇ Ｌタンパク粒子発現プラスミドを作成した。上記ＢＴＣとは、ヒト上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーに属する増殖因子で、細胞上のＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）と高い親和性を有する。従って、Ｃ末端に融合されたＢＴＣとＥＧＦＲとの結合を介したＥＧＦＲ陽性細胞認識能が期待される。

具体的には、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｖｏｌ．１３，ｐ１８１−１９１記載のヒトＢＴＣ配列をコードするプラスミド、ｐＢ０４１を鋳型として、ＮｄｅＩ配列を付加した配列番号３９の合成オリゴヌクレオチドとＰｖｕＩＩ配列を付加した配列番号４０の合成オリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いたＰＣＲ反応を行って、ＢＴＣのＥＧＦドメイン配列を含む遺伝子断片を増幅し、増幅ＤＮＡをｐＣＲＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。クローニングされた塩基配列を確認した後、ＢＴＣ配列を含む遺伝子断片を制限酵素ＮｄｅＩとＰｖｕＩＩで切り出した。実施例２および実施例３で作成したｐＢ０７９０あるいはｐＢ０７９１を制限酵素ＮｄｅＩとＰｖｕＩＩとで切断し、上記のＢＴＣ遺伝子断片を各々挿入することにより、Ｃ末端ＢＴＣ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子発現用プラスミドを作成した。これらのプラスミドにおいて、ＨＢｓＡｇ Ｌ蛋白質Ｃ末端に融合されたＢＴＣ配列を図５に示す。なお図中、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質との融合に使用したＳａｃＩサイトを波線で、ベータセルリン（ＥＧＦドメイン）配列挿入用に導入したＮｄｅＩサイトを点線、ＰｖｕＩＩサイトを二重下線で各々示した。またアミノ酸配列中、ＦＬＡＧ−ｔａｇ配列をボールド、ＺＺ−ｔａｇ配列を下線、Ｈｉｓ−ｔａｇ配列をイタリックで示した。

〔実施例８：Ｃ末端ＢＴＣ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質粒子の発現〕
実施例６（１）記載の方法を用いて、上記Ｃ末端ＢＴＣ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子発現用プラスミドをＣＯＳ７細胞にトランスフェクトし、その培養上清を回収した。この培養上清中の粒子量を、抗ＨＢｓＡｇ抗体を用いたＩＭＸ ＨＢｓＡｇアッセイキットで測定した結果、培養上清への粒子分泌が確認された。

〔実施例９：Ｃ末端ＢＴＣ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質粒子の二つの認識部位による感染能〕
Ｃ末端ＢＴＣ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質粒子は、Ｎ末端のＰｒｅＳ領域（ヒト肝細胞認識領域）によるヒト肝細胞特異的感染能と同時に、新たに表面に提示されたＢＴＣの特異性による感染能を有する。ＥＧＦＲは多くの癌細胞に過剰発現されており、ＥＧＦＲに結合するリガンドや抗体は肝癌細胞標的に用いられている。

上記で作製されたＣ末端ＢＴＣ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子（１００−１０００ｎｇ／ｍｌ）に最終濃度１０ｍＭとなるようにカルセインを混合したのち、エレクトロポレーション用チャンバーに入れ、エレクトロポレーション（条件：２２０Ｖ、９５０μＦ）により、カルセインを粒子内部に封入した。

あらかじめヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２（ＥＧＦＲも陽性）、とＥＧＦＲ過剰発現細胞であるヒト扁平上皮癌由来細胞株Ａ４３１、およびＥＧＦＲがほとんど発現していないハムスター由来ＣＨＯ細胞を、各々８ウェルチャンバースライドに播種し、１日培養しておいた。これらの細胞に上記で調製したカルセイン封入粒子を添加し、６〜１６時間培養した。遊離のカルセインを培地で洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、カルセイン封入ＢＴＣ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子を用いることにより、ＨｅｐＧ２細胞とＡ４３１細胞へのカルセイン導入増強がみられたが、ＣＨＯ細胞では増強効果が見られなかった。

また、あらかじめ野生型ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子あるいはＢＴＣタンパク質を各細胞に添加して４℃で３０分インキュベートし、細胞上の受容体をブロックした。その後、カルセイン封入粒子を添加して、６時間培養後観察した。ＨｅｐＧ２細胞にカルセイン封入野生型ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子を添加した場合には、野生型ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子前処理によりカルセイン導入が大きく低下したのに対し、カルセイン封入ＢＴＣ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子を添加した場合には、少し低下しただけだった。Ａ４３１細胞へのカルセイン封入ＢＴＣ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子を添加した場合、野生型ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子前処理によるカルセイン導入能の低下は見られなかった。ＢＴＣタンパク質で各細胞を前処理した場合、カルセイン封入ＢＴＣ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子のＡ４３１細胞へのカルセイン導入はほぼ消失したが、ＨｅｐＧ２細胞への導入能は少し低下しただけだった。野生型ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子とＢＴＣタンパク質とで同時に前処理したＨｅｐＧ２細胞への導入能は、大きく低下した。ヒト肝癌細胞に対する二種の異なる認識部位（本実施例の場合、Ｎ末端部のＰｒｅＳとＣ末端部のＢＴＣ）が相補的に働くことにより、より確実に標的細胞への感染を達成できることが示された。

〔実施例１０：Ｃ末端ＺＺタグ（ＺＺ−ｔａｇ）融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質粒子を発現するプラスミドの作製〕
実施例３に記載の、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質Ｃ末端にスペーサーを介してｔａｇ配列を融合した粒子を発現するプラスミドに、さらにＺＺ−ｔａｇ配列を融合することにより、ＺＺ−ｔａｇ配列を粒子表面に提示するＨＢｓＡｇ Ｌタンパク粒子発現プラスミドを作成した。上記ＺＺ−ｔａｇとは、Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来ＰｒｏｔｅｉｎＡの「イムノグロブリンＧのＦｃ領域結合領域をコードするアミノ酸配列（ＺＺタグの配列：Ｎ末から、ＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ
ＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ）」であり、ＺＺ−ｔａｇ表面に提示した粒子ではこれを介することにより各種の「抗体」あるいは「抗体Ｆｃ領域とリガンドタンパク質との融合タンパク質」の粒子表面への提示が可能となる。

具体的には、ＺＺ−ｔａｇ配列をコードするプラスミドｐＭＷＩＺ１（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ．５７，ｐ．５００−５０５，２００１に記載）を鋳型として、ＮｄｅＩ配列を付加した配列番号４１の合成オリゴヌクレオチドと、ＰｖｕＩＩ配列を付加した配列番号４２の合成オリゴヌクレオチドとを、プライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、ＺＺ−ｔａｇ配列を含む遺伝子断片を増幅し、増幅ＤＮＡをｐＣＲ（Ｒ）２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。クローニングされた塩基配列を確認した後、ＺＺ−ｔａｇ配列を含む遺伝子断片を制限酵素ＮｄｅＩとＰｖｕＩＩで切り出した。実施例２および３で作成したｐＢ０７９０あるいはｐＢ０７９１を制限酵素ＮｄｅＩとＰｖｕＩＩとで切断し、上記のＺＺ−ｔａｇ遺伝子断片を各々挿入することにより、Ｃ末端ＺＺ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子発現用プラスミドを作成した。これらのプラスミドにおいて、ＨＢｓＡｇ Ｌ蛋白質領域に付加された配列を図６に示す。なお図中、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質との融合に使用したＳａｃＩサイトを波線で、ＺＺ−ｔａｇ配列挿入用に導入したＮｄｅＩサイトを点線、ＰｖｕＩＩサイトを二重下線で各々示した。またアミノ酸配列中、ＦＬＡＧ−ｔａｇ配列をボールド、ＺＺ−ｔａｇ配列を下線、Ｈｉｓ−ｔａｇ配列をイタリックで示した。

〔実施例１１：Ｃ末端ＺＺ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質粒子の発現〕
実施例６（１）と同様に、上記Ｃ末端ＺＺ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子発現用プラスミドをＣＯＳ７細胞にトランスフェクトし、その培養上清を回収した。この培養上清中の粒子量を、抗ＨＢｓＡｇ抗体を用いたＩＭＸ ＨＢｓＡｇアッセイキットで測定した結果、培養上清への粒子分泌が確認された。

〔実施例１２：抗体提示ＺＺ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質粒子の二つの認識部位による感染能〕
ＺＺ−ｔａｇ配列は、抗体分子のＦｃ部分に対して高い親和性を有しており、例えば癌特異的抗体であるヒトＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）に対するマウスモノクローナル抗体７Ｇ７Ｂ６等と特異的に結合することができる。そこで、上記Ｃ末端ＺＺ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質粒子と抗体とを結合させることにより、粒子表面に抗体を提示したＣ末端ＺＺ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質粒子を作成した。抗体を提示したＣ末端ＺＺ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質粒子は、Ｎ末端のＰｒｅＳ領域（ヒト肝細胞認識領域）によるヒト肝細胞特異的感染能と同時に、新たに表面に提示された抗体の特異性による感染能を有する。

（１）抗ＥＧＦＲ抗体提示粒子によるＥＧＦＲ高発現細胞への感染
実施例１１で作製されたＣ末端ＺＺ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子（５０−１０００ｎｇ／ｍｌ）に最終濃度１ｍＭとなるようにカルセイン（黄色蛍光物質）を混合したのち、エレクトロポレーション用チャンバーに入れ、エレクトロポレーション（条件：２２０Ｖ、９５０μＦ）により、カルセインを粒子内部に封入した。カルセイン封入粒子に対し、等モル量のマウスモノクローナル抗体７Ｇ７Ｂ６を混合し、ＰＢＳ中で約１時間反応させた。これにより粒子表面に抗ＥＧＦＲ抗体を提示し内部にカルセインを封入したＣ末端ＺＺ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質粒子が作製できた。

あらかじめヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２と、ＥＧＦＲ過剰発現細胞であるヒト扁平上皮癌由来細胞株Ａ４３１と、ＥＧＦＲがほとんど発現していないハムスター由来ＣＨＯ細胞とを、各々８ウェルチャンバースライドに播種し、１日培養しておいた。これらの細胞に、上記で調製したカルセイン封入粒子を添加し、６〜１６時間培養した。遊離のカルセインを培地で洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、カルセイン封入抗ＥＧＦＲ抗体提示Ｃ末端ＺＺ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子を用いることにより、ＨｅｐＧ２細胞とＡ４３１細胞へのカルセイン導入増強がみられたが、ＣＨＯ細胞では増強効果が見られなかった。

また、あらかじめ野生型ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子を各細胞に添加して、４℃３０分インキュベートした後、カルセイン封入抗ＥＧＦＲ抗体提示融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子を添加した。さらに、６時間培養後観察したところ、野生型ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子で前処理したＡ４３１細胞への導入能は低下しなかったが、ＨｅｐＧ２細胞に対するカルセイン導入は少し低下した。抗ＥＧＦ抗体あるいはＢＴＣタンパク質で各細胞を前処理した場合、Ａ４３１細胞へのカルセイン導入は消失したが、ＨｅｐＧ２細胞への導入能は少し低下しただけだった。野生型ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子とＢＴＣタンパク質とで同時に前処理すると、ＨｅｐＧ２細胞への導入能が大きく低下した。

（２）抗ヒトトランスフェリン抗体提示粒子によるＴｆＲ高発現細胞への感染
実施例１１で作製されたＣ末端ＺＺ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子（５０−１０００ｎｇ／ｍｌ）に最終濃度１ｍＭとなるようにカルセイン（黄色蛍光物質）を混合したのち、エレクトロポレーション用チャンバーに入れ、エレクトロポレーション（条件：２２０Ｖ、９５０μＦ）により、カルセインを粒子内部に封入した。カルセイン封入粒子に対し、等モル量のマウス抗ヒトトランスフェリンレセプター（ＣＤ７１）抗体（クロ−ンＤＦ１５１３、Ａｎｃｅｌｌ社等）を混合し、ＰＢＳ中で約１時間反応させた。これにより粒子表面に抗ＴｆＲ抗体を提示し内部にカルセインを封入したＣ末端ＺＺ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質粒子が作製できた。

あらかじめヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２とＴｆＲ過剰発現細胞であるヒト乳癌由来細胞株ＭＣＦ７とヒトＴｆＲを持たないマウス正常線維芽細胞Ｂａｌｂ／Ｃ ３Ｔ３ Ａ３１細胞を、各々８ウエルチャンバースライドに播種し、１日培養しておいた。これらの細胞に上記で調製したカルセイン封入封入抗ＴｆＲ抗体提示粒子を添加し、６〜１６時間培養した。遊離のカルセインを培地で洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、カルセイン封入抗ＴｆＲ抗体提示ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子を用いることにより、ＨｅｐＧ２細胞とＭＣＦ７細胞へのカルセイン導入増強がみられたが、Ｂａｌｂ／Ｃ ３Ｔ３ Ａ３１細胞へは認められなかった。

（３）抗ヒトＣＤ４０抗体提示粒子によるヒト肝癌細胞株の二重標的化
ヒト肝細胞ガン表面特異的抗原に対する抗体、例えば抗ヒトＣＤ１０抗体あるいは抗ヒトＣＤ４０抗体（ＢＤファーミジェン社）は、ＨｅｐＧ２細胞をはじめ多くのヒト肝細胞ガンに結合することが知られている。実施例１２（１）と同様にして、粒子表面に抗ヒト肝細胞ガン抗体（抗ＣＤ４０）を提示し内部にカルセインを封入したＣ末端ＺＺ−ｔａｇ融合ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質粒子を作製した。

あらかじめヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２（ＣＤ４０陽性）とＣＤ４０陰性のヒト乳癌由来細胞株ＭＣＦ７を、各々８ウエルチャンバースライドに播種し、１日培養しておいた。これらの細胞に上記で調製したカルセイン封入抗ＣＤ４０抗体提示粒子を添加し、６〜１６時間培養した。遊離のカルセインを培地で洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、カルセイン封入抗ＣＤ４０抗体提示ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子を用いることにより、ＨｅｐＧ２細胞へのカルセイン導入増強がみられたが、ＣＤ４０抗原陰性の非肝細胞であるＭＣＦ７細胞への導入は認められなかった。

また、あらかじめ野生型ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子を各細胞に添加して、３０分インキュベートした後、カルセイン封入抗ＣＤ４０抗体提示ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子を添加した。さらに、６時間培養後観察したところ、野生型ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子で前処理したＨｅｐＧ２細胞に対するカルセイン導入は保たれていた。抗ＣＤ４０抗体で前処理したＨｅｐＧ２細胞に対するカルセイン導入も保たれていた。抗ＣＤ４０抗体と野生型ＨＢｓＡｇ Ｌ粒子で同時に前処理したＨｅｐＧ２細胞に対するカルセイン導入は大きく低下した。

尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。

以上のように、本発明は、中空ナノ粒子を標的となる細胞や組織に効率的に送達することができるとともに、その精製が簡便になり、薬剤等として用いた場合にその実用性をより一層高めることができる。

従って、本発明は、ドラッグデリバリーシステムに利用可能なナノカプセルとして、医療関連産業や医薬品関連産業野に利用できるだけでなく、各種試薬産業等にも利用することが可能となる。

Claims (23)

1. 粒子形成能を有するタンパク質により形成され、生体由来の化学構造を認識する生体構造認識部位を表面に提示する中空ナノ粒子において、上記粒子形成能を有するタンパク質のアミノ末端およびカルボキシル末端の双方に、上記生体構造認識部位が設けられているとともに、それぞれの生体構造認識部位が認識する生体由来の化学構造は異なっていることを特徴とする中空ナノ粒子。
2. 上記生体構造認識部位の少なくとも一方は、標的となる細胞または組織に特異的な構造を認識する標的構造認識部位であることを特徴とする請求項１に記載の中空ナノ粒子。
3. 上記生体構造認識部位の何れか一方は、中空ナノ粒子そのものを特異的に認識するための識別部位として機能することを特徴とする請求項１または２に記載の中空ナノ粒子。
4. 上記生体構造認識部位は、ウィルス由来の宿主細胞認識構造、抗原決定基、リガンド、リガンドの受容体の少なくとも何れかであることを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載の中空ナノ粒子。
5. 上記ウィルス由来の宿主細胞認識構造が、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質における肝細胞認識部位であることを特徴とする請求項４に記載の中空ナノ粒子。
6. 上記抗原決定基が、タグ配列であることを特徴とする請求項４に記載の中空ナノ粒子。
7. 上記タグ配列が、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇの少なくとも何れかであることを特徴とする請求項６に記載の中空ナノ粒子。
8. 上記生体構造認識部位が、複数種類のタグ配列を組み合わせてなるものであることを特徴とする請求項６または７に記載の中空ナノ粒子。
9. 上記リガンドが、細胞増殖因子またはＺＺ−ｔａｇであることを特徴とする請求項４に記載の中空ナノ粒子。
10. 上記細胞増殖因子が、上皮増殖因子または繊維芽細胞増殖因子であることを特徴とする請求項９に記載の中空ナノ粒子。
11. 上記生体構造認識部位が、タグ配列とリガンドとを組み合わせてなるものであることを特徴とする請求項６から１０の何れか１項に記載の中空ナノ粒子。
12. 上記粒子形成能を有するタンパク質が、ウィルス由来の表面抗原タンパク質であり、当該表面抗原タンパク質の末端部に存在する宿主細胞認識構造を上記標的構造認識部位として用いることを特徴とする請求項２ないし１１の何れか１項に記載の中空ナノ粒子。
13. 上記粒子形成能を有するタンパク質が、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質であることを特徴とする請求項１２に記載の中空ナノ粒子。
14. 上記抗原決定基および／またはリガンドが、中空ナノ粒子そのものを特異的に認識するための上記識別部位として設けられていることを特徴とする請求項６から１３の何れか１項に記載の中空ナノ粒子。
15. 上記生体構造認識部位は、粒子形成能を有するタンパク質の末端側のアミノ酸配列を置換または付加することにより、当該タンパク質に導入されていることを特徴とする請求項１ないし１４の何れか１項に記載の中空ナノ粒子。
16. 少なくとも粒子形成能を有するタンパク質により形成され、生体由来の化学構造を認識する生体構造認識部位を表面に提示する中空ナノ粒子の生産方法において、当該中空ナノ粒子が、上記粒子形成能を有するタンパク質のアミノ末端およびカルボキシル末端の双方に、上記生体構造認識部位が設けられており、かつ、各生体構造認識部位が認識する生体由来の化学構造は異なっているものであり、上記粒子形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子と、上記生体構造認識部位をコードするポリヌクレオチドとをつなげたキメラ遺伝子を構築し、これを真核細胞に導入して発現させることを特徴とする中空ナノ粒子の生産方法。
17. 上記真核細胞は、酵母、昆虫細胞または動物細胞の何れかであることを特徴とする請求項１６に記載の中空ナノ粒子の生産方法。
18. 上記粒子形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子として、ウィルス由来の表面抗原タンパク質をコードする遺伝子が用いられるとともに、当該遺伝子における、表面抗原タンパク質のカルボキシル末端側となる側に、生体構造認識部位をコードするポリヌクレオチドとをつなげることにより、上記キメラ遺伝子が構築されることを特徴とする請求項１６または１７に記載の中空ナノ粒子の生産方法。
19. 上記キメラ遺伝子は、上記粒子形成能を有するタンパク質の末端側のアミノ酸配列を、生体構造認識部位に置換または付加するように構築されていることを特徴とする請求項１６から１８の何れか１項に記載の中空ナノ粒子の生産方法。
20. さらに、上記識別部位により認識される化学構造を有する物質を担体として用いて、上記中空ナノ粒子を精製することを特徴とする請求項１６から１９の何れか１項に記載の中空ナノ粒子の生産方法。
21. 請求項１から１５の何れか１項に記載の中空ナノ粒子に細胞導入物質が封入されていることを特徴とする薬剤。
22. 上記細胞導入物質が、遺伝子または薬理作用を有する化合物であることを特徴とする請求項２１に記載の薬剤。
23. 請求項２１または２２に記載の薬剤を用いる疾患の治療方法。

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